ES2620400T3

ES2620400T3 - Derivados de ácido hialurónico obtenidos a través de entrecruzamiento de "química clic"

Info

Publication number: ES2620400T3
Application number: ES07802163.1T
Authority: ES
Inventors: Vittorio Crescenzi; Chiara Di Meo; Devis Galesso
Original assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 2006-09-11
Filing date: 2007-09-05
Publication date: 2017-06-28
Anticipated expiration: 2027-09-05
Also published as: AU2007296939B9; EP2061816A1; US20100291171A1; WO2008031525A1; CA2662924A1; JP2010502824A; JP5397770B2; EP2061816B1; IL197498A; ITMI20061726A1; AU2007296939B2; PL2061816T3; KR20090063235A; IL197498A0; AU2007296939A1; CN101528780B; US8512752B2; MX2009002653A; CN101528780A; CA2662924C

Abstract

Un procedimiento para la preparación de derivados entrecruzados de polisacáridos que tienen varios grupos carboxilo, en el que por lo menos una de las cadenas de polisacáridos consiste en ácido hialurónico o un derivado del mismo, entrecruzado por medio de reacción de cicloadición 1,3 dipolar, donde dicho proceso comprende los siguientes pasos: i) síntesis de derivados parciales seleccionados de entre ésteres, amidas, tioésteres o anhídridos de ácido hialurónico, y opcionalmente síntesis de otro polisacárido que tiene varios grupos carboxilo o las respectivas sales o derivados; ii) reacción de cicloadición entre los derivados obtenidos en el paso i) con la formación de enlaces covalentes entre las cadenas, en el que los derivados parciales obtenidos en el paso i) tienen pares de residuos que contienen grupos capaces de reaccionar uno con otro en el siguiente paso ii) y en el que los pares de residuos son un par del tipo 1,3-dipolo y dipolarófilo, en el que: - el compuesto 1,3-dipolo es seleccionado del grupo que consiste en derivados de azidas; - el compuesto dipolarofílico es seleccionado del grupo que consiste en alquenos, alquinos o derivados de alquenos o alquinos con uno o más grupos que atraen electrones unidos al doble o triple enlace, y preferiblemente 63 de acrilatos, acrilamidas, fumaratos, vinilcetonas, nitro-alquenos, nitro-alquinos, anhídrido maleico, metilacetileno y quinonas.

Description

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a 500 mg/ml dependiendo del tipo de polisacárido y el tipo de derivado, y preferiblemente de 5 a 100 mg/ml. La temperatura de reacción varía en ambos casos normalmente de 4 a 60°C, en particular de 15 a 40°C, mientras la formación de los productos entrecruzados y en consecuencia los hidrogeles tiene lugar después de un tiempo de agitación que varía desde algunos segundos a 30 minutos, en particular desde unos pocos segundos a 10 minutos.

La reacción de cicloadición puede tener lugar con catálisis sobre la parte de una sal de Cu(I), presente en la mezcla acuosa de reacción a una concentración final que varía de 1 a 50 mg/ml, y preferiblemente de 1 a 5 mg/ml,

o con catálisis de un sistema que genera Cu(I) in situ, y preferiblemente un sistema que consiste en una sal de Cu(II) (por ejemplo CuSO4) y ácido ascórbico en concentraciones catalíticas, o sin catalizador, si los sustituyentes sobre los grupos reactivos descritos anteriormente hacen la misma reacción rápida y eficiente también bajo estas condiciones.

Los hidrogeles, objeto de la presente invención y obtenidos por medio de la reacción descrita anteriormente, tienen la capacidad de absorber más agua o solvente e hincharse, y una de sus características radica en las propiedades viscoelásticas que pueden ser moduladas de acuerdo con el grado de entrecruzamiento alcanzado. En particular, estos hidrogeles pueden estar presentes en la forma de un fluido más o menos viscoso y mucoadhesivo, o en una estructura compacta tridimensional del tipo pared-pared, y en consecuencia tener una mayor resistencia mecánica (véase figura 5).

