ES2620258T3 - Método de tratamiento de células madre mesenquimales y su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con el estrés oxidativo - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere de una parte a un método de tratamiento de células madre mesenquimales, preferentemente de origen adiposo, que comprende fundamentalmente dos etapas, la obtención y aislamiento de células mesenquimales, y en segundo lugar, una etapa de crecimiento y tratamiento específico de las células en un medio de condicionamiento o tratamiento con un agente oxidante. La invención comprende también las células obtenidas de forma directa a través del método y su uso en el tratamiento de enfermedades causadas o asociadas a estrés oxidativo.

Description

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Metodo de tratamiento de celulas madre mesenquimales y su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con

el estres oxidativo

DESCRIPCION

Aspecto tecnico de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo de tratamiento para celulas mesenquimales, celulas obtenidas de forma directa a traves de este metodo y su uso en el tratamiento de enfermedades causadas por o asociadas al estres oxidativo.

Antecedentes de la invencion

El potencial de las celulas madre reside en su capacidad para diferenciarse en diferentes tipos celulares e integrarse en los correspondientes tejidos y organos. Otro aspecto beneficioso de las celulas madre es su secrecion paracrina de citocinas, interleucinas, factores troficos y factores de crecimiento.

La investigacion y los ensayos clmicos actuales se estan disenando para determinar el efecto terapeutico de las celulas madre en diversas patologfas, y hay una demanda creciente de terapias basadas en celulas madre.

Algunas enfermedades degenerativas del sistema respiratorio, del cardiovascular, inmunitario, del sistema endocrino, de los sistemas nerviosos central y periferico, lesion medular, lesion por isquemia-reperfusion y enfermedades desmielinizantes, tienen un componente inflamatorio mediado por especies reactivas del oxfgeno (ERO) denominado estres oxidativo.

Las especies reactivas del oxfgeno, principalmente, el radical anion superoxido (O2") y su producto de dismutacion H2O2, son subproductos de desecho natural en la mitocondria de las celulas, donde tiene lugar la cadena respiratoria, un fenomeno vital para la vida de la celula debido a su funcion en la generacion de la molecula energetica (ATP).

Las mitocondrias son los compartimentos de las celulas de mairnfero mas activos en procesos redox, realizando mas del 90 % de la transferencia de electrones al O2 como aceptor final de electrones. La mayona de la transferencia de electrones se da a traves de un circuito central de redox que usa la energfa potencial disponible de la oxidacion de varios sustratos metabolicos (por ejemplo, piruvato y acidos grasos) para generar ATP. La regulacion de este proceso es fundamental para la funcion celular, porque las celulas deben generar ATP mientras que al mismo tiempo mantienen una homeostasis apropiada en terminos de suministro de aminoacidos no esenciales, eliminacion de aminoacidos en exceso, suministro de glucosa e interconversion de precursores energeticos para permitir un suministro de energfa a largo plazo ante la ingesta variable e intermitente de alimentos. Parte de la regulacion parece darse junto con una baja tasa de generacion continua de las ERO y los sensores moleculares. Aunque esta poco definido, se sabe que el circuito redox asociado a esta regulacion requiere un ambiente redox especializado.

Bajo condiciones de estres oxidativo excesivo, el colapso simultaneo del potencial de generacion de ATP mitocondrial y un aumento transitorio en la generacion de ERO a traves de cadena respiratoria mitocondrial puede dar como resultado una liberacion de ERO hacia el citosol. Esto puede desencadenar “la liberacion de ERO inducida por ERO” en las mitocondrias vecinas. Por lo tanto, aunque la generacion de bajas tasas de ERO es un proceso normal en la mitocondria, la ruptura del flujo de electrones con una generacion excesiva de ERO puede dar como resultado la senescencia, apoptosis y muerte celular. Go and Jones, 2008. Redox compartmentalization in eukaryotic cells. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1273-1290); Zorov, Juhaszova and Sollott. 2006. Mitochondrial ROS- induced ROS release: an update and review. Biochim Biophys Acta 1757 (509-517).

De hecho, estos procesos son directamente relevantes en enfermedades relacionadas con el estres oxidativo mitocondrial, como la enfermedad de Parkinson, la ataxia de Friedreich, la enfermedad de Huntington y la diabetes. Go y Jones, 2008. Redox compartmentalization in eukaryotic cells. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1273-1290); Dringen, Gutterer y Hirrlinger, 2000. Glutathione metabolism in brain Metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem 267 (4912-4916); Chinta y Andersen, 2008. Redox imbalance in Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1362-1367); Cohen, 2000. Oxidative stress, mitochondrial respiration, and Parkinson's disease. Ann N Y Acad Sci 899 (112-120); Lodi, Tonon, Calabrese y Schapira, 2006. Friedreich's ataxia: from disease mechanisms to therapeutic interventions. Antioxid Redox Signal 8 (438-443); McGill y Beal, 2006. PGC-1alpha, a new therapeutic target in Huntington's disease? Cell 127 (465468); Donath, Ehses, Maedler, Schumann, Ellingsgaard, Eppler y Reinecke, 2005. Mechanisms of beta-cell death in type 2 diabetes. Diabetes 54 (Suppl 2) (S108-S113).

Los peroxidos, incluyendo el peroxido de hidrogeno (H2O2), son una de las principales especies reactivas de oxfgeno

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(ERO) que conducen al estres oxidativo. El H2O2 se forma continuamente por diferentes enzimas (que incluyen la superoxido dismutasa, la glucosa oxidasa y la monoamino oxidasa) y debe degradarse para prevenir el dano oxidativo. Se piensa que el efecto citotoxico del H2O2 se causa por radicales hidroxilo generados a partir de reacciones catalizadas por el hierro, causando un posterior dano del ADN, de las protemas y de los lfpidos de la membrana. El H2O2 actua como un “sustrato suicida” a altas concentraciones (>100 jM), que lleva a una inactivacion irreversible de la catalasa. Hyslop, Zhang, Pearson y Phebus, 1995. Measurement of striatal H2O2 by microdyalysis following global forebrain ischemia and reperfusion in the rat: Correlation with the cytotoxic potential of H2O2 in vitro. Brain Res 671 (181-186). El H2O2 provoca el agotamiento intracelular de glutation, una molecula que elimina el H2O2 de la celula, lo cual sugiere que el H2O2 entra y, por lo tanto, puede poner en marcha una o mas rutas toxicas en las celulas. Dringen, Pawlowski y Hirrlinger, 2005. Peroxide Detoxification by Brain Cells. J Neurosci Res 79(157-165); Halliwell y Whiteman, 2004. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? British Journal of Pharmacology 142 (231-255); Baud, Greene, Li, Wang, Volpe y Rosenberg, 2004. Glutathione Peroxidase-Catalase Cooperativity Is Required for Resistance to Hydrogen Peroxide by Mature Rat Oligodendrocytes. J Neurosci 24(1531-1540).

Las celulas tambien sintetizan moleculas antioxidantes y poseen mecanismos para reciclarlas. El glutation (GSH) es una de las principales protemas implicadas en la maquinaria antioxidante que elimina H2O2 junto con su forma oxidada GSSg y las enzimas relacionadas glutation peroxidasa (GPx), glutation reductasa (GR), glutarredoxina y NADPH/NADP+. Varios estudios que emplean modelos de cultivo celular respaldan el papel crucial que juega el GSH en la mitocondria como un efecto protector en la muerte celular apoptotica. En la apoptosis, muerte celular programada, la oxidacion del GSH/GSSG mitocondrial estimula el agotamiento del GSH, dando como resultado un aumento de ERO, lo que sugiere un papel del GSH en el control de la generacion de ERO en las mitocondrias. Dringen, Pawlowski Hirrlinger, 2005. Peroxide Detoxification by Brain Cells. J Neurosci Res 79(157-165); Dringen, Gutterer Hirrlinger, 2000. Glutathione metabolism in brain. Metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem 267 (4912-4916).

Otra enzima en la maquinaria antioxidante que elimina peroxido de hidrogeno es la catalasa. La catalasa es una enzima citoplasmatica que es de especial relevancia cuando se requiere la eliminacion de H2O2 en concentraciones elevadas. Baud, Greene, Li, Wang, Volpe y Rosenberg, 2004. Glutathione Peroxidase-Catalase Cooperativity Is Required for Resistance to Hydrogen Peroxide by Mature Rat Oligodendrocytes. J Neurosci 24(1531-1540).

Tambien se ha probado que las hMSC poseen los principales mecanismos enzimaticos y no enzimaticos para destoxificar especies reactivas y para corregir el dano oxidativo ocasionado en el proteoma y genoma que asegure un manejo eficiente de las ERO (Valle-Prieto y Conget, 2010. Human Mesenchymal Stem Cells efficiently manage oxidative stress. Stem Cell Dev 19, 1885-1893). Si este potencial se mantiene in vivo, las hMSC podnan tambien contribuir a una regeneracion de tejido que limita el dano en el tejido inducido por las ERO.

Algunos intentos exitosos por modificar de la smtesis de enzimas implicadas en la eliminacion de ERO describen que las celulas estromales de la medula osea (BMMSC, del ingles, Bone Marrow Stromal Cells) humana cultivadas en presencia de ascorbato expresan niveles mas elevados de superoxido dismutasa, catalasa y glutation (Stolzing and Scutt, 2006. Effect of reduced culture temperature on antioxidant defenses of mesenchymal stem cells. Free Radic Biol Med 41(326-338). Ademas, en el artmulo Ebert, Ulmer, Zeck, Meissner-Weigl, Schneider, Stopper, Schupp, Kassem y Jacob, 2006. Selenium supplementation restores the antioxidative capacity and prevents cell damage in bone marrow stromal cells in vitro. Stem Cells 24(1226-1235). Los autores describen el incremento de la capacidad antioxidante basal de dichas BMMSC, modificando las condiciones de cultivo celular mediante la complementacion con selenio o la disminucion de la temperatura. Stolzing y Scutt (2006) publicaron que la reduccion de la temperatura en estas BMMSC no afecta a su viabilidad, pero que incrementa su diferenciacion. Por el contrario, las celulas madre obtenidas de forma directa a traves del metodo de tratamiento de la presente invencion, celulas denominadas HC016, no presentan evidencias de diferenciacion, manteniendo su fenotipo indiferenciado, y tambien su viabilidad.

Ademas, Ebert et al. demostraron que la complementacion con selenio del medio de cultivo de BMMSC con 100 nM de selenito sodico incrementa de forma exclusiva la actividad de enzimas intracelulares dependientes de selenio, como son la glutation peroxidasa (GPx) y la tiorredoxina reductasa (TrxRs). Por el contrario, las celulas HC016 mantienen su viabilidad, capacidad proliferativa y fenotipo indiferenciado, y tambien activan genes que codifican para enzimas independientes de selenio claves para la destoxificacion de ERO, como son las superoxido dismutasas (SOD) y la catalasa (Cat). Ademas, las HC016 incrementan los niveles intracelulares de GSH.

