ES2618407T3 - Procedimiento para aumentar la productividad de metionina usando una mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de producción de L-metionina, que comprende: 1) preparar una solución de reacción que incluye (i) un precursor de metionina que es una O-acetil homoserina o una O-succinil homoserina, (ii) una enzima de conversión que tiene la actividad de convertir el precursor de metionina en metionina y (iii) una mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo; y 2) llevar a cabo una reacción de conversión enzimática al tiempo que se agita la solución de reacción; en el que la enzima de conversión es una o más seleccionada entre el grupo que consiste en cistationina gamma sintasa, O-succinil homoserina sulfihidrilasa y O-acetil homoserina sulfihidrilasa.
Description
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DESCRIPCION
Procedimiento para aumentar la productividad de metionina usando una mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un procedimiento para mejorar la productividad de L-metionina.
Descripcion de la tecnica relacionada
Metionina es uno de los aminos acidos esenciales en el cuerpo, y se ha usado ampliamente como alimentacion animal y aditivo alimentario, asf como tambien como componente de soluciones medicas acuosas y otras materias primas para productos medicinales. Metionina actua como precursor de colina (lecitina) y creatina, y tambien se usa como materia prima para la smtesis de cistema y taurina. Ademas, funciona como donante de azufre. S-adenosil- metionina procede de L-metionina y sirve como donante de metilo en el cuerpo y/o esta implicada en la smtesis de diversos neurotransmisores en el cerebro. Se ha encontrado tambien que metionina y/o S-adenosil-L-metionina (SAM) previenen la acumulacion de lfpidos en el tugado y las arterias y son eficaces para el tratamiento de depresion, inflamacion, enfermedades hepaticas y dolor muscular (Jeon BR et al., J. Hepatol, 2001, Mar; 34(3): 395401).
Para la smtesis qrnmica de metionina, se produce L-metionina a traves de la hidrolisis de 5-(p-metilmercaptoetilo)- hidantoma. No obstante, la metionina sintetizada qmmicamente esta presente, de manera desventajosa, en una mezcla de formas L- y D-. Por tanto, los presentes inventores han desarrollado un procedimiento biologico para sintetizar selectivamente L-metionina, y ya lo han aplicado a una patente (documento WO 2008/013432). El procedimiento, denominado brevemente como "procedimiento de dos etapas", comprende la produccion fermentativa de un precursor de L-metionina y la conversion enzimatica del precursor de L-metionina en L-metionina. Preferentemente, el precursor de L-metionina incluye O-acetil homoserina y O-succinil homoserina. El procedimiento de dos etapas se evalua en terminos de haber solucionado los problemas de los cuales adolecen los procedimientos convencionales, tales como toxicidad de sulfuro, regulacion de retroalimentacion de la cepa por parte de metionina y SAMe, y degradacion de los intermedios por parte de cistationina gamma sintasa, O-succinil homoserina sulfihidrilasa y O-acetil homoserina sulfihidrilasa. Tambien, en comparacion con el procedimiento de smtesis qrnmica convencional de produccion de D- y L-metionina, el procedimiento de dos etapas tiene la ventaja de ser selectivo para L-metionina unicamente, con la produccion concomitante de acidos organicos, mas particularmente, acido succmico y acido acetico como sub-productos utiles. El acido succmico se usa como materia prima en pinturas, productos cosmeticos, o productos medicinales, y acido acetico es muy util en los campos industriales, incluyendo la preparacion de acido vinil acetico, tincion, productos medicos tales como aspirina y soluciones de fijacion fotografica.
En la reaccion de conversion enzimatica del procedimiento de dos etapas, se usan las enzimas que tienen las actividades de cistationina gamma sintasa, O-succinil homoserina sulfihidrilasa y O-acetil homoserina sulfihidrilasa, y se mezcla O-acetil homoserina o O-succinil homoserina como precursor de L-metionina con metil mercaptano para producir L-metionina y un acido organico por medio de reaccion enzimatica.
Metil mercaptano existe como gas a temperatura ambiente, y es ligeramente soluble en agua, y tiene elevada solubilidad en soluciones alcalinas. La reaccion de conversion enzimatica para la produccion de L-metionina tiene lugar en una solucion acuosa. De este modo, metil mercaptano tiene una solubilidad mejorada en la solucion acuosa, y se espera que aumente en gran medida la productividad de metionina.