Brevemente, los hidrogeles, objeto de la presente invención, pueden ser obtenidos y modulados considerando los siguientes parámetros:

i. el peso molecular de los polisacáridos de partida o sus derivados;

ii. el grado de formación de derivados de los polisacáridos de partida o sus derivados, en relación a los grupos usados a continuación en la formación de entrecruzamiento;

iii. para derivados de los polisacáridos de partida, el tipo de molécula unida a los grupos carboxílicos no comprometidos en el entrecruzamiento y su grado de formación de derivados;

iv.: la concentración de los materiales de partida para obtener el gel;

v.: el tipo de grupos R1 que actúan como posibles espaciadores entre los polisacáridos y los grupos Y1;

vi. el tipo de solución en la cual se prepara el gel.

Dado que los geles así sintetizados se derivan de una matriz de polisacáridos, son ampliamente aplicados en el campo médico, en particular en el campo de la viscosuplementación y cirugía plástica, oncológica y reconstructiva.

Los derivados entrecruzados en la forma de hidrogeles son usados preferiblemente en cirugía plástica como agentes de relleno dérmico, en cirugía oncológica y reconstructiva, agentes de relleno en terapia de genes, matrices para la liberación de polinucleótidos, en ingeniería de tejidos como soportes que contienen material celular en regeneración de tejidos.

En particular, en el campo osteoarticular, donde uno de los tipos de tratamiento más ampliamente usado y efectivo para enfermedades degenerativas del cartílago y tejido sinovial es la inyección intra-articular de compuestos que tienen marcadas propiedades viscoelásticas, la capacidad de modular las características reológicas de los hidrogeles descritos aquí, mediante la variación de uno o más parámetros especificados anteriormente, ha probado ser un instrumento poderoso para el desarrollo de dispositivos médicos innovadores.

Además, aprovechando una aproximación diferente, el método de entrecruzamiento descrito en la presente invención es usado para la formación de un hidrogel que consiste en ácido hialurónico (y/o es un derivado del mismo) directamente en la cavidad sinovial, mediante administración intra-articular de una inyección, primero un componente y luego el segundo con o sin un catalizador a base de Cu(I), con dos inyecciones menos dolorosas, dado que consisten en soluciones que tenía inicialmente una baja viscosidad.

Otra ventaja del uso de los derivados entrecruzados de acuerdo con la presente invención en el campo osteoarticular, radica en el hecho de que el ácido hialurónico entrecruzado en la forma de un hidrogel, especialmente si se ha formado derivado al nivel de carboxilo por medio de un enlace más estable, tal como por ejemplo el enlace amida, tiene tiempos de degradación más largos respecto a aquellos de un compuesto de viscosuplementación inyectado en forma fluida y a base del polisacárido de partida o el polisacárido entrecruzado de acuerdo con métodos diferentes al del objeto de la presente invención, permitiendo mayores tiempos de residencia en el sitio de administración.

Esta última característica sorprendente puede ser demostrada mediante los resultados de estudios in vitro a 37°C

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ilustrativos (para descripciones adicionales y más detalladas, véase también la sección relacionada con los ejemplos, en particular Ejemplo 13).

En el primer caso se observa que la cantidad máxima de clorhidrato de doxorubicina es liberada en aproximadamente 50 h y es igual a 50% de la cantidad incorporada inicialmente en el gel (véase figura 6).

En el segundo diagrama, la cantidad máxima de clorhidrato de bencidamina es liberada en aproximadamente 6 h y es igual a 80% de la cantidad de fármaco incorporado inicialmente en el gel (véase figura 7).

Estos sistemas de fármacos de liberación controlada en la forma de geles pueden tener numerosos campos de aplicación, pero en particular en los campos dermatológico, oncológico, neumológico y osteo-articular.

En particular, en el caso de uso intra-articular, el gel anterior puede contener principios activos tales como sustancias antiinflamatorias, inhibidores de metal-proteasa, inhibidores de sintetasa NO u otras moléculas biológicamente activas para el tratamiento de patologías artrósicas y/o artríticas, obteniendo así una baja liberación del(los) principio(s) activo(s), asociada con la acción de viscosuplementación principalmente mecánica ofrecida por el gel.

En particular, un objeto de la presente invención se relaciona con el uso de sistemas de liberación controlada en cirugía oncológica reconstructiva o en neurocirugía oncológica, seguimiento del retiro de masas de cáncer, en el que el hidrogel contiene fármacos antineoplásicos y/o citostáticos y/o sus precursores como moléculas farmacológicamente activas.