En conclusion, las celulas HC016 obtenidas directamente del metodo de tratamiento de la presente invencion muestran una serie de ventajas con respecto a las celulas madre usadas en el estado de la tecnica, que hace que las celulas HC016 sean especialmente idoneas para actuar ante situaciones de estres oxidativo. Estas ventajas son fundamentalmente 1) la generacion de un agrupamiento intracelular superior de la molecula destoxificadora GSH, 2) una expresion superior e incrementada de los genes que codifican para enzimas implicadas en la eliminacion de

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especies reactivas de ox^geno, 3) una nueva conformacion del citoesqueleto y, por lo tanto, y consecuentemente, una mayor capacidad de migracion hacia zonas danadas, y 4) una mayor expresion de factores de crecimiento relacionados con los procesos de regeneracion tisular.

Estos efectos adquiridos por las HC016, aumentan sus defensas intracelulares y extracelulares frente a las ERO, sin producir modificaciones en cuanto a su viabilidad y estado de diferenciacion.

El documento WO 2010/150094 describe un metodo para la diferenciacion in vitro de celulas madre mesenquimales en adipocitos y su uso como terapia celular. El metodo descrito consiste en el cultivo de estas celulas en condiciones de hipoxia.

El documento W02007/030870 proporciona un metodo para la diferenciacion de celulas madre, mas precisamente, celulas embrionarias humanas (celulas hES), en cardiomiocitos y progenitores neurales mediante el cultivo de celulas hES en presencia de un medio sin suero, que adicionalmente incluye prostaglandina o una molecula inhibidora de la p38MAP quinasa.

Como consecuencia existe una importante necesidad en el estado de la tecnica de generar metodos de obtencion de celulas madre mesenquimales con mecanismos enzimaticos y no enzimaticos propios mejorados o aumentados para eliminar especies reactivas de oxfgeno, y en consecuencia, generar celulas que puedan usar con una mayor eficacia en las terapias celulares de enfermedades asociadas al estres oxidativo.

Objeto de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo de tratamiento de celulas madre mesenquimales derivadas de un tejido adiposo, y tambien al uso de dichas celulas madre mesenquimales tratadas previamente para el tratamiento de enfermedades asociadas y causadas por el estres oxidativo.

Las celulas madre de la presente invencion se pueden obtener de distintas fuentes, entre otras, tejido adiposo, medula osea, cordon umbilical y/o placenta, pero preferentemente, si bien preferentemente la presente invencion se realiza a partir de celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano, ASC.

En un aspecto de la presente invencion, las enfermedades que se considera que estan asociadas a y causadas por el estres oxidativo, o condiciones de estres degenerativo debido a componentes mediados por especies reactivas de oxfgeno son aquellas seleccionadas del grupo que consiste en: periarteritis nodosa, diabetes mellitus, enfermedades granulomatosas cronicas, arteriosclerosis, fibrosis pulmonar (enfermedad pulmonar obstructiva cronica, EPOC, fibrosis pulmonar idiopatica), smdrome de isquemia-reperfusion, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, enfermedad inflamatoria intestinal: colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, smdrome de distres respiratorio del adulto, ictus, lesion medular, lesiones en nervios perifericos, esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Huntington, esclerosis multiple, ataxia de Friedreich, periodontitis, enfermedades de las mucosas, enfermedades y lesiones que coexisten con un componente inflamatorio, heridas y ulceras agudas y cronicas.

El ambiente oxidativo presente en estas patologfas, induce el mantenimiento e incluso la intensificacion del proceso inflamatorio en la zona danada. Este fenomeno es uno de los factores que dificultan la recuperacion del tejido, que no es capaz de responder frente a la gran cantidad de ERO que se produce. Las celulas madre mesenquimales tratadas con el metodo de la presente invencion, adquieren una mayor capacidad de supervivencia en el ambiente oxidativo que se produce en las patologfas enumeradas anteriormente. Este hecho produce un incremento en la disponibilidad de los factores solubles de las celulas vivas que promueve la recuperacion del tejido danado.

Por tanto, un aspecto de la presente invencion es un metodo de tratamiento de celulas madre mesenquimales que incluye la obtencion y aislamiento de celulas madre mesenquimales de un donante humano y el cultivo de las celulas en un medio de tratamiento definido.

Un aspecto preferente de la presente invencion es la aplicacion del metodo de tratamiento anterior a celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo.

Tambien es un aspecto de la presente invencion un metodo para la modificacion funcional de celulas madre mesenquimales, para promover su supervivencia y aumentar su capacidad para producir moleculas implicadas en la destoxificacion de especies reactivas del oxfgeno.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a celulas madre mesenquimales obtenidas con el metodo de tratamiento de la presente invencion que presentan una expresion superior e incrementada de los genes implicados

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en la destoxificacion de especies reactivas de ox^geno, y/o niveles intracelulares superiores de GSH y/o cambios de conformacion en el citoesqueleto y/o un aumento en su capacidad de migracion celular, en comparacion a las celulas madre mesenquimales no tratadas con el metodo de preacondicionamiento de la invencion.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere al uso de las celulas madre mesenquimales tratadas segun la presente invencion que presentan niveles intracelulares superiores de GSH, mas preferentemente, una actividad superior e incrementada en los genes implicados en la eliminacion de especies reactivas de oxfgeno, seleccionados del grupo que consiste en: SOD1 superoxido dismutasa citoplasmatica, SOD2 superoxido dimutasa 2 mitocondrial, SOD3 superoxido dismutasa 3 extracelular, Cat calatasa, GPx glutation peroxidasa y GR glutation reductasa, mas preferentemente, una diferente conformacion del citoesqueleto y una mayor expresion del gen que codifica la beta- actina, asf como del factor de crecimiento IGF-1, como composiciones/reactivos terapeuticos en una terapia celular para el tratamiento de enfermedades causadas por o relacionadas con el estres oxidativo.

La presente invencion tambien se refiere al uso de las celulas mesenquimales de la presente invencion administradas en una zona adyacente al tejido danado, y/o en el epicentro de la lesion.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. Capacidad proliferativa determinada mediante el metodo MTT, de las ASC, HC016 (A), HOG y HOG tratadas mediante el metodo de la invencion (B), sometidas a un ambiente oxidativo (100 |iM). Como se puede observar, las celulas HC016 tienen un aumento significativo en la proliferacion celular cuando se estresan en un ambiente oxidativo. Este efecto no se produce cuando se aplica el mismo tratamiento a otras celulas como las celulas HOG. El asterisco indica p<0,05 en una prueba t de Student (Ejemplo 3).

Figura 2. Analisis cinetico de los niveles intracelulares de especies reactivas del oxfgeno en las celulas ASC, HC016, HOG y HOG tratadas con el metodo de la invencion. Este analisis muestra que solo las celulas HC016 disminuyen de forma significativa los niveles intracelulares de ERO, principalmente cuando se exponen a altas concentraciones de estres oxidativo. Los asteriscos indican diferencia estadfstica significativa segun la prueba de ANOVA de dos vfas (*, P<0,05; **, P<0,01) (Ejemplo 4).

Figura 3. Niveles intracelulares de glutation total (GSHtotal) en las celulas ASC y HC016 (Ejemplo 5). En condiciones de control, sin estres, el tratamiento produce un aumento del 10 % en los niveles basales de GSH de las celulas HC016 con respecto a las ASC.

Figura 4A. Niveles de expresion de genes implicados en la destoxificacion de especies reactivas del oxfgeno en las celulas ASC y HC016 (Ejemplo 6).

Figura 4B. Cuantificacion de la expresion de genes implicados en la destoxificacion de especies reactivas del oxfgeno (SOD1, SOD2, SOD3, Cat, GR, GPx) en las celulas ASC y HC016. Los valores se expresan como la proporcion HC016/ASC (Ejemplo 6).

Figura 5A. Niveles de expresion de genes implicados en la composicion del citoesqueleto (p-Actina) en las celulas ASC y HC016 (Ejemplo 7).

Figura 5B. Cuantificacion de los niveles de expresion de genes implicados en la composicion del citoesqueleto (p-Actina) en las celulas ASC y HC016. El valor se expresa como la propocion HC016/ASC (Ejemplo 7).

Figura 5C. Niveles de expresion del gen que codifica el factor de crecimiento IGF-I en las celulas ASC y HC016 (Ejemplo 7).

Figura 5D. Cuantificacion de la expresion del gen que codifica el factor de crecimiento IGF-I en las celulas ASC y HC016. El valor se expresa como la proporcion HC016/AMSC (Ejemplo 7).

Figura 6. Imagenes de microscopfa de fluorescencia de la inmunoticion con F-actina. Se puede observar un aumento de la presencia de F-actina en las celulas HC016, con respecto a las ASC, y su distribucion en fibras de estres, lo que indica cambios de conformacion del citoesqueleto en las celulas HC016 relacionadas con su mayor capacidad de migracion y capacidad quimiotactica (Ejemplo 8).

Figura 7. Tasa de crecimiento de las celulas HOG tras un ataque con estres oxidativo y efecto de la aplicacion de ACS y HC016 sobre esta tasa de crecimiento. El cocultivo de las celulas HOG estresadas con un ambiente oxidativo junto con las ASC y HC016 aumenta la supervivencia de las celulas HOG.

Sin embargo, solo el cocultivo con las HC016 mantiene este efecto protector a las 48 horas despues de la exposicion de las celulas HOG al ambiente oxidativo. El asterisco indica diferencia estadfstica significativa segun una prueba t de Student (p<0,05) (Ejemplo 9).

Figura 8. Imagenes representativas y grafico de barras cuantitativo que muestran la capacidad significativamente superior de migracion de las celulas HC016, con respecto a las celulas ASC, hacia celulas que sufren un ataque con estres oxidativo (Ejemplo 10).

Figura 9. Tabla con la evolucion de la puntuacion BBB (Basso-Beattie-Bresnahan) de tres grupos experimentales de ratas con una lesion medular que consisten en ratas no tratadas, tratadas con ASC y tratadas con HC016 (Ejemplo 12).

Descripcion detallada de la invencion

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La presente invencion se refiere en un aspecto a un metodo de tratamiento de celulas madre mesenquimales, preferentemente del tejido adiposo, es decir, obtenidas y/o aisladas a partir de tejido adiposo adulto, y mas precisamente de origen animal, preferentemente de un ser humano. Este procedimiento requiere fundamentalmente dos etapas, la primera, la obtencion y aislamiento de celulas madre mesenquimales, y la segunda, una etapa de crecimiento y tratamiento espedfico de las celulas en un medio de tratamiento definido que comprende un agente oxidante.