Considerando el problema anterior, los presentes inventores han realizado un esfuerzo para aumentar la solubilidad de metil mercaptano en la reaccion de conversion enzimatica para maximizar la produccion de L-metionina. Como resultado de ello, encontraron que una mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetil, mezclada en una relacion apropiada, puede mejorar la tasa de conversion de L-metionina y un acido organico a partir de un precursor de L- metionina, y de este modo se puede producir L-metionina con elevado rendimiento, en comparacion con los procedimientos convencionales, completando de este modo la presente invencion.
Sumario de la invencion
Es un objetivo de la presente invencion proporcionar un procedimiento para mejorar la tasa de conversion a partir de un precursor de L-metionina, O-acetil homoserina u O-succinil homoserina en la L-metionina, usando la mezcla de un compuesto de azufre, sulfuro de dimetilo y metil mercaptano, que es otro compuesto de azufre usado como sustrato en una reaccion de conversion enzimatica.
Efecto de la invencion
Por medio del uso de la presente invencion, se pueden aumentar la velocidad de produccion y la pureza de L- metionina y un acido organico en comparacion con el uso individual de metil mercaptano durante la reaccion de conversion. Ademas, se pueden obtener ventajas economicas de ahorro de costes para la instalacion de reaccion por medio de la productividad mejorada de metionina.
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Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un grafico de cambio de pH que muestra la velocidad de la reaccion de conversion enzimatica de acuerdo con el suministro de una solucion de metil mercaptano o una mezcla de metil mercaptano y una solucion de sulfuro de dimetilo en un reactor discontinuo de 1 l, y
La Figura 2 es un grafico que muestra la actividad relativa de acuerdo con la relacion de mezcla de una solucion de metil mercaptano (SMM) y sulfuro de dimetilo (DMS).
Descripcion detallada de las realizaciones preferidas
Con el fin de lograr el objeto anterior, un aspecto de la presente invencion es proporcionar un procedimiento para producir metionina, que comprende:
1) preparar una solucion de reaccion que incluye un precursor de metionina que es O-acetil homoserina y una O- succinil homoserina, una enzima que tiene la actividad de convertir el precursor de metionina en metionina, y una mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo; y
2) llevar a cabo la reaccion de conversion enzimatica al tiempo que se agita la solucion de reaccion,
en la que la enzima que tiene actividad de conversion del precursor de metionina en metionina es una o mas enzimas seleccionadas entre el grupo que consiste en cistationina gamma sintasa, O-succinil homoserina sulfihidrilasa y O-acetil homoserina sulfihidrilasa.
La expresion "procedimiento de dos etapas", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un procedimiento para producir L-metionina divulgado en el documento WO 2008/013432, que comprende las etapas de produccion de O-acetil homoserina u O-succinil homoserina por medio de fermentacion de glucosa usando un cepa de fermentacion preparada de acuerdo con el procedimiento; y conversion de O-acetil homoserina u O-succinil homoserina, junto con metil mercaptano, en metionina por medio de conversion enzimatica, produciendo de este modo L-metionina.
Posteriormente, la presente invencion se describe con detalle.
Un aspecto de la presente invencion es proporcionar un procedimiento para producir metionina, que comprende:
1) preparar una solucion de reaccion que incluye un precursor de metionina que es O-acetil homoserina y una O- succinil homoserina, una enzima que tiene la actividad de convertir el precursor de metionina en metionina, y una mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo; y
2) llevar a cabo la reaccion de conversion enzimatica al tiempo que se agita la solucion de reaccion, en la que la enzima esta seleccionada entre el grupo que consiste en una o mas enzimas seleccionadas entre el grupo que consiste en cistationina gamma sintasa, O-succinil homoserina sulfihidrilasa y O-acetil homoserina sulfihidrilasa.
La agitacion de la etapa 2) se puede llevar a cabo a 500 a 1000 rpm, preferentemente a 600 a 900 rpm, y mas preferentemente a 700 a 800 rpm.
