ES2613844T3 - Ligandos polidentados de alta afinidad selectivos y métodos para producirlos - Google Patents

Ligandos polidentados de alta afinidad selectivos y métodos para producirlos Download PDF

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Gerald L. Denardo
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Abstract

Un ligando de alta afinidad selectivo (SHAL) que se une específicamente a una célula cancerígena, donde dicho SHAL comprende: un primer ligando, un segundo ligando y un tercer ligando unidos entre sí por un enlazador, donde el enlazador comprende polietilenglicol o comprende polietilenglicol y una lisina; el primer ligando comprende ácido 3-(2-{ [3- cloro-5-(trifluorometil)-2- piridinil]oxi}anilino)-3-oxopropanoico (Ct); y el segundo ligando comprende ácido 4-[4-(4-clorobencil)piperazino]-3- nitrobencenocarboxílico (Cb); y el tercer ligando comprende 4-(Dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonil-L-valina (Dv).

Description

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DESCRIPCION
Ligandos polidentados de alta afinidad selectivos y metodos para producirlos
Declaracion relativa a los derechos de las invenciones realizadas por actividades de investigacion y desarrollo promovidas por el gobierno federal
Este trabajo ha sido financiado parcialmente a traves de la subvencion n° CA047829 del National Institutes of Health, National Cancer Institute (EE.UU.). Asimismo, de conformidad con el Contrato n° DE- AC52- 07NA27344 entre el Departamento de Ene^a de los Estados Unidos y Lawrence Livermore National Security LLC relativo al funcionamiento de Lawrence Livermore National Laboratory, el Gobierno de los Estados Unidos de America ostenta determinados derechos sobre esta invencion.
Campo de la invencion
Esta invencion se refiere al desarrollo de moleculas diana. Mas concretamente, esta invencion se refiere al desarrollo de ligandos de alta afinidad selectivos polidentados (SHAL) que pueden ser utilizados de manera analoga a los anticuerpos y/o ligandos peptfdicos como reactivos de afinidad o para el diagnostico y tratamiento de diversas enfermedades (como el cancer).
Antecedentes de la invencion
En general, se ha descubierto que los farmacos cancericidas, como los quimioterapeuticos, tambien son toxicos para las celulas de los tejidos normales. Por consiguiente, los efectos secundarios de estos farmacos pueden ser casi tan devastadores para el paciente como la propia enfermedad maligna. El descubrimiento de anticuerpos monoclonales y ligandos peptfdicos proporciono un nuevo metodo para mejorar la especificidad/selectividad de los farmacos. Al conjugar, por ejemplo, un agente citotoxico con un anticuerpo o ligando peptfdico dirigido contra los antfgenos presentes en las celulas malignas, pero no presentes en las celulas normales, se ha logrado la muerte selectiva de las celulas malignas. Se han creado numerosos inmunoconjugados diferentes que constan de un anticuerpo unido a un agente citotoxico dirigido contra diversos antfgenos de la superficie celular.
Los agentes citotoxicos utilizados en estos inmunoconjugados incluyen radioisotopos, diversas toxinas de plantas y bacterianas (como, Pseudomonas exotoxin, toxina difterica, ricina, abrina, etc.), diversos factores de crecimiento y mas recientemente agentes como las caspasas. A pesar de que se han documentado algunos exitos, en particular en el linfoma y las leucemias, por lo general las terapias basadas en anticuerpos, tanto las que usan anticuerpos solamente como las que utilizan inmunoconjugados, no han desarrollado el potencial previsto.
A pesar de que se han conseguido avances significativos en el tratamiento de enfermedades malignas, todavfa no se han desarrollado pautas curativas para la mayona de los pacientes o estas estan asociadas a toxicidades poco deseables para el paciente. Por tanto, se necesitan nuevas estrategias para el tratamiento de la mayona de las enfermedades malignas. Estas estrategias debenan tener como objetivo la maximizacion del efecto terapeutico, unido a la minimizacion de la toxicidad. Un planteamiento ha implicado el uso de ligandos espedficos para receptores de la superficie celular o anticuerpos espedficos para antfgenos asociados a las celulas malignas como medio para dirigir los farmacos o radioisotopos a las celulas malignas. El planteamiento resulta atractivo para muchas enfermedades malignas porque las celulas malignas presentan en sus superficies celulares una variedad de receptores y/o antfgenos hiperregulados o limitados a los tumores que se podnan utilizar como diana. Hasta ahora, se ha descubierto que los sistemas anticuerpo/antfgeno son mejores que los sistemas receptores del ligando, porque estan mas limitados que los receptores y en mayor cantidad en la celula maligna.
A pesar de estas ventajas, los anticuerpos no han desarrollado su potencial por multiples razones. Entre estas razones, los anticuerpos son macromoleculas (moleculas de gran tamano) que a menudo no acceden ni penetran de forma eficaz en el tumor maligno. Por otra parte, los anticuerpos suelen ser grandes moleculas inmunogenicas y pueden inducir una respuesta inmune en el paciente dirigida contra el agente terapeutico. Por otra parte, a menudo los anticuerpos no demuestran una especificidad suficiente para el tejido diana (como el cancer) y, por tanto, resultan utiles unicamente en pautas terapeuticas limitadas.
Resumen de la invencion
En determinadas realizaciones esta invencion proporciona, tal y como se define en las reivindicaciones, nuevos ligandos de alta afinidad selectivos polidentados (SHAL) que pueden funcionar para unirse de forma espedfica a determinadas moleculas diana de forma analoga a la union del anticuerpo. Se describen metodos para el diseno y la generacion de SHAL como reactivos de afinidad para la investigacion basica o aplicada o para el diagnostico y tratamiento de enfermedades infecciosas y/o malignas y su administracion a pacientes con enfermedades infecciosas y/o malignas.