Obtencion de celulas ASC:

En relacion con esta etapa, el procedimiento comprende en primer lugar la obtencion y aislamiento de celulas

madre mesenquimales.

El origen de las celulas madre mesenquimales puede seleccionarse del grupo que consiste en tejido adiposo, medula osea, cordon umbilical y/o placenta, preferentemente, la presente invencion se realiza a partir de celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano, ASC.

Por lo tanto, preferentemente, en la presente invencion, la fraccion de celulas madre mesenquimales que provienen del tejido adiposo se extrae de lipoaspirados de pacientes humanos sanos con anestesia. El lipoaspirado es donado por los pacientes tras su correspondiente consentimiento informado. Los lipoaspirados despues se lavan con PBS 1x y se digieren con colagenasa tipo I durante 30 minutos a 37 °C y despues se centrifugan para obtener un sedimento celular. Este sedimento se resuspende en tampon de lisis de eritrocitos y la suspension celular purificada se filtra a traves de un filtro de nylon de 100 pm y se centrifuga de nuevo. Tras resuspender las celulas, estas se siembran en recipientes de cultivo, para proceder con la expansion de la colonia celular.

Los procesos de expansion o subcultivo de las colonias celulares que se usan en la presente invencion incluyen la separacion de las celulas de los recipientes de cultivo mediante la incubacion con una solucion de tripsina/EDTA, la centrifugacion de la suspension celular recolectada, la determinacion de la densidad y viabilidad celular y la siembra en nuevos recipientes de cultivo celular.

La recoleccion de celulas en la presente invencion sigue la metodologfa descrita en el estado de la tecnica, tal como se indica en las publicaciones: Yoshimura, Shigeura, Matsumoto, Sato, Takaki, Aiba-Kojima, Sato, Inoue, Nagase, Koshima y Gonda, 2006. Characterization of Freshly Isolated and Cultured Cells Derived From the Fatty and Fluid Portions of Liposuction Aspirates. J Cell Physiol 208(64-76); Almeida, Campa, Alonso-Vale, Lima, Daud y Stocchero, 2008. Fraccion vascular estromal de tejido adiposo. Cir.plast. iberolatinoam. 34 (71-79); Wagner, Wein, Seckinger, Frankhauser, Wirkner, Krause, Blake, Schwager, Eckstein, Ansorge y Ho, 2005. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Experimental Hematology 33 (1402-1416).

Metodo de tratamiento de las celulas. Obtencion de celulas HC016:

Una vez se ha obtenido el numero de celulas adecuado, entre 300.000 - 2.000.000, estas se someten a un

tratamiento que requiere celulas en contacto con una concentracion definida de agente oxidante siguiendo

penodos de tratamiento espedficos.

Como agentes oxidantes se consideran, por ejemplo, los oxidos y/o peroxidos, entre otros, el peroxido de hidrogeno (H2O2), peroxido de calcio (CaO2), peroxido de magnesio (MgO2), peroxido de zinc (ZnO2), peroxido de manganeso (MnO2), peroxido de plomo (PbO2), oxido mtrico (NO), oxido nitroso (N2O), ozono (O3), perborato sodico (NaBO3), dioxido de selenio (SeO2), oxido de plata (Ag2O), sales ferricas como el cloruro ferrico (FeCh), sales de cobre como percarbonato sodico (2Na2CO3), permanganatos como el permanganato potasico (K2Mn2Os), dicromatos como el dicromato potasico (K2Cr2O7), sales de litio, sodio y calcio del acido hipocloroso (HClO-), clorito sodico (NaClO2), acido clorico (HClO3), clorato potasico (KCO3), hidroxido de aluminio (AhOs), hidroxido de aluminio coprecipitado con carbonato de magnesio (MgCO3), trioxido de arsenico (As(OH)3), peroxido de benzoilo ((C6HsCO)2O2), hidroxido de calcio (Ca(OH)2), clorhidrato de clordiazepoxido, oxido cuprico (CuO), oxidos de hierro, oxido de magnesio (MgO), dioxido de magnesio, hidroxido de magnesio (Mg(OH)2), hidroxido de potasio (KOH), hidroxido de sodio (NaOH), oxido de titanio (TiO2), oxido de zinc (ZnO) y otros agentes oxidantes, preferentemente el peroxido de hidrogeno (H2O2) que pertenece al grupo de especies reactivas del oxfgeno (ERO) que es un producto de desecho de la cadena respiratoria mitocondrial y molecula de senalizacion en procesos inflamatorios. Un incremento de H2O2 por encima de ciertos valores de tolerancia induce la muerte celular. Sin embargo, el presente metodo de tratamiento incluye el cultivo de las celulas con H2O2 de forma controlada, es decir con unos penodos y metodologfa controlados y a concentraciones definidas que provocan nuevas funcionalidades y caractensticas en las celulas madre mesenquimales obtenidas de forma directa con este tratamiento.

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Mas precisamente, el metodo de tratamiento desarrollado en la presente invencion incluye cultivar las celulas en un ambiente oxidativo moderado, siguiendo penodos de tratamiento definidos.

En terminos generales, el metodo de tratamiento incluye dos ciclos consecutivos de tratamiento con un intervalo de 48-72 horas, seguido de un tercer ciclo de tratamiento de 24-48 horas en un recipiente experimental.

En detalle, el penodo de tratamiento incluye las siguientes etapas:

a) Primer ciclo: Sembrar las celulas en un recipiente de cultivo y esperar durante un penodo de adaptacion de entre 4 y 8 horas para permitir que las celulas de adhieran y adquieran su morfologfa tipica.

b) Anadir el medio de tratamiento, compuesto por DMEM mas SBF al 10 % y una solucion de H2O2, hasta alcanzar una concentracion final en el intervalo de 0,01 y 0,05 mM.

c) Mantener 48-72 horas en el incubador a 37 °C y a una atmosfera con CO2 al 5 %.

d) Segundo ciclo: Renovar el medio de tratamiento reemplazandolo con DMEM mas SBF al 10 % y una solucion de H2O2, hasta alcanzar una concentracion final en el intervalo de 0,01 y 0,05 mM.

e) Incubar estas celulas 48-72 horas a 37 °C y a una atmosfera con CO2 al 5 %.

f) Tercer ciclo: Renovar el medio de tratamiento reemplazandolo con DMEM mas SBF al 10 % y una solucion de H2O2, hasta alcanzar una concentracion final en el intervalo de 0,01 y 0,05 mM.

g) Incubar estas celulas 24-48 horas a 37 °C y a una atmosfera con CO2 al 5 %.

Tras este penodo de tratamiento, las celulas han modificado sus caractensticas funcionales y morfologicas. A partir de este momento, el acronimo HC016 se implementa ahora para estas celulas.

Las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo preacondicionado obtenidas directamente del metodo de la presente invencion se caracterizan porque estas celulas madre mesenquimales mantienen su fenotipo indiferenciado, presentan un citoesqueleto en el que se organizan los microfilamentos en fibras de estres, presentan un aumento de la expresion del gen de SOD1 de al menos el 30 % con respecto a las ASC no tratadas, medida mediante el metodo de PCR, presentan un aumento de la expresion del gen de SOD2 de al menos el 25 % con respecto a las ASC no tratadas, medida mediante el metodo de PCR, presentan un aumento de la expresion del gen SOD3 de al menos el 50 % con respecto a las ASC no tratadas, medida mediante el metodo de PCR, y presentan un aumento de la expresion del gen de Cat de al menos el 50 % con respecto a las ASC no tratadas, medida mediante el metodo de PcR.

Los medios de cultivo o crecimiento incluyen los componentes habituales conocidos en el estado de la tecnica, estos son, por lo tanto, medios con alta concentracion en glucosa, (DMEM, Invitrogen) a un 85-95 % del volumen total, con suero bovino fetal en concentraciones del 5-15 % del volumen total (Biochrom) y una solucion antibiotica de PSA en una concentracion del 1 % del volumen total (Invitrogen).

Asimismo, el medio de tratamiento usado en el metodo de la invencion descrito anteriormente incluye una alta concentracion de glucosa, (DMEM, Invitrogen) a un 85-95 % del volumen total con suero bovino fetal en concentraciones del 5-15 % del volumen total (Biochrom), una solucion antibiotica de PSA en una concentracion del 1 % del volumen total y peroxido de hidrogeno (H2O2) en concentraciones de entre 0,01 a 0,05 mM del volumen total (Panreac).

Caracterizacion de las celulas HC016 en comparacion con las ACS no tratadas con el metodo de la invencion Como consecuencia del metodo de tratamiento de la invencion, las celulas HC016 de la presente invencion han adquirido y presentan unos niveles de expresion superiores e incrementados de determinados genes implicados en la eliminacion de especies reactivas del oxfgeno, tales como los genes que codifican las siguientes protemas: SOD1 Superoxido dismutasa 1 citoplasmatica, SOD2 superoxido dismutasa 2 mitocondrial, SOD3 superoxido dismutasa 3 extracelular, GPx glutation peroxidasa, GR glutation reductasa y Cat catalasa, en comparacion con las ASC no tratadas con el metodo de la invencion.

SOD1: La enzima superoxido dismutasa 1 es una protema dimerica que tiene cobre (Cu) y zinc (Zn) como cofactores. La SOD1 esta en el citoplasma celular y cataliza la dismutacion del superoxido, un producto de la cadena respiratoria y la enzima xantina oxidasa, en oxfgeno y peroxido de hidrogeno a traves de las siguientes reacciones.

• Cu-Zn(n+1)+-SOD + O2' ^ Cu-Znn+-SOD + O2

• Cu-Znn+-SOD + O2' + 2H+ ^ Cu-Zn(n+1)+-SOD + H2O2.

SOD2: La enzima superoxido dismutasa 2 es una protema tetramerica que tiene manganeso (Mn) como cofactor. La SOD2 se encuentra en las mitocondrias de las celulas y cataliza la dismutacion del superoxido, producto de la cadena respiratoria y la enzima xantina oxidasa, en oxfgeno y peroxido de hidrogeno a traves de las siguientes reacciones.

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• Mn(n+1)+-SOD + O2" ^ Mnn+-SOD + O2

• Mnn+-SOD + O2" + 2H+ ^ Mn(n+1)+-SOD + H2O2.

SOD3: La enzima superoxido dismutasa 3 es una protema homotetramerica que tiene cobre (Cu) y zinc (Zn) como cofactores. La SOD3 se libera al medio extracelular donde se une a la matriz extracelular a traves de heparan sulfato proteoglicano y el colageno tipo I para catalizar la dismutacion del superoxido presente en el medio, generando oxfgeno y peroxido de hidrogeno a traves de las siguientes reacciones.

