ES2618851T3 - Purificación de vectores retrovirales - Google Patents

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Abstract

Un proceso para producir una formulación de vector retroviral adecuada para la administración a un paciente, que comprende una etapa de esterilización por filtrado y una etapa de concertación, en el que la etapa de concentración es la etapa final en el proceso y la etapa de esterilización por filtrado es la penúltima etapa en el proceso, y en el que en la etapa de concentración se realiza en condiciones asépticas, y además en el que la etapa de esterilización por filtrado se realiza usando un filtro de esterilización con un tamaño de poro máximo de hasta o igual a 0,22 μm.

Description

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DESCRIPCION
Purificacion de vectores retrovirales Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos mejorados de produccion y purificacion de vectores retrovirales. Antecedentes de la invencion
El exito de las tecnicas de terapia genica depende de la capacidad para conseguir suficiente expresion de genes transferidos de una manera segura para seres humanos. Se usan con frecuencia retrovirus como un sistema de suministro (expresado de otro modo como un vetffculo de suministro o vector de suministro) para, entre otros, la transferencia de un nucleotido de interes (NOI), o una pluralidad de NOI, a uno o mas sitios de interes. Tambien ha habido un interes considerable en el desarrollo de sistemas de vectores lentivirales debido a que los lentivirus son capaces de infectar celulas que no estan en division (Lewis y Emerman (1993) J. Virol. 68: 510). Ademas los vectores lentivirales permiten expresion a largo plazo muy estable del gen de interes. Se ha mostrado que esta es de al menos un ano para celulas neuronales de rata transducidas in vivo (Bienemann et al. (2003) Mol. Ther. 5: 588).
El proceso de purificacion de vector es una etapa importante en las terapias de transferencia genica clmica, y esta ligado directamente a la seguridad y eficacia con respecto a pureza y fftulo. En la mayoffa de aplicaciones experimentales de pequena escala, los vectores pueden concentrarse y purificarse por metodos relativamente sencillos usando tecnicas de centrifugacion. Sin embargo, el aumento de escala de los metodos de purificacion para produccion a gran escala para uso clmico representa un reto importante. En particular, cuando se considera la produccion de vector para uso humano, pueden realizarse etapas adicionales tales como esterilizacion por filtrado para asegurar la pureza y seguridad de la preparacion del vector.
Los metodos de preparacion de vectores generalmente comprenden obtener el vector de celulas que producen vectores bien de forma estable o bien de forma transitoria y purificar el vector viral usando, por ejemplo, cromatograffa. En procesos industriales, la etapa final es la etapa de esterilizacion y se usa habitualmente al menos una etapa de ultrafiltracion antes de la etapa de esterilizacion para concentrar el vector viral y/o para intercambiar el tampon en el que se mantiene el vector viral.
Varias publicaciones describen la purificacion de virus de celulas, analizando principalmente el uso de matrices cromatograficas espedficas para purificacion del virus de un lisado celular. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 6.261.823 y Patente de Estados Unidos N.° 5.661.023 desvelan metodos que abarcan el uso de resina de intercambio anionico solamente mientras que la Patente de Estados Unidos N.° 5.837.520 desvela una combinacion secuencial de intercambio anionico seguido de cromatograffa de afinidad. Yamada et al. muestran que la purificacion de vector lentiviral usando HPLC de intercambio anionico conduce a mejora de la transferencia genica (Yamada et al. (2003) Biotechniques 34(5): 1074-8, 1080).
Sigue existiendo la necesidad de un metodo de purificacion de vector de retroviral a gran escala que produzca producto puro conservando al mismo tiempo altos fftulos. La presente invencion aborda esta necesidad.
Sumario de la invencion
Se ha mostrado que, inesperadamente, se pueden conseguir procesos mejorados para producir formulaciones de vectores retrovirales y lentivirales cuando una etapa de esterilizacion por filtrado no es la etapa final en el proceso de produccion. En particular, se ha descubierto que una etapa de esterilizacion por filtrado que se realiza posteriormente a una etapa de concentracion (por ejemplo por ultrafiltracion), da como resultado una perdida considerable de fftulo de vector viral. Esto fue sorprendente ya que el diametro de parffculas retrovirales esta en el intervalo de 80-120 nm y debeffan pasar facilmente a traves de los poros de un filtro de esterilizacion; de hecho esto sucede para sobrenadantes de cultivo celular que contienen vectores que se filtran rutinariamente sin perdida de fftulo funcional observada. No estuvo por lo tanto claro por que, una vez se habfa procesado la preparacion del vector ya no era posible esterilizar por filtrado la preparacion sin perdida de recuperacion.
Ademas, se descubrio sorprendentemente que pueden obtenerse producciones de parffculas de vectores aumentadas si la etapa de concentracion final se realiza despues de la etapa de esterilizacion por filtrado. Esto es contrario a los procesos de produccion virales establecidos en los que las etapas de concentracion se realizan tradicionalmente antes de la etapa de esterilizacion por filtrado. Tambien se ha descubierto que el mantenimiento de una concentracion de parffcula de vector adecuada, por ejemplo diluyendo una preparacion de parffcula de vector, antes de la esterilizacion por filtrado, tambien puede mejorar las producciones de parffculas de vectores. Es sorprendente que la reduccion de la concentracion de parffculas de vectores durante algunos estadios del proceso puede conducir de hecho en ultima estancia a produccion de producto mejorada.
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Se apreciara que pueden producirse formulaciones de menor dosis diluyendo de forma aseptica la formulacion producida por el proceso de la presente invencion.
El proceso de produccion de la presente invencion es preferentemente un proceso a gran escala para producir formulaciones de uso clmico que son adecuadas para la administracion a seres humanos como productos terapeuticos.
Las formulaciones de vectores retrovirales y lentivirales descritas en el presente documento son preferentemente adecuadas para la administracion a seres humanos como productos terapeuticos.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invencion se proporciona un proceso para producir una formulacion de vector retroviral adecuada para la administracion a un paciente que comprende una etapa de esterilizacion por filtrado y una etapa de concentracion, en el que la etapa de concentracion es la etapa final en el proceso y la etapa de esterilizacion por filtrado es la penultima etapa en el proceso, y en el que la etapa de concentracion se realiza en condiciones asepticas, y ademas en el que la etapa de esterilizacion por filtrado se realiza usando un filtro de esterilizacion con un tamano de poro maximo de hasta o igual a 0,22 |im.
Preferentemente el vector retroviral es un vector lentiviral.
Preferentemente la etapa de concentracion se realiza usando ultrafiltracion, preferentemente filtracion de flujo tangencial, mas preferentemente ultrafiltracion de fibra hueca.
Preferentemente la etapa de esterilizacion por filtrado se realiza usando un filtro de esterilizacion con un tamano de poro maximo de 0,2 |im.
En realizaciones preferidas, para recuperacion optima de parffculas de VAIE la concentracion del vector debena ser menor que o igual a aproximadamente 4,6 x l011 copias de genoma de ARN por ml de preparacion antes de la esterilizacion por filtrado. El nivel de concentracion apropiado puede conseguirse mediante el control de la concentracion del vector usando, por ejemplo, una etapa de dilucion, si es apropiado. Por lo tanto, en una realizacion, una preparacion de vector retroviral se diluye antes de la esterilizacion por filtrado. Por lo tanto, si un trabajador experto experimenta recuperacion menor de lo esperado de parffculas de vector, debena investigar la reduccion de la concentracion de las parffculas de vector antes de la esterilizacion por filtrado. El nivel de fftulo apropiado para recuperacion optima puede determinarse usando las tecnicas descritas posteriormente, y la seccion de ejemplos en particular.
De acuerdo con una realizacion de la presente invencion se proporciona un proceso para producir una formulacion de vector retroviral que comprende las siguientes etapas (i) a (vi) en orden cronologico:
(i) cultivar celulas que producen vector retroviral;
(ii) recoger el sobrenadante que contiene vector retroviral;
(iii) clarificar opcionalmente el sobrenadante;
(iv) purificar el vector retroviral para proporcionar una preparacion de vector retroviral;
(v) esterilizacion por filtrado de la preparacion de vector retroviral; y
(vi) concentrar la preparacion de vector retroviral para producir el producto a granel final.
En una realizacion el proceso no comprende la etapa de clarificacion (iii).
En otra realizacion el proceso sf incluye la etapa de clarificacion (iii).
Preferentemente la etapa (vi) se realiza usando ultrafiltracion o filtracion de flujo tangencial, mas preferentemente ultrafiltracion de fibras huecas.
Preferentemente el metodo de purificacion en la etapa (iv) es cromatograffa de intercambio ionico, mas preferentemente cromatograffa de intercambio anionico.
Preferentemente la esterilizacion por filtrado en la etapa (v) se realiza usando un filtro de esterilizacion de 0,22 |im o uno de 0,2 |im.
Preferentemente la etapa (iii) se realiza por clarificacion por filtrado.
Preferentemente la etapa (iv) se realiza usando un metodo o una combinacion de metodos seleccionados de cromatograffa, ultrafiltracion/diafiltracion o centrifugacion.
Preferentemente el metodo de cromatograffa o una combinacion de metodos se selecciona de cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de interaccion hidrofoba, cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de fase inversa y cromatograffa de afinidad de iones metalicos inmovilizados.
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Preferentemente, el metodo de centrifugacion se selecciona de centrifugacion zonal, centrifugacion isopfcnica y centrifugacion de sedimentacion.
Preferentemente el metodo de ultrafiltracion/diafiltracion se selecciona de diafiltracion de flujo tangencial, diafiltracion celular agitada y dialisis.
Preferentemente se incluye al menos una etapa en el proceso de la invencion para degradar acido nucleico para mejorar la purificacion.
Preferentemente dicha etapa es tratamiento con nucleasa.
Preferentemente, dicha nucleasa es Nucleasa Benzonase®.
Preferentemente se llevan a cabo una etapa o etapas de degradacion de acidos nucleicos en el proceso de la invencion en cualquier punto o puntos hasta e incluyendo la etapa (iv).
Preferentemente la etapa de purificacion (iv) del proceso incluye una etapa de intercambio de tampon. Preferentemente la etapa (vi) del proceso se realiza usando ultrafiltracion.
Preferentemente la ultrafiltracion comprende filtracion de flujo tangencial.
Preferentemente la ultrafiltracion comprende ultrafiltracion de fibras huecas.
La esterilizacion por filtrado de la etapa (v) del proceso se realiza usando un filtro de esterilizacion con un tamano de poro maximo de hasta o igual a 0,22 |im.
Preferentemente el intercambio de tampon comprende intercambio del tampon usado para las etapas precedentes con tampon de formulacion.
Preferentemente el tampon de formulacion es una solucion salina de pH tamponado que contiene azucares. Preferentemente el tampon es un tampon basado en TRIS.
En una realizacion la concentracion de partfculas del vector se diluye antes de la esterilizacion por filtrado. Preferentemente el vector retroviral es un vector lentiviral.
Mas preferentemente el vector lentiviral es un vector lentiviral no de primate.
Mas preferentemente el vector lentiviral deriva de VAIE. Cuando el vector lentiviral deriva de VAIE la concentracion de vector de las partfculas VAIE antes de la esterilizacion por filtrado en la preparacion de partfculas del vector es menor que o igual a 4,6 x 1011 copias de genoma de ARN por ml.
Preferentemente el vector retroviral comprende un nucleotido de interes (NOI).
Preferentemente los procesos de produccion de la invencion son para producir formulaciones de vector retroviral, en las que la formulacion de vector retroviral es adecuada para la administracion a un paciente. El paciente puede ser un ser humano o un animal. En una realizacion la formulacion de vector retroviral es adecuada para la administracion al ojo de un paciente. En otra realizacion, la formulacion de vector retroviral es adecuada para la administracion al cerebro de un paciente.
En algunas realizaciones, los procesos de produccion son para producir formulaciones de vectores retrovirales, en las que la formulacion de vector retroviral es adecuada para la administracion a un paciente por inyeccion. En una realizacion la formulacion de vector retroviral es adecuada para la inyeccion subretiniana directa opcionalmente despues de vitrectoirna del ojo de un ser humano o animal. En otra realizacion la formulacion del vector retroviral es adecuada para inyeccion directa al cuerpo estriado del cerebro de un ser humano o animal.
En algunas realizaciones los procesos de produccion son para producir formulaciones de vector retroviral, en las que la formulacion de vector retroviral es adecuada para la administracion ex vivo.
En otras realizaciones los procesos de produccion son para producir formulaciones de vector retroviral, en las que la formulacion de vector retroviral es adecuada para la administracion a una celula que puede obtenerse de un paciente.
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Se proporciona una formulacion del vector retroviral que puede obtenerse por el proceso de la presente invencion. La formulacion del vector retroviral puede ser para su uso en terapia genica.
Tambien se proporciona uso de la formulacion de vector retroviral en la preparacion de un medicamento para terapia genica.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 es un esquema del proceso de produccion de vector retroviral.
Descripcion detallada de la invencion
Se describiran ahora diversos elementos y realizaciones preferidos de la presente invencion por medio de ejemplos no limitantes.
La practica de la presente invencion empleara, a no ser que se indique de otro modo, tecnicas convencionales de qmmica, biologfa molecular, microbiologfa, ADN recombinante e inmunologfa, que estan dentro de las capacidades de un experto habitual en la materia. Dichas tecnicas se explican en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edicion, Libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periodicos) Current Protocols in Molecular Biology, C. 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, Nueva York, Ny; B. Roe, J. Crabtree, y A. Kahn (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak y James O'D. McGee (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; y, D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg (1992) Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. Roe, Simon, ed. Protein Purification Techniques. 2a ed. Oxford: Oxford University Press, 2001, Sofer, Gail y Hagel, Lars. Handbook of Process Chromatography: A Guide to Optimization, Scale-up, and Validation. Londres y San Diego: Academic Press, 1997, Janson, Jan-Christer y Ryden, Lars, eds. Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications. 2a ed. Nueva York: John Wiley & Sons, Inc., 1998, Masters, John R.W., ed. Animal Cell Culture: A Practical Approach. 3a ed. Oxford: Oxford University Press, 2000.
