ES2617508T3

ES2617508T3 - Método para determinar actividad de arilsulfatasa

Info

Publication number: ES2617508T3
Application number: ES12758277.3T
Authority: ES
Inventors: Kazuma Shiota; Hirofumi HORIGUCHI; Ai IYOTANI; Jun Yoshikawa; Tomoko Sato
Original assignee: Godo Shusei KK
Current assignee: Godo Shusei KK
Priority date: 2011-03-14
Filing date: 2012-03-13
Publication date: 2017-06-19
Anticipated expiration: 2032-03-13
Also published as: JPWO2012124668A1; EP2687598A1; DK2687598T3; EP2687598A4; EP2687598B1; US20190040446A1; US20140087404A1; US20170029865A1; WO2012124668A1; JP6013321B2; JP2016208998A

Abstract

Un método para determinar la actividad de arilsulfatasa en un sistema acuoso caracterizado porque la arilsulfatasa obtenida a partir de levadura se somete a reacción con un sustrato, del que se libera un fluoróforo al experimentar la acción de la arilsulfatasa, en un sistema de reacción acuoso que tiene alta fuerza iónica al que se ha añadido una sal inorgánica, en el que la concentración de la sal inorgánica en el sistema de reacción acuoso varía de 50 a 500 mM.

Description

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En la producción de la preparación de lactasa según la presente invención, se usa una cepa diploide de levadura que tiene un gen de lactasa, en cuya cepa la expresión de la proteína arilsulfatasa está restringida y mediante cuya cepa se produce la proteína lactasa. Además, la cepa diploide de levadura que se usa en la presente invención es una que produce proteína lactasa con una alta actividad, que puede proporcionar una preparación de lactasa de

4.000 NLU/g o más tal como está o concentrándola. La cepa diploide de levadura es, por ejemplo, un mutante que puede obtenerse tratando un microorganismo para mutarlo. Dicho mutante puede obtenerse, por ejemplo, mediante un método en el que una cepa diploide de levadura que produce la proteína lactasa con alta actividad se expone a irradiación ultravioleta o a un mutágeno químico para llevar a cabo la mutación, disrumpiendo o delecionando así los genes de la arilsulfatasa o los genes que regulan la expresión de la proteína arilsulfatasa aproximadamente ambos genes del diploide, o un método en el que los genes de la arilsulfatasa o los genes que regulan la expresión de la proteína arilsulfatasa se delecionan por procedimientos de ingeniería genética aproximadamente ambos genes del diploide. Para saber si puede obtenerse un mutante deseado, debe determinarse la actividad arilsulfatasa de un fluido de cultivo en el que se ha cultivado la levadura mutada por el método (método de fluorescencia) para determinar la actividad de arilsulfatasa según la presente invención.

La inducción de mutación por ultravioleta se lleva a cabo, por ejemplo, irradiando ultravioleta a una suspensión de una levadura diploide. La mutagénesis química se lleva a cabo, por ejemplo, añadiendo un mutágeno químico a una suspensión de una levadura diploide. Los ejemplos del mutágeno químico incluyen 5-bromouracilo, 2-aminopurina, ácido nitroso, hiroxilamina, acriflavina, compuestos de metanosulfonato, nitrosoguanidina y semejantes.

Para delecionar los genes de arilsulfatasa o los genes que regulan la expresión de una proteína arilsulfatasa por procedimientos de ingeniería genética, deben aplicarse procedimientos de ingeniería genética comunes, por ejemplo, la obtención de un fragmento génico que tiene una secuencia que es homóloga a la secuencia del gen que se pretende delecionar, subclonación del fragmento en un vector para construir un nuevo vector para disrumpir el gen que se pretende delecionar, y transformación de una cepa diploide de levadura usando el nuevo vector.

En la producción de la preparación de lactasa según la presente invención, también puede usarse un microorganismo recombinante genético que produce proteína lactasa con alta actividad, en el que un gen de lactasa de levadura se ha transformado de manera que la proteína lactasa se expresa y la expresión de la proteína arilsulfatasa está restringida. Como se ha descrito anteriormente, la "expresión de la proteína arilsulfatasa está restringida" significa que la proteína arilsulfatasa no se produce o su cantidad de producción está reducida, debido, por ejemplo, a que los genes relacionados con la producción de la proteína arilsulfatasa están restringidos, específicamente debido a que no hay gen de arilsulfatasa y/o no hay gen que regula la expresión de la proteína arilsulfatasa, o, debido a que un gen de arilsulfatasa (gen estructural) se ha disrumpido o un gen que regula la expresión que estimula el gen de la arilsulfatasa para expresar proteína arilsulfatasa se ha disrumpido.

El microorganismo recombinante genético en el que se ha transformado un gen de lactasa de levadura y la expresión de la proteína arilsulfatasa está restringida puede producirse por un método conocido. Por ejemplo, en un plásmido que es tolerante a la medicina A, se inserta un gen de lactasa, con un gen para regular la expresión del gen de lactasa si es necesario. Mediante el uso del plásmido para expresar lactasa así preparado, se transforma un microorganismo como un huésped. El microorganismo que se ha transformado se cultiva en un medio que comprende la medicina A, y se seleccionan las colonias que aparecen.