El procedimiento de la presente invencion puede ademas comprender la terminacion de la reaccion de conversion enzimatica, y es la realizacion espedfica de la presente invencion, se usa HCl 2 N para terminar la reaccion.
Ademas, el procedimiento de la presente invencion puede comprender la purificacion de metionina presentada en la solucion de reaccion. En particular, la etapa de purificacion de metionina puede comprender:
1) separar el microorganismo de la solucion de reaccion de conversion enzimatica;
2) decolorar y filtrar la solucion de reaccion, de la cual se retira el microorganismo; y
3) cristalizar a partir del filtrado.
La etapa de separacion del microorganismo se puede llevar a cabo usando una centnfuga de alta velocidad o un filtro de membrana. La etapa de decoloracion y filtracion de la solucion con el microorganismo retirado se puede llevar a cabo usando un carbono activado, pero no se limita a ello.
En el procedimiento de dos etapas para la produccion de metionina, se produce metionina por medio de una reaccion de conversion enzimatica usando O-acetil homoserina y O-succinil homoserina como precursor de L- metionina y metil mercaptano (CH3SH) como sustratos (Documento WO2008/013432). En este sentido, se usa metil mercaptano como fuente de azufre que puede reaccionar con el sustrato, O-acetil homoserina y O-succinil homoserina para producir metionina, y de este modo la eficiencia de produccion de metionina puede verse afectada en gran medida por la reactividad de metil mercaptano. No obstante, metil mercaptano tiene una solubilidad muy baja en una solucion acuosa neutra, y es volatil y, de este modo, se evapora rapidamente de la solucion. Por tanto, si se desarrolla un procedimiento capaz de mejorar la reactividad de metil mercaptano, la cantidad maxima posible de metil mercaptano puede reaccionar antes de la evaporacion de metil mercaptano, para mejorar el rendimiento de produccion de metionina. Por consiguiente, los inventores pretendieron desarrollar la reactividad de metil mercaptano mediante la adicion de otro material a la solucion de reaccion que contema metil mercaptano. Como resultado de ello, encontraron que cuando se mezcla sulfuro de dimetilo (DMS) como otro material con metil
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mercaptano para inducir la reaccion, se puede aumentar la tasa de conversion.
En el Ejemplo espedfico de la presente invencion, la reaccion de conversion no ocurre cuando se usa sulfuro de dimetilo solo. No obstante, cuando se usa la mezcla de metil mercaptano con sulfuro de dimetilo, aumenta la tasa de conversion, en comparacion con el uso individual de metil mercaptano (vease las Tablas 1 y 4, y la Figura 2). Ademas, la velocidad de reaccion fue mas elevada que el uso sencillo de metil mercaptano, de acuerdo con la tasa de disminucion de pH por parte de acido acetico, que es un sub-producto producido mediante mezcla de sulfuro de dimetilo (vease la Figura 1). Ademas, cuando se llevo a cabo un suministro continuo de la mezcla (vease la Tabla 2) o un cultivo a gran escala (vease la Tabla 3), tambien mejoraron las tasas de conversion, en comparacion con el uso individual de metil mercaptano. Por consiguiente, el procedimiento de la presente invencion puede usarse eficazmente para mejorar la tasa de conversion de L-metionina a partir de O-acetil homoserina y O-succinil homoserina.
La reaccion de conversion de metionina a partir del precursor de metionina usando enzimas que tienen actividad de conversion en metionina es como se muestra en los siguientes Esquemas de Reaccion.
Metil mercaptano (CH3SH) + O-succinil-L-homoserina ^ Succinato + L-metionina
Metil mercaptano (CH3SH) + O-acetil-L-homoserina ^ Acetato + L-metionina
En los esquemas de reaccion anteriores, el residuo de CH3S- de metil mercaptano esta sustituido con el residuo de acetato o succinato de O-succinil homoserina o O-acetil-homoserina para producir metionina.