Polinucleotidos
Los polinucleotidos usados en la presente invencion pueden comprender secuencias de ADN o ARN. Pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Un experto en la materia entendera que numerosos polinucleotidos diferentes pueden codificar el mismo polipeptido como resultado de la degeneracion del codigo genetico. Ademas, debe entenderse que los expertos en la materia pueden, usando tecnicas rutinarias, realizar sustituciones de nucleotidos que no afectan a la secuencia polipeptfdica codificada por los polinucleotidos usados en la invencion para reflejar el uso codonico de cualquier organismo hospedador particular en el que se vayan a expresar los polipeptidos. Los polinucleotidos pueden modificarse por cualquier metodo disponible en la tecnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo para potenciar la actividad in vivo o la vida util de polinucleotidos de la invencion. Pueden producirse polinucleotidos tales como polinucleotidos de ADN de forma recombinante, sintetica, o por cualquier medio disponible para los expertos en la materia. Tambien pueden clonarse por tecnicas convencionales.
Se produciran en general polinucleotidos mas largos usando medios recombinantes, por ejemplo usando tecnicas de clonacion de PCR (reaccion en cadena de la polimerasa). Esto implicara preparar un par de cebadores (por ejemplo de aproximadamente 15 a 30 nucleotidos) que flanquean una region de la secuencia que se desea clonar, poner los cebadores en contacto con ARNm o ADNc obtenido de una celula animal o humana, realizar una reaccion en cadena de la polimerasa en condiciones que provocan amplificacion de la region deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo purificando la mezcla de reaccion en un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores pueden disenarse para contener sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion adecuados de modo que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonacion adecuado.
Proteina
Como se usa en el presente documento, el termino “proteina” incluye moleculas polipeptfdicas monocatenarias asf como complejos de polipeptidos multiples en los que se unen polipeptidos constituyentes individuales por enlaces covalentes o no covalentes. Como se usa en el presente documento, los terminos “polipeptido” y “peptido” se refieren a un polfmero en el que los monomeros son aminoacidos y se unen entre sf mediante enlaces peptfdicos o disulfuro.
Variantes, derivados, analogos, homologos y fragmentos
Ademas de las protemas y los nucleotidos espedficos mencionados en el presente documento, la presente divulgacion tambien abarca el uso de variantes, derivados, analogos, homologos y fragmentos de los mismos.
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En el contexto de la presente invencion, una variante de cualquier secuencia dada es una secuencia en la que se ha modificado la secuencia espedfica de restos (bien restos de aminoacidos o bien de acidos nucleicos) de tal manera que el polipeptido o polinucleotido en cuestion conserve al menos una de las funciones endogenas. Puede obtenerse una secuencia variante mediante adicion, supresion, sustitucion, modificacion, reemplazo y/o variacion de al menos un resto presente en la protema de origen natural.
El termino “derivado” como se usa en el presente documento, en relacion con protemas o polipeptidos desvelados en el presente documento incluye cualquier sustitucion, variacion, modificacion, reemplazo, supresion y/o adicion de uno o mas restos de aminoacidos de o a la secuencia siempre que la protema o el polipeptido resultante conserve al menos una de sus funciones endogenas.
El termino “analogo” como se usa en el presente documento, en relacion con polipeptidos o polinucleotidos incluye cualquier mimetico, es decir, un compuesto qrnmico que posea al menos una de las funciones endogenas de los polipeptidos o polinucleotidos que imita.
Tfpicamente, pueden realizarse sustituciones de aminoacidos, por ejemplo, de 1, 2 o 3 a 10 o 20 sustituciones siempre que la secuencia modificada conserve la actividad o capacidad requerida. Las sustituciones de aminoacidos pueden incluir el uso de analogos de origen no natural.
Las protemas usadas en el presente documento tambien pueden tener supresiones, inserciones o sustituciones de restos de aminoacidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una protema funcionalmente equivalente. Pueden realizarse sustituciones de aminoacidos deliberadas basandose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilia y/o la naturaleza anfipatica de los restos siempre que se conserve la funcion de transporte o modulacion. Por ejemplo, los aminoacidos con carga negativa incluyen acido aspartico y acido glutamico; los aminoacidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoacidos con grupos de cabeza polar sin carga que tienen valores de hidrofilia similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.
Pueden realizarse sustituciones conservativas, por ejemplo segun la siguiente tabla. Los aminoacidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma lmea en la tercera columna pueden sustituirse entre sf:
alifAticos
No polares G A P
I L V
Polares - sin carga
C S T M
N Q
Polares - con carga
D E
K R
aromAticos
H F W Y
Los “fragmentos” tambien son variantes y el termino tfpicamente se refiere a una region seleccionada del polipeptido o polinucleotido que es de interes bien funcionalmente o bien, por ejemplo en un ensayo. “Fragmento” se refiere por lo tanto a una secuencia de aminoacidos o acido nucleico que es una parte de un polipeptido o polinucleotido de longitud completa.
Dichas variantes pueden prepararse usando tecnicas de ADN recombinante convencionales tales como mutagenesis dirigida. Cuando se van a realizar inserciones, son de ADN sintetico que codifica la insercion junto con regiones flanqueantes 5' y 3' correspondientes a la secuencia de origen natural a uno de los lados del sitio de insercion. Las regiones flanqueantes contendran sitios de restriccion convenientes correspondientes a sitios en la secuencia de origen natural de modo que la secuencia puede cortarse con la enzima o las enzimas apropiadas y el ADN sintetico ligarse al corte. El ADN se expresa despues para preparar la protema codificada. Estos metodos son solamente ilustrativos de las numerosas tecnicas convencionales conocidas en este campo para manipulacion de secuencias de ADN y tambien pueden usarse otras tecnicas conocidas.
Retrovirus
Como se conoce bien en la tecnica, un vector es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un ambiente a otro. Como ejemplo, algunos vectores usados en tecnicas de ADN recombinante permiten que entidades, tales como un segmento de ADN (tal como un segmento de ADN heterologo, tal como un segmento de ADNc heterologo) se transfieran a una celula hospedadora. Los ejemplos de vectores usados en tecnicas de ADN recombinante incluyen pero sin limitacion plasmidos, cromosomas, cromosomas artificiales o virus.
La expresion “vector de expresion” significa una construccion con capacidad de expresion in vivo o in vitro/ex vivo.
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El vector retroviral empleado en los aspectos de la presente invencion puede derivar de o puede ser derivable de cualquier retrovirus adecuado. Se ha identificado un gran numero de retrovirus diferentes. Los ejemplos incluyen: virus de leucemia murina (VLM), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de leucemia de linfocitos T humana (VLTH), virus de tumor mamario de raton (VTMR), virus de sarcoma de Rous (VSR), virus de sarcoma de Fujinami (VSFu), virus de leucemia murina de Moloney (VLM-Mo), virus de osteosarcoma murino FBR (VSM FBR), virus de sarcoma murino de Moloney (VSM-Mo), virus de leucemia murina de Abelson (VLM-A), virus de mielocitomatosis aviar 29 (MC29) y virus de eritroblastosis aviar (VEA). Puede encontrarse una lista detallada de retrovirus en Coffin et al., 1997, “Retroviruses”, Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763.
Los retrovirus pueden dividirse ampliamente en dos categonas: concretamente “sencillos” y “complejos”. Los retrovirus pueden dividirse ademas adicionalmente en siete grupos. Cinco de estos grupos representan retrovirus con potencial oncogenico. Los dos grupos restantes son los lentivirus y los espumavirus. Se presenta una revision de estos retrovirus en Coffin et al. 1997 (en la misma referencia).
Una partfcula de vector retroviral recombinante es capaz de transducir una celula receptora con un nucleotido de interes (NOI). Una vez dentro de la celula el genoma de ARN de la partfcula del vector se transcribe de forma inversa a ADN y se integra en el ADN de la celula receptora.
En un vector tfpico para uso en el metodo descrito en el presente documento al menos parte de una o mas regiones codificantes de protemas esenciales para la replicacion pueden retirarse del virus. Esto hace al vector viral defectuoso en replicacion. Tambien pueden reemplazarse partes del genoma viral por un NOI para generar un vector que comprende un NOI que es capaz de transducir una celula hospedadora no en division diana y/o integrar su genoma en un genoma hospedador.
Vectores lentivirales.
El vector lentiviral desvelado en el presente documento puede derivar de o puede ser derivable de cualquier lentivirus adecuado.
Los vectores lentivirales son parte de un grupo mayor de vectores retrovirales. Puede encontrarse una lista detallada de lentivirus en Coffin et al. (1997) “Retroviruses” Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763). Brevemente, los lentivirus pueden dividirse en grupos de primates y no primates. Los ejemplos del lentivirus de primates incluyen pero sin limitacion: el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el agente causante del smdrome de autoinmunodeficiencia humana (SIDA), y el virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS). El grupo lentiviral no primate incluye el virus visna/maedi (VVM) prototipo de “virus lento”, asf como el virus de la artritis-encefalitis caprina (VAEC) relacionado, virus de la anemia infecciosa equina (VAIE) y el mas recientemente descrito virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) y virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB).
La familia de lentivirus difiere del retrovirus porque los antivirus tienen la capacidad de infectar celulas tanto en division como no en division (Lewis et al. (1992); Lewis y Emerman (1994)). Por el contrario, otros retrovirus, tales como VML, son incapaces de infectar celulas no en division o que se dividen lentamente tales como las que componen, por ejemplo, tejido muscular, cerebral, pulmonar y hepatico.
Un vector lentiviral, como se usa en el presente documento, es un vector que comprende al menos una parte componente derivable de un lentivirus. Preferentemente, esa parte componente esta implicada en los mecanismos biologicos por los que el vector infecta celulas, expresa genes o se replica.
La estructura basica de genomas de retrovirus y lentivirus comparten muchas caractensticas comunes tales como una 5' LTR y una 3' LTR, entre o dentro de las que se localiza una senal de empaquetamiento para permitir que el genoma se empaquete, un sitio de union de cebadores, sitios de integracion para permitir la integracion en un genoma en un genoma de celulas hospedadoras y genes gag, pol y env que codifican los componentes de empaquetamiento, requiriendose estos polipeptidos para el ensamblaje de partfculas virales. Los lentivirus tienen caractensticas adicionales, tales como secuencias rev y RRE en VIH, que permiten la exportacion eficaz de transcritos de ARN de los provirus integrados del nucleo al citoplasma de una celula diana infectada.
En el provirus, los genes virales estan flanqueados en ambos extremos por regiones denominadas repeticiones terminales largas (LTR). Las LTR son responsables de la integracion proviral, y la transcripcion. Las LTR tambien actuan como secuencias promotoras-potenciadoras y pueden controlar la expresion de los genes virales.
Las LTR en sf mismas son secuencias identicas que pueden dividirse en tres elementos, que se denominan U3, R y U5. U3 deriva de la secuencia unica del extremo 3' del ARN. R deriva de una secuencia repetida en ambos extremos del ARN y U5 deriva de la secuencia unica del extremo 5' del ARN. Los tamanos de los tres elementos pueden variar considerablemente entre diferentes virus.
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En un genoma de vector lentiviral defectuoso gag, pol y nev pueden estar ausentes o no funcionales. Las regiones R en ambos extremos del ARN son secuencias repetidas. U5 y U3 representan secuencias unicas en los extremos 5' y 3' del genoma de ARN respectivamente.
En un vector lentiviral tipico descrito en el presente documento al menos parte de una o mas regiones codificantes de protemas esenciales para replicacion puede retirarse del virus. Esto hace al vector viral defectuoso en replicacion. Tambien pueden reemplazarse partes del genoma viral por un NOI para generar un vector que comprende un NOI que es capaz de transducir una celula hospedadora no en division diana y/o integrar su genoma en un genoma hospedador.
En una realizacion, los vectores retrovirales son vectores que no se integran como se describe en el documento WO 2007/071994.
En una realizacion adicional los vectores tienen la capacidad de suministrar una secuencia que esta desprovista de o carece de ARN viral. En una realizacion adicional un dominio de union heterologo (heterologo para gag) localizado en el ARN para suministrar y un dominio de union afm en gag o pol puede usarse para asegurar el empaquetamiento del ARN para suministrar. Ambos de estos vectores se describen en el documento WO 2007/072056.
El vector lentiviral puede ser un vector “no de primate”, es decir, derivado de un virus que no infecta principalmente a primates, especialmente seres humanos.
Los ejemplos de lentivirus no de primates puede ser cualquier miembro de la familia de lentiviridae que no infecte de forma natural a un primate y pueden incluir un virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), un virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB), un virus de la encefalitis y artritis caprina (VEAC), un virus Maedi visna (VMV) o un virus de la anemia infecciosa equina (VAIE).