Tfpicamente los SHAL comprenden dos o mas ligandos (fracciones de union) que se unen cada uno a diferentes regiones de la diana pretendida unidas entre sf directamente o a traves de un enlace. Cuando el SHAL esta dirigido a un marcador de una celula cancengena, el SHAL se asocia con una mayor densidad (abundancia) o accesibilidad a la celula diana en comparacion con las celulas normales. Por
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tanto, el SHAL proporciona la selectividad apropiada para el diagnostico o el tratamiento de las celulas diana. Se pueden generar diferentes SHAL facilmente para diferentes celulas malignas y enfermedades malignas. El SHAL representa un bloque constructivo core (por ejemplo, una fraccion diana) que se puede incorporar a moleculas mas grandes (como moleculas quimericas) para efectuar la entrega espedfica de un efector en la diana.
Por tanto, esta divulgacion proporciona un metodo para producir un ligando polidentado de alta afinidad selectivo (SHAL) que se une espedficamente a una molecula diana. En determinadas divulgaciones, el metodo implica tfpicamente seleccionar una primera biblioteca de ligandos para identificar un primer ligando que se une a la molecula diana; seleccionar una segunda biblioteca de ligandos para identificar un segundo ligando que se une a la molecula diana, donde el segundo ligando es diferente del primer ligando; unir el primer ligando al segundo ligando para formar un SHAL; y seleccionar el SHAL por su capacidad para unirse espedficamente a la molecula diana. En determinadas realizaciones, la molecula diana es una protema. En determinadas realizaciones, la molecula diana es un marcador cancengeno (por ejemplo, epftopo Lym-1, Muc-1, C-myc, p53, Ki67, Her2, Her4, BRCA1, BRCA2, Lewis Y, CA 15-3, g250, antfgeno de superficie celular HLA-Dr, CEA, CD20, CD22, integrina, CEA, 16, EGFr, AR, PSA, y otros receptores del factor de crecimiento, etc.). El metodo puede implicar tambien opcionalmente la seleccion del SHAL para identificar un SHAL que se une a la diana con una avidez y/o especificidad superior que cualquier ligando que comprende el SHAL. La primera biblioteca de ligandos y la segunda biblioteca de ligandos pueden ser la misma biblioteca o diferentes. En determinadas realizaciones, la primera y/o la segunda biblioteca de ligandos es una biblioteca de pequenas moleculas organicas. En determinadas realizaciones, la seleccion de la primera biblioteca de ligandos y/o la seleccion de la segunda biblioteca de ligandos comprende una seleccion in silico virtual. La seleccion in silico virtual puede comprender la seleccion de una base de datos de compuesta (como MDL® Available Chemicals Directory, ChemSpider, GNU-Darwin) utilizando uno o mas algoritmos utilizados en el programa DOCK. La seleccion in silico virtual puede comprender la seleccion de una base de datos de compuestos utilizando el programa DOCK. La seleccion in silico virtual puede implicar la seleccion de un primer ligando y/o multiples ligandos que se unen a una hendidura de una protema. En determinadas realizaciones la hendidura se identifica utilizando un algoritmo que emplea el programa SPHGEN. En determinadas realizaciones la hendidura se identifica utilizando el programa SPHGEN. La seleccion
in silico virtual puede implicar la seleccion de un segundo o tercer ligando que se une a regiones de la diana diferentes que los ligandos identificados cuando se selecciona la biblioteca del primer ligando.
En determinadas realizaciones, la seleccion de una primera biblioteca de ligandos y/o la seleccion de una segunda biblioteca de ligandos comprende adicionalmente la seleccion de uno o mas ligandos identificados en la seleccion in silico virtual en un ensayo ffsico para determinar la capacidad de unirse a la diana. Entre los ensayos ffsicos adecuados se incluyen, entre otros, un ensayo BIAcore, una espectroscopia de resonancia magnetica nuclear de diferencia de transferencia de saturacion, una espectroscopia de resonancia magnetica nuclear NOE de transferencia (trNOE), un ensayo ELISA, un ensayo competitivo, un ensayo de union de tejidos, un ensayo de union de celulas vivas, un ensayo de extractos celulares y similares.
La union de los ligandos puede implicar directamente unir dos o mas ligandos o unir dos o mas ligandos con un enlace (por ejemplo, un enlace tipo PEG, un enlace peptfdico, un enlace de avidina/biotina, un enlace de carbono de cadena recta, un enlace heterodclico, un enlace de carbono de cadena ramificada, un dendnmero, un enlace de acido nucleico, un enlace tiol, un enlace ester, un enlace que comprende una amina, un enlace que comprende un carboxilo, etc.). La union puede consistir opcionalmente en unir dos o mas ligandos con enlaces de diferentes longitudes para producir una biblioteca de SHAL que tienen enlaces de diferente longitud; y opcionalmente seleccionar la biblioteca de SHAL que tienen enlaces de diferente longitud para identificar los miembros de la biblioteca que tienen la avidez y/o especificidad mas elevada con respecto a la diana. En determinadas divulgaciones, el metodo implica asimismo seleccionar el SHAL(s) para identificar un SHAL que se une a la diana con una avidez y/o especificidad superior que cualquier ligando que comprende el SHAL. La seleccion de ligandos individuales y/o uno o varios SHAL bivalentes o polivalentes se puede realizar a traves de cualquiera de una variedad de metodos entre los que se incluyen, entre otros, un ensayo BIAcore, una espectroscopia de resonancia magnetica nuclear de diferencia de transferencia de saturacion, una espectroscopia de resonancia magnetica nuclear NOE de transferencia (trNOE), un ensayo ELISA, un ensayo competitivo, un ensayo de union de tejidos, un ensayo de union de celulas vivas, un ensayo de extractos celulares y similares. En determinadas realizaciones, la molecula diana es una protema y/o un marcador cancengeno (por ejemplo, epftopo Lym1, Muc-1, C-myc, p53, Ki67, Her2, Her4, BRCA1, BrCA2, Lewis Y, CA 15-3, G25o, antfgeno de superficie celular HLA- DR, etc.).