Tras la reaccion, se puede anadir metil mercaptano (CH3SH) en una diversidad de formas. Preferentemente, se puede anadir metil mercaptano en forma de gas de metil mercaptano o tambien se puede usar una solucion de metil mercaptano de sodio como tipo lfquido, debido a que la solucion de metil mercaptano de sodio y el gas de metil mercaptano muestran las mismas propiedades de reaccion en la solucion de reaccion acuosa. Por tanto, se puede usar directamente metil mercaptano, o en forma de solucion de metil mercaptano de sodio por medio de solubilizacion en la solucion de hidroxido de sodio. No obstante, dado que mercaptano de metilo existe como gas a temperatura ambiente, es mas preferible usar una solucion de metil mercaptano de sodio preparado por medio de solubilizacion de metil mercaptano en una solucion de hidroxido de sodio.
En la presente invencion, la enzima que tiene actividad de conversion en metionina puede incluir una o mas seleccionadas entre el grupo que consiste en cistationina gamma sintasa, O-succinil homoserina sulfihidrilasa y O- acetil homoserina sulfihidrilasa.
En la reaccion anterior, las enzimas que tienen una actividad de conversion en metionina usadas en la produccion de metionina pueden ser las procedentes de una cepa de microorganismo que pertenece a Escherichia sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Corynebacterium sp., Saccharomyces sp., Chromobacterium sp. Nocardia sp., Bradyrhizobium sp., Hyphomonas sp., Methylococcus sp., Methylobacillus sp., Nitrosomas sp., Kleisella sp., Bacillus sp., Shigella sp., Colwellia sp., Salmonella sp., levadura y hongos.
En la reaccion de conversion anterior, cuando se usa O-succinil homoserina como sustrato, la enzima puede incluir uno o mas seleccionados entre el grupo que consiste en cistationina gamma sintasa, O-succinil homoserina sulfihidrilasa y O-actil homoserina sulfihidrilasa, que proceden preferentemente de cepas de microorganismos que pertenecen a Psedomonas sp., Nocardia sp. y Chromobacterium sp., y mas preferentemente procedente de cepas de microorganismos que pertenecen a Pseudomonas aurogenosa, Nocardia Farcinica, Pseudomonas putida y Chromobacterium Violaceum.
En la reaccion de conversion anterior, cuando se usa O-acetil homoserina como sustrato, la enzima puede incluir un o mas seleccionados entre el grupo que consiste en cistationina gamma sintasa, O-succinil homoserina sulfihidrilasa y O-acetil homoserina sulfihidrilasa, que preferentemente proceden de cepas de microorganismos que pertenecen a Leptospira sp., Corynebacterium sp. e Hyphomonas sp., y mas preferentemente proceden de cepas de microorganismos que pertenecen a Leptospira meyeri, Pseudomonas aurogenosa, Hyphomonas Neptunium y Corynebacterium Violaceum.
En la realizacion espedfica de la presente invencion, se produjo O-acetil homoserina u O-succinil homoserina que se usa como sustrato en la reaccion de conversion para la produccion de L-metionina mediante fermentacion de la cepa de microorganismos preparada de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2008/013432, y el sustrato, O-acetil homoserina y O-succinil homoserina se purificaron a partir de la solucion fermentada por medio de precipitacion de metanol.
Ademas, las enzimas usadas en la reaccion de conversion para la produccion de L-metionina se obtuvieron a partir de los genes de O-succinil homoserina sulfihidrilasa procedente se Chromobacterium violaceum y O-acetil homoserina sulfihidrilasa procedente de Hyphomonas Neptunium, en las que las cepas que contienen genes se fermentaron, recuperaron y despues interrumpieron de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2008/013432.
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La solucion de la reaccion de conversion se preparo por medio de mezcla de O-acetil homoserina o O-succinil homoserina, que fue el sustrato recuperado por medio del procedimiento anterior, junto con la enzima que tiene una actividad de conversion en metionina.
El otro sustrato, metil mercaptano se mezclo con sulfuro de dimetilo en una relacion apropiada, y se anadio a la solucion de reaccion de conversion, y las tasas de conversion de metionina a partir de O-acetil homoserina u O- succinil homoserina se compararon en cada caso. Los resultados mostraron que una relacion de mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo fue optima cuando la relacion de metil mercaptano:sulfuro de dimetilo fue de 1,0:0,5 (mol:mol) a 1:1 (mol:mol), preferentemente de 1:0,20 (mol:mol) a 1:1 (mol:mol) y mas preferentemente de 1:0,25 (mol:mol) a 1:0,5 (mol:mol). Al mismo tiempo, se usa preferentemente sulfuro de dimetilo en una relacion de un 5 % a un 25 %, y mas preferentemente de un 20 % a un 25 %, basandose en la concentracion molar de metil mercaptano.