Sobre la base de las ventajas específicas suministradas por la buena biocompatibilidad, baja biodegradación y significativa mucoadhesión, la administración loco-regional de estos sistemas de liberación controlada, cargados con fármacos antineoplásicos y/o citostáticos prueba ser particularmente efectiva y ventajosa, en el caso por ejemplo de cirugía facial.

En estas formas de aplicación, en efecto la función de "agente de relleno" de la matriz de polisacárido entrecruzado en sí misma, está asociada con la actividad del fármaco que es liberado lentamente por dicha matriz, con objeto de prevenir la formación de neoplasma reincidente.

Los posibles sitios de administración de los sistemas de liberación controlada descritos previamente, comprenden todas aquellas cavidades o espacios de tejido que se derivan de intervenciones quirúrgicas, para el retiro de masas tumorales, donde es apropiado introducir un producto biocompatible, en la forma de un hidrogel medicado que tiene una función estructural y de relleno y una actividad farmacológica. En particular, las administraciones intratecales son de particular interés, el seguimiento del retiro de neoplasma cerebral (por ejemplo glioblastomas), administración intraperitoneal para seguimiento del retiro de tumores cólicos, vesicales, hepáticos y pancreáticos, y en el caso de administraciones reconstructivas masto-plásticas, después del retiro de tumores de mama.

Ejemplos de moléculas farmacológicamente activas que pueden ser usadas en esta forma de aplicación de los sistemas de liberación controlada de acuerdo con la presente invención, son todos aquellos que tienen una actividad antitumoral o citostática conocida y/o posibles precursores de los mismos, en particular moléculas farmacológicamente efectivas en el tratamiento del neoplasma listado anteriormente, y preferiblemente paclitaxel, doxorubicina, irinothecan, 5-fluorouracil, gemcitabin, vincristine y metotrexate.

Se suministran los siguientes ejemplos para una mejor ilustración de la presente invención.

Ejemplo 1

Introducción de grupo amido en HANa con 11-azida-3,6,9-trioxaundecano-1-amina en un solvente acuoso a pH=4 en la presencia de EDC•HCl y NHS

Se disolvieron 2 g de sal de sodio de HA de 700 kDa en 80 ml de amortiguador de MES 100 mM, pH=4. Se añadieron entonces los siguientes reactivos en secuencia: 1.43 g de EDC•HCl (clorhidrato de N(3,dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida) y 0.86 g de NHS (N-hidroxisuccinimida), y a continuación 3.30 ml de 11azida-3,6,9-trioxaundecano-1-amina a 90%. Se dejó entonces la mezcla bajo agitación a temperatura ambiente por 24 horas, se le realizó diálisis (MWCO=12 kDa) contra una solución saturada de NaCl por 24 horas, y luego contra agua destilada hasta que se alcanzó una conductividad constante. A continuación se transfirió la solución a un matraz, se congeló en nitrógeno líquido y se liofilizó. Se recuperó el producto 1 (véase la figura 8) como un polvo blanco.

Reacción de producto 1 con propargilamina

Se disolvieron 500 mg de producto 1 en 20 ml de agua destilada. Se añadieron entonces 2 ml de propargilamina y

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una solución saturada de NaCl por 24 horas, y luego contra agua destilada hasta que se alcanzó una conductividad constante. A continuación se transfirió la solución a un matraz, se congeló en nitrógeno líquido y se liofilizó, recuperando producto 3 (que tiene la misma estructura química que la figura 8) como un polvo blanco.

Introducción de grupo amido en HANa con propargilamina en un solvente acuoso a pH=4 en la presencia de EDC•HCl y NHS

Se añadieron 1.43 g de EDC•HCl, 0.86 g de NHS y luego 1.04 ml de propargilamina a 2 g de sal de sodio de HA de 69 kDa disueltos en 80 ml de amortiguador de MES 100 mM, pH=4. Se dejó la reacción bajo agitación a temperatura ambiente por 24 horas, se transfirió entonces la solución a tubos de diálisis de corte de 12 kDa contra una solución saturada de NaCl por 24 horas, y luego contra agua destilada hasta que se alcanzó una conductividad constante. A continuación se congeló la solución en nitrógeno líquido y se liofilizó para la recuperación de producto 4 (que tiene la misma estructura química que la figura 10) como un polvo blanco.

