ES2618885T3 - Formulaciones de vacuna para norovirus - Google Patents

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Abstract

Una formulación antigénica que comprende una combinación de dos o más partículas de tipo virus (VLP) de Norovirus monovalentes o una formulación antigénica que comprende VLP de Norovirus polivalentes para su uso en un método para generar una respuesta inmune de manera que la composición de VLP combinada puede lograr inmunidad frente a infección por cada genotipo de Norovirus representado en la formulación, en la que la respuesta inmune frente a una VLP dada en la combinación es de al menos el 50% de la respuesta inmune de la misma VLP cuando se mide individualmente.

Description

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DESCRIPCION
Formulaciones de vacuna para norovirus Campo de la invencion
La invencion pertenece al campo de las vacunas, especialmente al de las vacunas para norovirus. Ademas, la invencion se refiere a metodos para preparar composiciones de vacuna y a metodos para inducir una respuesta inmunogenica.
Antecedentes de la invencion
Los norovirus son calicivirus humanos no cultivables que aparecen como la principal causa de los brotes epidemicos de gastroenteritis no bacteriana (Glass y col., 2000; Hardy y col., 1999). La importancia clmica de los norovirus ha estado minusvalorada antes del desarrollo de ensayos moleculares de diagnostico sensibles. La clonacion del genoma del virus de Norwalk (NV) del genogrupo I prototipo y la produccion de partmulas similares a virus (VLP, por sus siglas en ingles) a partir de un sistema de expresion de baculovirus recombinante ha permitido el desarrollo de pruebas que han mostrado la extension de infecciones por norovirus (Jiang y col. 1990; 1992).
Los norovirus son virus de ARN de cadena sencilla y sentido positivo que contienen un genoma de ARN no segmentado. El genoma vmco codifica tres marcos de lectura abiertos, de los cuales los dos ultimos especifican la produccion de la protema principal de la capside y una protema estructural menor, respectivamente (Glass y col. 2000). Cuando se expresan a niveles elevados en sistemas de expresion eucariotas, la protema de la capside del NV, y de otros norovirus en particular, se ensambla en VLP que estructuralmente mimetizan a viriones de norovirus nativos. Cuando se observan mediante microscopfa electronica de transmision, las VLP no pueden distinguirse morfologicamente de viriones infecciosos aislados a partir de muestras de heces humanas.
Las respuestas inmunes frente a norovirus son complejas y la correlacion de proteccion esta empezando a elucidarse. Los estudios en voluntarios humanos realizados con el virus nativo mostraron que las respuestas inmunes de memoria derivadas a partir de mucosas proporcionaban proteccion a corto plazo tras la infeccion y sugenan que es posible la proteccion mediante vacunas (Lindesmith y col. 2003; Parrino y col. 1997; Wyatt y col., 1974).
Aunque el norovirus no puede cultivarse in vitro gracias a la disponibilidad de VLP y su capacidad para producirse en grandes cantidades, se ha realizado un progreso considerable a la hora de definir la topograffa antigenica y estructural de la capside del norovirus. Las VLP conservan la conformacion autentica de la protema de la capside vmca careciendo del material genetico infeccioso. Por consiguiente, las VLP mimetizan las interacciones funcionales del virus con los receptores celulares, mostrando de este modo una respuesta inmune del huesped apropiada al tiempo que carecen de la capacidad para reproducir o causar la infeccion. Junto al NIH, en el Baylor College of Medicine se estudiaron las respuestas inmunes humoral, mucosa y celular a las VLP de NV en voluntarios humanos en un ensayo clmico en fase I academico patrocinado por el investigador. Se demostro que la administracion de VLP por via oral era segura e inmunogenica en adultos sanos (Ball y col. 1999; Tacket y col. 2003). En otros centros academicos, los experimentos preclmicos en modelos animales han mostrado un aumento de las respuestas inmunes a VLP cuando se administran por via intranasal con adyuvantes de exotoxinas bacterianas (Guerrero y col. 2001; Nicollier-Jamot y col. 2004; Periwal y col. 2003). En conjunto, estos datos sugieren que una vacuna compuesta por VLP formulada de forma adecuada representa una estrategia viable de inmunizacion frente a una infeccion por norovirus.
Lobue AD y col. (Vaccine, Elsevier LTD, GB, vol. 24, n.° 24, 12 de junio de 2006, paginas 5220-5234) se refiere a la induccion de vacunas de norovirus polivalentes de anticuerpos bloqueantes sistemicos y de mucosa fuertes frente a multiples cepas.
Nicollier-Jamot B. y col. (Vaccine, Elsevier LTD, GB, vol. 22, n.° 9-10, 12 de marzo de 2004, paginas 1079-1086) se refiere a partmulas de tipo virus recombinantes de un norovirus (cepa del genogrupo II) administradas por via intranasal y por via oral con adyuvantes mucosos LT y LT(R192G) en ratones BALB/c para la induccion de respuestas inmunes de tipo Th1/Th2 celulares y humorales espedficas.
Hansman GS (Journal of General Virology, vol. 87, n.° 4, 01 de abril de 2006, paginas 909-919) se refiere a la diversidad genetica y antigenica entre norovirus.
El documento EP 2 360 175 se refiere a partmulas de tipo virus Norovirus y Sapovirus (VLP).
Resumen
La invencion actual se define, entre otras cosas, por los siguientes puntos:
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1. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de dos o mas partmulas de tipo virus (VLP) de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes para su uso en un metodo para generar una respuesta inmune de manera que la composicion de VLP combinada puede lograr inmunidad frente a infeccion por cada genotipo de Norovirus representado en la formulacion, en la que la respuesta inmune frente a una VLP dada en la combinacion es de al menos el 50% de la respuesta inmune de la misma VLP cuando se mide individualmente.
2. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun el punto 1 para el uso segun el punto 1, en la que al menos una de dichas cepas de Norovirus es diferente de las cepas de dichas VLP.
3. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun el punto 1 para el uso segun el punto 1, en la que dos o mas cepas de Norovirus son de genotipos diferentes.
4. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun el punto 1 para el uso segun el punto 1, en la que al menos una de dichas cepas de Norovirus es diferente de los genotipos de dichas VLP.
5. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun el punto 1 para el uso segun el punto 1, en la que dichas dos o mas cepas de Norovirus son de genogrupos diferentes.
6. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun el punto 1 para el uso segun el punto 1, en la que al menos una de dichas cepas de Norovirus es diferente de los genogrupos de dichas VLP.
7. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun el punto 5 para el uso segun el punto 5, en la que dichos genogrupos se seleccionan del grupo que consiste en GI, GII, GIII y GIV.
8. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun el punto 1 para el uso segun el punto 1, en la que dichas VLP de Norovirus monovalentes se derivan de las secuencias virales del genogrupo I o el genogrupo II o de una secuencia viral consenso de dos o mas cepas de Norovirus.
9. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun el punto 5 para el uso segun el punto 5, en la que dichas VLP de Norovirus monovalentes se derivan de los genotipos 1.1 y II.4.
10. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun el punto 1 para el uso segun el punto 1, en la que la formulacion antigenica se administra por via mucosa o por via parenteral.
11. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun el punto 10 para el uso segun el punto 10, en la que la administracion mucosa se lleva a cabo por via intranasal.
12. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun el punto 10 para el uso segun el punto 10, en la que la administracion parenteral se lleva a cabo por via intramuscular.
13. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun el punto 1 para el uso segun el punto 1, en la que la formulacion antigenica incluye uno o mas adyuvantes seleccionados del grupo que consiste en agonistas de receptores de tipo toll y sales de aluminio.
14. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun el punto 1 para el uso segun el punto 1, en la que la formulacion antigenica comprende ademas un agente de administracion.
Se describen formulaciones de vacuna y antigenicas que comprenden un antfgeno de Norovirus. En una realizacion, las formulaciones comprenden ademas al menos un adyuvante. El antfgeno de Norovirus puede derivarse de secuencias virales del genogrupo I o del genogrupo II o de una secuencia viral consenso. Las formulaciones de Norovirus comprenden peptidos antigenicos, protemas o partmulas de tipo virus (VLP). En una realizacion, las VLP pueden estar desnaturalizadas. En otra realizacion, los peptidos antigenicos y las protemas se seleccionan del grupo
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que consiste en monomeros de capside, multfmeros de capside, agregados de protemas y mezclas de los mismos. En otra realizacion, el antigeno de Norovirus esta presente en una concentracion de desde aproximadamente el 0,01% hasta aproximadamente el 80% en peso. La dosificacion del antigeno de Norovirus esta presente en una cantidad de desde aproximadamente 1 |ig hasta aproximadamente 100 mg por dosis.
En otra realizacion, las VLP de norovirus son VLP recombinantes producidas en un sistema de expresion usando una secuencia de acido nucleico de norovirus, que codifica al menos una protema de la capside o un fragmento de la misma. La protema de la capside se selecciona entre el grupo compuesto por VP1 o VP2, o una combinacion de las mismas. El sistema de expresion puede ser un sistema de expresion celular recombinante como un sistema de expresion de levaduras, bacterias, insectos, mairnferos, o un sistema de expresion celular infectado con baculovirus.
En todavfa otra realizacion, la composicion comprende ademas un agente de administracion que funciona potenciando la captacion del antigeno proporcionando un efecto de deposito, aumentando el tiempo de retencion del antfgeno en el lugar de la administracion o potenciando la respuesta inmune a traves de la relajacion de la uniones estrechas celulares en el lugar de la administracion. El agente de administracion puede ser un bioadhesivo, preferiblemente un mucoadhesivo seleccionado entre el grupo compuesto por glucosaminoglucanos (p. ej., sulfato de condroitina, dermatano sulfato de condroitina, sulfato de queratano, heparina, sulfato de heparano, hialuronano), polfmeros de hidratos de carbono (p. ej., pectina, alginato, glucogeno, amilasa, amilopectina, celulosa, quitina, estaquiosa, inulina, dextrina, dextrano), derivados entrecruzados de poli(acido acnlico), alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidona, polisacaridos (incluyendo mucina y otros mucopolisacaridos), derivados de celulosa (p. ej., hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa), protemas (p. ej., lectinas, protemas frimbiales) y acido desoxirribonucleico. Preferiblemente, el mucoadhesivo es un polisacarido. Mas preferiblemente, el mucoadhesivo es quitosano, o una mezcla que contiene quitosano como una sal de quitosano o base de quitosano.
En aun otra realizacion, se proporciona una composicion que comprende ademas un adyuvante. El adyuvante puede seleccionarse entre el grupo compuesto por agonistas de receptores de tipo toll (TLR), monofosforil lfpido A (MPL®), lfpido sintetico A, mimeticos o analogos del lfpido A, sales de aluminio, citoquinas, saponinas, derivados del dipeptido de muramilo (MDP), oligos CpG, lipopolisacarido (LPS) de bacterias gram negativas, polifosfacenos, emulsiones, virosomas, cocleatos, micropartmulas de poli(lactido-co-glicolidos) (PLG), partmulas de poloxamero, micropartmulas, endotoxinas, por ejemplo, endotoxinas bacterianas y liposomas. Preferiblemente, el adyuvante es un agonista del receptor de tipo toll (TLR). Mas preferiblemente, el adyuvante es MPL®.
Las composiciones descritas pueden proporcionarse como una formulacion lfquida o una formulacion en polvo seco. Las formulaciones en polvo seco de la presente invencion pueden contener un tamano medio de partmula de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 micras de diametro. En una realizacion, la composicion es una formulacion antigenica. En otra realizacion, la composicion esta formulada para su administracion como vacuna. Entre las vfas de administracion adecuadas se incluyen mucosa, intramuscular, intravenosa, subcutanea, intradermica, subdermica o transdermica. En particular, la via de administracion puede ser intramuscular o mucosa, prefiriendose las vfas de administracion mucosa que incluyen las rutas de administracion intranasal, oral o vaginal. En otra realizacion, la composicion se formula como un spray nasal, gotas nasales o polvo seco, en la que la formulacion se administra mediante deposito rapido dentro de la fosa nasal a partir de un dispositivo que contiene la formulacion que se mantiene cerca o se inserta dentro de la fosa nasal. En otra realizacion, la formulacion se administra en una o ambas fosas nasales.
Tambien se describen los procedimientos para generar una respuesta inmune frente a norovirus en un sujeto que comprende la administracion al sujeto de una formulacion antigenica o una vacuna que comprende la composicion de norovirus. En una realizacion, las formulaciones antigenicas y las vacunas que comprenden la composicion de norovirus encuentran su aplicacion en la generacion de anticuerpos frente a uno o mas antfgenos de norovirus. Las formulaciones de vacunas para norovirus pueden usarse para tratar las infecciones por norovirus.
Breve descripcion de los dibujos
En la figura 1 se muestra un ensayo de proliferacion in vitro espedfica de antfgeno de celulas de ganglios linfaticos cervicales murinos tras la inmunizacion intranasal in vivo con 10 |ig de VLP.
En la figura 2 se muestra un ensayo de proliferacion in vitro espedfica de antfgeno de esplenocitos tras la inmunizacion intranasal in vivo con 10 |ig de VLP.
En la figura 3 se muestra un ensayo de proliferacion in vitro espedfica de antfgeno de esplenocitos tras la inmunizacion intraperitoneal in vivo con 25 |ig de VLP.
En la figura 4 se muestra la IgG o IgA espedfica de VLP producida por celulas secretoras de anticuerpo (CSA) medida mediante un ensayo ELISPOT.
En la figura 5 se muestra la IgG espedfica de VLP medida por ELISA.
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En la figura 6 se muestra el resultado de un ensayo de potencia para la respuesta de IgG en suero frente a las VLP de Norwalk.
En la figura 7 se muestran los resultados de un ensayo de potencia en el que se comparan las respuestas de IgG en suero frente a las VLP de Norwalk en ratones inmunizados con una formulacion lfquida del antigeno o con una formulacion reconstituida a partir de polvo seco. En la grafica se muestra la potencia frente a la concentracion de VLP de Norwalk en las diferentes formulaciones.
En la figura 8 se muestra la respuesta de IgG en suero en conejos el dfa 21 (panel izquierdo) y el dfa 42 (panel derecho) seguido de la administracion de formulaciones para vacunas diferentes con VLP de norovirus.