Como el huésped para obtener el microorganismo recombinante genético en el que se ha transformado el gen de lactasa de levadura y la expresión de la proteína arilsulfatasa está restringida, puede usarse Escherichia coli, Bacillus subtilis, y semejantes.

Como el huésped para obtener el microorganismo recombinante genético en el que se ha transformado el gen de lactasa de levadura y la expresión de la proteína arilsulfatasa está restringida, es preferible usar un huésped que intrínsecamente no tiene gen de arilsulfatasa ni un gen para regular la expresión de la proteína arilsulfatasa, u otro huésped en el que se ha disrumpido o delecionado el gen de arilsulfatasa o un gen para regular la expresión de la proteína arilsulfatasa.

La lactasa para la preparación de lactasa se produce cultivando una cepa diploide de levadura que tiene un gen de lactasa en la que la expresión de la proteína arilsulfatasa está restringida o un microorganismo recombinante genético en el que se ha transformado un gen de lactasa de levadura y la expresión de la proteína arilsulfatasa está restringida, en el que la cepa diploide de levadura y el microorganismo producen proteína lactasa que tiene una alta actividad; recogiendo las células de levadura o microorgánicas sin destruir sus paredes celulares, recoger el fluido de cultivo con células de levadura o microorgánicas después de la destrucción de sus paredes celulares, o recogiendo el fluido de cultivo sin destruir las paredes celulares; y usando como un material bruto las células de levadura o microorgánicas recogidas y/o el fluido de cultivo, sin ninguna etapa para eliminar la arilsulfatasa. El concepto de "fluido de cultivo" también incluye un sobrenadante de cultivo.

Para cultivar microorganismos tales como levaduras, puede usarse un incubador tal como un matraz, un frasco, y un tanque. Como las condiciones de cultivo, se seleccionan temperatura, pH, un número de agitación, y semejantes, que son adecuadas para la producción de una enzima por el microorganismo.

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Como se muestra en la Tabla 1, los valores determinados de actividad arilsulfatasa se incrementaron por la adición de cloruro de potasio. En otras palabras, por la adición de cloruro de potasio, se pudo conseguir un ensayo con mayor sensibilidad.

Ejemplo 2 Desarrollo de un método para determinar la actividad arilsulfatasa (Parte 2)

(1) Se sometió GODO-YNL2 (preparación de lactasa líquida, producida por Godo Shusei Co. Ltd.) a una dilución de 100 veces con tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 6,5) que contenía cloruro de sodio 0, 125, 250, 500, ó

1.000 mM. A 0,5 mL de cada disolución, se añadieron 0,5 mL de disolución acuosa de sulfato potásico de 4metilumbeliferona 2 mM y la disolución se dejó reaccionar a 37 grados Celsius durante 3 horas. La reacción se paró añadiendo a la disolución 1,0 mL de disolución acuosa de hidróxido de sodio 0,1 N y la intensidad de la fluorescencia se determinó a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de fluorescencia de 450 nm. Los valores relativos se muestran en la Tabla 2, en la que se especifica el caso en el que no hay cloruro de sodio como 100%.

(2): La reacción y determinación de la fluorescencia se llevaron a cabo de la misma manera que la descrita en el (1) anteriormente, excepto que se usó tampón fosfato de sodio 100 mM (pH 6,5) como el diluyente para la enzima en lugar de tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 6,5). Los resultados se muestran en la Tabla 2.

(3): La reacción y determinación de la fluorescencia se llevaron a cabo de la misma manera que la descrita en el (1) anteriormente, excepto que se añadió cloruro de potasio al diluyente para la enzima en lugar de cloruro de sodio. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

(4): La reacción y determinación de la fluorescencia se llevaron a cabo de la misma manera que la descrita en el (1) anteriormente, excepto que se usó tampón fosfato de sodio 100 mM (pH 6,5) en lugar de tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 6,5) como el diluyente para la enzima, y que se añadió cloruro de potasio al diluyente para la enzima en lugar de cloruro de sodio. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

Incremento del valor determinado de actividad arilsulfatasa por combinación de sal inorgánica y tampón

Tipo de tampón concentración en: y el Concentración de sal inorgánica en el Valor relativo (%)

sistema de reacción: sistema de reacción (mM) 0 62,5 125 250 500

Tipo de sal inorgánica

Tampón fosfato potasio 50 mM: de Cloruro de sodio 100 230 310 440 600

Tampón fosfato sodio 50 mM: de Cloruro de sodio 100 200 310 410 550

Tampón fosfato potasio 50 mM: de Cloruro de potasio 100 230 330 460 640

Tampón fosfato sodio 50 mM: de Cloruro de potasio 100 220 340 470 600

Como se muestra en la Tabla 2, los valores determinados de actividad arilsulfatasa se incrementaron en una relación aproximadamente similar cuando se añadió cloruro de sodio o cloruro de potasio como una sal inorgánica, y la reacción y determinación se llevaron a cabo en tampón fosfato de potasio o fosfato de sodio.