Formación del hidrogel de ácido hialurónico en un solvente acuoso en la presencia de IL-2

Se disolvieron separadamente 400 mg de producto 3 y 400 mg de producto 4 en 8 ml de agua destilada hasta completa disolución. Se disolvieron también 0.5 mg de interleuquina 2 (IL 2) en 0.5 ml de agua. Se disolvieron aparte 30 mg de CuCl en 1.50 ml de agua destilada. Se mezclaron entonces las soluciones de los polímeros, se añadió a continuación la solución de interleuquina 2 y se dejó la mezcla bajo agitación suave. Se añadió finalmente la solución de CuCl, agitando con vórtice por unos pocos minutos hasta la formación del gel (véase la figura 12). Se realizó entonces diálisis al gel contra agua destilada para retirar el exceso CuCl.

Formación del hidrogel de ácido hialurónico en un solvente acuoso en la presencia de clorhidrato de doxorubicina

Se disolvieron separadamente 400 mg de producto 3 y 400 mg de producto 4 en 8 ml de agua destilada hasta completa disolución. Se disolvieron también 15 mg de clorhidrato de doxorubicina en 1 ml de agua. Se disolvieron aparte 30 mg de CuCl en 1.50 ml de agua destilada. Se mezclaron entonces las soluciones de los polímeros, a continuación se añadió la solución de clorhidrato de doxorubicina y se dejó la mezcla bajo agitación suave. Finalmente se añadió la solución de CuCl, agitando con vórtice por unos pocos minutos hasta la formación del gel (véase la figura 12). Se realizó entonces diálisis al gel contra agua destilada para retirar el exceso CuCl.

Ejemplo 7

Introducción de grupo amido en CMC con 11-azida-3,6,9-trioxaundecano-1-amina en un solvente acuoso a pH=4 en la presencia de EDC•HCl y NHS

Se disolvieron 2 g de CMC (carboximetilcelulosa) en 80 ml de amortiguador de MES 100 mM, pH=4. Se añadieron

1.57 g de EDC•HCl, 0.94 g de NHS, y a continuación 2.71 ml de 11-azida-3,6,9-trioxaundecano-1-amina a 90%. Se dejó la solución bajo agitación a temperatura ambiente por 24 horas, y luego se realizó diálisis (MWCO=12 kDa) contra una solución saturada de NaCl por 24 horas, y luego contra agua destilada hasta que se alcanzó una conductividad constante. A continuación se transfirió la solución a un matraz, se congeló en nitrógeno líquido y se liofilizó, recuperando producto 6 como un polvo blanco.

Se añadieron 2.87 g de EDC•HCl, 1.72 g de NHS y luego 1.73 ml de propargilamina a 2 g de sal de sodio de HA de 69 kDa disueltos en 80 ml de amortiguador de MES 100 mM, pH=4. Se dejó la reacción bajo agitación a temperatura ambiente por 24 horas, se transfirió entonces la solución a tubos de diálisis (MWCO=12 kDa) y se realizó diálisis contra una solución saturada de NaCl por 24 horas, y luego contra agua destilada hasta que se alcanzó una conductividad constante. A continuación se congeló la solución en nitrógeno líquido y se liofilizó, recuperando producto 4 (véase la figura 10) como un polvo blanco.

Formación del hidrogel mixto de ácido hialurónico y carboximetilcelulosa en un solvente acuoso

Se disolvieron 500 mg de producto 6 (derivado de CMC) en 10 ml de agua destilada, y de manera análoga para producto 4. Se preparó aparte una solución acuosa de 2% p/v CuCl. Se mezclaron las soluciones de los dos diferentes polímeros y se añadió entonces 1.50 ml de la solución de CuCl, agitando con vórtice por unos pocos minutos hasta la formación del gel (figura 13). Se realizó entonces diálisis al gel contra agua destilada hasta que se alcanzó un peso constante.