La L-metionina preparada mediante el procedimiento divulgado puede estar en forma de polvo seco o en forma lfquida disuelta en una solucion acuosa, que se purifica por medio de un procedimiento de purificacion.
El procedimiento de conversion del precursor de L-metionina en L-metionina usando la mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo de acuerdo con la presente invencion es capaz de producir L-metionina con un rendimiento mas elevado que los procedimientos convencionales, y de este modo la metionina producida se puede aplicar a diversos campos incluyendo alimentacion animal, aditivos alimentarios, medicinas y otras materias primas para productos medicinales.
A continuacion, se describen las constituciones y efectos de la presente invencion con mas detalle con referencia a los Ejemplos. No obstante, estos Ejemplos son con fines unicamente ilustrativos y no se pretende que la invencion esta limitada a estos Ejemplos.
Ejemplo 1: Comparacion de la Tasa de Conversion de Metionina de O-Acetil Homoserina de Acuerdo con la Relacion de Mezcla de Metil Mercaptano y Sulfuro de Dimetilo
Tras la reaccion de conversion, se mezclo sulfuro de dimetilo con una solucion de metil mercaptano a una relacion apropiada, y se anadio la mezcla a una solucion de reaccion de conversion para examinar la tasa de conversion de metionina a partir de O-acetil homoserina.
Metil mercaptano existe como un gas a temperatura ambiente, y puede existir en una forma de solucion de metil mercaptano de sodio (metil mercaptano de sodio, CHaS-Na, 2,14 M, 15%, Tokyo Chemical Industry, Japon) mediante la adicion a una solucion de hidroxido de sodio. En el presente Ejemplo, se uso una solucion de metil mercaptano de sodio de 2,14 M para llevar a cabo el experimento. A continuacion, la solucion de metil mercaptano de sodio de 2,14 M se designa como una solucion de metil mercaptano. La solucion de metil mercaptano y la solucion de disulfuro de dimetilo (13,38 M, 99%, Arkema, Francia) se mezclaron a una relacion molar apropiada (mol:mol) y se agito para preparar una solucion mezclada.
Se preparo la solucion de reaccion de conversion mediante adicion de 50 pl de solucion de enzima de conversion y 5'-fosfato de piridoxal 0,1 mM (Sigma, USA) como cofactor a 1 ml de solucion de O-acetil homoserina (500 mM). Se preparo la solucion de O-acetil homoserina mediante una solucion de O-acetil homoserina purificada a partir de un ifquido fermentado en una solucion de tampon de fosfato (pH 7,5).
Se uso una cepa de CJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL preparada mediante el procedimiento divulgado en el documento WO 2008/013432 como cepa de fermentacion. La cepa de CJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL se inoculo en un fermentador de 5 l, y se llevo a cabo el cultivo por medio de fermentacion por lotes durante 50-100 horas. Se purifico O-acetil homoserina a partir del lfquido fermentado mediante precipitacion de metanol. La enzima de conversion se obtuvo a partir de la cepa de E. coli W3110 transformada con pCJ-MetZ-CL procedente de Hyphomonas Neptunium, en la que se fermento la cepa, y despues se recupero y se interrumpio de acuerdo con el procedimiento divulgado en el documento WO 2008/013432. La mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo se anadio a la solucion de reaccion de conversion preparada para iniciar la reaccion de enzima. En este sentido, la cantidad anadida a la mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo se ajusto hasta que la cantidad final de metil mercaptano se hizo de 0,04 mM. Se llevo a cabo la reaccion a una temperatura de 33 °C y 800 rpm durante 10 minutos bajo agitacion. Para la conclusion de la reaccion, se anadio una solucion de HCl 0,2 N para terminar la reaccion. Se analizo la concentracion de la metionina de producto final por medio de HPLC. Se llevo a cabo el analisis en las condiciones divulgadas en el documento WO 2008/013432.