Tambien se proporciona un metodo para sintetizar un inhibidor para una enzima u otro receptor o protema de union. En determinadas realizaciones, el metodo implica tfpicamente identificar una primera hendidura (o protuberancia) y una segunda o tercera hendidura (o protuberancia) en la enzima u otro receptor o protema de union, donde la primera, segunda y tercera hendiduras flanquean los lados opuestos del punto activo o punto de union de la enzima u otro receptor o protema de union; seleccionar una primera biblioteca de ligandos para identificar un primer ligando que se une a la primera hendidura (o
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protuberancia); seleccionar una segunda biblioteca de ligandos para identificar un segundo ligando que se une a la segunda hendidura (o protuberancia); seleccionar una tercera biblioteca de ligandos para identificar un tercer ligando que se une a una tercera hendidura o protuberancia; unir el primer ligando a los ligandos segundo y tercero para formar un ligando de alta afinidad selectivo polidentado (SHAL); y seleccionar el SHAL por su capacidad para unirse de forma espedfica y para inhibir la enzima u otra protema de union. En determinadas divulgaciones, las hendiduras o "protuberancias" no tienen que estar ubicadas en lados opuestos del punto activo o punto de union de la enzima o del receptor o la protema de union, sino simplemente estar ubicadas de forma que la union del SHAL bloquee la union del ligando cognado nativo a ese punto. En determinadas realizaciones, la molecula diana comprende una molecula seleccionada del grupo compuesto por una protema, una enzima, un acido nucleico, una protema de union a acido nucleico y un carbohidrato. En determinadas divulgaciones, el metodo implica asimismo seleccionar el SHAL para identificar un SHAL que se une a la diana con una avidez y/o especificidad superior que cualquier ligando que comprende el SHAL. La primera, segunda y tercera bibliotecas de ligandos pueden ser la misma biblioteca o diferentes. En determinadas realizaciones, la primera y/o la segunda y/o la tercera biblioteca de ligandos es una biblioteca de pequenas moleculas organicas. En determinadas realizaciones, la seleccion de la primera, la segunda y/o la tercera biblioteca de ligandos comprende una seleccion in silico virtual. La seleccion in silico virtual puede comprender la seleccion de una base de datos de compuestos (como MDL® Available Chemicals Directory) utilizando uno o mas algoritmos utilizados en el programa DOCK. La seleccion in silico virtual puede comprender la seleccion de una base de datos de compuestos utilizando el programa DOCK. La seleccion in silico virtual puede implicar la seleccion de un primer, un segundo y/o un tercer ligando que se une a una hendidura de una protema. En determinadas realizaciones la hendidura se identifica utilizando un algoritmo que emplea el programa SPHGEN. En determinadas realizaciones la hendidura se identifica utilizando el programa SPHGEN. La seleccion in silico virtual puede implicar la seleccion de un segundo ligando que se une a una region de la diana diferente que los ligandos identificados cuando se selecciona la primera biblioteca de ligandos.
En determinadas realizaciones, la seleccion de una primera, una segunda o una tercera biblioteca de ligandos y/o la seleccion de una segunda biblioteca de ligandos comprende adicionalmente la seleccion de uno o mas ligandos identificados en la seleccion in silico virtual en un ensayo ffsico para determinar en un ensayo ffsico para determinar la capacidad de unirse a la diana. Entre los ensayos ffsicos adecuados se incluyen, entre otros, un ensayo BIAcore, una espectroscopia de resonancia magnetica nuclear de diferencia de transferencia de saturacion, una espectroscopia de resonancia magnetica nuclear NOE de transferencia (trNOE), un ensayo ELISA, un ensayo competitivo, un ensayo de union de tejidos, un ensayo de union de celulas vivas, un ensayo de extractos celulares y similares.
La union de los ligandos puede implicar directamente unir dos o mas ligandos o unir dos o mas ligandos con un enlace (por ejemplo, un enlace tipo PEG, un enlace pepffdico, un enlace de avidina/biotina, un enlace de carbono de cadena recta, un enlace heterodclico, un enlace de carbono de cadena ramificada, un dendnmero, un enlace de acido nucleico, un enlace tiol, un enlace ester, un enlace que comprende una amina, un enlace que comprende un carboxilo, etcj. La union puede consistir opcionalmente en unir los ligandos con enlaces de diferentes longitudes para producir una biblioteca de SHAl que tienen enlaces de diferente longitud; y opcionalmente seleccionar la biblioteca de SHAL que tienen enlaces de diferente longitud para identificar los miembros de la biblioteca que tienen la avidez y/o especificidad mas elevada con respecto a la diana.
La invencion proporciona, tal y como se define en las reivindicaciones, un ligando de alta afinidad selectivo polidentado (SHAL) que se une espedficamente a una diana deseada (por ejemplo, una celula cancengena). La diana es una celula cancengena. El SHAL comprende un primer ligando que se une a un primer punto de un marcador para la celula cancengena unida (directamente o a traves de un enlace) a un segundo o tercer ligando que se une a un segundo o tercer punto del mismo marcador o de un marcador diferente para la celula cancengena, donde el primer punto, el segundo punto y el tercer punto son puntos diferentes (por ejemplo, los tres ligandos son capaces de unirse de forma simultanea a la diana o dianas). En determinadas realizaciones, el primer punto, el segundo punto y/o el tercer punto es una hendidura (o "protuberancia") en el marcador o marcadores. Entre los marcadores adecuados se incluyen, entre otros, un epftopo Lym-1, Muc-1, C-myc, p53, Ki67, Her2, Her4, BRCA1, BRCA2, Lewis Y, CA 15-3, G250, el anffgeno de superficie celular HLA-DR, CEA, CD20, CD22, integrina, CEA, 16, EGFr, AR, PSA, otros receptores del factor de crecimiento y similares.
En determinadas realizaciones preferibles, el marcador es un anffgeno de superficie celular HLA-DR.