En una realizacion particularmente preferida el vector viral deriva de VAIE. VAIE tiene la estructura genomica mas sencilla de los lentivirus y se prefiere particularmente para uso en la presente invencion. Ademas de los genes gag, pol y env VAIE codifica otros tres genes: tat, rev y S2. Tat actua como un activador de la transcripcion de la LTR viral (Derse y Newbold (1993); Maury et al. (1994)) y Rev regula y coordina la expresion de genes virales mediante elementos de respuesta a rev (RRE) (Martarano et al. (1994)). Se cree que los mecanismos de accion de estas dos protemas son ampliamente similares a los mecanismos analogos en los virus de primates (Martano et al. misma referencia). La funcion de S2 se desconoce. Ademas, se ha identificado una protema de VAIE, Ttm, que esta codificada por el primer exon de tat cortado y empalmado en la secuencia codificante de env al inicio de la protema transmembrana.
Son vectores preferidos para usar en el proceso de la presente invencion vectores lentivirales recombinantes.
La expresion “vector lentiviral recombinante” se refiere a un vector con suficiente informacion genetica lentiviral para permitir el empaquetamiento de un genoma de ARN, en presencia de componentes de empaquetamiento, en una partmula viral capaz de infectar una celula diana. La infeccion de la celula diana puede incluir transcripcion inversa e integracion en el genoma de la celula diana. Este vector lentiviral recombinante porta secuencias codificantes no virales que van a suministrarse por el vector a la celula diana. Un vector lentiviral recombinante es incapaz de replicar de forma independiente para producir partmulas antivirales infecciosas dentro de la celula diana final. Habitualmente el vector lentiviral recombinante carece de un gen gag-pop y/o env funcional y/u otros genes esenciales para replicacion. El vector puede configurarse como un vector de intron dividido. Un vector de intron dividido se describe en la Solicitud de Patente de PCT WO 99/15683.
Preferentemente el vector lentiviral recombinante tiene un genoma viral mmimo.
Como se usa en el presente documento, la expresion “genoma viral mmimo” significa que el vector viral se ha manipulado para retirar los elementos no esenciales y para conservar los elementos esenciales para proporcionar la funcionalidad requerida para infectar, transducir y suministrar una secuencia de nucleotidos de interes a una celula hospedadora diana. Pueden encontrarse mas detalles de esta estrategia en el documento WO 98/17815 de los inventores.
En una realizacion de la presente invencion, el vector es un vector auto-inactivante.
Como ejemplo, se han construido vectores retrovirales auto-inactivantes suprimiendo los potenciadores de la transcripcion o los potenciadores y el promotor en la region U3 de la 3' LTR. Despues de un ciclo de transcripcion inversa e integracion del vector, estos cambios se copian a las LTR tanto 5' como 3' produciendo un provirus transcripcionalmente inactivo (Yu et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 3194-3198; Dougherty y Temin (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 1197-1201; Hawley et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 2406-2410; Yee et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 9564-9568). Sin embargo, cualquier promotor interno de las LTR en dichos vectores sera aun transcripcionalmente activo. Esta tragedia se ha empleado para eliminar efectos de los potenciadores y promotores
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en las LTR virales en transcripcion de genes colocados de forma interna. Dichos efectos incluyen aumento de la transcripcion (Jolly et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 1855-1872) o supresion de la transcripcion (Emerman y Temin (1984) Cell 39: 449-467). Esta estrategia tambien puede usarse para eliminar la transcripcion cadena abajo de la 3' LTR en ADN genomico (Herman y Coffin (1987) Science 236: 845-848). Esto es particularmente importante en la terapia genica humana donde tiene importancia cntica evitar la activacion adventicia de un oncogen endogeno.
Sin embargo, el vector plasirndico usado para producir el genoma viral dentro de una celula hospedadora/celula de empaquetamiento tambien incluira secuencias de control reguladoras de la transcripcion unidas operativamente con el genoma lentiviral para dirigir la transcripcion del genoma en una celula hospedadora/celula de empaquetamiento. Estas secuencias reguladoras pueden ser las secuencias naturales asociadas con la secuencia lentiviral transcrita, es decir, la region 5' U3, o pueden ser un promotor heterologo tal como otro promotor viral, por ejemplo el promotor de CMV. Algunos genomas lentivirales requieren secuencias adicionales para produccion de virus eficaz. Por ejemplo, en el caso de VIH, se incluyen preferentemente secuencias de rev y RRE. Sin embargo, el requisito de rev y RRE puede reducirse o eliminarse por optimizacion de codones. Pueden encontrarse mas detalles de esta estrategia en el documento WO 01/79518 de los inventores. Tambien se conocen secuencias alternativas que realizan la misma funcion que el sistema de rev/RRE. Por ejemplo, se encuentra un analogo funcional del sistema de rev/RRE en el virus de mono Mason Pfizer. Este se conoce como el elemento de transporte constitutivo (ETC) y comprende una secuencia de tipo RRE en el genoma que se cree que interacciona con un factor en la celula infectada. El factor celular puede considerarse un analogo de rev. Por lo tanto, ETC puede usarse como una alternativa al sistema de rev/RRE. Cualquier otro equivalente funcional que se conozca o este disponible puede ser relevante para la invencion. Por ejemplo, tambien se sabe que la protema Rex de VLTH-1 puede reemplazar funcionalmente la protema de Rev de VIH-1. Tambien se sabe que Rev y Rex tienen efectos similares a IRE-BP.
En una realizacion particularmente preferida, el vector lentiviral consiste en vector lentiviral mmimo auto-inactivante, derivado de virus de la anemia infecciosa equina (VAIE), que codifica preferentemente tres enzimas que estan implicadas en la ruta sintetica de dopamina. Las protemas codificadas por dicho vector pueden comprender una forma truncada del gen de tirosina hidroxilasa humana (TH*) (que carece de los 160 aminoacidos N terminales implicados en la regulacion de retroalimentacion de TH), la descarboxilasa de L-aminoacido aromatico humana (AADC) y el gen de la GTP-ciclohidrolasa 1 humana (CH1). El vector puede producirse por la transfeccion transitoria de celulas (por ejemplo, celulas HEK293T) con tres plasmidos, que codifican: (1) el genoma de vector de VAIE recombinante ProSavin® (Oxford BioMedica plc, Oxford Reino Unido) (pONYK1-ORT, documento WO 02/29065 y Farley et al. (2007) J. Gen. Med. 9: 345-356), (2) el vector de expresion de gag/pol de VAIE sintetico (pESGPK, documentos Wo 01/79518, WO 05/29065), (3) el vector de expresion de envoltura de VSV-G (pHGK).
Secuencia de empaquetamiento
Como se utiliza dentro del contexto de la presente invencion la expresion “senal de empaquetamiento” que se denomina indistintamente “secuencia de empaquetamiento” o “psi” se usa en referencia a la secuencia de accion en cis, no codificante, requerida para encapsidacion de cadenas de ARN lenvitiral durante la formacion de partmulas virales. En VIH-1, esta secuencia se ha mapeado en loci que se extienden desde cadena arriba del sitio donador de corte y empalme principal (SD) hasta al menos el codon de inicio de gag.
Como se usa en el presente documento, la expresion “senal de empaquetamiento extendida” o “secuencia de empaquetamiento extendida” se refiere al uso de secuencias alrededor de la secuencia psi con extension adicional al gen de gag. La inclusion de estas secuencias de empaquetamiento adicionales puede aumentar la eficacia de insercion de ARN de vector en partmulas virales.
Pseudotipificacion
Preferentemente, el vector retroviral se ha pseudotipificado. A este respecto, la pseudotipificacion puede conferir una o mas ventajas. Por ejemplo, con los vectores lentivirales, el producto genico de env de los vectores basados en VIH restringinan estos vectores para infectar solamente celulas que expresan una protema denominada CD4. Pero si el gen env en estos vectores se ha sustituido con secuencias de env de otros virus de ARN, estos pueden entonces tener un espectro infeccioso mas amplio (Verman y Somia (1997)). Por ejemplo, Miller et al. pseudotipificaron un vector de VLMMo con la envoltura del retrovirus anfotropico 4070A (Mol. Cell. Biol. 5: 431-437), otros trabajadores han pseudotipificado un vector basado en VIH con la glucoprotema de VSV (Verman y Somia (1997)).
En otra alternativa, la protema Env puede ser una protema Env modificada tal como una protema Env mutante o modificada por ingeniena genetica. Pueden realizarse modificaciones o seleccionarse para introducir capacidad de direccion o para reducir la toxicidad o para otro fin (Valsesia-Wittman et al. (1996); Nilson et al. (1996); Fielding et al. (1998) y referencias citadas en las mismas).
El vector retroviral puede pseudotipificarse con cualquier molecula elegida, pero se prefiere en particular la envoltura de VSV-G.
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VSV-G:
La glucoprotema de envoltura (G) del virus de la estomatitis Vesicular (VSV), un rabdovirus, es una protema de envoltura que se ha mostrado que es capaz de pseudotipificar ciertos retrovirus.
Su capacidad para pseudotipificar vectores retrovirales basados en VLMMo en ausencia de cualquiera protema de la envoltura retroviral se mostro por primera vez en Emi et al. (1991) J. Virol. 65: 1202-1207). El documento WO 94/294440 ensena que los vectores retrovirales pueden pseudotipificarse con exito con VSV-G. Estos vectores VSV- G pseudotipificados pueden usarse para transducir una amplia serie de celulas de mairnfero. Mas recientemente, Abe et al. (1998) J. Virol. 72(8) 6356-6361 ensenan que partmulas retrovirales no infecciosas pueden hacerse infecciosas por la adicion de VSV-G.
Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-7) pseudotipificaron con exito el retrovirus VLM con VSV-G y esto dio como resultado un vector que tema un rango de hospedador alterado en comparacion con VLM en su forma nativa. Se ha mostrado que los vectores pseudotipificados con VSV-G infectan no solamente celulas de mai^ero, sino tambien lmeas celulares derivadas de peces, reptiles e insectos (Burns et al. (1993) misma referencia). Se ha mostrado tambien que son mas eficaces que las envolturas anfotropicas tradicionales para una diversidad de lmeas celulares (Yee et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9564-9568, Lin, Emi et al. (1991) J. Virol. 65: 1202-1207). La protema VSV-G tambien puede usarse para pseudotipificar ciertos lentivirus y retrovirus debido a que su cola citoplasmatica es capaz de interaccionar con los nucleos retrovirales.
La provision de una envoltura de pseudotipificacion no lentiviral tal como protema VSV-G proporciona la ventaja de que las partmulas de vector pueden concentrarse a una alta titulacion sin perdida de infectividad (Akkina et al. (1996) J. Virol. 70: 2581-5). Las protemas de envoltura de lentivirus y retrovirus son aparentemente incapaces de soportar las fuerzas de corte durante la ultracentrifugacion, probablemente porque consisten en dos subunidades unidas de forma no covalente. La interaccion entre las subunidades puede romperse por la centrifugacion. En comparacion la glucoprotema de VSV esta compuesta de una unica unidad. La pseudotipificacion de protema VSV-G puede por lo tanto ofrecer ventajas potenciales.
El documento WO 00/52188 describe la generacion de vectores retrovirales pseudotipificados, de lmeas celulares productoras estables, que tienen protema de virus G de la estomatitis vesicular (VSV-G) como la protema de envoltura viral asociada a membrana, y proporciona una secuencia genica para la protema VSV-G.
Virus del Ro Ross
La envoltura viral del Rfo Ross se ha usado para pseudotipificar un vector lentiviral no primate (VIF) y despues de la administracion sistemica se transdujo predominantemente al hngado (Kang et al. (2002)). Se ha indicado que la eficacia es 20 veces mayor que la obtenida con el vector pseudotipificado con VSV-G, y provoco menos citotoxicidad como se mide por niveles en suero de enzimas hepaticas que sugieren hepatotoxicidad.
El Virus del Rfo Ross (VRR) es un alfavirus propagado por mosquitos que son endemicos y epidemicos en regiones tropicales y templadas de Australia. Las tasas de anticuerpos en poblaciones normales en la zona costera templada tienden a ser bajas (de 6 % al 15 %) aunque la sero-prevalencia alcanza de 27 al 37 % en las llanuras del sistema del Rfo del Valle de Murray. En 1979 a 1980 el Virus del Rfo Ross se hizo epidemico en las Islas del Padfico. La enfermedad no es contagiosa entre seres humanos y nunca es letal, siendo el primer smtoma dolor de las articulaciones con fatiga y letargo en aproximadamente la mitad de los pacientes (Fields Virology).
GP64 de Baculovirus
Se ha mostrado que la protema GP64 de baculovirus es una alternativa atractiva a VSV-G para vectores virales usados en la produccion a gran escala de virus de alto tttulo requeridos para aplicaciones clmicas y comerciales (Kumar M, Bradow BP, Zimmerberg J (2003) Hum. Gene Ther. 14(1): 67-77). En comparacion con vectores pseudotipificados con VSV-G, los vectores pseudotipificados con GP64 tienen un tropismo general similar y tttulos nativos similares. Debido a que la expresion de GP64 no destruye celulas, pueden generarse lmeas celulares basadas en 293T que expresan GP64 de forma constitutiva.
G de Rabia
En la presente invencion el vector puede pseudotipificarse con al menos una parte de la protema G de rabia o un mutante, una variante, un homologo o un fragmento de la misma.
Pueden encontrarse ensenanzas sobre la protema G de la rabia, asf como mutantes de la misma, en el documento WO 99/61639 asf como Rose et al. (1982) J. Virol. 43: 361-364, Hanham et al. (1993) J. Virol. 67: 530-542, Tuffereau et al. (1998) J. Virol. 72: 1085-1091, Kucera et al. (1985) J. Virol. 55: 158-162, Dietzschold et al. (1983) PNAS 80: 70-74, Seif et al. (1985) J.Virol. 53: 926-934, Coulon et al. (1998) J. Virol. 72: 273-278, Tuffereau et al. (1998) J. Virol. 72: 1085-10910, Burger et al. (1991) J. Gen. Virol. 72: 359-367, Gaudin et al. (1995) J. Virol. 69:
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Envolturas alternativas
Otras envolturas que pueden usarse para pseudotipificar vectores retrovirales incluyen Mokola, Ebola, 4070A y VCML (virus de la coriomeningitis linfodtica).