Ejemplo 3 Desarrollo de un método para determinar la actividad arilsulfatasa (Parte 3)

(1) Se sometió GODO-YNL2 (preparación de lactasa líquida, producida por Godo Shusei Co. Ltd.) a una dilución de 100 veces con tampón fosfato de potasio 100 mM, 125 mM, 250 mM, 500 mM, ó 1.000 mM (pH 6,5). A 0,5 mL de cada disolución, se añadieron 0,5 mL de disolución acuosa de sulfato potásico de 4-metilumbeliferona 2 mM y la disolución se dejó reaccionar a 37 grados Celsius durante 3 horas. A la disolución, se añadió 1,0 mL de disolución acuosa de hidróxido de sodio 0,1 N (para tampones fosfato de potasio 100 mM, 125 mM, y 250 mM) o disolución acuosa de hidrocloruro de sodio 1,0 N (para tampones fosfato de potasio 500 mM y 1.000 mM) para parar la reacción, y la intensidad de la fluorescencia se determinó a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de fluorescencia de 450 nm. Los valores relativos se muestran en la Tabla 3, en la que se especifica el caso en el que se usó tampón fosfato de potasio 100 mM como 100%.

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Preparación de lactasa purificada

A 50 kg de GODO-YNL2 (preparación de lactasa líquida, producida por Godo Shusei Co. Ltd.), se añadió agua para desalar usando una membrana de ultrafiltración (membrana ACP, producida por Asahi Kasei Corp.) hasta que la conductividad fue 3mSv o menor. La cantidad total se ajustó a 125 L mediante la adición de agua. Después, se adsorbió en una resina de intercambio iónico (DEAE TOYOPEARL 650M, 40cmφ, 50 L, producida por Tosoh Corp.) pre-equilibrada con tampón fosfato de potasio 10 mM (pH 7). La resina se lavó con 40 L de tampón fosfato de potasio 10 mM (pH 7) que contenía cloruro de sodio 50 mM, y después la lactasa se eluyó con 200 L de tampón fosfato de potasio 10 mM (pH 7) que contenía cloruro de sodio 100 mM. Después de la elución, el eluato se dividió en fracciones de 20 L. Se determinaron la actividad lactasa (por el método FCC IV; Food Chemicals Codex 4ª Edición, efectiva el 1 de julio, 1996, Committee on Food Chemicals Codex, p. 801-802) y la actividad arilsulfatasa (por el método de fluorescencia; se describirá más adelante con detalle) de cada fracción, y las fracciones con arilsulfatasa reducida se recogieron, se mezclaron, y se concentraron usando una membrana de ultrafiltración (membrana ACP, producida por Asahi Kasei Corp.) para obtener una disolución de lactasa concentrada. A esta disolución concentrada, se añadió glicerol para que fuera 50% (p/v). Así, se obtuvo una preparación de lactasa purificada.

Se determinó la actividad arilsulfatasa de GODO-YNL2 (preparación de lactasa líquida, producida por Godo Shusei Co. Ltd.) y de la preparación de lactasa purificada preparada como se ha descrito anteriormente, ambas de las cuales tenían actividad lactasa por el método FCC IV de 5.000 a 5.500 NLU/g (el método de fluorescencia; se describirá más adelante con detalle). Se determinó que la actividad arilsulfatasa de la preparación de lactasa purificada era 1/840 comparada con la de la pre-purificación (véase la Tabla 6 más adelante).

Preparación de preparaciones enzimáticas con varias relaciones de contaminación de arilsulfatasa

La preparación de lactasa purificada preparada como se ha descrito anteriormente y GODO-YNL2 (preparación de lactasa líquida, producida por Godo Shusei Co. Ltd.) se mezclaron apropiadamente para preparar las preparaciones de lactasa con varias relaciones de contaminación de arilsulfatasa, y se determinaron la actividad lactasa (por el método FCC IV) y la actividad arilsulfatasa (por los métodos colorimétrico y de fluorescencia).

Determinación de la actividad arilsulfatasa por el método colorimétrico

A 0,5 mL de preparación de lactasa, se añadieron 0,5 mL de tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 6,5) que contenía sulfato de p-nitrofenilo 20 mM y la disolución se dejó reaccionar a 37 grados Celsius durante 3 horas. A esta disolución, se añadieron 1,5 mL de disolución acuosa de hidróxido de sodio 1,5 N para parar la reacción, y la absorbancia se determinó a 410 nm.

Separadamente, se prepararon disoluciones acuosas que contenían p-nitrofenol a una concentración de 0 a 0,5 mM. A 0,5 mL de cada disolución, se añadieron 0,5 mL de tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 6,5). Además, se añadieron 1,5 mL de disolución acuosa de hidróxido de sodio 1,5 N para obtener muestras para la determinación. La absorbancia a 410 nm se determinó para preparar una curva de calibración.

A partir de la curva de calibración, se determinó la concentración de p-nitrofenol contenida en 1 mL de la disolución de reacción, y se dividió por 3 (debido a que el tiempo de la reacción era 3 horas), para calcular la concentración de p-nitrofenol para el periodo de tiempo de reacción de 1 hora. Después, a partir de esta concentración, se calculó la concentración de p-nitrofenol contenida en 1 mL de la disolución de la reacción (unidad: nmol), y se multiplicó por 2 (para convertir el valor en por 1 g, debido a que la cantidad de preparación de lactasa usada era 0,5 g), para calcular la actividad arilsulfatasa. Una U corresponde a la actividad que produce 1 nmol de p-nitrofenol en 1 hora, y la actividad arilsulfatasa se representa por la unidad "U/g de preparación de enzima".