En determinadas realizaciones, los tres ligandos se unen a puntos de un epftopo reconocido por el Lym-1 u otros anticuerpos espedficos del HLA-DR. En determinadas realizaciones, los tres ligandos son moleculas organicas pequenas. En determinadas realizaciones, el primer ligando es un ligando seleccionado de la Tabla 1 y el segundo y el tercer ligando, cuando estan presentes, son independientemente seleccionados de los ligandos de las Tablas 1, 5, 6, 7 u 8. En determinadas realizaciones, el SHAL comprende un primer, un segundo y/o un tercer ligando seleccionado de las Tablas 2, 3, o 4. En determinadas realizaciones, el SHAL comprende un primer, un segundo y/o un tercer ligando seleccionado de la Tabla 4. Los tres ligandos se pueden unir directamente o el primer ligando se puede
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unir al segundo y/o al tercer ligando a traves de un enlace (por ejemplo, un enlace tipo PEG, un enlace peptidico, un enlace de avidina/biotina, un enlace de carbono de cadena recta, un enlace heterodclico, un enlace de carbono de cadena ramificada, un dendnmero, un enlace de acido nucleico, un enlace tiol, un enlace ester, un enlace que comprende una amina, un enlace que comprende un carboxilo, etcj. En determinadas realizaciones, el SHAL tiene una avidez para el marcador superior a 10-6 M, mientras que los ligandos individuales que comprenden el SHAL tienen cada uno una afinidad de union con el marcador inferior a 10-6 M. En determinadas realizaciones, el SHAL tiene una formula como la mostrada aqrn y en las Figuras o es analoga a la misma.
Esta invencion proporciona asimismo moleculas quimericas que comprenden un SHAL como el aqrn descrito unido a un efector (por ejemplo, un marcador de epttopo, un segundo SHAL, un anticuerpo, una etiqueta, una citotoxina, un liposoma, un radionuclido, un farmaco, un profarmaco, una partfcula viral, una citoquina y un quelato). En determinadas realizaciones, el efector es un marcador de epttopo seleccionado del grupo compuesto por una avidina y una biotina. En determinadas realizaciones, el efector es una citoquina seleccionada del grupo compuesto por una toxina de difteria, una exotoxina de Pseudomonas, una ricina, una abrina y una quinasa de timidina. En determinadas realizaciones, el efector es un quelato que comprende un isotopo de metal seleccionado del grupo compuesto por 99Tc, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 72As, 111 - 113mIn, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 52Fe, 52mMn, 51Cr, 186, Re, f88Re, 77As, 90Y, 67Cu, 1s9Er, 121Sn, 127Te, 142Pr,
In,
i43p i98au, 199au, 161Tb,
9Pd, Dy, l49Pm, l5lPm, l53Sm;
. As
157Gd, 159Gd,
166Ho, 172Tm,
169Yb, 175Yb,
7Lu,
Rh, y Ag. En determinadas realizaciones, el efector es un
quelato que comprende un emisor alfa (por ejemplo, bismuto 213). En determinadas realizaciones, el efector es un quelato que comprende DOTa. En determinadas realizaciones, el efector de un lfpido o un liposoma (por ejemplo, un liposoma que contiene un farmaco).
En otra realizacion mas, esta invencion proporciona una formulacion farmaceutica que comprende un ligando de alta afinidad selectivo polidentado (SHAL) que se une espedficamente a una celula cancengena como se ha descrito en el presente y un excipiente farmaceuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, la formulacion se puede proporcionar como una formulacion de dosis unitaria. En determinadas realizaciones, la formulacion se puede proporcionar como una formulacion de liberacion prolongada.
Esta invencion proporciona asimismo una formulacion farmaceutica que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una molecula quimerica que comprende un SHAL como el descrito en el presente. En determinadas realizaciones, la formulacion se puede proporcionar como una formulacion de dosis unitaria. En determinadas realizaciones, la formulacion se puede proporcionar como una formulacion de liberacion prolongada.
Se proporcionan metodos para inhibir el crecimiento o la proliferacion de una celula cancengena. Los metodos tfpicamente implican poner en contacto la celula cancengena (por ejemplo, una celula metastasica, una celula tumoral, etc.) con un ligando de alta afinidad selectivo polidentado (SHAL) que se une espedficamente a una celula cancengena y/o con una molecula quimerica que comprende un ligando de alta afinidad selectivo polidentado (SHAL) que se une espedficamente a una celula cancengena unida a un efector (por ejemplo, farmaco, liposoma, citotoxina, radionuclido o quelante).
En determinadas realizaciones, esta invencion proporciona SHAL que se unen espedficamente a una diana deseada. La diana puede ser cualquier diana para la que se desee crear una fraccion de union. El SHAL comprende tfpicamente dos o mas ligandos unidos directamente o a traves de un enlace, donde un primer ligando se une a un primer punto de la diana y el segundo y/o tercer ligando se une al segundo y/o tercer punto de la diana del mismo marcador diana, donde el primer, el segundo y/o el tercer punto son puntos diferentes (por ejemplo, los tres ligandos son capaces de unirse simultaneamente a la diana o dianas). En determinadas realizaciones, el primer punto, el segundo punto y/o el tercer punto es una hendidura (o "protuberancia") en la diana o dianas. En determinadas realizaciones, el primer, el segundo y/o el tercer punto se encuentran en la misma molecula diana.