• Cu-Zn(n+1)+-SOD + O2" ^ Cu-Znn+-SOD + O2

• Cu-Znn+-SOD + O2- + 2H+ ^ Cu-Zn(n+1)+-SOD + H2O2

Cat: La enzima catalasa es una protema tetramerica con cuatro cadenas peptfdicas y cuatro grupos hemo porfirina (hierro, Fe) que esta presente en los peroxisomas de la mayor parte de las celulas aerobias como una enzima clave en la defensa ante el estres oxidativo. La catalasa reacciona con el peroxido de hidrogeno y lo convierte en agua. Aunque su mecanismo no se conoce completamente, su actividad se ha descrito de acuerdo con las siguientes reacciones.

• H2O2 + Fe(III)-E ^ H2O + O=Fe(IV)-E(.+)

• H2O2 + O=Fe(IV)-E(.+) ^ H2O + Fe( 11 I)-E + O2

Chelikani, Fita y Loewen, 2004. Diversity of structures and properties among catalases. Cell Mol Life Sci 61(192— 208).

GPx: La enzima glutation peroxidasa es una de las pocas protemas conocidas en vertebrados superiores que contienen selenocistema. La GPx se encuentra principalmente en el citoplasma e interviene en la destoxificacion del peroxido de hidrogeno generado por la superoxido dismutasa y la monoamino oxidasa mediante catalizacion de H2O2 que se une a moleculas de glutation reducido (GSH).

GR: La enzima glutation reductasa es una protema flavoprotema homodimerica. La GR pertenece a la familia piridin nucleotido-disulfito oxidorreductasa de clase I. Esta enzima participa en un ciclo fundamental en la defensa antioxidante. Su actividad consiste en reducir el glutation oxidado (GSSG) a su forma sulfhidrilo (GSH), el cual es una molecula principal en la defensa antioxidante.

cadeiKiiespuatoiia xantiua oxidasa

O,

imagen1

El aumento de la expresion de los genes implicados en la destoxificacion de ERO, ha sido cuantificada con respecto a las celulas ASC no tratadas, confirmando que las celulas HC016 presentan un aumento en la expresion del gen de SOD1 de al menos el 30 %, preferentemente el 53 %, un aumento en la expresion del gen de SOD2 de al menos el 25 %, preferentemente el 37 %, un aumento en la expresion del gen SOD3 de al menos el 50 %, preferentemente el 77 % y/o un aumento en la expresion del gen de Cat de al menos el 50 %, preferentemente el 78 %.

La metodologfa usada para cuantificar la expresion superior de genes de HC016 con respecto a las ASC, ha sido el siguiente: lisis celular, extraccion y purificacion del ARNm de cada grupo experimental siguiendo el protocolo incluido y descrito en el kit comercial de filtros de membrana SuperScript-III® First Strand. Se emplea un volumen de ARNm como molde para generar ADNc mediante la tecnica de reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) siguiendo los reactivos y protocolos incluidos en el kit Pure Link™ RNA Micro Kit. Los volumenes

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correspondientes del ADNc de cada grupo experimental se procesan con una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) que incluye cebadores espedficos que localizan fragmented de ADN presentes en los genes que codifican para la superoxido dismutasa 1, 2 y 3 (SOD1-3), catalasa (Cat), glutation peroxidasa (GPx) y glutation reductasa (GR). Los productos de la PCR de cada grupo experimental se migran mediante electroforesis y se determina el tamano del fragmento amplificado y se cuantifica la intensidad de cada banda. El valor resultante se normaliza con el valor de intensidad de un gen constitutivo definido, la gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa GAPDH.

Ademas, se ha demostrado que las celulas HC016 presentan un nivel superior de GSH intracelular de al menos el 8 %, preferentemente el 10 %, con respecto a las celulas ASC. El metodo utilizado para cuantificar el nivel superior de GSH de las celulas HC016 con respecto a las ASC, ha sido el metodo enzimatico de Tietze, tal como se detalla a continuacion: los grupos experimentales consisten en dos lotes independientes de hASC y HC016. Tras el tratamiento, se recolectan las celulas, se extraen sus protemas mediante la incubacion de las celulas con un tampon de lisis y la protema total en el sobrenadante se cuantifica siguiendo el protocolo y los reactivos suministrados con el kit de ensayo BioRad DC Protein. En una alteuota diferente del sobrenadante se precipitan las protemas y se transfiere el sobrenadante para la cuantificacion total de GSH y GSSG. Las muestras para los ensayos totales de GSH y GSSG se procesan por triplicado en una placa de 96 pocillos. Para la medicion de GSH, las muestras se incuban con glutation reductasa y despues de esto se mide la absorbancia a 405 nm cada 15 segundos durante 2,5 minutos. Para la medicion de GSSG, las protemas de la muestra purificada se tratan previamente con 2-vinilpiridina, mas tarde con glutation reductasa y finalmente se mide la absorbancia a 405 nm cada 15 segundos durante 30 minutos.

Los valores de absorbancia se extrapolan a una curva estandar generada mediante la repeticion de las mismas etapas descritas anteriormente, pero en lugar de usar muestras de protemas de las celulas, usando con concentraciones conocidas de GSH. Los valores se expresan como nmol/mg de protema. El glutation total se calcula como: GSHtotal _ GSHreducido + 2 GSSGoxidado.

Adicionalmente, las celulas HC016 se caracterizan por presentar unos niveles intracelulares de ERO inferiores en al menos el 10 %, preferentemente el 11 %, mas preferentemente el 15 % en comparacion a las ASC.

El metodo seleccionado para cuantificar la superioridad en los niveles de ERO intracelular de las HC016 con respecto a las ASC, ha sido la cuantificacion fluorimetrica basada en la sonda DCFA: los grupos experimentales consisten en cuatro poblaciones independientes, una de ASC, una segunda de HC016, una tercera de celulas HOG intactas y una cuarta con celulas HOG cultivadas con el mismo tratamiento que genera las HC016 a partir de ASC. Las celulas se lavan con PBS 1x y despues se les anade diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceina (DCFA) 10 pM durante 30 minutos. Posteriormente, se elimina el DCFA y se anade medio reciente. Despues, las celulas se cultivan en un medio oxidante anadiendo H2O2 al medio en un gradiente de concentracion de 0, 0,1, 0,25, 0,5 y 1 mM e inmediatamente despues de esto, se mide la evolucion de los niveles de ERO intracelular cada 5 minutos y por un total de 60 minutos en un fluonmetro lector de placas. Los graficos se representan en unidades arbitrarias de intensidad a lo largo del tiempo (minutos).

Adicionalmente, las celulas HC016 tratadas de acuerdo con el metodo de la presente invencion, presentan una mayor capacidad de migracion. Esta propiedad determina que las HC016 puedan acudir de forma mas eficiente a la zona del dano tisular e iniciar su accion trofica para proteger a las celulas danadas y afectar al control de un ambiente adverso. Esta capacidad de migracion significativamente mayor con respecto a las ASC, se determina mediante cambios de conformacion que se producen en el citoesqueleto de las HC016, y tambien un aumento en el tipo de microfilamentos (beta -actina), que se disponen en el borde de expansion de las celulas. Estas proyecciones de la membrana celular son el sustrato frsico para el movimiento celular durante la migracion. En este sentido, el analisis de la expresion del gen de la beta-actina muestra un incremento en las HC016 del 59 %, con respecto a las ASC (Fig.5 A-B). Ademas, la inmunotincion de la actina polimerizada o F-actina indica cambios morfologicos importantes relacionados con la mayor capacidad de motilidad, como la formacion de fibras de estres, un elemento indispensable en los procesos de migracion. La figura 6 muestra la inmunotincion de F-actina. En esta imagen se observa un incremento de la F-actina organizada en fibras de estres, que es uno de los aspectos cnticos en el proceso de migracion celular (Mitchison et al., 1996). Asimismo, el experimento realizado exclusivamente para analizar la capacidad de migracion celular por medio de camaras de Boyden (Fig. 8, ejemplo 10), muestra que las celulas HC016 tienen una capacidad de migracion 30 veces superior con respecto a las ASC.

Adicionalmente, las celulas HC016, presentan un incremento en la expresion del factor de crecimiento-1 similar a la insulina (IGF-1) del 64 %, con respecto a las ASC (Fig.5 C-D). Estudios previos han mostrado que el IGF-1 interviene de forma relevante en los procesos regenerativos producidos tras un dano. El IGF-1 es un potente factor neurotrofico, que se produce por celulas no neuronales tras un dano en el tejido nervioso, estimulando la regeneracion tisular. El IGF-1 promueve la supervivencia neuronal, el crecimiento de neuritas, la proliferacion de las celulas nerviosas, la mielinizacion y mejora la interaccion axon-celula de Schwann (Apel et al., 2010). Ademas, en

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otros modelos experimentales, se ha demostrado que la aplicacion local de IGF-1, permite la reparacion de musculo esqueletico danado, sin la formacion de tejido cicatricial y un mayor reclutamiento de celulas madre al lugar del dano (Spangenburg E.E. et al., 2010). Por estos motivos, la induccion de la expresion de IGF-1 en las celulas HC016 puede promover la capacidad regenerativa de las ASC, de tal forma que se incremente la capacidad de proliferacion celular, la recuperacion funcional de las celulas del tejido danado y el reclutamiento de celulas madre a la zona del dano, para contribuir al proceso de reparacion.

El metodo seleccionado para analizar la expresion de genes respecto a las ASC ha sido el siguiente: este analisis comparativo requiere de dos grupos experimentales que consisten en celulas ASC y celulas HC016. Una vez el metodo de tratamiento se ha completado, se recolecta cada grupo celular, se lisa, y se extrae y se purifica el ARN, y se procesa para generar ADNc. La reaccion PCR se lleva a cabo incluyendo cebadores espedficos que localizan fragmentos de ADN presentes en los genes que codifican para la p-actina y factor de crecimiento-1 similar a la insulina, IGF-1. Los productos de PCR de cada grupo experimental se migran mediante electroforesis y se determina el tamano del fragmento amplificado y se cuantifica la intensidad de cada banda. El valor resultante se normaliza con el valor de la intensidad de un gen constitutivo definido, el GAPDH.

El conjunto de estos datos indica que el metodo de tratamiento que genera las HC016 induce la smtesis de un agrupamiento de maquinaria molecular intra- y extracelular necesaria para la eliminacion de H2O2 y el control de un ambiente oxidativo adverso. Las celulas HC016 poseen mayor capacidad de migracion para alcanzar la zona del tejido danado y tambien, producen una mayor cantidad de factores troficos que ejercen su efecto en los procesos regenerativos de las celulas del tejido danado y preservan su supervivencia.