Se calculo la tasa de conversion (%) de metionina a partir de O-acetil homoserina partiendo de un porcentaje (%) del numero de moles de la metionina producidos con respecto al numero de moles del sustrato (mol/l) usados en la reaccion. Cuando se produjo 1 mol de metionina a partir de 1 mol de O-acetil homoserina y metil mercaptano, la tasa de conversion (%) fue de un 100 %. Los resultados de analisis se muestran en la siguiente Tabla 1.
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[Tabla 1]
- Comparacion de las tasas de conversion de O-acetil homoserina entre diferentes relaciones de mezcla de solucion de metil mercaptano (SMM) y sulfuro de dimetilo (DMS)
- Relacion molar
- Cantidad de produccion de Met [met-g]/[10 min] Tasa de conversion (%) Actividad relativa (%)
- SMM
- DMS
- 1
- 0 4,44 74,5 100
- 1
- 0,05 4,52 75,7 102
- 1
- 0,10 4,62 77,6 104
- 1
- 0,20 5,07 85,1 114
- 1
- 0,25 5,95 100 134
- 1
- 0,35 5,60 94,0 126
- 1
- 0,70 5,70 95,6 128
- 1
- 1,00 5,88 98,7 132
Como se muestra en la Tabla 1, cuando se anadio una mezcla de solucion de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo a una relacion de 1:0,25 (mol:mol), aumento la produccion de metionina hasta un 34 %, en comparacion con el uso individual de metil mercaptano. Cuando la relacion de mezcla de solucion de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo aumento mas de 1:0,25, la actividad no aumento mas, sino que se mantuvo en un nivel elevado.
Como grupo de control, cuando solo se anadio sulfuro de dimetilo a la solucion de reaccion de conversion en una cantidad identica a la presente en la mezcla 1:1 de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo, no se observo la produccion de metionina, lo que indica que el uso individual de sulfuro de dimetilo no puede producir metionina. Por tanto, se sugiere que sulfuro de dimetilo se mezcle con metil mercaptano para aumentar la reactividad de metil mercaptano, mejorando de este modo la produccion de metionina.
Ejemplo 2: Reaccion de Conversion de Metionina Usando una Mezcla de Metil Mercaptano y Sulfuro de Dimetilo
Para examinar si la produccion mejorada de metionina tiene lugar de forma continua en las mismas condiciones del Ejemplo 1, se examino la produccion de metionina al tiempo que la mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo se anadio de forma continua de acuerdo con el tiempo. La reaccion se mantuvo usando la misma solucion de reaccion de conversion durante 30 minutos al tiempo que se anadieron una solucion de metil mercaptano y la mezcla con sulfuro de dimetilo cada 10 minutos. Trascurridos 30 minutos, se termino la reaccion, y la cantidad de metionina producida se midio por medio de HPLC. Se llevo a cabo la reaccion en la condicion de relacion de mezcla de solucion de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo de 1:0,25 (mol:mol), a la cual se observo la produccion mas elevada de metionina en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 2.
[Tabla 2]
- Comparacion de las tasas de conversion de acuerdo con el suministro continuo de solucion de metil mercaptano o mezcla de sulfuro de dimetilo una escala de un tubo de 1,5 ml
- Solucion de metil mercaptano (100 %) Mezcla de metil mercaptano: sulfuro de dimetilo (mezcla 1:0,25)
- Metionina [g/l]
- 12,84 14,69
- Tasa de conversion [%]
- 66,88 76,51
- Actividad relativa [%]
- 100,00 114,41
Como se muestra en la Tabla 2, la tasa de conversion aumento hasta aproximadamente un 15% trascurridos 30 minutos, en comparacion con el uso individual de metil mercaptano.