Determinación de la actividad arilsulfatasa por el método de fluorescencia

La preparación de lactasa se diluyó con tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 6,5) que contenía cloruro de potasio 0,5 M para obtener una disolución al 1% (p/v). A 0,5 mL de esta disolución al 1%, se añadieron 0,5 mL de disolución acuosa de sulfato potásico de 4-metilumbeliferilo 2 mM y la disolución se dejó reaccionar a 37 grados Celsius durante 3 horas. A la disolución, se añadió 1 mL de disolución acuosa de hidróxido de sodio 0,1 N para parar la reacción, y la intensidad de la fluorescencia se determinó a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de fluorescencia de 450 nm.

Separadamente, se prepararon tampones fosfato de potasio 100 mM (pH 6,5) que contenían cloruro de potasio 0,5 M y 4-metilumbeliferona a una concentración de 0 a 4 µM. A 1,0 mL de cada disolución, se añadió 1 mL de disolución acuosa de hidróxido de sodio 0,1 N para obtener muestras para la determinación. La intensidad de la fluorescencia se determinó a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de fluorescencia de 450 nm para preparar una curva de calibración.

A partir de la curva de calibración, se determinó la concentración de 4-metilumbeliferona contenida en 1 mL de la disolución de reacción, y se dividió por 3 (debido a que el periodo de tiempo de la reacción era 3 horas). Después, a partir del volumen de la disolución de la reacción, se calculó la cantidad absoluta de 4-metilumbeliferona producida

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durante la reacción. La cantidad se multiplicó además por 200 (para convertir el valor en por 1 g del espécimen (preparación de lactasa), debido a que la cantidad de preparación de lactasa usada fue 0,5x0,01=0,005 g), y de esta manera se calculó la actividad arilsulfatasa. Una U es una actividad tal que 1 nmol de 4-metilumbeliferona se produce en 1 hora, y la actividad arilsulfatasa se representa por la unidad "U/g de preparación de enzima".

Resultados

Los resultados se muestran en la Tabla 6. Por el método colorimétrico, la determinación no fue posible cuando el contenido de arilsulfatasa disminuyó, mientras por el método de fluorescencia fue posible determinar con exactitud hasta el área de concentración de aproximadamente 1/100 del límite de detección por el método colorimétrico.

Tabla 6

Actividad lactasa y actividad arilsulfatasa de preparaciones de lactasa que contienen arilsulfatasa en varias relaciones de contaminación

Actividad lactasa (NLU/g): Actividad arilsulfatasa (U/g) Actividad arilsulfatasa de esta invención/actividad lactasa (%)

Método colorimétrico convencional: Método de esta invención

GODO-YNL2: 5.400 39 84 1,56

Mezcla de GODO-YNL2 con lactasa: (5.500) 8,7 20 0,36

purificada: (5.400) ND 15 0,28

(5.300): ND 1 0,02

Lactasa purificada: 5.500 ND 0,1 0,002

ND: no detectado

Ejemplo 8 Comparación del método de fluorescencia y el método como se indica en WO07/060247 (Patente japonesa abierta a inspección pública No. 2009-517061) en la determinación de la actividad arilsulfatasa, y examen organoléptico para sabor (Parte 1)

En WO07/060247, se describe que una preparación de lactasa contaminada con 19 unidades (unidades que se definen en WO07/060247) o menos de arilsulfatasa no produce sabor anormal cuando la preparación se añade para descomponer la lactosa después de la esterilización de la leche. Sin embargo, ésta es una observación basada en un examen que se llevó a cabo con el periodo de tiempo de reacción de lactasa limitado de 2 días. Por otra parte, cuando se añade realmente una preparación de lactasa a leche estable en almacenamiento a temperaturas ordinarias (leche UHT), se piensa que la reacción enzimática continuaría durante un plazo mayor de 1 mes o más. Por lo tanto, se prepararon preparaciones de lactasa que contenían arilsulfatasa a varias relaciones de contaminación y se confirmó su sabor después de días predeterminados desde la adición de las preparaciones a la leche.

Preparación de preparaciones de lactasa con varias relaciones de contaminación de arilsulfatasa

Se produjeron preparaciones de lactasa A a E que tenían varias relaciones de contaminación de arilsulfatasa mezclando apropiadamente la preparación de lactasa purificada preparada en el Ejemplo 7 y GODO-YNL2 (preparación de lactasa líquida, producida por Godo Shusei Co. Ltd.) seleccionado que contenía 100 unidades (sobre la base de lo descrito en WO07/060247) de actividad arilsulfatasa.

La actividad arilsulfatasa de cada una de las preparaciones de lactasa A a E así preparadas se determinó por el método descrito en WO07/060247 y el método de fluorescencia mostrado en el Ejemplo 7 anterior. Además, la actividad lactasa se determinó por el método FCC IV. Los resultados se muestran en la Tabla 7. En esta Tabla, la unidad como se describe en WO07/060247 significa ∆DO410x106/hora/NLU.