Ejemplo 8

Introducción de grupo amido en HANa con 11-azida-3,6,9-trioxaundecano-1-amina en un solvente acuoso a pH=4

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en la presencia de EDC•HCl y NHS

Se disolvieron 2 g de sal de sodio de HA de 200 kDa en 80 ml de amortiguador de MES 100 mM, pH=4. Se agregaron entonces en secuencia 1.43 g de EDC•HCl (clorhidrato de N-(3,dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida),

0.86 g de NHS (N-hidroxisuccinimida) y a continuación 5.50 ml de 11-azida-3,6,9-trioxaundecano-1-amina a 90%. Se dejó la reacción bajo agitación a temperatura ambiente por 24 horas, y luego se colocó en diálisis contra una solución saturada de NaCl por 24 horas, y luego contra agua destilada hasta que se alcanzó una conductividad constante. A continuación se transfirió la solución a un matraz, se congeló en nitrógeno líquido y se liofilizó, recuperando producto 5 (que tiene la misma estructura química que la figura 8) como un polvo blanco.

Introducción de grupo amido en CMC con propargilamina en un solvente acuoso a pH=4 en la presencia de EDC•HCl y NHS

Se añadieron 2.36 g de EDC•HCl, 1.41 g de NHS y luego 5.42 ml de propargilamina a 2 g de CMC disueltos en 80 ml de amortiguador de MES 100 mM, pH=4. Se dejó la reacción bajo agitación a temperatura ambiente por 24 horas, se transfirió entonces la solución a tubos de diálisis (MWCO=12 kDa) y se realizó diálisis contra una solución saturada de NaCl por 24 horas, y luego contra agua destilada hasta que se alcanzó una conductividad constante. A continuación se congeló la solución en nitrógeno líquido y se liofilizó, recuperando producto 7 como un polvo blanco.

Formación del hidrogel mixto de ácido hialurónico y CMC en un solvente acuoso/orgánico

Se disolvieron separadamente 500 mg de producto 5 y 500 mg de producto 7 (derivado de CMC) en 5 ml de agua destilada y 5 ml de NMP. Se disolvieron aparte 30 mg de CuCl en 1.50 ml de agua destilada. Se mezclaron entonces las soluciones de los polímeros, se añadió entonces la solución de CuCl, agitando con vórtice por unos pocos minutos hasta la formación del gel mixto de ácido hialurónico/carboximetilcelulosa. Se realizó entonces diálisis al gel hacia agua destilada para retirar el CuCl y solvente orgánico, donde dicha diálisis fue llevada a cabo hasta que se alcanzó un peso constante del gel.

Ejemplo 9

Introducción de grupo amido en Hyaffllp50 con 11-azida-3,6,9-trioxaundecano-1-amina en un solvente acuoso a pH=4 en la presencia de EDC•HCl y NHS

Se disolvieron 2 g de Hyaffllp50 en 80 ml de amortiguador de MES 100 mM, pH=4. Se añadieron entonces en secuencia 1.32 g de EDC•HCl (clorhidrato de N-(3,dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida), 0.79 g de NHS (Nhidroxisuccinimida) y a continuación 3.04 ml de 11-azida-3,6,9-trioxaundecano-1-amina a 90%. Se dejó la mezcla bajo agitación a temperatura ambiente por 24 horas, y luego se realizó diálisis (MWCO=12 kDa) contra una solución saturada de NaCl por 24 horas, y luego contra agua destilada hasta que se alcanzó una conductividad constante. A continuación se transfirió la solución a un matraz, se congeló en nitrógeno líquido y se liofilizó, recuperando producto 8 como un polvo blanco.

Introducción de grupo amido en Hyaffllp50 con propargilamina en un solvente acuoso a pH=4 en la presencia de EDC•HCl y NHS

Se agregaron 1.32 g de EDC•HCl, 0.79 g de NHS y luego 0.95 ml de propargilamina a 2 g de Hyaffllp50 disueltos en 80 ml de amortiguador de MES 100 mM, pH=4. Se dejó la reacción bajo agitación a temperatura ambiente por 24 horas, se transfirió entonces a solución a tubos de diálisis (MWCO=12 kDa) y se realizó diálisis contra una solución saturada de NaCl por 24 horas, y luego contra agua destilada hasta que se alcanzó una conductividad constante. A continuación se congeló la solución en nitrógeno líquido y se liofilizó, recuperando producto 9 como un polvo blanco.