Esta invencion proporciona asimismo diversos metodos de deteccion. En determinadas realizaciones, esta invencion proporciona un metodo para detectar una celula cancengena. El metodo implica tfpicamente poner en contacto la celula cancengena con una molecula quimerica que comprende un SHAL que se une espedficamente a una celula cancengena (por ejemplo, a un marcador cancengeno) unida a una etiqueta detectable (por ejemplo, un emisor de gamma, un emisor de positrones, un emisor de rayos X, un emisor de alfa, un emisor de fluorescencia, etc.) y detectar la presencia o ausencia de la etiqueta detectable. En determinadas realizaciones, el metodo implica tfpicamente poner en contacto una celula cancengena con una molecula quimerica que comprende un SHAl que se une espedficamente a una celula cancengena (por ejemplo, a un marcador cancengeno) unida a un marcador de epttopo; poner en contacto la molecula quimerica con un quelato que comprende una fraccion detectable por la que el quelato se une al marcador de epttopo, asociando asf la fraccion detectable con el quelato; y detectar la fraccion detectable. En determinadas realizaciones, la fraccion detectable es un radionuclido (por ejemplo, un emisor de gamma, un emisor de positrones, un emisor de alfa, un emisor de rayos X, etc.). En determinadas realizaciones, la deteccion comprende la visualizacion de imagenes externas y/o la visualizacion de imagenes internas. En determinadas realizaciones, la fraccion detectable comprende un isotopo de metal seleccionado del grupo
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compuesto por 99Tc, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 72As, 111In, 113mIn, 97Ru, 62Cu, 641Cu, 52Fe, 52mMn, 51Cr, 186, Re,
188Re, 77As, 90Y, 67Cu 169Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm,
157Gd, 159Gd, 166Ho, 72Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, y 111Ag. En determinadas realizaciones, el quelato comprende DOTA. En determinadas realizaciones, el marcador de epftopo es una avidina o una biotina.
Esta invencion contempla asimismo kits para crear y/o utilizar SHAL de esta invencion y/o moleculas quimericas que comprenden SHAL de esta invencion. En determinadas realizaciones, el kit comprende un contenedor que contiene un SHAL como el descrito en el presente y/o contenedores que contienen ligandos para unirse a un SHAL como el descrito en el presente. El kit puede incluir opcionalmente uno o mas enlaces, uno o mas efectores (quelatos, radionuclidos, etc.) y similares. En determinadas realizaciones, el SHAL se encuentra en un excipiente farmacologicamente aceptable.
En determinadas realizaciones, esta invencion excluye de forma expresa los SHAL en los que las fracciones de union que comprenden los SHAL son anticuerpos, anticuerpos de cadena simple y similares. En determinadas realizaciones, los SHAL no son anticuerpos polivalentes ni anticuerpos de cadena simple polivalentes. En determinadas realizaciones, los ligandos que comprenden los SHAL no son protemas. En determinadas realizaciones, esta invencion excluye de forma expresa los SHAL en los que las fracciones de union que comprenden los SHAL se unen preferible y/o espedficamente a acidos nucleicos. En determinadas realizaciones, los ligandos que comprenden los SHAL son moleculas organicas pequenas.
Definiciones
Los terminos "union espedfica" o "union preferente" se refieren a la union que se produce entre pares de especies como enzima/sustrato, receptor/agonista, anticuerpo/antfgeno y lectina/carbohidrato que puede estar mediada por interacciones covalentes y/o no covalentes. Cuando la interaccion de las dos especies produce tfpicamente un complejo unido de forma no covalente, la union que se produce es tfpicamente electrostatica, y/o por enlace de hidrogeno y/o el resultado de interacciones lipofflicas. Por consiguiente, la "union espedfica" ocurre entre pares de especies cuando existe una interaccion entre las dos que produce un complejo unido. En particular, la union espedfica se caracteriza por la union preferente de un miembro de una pareja a una especie concreta en comparacion con la union de ese miembro de la pareja a otras especies de la familia de compuestos a la que pertenece esa especie. Asf, por ejemplo, un ligando puede mostrar una afinidad por una hendidura concreta en una molecula de HLA-DRlO que es al menos dos veces, preferiblemente al menos 10 veces, mas preferiblemente al menos 100 veces, al menos 1000 veces o al menos 10 000 veces mayor que su afinidad por una hendidura diferente en la misma protema o en otras relacionadas.
Los terminos "ligando" o "fraccion de union", a efectos del presente, se refieren generalmente a una molecula que se une a una molecula diana concreta y forma un complejo unido como se ha descrito anteriormente. La union puede ser una union altamente espedfica. No obstante, en determinadas realizaciones, la union de un ligando individual a la molecula diana puede ser con una afinidad y/o especificidad relativamente baja. El ligando y su correspondiente molecula diana forman una pareja de union espedfica. Entre los ejemplos se incluyen, entre otros, pequenas moleculas organicas, azucares, lectinas, acidos nucleicos, protemas, anticuerpos, citoquinas, protemas receptoras, factores del crecimiento, protemas de union a acido nucleico y similares, que se unen espedficamente a las moleculas diana deseadas, a colecciones diana de moleculas, a receptores diana, a celulas diana y similares.
El termino "molecula organica pequena" se refiere a una molecula de un tamano comparable
al de las moleculas organicas generalmente utilizadas en el sector farmaceutico. El termino excluye las macromoleculas biologicas naturales (por ejemplo, protemas, acidos nucleicos, etc.). Las moleculas organicas pequenas preferibles tienen un tamano maximo aproximado de 5000 Da, mas preferiblemente de 2000 Da y mas preferiblemente de 1000 Da.
El termino "biblioteca de ligandos" se refiere a una coleccion (por ejemplo, a una pluralidad) de ligandos o potenciales ligandos. La biblioteca de ligandos puede ser una biblioteca ffsica real de ligandos y/o una base de datos (por ejemplo, una base de datos de compuestos que comprende descripciones de una pluralidad de potenciales ligandos, como MDL® Available Chemicals Directory, ChemSpider y similares).
El termino "SHAL" se refiere a una molecula que comprende una pluralidad de ligandos que se unen cada uno de ellos a una region diferente de la molecula diana a la que se dirige el SHAL. Los ligandos se unen directamente o a traves de un enlace para formar una fraccion polidentada que tfpicamente muestra una elevada avidez por la molecula diana. En determinadas realizaciones, el SHAL comprende dos o mas ligandos que se unen a su diana con baja afinidad (por ejemplo, <10"6M y/o se disocian en unos segundos o menos) que, cuando se unen, formal un SHAL que se une a la diana con una afinidad elevada (por ejemplo >10"6 M, o >10-7 M, o > 10"8 M y/o se disocian lentamente, por ejemplo en unas horas o dfas).