Nucleotido de interes (NOI)
En una realizacion, el virus es un vector retroviral de tipo silvestre, o un mutante o parte del mismo que aun es infeccioso en celulas. En otra realizacion, el virus es un vector retroviral recombinante que comprende informacion heterologa, que puede usarse en una situacion terapeutica para fines de terapia genica, o como un antigeno para fines de vacunacion. Esta es una realizacion preferida que emplea por ejemplo vectores retrovirales. La informacion heterologa se denomina “nucleotido de interes” (NOI).
El NOI puede tener una aplicacion terapeutica o de diagnostico. Los NOI adecuados incluyen, pero sin limitacion: secuencias que codifican enzimas, citocinas, quimiocinas, hormonas, anticuerpos, moleculas antioxidantes, moleculas de tipo inmunoglobulina modificadas tecnicamente, un anticuerpo monocatenario, protemas de fusion, moleculas co-estimulantes inmunitarias, moleculas inmunomoduladoras, ARN antisentido, microARN, ARNhp, ARNip, ribozimas, un mutante negativo de transdominio de una protema diana, una toxina, una toxina condicional, un antfgeno, una protema supresora de tumores y factores de crecimiento, protemas de membrana, protemas y peptidos vasoactivos, protemas y ribozimas antivirales y derivados de los mismos (tales como con un grupo indicador asociado). Los NOI tambien pueden codificar enzimas activadoras de pro-farmacos.
En otra realizacion, el NOI puede ser util en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo.
En otra realizacion, el NOI puede ser util en el tratamiento de enfermedad de Parkinson.
En otra realizacion mas, el NOI puede codificar una enzima o enzimas implicadas en la smtesis de dopamina. Por ejemplo, la enzima puede ser una o mas de las siguientes: tirosina hidroxilasa, GTP-ciclohidralasa I y/o aminoacido aromatico dopa descarboxilasa. Las secuencias de los tres genes estan disponibles: N.° de Referencia de GenBank® X05290, U19523 y M76180 respectivamente.
Como alternativa el NOI puede codificar el transportador de monoamina vesicular 2 (VMAT2). En una realizacion alternativa el genoma viral comprende un NOI que codifica aminoacido aromatico dopa descarboxilasa y un NOI que codifica VMAT 2. Dicho genoma puede usarse en el tratamiento de enfermedad de Parkinson, en particular junto con administracion periferica de L-DOPA.
En otra realizacion el NOI puede codificar una protema terapeutica o combinacion de protemas terapeuticas.
En otra realizacion, el NOI puede codificar una protema o protemas seleccionadas del grupo que consiste en factor neurotrofico derivado de celulas gliales (GDNF), factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrofico ciliar (CNTF), neurotrofina-3 (NT-3), factor de crecimiento de fibroblastos acido (aFGF), factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), interleucina-1 beta (IL-1P), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), factor de crecimiento de insulina 2, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C/VEGF-2, VEGF-D, VEGF-E, PDGF-A, PDGF-B, hetero- y homo-dfmeros de PDFG-A y PDFG-B.
En otra realizacion, el NOI puede codificar una protema anti-angiogenica o protemas anti-angiogenicas seleccionadas del grupo que consiste en angiostatina, endostatina; factor plaquetario 4, factor derivado de epitelio pigmentario (PEDF), restina, interferon-alfa, protema inducible por interferon, gro-beta y tubedown-1, Interleucina (IL)-1, IL-12, acido retinoico, anticuerpos anti-VEGF, aptameros, oligos antisentido, ARNip, trombospondina, protemas del receptor de VEGF tales como las descritas en los documentos US 5.952.199 y US 6.100.071 y anticuerpos anti-receptor de VEGF.
En otra realizacion, el NOI puede codificar una protema que se expresa normalmente en una celula ocular. En otra realizacion, el NOI puede codificar una protema que se expresa normalmente en una celula fotorreceptora.
En otra realizacion, el NOI puede codificar una protema seleccionada del grupo que comprende RPE65, protema receptora que interacciona con aril-hidrocarburo de tipo 1 (AIPL1), CRB1, acetiltransferasa retiniana de lecitina (LRAT), caja homeotica espedfica de fotorreceptor (CRX), guanilato ciclasa retiniana (GUCY2D), protema de
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interaccion con RPGR 1 (RPGRIP1), LCA2, LCA3, LCA5, distrofina, PRPH2, CNTF, ABCR/ABCA4, EMP1, TIMP3, MERTK, ELOVL4, MYO7A, USH2A y opticina.
Por lo tanto, el vector retroviral puede usarse para suministrar uno o mas NOI utiles en el tratamiento de los trastornos enumerados en los documentos WO 98/05635, WO 98/07859, WO 98/09985. El nucleotido de interes puede ser ADN o ARN. Se proporcionan ejemplos de dichas enfermedades a continuacion:
Un trastorno que responde a citocina y actividad de proliferacion/diferenciacion de celulas; actividad inmunosupresora o inmunoestimulante (por ejemplo, para tratar deficiencia inmunitaria, incluyendo infeccion con virus de la inmunodeficiencia humana; regulacion del crecimiento de linfocitos; tratamiento del cancer y muchas enfermedades autoinmunitarias y para el rechazo de trasplante o inducir inmunidad tumoral; regulacion de hematopoyesis, por ejemplo tratamiento de enfermedades mieloides o linfoides; promocion del crecimiento de hueso, cartflago, tendon, ligamiento y tejido nervioso, por ejemplo para curar heridas, tratamiento de quemaduras, ulceras y enfermedad periodontal y neurodegeneracion, inhibicion o activacion de hormona estimulante del folmulo (modulacion de la fertilidad); actividad quimiotactica/quimiocinetica (por ejemplo para movilizar tipos celulares espedficos a sitios de lesion o de infeccion); actividad hemostatica y trombolttica (por ejemplo para tratar hemofilia e ictus); actividad antiinflamatoria (para tratar por ejemplo choque septico o enfermedad de Crohn); actividad inhibidora de macrofagos y/o inhibidora de linfocitos T y por lo tanto, actividad antiinflamatoria; actividad antiinmunitaria, es decir, efectos inhibidores contra una respuesta inmunitaria celular y/o humoral, incluyendo una respuesta no asociada con inflamacion; inhibir la capacidad de macrofagos y linfocitos T para adherirse a componentes de la matriz extracelular y fibronectina, asf como expresion del receptor de fas regulado positivamente en linfocitos T.
Trastornos de tumores malignos incluyendo cancer, crecimiento, invasion y propagacion de tumores benignos y malignos, angiogenesis, metastasis, ascitis y efusion de la pleura maligna.
Enfermedades autoinmunitarias incluyendo artritis, incluyendo artritis reumatoide, hipersensibilidad, reacciones alergicas, asma, lupus eritematoso sistemico, enfermedades de colageno y otras enfermedades.
Enfermedades cardiovasculares incluyendo arteriosclerosis, enfermedad cardiaca aterosclerotica, lesion de reperfusion, parada cardiaca, infarto de miocardio, trastornos inflamatorios vasculares, smdrome de dificultad respiratoria, efectos cardiovasculares, migrana y anti-trombosis dependiente de aspirina, ictus, isquemia cerebral, enfermedad cardiaca isquemica u otras enfermedades.
Enfermedades del tracto gastrointestinal incluyendo ulcera peptica, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn y otras enfermedades.
Enfermedades hepaticas incluyendo fibrosis hepatica, cirrosis hepatica u otras enfermedades.
Enfermedades renales y urologicas incluyendo tiroiditis u otras enfermedades glandulares, glomerulonefritis u otras enfermedades.
Trastornos del ofdo, la nariz y la boca, incluyendo otitis u otras enfermedades otorrinolaringologicas, dermatitis u otras enfermedades dermicas.
Trastornos dentales y orales incluyendo enfermedades periodontales, periodontitis, gingivitis u otras enfermedades dentales/orales.
Enfermedades testiculares incluyendo orquitis o epidfdimo-orquitis, infertilidad, traumatismo orquidial u otras enfermedades testiculares.
Enfermedades ginecologicas incluyendo disfuncion placentaria, insuficiencia placentaria, aborto habitual, eclampsia, pre-eclampsia, endometriosis y otras enfermedades ginecologicas.
Trastorno oftalmologico tal como uveitis posterior, uveitis intermedia, uveitis anterior, conjuntivitis, coriorretinitis, uveorretinitis, neuritis optica, inflamacion intraocular, por ejemplo, retinitis o edema macular cistoide, oftalmia simpatica, escleritis, retinitis pigmentosa, degeneracion macular incluyendo degeneracion macular relacionada con la edad (AMD) y degeneracion macular juvenil incluyendo Enfermedad de Best, Enfermedad de Stargardt, smdrome de Usher, distrofia retiniana en panal de Doyne, Distrofia Macular de Sorby, retinosquisis juvenil, Distrofia de Conos- Bastones, Distrofia Corneana, Distrofia de Fuch, amaurosis congenita de Leber, neuropatfa optica hereditaria de Leber (LHON), smdrome de Adie, enfermedad de Oguchi, enfermedad de fondus degenerativo, traumatismo ocular, inflamacion ocular provocada por infeccion, vitreorretinopatfas proliferativas, neuropatfa optica isquemica aguda, cicatrizacion excesiva, por ejemplo, despues de operacion de filtracion de glaucoma, reaccion contra implantes oculares, rechazo de injerto de trasplante corneano y otras enfermedades oftalmicas.
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Trastornos neurodegenerativos y neurologicos incluyendo enfermedad de Parkinson, complicacion y/o efectos secundarios del tratamiento de la enfermedad de Parkinson, complejo de demencia relacionado con SIDA, encefalopatfa relacionada con VIH, enfermedad de Devic, corea de Sydenham, enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades, afecciones o trastornos degenerativos del SNC, ictus, smdrome post-polio, trastornos psiquiatricos, mielitis, encefalitis, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomielitis, neuropatfa aguda, neuropatia subaguda, neuropatfa cronica, smdrome de Guillain-Barre, corea de Sydenham, miastenia grave, pseudo-tumor cerebral, Smdrome de Down, enfermedad de Huntington, compresion del SNC o traumatismo del SNC o infecciones del SNC, atrofias y distrofias musculares, enfermedades, afecciones o trastornos de los sistemas nerviosos central y periferico, enfermedad de las neuronas motoras incluyendo esclerosis lateral amiotrofica, atrofia muscular espinal, lesion de la medula espinal y avulsion.
Otras enfermedades y afecciones tales como inflamacion post-traumatica, hemorragia, coagulacion y respuesta de fase aguda, caquexia, anorexia, infeccion aguda, choque septico, enfermedades infecciosas, complicaciones o efectos secundarios de la cirugfa, trasplante de medula osea u otras complicaciones de trasplante y/o efectos secundarios, complicaciones y efectos secundarios de la terapia genica, por ejemplo, debido a infeccion con un vehmulo viral, o SIDA, para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, para la prevencion y/o el tratamiento de rechazo de injertos en casos de trasplante de celulas, tejido y organos naturales o artificiales tales como cornea, medula osea, organos, lentes, marcapasos, tejido cutaneo natural o artificial.
ARNip/micro-ARN
El NOI puede comprender o codificar un ARNip o micro-ARN o ARNhp o micro ARN o ARNhp regulado (Dickins et al. (2005) Nature Genetics 37: 1289-1295, Silva et al. (2005) Nature Genetics 37: 1281-1288).
El silenciamiento genico post-transcripcional (PTGS) mediado por ARN bicatenario (ARNbc) es un mecanismo de defensa celular conservado para controlar la expresion de genes ajenos. Se cree que la integracion aleatoria de elementos tales como transposones o virus provoca la expresion de ARNbc lo que activa la degradacion espedfica de secuencia de ARNm monocatenario homologo o ARN genomico viral. El efecto de silenciamiento se conoce como interferencia de ARN (ARNi) (Ralph et al. (2005) Nature Medicine 11: 429-433). El mecanismo de ARNi implica el procesamiento de ARNbc largos en dobles cadenas de aproximadamente 21-25 nucleotidos (nt) de ARN. Estos productos se denominan ARN de interferencia pequenos o de silenciamiento (ARNip) que son los mediadores espedficos de secuencia de degradacion de ARNm. En celulas de mairnfero diferenciadas se ha descubierto que ARNbc > 30 pb activa la respuesta de interferon que conduce a la detencion de la smtesis de protemas y degradacion de ARNm no espedfico (Stark et al. (1998)). Sin embargo esta respuesta puede evitarse usando dobles cadenas de ARNip de 21 nt (Elbashir et al. (2001), Hutvagner et al. (2001)) lo que permite que la funcion genica se analice en celulas de marnffero cultivadas.
En otra realizacion el NOI comprende un micro-ARN. Los micro-ARN son un grupo muy grande de ARN pequenos producidos de forma natural en organismos, al menos algunos de los cuales regulan la expresion de genes diana. Son miembros fundacionales de la familia de micro-ARN let-7 y lin-4. El gen let-7 codifica una especie de ARN altamente conservada, pequena, que regula la expresion de genes que codifican protemas endogenas durante el desarrollo del gusano. La especie de ARN activa se transcribe inicialmente como un precursor de ~70 nt, que se procesa postraduccionalmente en una forma madura de ~21 nt. Tanto let-7 como lin-4 se transcriben como precursores de ARN en horquilla que se procesan hasta sus formas maduras mediante enzima de Dicer.