Tabla 7

Actividad arilsulfatasa en preparaciones de lactasa que contienen arilsulfatasa en varias relaciones de contaminación

Nombre de la preparación de lactasa y actividad lactasa (NLU/g): Actividad arilsulfatasa (unidad) que se determinó por el método descrito en WO07/060247 (Patente japonesa abierta a inspección pública No. 2009-517061) Actividad arilsulfatasa (U/g) que se determinó por el método de la presente invención Actividad arilsulfatasa de esta invención/Actividad lactasa (%)

A (5.500): ND 0,1 0,002

B (5.500): ND 1,0 0,02

C (5.500): 8 27 0,5

D (5.500): 18 59 1,1

E (5.500): 100 320 5,8

5 ND: no detectado

Examen organoléptico de sabor

En referencia al Ejemplo 4 de WO07/060247, cada una de las preparaciones de lactasa A a E se añadió a una leche de vaca disponible comercialmente (una esterilizada con calor; condiciones estériles: 130 grados Celsius, 2 segundos) de manera que el contenido en lactasa se convertiría en 20.000 NLU/L de leche, y se mantuvo a 30

10 grados Celsius. Después de 2 días, 1 mes, y 3 meses de almacenamiento, se llevó a cabo un examen organoléptico para la leche de vaca a la que no se había añadido preparación de lactasa y las leches a las que se habían añadido preparaciones de lactasa.

El examen organoléptico se llevó a cabo como un estudio ciego. Once a trece panelistas olieron y mantuvieron en la boca la leche después del almacenamiento durante un determinado periodo de tiempo para juzgar la presencia o

15 ausencia de sabor anormal. La evaluación se llevó a cabo puntuando 0 puntos (-) para ausencia de sabor anormal, 1 punto (+) que significaba que el panelista era consciente de sabor anormal, ó 2 puntos (++) que significaba que el panelista era fuertemente consciente de sabor anormal. Los resultados se resumen en la Tabla 8.

Tabla 8

Resultados del examen organoléptico de sabor (sabor anormal) de leches de vaca que se trataron con 20 preparaciones de lactasa que contenían arilsulfatasa en varias relaciones de contaminación

Preparaciones de lactasa: Periodo de tiempo de reacción

2 días: 1 mes 3 meses

No añadida: - - -

A: - - -

B: - - -

C: - ++ ++

D: - ++ ++

E: + ++ ++

++: fuertemente consciente +: consciente -: no consciente

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Después de 2 días del periodo de tiempo de reacción por la preparación de lactasa (es decir, periodo de tiempo de almacenamiento de la leche de vaca), sólo la preparación E presentó un sabor anormal aparente. Esto coincidió con la descripción en WO07/060247. Sin embargo, cuando el periodo de tiempo de reacción fue 1 mes o más, las preparaciones C y D también presentaron un sabor anormal notorio. Esto indica que el sabor inusual y sabor anormal no pueden controlarse suficientemente, incluso si la actividad arilsulfatasa es 8 unidades, que es el límite de detección en la unidad descrita en WO07/060247, considerando que las preparaciones de lactasa se usan, por ejemplo, en leche estable en almacenamiento a temperaturas ordinarias (leche UHT).

Por otra parte, las preparaciones A y B no presentaron un sabor anormal notorio para el periodo de tiempo de reacción de 1 y 3 meses. Considerando el uso de la preparación de lactasa en leche estable en almacenamiento a temperaturas ordinarias (leche UHT), es necesario asumir un periodo de tiempo de reacción de 1 mes o más. Por lo tanto, para dicha utilización, resulta claro que es preferible usar la preparación de lactasa A o B (es decir, una que tenga una relación de la actividad arilsulfatasa por el método de la presente invención a la actividad lactasa por el método FCC IV de 0,02% o menos) y que es más preferible usar la preparación de lactasa A. Además, resultó claro que es necesario determinar el valor de la actividad arilsulfatasa que es comparable con el de la preparación de lactasa A o B por el método de fluorescencia como se describe en esta descripción o por un método de análisis que tenga una sensibilidad similar o mayor que el método de fluorescencia anterior.

Ejemplo 9 Obtención de un mutante que tiene una producibilidad reducida de arilsulfatasa

El contenido de un asa de siembra de Kluyveromyces lactis G14-427, que era una cepa diploide, se inoculó en 10 ml de medio YPD (que contenía 1% de extracto de levadura, 1% de glucosa, y 2% de peptona). La suspensión de células obtenida se almacenó a 30 grados Celsius para cultivar las células. Después de llegar a una fase logarítmica, la suspensión se centrifugó y las células se recogieron. Las células recogidas se dispersaron en agua estéril de manera que la absorbancia de la suspensión obtenida se convirtió en 0,5 a 600 nm. Mediante el uso de una lámpara UV, se irradió ultravioleta a la suspensión durante 15 segundos. Las células se recogieron por centrifugación, y las células recogidas se dispersaron en medio YPD mediante mezclado. A partir del medio YPD que comprendía las células, se tomó una dosis óptima del medio YPD y se aplicó en una placa de agar YPD. El cultivo estático de la placa se llevó a cabo a 37 grados Celsius durante 7 días. A partir de una colonia que había crecido, se raspó una pequeña cantidad de células, y las células raspadas se mezclaron con 1 ml de disolución que comprendía Zimoliasa (producida por Seikagaku Bio-business Corporation) en una cantidad de 1 mg/mL. La reacción se llevó a cabo a 30 grados Celsius durante 2 horas para destruir las paredes celulares. Posteriormente, se llevó a cabo una centrifugación y se recogió el sobrenadante.