Formación del hidrogel de Hyaffllp50 en un solvente acuoso/orgánico

Se disolvieron separadamente 400 mg de cada uno de los dos derivados 8 y 9 descritos anteriormente, en 4 ml de agua destilada y 4 ml de NMP. Se disolvieron aparte 30 mg de CuCl en 1.50 ml de agua destilada. Se mezclaron entonces las soluciones de los polímeros, se añadió entonces la solución de CuCl y se agitó la mezcla con vórtice por unos pocos minutos hasta la formación del gel (véase la figura 14). Se realizó entonces diálisis al gel contra agua destilada para retirar el exceso CuCl hasta que se alcanzó un peso constante del gel.

Ejemplo 10

Introducción de grupo amido en Hyaff9p10 con 11-azida-3,6,9-trioxaundecano-1-amina en un solvente acuoso a pH=6 en la presencia de EDC•HCl y NHSS

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Se disolvió 1 g de Hyaff9p10 en 80 ml de amortiguador de MES 100 mM, pH=6. Se añadieron entonces 470 mg de EDC•HCl, 530 mg de NHSS (N-hidroxisulfosuccinimida) y a continuación 1.60 ml de 11-azida-3,6,9trioxaundecano-1-amina a 90%. Se dejó la solución bajo agitación a temperatura ambiente por 8 horas, y luego se realizó diálisis en tubos (corte 12 kDa) contra una solución saturada de NaCl, y luego contra agua destilada hasta que se alcanzó una conductividad constante. A continuación se transfirió la solución a un matraz, se congeló en nitrógeno líquido y se liofilizó. Se recuperó producto 10 como un polvo blanco.

Introducción de grupo amido en Hyaff9p10 con propargilamina en un solvente acuoso a pH=6 en la presencia de EDC•HCl y NHSS

Se disolvió 1 g de Hyaff9p10 en 80 ml de MES buffer 100 mM, pH=6. Se añadieron entonces a la solución 470 mg de EDC•HCl, 540 mg de NHSS y luego 530 ml (3x) de propargilamina. Se dejó el sistema bajo agitación a temperatura ambiente por 8 horas y se realizó diálisis (MWCO=12 kDa) contra una solución saturada de NaCl por 24 horas, y luego contra agua destilada hasta que se alcanzó una conductividad constante. Se transfirió la solución a un matraz y a continuación se congeló y se liofilizó para la recuperación de producto 11 como un polvo blanco.

Formación del hidrogel de Hyaff9p10 en un solvente acuoso

Se disolvieron completamente y separadamente 300 mg de producto 10 y 300 mg de producto 11 en 6 ml de agua destilada. Se preparó aparte una solución acuosa 2% p/v de CuCl. Se mezclaron entonces las soluciones de los polímeros, añadiendo 1 ml de la solución de CuCl y se agitó la mezcla con vórtice por unos pocos minutos hasta la formación del gel (véase la figura 15). Se realizó entonces diálisis al gel contra agua destilada hasta que se alcanzó un peso constante del gel.

Ejemplo 11

Se disuelven 2 g de sal de sodio de HA de 200 kDa en 80 ml de amortiguador de MES 50 mM, pH=4. Se agregan entonces de secuencia 2,90 g de EDC•HCl (clorhidrato de N-(3, dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida), 1,77 g de NHS (N-hidroxisuccinimida), y 5,50 ml de 11-azida-3,6,9-trioxaundecano-1-amina a 90%. Se deja la reacción bajo agitación a temperatura ambiente por 48 h y se realiza diálisis entonces (MWCO=14 kDa) contra una solución saturada de NaCl por 24 h, y contra agua destilada hasta que se alcanza una conductividad constante. A continuación se transfiere la solución un matraz, se congela en nitrógeno líquido y luego se liofiliza. Se recupera producto 1 (véase la figura 16) como un polvo blanco.

Se añaden 2,90 g de EDC•HCl, 1,77 g de NHS y luego 1,73 ml de propargilamina a 2 g de sal de sodio de HA de 200 kDa disueltos en 80 ml de amortiguador de MES 50 mM, pH=4. Se deja la reacción por 48 h bajo agitación a temperatura ambiente, se transfiere entonces la solución a tubos de diálisis (MWCO=14 kDa) y se realiza diálisis contra una solución saturada de NaCl por 24 h, y luego contra agua destilada hasta que se ha alcanzado una conductividad constante. A continuación se congela la solución en nitrógeno líquido y se liofiliza para la recuperación de producto 2 (véase la figura 17) como un polvo blanco.