Uso de las celulas HC016 en el tratamiento de enfermedades asociadas o derivadas del estres oxidativo.

Tal y como se ha comentado anteriormente, las caractensticas de las celulas HC016 indicadas en el apartado anterior las hacen especialmente adecuadas para el tratamiento de enfermedades causadas por estres oxidativo o condiciones de evolucion degenerativa debido a componentes mediados por especies reactivas de oxfgeno.

Una de las patologfas que afectan al sistema nervioso central y en la que esta implicado el estres oxidativo, ocasionando cambios degenerativos debido a componentes mediados por especies reactivas de oxfgeno, es la lesion medular.

La lesion medular constituye un dano en el tejido nervioso en el que no estan implicados patogenos, y no esta inducido por factores externos ni geneticos. En el punto de la lesion, las consecuencias inmediatas del traumatismo son compresion tisular, hemorragia, edema y agotamiento de oxfgeno y nutrientes en la zona del impacto (Lu, Liang, Chen, Chen, Hsu, Liliang, Lin y Cho, 2004. Injury severity and cell death mechanisms: Effects of concomitant hypovolemic hypotension on spinal cord ischemia-reperfusion in rats. Exp Neurol 185: 120-132; Fehlings y Tator, 1995. The relationships among the severity of spinal cord injury, residual neurological function, axon counts and counts of retrogradely labeled neurons after experimental spinal cord injury. Exp Neurol 132: 220-228). Estos fenomenos biologicos activan dos mecanismos de defensa celular, la muerte celular programada o apoptosis (Yukawa, Lou, Fukui y Lenke, 2002. Optimal treatment timing to attenuate neuronal apoptosis via Bcl-2 gene transfer in vitro and in vivo. J Neurotrauma 19: 1091-1103) y la reaccion inmunitaria innata (Carpentier y Palmer, 2009. Immune influence on adult neural stem cell regulation and function. Neuron 64: 79-92) que se extienden a areas anexas no lesionadas y persisten durante semanas e incluso meses tras la lesion en forma de isquemia tisular e inflamacion, en otras palabras, produciendo un dano secundario (Lu, Liang, Chen, Chen, Hsu, Liliang, Lin y Cho, 2004. Injury severity and cell death mechanisms: Effects of concomitant hypovolemic hypotension on spinal cord ischemia-reperfusion in rats. Exp Neurol 185: 120-132).

Estas dos formas de respuesta tisular se expanden a lo largo de la medula espinal y afectan a tejido inicialmente sano, ya que los mecanismos de los que dispone el tejido nervioso para responder ante sus consecuencias fisiologicas son insuficientes.

La expansion se realiza, en gran medida, a traves de metabolitos reactivos del oxfgeno (MRO) propios de la respuesta inmunitaria innata que ocasionan un estres oxidativo, que en funcion de su intensidad puede inducir la apoptosis (Liu, Liu, y Wen, 1999. Elevation of hydrogen peroxide after spinal cord injury detected by using the Fenton reaction. Free Rad Biol & Medicine 27: 478-482; Yukawa et al., 2002). De estos, el MRO mas abundante es el peroxido de hidrogeno (H2O2) que difunde en el medio extracelular que rodea a las celulas nerviosas y se expande en forma de dano secundario. El H2O2 reacciona y degrada las membranas, protemas y el ADN de las celulas (Braughler y Hall, 1989. Central Nervous System trauma and stroke. I. Biochemical considerations for oxygen radical formation and lipid peroxidation. Free Radic Biol Med. 6: 289-301) y en ultima instancia, induce en ellas una muerte celular programada o apoptosis (Yukawa et al., 2002). El H2O2 tambien es un producto de desecho de las celulas normales, de manera que tienen ciertas defensas ante esta molecula (Phillis, 1994. A “radical” view of cerebral ischemic injury. Prog Neurobiol 42: 441-448). Sin embargo, los niveles de H2O2 que se generan tras la lesion son mas altos que aquellos fisiologicamente tolerables (Hyslop, Zhang, Pearson y Phebus, 1995. Measurement of striatal

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H2O2 by microdialysis following global forebrain ischemia and reperfusion in the rat: Correlation with the cytotoxic potential of H2O2 in vitro. Brain Res 671: 181-186). De entre las celulas nerviosas, los oligodendrocitos, celulas que generan la vaina de mielina que recubre al axon de las neuronas, son mas vulnerables a los MRO ya que poseen menos defensas ante ellos, y contienen moleculas que los convierten en objetivo principal del dano secundario (Dringen R, Pawlowski P y Hirrlinger J. 2005. Peroxide detoxification by brain cells. J Neurosci Res 79: 157-165). Por tanto, ademas de la muerte celular inicial tras el traumatismo, el dano oxidativo debido al posterior H2O2 ocasiona una desmielinizacion persistente de las fibras nerviosas, que reduce la conduccion de la senal nerviosa a traves de estas (Nashmi R y Fehlings MG. 2001. Changes in axonal physiology and morphology after chronic compressive injury of the rat thoracic spinal cord. Neuroscience 104: 235-251).

Otras enfermedades son aquellas seleccionadas del grupo que consiste en: periarteritis nodosa, diabetes mellitus, enfermedad granulomatosa cronica, arteriosclerosis, ictus, fibrosis pulmonar (enfermedad pulmonar obstructiva cronica, EPOC, fibrosis pulmonar idiopatica), smdrome de isquemia-reperfusion, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, artritis reumatoide, lupus eritematoso, enfermedad intestinal inflamatoria: colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, smdrome de distres respiratorio del adulto, arteriosclerosis, lesion medular, lesiones en nervios perifericos, esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Huntington, ataxia de Friedreich, periodontitis, enfermedades de las mucosas, enfermedades y lesiones que coexisten con un componente inflamatorio, heridas y ulceras agudas y cronicas

La administracion de las celulas HC016 a la zona afectada disminuye el nivel de estres oxidativo originado como consecuencia de la activacion de las celulas del sistema inmunitario durante los procesos inflamatorios.

Adicionalmente, la administracion de las celulas HC016 a la zona afectada disminuye los niveles de estres oxidativo que surgen como resultado de la produccion de los MRO tras una hemorragia interna, mejora la secrecion de citocinas paracrinas, interleucinas, quimiocinas, factores troficos y factores de crecimiento, aumenta la supervivencia y proliferacion de otras celulas de mairnfero, disminuye los niveles de MRO extracelulares en la proximidad de las celulas de mai^ero proximas a las HC016 administradas y disminuye los niveles extracelulares de moleculas proinflamatorias de senalizacion tales como TNF-alfa, IL-1beta, etc.

Ademas, las celulas HC016 presentan una capacidad quimiotactica significativamente superior hacia celulas danadas por el H2O2 extracelular, tal y como se demuestra en el Ejemplo 10 de la presente invencion.

El uso de las celulas HC016 incluye la administracion de las celulas mesenquimales previamente tratadas en una zona adyacente al lugar del dano, en vez del epicentro de la lesion, con el fin de limitar la irradiacion del dano tisular, la extension de la lesion y la perdida funcional.

El tejido en la lesion sufre una fuerza compresiva intensa que rompe las membranas de las celulas nerviosas y de las celulas del sistema vascular. Tambien, como consecuencia de la lesion, puede existir una hemorragia debido a la rotura de arterias y venas, una disgregacion de organulos, citoplasma, vesmulas y membranas celulares, hechos que llevan a una necrosis tisular. Estos eventos son inherentes a la lesion. Mas tarde, si estos no se tratan, las moleculas que liberan las celulas necroticas, junto con otras moleculas que liberan las celulas del sistema inmunitario, expandiran el dano a las areas adyacentes a la lesion a traves de moleculas de senalizacion celular tales como el H2O2. La aplicacion de esta terapia basada en celulas mesenquimales esta disenada para disminuir o minimizar la expansion del dano tisular. Por tanto, la aplicacion de la terapia celular sera preferentemente en un area adyacente al lugar de la lesion.

En otro aspecto de la invencion, las celulas tratadas seran aplicadas utilizando una via de administracion que las permita llegar directamente al epicentro de la lesion, con el fin de metabolizar las especies reactivas del oxfgeno en la zona, disminuir el estres oxidativo y controlar el estado inflamatorio, para evitar la situacion de muerte celular masiva en esta zona.

Las vfas de administracion pueden ser: cualquier via parenteral (tales como intraarterial, intravenosa, intralinfatica, intrarraqmdea, epidural, intramedular), subcutanea, intramuscular, intraperitoneal, transdermica (percutanea), intraarticular, intratraqueal, intraalveolar, intratecal, intraocular, conjuntival, intracardiaca, intranasal, vaginal, uretral, cutanea, rectal, sublingual, oral, transmucosa oral. Para llevar a cabo estas aplicaciones, las celulas obtenidas a traves del metodo de la presente invencion se formulan en los vehmulos apropiados y farmaceuticamente aceptables que son ya conocidos para el experto en la materia, dependiendo de la via.

Entre otras cosas, la formulacion proporciona una solucion que, ademas de las celulas HC016, contiene entre otros, Ringer-Lactato, albumina humana (CSL-Behring), etc. que se dispone en viales de vidrio, esteriles y no pirogenicos (Sword Scientific).

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De igual modo, las celulas HC016 pueden ser incorporadas en biomateriales de origen natural y/o sintetico, para la generacion de terapias celulares y de ingeniena tisular, tales como hidrogeles, espumas y materiales polimericos, materiales compuestos, derivados de fosfato calcico y materiales metalicos, que permitan una mejor administracion de las celulas a la zona de lesion y una mayor capacidad de supervivencia y funcionalidad de las mismas, segun sea apropiado.

Tras la administracion de las celulas HC016 a los mairnferos, las celulas mesenquimales migran hacia la zona de lesion, donde activan la proliferacion de las celulas adyacentes a la zona de inyeccion. Preferentemente, estas celulas poseen el mismo fenotipo adyacente al parenquima en el que se ha realizado la inyeccion y son celulas precursoras. Aun mas preferentemente, el fenotipo celular coincide con el de las celulas del parenquima adyacente y con el de las celulas precursoras.

En otro aspecto de la invencion, las celulas mesenquimales HC016 administradas permanecen en el tejido. Ademas, la presencia de celulas mesenquimales administradas en el tejido del paciente no induce una respuesta inmunitaria frente a dichas celulas mesenquimales administradas.

Ejemplos

Ejemplo 1: Obtencion de celulas mesenquimales de tejido adiposo (ASC)

Las celulas madre mesenquimales de tejido adiposo se afslan de tejido humano siguiendo la metodologfa descrita por Yoshimura et al., 2006; Almeida et al., 2008; Wagner et al., 2005.