Se determinaron la actividad lactasa (el método FCC IV) y la actividad arilsulfatasa (por el método de fluorescencia descrito en el Ejemplo 7) del sobrenadante. Se calculó la relación de la actividad arilsulfatasa a la actividad lactasa y se seleccionaron las cepas que presentaron valores pequeños.

Las cepas seleccionadas se sometieron repetidamente a los tratamientos anteriores para mutación y selección. Como resultado, se pudo obtener un mutante (cepa SM1182), cepa en la que un gen de arilsulfatasa entre dos genes de arilsulfatasa que habían existido en la cepa diploide, Kluyveromyces lactis G14-427, se convirtió en disfuncional. El criterio de que "un gen de arilsulfatasa entre dos genes de arilsulfatasa se convirtió en disfuncional " se basó en el hecho siguiente: el sobrenadante del cultivo de la cepa SM1182 presentó una actividad arilsulfatasa de aproximadamente la mitad de la del sobrenadante del cultivo de la cepa madre, cepa G14-427.

Además, el mutante obtenido (cepa SM1182) se usó como una cepa madre y se llevaron a cabo tratamientos para causar mutación. Como resultado, se obtuvo un mutante (cepa SF-81) en el que el otro gen de arilsulfatasa también se había convertido en disfuncional, concretamente, uno que tenía una actividad arilsulfatasa de cero.

Kluyveromyces lactis G14-427 como una cepa madre y dos mutantes que se habían obtenido por los métodos descritos anteriormente se cultivaron respectivamente por agitación en medio YPD (70 mL/matraz) a 26 grados Celsius durante 4 días.

Posteriormente, a cada medio de cultivo se añadió Zimoliasa (producida por Seikagaku Bio-business Corporation) para estar en una concentración de 2 mg/mL. La reacción se llevó a cabo a 30 grados Celsius durante 2 horas para destruir las paredes celulares. Los sobrenadantes se recogieron respectivamente por centrifugación, y se sometieron a determinaciones de la actividad lactasa por el método FCC IV y la actividad arilsulfatasa por el método descrito en el Ejemplo 7. La Tabla 9 muestra el resultado.

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Tabla 9 Comparación de actividad arilsulfatasa de la cepa parental y la cepa mutante

Actividad lactasa (NLU/g): Actividad arilsulfatasa (U/g)

Cepa G14-427: 16 6

Cepa SM182: 16 3

Cepa SF-81: 16 0

Ejemplo 10 Obtención de la cepa huésped

En 10 mL de medio YPD, se inoculó el contenido de un asa de siembra de Kluyveromyces lactis, cepa G14-427, que era una cepa diploide, y las células se crecieron hasta fase log a 30 grados Celsius. Las células se recogieron centrifugando el medio de cultivo. Las células recogidas se dispersaron en agua estéril de manera que la absorbancia de la suspensión obtenida se convirtió en 0,5 a 600 nm. Mediante el uso de una lámpara UV, se irradió ultravioleta a la suspensión celular durante 15 segundos. Las células se recogieron por centrifugación, y se mezclaron y dispersaron en medio YPD. Se tomó una cantidad apropiada de medio YPD que contenía las células y se extendió en una placa de agar YPD. El cultivo estático de la placa se llevó a cabo a 37 grados Celsius durante 4 días en condiciones estáticas. Las colonias que habían crecido se cultivaron en medio SD (0,67% base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 2% glucosa, 2% agar) después de su réplica en placa, y se seleccionaron aquellas que no habían sido capaces de crecer.

Estas cepas que no habían sido capaces de crecer en el medio SD anterior se extendieron en otro medio SD que contenía 20 mg/mL de L-metionina de la placa de agar YPD original, y aquellas que habían crecido se designaron como mutante que requiere L-metionina (cepa 7-19).

En 10 mL de medio YPD, se inoculó el contenido de un asa de siembre de la cepa 7-19, y las células se crecieron hasta fase log a 30 grados Celsius. Las células se recogieron centrifugando el medio de cultivo. Las células recogidas se dispersaron en agua estéril de manera que la absorbancia de la suspensión obtenida se convirtió en 0,5 a 600 nm. Mediante el uso de una lámpara UV, se irradió ultravioleta a la suspensión celular durante 15 segundos. Las células se recogieron por centrifugación, y se mezclaron y dispersaron en medio YPD. Se tomó una cantidad apropiada de medio YPD que contenía las células y se extendió en una placa de agar YPD. El cultivo estático de la placa se llevó a cabo a 37 grados Celsius durante 4 días. Las colonias que habían crecido se cultivaron en medio SD que contenía 20 mg/mL de L-metionina después de su réplica en placa, y se seleccionaron aquellas que no habían sido capaces de crecer.

Estas cepas que no habían sido capaces de crecer en el medio SD anterior que contenía L-metionina se extendieron en otro medio SD que contenía 20 mg/mL de L-histidina y 20 mg/mL de L-metionina de la placa de agar YPD original, y aquellas que habían crecido se designaron como mutante que requiere doble nutriente L-metionina y Lhistidina (cepa 8-23). El crecimiento de los mutantes que requieren nutrientes se muestra en la Tabla 10.