El termino "polidentado", cuando se utiliza con respecto a un SHAL, indica que el SHAL comprende dos o mas ligandos. Los ligandos tfpicamente se unen a diferentes partes de la diana a la que esta dirigida el SHAL.
Los terminos "bidentado", "tridentado", etc., cuando se utilizan con respecto a un SHAL, se refieren a
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SHAL que constan de dos ligandos, SHAL que constan de tres ligandos, etc.
El termino "SHAL polivalente" se refiere a una molecula en la que se unen dos o mas SHAL (por ejemplo, dos o mas SHAL bidentados). Asf, por ejemplo, un SHAL bivalente se refiere a una molecula en la que se unen dos SHAL. Un SHAL trivalente se refiere a una molecula en la que se unen tres SHAL, etc. Una version bivalente del SHAL bidentado JP459B se ilustra en la Figura 14.
Un "SHAL poliespedfico" son dos o mas SHAL unidos donde cada uno de los SHAL es polidentado y cualquiera de ellos o ambos pueden ser sintetizados polivalentes (o generados de otro modo), de forma que tengan dos o mas dianas para cada SHAL (conjunto de poliligandos). Por ejemplo, un SHAL puede ser sintetizado con dos o mas ligandos para las cavidades de HLA-DR y las cavidades de un CDXX, por ejemplo CD20 o CD22, o de los tres, etc. Otro ejemplo implica la union de un SHAL MUC-1 y un SHAL antilinfoma, porque algunos linfomas presentan una sobreexpresion de los receptores tradicionales de HLA-DR y CD y de MUC (regulacion al alza). Un SHAL sintetizado con dos o mas ligandos para las cavidades de HLA-DR y las cavidades para un quelato, por ejemplo DOTA, etc., donde en las dianas SHAL univalentes o bivalentes la celula maligna y el segundo modulo univalente o bivalente captura un agente administrado posteriormente, por ejemplo un radiometal quelado con DOTA o un profarmaco disenado para activar el farmaco transportado a la celula maligna por el primer SHAL.
El termino "in silico virtual" cuando se utiliza por ejemplo con respecto a los metodos de seleccion, se refiere a metodos que se llevan a cabo sin una seleccion ffsica real de las fracciones en cuestion. Tfpicamente la seleccion in silico virtual se realiza por medios informaticos, por ejemplo utilizando modelos de las moleculas de interes concretas. En determinadas realizaciones, los metodos virtuales se pueden realizar utilizando modelos ffsicos de las moleculas en cuestion y/o mediante una simple inspeccion visual y manipulacion.
La expresion "diana para un SHAL" se refiere a la fraccion a la que se va a unir espedficamente el SHAL bidentado o polidentado.
La expresion "un algoritmo que se encuentra en. . . ", por ejemplo "un algoritmo que se encuentra en SPHGEN", se refiere a un algoritmo que es aplicado por (que se encuentra en) el mencionado software. El algoritmo, sin embargo, puede ser aplicado manualmente o a traves de un programa distinto del mencionado software y continuar representando un uso de un algoritmo que se encuentra en el mencionado software.
El termino "hendidura" cuando se refiere a una hendidura en una protema quiere decir una cavidad,
indentacion o depresion en la superficie de la molecula de protema que se crea como resultado del pliegue de la cadena peptfdica en la estructura tridimensional que hace la protema funcional. Una hendidura se puede reconocer facilmente mediante la inspeccion de la estructura de la protema y/o utilizando softwares de modelado disponibles en el mercado (por ejemplo, DOCK).
El termino "marcadores cancengenos" se refiere a biomoleculas como protemas que son
utiles para el diagnostico y pronostico del cancer. A efectos del presente, "marcadores cancengenos" incluye, entre otros lo siguiente: PSA, gonadotropina corionica humana, alfa-fetoprotema, antfgeno carcinoembrionico, antfgeno cancengeno (CA) 125, CA 15-3, CD20, CDH13, CD 31,CD34, CD105, CD146, D16S422HER-2, fosfatidilinositol 3-quinasa (PI 3-quinasa), tripsina, complejo de tripsina-1 con alf(1)-antitripsina, receptor de estrogeno, receptor de progesterona, c-erbB-2, bc1-2, fraccion de fase sintetica (SPF), p185erbB-2, insulina de baja afinidad como protema de union a factor de crecimiento, factor de tejido urinario, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento epidermico, receptor del factor de crecimiento epidermico, protemas de apoptosis (p53,Ki67), factor VIII, protemas de adhesion (CD-44, sialil-TN, grupo sangumeo A, lacZ bacteriano, fosfatasa alcalina placentaria humana (ALP), alfa-difluorometilornitina (DFMO), timidina fosforilasa (dTHdPase), thrombomodulina, receptor de laminina, fibronectina, anticiclinas,
anticiclina A, B o E, antfgeno nuclear asociado a proliferacion, lectina UEA-1, CEA, 16 y factor de von Willebrand.
Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protema" se utilizan de forma intercambiable en el presente para referirse a un polfmero de residuos de aminoacidos. El termino se aplica a polfmeros de aminoacidos en los que uno o mas residuos de aminoacidos son un analogo qrnmico artificial del correspondiente aminoacido presente naturalmente, asf como de polfmeros de aminoacidos presentes naturalmente. El termino tambien incluye variantes en la union peptfdica tradicional que une a los aminoacidos que componen el polipeptido.
Los terminos "acido nucleico" u "oligonucleotido" o equivalentes gramaticales se refieren, a efectos del presente, al menos a dos nucleotidos unidos covalentemente. Un acido nucleico de la presente invencion es preferiblemente de cadena simple o doble y por lo general contendra enlaces de fosfodiester, aunque en algunos casos, como se senala mas adelante, se incluyen analogos de acido nucleico que pueden tener cadenas alternativas y que comprenden, por ejemplo, fosforamida (Beaucage et al. (1993)
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Tetrahedron 49(10): 1925) y las referencias a este; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81:579; Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:3487; Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805, Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; y Pauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26: 1419), fosforotioato (Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; y Patente USA N° 5 644 048), fosforoditioato (Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. Ill :2321, enlaces de O- metilfoforoamidita (vease Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A
Practical Approach, Oxford University Press), y enlaces y cadenas de acido nucleico peptidico (vease Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895; Meier et al. (1992) Chem. Int.