La fraccion de celulas madre mesenquimales del tejido adiposo se obtienen de lipoaspirados de pacientes sanos con anestesia. El lipoaspirado se lava con PBS 1x y se digiere con colagenasa tipo I durante 30 minutos a 37 °C y despues se centrifuga para obtener un sedimento celular. Este sedimento se resuspende en tampon de lisis de eritrocitos y la suspension celular purificada se hace pasar a traves de un filtro de 100 pm y se centrifuga de nuevo. Tras resuspender las celulas, estas se siembran en medios de cultivo para la expansion celular.

Las celulas se cultivan como cultivos primarios durante un penodo de 5 dfas en un medio de crecimiento compuesto por DMEM (Invitrogen) con suero fetal de ternera al 10 % (Biochrom) y PSA antibiotico-antimicotico al 1 % (Invitrogen) en el incubador a 37 °C y CO2 al 5 %.

Consecutivamente, las celulas se expanden cuando adquieren semiconfluencia. Para este proceso, las celulas se separan de la superficie de cultivo usando una solucion de tripsina/EDTA al 0,05 %, se centrifugan y se resuspenden en medio reciente. La densidad y viabilidad celular se determinan en la suspension celular obtenida y se siembra en una nueva superficie de cultivo celular.

Ejemplo 2: Aplicacion del tratamiento de la invencion a las celulas ASC: Obtencion de las celulas HC016

Se sembraron 350.000 celulas de un subcultivo de celulas ASC en un recipiente de cultivo T25 con 5 ml de medio de crecimiento con la siguiente composicion: DMEM (Invitrogen) con un suero fetal de ternera al 10 % (Biochrom) y PSA antibiotico-antimicotico al 1 % (Invitrogen) y se introduce el soporte con las celulas en el incubador a 37 °C y CO2 al 5 % hasta su adherencia.

Primer ciclo: se anade el medio de tratamiento que contiene la siguiente composicion: DMEM (Invitrogen) con suero fetal de ternera al 10 % (Biochrom), PSA antibiotico-antimicotico al 1 % (Invitrogen) y H2O2 al 0,01 % (Panreac). Se incuban estas celulas en este medio durante 48 horas.

Segundo ciclo: Despues de 48 horas se obtienen las celulas y se siembran de nuevo 350.000 celulas en un segundo recipiente de cultivo T25 y se incuba durante 4 horas a 37 °C y CO2 al 5 % hasta su adherencia. Consecutivamente, se anade el medio de tratamiento y se incuban estas celulas durante 48 horas.

Tercer ciclo: Despues de estas 48 horas se obtienen las celulas y se siembran de nuevo 350.000 celulas en un tercer recipiente de cultivo T25 y se incuba durante 4 horas a 37 °C y CO2 al 5 % hasta su adherencia. Consecutivamente, se anade el medio de tratamiento y se incuban estas celulas durante 48 horas.

Transcurridas estas 48 horas, las celulas ASC tratadas pasan a renombrarse como HC016.

Ejemplo 3: Analisis comparativo de la proliferacion de las celulas HC016 con respecto a las ASC.

El analisis de la proliferacion se realizo en los siguientes cuatro grupos celulares experimentales: ASC, celulas

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HC016, celulas HOG intactas y celulas HOG cultivadas con tratamiento de la invencion que generan las HC016.

Las celulas HOG son celulas humanas procedentes de un oligodendroglioma y son consideradas como un modelo oligodendroglial experimental del linaje neural. Las celulas HOG se cultivan indiferenciadas con capacidad proliferativa y antecedentes geneticos oligodendrogliales.

Las ASC se cultivan con la metodologfa y el medio de crecimiento definido y descrito en el Ejemplo 1 para generar la poblacion celular para este experimento. Se genera un lote del mismo numero de celulas HC016 segun el Ejemplo 2. La poblacion de celulas HOG se genera mediante los metodos para las ASC y HC016 de acuerdo con el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2, respectivamente.

Una vez preparadas las cuatro poblaciones celulares, se siembran las celulas en placas de 96 pocillos con medio de crecimiento hasta que estas quedan adheridas al pocillo. A continuacion, las celulas se cultivan en ambiente oxidativo, mediante la exposicion a H2O2 0,1 mM. La proliferacion se mide siguiendo los protocolos y reactivos incluidos del ensayo de proliferacion celular por MTT en diferentes tiempos: 0, 24, 48 y 72 horas. De acuerdo con el fabricante del kit, este ensayo genera una estimacion colorimetrica de la proliferacion celular, y por lo tanto, este parametro se analiza y compara en los cuatro tipos celulares.

Los graficos se representan en unidades arbitrarias de intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo (horas). Resultados

La capacidad proliferativa de las HC016 es 1,23 veces superior a la de la poblacion control de ASC a las 72 horas despues del estimulo oxidativo (aumento del 23 %)(prueba t de Student p<0,05; n=3 muestras) (Fig. 1A). Este efecto no se comparte por otras celulas humanas, los oligodendrocitos HOG (Fig. 1B). El tratamiento de la presente invencion es efectivo en las ASC, pero puede no ser fectivo en otros tipos celulares como los oligodendrocitos HOG.

Ejemplo 4: Niveles intracelulares de especies reactivas de oxfgeno en las celulas HC016.

El analisis de los niveles intracelulares de especies reactivas de oxfgeno se realiza en cuatro grupos celulares experimentales: ASC, HC016, celulas HOG intactas y celulas HOG cultivadas con el tratamiento de la invencion que genera las HC016.

Una vez preparadas las cuatro poblaciones celulares, se siembran las celulas en placas de pocillos con medio de crecimiento hasta que estas quedan adheridas al pocillo. Despues, las celulas se lavan brevemente con PBS 1x, despues el PBS se reemplaza por 100 pl de PBS 1x con la sonda diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFA) 10 pM y se incuban las celulas durante 30 minutos. Posteriormente se elimina el DCFA y se anade medio reciente. Despues, las celulas se cultivan en un medio H2O2 a diferentes concentraciones: 0, 0,1, 0,25, 0,5 y 1 mM. Se mide la evolucion en el tiempo de los niveles intracelulares de MRO con medidas cada 5 minutos y por un total de 60 minutos en un fluonmetro lector de placas. Los rangos de las longitudes de onda de excitacion/emision son 485/538 nm.

Los graficos se representan en unidades arbitrarias de intensidad a lo largo del tiempo (minutos).

Resultados

Transcurridos 55 minutos tras haberse expuesto a un gradiente de H2O2, las celulas HC016 contienen niveles de MRO intracelulares significativamente menores que las celulas ASC (11 % inferior); prueba ANOVA de dos vfas P<0,031 y (15 % inferior); prueba ANOVA de dos vfas (P<0,039, respectivamente) (Fig. 2). El tratamiento que genera las HC016 a partir de las ASC no induce la misma respuesta en otras celulas de mairnfero como las celulas oligodendrogliales hOg (Fig. 2). Ademas, la presencia de niveles intracelulares inferiores de ERO en las celulas HC016, indica de forma indirecta, que los niveles extracelulares de esta molecula tambien disminuyen, por lo que las celulas HC016 tienen una mayor capacidad de eliminar el peroxido de hidrogeno de su entorno, convirtiendolas en celulas con una mayor capacidad destoxificante del H2O2 en el lugar de aplicacion como terapia celular.

Ejemplo 5: Niveles intracelulares de glutation total (GSH).

Los grupos experimentales consisten en dos lotes independientes de ASC y HC016. Las ASC se han cultivado con la metodologfa y los medios descritos anteriormente. Las ASC se han extrafdo y aislado del tejido adiposo humano usando los metodos descritos y se han subcultivado en medio de crecimiento hasta que se obtuvo la poblacion celular necesaria para este experimento. Tambien se genera un lote de HC016 con el mismo numero de celulas con la metodologfa de la invencion.

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Tras la etapa de condicionamiento celular, las celulas se recogen mediante la digestion con tripsina/EDTA al 0,05 %, las protemas se extraen mediante la incubacion de las celulas con un tampon de lisis (inhibidor de proteasa, EDTA y Triton X-100 en tampon de fosfato de sodio a pH 7,5) y la protema total en el sobrenadante se cuantifica siguiendo el protocolo y los reactivos suministrados con el kit de ensayo BioRad DC Protein.

En otra almuota del sobrenadante se precipitan las protemas con acido sulfosalidlico al 5 % y se centrifugan, y los peptidos de bajo peso disueltos en el sobrenadante se transfieren para los ensayos del GSH y GSSG totales.

Las muestras para los ensayos de GSH y GSSG totales se procesan por triplicados en una placa de 96 pocillos. Para la medicion de GSH, las muestras contienen el 5 % de protema purificada, el 45 % de agua destilada y el 50 % de tampon de reaccion (EDTA 0,2 M, DTNB 1,2 mg/100 pl, 3,6 mg de NADPH y 4,5 unidades de glutation reductasa en tampon de fosfato de sodio 0,1 M a pH 7,5). Despues se mide la absorbancia a 405 nm cada 15 segundos durante 2,5 minutos. Para la medicion del GSSG, las muestras de protema purificada se pretratan con 2-vinilpiridina en una relacion 96,3 % / 3,7 %; (protema/reactivo) y se incuban durante 1 hora a 4 °C. Despues, las muestras se preparan conteniendo un 10 % de la muestra pretratada, un 40 % de agua destilada y un 50 % de tampon de reaccion (EDTA 0,2 M, DTNB 1,2 mg/100 pl, 3,6 mg de NADPH y 4,5 unidades de glutation reductasa en tampon fosfato sodico 0,1 M a pH 7,5). Despues, se mide la absorbancia a 405 nm cada 15 segundos durante 30 minutos.

Los valores de absorbancia se extrapolan a una recta patron generada mediante la repeticion de las mismas etapas con concentraciones conocidas de GSH. Los valores se expresan como nmol/mg de protema. El GSH total se calcula como GSH + 2GSSG.

Resultados

Las celulas HC016 muestran un mayor contenido basal en GSH total con respecto a las ASC (Fig. 3) (10 % superior). La presencia de estos niveles superiores de GSH total intracelular en las celulas HC016 confirma tambien la mayor capacidad superior de destoxificacion de agentes toxicos de estas celulas, confiriendoles una mayor resistencia ante el estres ambiental o ante el incremento de la actividad metabolica celular.

Ejemplo 6: Niveles de expresion de genes implicados en la destoxificacion de metabolitos reactivos de oxfgeno.