Tabla 10

Crecimiento de cepas mutantes en varios medios de cultivo

Medio SD: Medio SD + L-Metionina Medio SD + L-Metionina + L-Histidina

Cepa G14-427: + + +

Cepa 7-19: - + +

Cepa 8-23: - - +

+: crecieron -: no crecieron Ejemplo 11 Obtención de una cepa con doble disrupción de gen que no produce arilsulfatasa

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anteriormente. Como se muestra en la Figura 3, el fragmento obtenido que contenía el gen HIS4 se trató con Bgl II y Eco RI y después se insertó en el sitio Bgl II-Eco RI de pGSuC. El plásmido así construido se designó como pdSuC1. Los varios métodos usados para la construcción fueron similares a los indicados anteriormente.

Para construir un vector para disrumpir el gen de arilsulfatasa con el gen MET6 como un marcador, se diseñaron los cebadores SuCd-M6F y SuCd-M6R teniendo cada uno 40 bases de secuencia homóloga del gen de arilsulfatasa añadidas al lado 5'. Las secuencias homólogas del gen de arilsulfatasa estaban cerca de los sitios de la enzima de restricción para Cla I, que existían dos localizaciones en el marco de lectura abierto. Como se muestra en la Figura 4, se obtuvo un fragmento que tenía secuencias homólogas a arilsulfatasa en ambos extremos del gen MET6 usando estos cebadores y ADN genómico como el molde. El fragmento obtenido se subclonó en vector pGEM (marca comercial registrada)-T (producido por Promega) para obtener pdSuCM6. Los varios métodos usados para la construcción fueron similares a los indicados anteriormente.

Transformación de la cepa mutante 8-23 que requiere doble nutriente L-metionina y L-histidina usando un vector para disrumpir el gen de arilsulfatasa

La Figura 5 representa un diagrama esquemático de construcción de un transformante. El plásmido pdSuC1 se linearizó por tratamiento con Nco I y Aat II, seguido de transformación de la cepa 8-23 con el plásmido linearizado por el método del acetato de litio. Así, se obtuvo una cepa transformante, SuCD, cepa que creció en medio SD con 20 µg/mL de metionina añadida.

Después, el plásmido pdSuCM6 se linearizó mediante tratamiento con ClaI, seguido de transformación de la cepa SuCD con el plásmido linearizado por el método del acetato de litio. Así, se obtuvo una cepa transformante, SuCDD5-2, cepa que creció en medio SD.

Transferencia Southern de los ADN de la cepa parental y cepas transformantes

Los transformantes obtenidos se cultivaron respectivamente en medio YPD, y se prepararon los ADN genómicos respectivamente a partir de los fluidos de cultivo usando Dr. GenTLE™ (de levadura) (producido por Takara Bio Inc.). Los ADN genómicos obtenidos se digirieron con Bam HI, seguido de análisis Southern. Como la sonda, se usó el fragmento Aat II-Eco RI del gen de arilsulfatasa. Para el marcaje y detección de ácido nucleico, se usó el sistema de marcaje directo y detección AlkPhos con CDP-Star (producido por GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.), y el método de uso fue según el documento adjunto.

Los resultados de la transferencia Southern se muestran en la Figura 6. Los carriles 1, 2, y 3 representan la cepa parental G14-427, el transformante SuCDD5-2, y el transformante SuCD, respectivamente. En el carril 3, con la banda (12,1 kb) del fragmento que contiene el gen de arilsulfatasa y el gen HIS4, también se detectó una banda en la misma posición (7,8 kb) en el carril 1. Así, se confirmó que sólo uno de los genes de arilsulfatasa se había disrumpido. Por otra parte, en el carril 2, la banda de 7,8 kb se desplazó a 5,3 kb. Así, se confirmó que ambos genes de arilsulfatasa se habían disrumpido.

Detección de actividad arilsulfatasa en la cepa con doble disrupción de genes de arilsulfatasa

La cepa parental, cepa G14-427 de Kluyveromyces lactis (una cepa diploide) y la cepa SuCDD5-2 construida como se ha descrito anteriormente se inocularon respectivamente en medio YPD, y se incubaron a 30 grados Celsius, con agitación a 210 rpm durante 72 horas. A cada fluido de cultivo, se añadió Zimoliasa (producida por Seikagaku Biobusiness Corp.) para estar en una concentración de 2 mg/mL, y la reacción se llevó a cabo a 30 grados Celsius durante 2 horas para disrumpir las paredes celulares. Los sobrenadantes se recogieron respectivamente por centrifugación, y se determinaron la actividad lactasa y actividad arilsulfatasa por el método FCC IV y el método como se describe en el Ejemplo 7, respectivamente. Los resultados se muestran en la Tabla 12.

Se ha revelado que aunque en el fluido de cultivo de la cepa SuCDD5-2, está contenida lactasa, la arilsulfatasa no está contenida o está contenida en una cantidad muy pequeña, si lo está, de manera que no puede detectarse por el método de fluorescencia. Concretamente, se ha confirmado que aunque la cepa SuCDD5-2 mantiene la productividad de lactasa, la productividad de arilsulfatasa es cero o casi cero.