Ejemplo 3: Reaccion de Conversion Enzimatica de O-Acetil Homoserina en un Reactor Discontinuo de 1 l
Para examinar la eficiencia de la reaccion de conversion en un reactor de gran escala, se llevo a cabo la reaccion usando 500 ml de O-acetil homoserina 700 mM en un reactor discontinuo de 1 l. Se llevo a cabo la reaccion de conversion enzimatica al tiempo que se suministraba de forma continua la solucion de metil mercaptano o la mezcla 5 de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo de 1:0,25 (mol:mol) a un caudal de 3,0 ml/min durante 60 minutos. La cantidad de metil mercaptano presente en cada solucion se ajusto para que fuese identica. La temperatura de reaccion fue de 33 °C y se llevo a cabo la agitacion a 700 rpm. Se preparo lfquido enzimatico de conversion de la misma forma que en el Ejemplo anterior, y se anadieron 10 ml del mismo. Se anadio 5'-fosfato de piridoxal 0,1 mM (Sigma, USA) como cofactor. Trascurridas aproximadamente 3 horas, se midio la cantidad de metionina producida 10 por medio de HPLC. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 3.
[Tabla 3]
- Comparacion de las tasas de conversion de acuerdo con el suministro de metil mercaptano o mezcla de sulfuro de dimetilo en un reactor discontinuo de 1 l.
- SMM (100 %) SMM 1: DMS 0,25 M (mol:mol)
- Metionina [g/l]
- 65,6 75,5
- Tasa de conversion [%]
- 85 100
- Actividad relativa [%]
- 100 118
Como se muestra en la Tabla 3, cuando se anadio la mezcla de solucion de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo con una relacion de 1:0,25 (mol:mol), aumento la tasa de conversion hasta aproximadamente un 18%, en 15 comparacion con el uso individual de metil mercaptano.
Tras la reaccion de conversion de O-acetil homoserina, tambien se produjo acetato como producto ademas de metionina, y de este modo tuvo lugar una disminucion de pH. Tras el inicio de la reaccion, al tiempo que se suministraron la solucion de metil mercaptano y la mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo, el pH aumento debido a que se suministro metil mercaptano en forma lfquida por medio de solucion en NaOH. No obstante, tras 20 completar el suministro, el pH disminuyo. Cuando se produjo acido acetico (en caso de usar O-acetil homoserina como sustrato) o acido succmico (en caso de usar O-succinil homoserina como sustrato) como sub-productos de la reaccion de conversion, la velocidad de reaccion de la enzima puede venir reflejada por la velocidad de disminucion de pH. Como se muestra en la Figura 1, cuando se uso la mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo de 1:0,25 (mol:mol), se encontro que la velocidad de reaccion de la enzima de acuerdo con la velocidad de disminucion 25 de pH era relativamente elevada, en comparacion con el uso individual de metil mercaptano.
Ejemplo 4: Reaccion de Conversion Enzimatica de O-Succinil Homoserina de Acuerdo con la Cantidad de Adicion de Sulfuro de Dimetilo con respecto a Metil Mercaptano
Tambien se uso O-succinil homoserina como sustrato para la reaccion de conversion enzimatica de metionina para llevar a cabo la reaccion de produccion de metionina y acido succmico.
30 Se anadieron diferentes cantidades de sulfuro de dimetilo a la solucion de metil mercaptano en una escala de tubo de 1,5 ml como en el Ejemplo 1, y despues se comparo la tasa de conversion de metionina a partir de O-succinil homoserina. Se anadio sulfuro de dimetilo en una relacion de metil mercaptano con respecto a sulfuro de dimetilo de 1:0, 1:0,25, 1:0,35 y 1:1 (mol:mol). Se preparo el lfquido de reaccion de conversion mediante adicion de 50 pl de lfquido de enzima de conversion y 5'-fosfato de piridoxal 0,1 mM como cofactor a 1 ml de solucion de O-succinil 35 homoserina (500 mM). Se preparo la solucion de O-succinil homoserina mediante solucion de O-succinil homoserina purificada a partir de un lfquido fermentado en una solucion de tampon de fosfato (pH 7,5). Se inoculo una cepa de CJM-BTJ/pCJ-metA-CL preparada por medio del procedimiento divulgado en el documento WO 2008/013432 en un fermentador de 5 l, y se llevo a cabo el cultivo por medio de fermentacion por lotes de alimentacion durante 50-100 horas. Se purifico O-succinil homoserina a partir del lfquido fermentado por medio de precipitacion de metanol. Se 40 obtuvo la enzima de conversion a partir de cepa de E. coli W3110 transformada con pCJ-MetZ-Cl procedente de Chromobacterium violaceum, en la que se fermento