Formación del hidrogel de ácido hialurónico con CuSO4•5H2O catalítico y ácido ascórbico en un solvente acuoso en el presente de BSA

Se preparan 25 ml de una solución acuosa 2% p/v de albúmina de suero bovino (BSA); se disuelven entonces 500 mg de producto 1 y 500 mg de producto 2 en 14 ml la solución anterior. A continuación se añaden 2 ml de una solución acuosa obtenida con 50 mg de CuSO4•5H2O y 4 ml de una solución acuosa de 40 mg de ácido ascórbico, agitando con formación de vórtice por algunos minutos. El gel formado rápidamente (véase la figura 18) incorpora la proteína de BSA.

Formación del hidrogel de ácido hialurónico entrecruzado con CuCl catalítico en un solvente acuoso en la presencia de clorhidrato de doxorubicina.

Se disuelven 29 mg de clorhidrato de doxorubicina en 2 ml de agua y se añaden entonces 50 mg de producto 1 y 50 mg de producto 2 sintetizado como se describió anteriormente. A continuación se añaden 830 mL de una solución 1% p/v de CuCl a la solución y se forma el gel después de algunos minutos, incorporando directamente el fármaco presente en la solución.

Mediciones de liberación del fármaco clorhidrato de doxorubicina a partir de hidrogeles a base de ácido hialurónico

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(MWCO=14 kDa) contra una solución saturada de NaCl por 24 h, y contra agua destilada hasta que se ha alcanzado una conductividad constante. Se transfiere entonces la solución a un matraz, se congela en nitrógeno líquido y luego se liofiliza. Se recupera producto 1 como un polvo blanco.

Reacción de producto 1 con 1,4-Dietinilbenceno en un solvente acuoso/orgánico con CuSO4.5H2O catalítico y ácido ascórbico

Se disuelven 500 mg de producto 1 en 45 ml de agua destilada y 150 mg de 1,4-dietinilbenceno en 1,5 ml de DMSO. Se mezclan las soluciones, se añaden entonces 1,5 ml de una solución acuosa obtenida con 50 mg de CuSO4.5H2O en 3 ml de H2O y 2 ml de una solución acuosa de 88 mg de ácido ascórbico. Se agita la mezcla por 4 h a temperatura ambiente, se realiza entonces diálisis a la solución (MWCO=14 kDa) contra una solución saturada de EDTA por 24 h, y luego contra agua destilada hasta que se ha alcanzado una conductividad constante. A continuación se transfiere la solución a un matraz, se congela en nitrógeno líquido y se liofiliza, recuperando el producto (véase la figura 22) como un polvo blanco.

Reacción de producto 1 con 1,6-heptadiina en un solvente acuoso/orgánico con CuSO4.5H2O catalítico y ácido ascórbico

Se disuelven 500 mg de producto 1 en 45 ml de agua destilada y se disuelven 0,13 ml de 1,6-heptadiina en 1,5 ml de DMSO. Se mezclan las soluciones, se añaden entonces 1,5 ml de una solución acuosa obtenida con 50 mg de CuSO4.5H2O en 3 ml de H2O y 2 ml de una solución acuosa de 88 mg de ácido ascórbico. Se agita la mezcla por 4 h a temperatura ambiente, se realiza entonces diálisis a la solución (MWCO=14 kDa) contra una solución saturada de EDTA por 24 h, y luego contra agua destilada hasta que se ha alcanzado una conductividad constante. A continuación se transfiere la solución a un matraz, se congela en nitrógeno líquido y se liofiliza, recuperando el producto (véase la figura 23) como un polvo blanco.

Reacción de producto 1 con 1,8-nonadiina en un solvente acuoso/orgánico con CuSO4.5H2O catalítico y ácido ascórbico

Se disuelven 500 mg de producto 1 en 45 ml de agua destilada y se disuelven 0,18 ml de 1,8-nonadiina en 1,5 ml de DMSO. Se mezclan las soluciones, se añaden a continuación 1,5 ml de una solución acuosa obtenida con 50 mg de CuSO4.5H2O en 3 ml de H2O y 2 ml de una solución acuosa de 88 mg de ácido ascórbico. Se agita la mezcla por 4 h a temperatura ambiente, se realiza entonces diálisis a la solución (MWCO=14 kDa) contra una solución saturada de EDTA por 24 h, y luego frente a agua destilada hasta que se ha alcanzado una conductividad constante. Se transfiere entonces la solución a un matraz, se congela en nitrógeno líquido y se liofiliza, recuperando el producto (véase la figura 24) como un polvo blanco.