En la figura 9 se muestra la respuesta de IgG en suero en conejos inmunizados por via intranasal con una formulacion lfquida o con una formulacion en polvo seco con VLP de Norwalk.
En la figura 10 se muestra la estabilidad de la formulacion en polvo seco medida mediante analisis por PAGE en presencia de SDS y cromatograffa de exclusion molecular (CEM). El analisis de regresion indica que no se observan tendencias estadfsticas en los |ig totales o intactos de VLP por cada 10 mg de polvo seco durante 1 ano. El porcentaje de agregado es un calculo en el que se asume que la protema VLP no detectada por CEM, en comparacion con la protema VLP total determinada por PAGE-SDS cuantitativo, esta agregada.
En la figura 11 se muestran los resultados de un ensayo ELISA de la respuesta de anticuerpos anti-norovirus en ratones inmunizados i.p. con antfgenos multiples de norovirus. Las flechas delgadas indican inyecciones de recuerdo con formulaciones que contienen solo VLP de Norwalk. Las flechas gruesas muestran inyecciones de recuerdo con formulaciones que contienen VLP de Norwalk y de Houston.
En la figura 12 se muestra un ensayo ELISA de una respuesta humoral anti-norovirus en ratones inmunizados i.p. con VLP de Norwalk, VLP de Houston o una combinacion de VLP de Norwalk y Houston.
En la figura 13 se muestra la presencia de celulas plasmatica de larga duracion espedficas de VLP en esplenocitos (A), ganglios linfaticos cervicales (B) y medula osea (C) en ratones 114 dfas despues de la inmunizacion intranasal con VLP de Norwalk en ratones.
En la figura 14 se muestra la respuesta de celulas B de memoria espedficas de Norwalk en esplenocitos de ratones inmunizados por via intranasal con VLP de Norwalk. En el panel A se muestran celulas secretoras de anticuerpos IgA a dfa 0 (grafico de la izquierda) y a dfa 4 en cultivos con VLP de Norwalk (grafico de la derecha). En el panel B se muestran celulas secretoras de anticuerpos IgG a dfa 0 (grafico de la izquierda) y a dfa 4 en cultivos con VLP de Norwalk (grafico de la derecha). La diferencia en el numero de celulas entre el dfa 0 y el dfa 4 indica el nivel de expansion y diferenciacion de celulas B de memoria.
En la figura 15 se muestran los resultados del ensayo ELISPOT de celulas mononucleares de sangre periferica aisladas de conejos inmunizados por via intranasal con una formulacion para vacuna de VLP de Norwalk. En el panel de la izquierda se muestra el numero de celulas secretoras de anticuerpos (CSA) espedficas de VLP de Norwalk a dfa 0 (dfa de obtencion del tejido), mientras que en el panel de la derecha se muestra el numero de CSA espedficas de VLP de Norwalk despues de 4 dfas en cultivo con VLP de Norwalk. La diferencia en el numero de celulas entre el dfa 0 y el dfa 4 indica el nivel de respuesta de las celulas B de memoria.
En la figura 16 se muestran los resultados del ensayo ELISPOT de esplenocitos obtenidos a partir de conejos inmunizados por via intranasal con una formulacion para vacuna de VLP de Norwalk. En el panel de la izquierda se muestra el numero de celulas secretoras de anticuerpos (CSA) espedficas de VLP de Norwalk a dfa 0 (dfa de obtencion del tejido), mientras que en el panel de la derecha se muestra el numero de CSA espedficas de VLP de Norwalk despues de 4 dfas en cultivo con VLP de Norwalk. La diferencia en el numero de celulas entre el dfa 0 y el dfa 4 indica el nivel de respuesta de las celulas B de memoria.
En la figura 17 se muestran los resultados del ensayo ELISPOT de celulas de medula osea obtenidas a partir de las tibias de conejos inmunizados por via intranasal con una formulacion para vacuna de VLP de Norwalk. En el panel de la izquierda se muestra el numero de celulas secretoras de anticuerpos (CSA) espedficas de VLP de Norwalk a dfa 0 (dfa de obtencion del tejido), mientras que en el panel de la derecha se muestra el numero de CSA espedficas de VLP de Norwalk despues de 4 dfas en cultivo con VLP de Norwalk. La presencia de CSA a dfa 0 indica la presencia de celulas plasmaticas de larga duracion. La diferencia en el numero de celulas entre el dfa 0 y el dfa 4 indica el nivel de respuesta de las celulas B de memoria.
En la figura 18 se muestran los resultados del ensayo ELISPOT de celulas de ganglios linfaticos mesentericos obtenidos a partir de conejos inmunizados por via intranasal con una formulacion para vacuna de VLP de Norwalk. En el panel A se muestran las celulas secretoras de anticuerpos (CSA) positivas para IgG espedficas de VLP de Norwalk. En el panel B se muestran las CSA positivas para IgA espedficas de VLP de Norwalk. En los paneles de la izquierda se muestra el numero de CSA espedficas de VLP de Norwalk a dfa 0 (dfa de obtencion del tejido),
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mientras que en los paneles de la derecha se muestra el numero de CSA espedficas de VLP de Norwalk despues de 4 d^as en cultivo con VLP de Norwalk. La presencia de CSA a dfa 0 indica la presencia de celulas plasmaticas de larga duracion. La diferencia en el numero de celulas entre el dfa 0 y el dfa 4 indica el nivel de respuesta de celulas B de memoria.
En la figura 19 se muestra el ensayo de proliferacion espedfica de antigeno de esplenocitos tras la inmunizacion intranasal in vitro en conejos. En el panel de la izquierda se muestra la proliferacion de celulas T tras la reestimulacion con VLP de Norwalk en esplenocitos no fraccionados, mientras que en el panel de la derecha se muestra la proliferacion de celulas T CD4+ tras la reestimulacion con VLP de Norwalk.
Descripcion detallada
La presente invencion se refiere a composiciones antigenicas de norovirus.
Antigenos de norovirus
Se describe una composicion que comprende uno o mas antigenos de Norovirus. Por “Norovirus”, “Norovirus (NOR)”, “norovirus” y expresion gramaticales equivalentes en este documento se entiende miembros del genero Norovirus de la familia Caliciviridae. En algunas realizaciones, un norovirus puede incluir un grupo de virus sin envoltura, con ARN de cadena sencilla de sentido positivo relacionados que pueden ser infecciosos para humanos o especies de mairnferos no humanos. En algunas realizaciones, un norovirus puede causar una gastroenteritis aguda en humanos. Los norovirus tambien pueden hacer referencia a virus estructurados pequenos y redondos (SRSV, por sus siglas en ingles) que tienen una estructura superficial definida o un contorno irregular al microcopio electronico. Dentro de los norovirus se incluyen al menos cuatro genogrupos (GI-IV) definidos por las secuencias de acido nucleico y aminoacidos que comprende 15 grupos geneticos. Los genogrupos principales son GI y GII. Se han propuestos los genogrupos GIII y GIV, aunque estan aceptados a nivel general. El representante de GlII es la cepa bovina Jena. Hasta el momento, GIV contiene un virus, Alfatron. Consulte Vinje y col. J. Clin. Micro. 41:1423-1433 (2003) para obtener mas informacion. Por “Norovirus” tambien se entiende en este documento las partmulas similares a virus recombinantes de norovirus (VLP de NORr). En algunas realizaciones, las VLP de norovirus recombinantes se producen en un sistema de expresion usando una secuencia de acido nucleico de norovirus, que codifica al menos una protema de la capside o un fragmento de la misma. En otras realizaciones, la expresion recombinante de al menos la protema de la capside de norovirus codificada por el ORF2 en celulas, por ejemplo, a partir de un vector de baculovirus en celulas Sf9, puede producir un autoensamblaje espontaneo de la protema de la capside en VLP. Aun en otras realizaciones, la expresion recombinante de al menos las protemas de norovirus codificadas por ORF1 y ORF2 en celulas, p. ej., a partir de un vector de baculovirus en celulas Sf9, puede producir un autoensamblaje espontaneo de la protema de la capside en VLP. La secuencia de acido nucleico de norovirus tambien puede ser una secuencia consenso que comprenda diversas cepas de norovirus o una construccion sintetica modificada para potenciar los rendimientos o la estabilidad, o mejorar las propiedades antigenicas o inmunogenicas del antfgeno codificado. Las VLP son estructuralmente similares a los norovirus aunque carecen del genoma ARN vmco y, por tanto, no son infecciosas. Por consiguiente, “Norovirus” incluye viriones que pueden ser partmulas infecciosas o no infecciones, en las que se incluyen partmulas defectuosas.
Entre los ejemplos no limitantes de norovirus se incluyen el virus de Norwalk (NV, GenBank M87661, NP056821), virus de Southampton (SHV, GenBank L07418), virus Escudo del Desierto (DSV, U04469), virus de Hesse (HSV), virus de Chiba (CHV, GenBank AB042808), virus de Hawaii (HV, GenBank U07611), virus de la Montana Nevada (SMV, GenBank U70059), virus de Toronto (TV, Leite y col., Arch. Virol. 141:865-875), virus de Bristol (BV), virus de Jena (JV, AJ01099), virus de Maryland (MV, AY032605), virus de Seto (SV, GenBank AB031013), virus de Camberwell (CV, AF145896), virus de Lordsdale (LV, GenBank X86557), virus de Grimsby (GrV, AJ004864), virus de Mexico (MXV, GenBank U22498), Boxer (AF538679), C59 (AF435807), VA115 (AY038598), BUDS (AY660568), virus de Houston (HoV), cepa de Minerva (EF126963.1), cepa Laurens (EF126966.1), MoH (AF397156), virus de Parris Island (PiV; AY652979), VA387 (AY038600), VA207 (AY038599) y Operacion de Liberacion Iraqu (OIF, AY675554). En algunas realizaciones puede usarse un criptograma para su identificacion y se organiza como: especie huesped a partir de la cual se aislo el virus/abreviatura del genero/abreviatura de la especie/nombre de la cepa/ano de aparicion/pafs de origen. (Green y col., Human Caliciviruses, en Fields Virology Vol. 1, 841-874 (Knipe y Howley, editores jefe, 4a ed., Lippincott Williams & Wilkins 2001)). En algunas realizaciones se prefiere el uso de una combinacion de genogrupos de norovirus como cepas de los genogrupos I.1 (virus de Norwalk) y II.4 (virus de Houston) u otras cepas normalmente en circulacion, o construcciones sinteticas que representan combinaciones o porciones de las mismas. Habitualmente se identifican nuevas cepas de norovirus (Centers for Disease Control, Morbidity and Mortality Weekly Report, 56(33):842-846 (2007)) y tambien pueden usarse secuencias consenso de dos o mas cepas vmcas para expresar antfgenos de norovirus.
El antfgeno de norovirus puede estar en forma de peptidos, protemas o partmulas similares a virus (VLP). En una realizacion preferida, el antfgeno de norovirus comprende vLp. Segun se usa en este documento, las “partmulas similares a virus o VLP” se refieren a partmulas similares a virus, fragmentos, agregados o porciones de las mismas producidos a partir de la secuencia que codifica la protema de la capside de norovirus y que comprende caractensticas antigenicas similares a las de partmulas de norovirus infecciosas. Los antfgenos de norovirus tambien
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pueden estar en forma de monomeros de capside, multimeros de capside, protemas o fragmentos peptidicos de VLP, o agregados o mezclas de los mismos. Las protemas o peptidos antigenicos de norovirus tambien pueden estar en forma desnaturalizada, producida usando procedimientos conocidos en la tecnica.
Entre los antfgenos de norovirus tambien pueden incluirse variantes de dichas protemas de la capside o fragmentos de las mismas expresadas sobre o en las VLP de la invencion. Las variantes pueden contener alteraciones en las secuencias de aminoacidos de las protemas constituyentes. El termino “variante” con respecto a un polipeptido se refiere a una secuencia de aminoacidos que esta alterada en uno o mas aminoacidos con respecto a una secuencia de referencia. La variante puede tener cambios “conservadores”, en los que el aminoacido sustituido tiene propiedades estructurales o qmmicas similares, por ejemplo, sustitucion de leucina por isoleucina. Alternativamente, una variante puede tener cambios “no conservadores”, por ejemplo, sustitucion de una glicina por triptofano. Tambien pueden incluirse variaciones analogas menores como delecion o insercion de aminoacidos, o ambas. Las directrices para determinar que restos de aminoacidos pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin eliminar la actividad biologica o inmunologica pueden encontrarse usando programas de ordenador bien conocidos en la tecnica como, por ejemplo, el programa DNASTAR.
Entre los libros de texto en los que se describen las tecnicas biologicas molecular aplicables a la presente invencion, como clonacion, mutacion y similares, se incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook y col., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 (“Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel y col., eds., Current Protocols, sociedad entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (“Ausubel“). En estos libros se describe la mutagenesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros temas destacados relacionados, por ejemplo, con la clonacion y mutacion de las protemas de la capside de norovirus. Por tanto, tambien se describen metodos conocidos de ingeniena de protemas y tecnologfa de ADN recombinante para mejorar o alterar las caractensticas de las protemas expresadas sobre o en las VLP de la invencion. Pueden utilizarse diversos tipos de mutagenesis para producir y/o aislar variantes de acidos nucleicos, incluyendo secuencias consenso, que codifican moleculas proteicas y/o modificar/mutar adicionalmente las protemas en o sobre las VLP de la invencion. Entre estos se incluyen, pero sin limitaciones, mutagenesis dirigida a sitio, mutagenesis puntual al azar, recombinacion homologa (mezcla aleatoria de ADN), mutagenesis usando moldes que contiene uracilo, mutagenesis dirigida por oligonucleotido, mutagenesis de ADN modificado por fosforotioato, mutagenesis usando ADN doble incompleto o similares. Entre los procedimientos adecuados adicionales se incluyen reparacion de errores de apareamiento puntuales, mutagenesis usando cepas huesped deficientes en mecanismos de reparacion, restriccion-seleccion y restriccion-purificacion, mutagenesis por delecion, mutagenesis por smtesis total del gen, reparacion de roturas de doble cadena y similares.