Este analisis comparativo requiere dos grupos experimentales que consisten en celulas ASC y HC016. Las ASC convencionales son cultivadas con la metodologfa y los medios descritos anteriormente para obtener la poblacion celular necesaria para esta experimentacion. Se genero un lote de celulas HC016 aplicando el metodo ya descrito en el ejemplo 2.

Una vez que se ha completado el procedimiento de condicionamiento, se recolecta cada grupo celular del recipiente de cultivo celular mediante digestion con tripsina/EDTA. Las celulas se lisan y el ARNm total de cada grupo se extrae por separado y se purifica empleando un sistema de filtros de membrana comercialmente disponible que retiene fragmentos de membranas celulares y protemas. El ARNm eluido se convierte a ADNc mediante la tecnica de reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) siguiendo un protocolo establecido y el reactivo incluido en el kit comercial (Pure Link™ RNA Micro Kit; Invitrogen; Ref. 911811). Los volumenes correspondientes del ADNc obtenido de cada grupo experimental se mezclan con los volumenes y concentraciones adecuadas para realizar una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) que incluye secuencias cebadoras disenadas que se unen a fragmentos espedficos de ADNc localizados en regiones de exones de los genes de las superoxido dismutasa 1, 2 y 3, de la catalasa, de la glutation peroxidasa y de la glutation reductasa. Los productos de la PCR de cada grupo experimental se migran en un gel de agarosa mediante la tecnica de electroforesis (agarosa al 4 % en tampon TAE 1x) mas un volumen de concentracion definida de un reactivo comercial que tine el ADN (SYBR Safe DNA gel stain; Invitrogen; Ref. S33102). Los geles son transiluminados con luz UV y se obtiene densidad optica mediante un sistema de imagen digital para medir la densidad optica de cada banda de migracion. El valor de la densidad optica de cada banda de cada grupo experimental y cada gen seleccionado se sustrae y se normaliza al valor de la densidad optica de una expresion de genes constitutivos definida.

Resultados

Los niveles de expresion de los genes implicados en metabolismo oxidativo de las celulas HC016 son diferentes a los de las ASC (Fig. 4A). La cuantificacion de la expresion de los diferentes genes muestra que las celulas HC016 preentan un aumento del 53 % del gen de SOD1 con respecto a las ASC, el 37 % del gen de SOD2, el 77 % del gen SOD3, el 78 % del gen de Cat, el 18 % del gen de GR y el 16 % del gen de GPx (Fig. 4B). Estos resultados permiten concluir que las celulas HC016 presentan una mejora en las defensas antioxidantes intra y extracelulares con respecto a las ASC (Fig. 4A).

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Ejemplo 7: Niveles de expresion de genes y protemas implicados en citoesqueleto y la secrecion de factores de crecimiento.

Este analisis comparativo requiere dos grupos experimentales que consisten en celulas ASC convencionales que se cultivan con la metodologfa y los medios descritos anteriormente para obtener la poblacion celular necesaria para esta experimentacion, y un lote de un numero similar de celulas HC016 que se genera con la metodologfa descrita en el ejemplo 2. Como en el Ejemplo 6, cuando el proceso de acondicionamiento ha terminado, se recolecta cada grupo celular mediante digestion con tripsina/EDTA, se lisan las celulas, se extrae el ARNm por separado y se purifica, y el ARNm se convierte en ADNc. La PCR se realiza con el ADNc que incluye secuencias cebadoras disenadas para unirse a fragmentos espedficos de ADNc situados en regiones de exones de los genes de la p- actina y el IGF-1. Como en el Ejemplo 6, los productos de la PCR de cada grupo experimental se migran en un gel de agarosa mediante la tecnica de electroforesis. La densidad optica de cada banda de migracion se mide y a su valor se le sustrae el valor de fondo y se normaliza al valor de densidad optica de la expresion de un gen constitutivo definido, GADPH.

Resultados

Los niveles de expresion de los genes asociados con los componentes del citoesqueleto y los factores de crecimiento en las celulas HC016 cuando se compara con las ASC (Figs. 5A y C). La cuantificacion de la expresion de los diferentes genes muestra que las celulas HC016 presentan un aumento del 59 % del gen de la p-actina (Fig. 5B) y un aumento del 64 % del gen de IGF-I con respecto a las ASC (Fig. 5D).

Ejemplo 8: Composicion y distribucion de moleculas del citoesqueleto.

Este analisis comparativo requiere dos grupos experimentales que consisten de nuevo en celulas ASC convencionales que se cultivan con la metodologfa y los medios descritos anteriormente para obtener la poblacion celular necesaria para esta experimentacion, y un lote de un numero similar de celulas HC016 que se genera con la metodologfa descrita en el ejemplo 2.

Las celulas de ambas poblaciones se siembran en placas de 24 pocillos con el medio y la metodologfa descrita anteriormente. Una vez que se adhieren las celulas, se elimina el medio y se lavan brevemente las celulas con PBS 1x. Despues, se fijan las celulas con formaldelddo al 4 % en PBS 1x durante 12 minutos, se permeabilizan con Triton X-100 al 0,1 % en PBS 1x durante 10 minutos a 4 °C, se lavan de nuevo en PBS 1x y se incuban con 100 |jg/ml de Faloidina-FITC (Sigma-Aldrich; Ref. P5282) en PBS 1x durante 1 hora a temperatura ambiente («23 °C). Despues, las celulas se lavan exhaustivamente con PBS 1x, se tinen los nucleos con 10 jg/ml de Hoechst 33258 (Invitrogen; Ref. H1398) y finalmente se cubren con una fina capa de Fluoromont-G (Southern Biotech; Ref. 010001) y se visualizan con un microscopio de fluorescencia.

Resultados

El citoesqueleto de las celulas HC016 tiene mas filamentos de F-actina y mas densos que los de las celulas ASC, y se organizan en fibras de estres. La observacion de las celulas ASC y HC016 al microscopio muestran cualitativamente que las celulas HC016 poseen mas filamentos de F-actina y mas densos que las ASC (Fig. 6), lo que confiere un citoesqueleto mas robusto y mas preparado ante una posible remodelacion estructural. En el Ejemplo 7 se muestra la cuantificacion de la expresion del gen que codifica los monomeros de F-actina y p-actina (Fig 5A-B). Ambos dos resultados indican el aumento de la smtesis de F-actina, y este ultimo resultado, el efecto sobre el citoesqueleto celular.

Ejemplo 9: Capacidad de proteccion de las celulas de linaje neural con las celulas HC016.

Los grupos experimentales consisten en celulas oligodendrogliales HOG control sin ningun tipo de modificacion en su proceso normal de cultivo, celulas HOG cultivadas en un medio oxidativo, cocultivo de ASC con celulas HOG en un ambiente oxidativo y cocultivo de celulas HC016 con celulas HOG en un ambiente oxidativo.

Las celulas HOG son celulas de oligodendroglioma humano consideradas como un modelo oligodendroglial experimental del linaje neural. Las celulas HOG se cultivan indiferenciadas con capacidad proliferativa y fondo genetico oligodendroglial.

Se generan poblaciones de celulas ASC y HC016 con numero de celulas similar con los metodos descritos en el Ejemplo 1 y 2. El dfa del experimento se recolectan las celulas mediante digestion con tripsina/EDTA al 0,05% para incluirse en el sistema de cocultivo in vitro basado en las camaras de Boyden incluidas en placas de 24 pocillos

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(insertos de las placas transpocillo) que evitan el contacto ffsico entre las dos poblaciones celulares.

El d^a del experimento los oligodendrocitos se siembran y se adhieren al fondo de la placa de 24 pocillos y se cultivan en un medio oxidativo durante 1 hora anadiendo 0,5 ml de H2O2 0,5 mM en el medio de cultivo. Tras el ataque oxidativo, el medio se reemplaza por medio de cultivo reciente y se cultivan en un medio compuesto por DMEM que contiene el 10 % de suero bovino fetal y antibioticos a 37 °C.

En una siguiente etapa, en las situaciones de cocultivo, las celulas ASC o las HC016 se incluyen sembradas en una camara de Boyden (insertos de las placas de transpocillo) como corresponde con los grupos experimentales descritos anteriormente.

Hasta un penodo de 24 y 48 horas, la viabilidad oligodendroglial se cuantifica por el metodo de exclusion de azul de tripano.

La tasa de crecimiento (TC) se calcula como: % celulas vivas - % celulas muertas. La tasa de crecimiento de las HOG oxidadas con respecto a las HOG normales se calcula como: TChog oxidadas/TCHOG control.

Los valores resultantes se normalizan con respecto a las HOG oxidadas y se representan como porcentajes en graficos de barras.

Resultados

Transcurridas 48 horas tras el estimulo oxidativo sobre las celulas HOG, las celulas cocultivadas con celulas HC016, presentan una tasa de crecimiento normalizada con respecto a las HOG oxidadas de un 21 % superior (Fig. 7) con respecto a las celulas HOG cocultivadas con las ASC. Mientras que a las 24 horas ambos tipos celulares favorecen la viabilidad de las HOG oxidadas en igual medida (Fig. 7), a medio plazo las celulas HC016 presentan un efecto mas duradero sobre las HOG oxidadas. Por este motivo, la aplicacion de estas celulas como terapia celular in vitro presenta mas beneficios con respecto a la terapia convencional con las ASC, puesto que las celulas HC016 permiten mejorar y aumentar el efecto en el tiempo, en relacion con las ASC, sobre otros tipos celulares en condiciones de estres, como se produce en condiciones de dano tisular, en las enfermedades referidas en este documento.

Ejemplo 10: Capacidad de migracion de las HC016 hacia las celulas de senalizacion de inflamacion/estres oxidativo.

Los grupos experimentales consisten en celulas oligodendrogliales control sin ninguna modificacion en el procedimiento de cultivo, celulas oligodendrogliales cultivadas en un ambiente oxidativo, cocultivo de ASC con celulas oligodendrogliales cultivadas en un ambiente oxidativo y cocultivo de HC016 con celulas oligodendrogliales en un ambiente oxidativo.

Para analizar la capacidad de migracion de las celulas ASC y HC016, se genero un modelo de estres oxidativo con celulas de mairnfero de ensayo (celulas oligodendrogliales) cuya proliferacion y viabilidad es sensible a las condiciones de estres oxidativo. El modelo de estres oxidativo consiste en celulas HOG oligodendrogliales sembradas y adheridas a la base de una placa de 24 pocillos y cultivadas en un ambiente oxidativo durante 1 hora anadiendo 0,5 ml de H2O2 0,5 mM al medio de cultivo. Tras el ataque toxico, el medio se reemplaza con medio de cultivo reciente y se cultiva con un medio compuesto de DMEM que contiene suero fetal bovino al 10 % y antibioticos a 37 °C.