Promotores
La expresion de un NOI puede controlarse usando secuencias de control, que incluyen promotores/potenciadores y otras senales de regulacion de la expresion. Pueden usarse promotores procarioticos y promotores funcionales en celulas eucariotas. Pueden usarse promotores espedficos de tejidos o espedficos de estfmulos. Tambien pueden usarse promotores quimericos que comprenden elementos de secuencias de dos o mas promotores diferentes.
Las secuencias promotoras adecuadas son promotores fuertes incluyendo los que derivan de los genomas de virus, tales como poliomavirus, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus (CMV), retrovirus y Virus de Simio 40 (SV40), o de promotores de marnfferos heterologos, tales como el promotor de actina o el promotor de protema ribosomica. La transcripcion de un gen puede aumentarse adicionalmente insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son relativamente independientes de orientacion y posicion; sin embargo, se puede emplear un potenciador de un virus de celula eucariota, tal como el potenciador de SV40 en el lado tardfo del origen de replicacion (pb 100-270) y el potenciador del promotor temprano de CMV. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posicion 5' o 3' del promotor, pero esta preferentemente localizado en un sitio 5 'del promotor.
El promotor puede incluir adicionalmente elementos para asegurar o para aumentar la expresion en un hospedador adecuado. Por ejemplo, las caractensticas pueden ser regiones conservadas, por ejemplo una caja Pribnow o una caja TATA. El promotor puede incluso contener otras secuencias para afectar a (tal como mantener, potenciar, reducir) los niveles de expresion de una secuencia de nucleotidos. Otras secuencias adecuadas incluyen el intron de
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Sh1 o un intron de ADH. Otras secuencias incluyen elementos inducibles, tales como elementos inducibles por temperatura, productos qmmicos, luz o tension. Ademas, pueden estar presentes elementos adecuados para potenciar la transcripcion o traduccion.
Optimizacion de codones
Los polinucleotidos usados en la presente invencion (incluyendo los componentes de NOI y/o vector) pueden tener codones optimizados. La optimizacion de codones se ha descrito previamente en los documentos WO 99/41397 y WO 01/79518. Diferentes celulas difieren en su uso de codones particulares. Esta preferencia codonica corresponde a una desviacion en la abundancia relativa de un ARNt particular en el tipo celular. Alterando los codones de la secuencia de modo que se adapten para coincidir con la abundancia relativa de ARNt correspondientes, es posible aumentar la expresion. Por la misma razon, es posible reducir la expresion eligiendo deliberadamente codones para los que se sabe que los ARNt correspondientes son poco habituales en el tipo celular particular. Por lo tanto, esta disponible un grado adicional de control de la traduccion.
Muchos virus, incluyendo VIH y otros lentivirus, usan un gran numero de codones poco habituales y cambiando estos para corresponder con codones de mairnferos usados habitualmente, se puede conseguir expresion aumentada de un gen de interes, por ejemplo un componente NOI o de empaquetamiento en celulas productoras de mam^era. Se conocen en la tecnica tablas de uso codonico para celulas de mamffero, asf como para una diversidad de otros organismos.
La optimizacion de codones de componentes de vectores virales tiene varias otras ventajas. En virtud de alteraciones en sus secuencias, se elmininan secuencias de inestabilidad de ARN (INS) de las secuencias de nucleotidos que codifican los componentes de empaquetamiento de las partmulas virales requeridas para ensamblaje de partmulas virales en las celulas productoras/celulas de empaquetamiento. Al mismo tiempo, la secuencia codificante de secuencias de aminoacidos para los componentes de empaquetamiento se conserva de modo que los componentes virales codificados por las secuencias permanezcan iguales, o al menos suficientemente similares de modo que la funcion de los componentes de empaquetamiento no este comprometida. En vectores lentivirales la optimizacion de codones tambien supera el requisito de Rev/RRE para exportacion, haciendo las secuencias optimizadas independientes de Rev. La optimizacion de codones tambien reduce la recombinacion homologa entre diferentes construcciones dentro del sistema de vector (por ejemplo entre las regiones de solapamiento en las fases abiertas de lectura de gag-pol y env). El efecto general de optimizacion de codones es por lo tanto un aumento notable en el tftulo viral y mejora de la seguridad.
En una realizacion, solamente se optimizan los codones relacionados con INS. Sin embargo, en una realizacion mucho mas preferida y practica, las secuencias se optimizan con respecto a sus codones en su totalidad, con algunas excepciones, por ejemplo la secuencia que abarca el sitio de desplazamiento de fase de gag-pol (vease posteriormente).
El gen gag-pol comprende dos fases de lectura solapantes que codifican las protemas gag-pol. La expresion de ambas protemas depende de un desplazamiento de fase durante la traduccion. Este desplazamiento de fase sucede como resultado de “deslizamiento” de ribosomas durante la traduccion. Se cree que este deslizamiento esta provocado al menos en parte por estructuras secundarias de ARN que detienen el ribosoma. Dichas estructuras secundarias existen cadena abajo del sitio de desplazamiento de fase en el gen gag-pol. Para VIH, la region de solapamiento se extiende desde el nucleotido 1222 cadena abajo del comienzo de gag (en la que el nucleotido 1 es la A de la ATG de gag) hasta el final de gag (nt 1503). En consecuencia, un fragmento de 281 pb que abarca el sitio de desplazamiento de fase y la region de solapamiento de las dos fases de lectura preferentemente no tiene codones optimizados. La conservacion de este fragmento permitira una expresion mas eficaz de las protemas gag- pol.
Para VAIE se ha considerado que el comienzo del solapamiento es nt 1262 (en el que el nucleotido 1 es la A de la ATG de gag). El final del solapamiento esta en 1461 pb. Para asegurar que el sitio de desplazamiento de fase y el solapamiento de gag-pol estan conservados, se ha conservado su secuencia de tipo silvestre de nt 1156 a 1465.
Pueden realizarse derivaciones de uso de codon optimo, por ejemplo, para acomodar los sitios de restriccion convenientes y pueden introducirse cambios de aminoacidos conservativos en las protemas gag-pol.
En una realizacion, la optimizacion de codones se basa en genes de marnfferos expresados ligeramente. La tercera y en ocasiones la segunda y la tercera bases pueden cambiarse.
Debido a la naturaleza degradada del Codigo Genetico, se apreciara que un experto en la materia puede conseguir numerosas secuencias de gag-pol. Tambien existen muchas variantes retrovirales descritas que pueden usarse como un punto de partida para generar una secuencia de gag pol de codones optimizados. Los genomas lentivirales pueden ser bastante variables. Por ejemplo existen muchas cuasiespecies de VIH-1 que aun son funcionales. Este tambien es el caso para VAIE. Estas variantes pueden usarse para potenciar partes particulares del proceso de transduccion. Pueden encontrarse ejemplos de variantes de VIH-1 en las Bases de datos de VIH operadas por Los
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Alamos National Security, LLC en <
http://hiv-web.lanl.gov>. Pueden encontrarse detalles de clones de VAIE en la base de datos del Centro Nacional para la Informacion Biotecnologica (NCBI) localizada en <
http://www.ncbi.nlm.nih.gov>.
La estrategia para secuencias de gag-pol con codones optimizados puede usarse en relacion con cualquier retrovirus. Esto se aplicana a todos los lentivirus, incluyendo VAIE, ViF, VIB, VAEC, VMR, VIS, VIH-1 y VIH-2. Ademas este metodo podna usarse para aumentar la expresion de genes de VLTH-1, VLTH-2, HFV, HSRV y retrovirus endogenos humanos (HERV), MLV y otros retrovirus.
La optimizacion de codones puede hacer a la expresion de gag-pol independiente de Rev. Para permitir el uso de factores anti rev o RRE en el vector lentiviral, sin embargo, sena necesario hacer al sistema de generacion de vectores virales totalmente independiente de Rev/RRE. Por lo tanto, tambien es necesario modificar el genoma. Esto se consigue optimizando componentes de genoma del vector. Provechosamente, estas modificaciones tambien conducen a la produccion de un sistema mas seguro desprovisto de todas las protemas adicionales tanto en la celula productora como en la transducida.
Sistemas de produccion de vectores retrovirales
Los vectores retrovirales pueden propagarse convenientemente en celulas (denominados en ocasiones “celulas hospedadoras”).
Una celula puede ser cualquier celula en la que pueda propagarse un vector retroviral deseado.
Usando lmeas celulares productoras/de empaquetamiento estables, es posible propagar cantidades de partmulas de vectores virales (por ejemplo preparar tftulos adecuados del vector lentiviral) para purificacion posterior.
Como se usa en el presente documento, la expresion “celula productora” o “celula productora de vector” se refiere a una celula que contiene todos los elementos necesarios para produccion de partmulas de vectores lentivirales.
Como se usa en el presente documento, la expresion “celula de empaquetamiento” se refiere a una celula que contiene los elementos necesarios para la produccion de virus recombinante infeccioso que estan ausentes en el genoma de ARN. Tfpicamente, dichas celulas de empaquetamiento contienen uno o mas plasmidos productores que son capaces de expresar protemas estructurales virales (tales como gag-pol y env con codones optimizados) pero no contienen una senal de empaquetamiento.
Preferentemente las celulas productoras/celulas de empaquetamiento derivan de una celula de mairnfero y, preferentemente, de una celula de primate tal como una celula de rinon embrionario humano que se prefiera particularmente. Aunque se prefieren celulas de primates, cualquier tipo de celula que sea capaz de soportar la replicacion del virus sena aceptable en la practica de la invencion. Otros tipos celulares podnan incluir, pero sin limitacion, cualquier celula eucariota para la que se establezcan tecnicas de cultivo tisular siempre que las celulas sean permisivas para retrovirus.
La celula puede derivar de una lmea celular existente, por ejemplo, de una lmea celular HEK 293.
Para mejorar la seguridad, se han producido lmeas celulares en las que se suprime la 3' LTR del provirus. En dichas celulas, senan necesarias dos recombinaciones para producir un virus de tipo silvestre. Una mejora adicional implica la introduccion de los genes gag-pol y el gen env en construcciones separadas. Estas construcciones pueden introducirse secuencialmente para evitar la recombinacion durante la transfeccion. En estas lmeas celulares de construccion dividida, puede conseguirse una reduccion adicional en la recombinacion cambiando los codones. Esta tecnica, basada en la redundancia del codigo genetico, se dirige a reducir la homologfa entre las construcciones separadas, por ejemplo entre las regiones de solapamiento en las fases abiertas de lectura de gag-pol y env.
En una realizacion las celulas de produccion de vector usadas en la presente invencion usan como su sistema de produccion, tres unidades de transcripcion que expresan un genoma, los componentes de gag-pol y una envoltura. El casete de expresion de envoltura puede incluir una de varias envolturas tales como VSV-G o diversas envolturas de retrovirus murino tales como 4070A. La envoltura de VSV-G se prefiere particularmente.
En una realizacion las secuencias de protema de envoltura y secuencias de nucleocapsida estan todas integradas de forma estable en la celula productora y/o de empaquetamiento. Sin embargo, una o mas de estas secuencias tambien podnan existir en forma episomica y podna producirse expresion genica del episoma.
Una realizacion adicional utiliza un sistema inducible por ejemplo, el sistema Tet (Gossen y Bujard) para generar celulas productoras/de empaquetamiento estables que expresan un producto genico toxico tal como VSV-G (documento EP 0572401B).
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En una realizacion alternativa se usa transfeccion transitoria para generar las celulas productoras virales. La transfeccion transitoria evita el tiempo mas largo requerido para generar lmeas celulares productoras de vectores estables y puede usarse si el genoma de vector o componentes de empaquetamiento lentiviral son toxicos para celulas.
En una realizacion particularmente preferida, la celula de empaquetamiento usada para producir el vector retroviral se produce por la transfeccion de celulas (por ejemplo, celulas HEK293T) con tres plasmidos que codifican (i) el genoma de vector retroviral recombinante, (ii) un vector de expresion que codifica gag/pol y (iii) un vector de expresion que codifica env.
Los metodos de transfeccion pueden realizarse usando metodos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el proceso de transfeccion puede realizarse usando fosfato calcico o formulaciones disponibles en el mercado tales como Lipofectamine™ 2000CD (Invitrogen, CA) o polietilenimina (PEI).
Tambien pueden generarse celulas productoras/de empaquetamiento transduciendo una lmea celular adecuada con un vector retroviral que expresa uno de los componentes de la celula productora/de empaquetamiento, es decir, un genoma, los componentes de gag-pol y una envoltura como se describe en el documento WO 2004/022761.
Se cultivan celulas transfectadas con los componentes que codifican el vector retroviral para aumentar los numeros de celulas y virus y/o los tttulos virales. El cultivo de una celula se realiza para permitir que metabolice y/o crezca y/o se divida y/o produzca virus de interes de acuerdo con la invencion. Esto puede conseguirse por metodos bien conocidos por los expertos en la materia, e incluye pero sin limitacion proporcionar nutrientes para la celula, por ejemplo en el medio de cultivo apropiado. Los metodos pueden comprender crecimiento adherido a superficies, crecimiento en suspension o combinaciones de los mismos. El cultivo puede realizarse por ejemplo en matraces de cultivo tisular, placas, frascos rotatorios o en biorreactores, usando sistemas discontinuos, semicontinuos, continuos, de fibra hueca y similares. Para conseguir produccion a gran escala (continua) de virus a lo largo del cultivo celular se prefiere en la tecnica tener celulas capaces de crecer en suspension. Se conocen condiciones adecuadas para cultivar celulas (vease por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Paterson, editores (1973), y R. I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, cuarta edicion (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-47134889-9).