Las VLP de la presente invencion pueden formarse a partir de la protema de la capside de norovirus de longitud completa, como las protemas VP1 y/o VP2 o determinados derivados de VP1 o VP2 usando procedimientos convencionales en la tecnica. Alternativamente, la protema de la capside usada para formar las VLP es una protema de la capside truncada. En algunas realizaciones, por ejemplo, al menos una de las VLP comprende una protema VP1 truncada. En otras realizaciones, todas las VLP comprenden protemas VP1 truncadas. El truncamiento puede ser un truncamiento en el extremo N o C terminal. Las protemas de la capside truncadas son derivados de la protema de la capside adecuadamente funcionales. Los derivados funcionales de protemas de la capside son capaces de inducir una respuesta inmune (si es necesario, cuando estan convenientemente acompanadas de adyuvante) de una forma similar a la respuesta inmune inducida por una VLP compuesta por la protema de la capside de longitud completa.
Las VLP pueden contener protemas VP1 principales y/o protemas VP2 menores. Preferiblemente, cada VLP contiene protemas VP1 y/o VP2 solo de un genogrupo de norovirus que da lugar a una VLP monovalente. Segun se usa en este documento, el termino “monovalente” significa que las protemas antigenicas derivan de un unico genogrupo de norovirus. Por ejemplo, las VLP contienen VP1 y/o VP2 de una cepa de virus del genogrupo I (p. ej., VP1 y VP2 del virus de Norwalk). Preferiblemente la VLP esta compuesta predominantemente por protemas VP1. En una realizacion de la invencion, el antfgeno es una mezcla de VLP monovalentes en las que la composicion incluye VLP compuestas por VP1 y/o VP2 de un unico genogrupo de norovirus mezcladas con VLP compuestas por VP1 y/o VP2 de un genogrupo de norovirus diferente obtenidas de multiples cepas vmcas (p. ej., virus de Norwalk y virus de Houston). Simplemente a modo de ejemplo, la composicion puede contener VLP monovalentes de una o mas cepas del genogrupo I de norovirus junto con VLP monovalentes de una o mas cepas del genogrupo II de norovirus. Preferiblemente, la mezcla de VLP de norovirus esta compuesta por las cepas de norovirus de Norwalk y Houston.
Sin embargo, en una realizacion alternativa de la invencion, las VLP pueden ser VLP polivalentes que comprenden, por ejemplo, protemas VP1 y/o VP2 de un genogrupo de norovirus entremezcladas con protemas VPl y/o VP2 de un segundo genogrupo de norovirus, en las que las diferentes protemas VP1 y VP2 son protemas VP1 y VP2 no quimericas, aunque se asocian entre sf con la misma estructura de la capside para formar VLP inmunogenicas. Segun se usa en este documento, el termino “polivalente” significa que las protemas antigenicas derivan de dos o mas genogrupos de norovirus. Las VLP polivalentes pueden contener antfgenos de VLP obtenidos de dos o mas cepas vmcas. Simplemente a modo de ejemplo, la composicion puede contener VLP polivalentes que comprenden
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monomeros o poKmeros de la capside de una o mas cepas del genogrupo I de norovirus junto con monomeros o poKmeros de la capside de una o mas cepas del genogrupo II de norovirus. Preferiblemente, las VLP polivalentes contienen protemas de la capside de las cepas de norovirus de Norwalk y de Houston.
La combinacion de VLP monovalentes o polivalentes dentro de la composicion preferiblemente podna no bloquear la inmunogenicidad de cada tipo de VLP. En particular, se prefiere que no existan interferencias entre las VLP de norovirus en la combinacion de la invencion, de modo que la composicion de VLP combinada de la invencion sea capaz de inducir inmunidad frente a la infeccion por cada genotipo de norovirus representado en la vacuna. De forma adecuada, la respuesta inmune frente a un tipo de VLP determinado en la combinacion es al menos el 50% de la respuesta inmune del mismo tipo de VLP cuando se mide de forma individual, preferiblemente el 100% o, sustancialmente, el 100%. La respuesta inmune puede medirse de forma apropiada, por ejemplo, mediante la respuesta humoral, como se muestra en los ejemplos de este documento.
Pueden producirse VLP polivalentes mediante la expresion independiente de las protemas individuales de la capside seguido de su combinacion para formar las VLP. Alternativamente, las protemas multiples de la capside pueden expresarse dentro de la misma capside, a partir de una o mas construcciones de ADN. Por ejemplo, pueden transformarse o transfectarse multiples construcciones de ADN dentro de celulas huesped, codificando cada vector una protema diferente de la capside. Alternativamente, puede usarse un unico vector que tenga multiples genes de la capside, controlados por un promotor compartido o por multiples promotores individuales. Tambien pueden incorporarse elementos IRES dentro de vector, cuando sea apropiado. Usando estas estrategias de expresion, las protemas de la capside coexpresadas pueden purificarse conjuntamente para la posterior formacion de VLP y pueden formarse de forma espontanea VLP polivalentes que pueden purificarse a continuacion.
Un proceso preferido para la produccion de VLP polivalentes comprende la preparacion de protemas de la capside de VLP o derivados, como protemas VP1 y/o VP2, de diferentes genotipos de norovirus, la mezcla de las protemas y el ensamblaje de las protemas para producir VLP polivalentes. Las protemas de la capside pueden estar en forma de un extracto sin purificar, estar parcialmente purificadas o purificadas antes del mezclado. Las VLP monovalentes ensambladas de genogrupos diferentes pueden desensamblarse, mezclarse entre sf y ensamblarse de nuevo en VLP polivalentes. Preferiblemente, las protemas o las VLP estan, al menos, parcialmente purificadas antes de su combinacion. Opcionalmente, puede llevarse a cabo una purificacion adicional de las VLP polivalentes despues del ensamblaje.
De forma adecuada, las VLP de la invencion se obtienen mediante el desensamblaje y reensamblaje de las VLP para obtener VLP puras y homogeneas. En una realizacion, las VLP polivalentes pueden obtenerse mediante desensamblaje de dos o mas VLP, seguido de la combinacion de los componentes de las VLP desensambladas en cualquier punto adecuado antes del reensamblaje. Esta tecnica es adecuada cuando las VLP se forman espontaneamente a partir de la protema VP1 expresada como ocurre, por ejemplo, en algunas cepas de levadura. Cuando la expresion de la protema VP1 no induce la formacion espontanea de VLP, las preparaciones de las protemas o capsomeros de VP1 pueden combinarse antes del ensamblaje en VLP.
Cuando se utilizan VLP polivalentes, preferiblemente los componentes de las VLP se mezclan en las proporciones en las que se desee para la mezcla final de VLP. Por ejemplo, una mezcla de la misma cantidad de una protema VP1 parcialmente purifica de los virus Norwalk y Houston (u otras cepas de norovirus) proporcionan una VLP polivalente con cantidades aproximadamente iguales de cada protema.
Las composiciones que comprenden VLP polivalentes pueden estabilizarse mediante soluciones conocidas en la tecnica, como las recogidas en los documentos WO 98/44944 y WO0045841.
Las composiciones de la invencion pueden comprender otras protemas o fragmentos de protemas ademas de las protemas VP1 y VP2 o sus derivados. Tambien pueden administrarse otras protemas o peptidos conjuntamente con la composicion de la invencion. Opcionalmente, la composicion puede tambien formularse o administrarse conjuntamente con antfgenos que no sean de norovirus. De forma adecuada, estos antfgenos pueden proporcionar proteccion frente a otras enfermedades.
La protema VP1 o su derivado proteico funcional es adecuadamente capaz de formar una VLP y la formacion de VLP puede evaluarse mediante tecnicas convencionales como, por ejemplo, microscopfa electronica y dispersion de luz laser dinamica.
Preparacion del antigeno
Las moleculas antigenicas de la presente invencion pueden prepararse mediante aislamiento y purificacion a partir de los organismos en los que se producen de forma natural, y pueden prepararse mediante tecnicas recombinantes. Preferiblemente, los antfgenos de VLP de norovirus se preparan a partir de celulas de insecto, como las celulas Sf9 o H5, aunque tambien puede usarse cualquier celula adecuada como celulas de E. coli o celulas de levadura, por ejemplo, de S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastori y otros sistemas de expresion de Pichia, expresion en celulas de marnffero tales como sistemas CHO o HEK. Cuando se prepara mediante un procedimiento recombinante o
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mediante smtesis, pueden realizarse una o mas inserciones, deleciones, inversiones o sustituciones de los aminoacidos que constituyen el peptido. Cada uno de los antigenos mencionados anteriormente se utiliza preferiblemente en su estado sustancialmente puro.
Los procedimientos de produccion de VLP de norovirus en cultivos de celulas de insecto se han descrito previamente en la patente de EE. UU N.° 6.942.865. Brevemente, se clono un ADNc del extremo 3' del genoma que contema el gen de la capside vmca (ORF2) y un gen estructural menor (ORF3). Los baculovirus recombinantes portadores de los genes de la capside vmca se construyeron a partir del ADNc clonado. Las VLP de norovirus se produjeron en los cultivos de celulas de insecto Sf9 o H5.
Adyuvantes
Se describe ademas una composicion que comprende adyuvantes para su uso con el antigeno de Norovirus. La mayona de los adyuvantes contienen una sustancia disenada para proteger al antigeno de un catabolismo rapido, como hidroxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador de las respuestas inmunes, como protemas derivadas de Bordetella pertussis o de Mycobacterium tuberculosis. Los adyuvantes adecuados esta disponibles en el mercado como, por ejemplo, adyuvante incompleto y adyuvante completo de Freund (Pifco Laboratories, Detroit, Mich.); adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); sales de aluminio como gel de hidroxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o cinc; una suspension insoluble de tirosina acilada; azucares acilados, polisacaridos cationica o anionicamente derivatizados; polifosfacenos, microesferas biodegradable y Quil A.
Entre los adyuvantes adecuados tambien se incluyen, pero sin limitaciones, agonistas de los receptores de tipo toll (TLR), monofosforil lfpido A (MPL), lfpido sintetico A, mimeticos o analogos del lfpido A, sales de aluminio, citoquinas, saponinas, derivados del dipeptido de muramilo (MDP), oligos CpG, lipopolisacarido (LPS) de bacterias gram-negativas, polifosfacenos, emulsiones, virosomas, cocleatos, micropartfculas de poli(lactido-co-glucolidos) (PLG), partfculas de poloxamero, micropartfculas y liposomas. Preferiblemente, los adyuvantes no son exotoxinas derivadas de bacterias. Los adyuvantes preferidos son aquellos que estimulan una respuesta de tipo Th1, como 3DMPL o QS21.
El monofosforil lfpido A (MPL), un derivado no toxico del lfpido A de Salmonella, es un potente agonista de TLR-4 que se ha desarrollado como adyuvante para vacunas (Evans y col. 2003). En estudios murinos preclmicos, se ha demostrado que el MPL intranasal potencia las respuestas humorales secretoras, asf como sistemicas (Baldridge y col. 2000; Yang y col. 2002). Tambien se ha comprobado que es seguro y eficaz como adyuvante para vacunas en estudios clmicos con mas de 120.000 pacientes (Baldrick y col., 2002; 2004). El MPL estimula la induccion de inmunidad innata a traves del receptor TLR-4 y es, por tanto, capaz de inducir respuestas inmunes inespedficas frente a una amplia variedad de patogenos infecciosos, incluyendo tanto bacterias gram-negativas como gram- positivas, virus y parasitos (Baldrick y col. 2004; Persing y col. 2002). La inclusion de MPL en formulaciones intranasales debena proporcionar una induccion rapida de respuestas innatas, inducir respuestas inmunes inespedficas tras la estimulacion vmca al tiempo que se potencian las respuestas espedficas generadas por los componentes antigenicos de la vacuna.
Por consiguiente, en una realizacion, la presente invencion proporciona una composicion que comprende monofosforil lfpido A (MPL®) o monofosforil lfpido A 3 De-O-acilado (3D-MPL®) como potenciador de la inmunidad adquirida e innata. Desde un punto de vista qrnmico, el 3D-MPL® es una mezcla de monofosforil lfpido A De-O- acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma preferida de monofosforil lfpido A 3 De-O-acilado se describe en la Patente Europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA). En otra realizacion, la presente invencion proporciona una composicion que comprende lfpido A sintetico, mimeticos o analogos del lfpido A, como lfpido A PET de BioMira o derivados sinteticos disenados para funcionar con agonistas de TLR-4.
Los terminos “cantidad adyuvante eficaz” o “cantidad eficaz de adyuvante” seran bien entendidos por los expertos en la materia e incluyen una cantidad de uno o mas adyuvantes que son capaces de estimular la respuesta inmune frente a un antfgeno administrado, es decir, una cantidad que aumenta la respuesta inmune frente a una composicion de antfgeno administrada, medida en terminos de niveles de IgA en los lavados nasales, niveles de IgG o IgM en suero o proliferacion de celulas B o T. De forma adecuada, un aumento eficaz de los niveles de inmunoglobulina incluye mas del 5%, preferiblemente mas del 25% y, en particular, mas del 50% en comparacion con la misma composicion de antfgeno sin ningun adyuvante.
Agente de administracion
Tambien se describe una composicion que comprende un agente de administracion que funciona aumentando la captacion del antfgeno en funcion de, pero sin restricciones, un aumento de la viscosidad del lfquido debido al efecto unico o combinado de la deshidratacion parcial de los mucopolisacaridos del huesped, las propiedades ffsicas del agente de administracion o mediante interacciones ionicas entre el agente de administracion y los tejidos del huesped en el sitio de exposicion, lo que proporciona un efecto de deposito. Alternativamente, el agente de administracion puede aumentar el tiempo de retencion del antfgeno en el sitio de administracion (p. ej., retraso de la
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liberacion del antigeno). Este agente de administracion puede ser un agente bioadhesivo. En particular, el bioadhesivo puede ser un agente mucoadhesivo seleccionado entre el grupo compuesto por glucosaminoglucanos (p. ej., sulfato de condroitina, dermatano sulfato de condroitina, sulfato de queratano, heparina, sulfato de heparano, hialuronano), poKmeros de hidratos de carbono (p. ej., pectina, alginato, glucogeno, amilasa, amilopectina, celulosa, quitina, estaquiosa, inulina, dextrina, dextrano), derivados entrecruzados de poli(acido acnlico), alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidona, polisacaridos (como mucina y otros mucopolisacaridos), derivados de celulosa (p. ej., hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa), protemas (p. ej., lectinas, protemas frimbiales) y acido desoxirribonucleico. Preferiblemente, el agente mucoadhesivo es un polisacarido, como quitosano, una sal de quitosano o una base de quitosano (p. ej., glutamato de quitosano).