Tabla 12

Comparación entre la actividad arilsulfatasa de cepa que tiene dos genes de arilsulfatasa y otra cepa en la que ambos genes de arilsulfatasa se han disrumpido

Cepa que produce lactasa: Actividad lactasa (NLU/g) Actividad arilsulfatasa (U/g)

Cepa G14-427: 16 6

Cepa SucDD5-2: 16 0

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Ejemplo 12 Preparación de preparaciones enzimáticas con la cepa SF-81 y la cepa CBS2359

La cepa SF-81 (un mutante diploide con una productividad reducida de arilsulfatasa) obtenida en el Ejemplo 9 y la cepa CBS2359 (una cepa monoploide) se inocularon respectivamente en un medio para la producción de lactasa que contenía 7% de licor de maíz fermentado y 2% lactosa, y se incubó a 30 grados Celsius con agitación a 210 rpm durante 96 horas. Después, las células se recogieron respectivamente por centrifugación. Se añadió agua purificada estéril a las células y las paredes celulares de las células recogidas se disrumpieron con lechos de vidrio y ondas ultrasónicas. La mezcla que contenía células así obtenida, agua purificada, y semejantes, se centrifugó y se recogió el sobrenadante. La actividad lactasa del sobrenadante obtenido se determinó por el método de fluorescencia como se describe en el Ejemplo 7. Como resultado, la actividad relativa de la cepa CBS2359 fue 2% comparada con la actividad lactasa de la cepa SF-81 que se especificó como 100%.

El sobrenadante anterior se fraccionó con sulfato de amonio y se concentró con una membrana de ultrafiltración. Como resultado, a partir de células de la cepa SF-81, se obtuvieron preparaciones de lactasa, preparaciones que tienen una actividad lactasa respectiva de aproximadamente 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000 ó 6.000 NLU/g dependiendo del grado de concentración. Por otra parte, no se obtuvo ninguna preparación que tuviera una actividad lactasa de

1.000 NLU/g o mayor a partir de la cepa CBS2359 aunque se llevó a cabo un método de concentración similar.

Ejemplo 13 Preparación de la preparación enzimática

La cepa SF-81 se inoculó en un medio para la producción de lactasa que contenía 7% de licor de maíz fermentado y 2% lactosa, y se incubó a 30 grados Celsius con agitación a 210 rpm durante 96 horas. Después, las células se recogieron por centrifugación. Se añadió agua purificada estéril a las células y las paredes celulares de las células recogidas se disrumpieron con lechos de vidrio y ondas ultrasónicas. El sobrenadante se recogió por centrifugación. El sobrenadante se fraccionó con sulfato de amonio y se concentró con una membrana de ultrafiltración para obtener una preparación de lactasa que tenía una actividad lactasa de aproximadamente 5.000 NLU/g. La actividad arilsulfatasa se esta preparación de lactasa fue 1 U/g o menos según el método de la presente invención (el método de fluorescencia).

Ejemplo 14 Examen organoléptico para sabor (Parte 2)

Se prepararon cinco preparaciones de lactasa teniendo cada una actividad arilsulfatasa de 1 a 20 U/g según se determina por el método de fluorescencia mostrado en el Ejemplo 7 a partir de la preparación de lactasa per se producida a partir de la cepa SF-81 por el método según se describe en el Ejemplo 13, y mezclando apropiadamente la preparación de lactasa con GODO-YNL2 (preparación de lactasa líquida, producida por Godo Shusei Co. Ltd.). Además, la actividad lactasa de cada preparación de lactasa se determinó por el método FCC IV.

Examen organoléptico para sabor

Como en el Ejemplo 8, cada una de las 5 preparaciones de lactasa se añadió a una leche de vaca disponible comercialmente para tener un contenido de lactasa de 20.000 NLU/L de leche, y las leches de vaca obtenidas se almacenaron a 30 grados Celsius. Después de 1 mes de almacenamiento, se llevó a cabo un examen organoléptico para sabor por un método similar a como se describe en el Ejemplo 8, en el que las leches a las se habían añadido respectivamente las preparaciones de lactasa se compararon con la leche a la que no se había añadido preparación de lactasa. Los resultados se muestran en la Tabla 13.

Tabla 13

Resultados del examen organoléptico para sabor (sabor anormal) de leches de vaca que se trataron con preparaciones de lactasa que contenían arilsulfatasa en varias relaciones de contaminación

Preparaciones de lactasa: Sabor anormal

Actividad lactasa (NLU/g): Actividad arilsulfatasa (U/g) Actividad arilsulfatasa/Actividad lactasa (%) Periodo de tiempo de reacción: 1 mes

No añadida: -

5.000: 1 o menos 0,02 o menos -

5.000: 5 0,1 -

5.000: 10 0,2 +

5.000: 15 0,3 +

5.000: 20 0,4 +

+: consciente;

-: no consciente

A partir de los resultados mostrados en la Tabla 13, se ha concluido que la actividad arilsulfatasa según se determina por el método según la presente invención es preferiblemente 5 U/g o menos. Además, se ha demostrado que la proporción de actividad arilsulfatasa (unidad: U/g) según se determina por el método según la presente invención es preferiblemente 0,1% o menos usando la actividad lactasa (unidad: NLU/g) por el método FCC IV como la base.

Claims

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