Ed. Engl. 31: 1008; Nielsen (1993) Nature, 365: 566; Carlsson et al. (1996) Nature 380: 207). Otros acidos nucleicos analogos incluyen aquellos con cadenas positivas (Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097; cadenas no ionicas (Patentes USA N° 5 386 023, 5 637 684, 5 602 240, 5 216 141 y 4 469 863; Angew. (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; Letsinger el al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597; Capttulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui y P. Dan Cook;
Mesmaeker et al. (1994), Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395; Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) y cadenas sin ribosa, incluyendo las descritas en las Patentes USA N° 5 235 033 y 5 034 506, y Capftulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed.
Y.S. Sanghui y P. Dan Cook. Los acidos nucleicos que contienen uno o mas azucares carbodclicos tambien estan incluidos en la definicion de acidos nucleicos (vease Jenkins et. al. (1995), Chem.
Soc. Rev. pp.169-176). Varios analogos de acidos nucleicos se describen en Rawls, C & E News, 2 de junio de 1997, pagina 35. Estas modificaciones de la cadena de ribosa-fosfato se pueden realizar para facilitar la adicion de fracciones adicionales como etiquetas, o para aumentar la estabilidad y la vida util de estas moleculas en entorno fisiologicos.
El termino "biotina" se refiere a biotina y biotinas modificadas o analogos de biotina que son capaces de unirse a avidina o a diversos analogos de avidina. La "biotina" puede ser, entre otras cosas, modificada mediante la adicion de uno o mas compuestos, habitualmente a traves de su residuo de carboxilo libre. Entre los derivados de biotina utiles se incluyen, entre otros, esteres activos, aminas, hidrazidas y grupos tiol que estan unidos con un grupo reactivo complementario como amina, un grupo alquilo o acilo, un grupo carbonilo, un haluro de alquilo o un aceptor tipo Michael en el polfmero o compuesto anadido.
La avidina, que se encuentra tipicamente en la clara de huevo, tiene una afinidad de union muy elevada con la biotina, que es una vitamina del complejo B (Wilcheck et al. (1988) Anal. Biochem, 171:1). La estreptavidina, obtenida de Streptomyces avidinii, es similar a la avidina, pero presenta una union tisular no espedfica inferior y, por tanto, a menudo se utiliza en lugar de la avidina. A efectos del presente, la "avidina" incluye todas sus formas biologicas sea en su estado natural o en sus formas modificadas. Las formas modificadas de la avidina que han sido tratadas para eliminar los residuos de carbohidrato de la protema ("avidina desglicosilada") y/o su carga altamente basica ("avidina neutra"), por ejemplo, tambien resultan utiles en la invencion.
A efectos del presente, el termino residuo se refiere a aminoacidos naturales, sinteticos o modificados.
A efectos del presente, un "anticuerpo" se refiere a una protema que consta de uno o mas polipeptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulinas o fragmentos de genes de inmunoglobulinas. Los genes de inmunoglobulinas reconocidos incluyen los genes de region contante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, asf como multitud de genes de region variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alpha, delta, o epsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Se sabe que una unidad estructural de inmunoglobulina tfpica (anticuerpo) comprende un tetramero. Cada tetramero se compone de dos pares identicos de cadenas polipeptfdicas, donde cada par tiene una cadena "ligera" (unos 25 kD) y una cadena "pesada" (unos 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una region variable de unos 100 a 110 o mas aminoacidos principalmente responsables del reconocimiento del antfgeno. Los terminos cadena ligera variable (Vl) y cadena pesada variable (Vh) se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente.
Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas como como una serie de fragmentos bien caracterizados producidos mediante digestion con diversas peptidasas. Asf, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces de disulfuro en la region bisagra para producir F(ab)'2, un dfmero de Fab que es por sf mismo una cadena ligera unida a Vh-Ch1 a traves de un enlace de disulfuro. El F(ab)'2 puede ser reducido en condiciones suaves para romper el enlace de disulfuro en la region diana, convirtiendo asf el dfmero (Fab')2 en un monomero Fab'. El monomero Fab' es basicamente un Fab con parte de la region bisagra (vease, Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), para obtener una descripcion mas detallada de otros fragmentos de anticuerpos). A pesar de que varios fragmentos de anticuerpos se definen en terminos de la digestion de un anticuerpo intacto, un experto en
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la tecnica apreciara que estos fragmentos Fab' se pueden sintetizar de novo por medios qmmicos o utilizando una metodologfa de ADN recombinante. Por tanto, a efectos del presente, el termino "anticuerpo" tambien incluye fragmentos de anticuerpo producidos mediante la modificacion de anticuerpos completos o sintetizados de novo utilizando metodologfas de ADN recombinante. Los anticuerpos preferibles incluyen anticuerpos de cadena simple (anticuerpos que existen como una cadena polipeptfdica simple), mas preferiblemente anticuerpos Fv de cadena simple (sFv o scFv) en los que una cadena pesada variable y una cadena ligera variable se unen (directamente o mediante un enlace peptfdico) para formar un polipeptido continuo. El anticuerpo Fv de cadena simple esta unido covalentemente al heterodfmero Vh-VI, que puede ser expresado por un acido nucleico que incluye secuencias de codificacion Vh- y Vl- unidas directamente o unidas a traves de un enlace que codifica peptidos. Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883. A pesar de que Vh y Vl estan conectados como una cadena polipeptfdica simple, los dominios Vh y Vl se asocian de forma no covalente. Las primeras moleculas del anticuerpo funcional en expresarse en la superficie del fago filamentoso fueron Fv de cadena simple (scFv); sin embargo, tambien han prosperado otras estrategias de expresion. Por ejemplo, las moleculas Fab se pueden presentar en un fago si una de las cadenas (pesada o ligera) se fusiona con una protema de capside g3 y la cadena complementaria es exportada al periplasma de una molecula soluble. Las dos cadenas se pueden codificar en el mismo replicon o en replicones diferentes; lo importante es que las dos cadenas del anticuerpo de cada molecula Fab se unan postranslacionalmente y que el dfmero se incorpore a la partteula de fago a traves del enlace de una o mas de las cadenas a, por ejemplo, g3p (vease, por ejemplo, la Patente USA N° 5733743). Los anticuerpos scFv y varias otras estructuras que convierten las cadenas polipeptfdicas pesada y ligera naturalmente agregadas pero qmmicamente separadas de la region V de un anticuerpo en una molecula que se pliega en una estructura tridimensional similar a la estructura de un punto de union de antfgeno son conocidos por los expertos en la tecnica (veanse, por ejemplo, las Patentes USA N° 5 091 513, 5 132 405 y 4 956 778). Los anticuerpos particularmente preferibles incluiran todos los que se han presentado en un fago o una levadura (por ejemplo, scFv, Fv, Fab y Fv con enlace de disulfuro (Reiter et al. (1995) Protein Eng. 8:1323-1331).