El quitosano, un polisacarido lineal con carga positiva derivado de la quitina de las conchas de los crustaceos, es un bioadhesivo para las celulas epiteliales y su capa mucosa superpuesta. La formulacion de los antfgenos con quitosano aumenta su tiempo de contacto con la membrana nasal, aumentando por tanto la captacion en virtud de un efecto deposito (Illum y col. 2001; 2003; Davis y col. 1999; Bacon y col. 2000; van der Lubben y col. 2001; 2001; Lim y col. 2001). El quitosano se ha probado como sistema de administracion nasal para varias vacunas, como para la gripe, pertussis y difteria, tanto en modelos animales como en humanos (Illum y col. 2001; 2003; Bacon y col. 2000; Jabbal-Gill y col. 1998; Mills y col. 2003; McNeela y col. 2004). En estos ensayos clmicos, se ha demostrado que el quitosano potencia las respuestas inmunes sistemicas a niveles equivalentes a la vacunacion parenteral. Ademas, tambien se midieron niveles significativos de IgA espedfica de antfgeno en las secreciones mucosas. Por tanto, el quitosano puede potenciar en gran medida la eficacia de una vacuna nasal. Ademas, debido a sus caractensticas ffsicas, el quitosano esta especialmente indicado para vacunas intranasales formuladas como polvos (van der Lubben y col. 2001; Mikszta y col. 2005; Huang y col. 2004).
Por consiguiente, en una realizacion, la presente invencion proporciona una composicion antigenica o para vacuna adaptada para la administracion intranasal, en la que la composicion incluye al menos un antfgeno de norovirus y al menos un adyuvante, en la que dicho antfgeno comprende partmulas similares a virus (VLP) de norovirus y el adyuvante no es una exotoxina derivada de bacterias y en la que la composicion se formula como polvo seco, preferiblemente en combinacion con al menos un agente de administracion, como quitosano, y al menos un adyuvante, como MPL®, CPF, imiquimod, gardiquimod o lfpido A sintetico o mimeticos o analogos de lfpido A.
El peso molecular del quitosano puede estar entre 10 kDa y 800 kDa, preferiblemente entre 100 kDa y 700 kDa y, mas preferiblemente, entre 200 kDa y 600 kDa. La concentracion de quitosano en la composicion tfpicamente sera de hasta aproximadamente el 80% (p/p), por ejemplo, el 5%, 10%, 30%, 50%, 70% u 80%. El quitosano es aquel que, preferiblemente, esta desacetilado al 75%, por ejemplo, al 80-90%, mas preferiblemente al 82-88% desacetilado, siendo ejemplos particulares con el 83%, 84%, 85%, 86% y 87% de desacetilacion.
Formulaciones para vacunas y antigenicas
Las composiciones de la invencion pueden formularse para su administracion como formulaciones para vacunas y antigenicas. Segun se usa en este documento, el termino “vacuna” se refiera a una formulacion que contiene VLP de norovirus u otros antfgenos de norovirus de la presente invencion segun se ha descrito anteriormente, que esta en forma tal que es posible administrarse a un vertebrado y que induce una respuesta inmune suficiente para inducir una inmunidad terapeutica para aliviar una infeccion y/o reducir al menos un smtoma de una infeccion y/o potenciar la eficacia de otra dosis de VLP o antfgeno. Segun se usa en este documento, los terminos “formulacion antigenica” o “composicion antigenica” se refieren a una preparacion que, cuando se administra a un vertebrado, por ejemplo un mairnfero, inducira una respuesta inmune. Segun se usa en este documento, el termino “respuesta inmune” se refiere tanto a la respuesta inmune humoral como a la respuesta inmune mediada por celulas. La respuesta inmune humoral conlleva la estimulacion de la produccion de anticuerpos por los linfocitos B que, por ejemplo, neutralizan agentes infecciosos, bloquean la entrada en las celulas de agentes infecciosos, bloquean la replicacion de dichos agentes infecciosos y/o protegen a las celulas huesped de la infeccion y la destruccion. La respuesta inmune mediada por celulas se refiere a una respuesta inmune que esta mediada por linfocitos T y/o por otras celulas, como macrofagos, frente a un agente infecciosos, mostrado por un vertebrado (p. ej., un humano), que previene o alivia la infeccion o reduce al menos un smtoma de la misma. La preparacion de la vacuna se describe de forma general en Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press Nueva York). Las composiciones de la presente invencion pueden formularse, por ejemplo, para su administracion en una o mas de entre las mucosas oral, gastrointestinal y respiratoria (p. ej., nasal).
Cuando se pretende que la composicion se administre en la mucosa respiratoria (p. ej., nasal), esta se formula como polvo seco, por ejemplo, para un deposito rapido dentro de las fosas nasales.
Las composiciones para administracion como polvo seco pueden contener uno o mas excipientes normalmente incluidos en dichas composiciones, por ejemplo, agentes mucoadhesivos, agentes de carga y agente para proporcionar caractensticas de flujo y tamano del polvo apropiadas. Entre los agentes de carga y de flujo y tamano del polvo pueden incluirse manitol, sacarosa, trehalosa y xilitol. Dichas composiciones pueden contener tambien conservantes, agentes de ajuste de la viscosidad, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes tamponadores y similares. Los agentes de viscosidad pueden ser celulosa microcristalina, quitosano, almidones, polisacaridos y
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similares.
En una realizacion, las composiciones de la invencion formuladas para la administracion como formulaciones para vacuna o antigenicas de norovirus pueden formularse como polvo seco que contiene uno o mas antigenos de genogrupos de norovirus como inmunogeno, un adyuvante como MPL®, un biopolfmero como quitosano para estimular la adhesion a las superficies de la mucosa y agentes de carga como manitol y sacarosa. Por ejemplo, la vacuna de norovirus puede formularse como 10 mg de un polvo seco que contenga uno o mas antfgenos del genogrupo de norovirus (p ej., virus de Norwalk, virus de Houston o virus de la Montana Nevada), adyuvante MPL®, mucoadhesivo quitosano y manitol y sacarosa como agentes de carga y para proporcionar caractensticas de flujo adecuados. La formulacion puede contener aproximadamente 7,0 mg (intervalo del 25 al 90% p/p) de quitosano, aproximadamente 1,5 mg de manitol (intervalo del 0 al 50% p/p), aproximadamente 1,5 mg de sacarosa (intervalo del 0 al 50% p/p), aproximadamente 25 |ig de MPL® (intervalo del 0,1 al 5% p/p) y aproximadamente 100 |ig de antfgeno de norovirus (intervalo de 0,05 a 5% p/p).
El antfgeno de norovirus puede estar presente a una concentracion desde aproximadamente el 0,01% (p/p) hasta aproximadamente el 80% (p/p). En una realizacion, los antfgenos de norovirus pueden estar formulados a dosis de aproximadamente 5 |ig, aproximadamente 15 |ig y aproximadamente 50 |ig por 10 mg de formulacion en polvo seco (0,025, 0,075 y 0,25% p/p) para su administracion en ambos fosas nasales o aproximadamente 10 |ig, aproximadamente 30 |ig y aproximadamente 100 |ig (0,1; 0,3 y 1,0% p/p) para su administracion en una fosa nasal. La formulacion puede administrarse en una o ambas fosas nasales durante cada administracion. Puede realizarse una administracion de refuerzo 1 a 12 semanas despues de la primera administracion para mejora la respuesta inmune. El contenido de los antfgenos de norovirus en las formulaciones para vacunas y antigenicas puede estar en el intervalo de 1 |ig a 100 mg, preferiblemente en el intervalo de 1-500 |ig, mas preferiblemente de 5-200 |ig, mas tipicamente en el intervalo de 10-100 |ig. El antfgeno de norovirus total administrado en cada dosis sera de aproximadamente 10 |ig, aproximadamente 30 |ig o aproximadamente 100 |ig en un total de 20 mg de polvo seco cuando se administra en ambas fosas nasales o de 100 mg de polvo seco cuando se administra en una fosa nasal. Las caractensticas del polvo seco son tales que menos del 10% de las partfculas tiene un diametro menor de 10 |im. El tamano medio de partfcula oscila entre 10 y 500 |im de diametro.
En otra realizacion, las composiciones para vacunas y antigenicas pueden formularse como un lfquido para administracion posterior a un sujeto. Una formulacion lfquida destinada a administracion intranasal comprendena antfgeno(s) del genogrupo de Norovirus, adyuvante y un agente de administracion tal como quitosano. Las formulaciones lfquidas para administracion oral o intramuscular (i.m.) comprendenan antfgeno(s) del genogrupo de Norovirus, adyuvante y un tampon, sin un agente de administracion (por ejemplo quitosano).
Preferiblemente, las composiciones antigenicas y para vacunas descritas anteriormente en este documento se liofilizan y conservan sin agua hasta que esten listas para su uso. Alternativamente, los diferentes componentes de la composicion pueden conservarse por separado en un kit o dispositivo (estando uno o todos los componentes liofilizados). Los componentes pueden permanecer en forma liofilizada para la formulacion seca. Para su administracion como polvo seco, la formulacion para vacuna o antigenica puede cargarse previamente en un dispositivo de administracion intranasal o un parche de administracion topica (p. ej., dermica) y conservarse hasta su uso. Preferiblemente, este dispositivo de administracion y el envase asociado protegeran y aseguraran la estabilidad de su contenido.
La liofilizacion de formulaciones antigenicas y para vacunas es bien conocida en la tecnica. Tfpicamente, el antfgeno lfquido se liofiliza en presencia de agentes que lo protegen durante el proceso de liofilizacion y para obtener polvos con las caractensticas deseadas. Normalmente se utilizan azucares como sacarosa, manitol, trehalosa o lactosa (presentes a una concentracion inicial de 10-200 mg/ml) para la crioproteccion y lipoproteccion de los antfgenos proteicos y para obtener pastillas o polvos liofilizados con las caractensticas deseadas. Las composiciones liofilizadas son, en teona, mas estables. Tambien pueden utilizarse otras tecnologfas de secado, como secado por pulverizacion o liofilizacion por pulverizacion. Mientras que el objetivo de la mayona de los procesos de formulacion es minimizar la agregacion y degradacion de la protema, los inventores han demostrado que la presencia de antfgeno agregado potencia la respuesta inmune frente a las VLP de norovirus (veanse los ejemplos 3 y 4 en modelos animales). Por tanto, los inventores han desarrollado procedimientos por los cuales puede controlarse el porcentaje de agregacion del antfgeno durante el proceso de liofilizacion para producir una proporcion optima de antfgeno agregado para que un antfgeno intacto induzca una respuesta inmune maxima en modelos animales.
Por tanto, tambien se describe un procedimiento para obtener formulaciones de antfgeno de norovirus que comprende a) preparar una solucion previa a la liofilizacion que contiene el antfgeno de norovirus, sacarosa y quitosano donde las proporciones de sacarosa con respecto a quitosano, son de aproximadamente 0:1 a aproximadamente 10:1; b) congelar la solucion y c) liofilizar la solucion congelada durante 30-72 horas, donde el producto liofilizado final contiene un porcentaje de dicho antfgeno de norovirus en forma de agregado. La liofilizacion puede realizarse a temperatura ambiente, temperatura reducida o proceder en ciclos a diversas temperaturas. Solo con fines ilustrativos, la liofilizacion puede tener lugar en varios pasos, por ejemplo, un ciclo inicial a -69°C, ajustado gradualmente a -24°C durante 3 horas, manteniendo a continuacion esta temperatura durante 18 horas, y
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ajustandola despues gradualmente a -16°C durante 1 hora, manteniendo esta temperatura durante 6 horas y ajustandola a +34°C de forma gradual durante 3 horas y, finalmente, manteniendo esta temperatura durante 9 horas. La solucion previa a la liofilizacion puede contener ademas un agente de carga. Dicho agente de carga puede ser manitol.
Las proporciones adecuadas de sacarosa y quitosano para obtener los porcentajes deseados de agregacion pueden determinarse mediante las siguientes directrices. Una mezcla previa a la liofilizacion que contenga proporciones de masa de sacarosa con respecto al quitosano en un intervalo de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 10:1 producira un intervalo de aproximadamente el 50% al 100% de antfgeno de norovirus intacto (es decir, del 0% al 50% de antfgeno agregado) tras la liofilizacion dependiendo de las concentraciones de la solucion previa a la liofilizacion (vease el ejemplo 13). Las proporciones de masa de 0:1 de sacarosa con respecto a quitosano produciran menos del 30% de antfgeno de norovirus intacto (es decir, mas del 70% de antfgeno agregado). La omision tanto de sacarosa como de quitosano y el uso solo de un agente de carga, como manitol, producira menos del 10% de antfgeno intacto (es decir, mas del 90% de antfgeno agregado dependiendo de las concentraciones de la solucion previa a la liofilizacion). Usando estas directrices, el experto podna ajustar las proporciones de masa de sacarosa con respecto a quitosano y las concentraciones en la mezcla previa a la liofilizacion para obtener la cantidad de agregacion deseada para producir una respuesta inmune optima.
Ademas, la inclusion de sacarosa, quitosano y manitol en la solucion previa a la liofilizacion no tiene efecto negativo sobre la estabilidad del antfgeno de norovirus intacto con el tiempo, es decir, la proporcion de antfgeno agregado/antfgeno intacto en la formulacion no aumenta cuando se conserva como polvo seco durante un periodo de aproximadamente 12 meses o mas (vease el ejemplo 10). Por tanto, este procedimiento de liofilizacion garantiza formulaciones estables con proporciones predecibles y controlables de antfgeno de norovirus agregado con respecto al antfgeno intacto.
Procedimientos para estimular una respuesta inmune
La cantidad de antfgeno en cada dosis de formulacion antigenica o para vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmune solida sin efectos adversos significativos. Esta cantidad variara dependiendo de que antfgenos espedficos se empleen, ruta de administracion y adyuvantes utilizados. En general, la dosis administrada a un paciente debena ser suficiente para producir una respuesta terapeutica beneficiosa en el paciente con el tiempo o inducir la produccion de anticuerpos espedficos de antfgeno. Por tanto, la composicion se administra a un paciente en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune frente a antfgenos espedficos y/o aliviar, reducir o curar los smtomas y/o complicaciones de la enfermedad o infeccion. La cantidad adecuada para conseguir esto se define como una “dosis terapeuticamente eficaz”.