Preferentemente las celulas se “desarrollan a granel” en matraces de cultivo tisular y posteriormente se cultivan en recipientes de cultivo multicapas para generar las celulas productoras de vectores.
Preferentemente se cultivan celulas de un modo adherente para generar las celulas productoras de vectores. Preferentemente se cultivan celulas en un modo discontinuo para generar las celulas productoras de vectores. Clarificacion
En realizaciones preferidas de la invencion, el sobrenadante recogido del cultivo celular se clarifica.
De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas la etapa de clarificacion se realiza antes de la adicion de nucleasa.
La clarificacion puede realizarse por una etapa de filtracion, retirando residuos celulares y otras impurezas. Los filtros adecuados pueden utilizar filtros de celulosa, fibras de celulosa regeneradas, fibras de celulosa combinadas con auxiliares de filtros inorganicos (por ejemplo tierras diatomeas, perlita, sflice pirogena), filtros de celulosa combinados con auxiliares de filtros inorganicos y resinas organicas, o cualquier combinacion de los mismos, y filtros polimericos (los ejemplos incluyen pero sin limitacion, nylon, polipropileno, polietersulfona) para conseguir retirada eficaz y recuperaciones aceptables. En general, es preferible pero no se requiere un proceso de multiples etapas. Un proceso ejemplar de dos o tres etapas consistina en un filtro o filtros gruesos para retirar precipitados grandes y residuos celulares seguido de filtro o filtros de segundo estadio de refinamiento con tamanos de poros nominales mayores de 0,2 micrometros pero menores de 1 micrometro. La combinacion optima puede estar en funcion de la distribucion del tamano del precipitado asf como otras variables. Ademas, tambien pueden usarse para clarificacion operaciones de una unica etapa que emplean un filtro de tamano de poro relativamente pequeno o centrifugacion. Mas generalmente, sera aceptable usar en la etapa de clarificacion de la presente invencion cualquier enfoque de clarificacion incluyendo pero sin limitacion filtracion de punto muerto, microfiltracion, centrifugacion o adicion de auxiliares de filtro (por ejemplo tierras diatomeas) en combinacion con filtracion de punto muerto o en profundidad, que proporciona un filtrado de claridad adecuada para no obstruir la membrana y/o resinas en las etapas posteriores.
En una realizacion, se usa filtracion en profundidad y filtracion de membrana. Se mencionan productos disponibles en el mercado utiles a este respecto, por ejemplo, en el documento WO 03/097797, p. 20-21. Las membranas que pueden usarse pueden estar compuestas de diferentes materiales, pueden diferir en su tamano de poro y pueden usarse en combinaciones. Pueden obtenerse comercialmente de varios proveedores.
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Preferentemente el filtro usado para clarificacion esta en el intervalo de 1,2 a 0,22 pm.
Mas preferentemente el filtro usado para clarificacion es un filtro de 1,2/0,45 pm o un filtro asimetrico con un tamano de poro nominal mmimo de 0,22 pm
Tratamiento con nucleasa
La presente invencion en realizaciones preferidas emplea nucleasa para degradar ADN/ARN contaminante, es decir principalmente acidos nucleicos de celulas hospedadoras. Las nucleasas ejemplares adecuadas para su uso en la presente invencion incluyen Nucleasa Benzonase® (documento EP 0229866) que ataca y degrada todas las formas de ADN y ARN (monocatenarios, bicatenarios, lineales o circulares) o cualquier otra DNasa y/o RNasa habitualmente usada dentro de la tecnica con el fin de eliminar ADN y/o ARN no deseado o contaminante de una preparacion. En realizaciones preferidas, la nucleasa es Nucleasa Benzonase®, que hidroliza rapidamente acidos nucleicos hidrolizando enlaces fosfodiester internos entre nucleotidos espedficos, reduciendo de este modo el tamano de los polinucleotidos en el sobrenadante que contiene vectores. La Nucleasa Benzonase® puede obtenerse comercialmente de Merck KGaA (codigo W214950). La concentracion en la que se emplea la nucleasa esta preferentemente dentro del intervalo de 1-100 unidades/ml.
De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas se incluye mas de un tratamiento de nucleasa. Por ejemplo, podna anadirse Nucleasa Benzonase® al sobrenadante que contiene vector antes y/o despues de purificarse el vector por cromatograffa.
Como un ejemplo no limitante, se anade Nucleasa Benzonase® al sobrenadante que contiene vector que esta entre 37 °C y temperatura ambiente y cuando la mezcla se incuba de 2 a 8 °C, preferentemente durante una noche.
En lugar de o ademas de tratar con una nucleasa para fragmentar acido nucleico libre (principalmente ADN de celulas hospedadoras), podna aplicarse precipitacion selectiva (retirada) de ADN de impurezas en medio de cultivo celular, por ejemplo por precipitacion con una cantidad apropiada de un agente de precipitacion selectivo tal como bromuro de domifeno (DB), CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio), cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de bencetonio (BTC), cloruro de tetradeciltrimetilamonio (TTA) polietilenimina (PEI), etc., como se desvela en detalle en el documento WO 03/097797.
Ultrafiltracion/diafiltracion
De acuerdo con realizaciones de la presente invencion, la suspension de vector se somete a ultrafiltracion (denominada en ocasiones diafiltracion cuando se usa para intercambio de tampon) al menos una vez durante el proceso, por ejemplo para concentrar el vector y/o intercambio de tampon. El proceso usado para concentrar el vector de acuerdo con el metodo de la presente invencion puede incluir cualquier proceso de filtracion (por ejemplo, ultrafiltracion (UF)) cuando la concentracion del vector aumente obligando al diluyente a pasar a traves de un filtro de tal manera que el diluyente se retire de la preparacion de vector mientras que el vector es incapaz de pasar a traves del filtro y permanece por lo tanto, en forma concentrada, en la preparacion de vector. UF se describe en detalle, por ejemplo, en Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman y A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, 1996); y en: Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN n.° 87762456-9). Un proceso de filtracion preferido es la Filtracion de Flujo Tangencial (“FFT”) como se describe, por ejemplo, en el catalogo de MILLIPORE titulado “Pharmaceutical Process Filtration Catalog”, pp. 177-202 (Bedford, Massachusetts, 1995/96). FFT se usa ampliamente en la industria de bioprocesamiento para recogida de celulas, clarificacion, purificacion y concentracion de productos incluyendo virus. El sistema se compone de tres flujos de procesamiento distintos: la solucion de alimentacion, el permeado y el retenido. Dependiendo de la aplicacion, pueden usarse filtros con diferentes tamanos de poros. En la presente invencion el retenido contiene el producto (vector lentiviral). A este fin, la membrana de ultrafiltracion particular seleccionada tendra un tamano de poro suficientemente pequeno para conservar el vector pero suficientemente grande para eliminar eficazmente impurezas. Dependiendo del fabricante y el tipo de membrana, para vectores retrovirales pueden ser apropiados puntos de corte de peso molecular nominales (PCPMN) entre 100 y 1000 kDa, por ejemplo membranas con PCPMN de 300 kDa o 500 kDa. La composicion de membrana puede ser, pero sin limitacion, celulosa regenerada, polietersulfona, polisulfona o derivados de las mismas. Las membranas pueden ser laminas planas (tambien denominadas pantallas planas) o fibras huecas. Una UF preferida usada en la presente invencion es UF de fibras huecas. UF se refiere en general a filtracion usando filtros con un tamano de poro de menos de 0,1 pm. Los productos en general se conservan, mientras que el volumen puede reducirse mediante permeacion (o mantenerse constante durante la diafiltracion anadiendo tampon a la misma velocidad que la velocidad con la que el permeado, que contiene tampon e impurezas, se retira en el lado de permeado).
Las dos geometnas mas ampliamente usadas para FFT en la industria biofarmaceutica son placa y marco (pantallas planas) y modulos de fibra hueca. Las unidades de fibra hueca para ultrafiltracion y microfiltracion se desarrollaron por Amicon y Ramicon a principios de los anos 70 (Cheryan, M. Ultrafiltration Handbook), incluso aunque existen ahora multiples proveedores incluyendo Spectrum y GE Healthcare. Los modulos de fibras huecas consisten en una serie de fibras autosustentables con una capa de piel densa. Los diametros de las fibras vanan de 0,5 mm a 3 mm.
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Una ventaja de los modulos de fibras huecas es la disponibilidad de filtros de areas de membranas pequenas (aproximadamente 16 cm2) a areas de membranas muy grandes (aproximadamente 20 m2) permitiendo un aumento de escala lineal y sencillo. En ciertas realizaciones preferidas de acuerdo con la invencion, se usan fibras huecas para FFT. Se ha indicado que estas proporcionan menos cizalla y una mejor relacion de partfcula viral/unidad infecciosa (PV/UI) que las membranas de pantalla plana. Ademas, la presion transmembrana es generalmente menor en fibras huecas que con pantallas planas. En ciertas realizaciones, se usan fibras huecas de 500 kDa (0,05 pm) de tamano de poro de acuerdo con la invencion. La ultrafiltracion puede comprender diafiltracion (DF), usando ultrafiltros y es un modo ideal de retirar e intercambiar sales, azucares, disolventes no acuosos, separacion de especies libres de las unidas, retirada de material de bajo peso molecular o cambio rapido de ambientes ionicos y/o de pH. Se retiran microsolutos mas eficazmente anadiendo disolvente a la solucion que se ultrafiltra a una velocidad igual a la velocidad de UF. Esto lava las microespecies de la solucion a un volumen constante, purificando el vector retenido.
UF/DF puede usarse para concentrar y/o intercambiar el tampon de las suspensiones de vector de acuerdo con la presente invencion en diferentes estadios del proceso de purificacion. La presente invencion preferentemente utiliza una etapa de DF para intercambiar el tampon de un sobrenadante despues de cromatografia u otras etapas de purificacion, pero tambien puede usarse antes de la cromatografia.
Preferentemente, el eluato de la etapa de cromatografia de acuerdo con la presente invencion se concentra y despues se purifica por ultrafiltracion-diafiltracion. Durante este proceso el vector se cambia a tampon de formulacion. Sin embargo, se ha descubierto sorprendentemente que puede conseguirse produccion de vector mejorada si la concentracion hasta la concentracion final deseada no tiene lugar hasta despues de la etapa de esterilizacion por filtrado. Despues de dicha filtracion esteril, la sustancia esterilizada por filtrado se concentra por UF aseptica para producir el producto de vector a granel.
En realizaciones de la invencion la ultrafiltracion/diafiltracion puede ser diafiltracion de flujo tangencial, diafiltracion celular agitada y dialisis.
Cromatografia
Los expertos en la materia conocen bien tecnicas de purificacion. Estas tecnicas tienden a implicar la separacion de las parficulas de vector del medio celular y, si es necesario, la purificacion adicional de las parficulas de vector. Pueden usarse para esta purificacion uno o mas de una diversidad de metodos cromatograficos. Aunque la cromatografia de intercambio ionico, y mas particularmente de intercambio anionico, es un metodo preferido para la presente invencion, podnan usarse otros metodos. Se proporciona a continuacion una descripcion de algunas de las tecnicas cromatograficas relevantes.
Cromatografia de intercambio ionico
La cromatografia de intercambio ionico utiliza el hecho de que las especies con carga, tales como biomoleculas y vectores virales, pueden unirse de forma reversible con una fase estacionaria (tal como una membrana, o bien el empaquetamiento en una columna) que tiene grupos, fijados en su superficie, que tienen una carga opuesta. Existen dos tipos de intercambiadores ionicos. Los intercambiadores anionicos son fases estacionarias que portan grupos que tienen una carga positiva y por lo tanto pueden unirse con especies con una carga negativa. Los intercambiadores cationicos portan grupos con una carga negativa y por lo tanto pueden unirse con especies con carga positiva. El pH del medio tiene una influencia importante en esto, ya que puede alterar la carga de una especie. Por lo tanto, para una especie tal como una protema, si el pH esta por encima del pi, la carga neta sera negativa, mientras que por debajo del pi, la carga neta sera positiva.
El desplazamiento (elucion) de la especie unida puede efectuarse mediante el uso de tampones adecuados. Por lo tanto habitualmente la concentracion ionica del tampon aumenta hasta que la especie se desplaza mediante competicion de iones de tampon por los sitios ionicos en la fase estacionaria. Un metodo alternativo de elucion implica cambiar el pH del tampon hasta que la carga neta de la especie ya no favorece la union con la fase estacionaria. Un ejemplo sena reducir el pH hasta que la especie adopte una carga neta positiva y ya no se una a un intercambiador anionico.
Puede conseguirse algo de purificacion si las impurezas no tienen carga, o bien si portan una carga de signo opuesto a la de la especie deseada, pero el mismo signo que el del intercambiador ionico. Esto se debe a que las especies sin carga y las que tienen una carga del mismo signo que un intercambiador ionico, normalmente no se uniran. Para diferentes especies unidas, la fuerza de la union vana con factores tales como la densidad de carga y la distribucion de cargas en las diversas especies. Por lo tanto aplicando un gradiente ionico de pH (como un gradiente continuo, o como una serie de etapas), la especie deseada podna eluirse por separado de las impurezas.