la cepa, y despues se recupero y se interrumpio de acuerdo con el procedimiento divulgado en el documento WO 2008/013432. Se anadieron 0,05 ml de enzima. Se anadieron 0,02 ml de cada mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo a diferentes relaciones a la solucion de reaccion de conversion preparada para iniciar la reaccion de enzima. Se ajusto cada solucion para que tuviera la cantidad 45 identica de metil mercaptano. Se llevo a cabo la reaccion a una temperatura de 33 °C y 800 rpm durante 10 minutos bajo agitacion. Para la terminacion de la reaccion, se anadio una solucion de HCl 0,2 N para terminar la reaccion. Se analizo la concentracion de metionina de producto final por medio de HPLC. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
[Tabla 4]
- Comparacion de las tasas de conversion de O-succinil homoserina de acuerdo con la cantidad anadida
- Relacion de mezcla de metil mercaptano: sulfuro de dimetilo (mol: mol)
- 1:0 1:0,25 1:0,35 1:1
- Metionina [g/l]
- 4,3 4,6 4,7 4,5
- Tasa de conversion [%]
- 86 94 95 92
- Actividad relativa [%]
- 100 109 110 107
Como se muestra en la Tabla 4, cuando la mezcla de solucion de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo se anadio con una relacion de 1:0,35 (mol:mol), la actividad aumento hasta aproximadamente un 10 %, en comparacion con el 5 uso individual de metil mercaptano. Cuando la mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo se anadio con una relacion de 1:0,25 y 1:1 (mol:mol), la actividad enzimatica no aumento en gran medida, en comparacion con la relacion de mezcla de 1:0,35 (mol:mol), sino que cada una de las actividades enzimaticas aumento en aproximadamente un 9 % y 7 %, en comparacion con el uso individual de metil mercaptano.
Aplicabilidad Industrial
10 Como se ha descrito en los Ejemplos anteriores, la presente invencion proporciona un procedimiento para aumentar la tasa de conversion de metionina, aplicandose a diversos campos incluyendo alimentacion animal, aditivos alimentarios y medicinas.
Claims (8)
- 510152025REIVINDICACIONES1. Un procedimiento de produccion de L-metionina, que comprende:1) preparar una solucion de reaccion que incluye (i) un precursor de metionina que es una O-acetil homoserina o una O-succinil homoserina, (ii) una enzima de conversion que tiene la actividad de convertir el precursor de metionina en metionina y (iii) una mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo; y2) llevar a cabo una reaccion de conversion enzimatica al tiempo que se agita la solucion de reaccion;en el que la enzima de conversion es una o mas seleccionada entre el grupo que consiste en cistationina gamma sintasa, O-succinil homoserina sulfihidrilasa y O-acetil homoserina sulfihidrilasa.
- 2. Un procedimiento de produccion de L-metionina de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el metil mercaptano es un gas de metil mercaptano o una solucion de metil mercaptano de sodio.
- 3. Un procedimiento de produccion de L-metionina de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo tiene una relacion molar de metil mercaptano : sulfuro de dimetilo de 1:0,05 a 1:1.
- 4. Un procedimiento de produccion de L-metionina de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo tiene una relacion molar de metil mercaptano : sulfuro de dimetilo de 1:0,20 a 1:1.
- 5. Un procedimiento de produccion de L-metionina de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que la mezcla de metil mercaptano y sulfuro de dimetilo tiene una relacion molar de metil mercaptano : sulfuro de dimetilo de 1:0,25 a 1:0,5.
- 6. Un procedimiento de produccion de L-metionina de acuerdo con la reivindicacion 1, que ademas comprende terminar la reaccion de conversion enzimatica.
- 7. Un procedimiento de produccion de L-metionina de acuerdo con la reivindicacion 1, que ademas comprender purificar la L-metionina.
- 8. Un procedimiento de produccion de L-metionina de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que se produce O-acetil homoserina u O-succinil homoserina en una etapa anterior por medio de fermentacion de glucosa usando un microorganismo y en el que la etapa de purificacion de metionina comprende:1) separar el microorganismo de la solucion de reaccion de conversion enzimatica;2) decolorar y filtrar la solucion de reaccion de la cual se ha retirado el microorganismo; y3) cristalizar a partir del filtrado.
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