Para una forma sustancialmente pura del antfgeno de norovirus, se preve que cada dosis comprenda de aproximadamente 1 |ig a 10 mg, preferiblemente aproximadamente 2-50 |ig para cada antfgeno de norovirus en la formulacion. En un regimen de inmunizacion tfpica que emplea las preparaciones antigenicas de la presente invencion, las formulaciones puede administrarse en varias dosis (p. ej., 1-4), conteniendo cada dosis 1-100 |ig de cada antfgeno. La dosis sera determinada por la actividad inmunologica de la composicion producida y la afeccion del paciente, asf como el peso corporal o las areas superficiales del paciente que se va a tratar. El tamano de la dosis tambien se determinara por la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto secundario adverso que pudiera acompanar a la administracion de una composicion en particular a un paciente en especial.
Las composiciones de la invencion formulada para su administracion como formulaciones para vacunas o antigenicas pueden administrarse mediante una via mucosa o no mucosa. Estas administraciones pueden incluir la administracion in vivo mediante inyeccion parenteral (p. ej., intravenosa, subcutanea e intramuscular) u otras vfas directas tradicionales, como vfas bucal/sublingual, rectal, oral, nasal, topica (como transdermica y oftalmica), vaginal, pulmonar, intraarterial, intraperitoneal, intraocular o intranasal o directamente dentro de un tejido espedfico. Alternativamente, las vacunas de la invencion pueden administrarse mediante cualquiera de las diversas vfas, como oral, topica, subcutanea, mucosa, intravenosa, intramuscular, intranasal, sublingual, transcutanea, subdermica, intradermica y mediante supositorios. La administracion puede conseguirse simplemente mediante administracion directa usando un parche, aguja, cateter o dispositivo relacionado, en un unico punto temporal o en multiples puntos temporales.
En una realizacion preferida, las composiciones de la invencion formuladas para la administracion como formulaciones para vacunas o antigenicas se administran en una superficie mucosa. La inmunizacion a traves de las superficies mucosas ofrece numerosas posibles ventajas sobre otras rutas de inmunizacion. Los beneficios mas obvios son 1) la inmunizacion mucosas no requiere de agujas o personal muy preparado para su administracion y 2) las respuestas inmunes se generan en los sitios de entrada de patogenos, asf como a nivel sistemico (Isaka y col., 1999; Kozlowski y col., 1997; Mestecky y col., 1997; Wu y col., 1997).
Adicionalmente, se describe un procedimiento para inducir una respuesta inmune mucosa IgA y una respuesta inmune sistemica IgG mediante la administracion (preferiblemente intranasal u oral) en una superficie mucosa del paciente una composicion antigenica o para vacuna que comprende uno o mas antfgenos de norovirus, al menos un
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adyuvante eficaz y/o al menos un agente de administracion.
Tambien se describe la provision de medios para la dispensacion de las formulaciones intranasales de antfgenos de norovirus definidas anteriormente en este documento y al menos un adyuvante o al menos un agente de administracion como se define anteriormente en este documento. Un dispositivo de dispensacion puede, por ejemplo, estar en forma de un sistema de administracion como aerosol y puede prepararse para dispensar solo una dosis o diversas dosis. Este dispositivo podna administrar una dosis regulada de la formulacion para vacuna o antigenica en las fosas nasales. Entre otros ejemplos de dispositivos apropiados se incluyen, pero sin limitaciones, cuentagotas, torunda, aerosoles, insufladores (p. ej., dispositivo de administracion nasal Valois Monopowder, Bespak UniDose DP), nebulizadores e inhaladores. Los dispositivos pueden administrar la formulacion para vacuna o antigenica mediante sistemas pasivos que requieren que el sujeto inhale la formulacion en su cavidad nasal. Alternativamente, el dispositivo puede administrar de forma activa la formulacion mediante el bombeo o pulverizacion de una dosis dentro de la cavidad nasal. La formulacion antigenica o para vacuna puede administrarse dentro de una o ambas fosas nasales mediante uno o mas de estos dispositivos. La administracion podna incluir dos dispositivos por sujeto (un dispositivo por fosa nasal). La dosis real de principio activo (antfgeno de norovirus) puede ser de aproximadamente 5-1.000 |ig. La formulacion antigenica o para vacuna puede administrarse en la mucosa nasal mediante deposito rapido dentro de las fosas nasales a partir de un dispositivo que contenga la formulacion que se mantiene proximo o se inserta en la fosa nasal.
Tambien se describe un procedimiento de generacion de anticuerpos frente a uno o mas antfgenos de norovirus, comprendiendo dicho procedimiento la administracion de la composicion de la invencion. Estos anticuerpos pueden aislarse y purificarse mediante procedimientos rutinarios en la tecnica. Los anticuerpos aislados espedficos para los antfgenos de norovirus pueden usarse en el desarrollo de ensayos inmunologicos diagnosticos. Estos ensayos podnan emplearse para detectar un norovirus en muestras clmicas e identificar el virus en concreto causante de la infeccion (p. ej., Norwalk, Houston, Montana Nevada, etc.). Alternativamente, los anticuerpos aislados pueden administrarse a sujetos susceptibles de infeccion por norovirus para conferir una inmunidad pasiva o a corto plazo.
Como se menciono anteriormente, las composiciones de la invencion formuladas para su administracion como formulaciones para vacunas o antigenicas pueden administrarse a un sujeto para tratar los smtomas de una infeccion por norovirus. En la tecnica son bien conocidos los smtomas de la infeccion por norovirus e incluyen nauseas, vomitos, diarrea y colicos estomacales. Adicionalmente, un paciente con una infeccion por norovirus puede presentar febncula, cefalea, escalofnos, dolor muscular y fatiga. Tambien se describe un procedimiento de induccion de una respuesta inmune en un sujeto que sufre una infeccion por norovirus administrando al sujeto una formulacion para vacuna de la invencion de modo que se mejora y/o reduce al menos un smtoma asociado con la infeccion por norovirus. La reduccion de un smtoma puede determinarse subjetiva u objetivamente, por ejemplo, autovaloracion por un sujeto, valoracion por un medico o realizacion de un ensayo o medicion apropiada (p. ej., temperatura corporal), incluyendo, por ejemplo, una evaluacion de la calidad de vida, una progresion mas lenta de la infeccion por norovirus o de los smtomas adicionales, una reduccion de la intensidad de los smtomas de norovirus o de ensayos adecuados (p. ej., valor del anticuerpo y/o ensayos de activacion de celulas T). La evaluacion objetiva comprende tanto evaluaciones animales como humanas.
Ejemplos
Ahora, la invencion se ilustrara con mayor detalle en referencia a las realizaciones espedficas descritas en los ejemplos siguientes. Se pretende que los ejemplos sean puramente ilustrativos de la invencion y no pretenden limitar su alcance de ninguna forma.
Ejemplo 1. Investigaciones sobre respuestas inmunes a diferentes formas de antigenos de norovirus
Para estudiar la eficacia de las formulaciones para vacunas, se inmunizaron ratones por via intranasal (i.n.) con una formulacion para vacuna en suspension lfquida mediante una micropipeta. Los ratones recibieron solo una unica dosis de vacuna (sensibilizacion).
Para el experimento, se prepararon tres formulaciones para vacuna. La primera, denominada 100% agregada, se preparo mediante liofilizacion de VLP en condiciones que alteran la estructura nativa de la VLP e induce agregacion. La segunda, 100% intacta, se preparo con placebo liofilizado rehidratado, inoculada con VLP monodispersas 100% nativas a partir de soluciones madre de VLP no liofilizadas. La tercera formulacion, mezcla 50/50, se hace mezclando las dos formulaciones previas en una proporcion 1:1 o liofilizando en condiciones que producen VLP aproximadamente 50% intactas y 50% agregadas. El estado estructural y la concentracion de VLP nativa intacta se evaluaron mediante cromatograffa lfquida de alta resolucion de exclusion molecular (EM-HPLC) y absorbancia con luz ultravioleta (UV). La concentracion de protema total (que incluye el agregado) de las formulaciones se determino mediante tincion cuantitativa de las protemas resueltas en electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sodico (PAGE-SDS). El porcentaje de agregada/intacta se calculo como la proporcion de VLP nativa intacta frente a la protema total.
Tabla 1. Las mezclas mostradas a continuacion se prepararon para el experimento 605.125, vacunacion lfquida i.n.
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en raton
Numero de grupo
Quitosano (mg/ml) Manitol (mg/ml) Sacarosa (mg/ml) MPL (mg/ml) VLP de Norwalk (mg/ml)
1
3,5 0,750 0,750 1,0 1,0
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3,5 0,750 0,750 1,0 1,0
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3,5 0,750 0,750 1,0 1,0
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3,5 0,750 0,750 1,0 0
Tabla 1. Sensibilizacion para el exp. 605.125 (i.n. en raton) Los valores indican las concentraciones finales de las formulaciones.
Dosis: 20 |il por raton; 10 |il por fosa nasal.
Grupo 1, 100% agregada: VLP 100% agregadas rehidratadas.
Grupo 2; 100% intacta: placebo liofilizado rehidratado, inoculado con VLP 100% intactas a partir de una solucion madre de VLP no liofilizada.
Grupo 3, mezcla 50/50: mezclas 1:1 de soluciones de los grupos 1 y 2.
Grupo 4, naive: placebo liofilizado rehidratado.
En este experimento se mide la respuesta inmune en ratones frente a diferentes formulaciones de VLP de norovirus. Se vacunaron por via intranasal (i.n.) a grupos de ratones (5 por grupo) una vez con las formulaciones en polvo seco rehidratadas mostradas en la Tabla 1. Los animales vacunados con formulaciones que conteman VLP recibieron la misma cantidad de protema total. 100% agregada (protema VLP agregada al 100%), 100% intacta (VLP monodispersas 100% nativas), mezcla 50/50 (mezcla 1:1 de VLP monodispersas y agregadas), naive (sin protema VLP). El dfa 14 tras la inmunizacion i.n., se sacrifico a los ratones, se extrajeron los ganglios linfaticos cervicales y los bazos y se preparo una unica suspension celular para los ensayos de proliferacion celular in vitro espedfica de antfgeno. En estos ensayos se evaluo la respuesta de las celulas de los ganglios linfaticos cervicales o de los esplenocitos para determinar las respuestas inmunogenicas frente al antfgeno tras la inmunizacion in vivo. Las celulas de ganglios linfaticos cervicales o los esplenocitos fueron reestimulados con VLP monodispersas nativas (VLP nativa, barras negras) o con protema de VLP desnaturalizada por calor (AVLP, barras blancas), y se determino el grado de proliferacion celular de cada forma de antfgeno (100% agregada, 100% intacta, mezcla 50/50 o naive) mediante la incorporacion de timidina tritiada como se indica en el eje de ordenadas (CPM) (Figura 1, celulas de ganglio linfatico cervical, Figura 2, esplenocitos).
Ejemplo 2: Ensayo de proliferacion in vitro especifico de antigeno
Para estudiar mas en profundidad la potencia de las formulaciones para vacuna, se inmunizo a ratones por via intraperitoneal (i.p.) con la formulacion para vacuna en suspension lfquida. Los ratones recibieron solo una unica dosis de vacuna (sensibilizacion).
De forma similar al ejemplo 1, se vacunaron grupos de ratones (5 por grupo), aunque esta vez por via intraperitoneal (i.p.), una vez con las formulaciones en polvo seco rehidratadas mostradas en la Tabla 2. De nuevo, los animales vacunados con formulaciones que conteman VLP recibieron la misma cantidad de protema total. 100% agregada (protema VLP agregada al 100%), 100% intacta (VLP intactas 100% nativas); mezcla 50/50 (mezcla 1:1 de VLP intactas y agregadas), naive (sin protema VLP).
Tabla 2. Las mezclas mostradas a continuacion se prepararon para el experimento 605.127, inmunizacion lfquida i.p. en raton.
Numero de grupo
Quitosano (mg/ml) Manitol (mg/ml) Sacarosa (mg/ml) MPL (mg/ml) VLP de Norwalk (mg/ml)
1
7 1,475 1,475 0,025 0,025
2
7 1,475 1,475 0,025 0,025
3
7 1,475 1,475 0,025 0,025
4
7 1,475 1,475 0,025 0
Sensibilizacion para el exp. 605.127 (i.p. en raton) Los valores indican las concentraciones finales de las formulaciones y son equivalentes a un dispositivo de administracion unico de 10 mg.
Dosis: 1 ml i.p. por raton.
Grupo 1, 100% agregada: VLP 100% agregadas rehidratadas.
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Grupo 2; 100% intacta: placebo liofilizado rehidratado, inoculado con VLP 100% intactas a partir de una solucion madre de VLP no liofilizada.
Grupo 3, mezcla 50/50 : rehidratado a partir de VLP liofilizada intacta/agregada 50/50.
Grupo 4, naive: placebo liofilizado rehidratado.
En este ensayo se midio la respuesta de diferentes celulas murinas a las VLP tras la inmunizacion in vivo. El dfa 14 despues de la inmunizacion, los ratones fueron sacrificados, se extrajeron los bazos y se preparo una unica suspension celular. Los esplenocitos fueron estimulados de nuevo con VLP intactas nativas (VLP nativa, barras punteadas) o con protema de VLP desnaturalizada por calor (AVLP, barras blancas), y se determino el grado de proliferacion celular de cada forma de antigeno (100% agregada, 100% intacta, mezcla 50/50 o naive) mediante la incorporacion de timidina tritiada como se indica en el eje de ordenadas (CPM) (Figura 3). Estos datos indican que diferentes formas bioffsicas de las VLP preparadas en las formulaciones para vacuna desencadenan respuestas de celulas T comparables.