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Cromatografia de Exclusion por Tamano
La cromatografia de exclusion por tamano es una tecnica que separa especies segun su tamano. Tfpicamente se realiza mediante el uso de una columna empaquetada con parficulas que tienen poros de un tamano bien definido. Para la separacion cromatografica, se seleccionan parficulas que tienen tamanos de poros que son apropiados con respecto a los tamanos de la especie en la mezcla para separar. Cuando se aplica a la mezcla, como una solucion (o suspension, en el caso de un virus), a la columna y despues se eluye con tampon, las parficulas mayores se eluiran en primer lugar ya que tienen acceso limitado (o no) a los poros. Parficulas mas pequenas se eluiran despues ya que pueden entrar en los poros y por lo tanto toman una ruta mas larga a traves de la columna. Por lo tanto al considerar el uso de la cromatografia de exclusion por tamano para la purificacion de vectores virales, se esperana que el vector se eluyera antes que las impurezas mas pequenas tales como protemas.
Cromatografia de Interaccion Hidrofoba (HIC)
Especies, tales como protemas, tienen en su superficie, regiones hidrofobas que pueden unirse de forma reversible a sitios debilmente hidrofobos en una fase estacionaria. En medios que tienen una concentracion de salinidad relativamente alta, se promueve esta union. Tfpicamente en HIC la muestra para purificarse se une a la fase estacionaria en un ambiente de alta salinidad. Se consigue despues elucion mediante la aplicacion de un gradiente (continuo, o como una serie de etapas) de concentracion salina decreciente. Una sal que se usa habitualmente es sulfato de amonio. Las especies que tienen diferentes niveles de hidrofobicidad tenderan a eluirse a diferentes concentraciones salinas y por lo tanto las especies diana pueden purificarse de impurezas. Otros factores, tales como pH, temperatura y aditivos al medio de elucion tales como detergentes, sales caotropicas y compuestos organicos tambien pueden influir en la fuerza de union de especies a fases estacionarias de HIC. Pueden ajustarse uno o mas de estos factores o utilizarse para optimizar la elucion y purificacion del producto.
Los vectores virales tienen en su superficie, restos hidrofobos tales como protemas, y por lo tanto HIC podna emplearse potencialmente como un medio de purificacion.
Cromatografia de Fase Inversa (RPC)
Como HIC, RPC separa especies segun diferencias en sus hidrofobicidades. Se usa una fase estacionaria de mayor hidrofobicidad que la empleada en HIC. La fase estacionaria consiste con frecuencia en un material, fipicamente sflice, con el que se unen restos hidrofobos tales como grupos alquilo o grupos fenilo. Como alternativa la fase estacionaria podna ser un pofimero organico, sin ningun grupo unido. La muestra que contiene la mezcla de especies para resolver se aplica a la fase estacionaria en un medio acuoso de polaridad relativamente alta que promueve la union. Despues se consigue elucion reduciendo la polaridad del medio acuoso mediante la adicion de un disolvente organico tal como isopropanol o acetonitrilo. Habitualmente se usa un gradiente (continuo o como una serie de etapas) de concentracion de disolvente organico creciente y las especies se eluyen en orden de sus hidrofobicidades respectivas.
Otros factores, tales como el pH del medio de elucion, y el uso de aditivos, tambien pueden influir en la fuerza de union de especies con fases estacionarias de RPC. Uno, o mas, de estos factores pueden ajustarse o utilizarse para optimizar la elucion y purificacion del producto. Un aditivo comun es el acido trifluoroacetico (TFA). Esto suprime la ionizacion de grupos acidos tales como restos de carboxilo en la muestra. Tambien reduce el pH en el medio de elucion y esto suprime la ionizacion de grupos de silanol libres que pueden estar presentes en la superficie de fases estacionarias que tienen una matriz de sflice. TFA es uno de una clase de aditivos conocidos como agentes de emparejamiento de iones. Estos interaccionan con grupos ionicos, presentes en especies en la muestra, que portan una carga opuesta. La interaccion tiende a enmascarar la carga, aumentando la hidrofobicidad de la especie. Otros agentes de emparejamiento de iones, tales como TFA y acido pentafluoropropionico interaccionan con grupos con carga positiva en una especie. Agentes de emparejamiento de iones cationicos tales como trietilamina, interaccionan con grupos con carga negativa.
Los vectores virales tienen en su superficie restos hidrofobos, tales como protemas, y por lo tanto RPC, potencialmente, podna emplearse como un medio de purificacion. Considerando su uso, sin embargo, se requerina tener cuidado para limitar el dano al vector debido al uso de disolventes organicos y tambien las condiciones de pH bajo usadas con frecuencia en la tecnica.
Cromatografia de Afinidad
La cromatografia de afinidad utiliza el hecho de que ciertos ligandos que se unen espedficamente con biomoleculas tales como protemas o nucleotidos, pueden inmovilizarse en una fase estacionaria. La fase estacionaria modificada puede despues usarse para separar la biomolecula relevante de una mezcla. Son ejemplos de ligandos altamente espedficos anticuerpos para la purificacion de anfigenos diana e inhibidores enzimaticos para la purificacion de enzimas. Tambien pueden utilizarse interacciones mas generales tales como el uso del ligando de protema A para el aislamiento de una amplia serie de anticuerpos.
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Tfpicamente, se realiza cromatograffa de afinidad mediante la aplicacion de una mezcla, que contiene la especie de interes, a la fase estacionaria que tiene el ligando relevante unido. En condiciones apropiadas esto conducira a la union de la especie con la fase estacionaria. Despues se retiran por lavado componentes no unidos antes de aplicar un medio de elucion. El medio de elucion se elige para romper la union del ligando con la especie diana. Esto se consigue habitualmente mediante la eleccion de una fuerza ionica apropiada, pH o mediante el uso de sustancias que competiran con la especie diana por sitios del ligando. Para algunas especies unidas, se usa un agente caotropico tal como urea para efectuar el desplazamiento del ligando. Esto, puede dar como resultado, sin embargo, una desnaturalizacion irreversible de la especie.
Los vectores virales tienen en su superficie restos tales como protemas, que podffan ser capaces de unirse espedficamente con ligandos apropiados. Esto significa que, potencialmente, podffa usarse cromatograffa de afinidad en su aislamiento.
Cromatograffa de Afinidad de lones Metalicos Inmovilizados (IMAC)
Las biomoleculas, tales como protemas, pueden tener en su superficie restos donadores de electrones que pueden formar enlaces coordinados con iones metalicos. Esto puede facilitar su union con fases estacionarias que portan
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iones metalicos inmovilizados tales como Ni , Cu , Zn o Fe . Las fases estacionarias usadas en IMAC tienen agentes quelantes, ffpicamente acido nitriloacetico o acido iminodiacetico unido covalentemente con su superficie y es el agente quelante que retiene el ion metalico. Es necesario que el ion metalico quelado tenga al menos un sitio de coordinacion restante disponible para formar un enlace coordinado con una biomolecula. Potencialmente existen varios restos en la superficie de biomoleculas que podffan ser capaces de unirse con el ion metalico inmovilizado. Estos incluyen restos de histidina, triptofano y cistema, asf como grupos fosfato. Para protemas, sin embargo, el donador predominante parece ser el grupo imidazol del resto de histidina. Pueden separarse protemas nativas usando lMAC si muestran restos donadores adecuados en su superficie. De otro modo puede usarse IMAC para la separacion de protemas recombinantes que portan una cadena de varios restos de histidina unidos.
Tfpicamente, se realiza IMAC mediante la aplicacion de una mezcla, que contiene la especie de interes, a la fase estacionaria. En condiciones apropiadas esto conducira al enlace coordinado de la especie con la fase estacionaria. Despues se retiran por lavado componentes no unidos antes de aplicarse un medio de elucion. Para elucion, pueden usarse gradientes (continuos o como una serie de etapas) de concentracion salina creciente o pH decreciente. Ademas un procedimiento habitualmente usado es la aplicacion de un gradiente de concentracion de imidazol creciente. Pueden separarse biomoleculas que tengan propiedades donadoras diferentes, por ejemplo que tengan restos de histidina en diferentes ambientes, mediante el uso de elucion de gradiente.
Los vectores virales tienen en su superficie restos tales como protemas, que podffan ser capaces de unirse con fases estacionarias de IMAC. Esto significa que, potencialmente, podffa usarse IMAC en su aislamiento.
Centrifugacion
Las tecnicas de centrifugacion adecuada incluyen centrifugacion zonal, ultracentrifugacion isopmnica y centrifugacion de sedimentacion.
Esterilizacion por Filtrado
La esterilizacion por filtrado es comun en procesos para materiales de uso farmaceutico, y es conocida por los expertos en la materia. La esterilizacion por filtrado hace a la formulacion resultante sustancialmente libre de contaminantes. El nivel de contaminantes despues de esterilizacion por filtrado es tal que la formulacion es adecuada para uso clmico. De acuerdo con la presente invencion, cualquier concentracion adicional (por ejemplo mediante ultrafiltracion) despues de la etapa de esterilizacion por filtrado se realiza en condiciones asepticas.
Los expertos en la materia conocen bien filtros de esterilizacion adecuados para uso en la presente invencion. El filtro de esterilizacion tiene un tamano de poro maximo de 0,22 |im.
Verificacion de la Integridad del Vector
Pueden usarse diversos ensayos para verificar la integridad genetica del vector retroviral durante el proceso de purificacion. Uno de dichos metodos es confirmar la presencia de un gen codificado por el vector. En una realizacion preferida, el metodo puede confirmar la presencia de uno mas nucleotidos de interes (NOI) codificados por el vector. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante aislamiento de ARN a partir de la preparacion de vector, y digestion con DNasaI para degradar aDn plasmfdico residual. Las reacciones de transcriptasa inversa (RT) convierten las secuencias de ARN en ADNc, y estas se siguen de amplificacion por PCR espedfica de regiones seleccionadas de la secuencia de NOI.
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Composiciones Farmaceuticas y Administracion
La presente divulgacion proporciona una formulacion (composicion farmaceutica) para tratar a un individuo por terapia genica, en la que la composicion comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un vector. La composicion farmaceutica puede ser para uso humano o animal. Tfpicamente, un medico determinara la dosificacion real que sera mas adecuada para un sujeto individual y variara con la edad, el peso y la respuesta del individuo particular.
La composicion puede comprender opcionalmente un vehmulo, diluyente, excipiente o adyuvante farmaceuticamente aceptable. La eleccion de vetnculo, excipiente o diluyente farmaceutico puede seleccionarse con respecto a la via pretendida de administracion y la practica farmaceutica convencional. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender, o ademas de, el vetnculo, excipiente o diluyente cualquier aglutinante o aglutinantes, lubricante o lubricantes, agente o agentes de suspension, agente o agentes de recubrimiento, agente o agentes de solubilizacion adecuados y otros agentes transportadores que pueden ayudar o aumentar la entrada viral en el sitio diana (tal como por ejemplo un sistema de suministro lipfdico).
Cuando sea apropiado, la composicion puede administrarse por uno cualquiera o mas de: inhalacion, en forma de un supositorio o pesario, por via topica en forma de una locion, solucion, crema, pomada o polvo de uso externo, mediante el uso de un parche cutaneo, por via oral en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidon o lactosa, o en capsulas u ovulos solos o en mezcla con excipientes, o en forma de elixires, soluciones o suspensiones que contienen agentes saponferos o colorantes, o pueden inyectarse por via parenteral, por ejemplo por via intracavernosa, via intravenosa, via intramuscular, via intracraneal, via intraocular o via subcutanea. Para la administracion parenteral, las composiciones pueden usarse mejor en forma de solucion acuosa esteril que puede contener otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacaridos para hacer a la solucion isotonica con la sangre. Para la administracion bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma de comprimidos o grageas que pueden formularse de una manera convencional.
Tratamiento
El vector retroviral producido por el proceso de la presente invencion puede usarse en el tratamiento. Se apreciara que todas las referencias en el presente documento al tratamiento incluyen tratamiento curativo, paliativo y profilactico. Se prefiere en particular el tratamiento de mairnferos. Los tratamientos tanto de humanos como veterinarios estan dentro del alcance de la presente divulgacion.
En un ejemplo, la formulacion de vector retroviral producida por el proceso puede usarse para introducir los tres genes que codifican las tres enzimas de la ruta sintetica de dopamina para tratar la enfermedad de Parkinson. El vector retroviral es un vector lentiviral mmimo auto-inactivante, sin replicacion, derivado del virus de la anemia infecciosa Equina (VAIE) que puede pseudotipificarse con VSV-G o una protema de envoltura viral alternativa. Los genes portados por el vector retroviral pueden comprender una forma truncada del gen de tirosina hidroxilasa humana (TH*) (que carece de los 160 aminoacidos N terminales implicados en la regulacion de retroalimentacion de TH*), la L-aminoacido descarboxilasa aromatica humana (AADC), y el gen de la GTP-ciclohidrolasa 1 humana (CH1). El vector retroviral puede producirse por la transfeccion transitoria de celulas HEK293T con tres plasmidos, que codifican: (1) el genoma del vector de vAlE recombinante (pONYKI-ORT), (2) el vector de expresion de gal/pol de VAIE sintetico (pESGPK), (3) el vector de expresion de envoltura de VSV-G (pHGK). La formulacion del vector retroviral puede administrarse por inyeccion directa en el cuerpo estriado del cerebro.