Reacción de producto 1 con propargiléter en un solvente acuoso/orgánico con CuSO4.5H2O catalítico y ácido ascórbico

Se disuelven 500 mg de producto 1 en 45 ml de agua destilada y se disuelven 0,12 ml de propargiléter en 1,5 ml de DMSO. Se mezclan las soluciones, se añaden a continuación 1,5 ml de una solución acuosa obtenida con 50 mg de CuSO4.5H2O en 3 ml de H2O y 2 ml de una solución acuosa de 88 mg de ácido ascórbico. Se agita la mezcla por 4 h a temperatura ambiente, se realiza entonces diálisis a la solución (MWCO=14 kDa) contra una solución saturada de EDTA por 24 h, y luego contra agua destilada hasta que se ha alcanzado una conductividad constante. Se transfiere entonces la solución a un matraz, se congela en nitrógeno líquido y se liofiliza, recuperando el producto (véase la figura 25) como un polvo blanco.

Ejemplo 13

Introducción de grupo amido en HANa con 11-azida-3,6,9-trioxaundecano-1-amina en un solvente acuoso a pH=4 en la presencia de EDCdHCl y NHS

Se disuelven 2 g de sal de sodio de HA de 200 kDa en 80 ml de amortiguador de MES 50 mM, pH=4. Se añaden a continuación en secuencia 2,90 g de EDCdHCl (clorhidrato de N-(3, dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida), 1,77 g de NHS (N-hidroxisuccinimida), y luego 5,50 ml de 11-azida-3,6,9-trioxaundecano-1-amina a 90%. Se deja la reacción bajo agitación a temperatura ambiente por 48 h, y luego se realiza diálisis (MWCO=14 kDa) contra una solución saturada de NaCl por 24 h, y contra agua destilada hasta que se ha alcanzado una conductividad constante. Se transfiere entonces la solución a un matraz, se congela en nitrógeno líquido y luego se liofiliza. Se recupera producto 1 como un polvo blanco.

Formación del hidrogel de ácido hialurónico con 1,4-dietinilbenceno obtenido con CuSO4.5H2O catalítico y ácido ascórbico en un solvente acuoso/orgánico en la presencia de clorhidrato de doxorubicina

Se disuelven separadamente 100 mg de producto 1 en 1,1 ml de agua destilada y se disuelven 3 mg de 1,4

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ml de 1,8-nonadiina en 11.23 ml de DMSO, mientras se disuelven 23,2 mg de clorhidrato de doxorubicina en 0,5 ml de agua destilada. Se mezcla la solución de ácido hialurónico con la de doxorubicina y con 0.2 ml de la de 1,8nonadiina; se agregan entonces 0,1 ml de una solución acuosa obtenida con 50 mg de CuSO4.5H2O en 1 ml de H2O y 0,1 ml de una solución acuosa de 20 mg de ácido ascórbico. Se agita la mezcla por algunos minutos

5 formando vórtice. El gel formado rápidamente (véase la figura 31) incorpora dentro el clorhidrato de doxorubicina.

Mediciones de liberación del fármaco clorhidrato de doxorubicina desde un hidrogel a base de ácido hialurónico con 1,8-nonadiina obtenida con CuSO4.5H2O catalítico

La cantidad de clorhidrato de doxorubicina liberada del hidrogel, en 100 ml de agua destilada, es determinada por medio de mediciones espectrofotométricas U.V. a λ=486 nm mediante interpolación de los valores de absorbancia

10 sobre una línea de calibración construida usando soluciones del fármaco a concentración conocida.

Las mediciones de liberación del fármaco son ejecutadas sobre el hidrogel descrito anteriormente.

La cantidad máxima de clorhidrato de doxorubicina es liberada sobre un periodo de aproximadamente 100 h y es igual a 14% de la cantidad de fármaco incorporada inicialmente en el gel (véase la figura 32).

Claims

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