Ejemplo 3. Ensayo ELISPOT especifico de VLP
Las respuestas de celulas secretoras de anticuerpos (CSA) espedficas de VLP se midieron en ratones inmunizados por via intraperitoneal con las diferentes formulaciones VLP de NV descritas en el ejemplo 2. Se vacunaron grupos de ratones (5 por grupo) i.p. una vez con las formulaciones en polvo seco rehidratadas mostradas en la Tabla 2 (ejemplo 2). Los animales vacunados con formulaciones que conteman VLP recibieron la misma cantidad de protema total. 100% agregada (protema VLP agregada al 100%), 100% intacta (VLP intactas 100% nativas); mezcla 50/50 (mezcla 1:1 de VLP intactas y agregadas), naive (sin protema VLP). A dfa 14, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron los ganglios linfaticos cervicales. Las celulas de los ganglios linfaticos cervicales se cultivaron durante la noche en placas de ELISPOT recubiertas con VLP intactas nativas y se desarrollan los ELISPOT espedficos de IgG o IgA usando los anticuerpos secundarios conjugados peroxidada de rabano picante (HRP) apropiados (Figura 4). Estos datos muestran que las tres formulaciones de antfgeno de VLP indudan una respuesta de celulas B espedfica de antfgeno. El grupo inmunizado con VLP 100% agregada mostraba la mayor respuesta inmune.
Ejemplo 4. ELISA especifico de VLP
Los niveles de IgG serica se midieron a partir de ratones inmunizados i.p. con diferentes formulaciones de VLP de NV. Se vacunaron grupos de ratones (5 por grupo) i.p. una vez con las formulaciones en polvo seco rehidratadas mostradas en la Tabla 2 (ejemplo 2). Los animales vacunados con formulaciones que conteman VLP recibieron la misma cantidad de protema total. 100% agregada (protema VLP agregada al 100%), 100% intacta (VLP intactas 100% nativas); mezcla 50/50 (mezcla 1:1 de VLP intactas y agregadas), naive (sin protema VLP). A dfa 14, se recogio el suero y se analizo mediante ELISA la IgG en suero espedfica anti-VLP (Figura 5). Estos datos se correlacionan con los resultados mostrados en el ejemplo 3, lo que indica que las tres formulaciones de antfgeno VLP inducen una respuesta de celulas B espedfica de antfgeno. Una vez mas, el grupo inmunizado con VLP 100% agregada mostraba la mayor respuesta inmune.
Ejemplo 5. Formulaciones para vacuna en conejos
Las formulaciones se administraron a conejos por via intranasal (i.n.) usando el dispositivo de administracion nasal MonoPowder de Valois. Las formulaciones en polvo seco se muestran en las tablas 3 y 4.
Tabla 3. Las formulaciones descritas a continuacion se prepararon para el experimento 605.129, vacunacion con polvo seco (PS) i.n. en conejo
Formulaciones de sensibilizacion para el exp. 605.129 (i.n. en conejo) (cantidades finales para las vacunas de PS).
Numero de grupo
Quitosano (mg/10 mg de PS) Manitol (mg/10 mg) Sacarosa (mg/10 mg) MPL (mg/10 mg) VLP de Norwalk (ml/10 mg)
1
7 1,475 1,475 0,025 0,025
2
7 1,475 1,475 0,025 0,025
3
7 1,475 1,475 0,025 0,025
4
7 1,475 1,475 0,025 0
Los valores indican las concentraciones finales de las formulaciones segun un dispositivo unico (10 mg de PS) que es 1/2 de la dosis total.
Dosis: 20 mg de PS por animal, 10 mg por fosa nasal.
Grupo 1, 100% agregada: VLP liofilizadas 100% agregadas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Grupo 2; 100% intacta: VLP liofilizadas 100% intactas
Grupo 3, mezcla 50/50: VLP liofilizadas intactas/agregadas 50/50 (no una mezcla de 1 y 2).
Grupo 4, naive: placebo.
Tabla 4. Las formulaciones mostradas a continuacion se prepararon para el experimento 605.129, vacunacion con polvo seco (PS) i.n. en conejo.
Formulaciones de recuerdo para el exp. 605.129 (i.n. en conejo) (cantidades finales para las vacunas de PS).
Numero de grupo
Quitosano (mg/10 mg de PS) Manitol (mg/10 mg) Sacarosa (mg/10 mg) MPL (mg/10 mg) VLP de Norwalk (mg/10 mg)
1
7 1,475 1,475 0,025 0,025
2
7 0 2,95 0,025 0,025
3
7 1,475 1,475 0,025 0,025
4
7 1,475 1,475 0,025 0
Los valores indican las concentraciones finales de las formulaciones segun un dispositivo unico (10 mg de PS) que es 1/2 de la dosis total.
Dosis: 20 mg de PS por animal, 10 mg por fosa nasal.
Grupo 1, 100% agregada: VLP 100% agregadas liofilizadas.
Grupo 2; 100% intacta: VLP* 100% intactas**
Grupo 3, mezcla 50/50: VLP liofilizadas intactas/agregadas 50/50 (no una mezcla de 1 y 2).
Grupo 4, naive: placebo liofilizado.
*Formuladas sin manitol para aumentar la cantidad de VLP intactas tras la liofilizacion.
**La preparacion produce solo ~80% de VLP intactas.
Ejemplo 6. Ensayo de potencia de la formulacion para vacuna de norovirus en ratones
Se inmunizaron ratones C57B16 hembra por via intraperitoneal (i.p.) el dfa 0 con diferentes diluciones de una vacuna en polvo seco de VLP de Norwalk reconstituida (que contema VLP de Norwalk, MPL y quitosano). Se inyectaron a cada animal 100 |il de las formulaciones indicadas. Se recogio el suero cada semana y se midio la IgG en suero anti-VLP mediante ELISA. Los valores del suero recogido 3 semanas despues de la inmunizacion se muestran en la Figura 6.
Se representa el valor de cada raton individual, indicando las barras la media del grupo. Los valores de IgG anti VLP en suero se correlacionan con la dosis de vacuna indicada. Este diseno experimental ha sido refinado y desarrollado como ensayo de potencia necesario para el lanzamiento de vacunas fabricadas segun al BPF para ensayos clmicos en humanos (Figura 6).
Ejemplo 7. Potencia de las formulaciones de norovirus liquidas frente a reconstituidas en ratones
Se inmunizo a ratones C57B16 hembra i.p. el dfa 0 con formulaciones que conteman quitosano, manitol, MPL y diversas concentraciones de VLP de Norwalk (Tabla 5) en un volumen de 100 |il. Se genero una curva patron interna (grupos 1-5) solubilizando 10 mg/ml de matriz en polvo seco (manitol, MPL y quitosano) en agua purificada y se anadieron las cantidades especificadas de VLP de Norwalk lfquida. Por el contrario, los lotes de VLP segun la BPF se liofilizaron previamente y, a continuacion, se solubilizaron en 1,0 ml de agua purificada (grupos 6-8). Se recogio suero de los ratones los dfas 14, 21 y 30 y la IgG anti-VLP de Norwalk en suero se midio mediante ELISA.
Tabla 5. Formulaciones de Norwalk lfquidas y reconstituidas utilizadas en ratones inmunizados (i.p.).
Grupo
Tratamiento IC del 95% Potencia calculada
Potencia
Mm. Max.
1
5 |ig de VLP en placebo 0,173 58,0 39,0 86,3
2
2,5 |ig de VLP en placebo 0,192 23,3 15,0 36,3
3
1,25 |ig de VLP en placebo 0,182 11,2 7,4 17,0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
4
0,63 |ig de VLP en placebo 0,287 5,4 2,8 10,4
5
0,31 |ig de VLP en placebo 0,114 3,8 2,9 4,9
6
2,5 |ig del lote BPF 0,276 11,3 6,0 21,3
7
7,5 |ig del lote BPF 0,221 96,8 58,2 161,0
8
25 |ig del lote BPF 0,147 113,6 80,9 159,5
La potencia relativa de cada formulacion se calculo usando la siguiente formula: Antilog. (Media - intersecc.Y/pendiente). La potencia se representa frente a la concentracion de VLP en las formulaciones y se notifica en relacion con la curva patron generada usando cantidades conocidas de VLP inoculadas dentro del fondo de la matriz (Figura 7). Los resultados mostrados son representativos de 3 puntos temporales de recogida de suero independientes. Estos datos indican que la formulacion de VLP de Norwalk reconstituida a partir de polvo seco tiene una potencia total mas alta que las formulaciones lfquidas.
Ejemplo 8. Potencia de la formulacion en polvo seco en conejos
Se inmunizaron por via intranasal (i.n.) 43 conejos hembra New Zealand White usando el dispositivo de administracion nasal Monopowder de Valois con 5 |ig (Bajo) o 25 |ig (Alto) de VLP de Norwalk ± MPL y ± quitosano formulados como polvos secos. Un grupo recibio la dosis Alta de VLP y MLP formulados como lfquido y administrados por via intramuscular (i.m.). Los conejos se vacunaron los dfas 0 y 21. Cuando se utilizo MPL, se hizo a la misma dosis que las VLP (es decir, 5 |ig de VLP de Norwalk y 5 |ig de MPL). Cuando se utilizo quitosano, se hizo a 7 mg/dosis.
La IgG espedfica en suero para las VLP de Norwalk (segun se determina por ELISA), se muestra en la Figura 8. Se muestra la media de los valores para cada grupo de tratamiento del dfa 21 (panel izquierdo, recogido justo antes de la administracion de la inmunizacion de recuerdo) y del dfa 42 (panel izquierdo). Los valores se presentan en U/ml de IgG espedfica de VLP, con 1 U aproximadamente por 1 |ig. Las desviaciones tfpicas se indican mediante barras. Todos los grupos de tratamiento teman 6 animales, excepto el grupo control negativo (3 conejos) y el grupo inmunizado por via intramuscular (4 animales). Estos datos muestran que, generalmente, la dosis de VLP mas alta da lugar a niveles mas altos de IgG anti-VLP en suero. El quitosano, en particular, potencia las respuestas a vacunas intranasales. El grupo inmunizado i.m. mostro las mayores respuestas. Sin embargo, los niveles de IgG espedfica de VLP en los grupos inmunizados por via intranasal tambien fueron bastante solidos.
Ejemplo 9. Potencia de las formulaciones de norovirus liquidas frente a secas administradas por via intranasal en conejos
Los conejos New Zealand White hembra fueron inmunizados por via intranasal usando el dispositivo de administracion nasal Monopowder de Valois con 50 |ig de VLP de Norwalk + 50 |ig de MPL + 14 mg de quitosano formulados como un polvo seco o un lfquido. El contenido de la vacuna era identico, excepto por el estado ffsico. Las inmunizaciones se realizaron los dfas 0 y 21 (semanas 0 y 3), con recogfa de suero antes de la dosis de recuerdo a las 3 semanas y de nuevo a las 6 semanas despues de la vacunacion inicial. La IgG espedfica en suero para las VLP de Norwalk se midio mediante ELISA y los resultados se muestran en la Figura 9.
Se indican las medias de grupo, representando las barras las desviaciones tfpicas. El grupo de inmunizacion con polvo seco estaba compuesto por 6 conejos y el grupo de inmunizacion lfquida por 10 conejos. Se representan 8 conejos control negativo. Se observaron pequenas diferencias entre los grupos de inmunizacion lfquida y con polvo seco a las 3 semanas; sin embargo, 6 semanas tras la inmunizacion inicial, los conejos inmunizados con la formulacion en polvo seco presentaban respuestas IgG anti-VLP en suero superiores en comparacion con el grupo de inmunizacion lfquida.
Ejemplo 10. Estabilidad de las formulaciones en polvo seco de norovirus
Para estudiar la estabilidad de la formulacion de VLP en polvo seco, el farmaco sin procesar se preparo mezclando (por cada 10 mg de farmaco) 25 |ig de una VLP del genogrupo I en solucion con 25 |ig de MPL, 700 |ig de glutamato de quitosano, 1.475 mg de manitol y 1.475 mg de sacarosa. La solucion se liofilizo, se mezclo con 6,3 mg de glutamato de quitosano adicional (por cada 10 mg de farmaco), se cargo en dispositivos monodosis Bespak a un valor nominal de 10 mg de polvo seco y se conservo en bolsas de aluminio selladas con capsulas de desecante. El contenido total de VLP se midio usando PAGE-SDS tenido con rojo Imperial y se hizo un escaner de densitometna, mientras que se uso la cromatograffa de exclusion molecular (CEM) para cuantificar el contenido de VLP intactas. Estas medidas indicaban que, dentro del error experimental, los cambios en la VLP total o intacta no eran detectables durante el periodo de 12 meses (Figura 10). Asumiendo que la menor recuperacion de la protema VLP por CEM, en comparacion con los resultados del PAGE en presencia de SDS, era debido a la agregacion, el porcentaje agregado calculado no aumentaba con el tiempo sino que mas bien permaneda constante o disminma a lo largo de los 12 meses de conservacion. Uno de los problemas de estabilidad mas frecuente con las protemas es un aumento de la agregacion durante su conservacion. En funcion de los resultados presentados en la Figura 10, puede concluirse que la formulacion da lugar a un porcentaje estable de VLP intactas, lo que permite la fabricacion y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
uso del producto durante al menos un periodo de un ano.
Ejemplo 11. Antigenos multiples de norovirus
Se inmunizaron 8 ratones C57Bl/6 (hembras de 9 semanas de edad) por via intraperitoneal (i.p.) los dfas 0 y 14 con 2,5 |ig de VLP de Norwalk formuladas con 0,7 mg de quitosano, 2,5 |ig de MPL y 0,3 mg de manitol llevado a 0,1 ml con agua. Se inmunizaron dos ratones control con solucion salina. Los dfas 28 y 49 se inmunizaron de nuevo i.p. con 2,5 |ig de VLP de Norwalk + 2,5 |ig de VLP de Houston formuladas con 0,7 mg de quitosano, 2,5 |ig de MPL y 0,3 mg de manitol llevado a 0,1 ml con agua. Los ratones control recibieron solucion salina de nuevo. Las muestras de suero se recogieron cada semana a partir de la semana 5 (dfa 35) y se analizo por ELISA su reactividad con VLP de Norwalk o VLP de Houston. El momento de la inmunizacion de recuerdo con las mezclas solo de Norwalk se indican mediante las flechas delgadas y las mezclas de VLP de Norwalk + Houston se indican mediante flechas gruesas. Se muestran las respuestas de IgG en suero individuales espedficas para las VLP de Norwalk (panel superior) o VLP de Houston (panel inferior) en U/ml (con aproximadamente 1 U por 1 |ig de IgG). Las medias estan indicadas por barras. Tengase en cuenta que las escalas del eje Y son diferentes, ya que las respuestas anti- Norwalk eran mucho mas solidas debido a dos inmunizaciones previas los dfas 0 y 14 (semanas 0 y 2). Sin embargo, las respuestas frente a las VLP de Houston son bastante solidas, con la aparicion de un gran aumento en la segunda semana tras la inmunizacion de recuerdo. Estos datos demuestran que pueden generarse respuestas inmunes espedficas frente a diferentes cepas antigenicas de VLP de norovirus en la misma mezcla inmunizante (Figura 11).