En una siguiente etapa, en las situaciones de cocultivo, se incluyen las celulas ASC o HC016 sembradas en una camara de Boyden (insertos de camara de transpocillo) tal como corresponde a los grupos experimentales descritos anteriormente.

Hasta un penodo de 24, 48 y 72 horas, los insertos transpocillo se lavan con PBS 1x y se fijan con formaldehndo al 4 % en PBS 1x durante 12 minutos. Las celulas en la superficie superior de la membrana transpocillo se eliminan con un bastoncillo de algodon de Q-tip y las celulas restantes se tinen con una solucion de violeta de cresilo al 0,1 % durante 1 hora a temperatura ambiente («23 °C). Despues, se lavan bien con PBS 1x y finalmente se cortan de los insertos, se montan sobre portaobjetos cubiertos con una fina capa de medio de montaje DPX (Sigma-Aldrich; Ref. 44581) y se visualizan al microscopio. Las membranas se visualizan en un microscopio, se adquieren imagenes representativas de cada situacion y se cuenta el numero de celulas por area en cada grupo experimental.

La cuantificacion esta expresada en numero de celulas migradas por mm2.

Resultados

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Se analizaron un total de 10 campos de 0,57 mm2 cada uno (Fig. 8) para un total de 5,7 mm2. En este area, a las 48 y 72 horas, las celulas HC016 tienen una capacidad migratoria 32,75 veces (3,275 %) y 20,61 veces (2,061 %) superior (Fig. 8) con respecto a las ASC hacia la zona de celulas danadas por estres oxidativo. En conclusion, el tratamiento de las HC016 genera una capacidad quimiotactica mas fuerte y superior hacia las celulas HOG danadas por el H2O2 extracelular, con respecto a las ASC. El efecto quimiotactico que ejercen las celulas HOG tras la aplicacion del H2O2 puede relacionarse con fenomenos tales como el estres oxidativo y la induccion de componentes de la inflamacion que tienen lugar tras la liberacion de metabolitos reactivos del oxfgeno.

Ejemplo 11: Preparacion de la forma farmaceutica de las celulas HC016.

Las celulas HC016 se prepararon segun la formulacion farmaceutica que lleva al medicamento de terapia celular para su uso en el modelo animal y la determinacion de su eficacia:

Asf, una vez llevado a cabo el tratamiento para obtener celulas HC016 a partir de las ASC, segun lo especificado en el ejemplo 2, las celulas se disponen en viales de cristal no pirogenico.

Para este proposito, las celulas HC016 se separan del recipiente de cultivo mediante la aplicacion de una solucion de tripsina-EDTA al 0,05 %, la actividad de la enzima se neutraliza mediante la adicion de FBS (Biochrom), y se llevo a cabo la centrifugacion a 400 g de la suspension celular obtenida. Se elimino el sobrenadante, el sedimento celular se resuspendio en solucion salina (Grifols) y se llevo a cabo una nueva centrifugacion para eliminar cualquier resto de soluciones anteriores. Se descarto el sobrenadante y las celulas se resuspendieron en una solucion inyectable (Ringer-Lactato al 95 % (Grifols) y albumina humana al 5 % (CSL-Behring). Se realizo el recuento celular y analisis de la viabilidad usando un hemocitometro, y la solucion celular se ajusto a una concentracion de 200.000 celulas/^l.

La formulacion farmaceutica para su aplicacion mediante inyeccion estereotaxica en el modelo animal, esta compuesta de: una solucion de 50 |il de celulas HC016 viables a una concentracion de 200.000 celulas/^l en Ringer- Lactato al 95 % (Grifols) y albumina humana al 5 % (CSL-Behring), dispuesta en viales de cristal esteriles y no pirogenicos (Sword Scientific).

Ejemplo 12: Capacidad de proteccion y/o de rehabilitacion de la funcion motora de una terapia celular basada en la aplicacion de celulas HC016 en un modelo animal de lesion medular.

Los grupos experimentales consisten en tres grupos de 10 ratas Sprague-Dawley adultas de 250-300 gramos de peso. A estos animales, bajo anestesia general con isoflurano al 3-4 % se les realizo una laminectoirna a nivel toracico de manera que la medula espinal quedase expuesta. Sobre la cara dorsal de la medula espinal se aplica una lesion medular moderada mediante contusion calibrada y definida mediante una serie de parametros tales como la distancia y el peso cargado en un embolo metalico de diametro conocido. El primer grupo de 10 animales recibieron la lesion y no recibieron terapia alguna. El segundo grupo de 10 animales recibieron la lesion medular y se trataron con una terapia celular basada en ASC. El tercer grupo de 10 animales recibieron la lesion medular y se trataron con una terapia celular basada en HC016. Las terapias celulares, ASC y HC016, se aplican 48 horas tras la lesion mediante inyeccion estereotaxica en 6 puntos de la medula a niveles superiores e inferiores a la lesion. Cada inyeccion consiste en 1 ml de solucion salina que contiene 200.000 celulas, haciendo una dosis total de 1.200.000 celulas por animal. Las ratas se supervisaron en todo momento en un animalario y recibieron comida y bebida ad libitum. La capacidad de proteccion y/o la rehabilitacion de la funcion motora en cada grupo se determino mediante un ensayo funcional tras 1, 2, 3, 4, 6 y 8 semanas de exploracion de la locomocion en campo abierto. Este examen se conoce como escala Basso-Beattie-Bresnahan (puntuacion BBB) y es un metodo fiable y sensible que alcanza una puntuacion de 21 y que proporciona una medida semicuantitativa de la recuperacion a corto, medio y largo plazo (Basso, Beattie y Bresnahan, 1995. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12;1-21).

La cuantificacion se expresa como la media estadfstica del valor en la escala BBB de cada grupo experimental en cada tiempo de exploracion.

Resultados

La aplicacion de una terapia celular basada en HC016 tras una lesion medular favorece la recuperacion de las habilidades motoras ensayadas en la prueba BBB. De acuerdo con la escala de esta prueba, los valores indican que esta recuperacion esta al menos un punto por encima de la terapia basada en ASC en todos los tiempos analizados, 1, 2, 3, 4, 6 y 8 semanas tras la lesion (Fig. 9). La evolucion de recuperacion muestra que la terapia con celulas HC016 acorta el tiempo de obtencion de la mejor puntuacion, obtenida en la octava semana con las celulas HC016.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de preacondicionamiento de celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo, que comprende cultivar las celulas madre mesenquimales obtenidas y aisladas en un medio de tratamiento que comprende H2O2 como agente oxidante, caracterizado porque dicho cultivo de celulas en un medio de tratamiento comprende las siguientes etapas:

   a) primer ciclo: sembrar las celulas en una superficie de cultivo y permitir un tiempo de acondicionamiento comprendido entre 4 y 8 horas para que las celulas se adhieran y adquieran su morfologfa tfpica;

   b) anadir el medio de tratamiento hasta alcanzar una concentracion final de H2O2 comprendida entre 0,01- 0,05 mM;

   c) mantener durante 48-72 horas dentro del incubador a 37 °C y a una atmosfera con CO2 al 5 %;

   d) segundo ciclo: renovar el medio de tratamiento hasta alcanzar de nuevo una concentracion final comprendida entre 0,01 y 0,05 mM;

   e) incubar estas celulas durante 48-72 horas a 37 °C con CO2 al 5 %;

   f) tercer ciclo: renovar el medio de tratamiento aplicando de nuevo dicho medio hasta alcanzar una vez mas una concentracion final de H2O2 comprendida entre 0,01 y 0,05 mM;

   g) incubar estas celulas durante 24-48 horas a 37 °C con CO2 al 5 %.
2. 2. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las celulas mesenquimales se afslan a partir de tejido adiposo humano.
3. 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado porque el medio de tratamiento usado en las etapas b), d) y f) comprende un medio de cultivo celular convencional al 85-95 %, suero fetal de ternera al 5-15 %, antibioticos al 0,5-5 % y peroxido de hidrogeno a 0,01-0,05 mM.
4. 4. Celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo preacondicionado obtenidas directamente a partir del metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadas porque estas celulas madre mesenquimales mantienen su fenotipo indiferenciado, presentan un citoesqueleto donde los microfilamentos se organizan en fibras de estres, presentan un aumento de la expresion del gen de SOD1 de al menos el 30 % con respecto a las ASC no tratadas, medido mediante el metodo de la PCR, presentan un aumento de la expresion del gen de SOD2 de al menos el 25 % con respecto a las ASC no tratadas, medida mediante el metodo de la PCR, presentan un aumento de la expresion del gen de SOD3 de al menos el 50 % con respecto a las ASC no tratadas, medido mediante el metodo de la PCR, y presentan un aumento de la expresion del gen de Cat de al menos el 50 % con respecto a las ASC no tratadas, medida mediante el metodo de la PCR.
5. 5. Las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo preacondicionado de acuerdo con la reivindicacion

   4, caracterizadas porque las celulas presentan un aumento intracelular de GSH de al menos el 8 % con respecto a las ASC no tratadas, medido mediante el metodo enzimatico de Tietze.
6. 6. Las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo preacondicionado de acuerdo con la reivindicacion

   5, caracterizadas porque las celulas presentan una disminucion de los niveles intracelulares de MRO de al menos el 10 % con respecto a las ASC no tratadas, medidas mediante el metodo cuantitativo fluorometrico con una sonda DCFA.
7. 7. Las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo preacondicionado de acuerdo con la reivindicacion

   6, caracterizadas porque las celulas presentan un aumento de beta-actina de al menos el 40 % con respecto a las ASC no tratadas, medido mediante el metodo de la PCR.
8. 8. Las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo preacondicionado de acuerdo con la reivindicacion

   7, caracterizadas porque las celulas presentan un aumento del IGF-1 de al menos el 40 % con respecto a las ASC no tratadas, medido mediante el metodo de la PCR.
9. 9. Las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo preacondicionado de acuerdo con las reivindicaciones 5-8 para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con, o causadas por, estres oxidativo.
10. 10. Las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo preacondicionado para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9 en el tratamiento de enfermedades seleccionadas del grupo que consiste en: periarteritis nodosa, diabetes mellitus, enfermedad granulomatosa cronica, arteriosclerosis, ictus, fibrosis pulmonar (enfermedad pulmonar obstructiva cronica, EPOC, fibrosis pulmonar idiopatica), smdrome de isquemia-reperfusion, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, enfermedad intestinal

    inflamatoria: colitis ulcerosa y enfermedad de Chron, smdrome de distres respiratorio del adulto, aterosclerosis, lesion medular, lesiones en nervios perifericos, esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Huntington, ataxia de Friedreich, periodontitis, enfermedades de las mucosas y enfermedades y lesiones que se producen con un componente inflamatorio, ulceras y heridas agudas y cronicas.