En otro ejemplo, la formulacion del vector retroviral producida por el proceso puede usarse como un producto de terapia genica disenado para introducir el gen de MYO7A corrector en fotorreceptores y soportar celulas epiteliales de pigmento retiniano (RPE) y de este modo atenuar o invertir el deterioro de la vision que se asocia con el Smdrome de Usher 1B. El vector retroviral es un vector lentiviral mmimo auto-inactivante, no replicativo, derivado del virus de la anemia infecciosa Equina (VAIE) que puede pseudotipificarse con VSV-G o una protema de envoltura viral alternativa. El gen portado por el vector retroviral es el ADNc de MYO7A, que codifica la protema MYO7A (un gen grande que tiene mas de l0o mb de longitud). La expresion de la protema MYO7A grande puede optimizarse para dirigirse a RPE y celulas fotorreceptoras usando el nuevo promotor quimerico de CMV/MYO7A que evita la sobreexpresion de este subtipo de miosina. Sin embargo, tambien es posible que puedan usarse promotores alternativos, tales como CMV. La formulacion del vector retroviral puede administrarse por inyeccion subretiniana directa despues de vitrectornfa del ojo.
En otro ejemplo, la formulacion de vector retroviral producida por el proceso puede usarse para introducir el gen de casete de union a ATP corrector, ABCA4 (tambien conocido como ABCR), en fotorreceptores y de este modo atenuar o invertir la patofisiologfa que conduce a enfermedad de Stargardt. El vector retroviral es un vector lentiviral mmimo no replicante, auto-inactivante, derivado del virus de la anemia infecciosa Equina (VAIE) que puede pseudotipificarse con VSV-G o una protema de envoltura viral alternativa. El gen portado por el vector retroviral es el ADNc de ABCA4 que codifica la protema ABCA4. La expresion de la protema ABCA4 puede optimizarse para expresion en celulas fotorreceptoras tanto bastones como conos usando un promotor espedfico de fotorreceptor, tal como rodopsina quinasa, sin embargo, tambien es posible que puedan usarse promotores alternativos, tales como
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CMV. La formulacion de vector retroviral puede administrarse por inyeccion subretiniana directa despues de vitrectomna del ojo.
En otro ejemplo, la formulacion de vector retroviral producida por el proceso puede usarse como un producto de terapia genica disenado para evitar la reaparicion del crecimiento de vasos sangumeos aberrantes en edema en los ojos de pacientes con la forma humeda de degeneracion macular relacionada con la edad (AMD). Este vector retroviral suministra un gen o genes que codifican una protema o protemas anti-angiogenicas, tales como angiostatina y/o endostatina. El vector retroviral es un vector lentiviral mmimo no replicativo, auto-inactivante derivado del virus de la anemia infecciosa Equina (VAIE) que puede pseudotipificarse con VGS-G o una protema de envoltura viral alternativa. En un ejemplo el vector retroviral expresa genes de endostatina y angiostatina humana en una configuracion bicistronica que utiliza un sitio de entrada ribosomica interna (IRES) para suministro a celulas del epitelio pigmentario retiniano. La expresion del gen o los genes anti-angiogenicos puede restringirse al epitelio pigmentario retiniano diana usando un promotor espedfico de RPE tal como el promotor de distrofia macular viteliforme 2 (VMD2), mas recientemente conocido como el promotor de bestrofina, sin embargo tambien es posible que puedan usarse promotores alternativos tales como CMV. La formulacion de vector retroviral puede administrarse por inyeccion subretiniana directa despues de vitrectoirna del ojo.
En otro ejemplo mas, la formulacion de vector retroviral producida por el proceso puede usarse como un producto de terapia genica disenado para evitar el rechazo de injerto corneano como resultado de neovascularizacion por suministro de gen o genes anti-angiogenicos a la cornea del donante antes del injerto. El vector retroviral es un vector lentiviral mmimo no replicativo, auto-inactivante derivado del virus de la anemia infecciosa Equina (VAIE), que puede pseudotipificarse con VSV-G o una protema de envoltura viral alternativa. En un ejemplo, el vector retroviral expresara un gen o genes anti-angiogenicos tales como genes de endostatina y angiostatina humanas en una configuracion bicistronica que utiliza un sitio de entrada ribosomica interna (IRES) para suministro ex vivo a injertos corneanos. La formulacion de vector retroviral puede aplicarse a tejido de injerto corneano ex vivo, y el tejido donante transducido puede tambien almacenarse antes del trasplante. La expresion del gen o genes anti- angiogenicos puede estar conducida por un promotor constitutivo tal como el promotor de CMV, sin embargo tambien es posible que puedan usarse promotores alternativos.
Ejemplos
Se describiran ahora diversos elementos y realizaciones preferidos de la invencion por medio de Ejemplos no limitantes en referencia a los ejemplos adjuntos.
Descripcion del Proceso de Fabricacion
ProSavin® es un vector lentiviral, disenado para la tratar la enfermedad de Parkinson suministrando tres genes que codifican tres enzimas de la ruta biosintetica de dopamina.
La sustancia activa del vector ProSavin® consiste en un vector lentiviral mmimo auto-inactivante, derivado del Virus de la Anemia Infecciosa Equina (VAIE) y pseudotipificado con VSV-G, que codifica tres enzimas que estan implicadas en la ruta sintetica de dopamina.
Las protemas codificadas por el vector ProSavin® son una forma truncada del gen de tirosina hidroxilasa humana (TH*) (que carece de los 160 aminoacidos N terminales implicados en la regulacion de retroalimentacion de TH), la L-aminoacido descarboxilasa aromatica humana (AADC), y el gen de la GTP-ciclohidrolasa 1 humana (CH1).
El vector ProSavin® se produce por la transfeccion transitoria de celulas HEK293T con tres plasmidos que codifican: (1) el genoma del vector de VAIE recombinante ProSavin® (pONYKI-ORT), (2) el vector de expresion de gal/pol de VAIE sintetico (pESGPK), (3) el vector de expresion de envoltura de VSV-G (pHGK).
Se expanden celulas HEK293T en matraces de cultivo tisular, en fabricas celulares (FC) de 10 capas como se muestra en la Figura 1. El volumen de sobrenadante, antes de la transfeccion, es de aproximadamente 24 litros. La mezcla de transfeccion, que contiene cantidades fijas de los plasmidos y reactivo Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, CA) CD o PEI se transfiere a un deposito, unido a una fabrica celular. El medio de cultivo de la FC se drena al deposito y, despues de mezclar, el medio que contiene plasmido se devuelve a la FC. Este proceso se repite para todas las FC. A las 14-19 horas despues de la transfeccion, el medio se reemplaza con medio de cultivo nuevo complementado con butirato sodico 10 mM. Despues de 6-8 horas de induccion con butirato sodico, el medio que contiene butirato sodico se reemplaza por medio de cultivo nuevo sin butirato sodico. Despues de 21-23 horas adicionales, el sobrenadante que contiene vector se recoge en una bolsa flexible esteril.
Despues de la recogida de sobrenadante que contiene vector, se recogen muestras de celulas post produccion de todas las FC. Las celulas post produccion (CPP) se ensayan con respecto a lentivirus competente en replicacion (LCR) (vease posteriormente). El sobrenadante que contiene vector se clarifica por filtrado, usando un filtro de 1,2/0,45 |im y, para digerir ADN, se anade Nucleasa Benzonase® hasta una concentracion final de 5 U/ml (Figura 1). Despues de incubacion durante una noche a 2-8 °C, el vector tratado con Nucleasa Benzonase® se purifica por
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cromatograffa de membrana de intercambio anionico, usando un gradiente de elucion por etapas de cloruro sodico. La fraccion que contiene vector del eluato despues se concentra y se purifica adicionalmente por ultrafiltracion/diafiltracion de fibras huecas. Durante este proceso el vector se cambia a tampon de formulacion para producir lotes de sustancias farmacologicas de aproximadamente 400 ml, que se separan en alfcuotas y se almacenan congelados a <-70 °C (Figura 1).
La sustancia o las sustancias farmacologicas, se descongelan, agrupan y se esterilizan por filtrado (0,2 |im). La sustancia farmacologica a granel esterilizada por filtrado se concentra despues por ultrafiltracion de fibras huecas para producir el producto farmacologico a granel mostrado en la (Figura 1).
Esterilizacion por Filtrado de Preparacion de Vector ProSavin®
Para determinar el numero y concentracion de partfculas de vector dentro de lotes individuales, se uso un ensayo de PCR de transcriptasa inversa en tiempo real (qRT-PCR) para cuantificar el numero de secuencias de ARN genomico de vector dentro de preparaciones de vectores. Esto se basa en la naturaleza predecible del empaquetamiento de ARN de vector retroviral y se ha descrito previamente (Radcliffe et al. (2008) Gene Therapy 15: 289-297). Una preparacion de VAIE, IHl8, tuvo una concentracion de partfculas de vector en el estadio de producto final de 5,6 x 1012 copias de ARN por ml. Un intento de filtrar a traves de una unidad de filtracion esterilizante a esta concentracion condujo a solamente 18,5 % de recuperacion (las copias de ARN total fueron 3,93 x 1013 copias antes de la filtracion y 7,26 x 1012 despues de la filtracion). Diversas otras preparaciones tambien condujeron a escasas recuperaciones de filtracion. Se decidio por lo tanto ensayar la hipotesis de que filtrar en un estadio anterior del proceso, en el que la concentracion de partfculas de vector era menor debido a menor concentracion general, puede conducir a mayores recuperaciones del proceso de filtracion. El proceso de fabricacion ya inclrna un estadio de retencion intermedio, de modo que los estudios de filtracion se centraron en este estadio de fabricacion por conveniencia. Para ensayar la hipotesis de que concentraciones menores de vector conducinan a recuperacion mejorada de la filtracion esterilizante, se filtro material de una preparacion de vector anterior, que se sabfa que estaba a una concentracion de partfculas menor. Este lote, IH17, no se proceso inicialmente hasta el estadio de “producto final” debido a perdidas que se habfan producido durante el estadio de intercambio ionico, lo que condujo al numero de copias de ARN menor de lo esperado en un estadio intermedio; 5,5 x 1010 copias por ml. La filtracion de este material condujo a una recuperacion drasticamente mejorada del 82,4 %.
La confirmacion de que concentraciones menores pero volumenes mayores de partfculas de vector condudan a recuperaciones mejoradas de la filtracion esterilizante se consiguio posteriormente usando dos lotes diferentes, IH19 e IH21. Para IH19, el numero de copias de ARN en el estadio de retencion intermedio de fabricacion fue de 1,2 x 1012 copias por ml. Este se diluyo a 4,6 x 1011 copias por ml antes de la filtracion, dando como resultado una recuperacion de 84,5 % de partfculas de vector (las copias de ARN totales fueron de 9,2 x 1013 copias antes de la filtracion y 7,80 x 1013 despues de la filtracion). Se demostro posteriormente que la fabricacion de este lote de vector habfa tenido exito por varias otras medidas de calidad de vector, incluyendo el ensayo de fuerza de vector. Para IH21, el numero de copias de ARN en el estadio de retencion intermedio de fabricacion fue de 8,1 x 1010 copias por ml. Esto se filtro, lo que condujo a una recuperacion de 86,6 % de partfculas de vector (las copias de ARN totales fueron 1,64 x 1013 copias antes de la filtracion y 1,42 x 1013 despues de la filtracion). Tambien se demostro que la fabricacion de este lote de vector habfa tenido exito por varias otras medidas de calidad de vector, incluyendo el ensayo de fuerza del vector.
A partir de estos estudios, se concluyo que se consegrna filtracion de partfculas de VAIE con altas recuperaciones cuando las concentraciones de vector fueron menores de o iguales a 4,6 x 1011 copias por ml.

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un proceso para producir una formulacion de vector retroviral adecuada para la administracion a un paciente, que comprende una etapa de esterilizacion por filtrado y una etapa de concertacion, en el que la etapa de concentracion es la etapa final en el proceso y la etapa de esterilizacion por filtrado es la penultima etapa en el proceso, y en el que en la etapa de concentracion se realiza en condiciones asepticas, y ademas en el que la etapa de esterilizacion por filtrado se realiza usando un filtro de esterilizacion con un tamano de poro maximo de hasta o igual a 0,22 |im.
  2. 2. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 1 que comprende las siguientes etapas (i) a (vi) en orden cronologico:
    (i) cultivar celulas que producen vector retroviral;
    (ii) recoger el sobrenadante que contiene vector retroviral;
    (iii) opcionalmente clarificar el sobrenadante;
    (iv) purificar el vector retroviral para proporcionar una preparacion de vector retroviral;
    (v) esterilizacion por filtrado de la preparacion de vector retroviral; y
    (vi) concentrar la preparacion de vector retroviral para producir el producto a granel final.
  3. 3. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 2 en el que la etapa (iv) se realiza utilizando un metodo o combinacion de metodos seleccionados de cromatograffa, ultrafiltracion/diafiltracion o centrifugacion.
  4. 4. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 3 en el que se incluye al menos una etapa para degradar acido nucleico para mejorar la purificacion.
  5. 5. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 4 en el que dicha etapa es tratamiento con nucleasa.
  6. 6. Un proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 y 5 en el que se lleva a cabo una etapa de degradacion de acido nucleico en cualquier punto hasta e incluyendo la etapa (iv).
  7. 7. Un proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 y 5 en el que la etapa de purificacion (iv) incluye una o mas etapas de intercambio de tampon.
  8. 8. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 en el que la etapa (iii) se realiza por clarificacion por filtrado.
  9. 9. Un proceso de acuerdo con cualquiera reivindicacion precedente en el que la etapa de concentracion se realiza usando ultrafiltracion.
  10. 10. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente en el que una preparacion de vector retroviral se diluye antes de la esterilizacion por filtrado.
  11. 11. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente en el que el vector retroviral deriva de un lentivirus.
  12. 12. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 11 en el que el vector retroviral deriva de Virus de la Anemia Infecciosa Equina (VAIE) y la concentracion de vector retroviral antes de la esterilizacion por filtrado es menor que o igual a 4,6 x 1o11 copias de genoma de ARN por ml de preparacion de vector retroviral.
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