Ejemplo 12. Respuesta inmune frente a diferentes antigenos de norovirus
Se inmunizaron ratones C57B16 hembra por via intraperitoneal (i.p.) los dfas 0 y 14 con 25 |ig de VLP de Norwalk, 25 |ig de VLP de Houston o una combinacion de 25 |ig de VLP de Norwalk y 25 |ig de VLP de Houston. Se recogio el suero cada semana y se midio la IgG en suero anti-VLP mediante ELISA. Los valores del suero recogido 4 semanas despues de la inmunizacion se muestran en la Figura 12.
El contenido de VLP de las inmunizaciones se indica en el eje X. Se representa en valor de cada raton individual, indicando las barras la media del grupo. Los niveles de anticuerpos se representan en U/ml, siendo 1 U aproximadamente 1 |ig de IgG en suero. Los valores en el panel izquierdo se determinaron usando VLP de Norwalk como agente de captura, mientras que las VLP de Houston se usaron para recubrir las placas de ELISA para medir los valores del panel de la derecha. Estos datos muestran que la inmunizacion con VLP de Norwalk no induce la obtencion de anticuerpos en suero que son capaces de reconocer las VLP de Houston o viceversa.
Ejemplo 13. Las mezclas de sacarosa y quitosano conservan la estructura de VLP de norovirus en las formulaciones en polvo seco
En los experimentos siguientes se examinaron los efectos de la sacarosa, el quitosano y el manitol solo o en combinacion, en soluciones previas a la liofilizacion en la estructura cuaternaria de las VLP nativas de Norwalk durante la liofilizacion. La Tabla 6 es una mezcla de varios experimentos que muestra las concentraciones de las soluciones previas a la liofilizacion de los constituyentes de interes, el volumen total de la mezcla y las proporciones de masa correspondientes. Todas las soluciones se removieron manualmente y se agitaron con suavidad hasta homogeneidad, a continuacion se congelaron en nitrogeno lfquido y se liofilizaron de forma externa a la unidad usando recipientes con tubo lateral durante tiempos que oscilaban de aproximadamente 30 a 60 horas.
Tabla 6. Mezclas de solucion preliofilizacion utilizadas para comprobar los efectos de diferentes concentraciones y combinaciones de sacarosa, glutamato de quitosano (quitosano) y manitol sobre la estructura cuaternaria de las VLP de Norwalk.
Experimento y muestra
Concentraciones de las soluciones de constituyentes previas a la liofilizacion (mg/ml) Volumen total (ml) Equivalentes de masa S = sacarosa Q = quitosano M = manitol
Sacarosa
Quitosano Manitol VLP (protema) S Q M
LE1
0 0 100 0,83 0,30 0 0 1
LE2
0 0 75,0 0,62 0,40
LE3
0 0 50,0 0,42 0,60
LE4
0 0 25,0 0,21 1,20
5
10
15
20
25
LE5
0 0 10,0 0,08 3,00
LG1-LG3
0 7,83 0 0,20 1,28 0 1 0
LG4-LG6
0 5,06 0 0,13 1,98
LG7-LG9
0 2,09 0 0,05 4,78
LG10
19,32 1,93 0 0,05 5,18 10 1 0
LG11
10,05 2,01 0 0,05 4,98 5 1
LG12
5,13 2,05 0 0,05 4,88 2,5 1
LG13
9,52 0,00 0 0,09 2,63 1 0
LJ1-LJ2
5,29 2,51 0 0,09 2,79 2 1 0
LJ3-LJ4
4,17 1,98 0 0,07 3,54
LJ5-LJ6
3,65 1,73 0 0,06 4,04
LJ7-LJ8
2,93 1,39 0 0,05 5,04
LJ9-LJ10
5,25 2,49 0 0,09 2,81
LJ11-LJ12
4,14 1,97 0 0,07 3,56
LJ13-LJ14
3,63 1,72 0 0,06 4,06
LIG1d-Sa
2,98 1,42 0,00 1,12 4,94 2 1 0
LIG1d-S1
12,89 6,12 0,00 1,12 2,29 2 1 0
LIG1d-S2
12,26 5,82 12,26 0,67 2,41 1 0,5 1
LIG1d-Sb
2,95 1,40 2,95 0,67 5,00 1 0,5 1
LIG1d-S3
29,32 0,00 29,32 0,83 1,01 0 0 1
En la Tabla 7 se muestran los resultados del analisis por cromatograffa Kquida de alta resolucion de exclusion molecular (EM-HPLC) de las muestras liofilizadas mostradas en la Tabla 6. Las muestras liofilizadas se reconstituyeron con agua y se analizaron mediante EM-HPLC. Las VPL de NV sin procesar, analizadas simultaneamente, se usaron como patron de referencia para cuantificar el contenido en VLP de NV de las muestras problema reconstituidas. Se usaron tanto detectores UV como de fluorescencia para la cuantificacion (los datos mostrados son del detector de fluorescencia). El EM-HPLC se realizo usando una columna de Superose™ 6 10-300, con una fase movil que consiste en fosfato sodico 10 mM, acido cttrico 10 mM, pH 5 y NaCl 500 mM, a un flujo de 0,5 ml/min. Las concentraciones de protema se cuantificaron usando areas integradas de picos de elucion. “VLP” es el pico que eluye de la columna aproximadamente a los 15 min y cualquier hombro precedente y/o cola del pico dentro del intervalo de tiempo de elucion aproximado de las VLP del NV patron de referencia analizado de forma simultanea. El fragmento de VLP que eluye de la columna aproximadamente a los 32 minutos es una especie unica muy estable resultado de la desestabilizacion y el consiguiente desensamblaje de las VLP. No se observaron fragmentos intermedios y mas pequenos.
Los resultados muestran que las combinaciones de sacarosa y quitosano produdan una amplia gama de recuperaciones de VLP de NV monodispersas nativas incluyendo las mas altas (aproximadamente el 100% de recuperacion) posteriores a la liofilizacion (muestras LG10-LG12). Ademas, las formas de los picos de elucion de las VLP de NV de estas muestras eran identicas al patron de referencia de VLP de NV sin procesar, lo que indica una alta conservacion de la estructura nativa. Las muestras que conteman sacarosa solo mostraban formas de pico similares al patron de referencia, aunque las recuperaciones de VLP de NV eran menores (recuperacion de aproximadamente el 60% [muestra LG13]). Las muestras que conteman solo manitol produdan VLP practicamente agregadas por completo (muestras LE1-LE6 y LIG1d-S3). Los efectos perjudiciales del manitol sobre la estructura de las VLP de NV se contrarrestaban por la presencia de quitosano y sacarosa (muestras LIG1d-S2 y LIG1d-SB).
Tabla 7. Experimento e identificacion de la muestra y resultados del analisis del efecto de la sacarosa, el quitosano y el manitol y combinaciones de los mismos sobre la estabilidad de la estructura de las VLP de NV durante la congelacion y la liofilizacion.
Experimento y muestra
Conc. teorica de VLP (mg/ml) N Media de la concentracion de protema medida y tiempo de elucion del pico por EM-HPLC Valores porcentuales medios de protema recuperada como porcentaje del valor teorico Equivalentes de masa S = sacarosa Q = quitosano M = manitol
“VLP” ~15 min (mg/ml)
Fragment o de VLP ~32 min (mg/ml) Protein a total (%) “VLP” (%)
S
Q M
LE1-LE5
0,25 5 0,02 0,12 56,0 6,3 0 0 1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
LG1-LG9
0,25 9 0,06 0,00 24,0 24,0 0 1 0
LG10
0,25 1 0,25 0,00 101 101 10 1 0
LG11
0,25 1 0,25 0,00 101 101 5 1 0
LG12
0,25 1 0,25 0,00 100 100 2,5 1 0
LG13
0,25 1 0,16 0,00 65 65 1 0 0
LJ1-LJ14
0,25 14 0,22 0 85,4 85,4 2 1 0
LIG1d-S1
0,25 1 0,21 0 88 88 2 1 0
LIG1d-Sa
0,25 1 0,12 0 50 50 2 1 0
LIG1d-S2
0,25 1 92 0 92 92 1 0,5 1
LIG1d-Sb
0,25 1 60 0 60 60 1 0,5 1
LIG1d-S3
0,25 1 < 1 < 1 < 1 < 1 0 0 1
Ejemplo 14. Induccion de celulas plasmaticas de larga duracion y de celulas B de memoria espedficas de norovirus en ratones inmunizacion por via intranasal
A. Celulas plasmaticas de larga duracion espedficas de VLP de Norwalk
Se inmunizaron ratones BALB/c por via intranasal con VLP de norovirus y un adyuvante. A los controles naive se les administro solo adyuvante. A los 114 dfas tras la inmunizacion, se extrajeron el bazo, los ganglios linfaticos cervicales y la medula osea de ambos grupos de ratones. El dfa de la extraccion de los tejidos (dfa 0), se analizo la presencia de celulas secretoras de anticuerpos (CSA) espedficas de antfgeno usando un ensayo ELISPOT. En la Figura 13A-C se presentan los resultados de los diferentes tejidos. La deteccion de inmunoglobulinas (IgG, IgA e IgM) en estos tejidos indica la presencia de celulas plasmaticas de larga duracion espedficas de norovirus.
B. Celulas B de memoria espedficas de VLP de Norwalk
Se desarrollo un ensayo in vitro para detectar la presencia de celulas B de memoria espedficas de VLP de Norwalk a partir de ratones inmunizados por via intranasal con VLP de Norwalk. Los diversos tejidos linfoides o la sangre completa (celulas mononucleares de sangre perifericas, esplenocitos, celulas de ganglios linfaticos, etc.) pueden servir como fuente de celulas en las que puede analizarse la presencia de celulas B de memoria usando este ensayo.
En este experimento, se extrajo y proceso el bazo de los animales inmunizados y naive (controles) y se cultivaron los esplenocitos durante cuatro dfas en presencia o ausencia (controles) de VLP de Norwalk (20 |ig/ml). Se realizo un ensayo ELISPOT inicial espedfico de VLP el dfa de la extraccion de tejido (dfa 0) para establecer los niveles basales de CSA (vease la seccion A anterior). Despues de cuatro dfas en cultivo, se recogieron las celulas y se analizaron de nuevo en un ensayo ELISPOT para cuantificar la cantidad de CSA espedficas de VLP. La diferencia en la cantidad de CSA espedficas de VLP entre los ensayos del dfa 0 y del dfa 4 representa la poblacion de celulas B de memoria espedficas de antfgeno. Los resultados de este experimento se muestran en las Figuras 14A y B.
Ejemplo 15. Respuestas de las celulas B de memoria especificas de norovirus en conejos
Se inmunizaron dos conejos New Zealand White hembra por via intranasal con una formulacion en polvo seco compuesta por 25 |ig de VLP de Norwalk, 25 |ig de MPL, 1,5 mg de manitol, 1,5 mg de sacarosa y 7,0 mg de quitosano por 10 mg de polvo seco cargada en dispositivos de administracion intranasal Mark 4 de Valois. Los dos conejos recibieron un total de tres inmunizaciones a intervalos de 14 dfas. Para estos experimentos, se uso un conejo hembra no inmunizado como control naive.
A. Obtencion y procesamiento de los tejidos de conejo
Celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC): Se obtuvo sangre completa (~50 ml) de conejos en tubos de extraccion que conteman EDTA para evitar la coagulacion. La sangre completa se diluyo 1:3 con D-PBS esteril y se pusieron ~35 ml de sangre completa diluida en una capa sobre 15 ml de medio de separacion Lympholyte en un tubo de centnfuga de 50 ml. Los tubos se centrifugaron a 800xg durante 20 minutos a temperatura ambiente. La capa leucoplaquetaria que contema los PBMC se retiro con cuidado usando una pipeta esteril de 5 ml y las celulas se lavaron dos veces con D-PBS. En caso necesario, los eritrocitos contaminantes se eliminaron mediante lisis con ACK. Las celulas se resuspendieron en medio RPMI-1640-STF al 10% (1640-C) y se contaron en un hemocitometro usando un procedimiento de exclusion con Trypan.
Celulas de ganglios linfaticos mesentericos: Tras ser sacrificados, se extrajeron de forma aseptica los ganglios linfaticos mesentericos de cada conejo por separado. Los tejidos se mantuvieron en una placa de Petri esteril de plastico que contema ~10 ml de RPMI-1640-sin suero (1640-SS). Los ganglios linfaticos se pasaron a traves de una malla esteril usando un mortero esteril para dispersar el tejido y obtener una unica suspension de celulas de ganglio linfatico. Las celulas se recogieron, lavaron dos veces con 1640-SS y, finalmente, se filtraron a traves de un filtro esteril de 70 |im para eliminar aglomerados y restos celulares. Las celulas se resuspendieron en 1640-C y se
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contaron en un hemocitometro usando un procedimiento de exclusion con azul de Trypan.
Esplenocitos: Se obtuvieron los bazos en condiciones asepticas de cada conejo tras ser sacrificados. Los bazos se colocaron en placas de Petri esteriles que conteman aproximadamente 10 ml de 1640-NS. Usando una aguja de calibre 22 esteril y una jeringa, se inyecto repetidamente el medio en el tejido para romper la capsula esplenica y obtener las celulas. A continuacion se usaron pinzas esteriles para disgregar los fragmentos de tejido restantes. El contenido de la placa de Petri se transfirio a un tubo de centnfuga esteril y la suspension celular y el tejido esplenico roto se dejaron asentar durante 6-8 minutos para que sedimentaran los fragmentos grandes de tejido. La suspension celular unica se transfirio a un segundo tubo de centnfuga esteril y las celulas se lavaron una vez con 1640-NS. Los eritrocitos de la preparacion de esplenocitos se eliminaron mediante lisis con ACK (8 ml de tampon ACK, 8 minutos, a temperatura ambiente) y las celulas se lavaron una vez mas con 1640-NS y, finalmente, se filtraron a traves de un filtro esteril de 70 |im para eliminar los agregados y los restos celulares. El sedimento celular final se resuspendio en medio 1640-completo y se contaron en un hemocitometro usando un procedimiento de exclusion con azul de Trypan.
Celulas de la medula osea: Se obtuvieron los huesos de la tibia de las patas inferiores de los conejos individuales tras su sacrificio. Para extraer las celulas de la medula osea, se cortaron los extremos de los huesos usando una sierra para huesos y se extrajo el contenido de los huesos mediante lavado con inyecciones repetidas de medio 1640-NS. Las celulas de medula osea se pipetearon arriba y abajo repetidamente para romper y dispersar los agregados de celulas. Las celulas se lavaron una vez con medio 1640-NS, los eritrocitos se lisaron con medio ACK y las celulas se lavaron una vez mas con 1640-NS. Finalmente, las celulas se filtraron a traves de un filtro de 70 |im para eliminar los agregados y los restos celulares. El sedimento celular final se resuspendio en medio 1640- completo y se contaron en un hemocitometro usando un procedimiento de exclusion con azul de Trypan.
B. Ensayo ELISPOT
Tras humedecer previamente y lavar las placas de filtracion de PVDF de Millipore de 96 pocillos, se recubrieron con una solucion esteril de VLP de Norwalk nativa a una concentracion de 40 |ig/ml en un volumen final de 50 ^l/pocillo. Las placas se incubaron durante toda la noche a 4°C, se lavaron con D-PBS y se bloquearon con la adicion de 1640-
C. Las celulas de los ganglios linfaticos mesentericos, los esplenocitos y las celulas de medula osea de los conejos inmunizados y de los conejos control naive se anadieron a los pocillos a concentraciones variables (1*106, 5*105, 2*105 y 1X105 celulas/pocillo) y las placas se incubaron durante toda la noche a 37°C. Las placas se lavaron abundantemente con PBS-Tween, se anadieron reactivos secundarios espedficos de IgG e IgA de conejo a los pocillos y se incubaron durante 2 horas mas a temperatura ambiente. Tras un lavado exhaustivo, las placas se desarrollaron con cromogeno DAB/sustrato y se leyeron en un lector de placas de ELISPOT. Las manchas que aparecieron en los pocillos de los animales control sin inmunizacion se restaron de los grupos experimentales. Los datos se expresan como celulas secretoras de anticuerpos espedficas de VLP de Norwalk y se normalizaron por 1x106 celulas.
C. Ensayo de celulas B de memoria espedficas de VLP de Norwalk
Las celulas linfoides aisladas de los diversos tejidos descritas anteriormente se resuspendieron en medio 1640-C en presencia de VLP de Norwalk (10 |ig/ml) a una densidad de 5x106 celulas por ml. Las celulas se incubaron en placas de 24 pocillos en volumenes de 1 ml durante cuatro dfas a 37°C. Los ensayos de ELISPOT espedficos de VLP se realizaron sobre estas celulas en el momento del cultivo. Despues de cuatro dfas en cultivo, las celulas se transfirieron, lavaron dos veces con medio 1640-NS, se resuspendieron el 1640-Completo y se contaron en un hemocitometro usando un procedimiento de exclusion con azul Trypan. Las celulas de probaron de nuevo en un ensayo de ELISPOT espedfico de VLP de Norwalk. Los datos obtenidos de los ensayos ELISPOT realizados el dfa de obtencion de los tejidos se refieren como actividad CSA a dfa 0 (fondo). Cualquier mancha detectada en el punto temporal del dfa 0 se asume como celulas plasmaticas de secrecion activa o celulas plasmaticas de larga duracion (CPLD) Los datos obtenidos del ensayo ELISPOT realizado con las celulas en cultivo a dfa 4 se refieren como actividad CSA a dfa 4 y la actividad de celulas B de memoria estan representadas por la diferencia entre la actividad CSA a dfa 4 y la actividad CSA a dfa 0.
D. Las celulas B de memoria espedficas de VLP de Norwalk estan presentes en sangre periferica de conejos inmunizados por via intranasal
La sangre completa se obtuvo de dos conejos inmunizados (RB735 y RB1411) 141 dfas despues de la ultima de las tres inmunizaciones intranasales con una formulacion para vacuna en polvo seco que conteman VLP de Norwalk, como se describe anteriormente. Tambien se obtuvo sangre de un conejo naive, no inmunizado. La sangre se proceso para obtener celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y las PBMC se colocaron en un ensayo de celulas B de memoria espedficas de VLP de Norwalk (seccion C anterior). Los resultados se muestran en la Figura 15. En el panel izquierdo se muestran los resultados del ensayo ELISPOT inicial en el momento de la obtencion del tejido (CSA a dfa 0). En el panel derecho se muestran los resultados del ensayo ELISPOT despues de 4 dfas en cultivo con VLP de Norwalk (CSA a dfa 4).
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Los resultados del ensayo ELISPOT a dfa 0 (Figura 15, panel izquierdo) muestran que no quedan celulas plasmaticas espedficas de VLP en sangre periferica aproximadamente 140 d^as despues de la ultima inyeccion de recuerdo con vacuna en polvo seco para VLP de Norwalk. En el panel izquierdo de la Figura 15 se muestran los resultados del ensayo ELISPOT de las PBMC cultivadas durante cuatro dfas in vitro con VLP de Norwalk. En los dos conejos inmunizados, una cantidad significativa de PBMC, presumiblemente una subpoblacion de celulas B de memoria, hadan madurado a celulas plasmaticas espedficas de VLP de Norwalk secretoras de IgG. Aunque se realizaron ensayos para celulas B de memoria secretoras de IgA, solo se detectaron celulas B de memoria secretoras de IgG en la poblacion de PBMC. Como estaba previsto, el animal naive no mostraba celulas B de memoria espedficas de antigeno. Por tanto, las celulas B de memoria espedficas de VLP se encontraron en la circulacion periferica de los conejos mas de 140 dfas despues de la ultima de las tres inmunizaciones intranasales.
E. Las celulas B de memoria espedficas de VLP de Norwalk estan presentes en el bazo de conejos inmunizados por via intranasal
Los esplenocitos se obtuvieron de los bazos de los dos conejos inmunizados mediante vacuna y el conejo control no inmunizado. Los ensayos de celulas B de memoria espedficas de VLP de Norwalk (descritos anteriormente) se realizaron con estas celulas y los resultados se muestran en la Figura 16. Como se observo en la poblacion de PBMC, el ensayo ELISPOT del dfa 0 muestra que no hay celulas plasmaticas espedficas de antfgeno presentes en el bazo (Figura 16, panel izquierdo). Sin embargo, despues de cuatro dfas de incubacion in vitro con VLP de Norwalk, las celulas de memoria B espedficas de VLP de Norwalk eran aparentes en la poblacion de esplenocitos. Por tanto, el bazo representa un sitio para la migracion de celulas B de memoria tras la inmunizacion intranasal.
F. Una poblacion de celulas plasmaticas de larga duracion espedficas de VLP de Norwalk se encuentra en la medula osea pero no celulas B de memoria
Se obtuvieron las celulas de medula osea de las tibias de conejos experimentales y se analizo la presencia de celulas plasmaticas de larga duracion y celulas B de memoria. Los resultados se presentan en la Figura 17. En el panel izquierda de la Figura 17 se muestra que el conejo 1411 sigue teniendo una poblacion significativa de celulas plasmaticas espedficas de antfgeno en la medula osea. Las celulas plasmaticas que migran a la medula osea y permanecen ad durante un periodo significativo de tiempo tras la inmunizacion se denominan celulas plasmaticas de larga duracion (CPLD). El conejo 735 no mostro una cantidad alta de CPLD. No se encontraron CPLD en la medula osea del conejo naive. Las celulas de medula osea se cultivaron en un ensayo de celulas B de memoria y se analizo de nuevo la presencia de celulas B de memoria. En el panel derecho de la Figura 17 se muestra la ausencia de esencialmente celulas B de memoria espedficas de antfgeno en la medula osea. Por tanto, las celulas plasmaticas de larga duracion migran a la medula osea pero no se encontraron en esta celulas B de memoria.
G. Las celulas B de memoria espedficas de VLP de Norwalk secretoras tanto de IgG como de IgA se encuentran en los ganglios linfaticos mesentericos de conejos inmunizados por via intranasal
Los ganglios linfaticos mesentericos se obtuvieron de todos los conejos experimentales y se analizo la presencia de CPLD y de celulas B de memoria en las celulas aisladas. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 18A. Como con la mayona del tejido linfoide analizado, excepto la medula osea, no se encontraron CPLD (paneles de la izquierda de la Figura 18A) en los ganglios mesentericos. Tras la incubacion in vitro con las VLP de Norwalk, se encontro una cantidad muy alta de celulas B de memoria espedficas de VLP secretoras de IgG en la poblacion de ganglios linfaticos mesentericos (Figura 18A, panel derecho). Las cantidades de celulas B de memoria en los ganglios linfaticos mesentericos eran significativamente mas altas que las observadas en los demas tejidos linfoides analizados.
Varios investigadores han demostrado que la inmunizacion en un sitio inductor mucoso como las fosas nasales o el intestino, es capaz de inducir la llamada respuesta inmune de mucosa. Generalmente, esta respuesta se ha caracterizado por la presencia de celulas B IgA+ y celulas plasmaticas secretoras de IgA localizadas en el tejido linfoide mucoso. Por este motivo, tambien se analizo en las celulas de los ganglios linfaticos mesentericos la presencia de CPLD o celulas B de memoria secretoras de IgA. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Figura 18B. Una vez mas, no se encontraron celulas CPLD IgA+ en la poblacion de los ganglios linfaticos mesentericos (figura 18B, panel izquierdo). Sin embargo, las celulas B de memoria secretoras de IgA se detectaron en este tejido (Figura 18B, panel derecho). Por tanto, la inmunizacion intranasal con una formulacion para vacuna en polvo seco de VLP de Norwalk induda una respuesta inmune mucosa que tema como resultado tanto la migracion de celulas B de memoria espedficas de antfgeno tanto IgG+ como IgA+ al tejido linfoide asociado a intestino. La produccion de celulas B de memoria espedficas de antfgeno inducidas por la inmunizacion con la formulacion para vacuna de Norwalk es un posible indicador de la eficacia de la vacuna. La presencia de celulas B de memoria es un marcador de inmunidad de larga duracion.
H. Celulas T de memoria CD4+ espedficas de VLP
Los esplenocitos obtenidos de los conejos inmunizados se reestimularon con VLP de Norwalk intactas y el grado de proliferacion celular se determino mediante incorporacion de timidina tritiada como se indica en el eje de ordenada
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(CPM) (Figura 19). En el panel izquierdo se muestra la proliferacion celular de una poblacion no fraccionada de esplenocitos, mientras que en el panel de la derecha se muestra la proliferacion celular de celulas T CD4+.
La presente invencion no ha de limitarse en alcance por las realizaciones espedficas descritas, que tienen la finalidad de ser solo ilustraciones de aspectos individuales de la invencion, y metodos y componentes funcionalmente equivalentes estan dentro del alcance de la invencion. De hecho, diversas modificaciones de la invencion, ademas de las mostradas y descritas en este documento, seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la descripcion anterior y los dibujos adjuntos usando simplemente experimentacion de rutina. Se pretende que tales modificaciones y equivalentes se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
La cita o discusion de una referencia bibliografica en este documento no se interpretara como una admision de que esta es una tecnica previa a la presente invencion.
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Claims (7)

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REIVINDICACIONES
Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de dos o mas partfculas de tipo virus (VLP) de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes para su uso en un metodo para generar una respuesta inmune de manera que la composicion de VLP combinada puede lograr inmunidad frente a infeccion por cada genotipo de Norovirus representado en la formulacion, en la que la respuesta inmune frente a una VLP dada en la combinacion es de al menos el 50% de la respuesta inmune de la misma VLP cuando se mide individualmente.
Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun la reivindicacion 1 para el uso segun la reivindicacion 1, en la que al menos una de dichas cepas de Norovirus es diferente de las cepas de dichas VLP.
Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun la reivindicacion 1 para el uso segun la reivindicacion 1, en la que dos o mas cepas de Norovirus son de genotipos diferentes.
Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun la reivindicacion 1 para el uso segun la reivindicacion 1, en la que al menos una de dichas cepas de Norovirus es diferente de los genotipos de dichas VLP.
Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun la reivindicacion 1 para el uso segun la reivindicacion 1, en la que dichas dos o mas cepas de Norovirus son de genogrupos diferentes.
Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun la reivindicacion 1 para el uso segun la reivindicacion 1, en la que al menos una de dichas cepas de Norovirus es diferente de los genogrupos de dichas VLP.
Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun la reivindicacion 5 para el uso segun la reivindicacion 5, en la que dichos genogrupos se seleccionan del grupo que consiste en GI, GII, GIII y GIV.
Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun la reivindicacion 1 para el uso segun la reivindicacion 1, en la que dichas VLP de Norovirus monovalentes se derivan de las secuencias virales del genogrupo I o el genogrupo II o de una secuencia viral consenso de dos o mas cepas de Norovirus.
Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun la reivindicacion 5 para el uso segun la reivindicacion 5, en la que dichas VLP de Norovirus monovalentes se derivan de los genotipos 1.1 y II.4.
Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun la reivindicacion 1 para el uso segun la reivindicacion 1, en la que la formulacion antigenica se administra por via mucosa o por via parenteral.
Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun la reivindicacion 10 para el uso segun la reivindicacion 10, en la que la administracion mucosa se lleva a cabo por via intranasal.
Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun la reivindicacion 10 para el uso segun la reivindicacion 10, en la que la administracion parenteral se lleva a cabo por via intramuscular.
Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus
monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun la reivindicacion 1 para el uso segun la reivindicacion 1, en la que la formulacion antigenica incluye uno o mas adyuvantes seleccionados del grupo que consiste en agonistas de receptores de tipo toll y sales de aluminio.
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14. Una formulacion antigenica que comprende una combinacion de al menos dos VLP de Norovirus monovalentes o una formulacion antigenica que comprende VLP de Norovirus polivalentes segun la reivindicacion 1 para el uso segun la reivindicacion 1, en la que la formulacion antigenica comprende ademas un agente de administracion.
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ES13157573.0T 2006-09-29 2007-09-28 Formulaciones de vacuna para norovirus Active ES2618885T3 (es)

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