A efectos del presente, la expresion "se une espedficamente", cuando se refiere a un SHAL o a una biomolecula (por ejemplo, protema, acido nucleico, anticuerpo, etc.), se refiere a una reaccion de union que es determinante de la presencia del SHAL o biomolecula en una poblacion heterogenea de moleculas (por ejemplo, protemas y otras biologfas). Por tanto, en las condiciones designadas (por ejemplo, condiciones de ensayo de union en el caso de un SHAL, o condiciones de hibridacion rigurosas en el caso de un acido nucleico), el ligando especificado o SHAL se une de forma preferente a su molecula "diana" concreta y no se une de forma preferente a una cantidad importante de otras moleculas presentes en la muestra.
Un "efector" se refiere a cualquier molecula o combinacion de moleculas cuya actividad es recomendable para llegar hasta y/o localizar una diana (por ejemplo, en una celula que presenta un marcador caractenstico). Los efectores incluyen, entre otros, etiquetas, citotoxinas, enzimas, factores de crecimiento, factores de transcripcion, farmacos, ftpidos, liposomas, etc.
Un "reporter" es un efector que proporciona una senal detectable (por ejemplo, es una etiqueta detectable). En determinadas realizaciones, el reporter no necesita proporcionar la senal detectable por sf mismo, sino que simplemente proporciona una fraccion que posteriormente se puede unir a una etiqueta detectable.
El termino "sustitucion conservadora" se utiliza en relacion con las protemas o
peptidos para reflejar sustituciones de aminoacidos que no alteran sustancialmente la actividad (especificidad o afinidad de union) de la molecula. Tfpicamente, las sustituciones conservadoras de aminoacidos implican la sustitucion de un aminoacido por otro aminoacido con propiedades qmmicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). Los siguientes seis grupos contienen aminoacidos que son sustituciones conservadoras tfpicas entre sft 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Acido aspartico (D), Acido glutamico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).
Los terminos "marcador de epftopo" o "marcador de afinidad" se utilizan de forma intercambiable a efectos del presente y por lo general se refieren a una molecula o un dominio de una molecula que es espedficamente reconocido por un anticuerpo u otro vinculante de union. El termino se refiere tambien al complejo del vinculante de union. Asf, por ejemplo, la biotina o un complejo de biotina/avidina se consideran ambos un marcador de afinidad. Ademas de los epftopos reconocidos en interacciones de epftopo/anticuerpo, los marcadores de afinidad comprenden asimismo "epftopos" reconocidos por otras moleculas de union (por ejemplo, ligandos a los que se han unido receptores), ligandos a los que se han unido otros ligandos para formar heterodfmeros u homodfmeros, His6 a los que se ha unido Ni-NTA, biotina a la que se ha unido avidina, estreptavidina, o anticuerpos anti-biotina y similares.
Los marcadores epftopos son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Por otra parte, en el mercado hay disponibles anticuerpos espedficos para una amplia variedad de marcadores epftopos. Estos incluyen, entre otros, anticuerpos contra el epftopo DYKDDDDK (SEC. ID N°: l), anticuerpos c-myc
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(comercializados por Sigma, St. Louis), el epftopo del carbohidrato HNK-1, el epftopo HA, el epftopo HSV, los epftopos His4, Hiss, y His6 que son reconocidos por los anticuerpos espedficos para el epftopo His (vease, por ejemplo, Qiagen) y similares. Por otra parte, se comercializan vectores para protemas con marcadores de epftopos. Asf, por ejemplo, el vector pCMV-Tagl es
un vector marcador de epftopo disenado para la expresion del gen en celulas de mairftfero. Un gen diana insertado en el vector pCMV-Tagl puede ser marcado con el epftopo FLAG® (N-terminal, C-terminal o marcador interno), el epftopo c-myc (C-terminal) o tanto con el epftopo FLAG (N- terminal) como con el c- myc (C-terminal).
Un enlace tipo PEG se refiere a un enlace que contiene un glicol de polietileno (PEG).
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 ilustra un metodo para crear SHAL identificando ligandos individuales (azul) que se unen a dos puntos unicos de la superficie de una diana (por ejemplo, HLA-DR10 que incluye el epftopo Lym-1 (aminoacidos rojos, verdes, amarillos)) y unirlos sinteticamente para producir una molecula que se une a ambos puntos.
La Figura 2 ilustra el uso de microarrays tisulares que contienen, por ejemplo, una gran cantidad tanto de tejidos normales como de neoplasias linfocfticas. Estos tejidos pueden ser tratados con SHAL marcados con biotina, enjuagados por estreptavidina marcada con rodamina, y la union del SHAL se puede comprobar mediante microscopfa de fluorescencia.
La Figura 3 ilustra un microarray de tejido humano que comprende cores de tejido tenidos con eosina y hematoxilina, fijados con formalina e insertados en parafina. Los cuatro paneles se obtienen de una imagen unica digital de ScanScope. Esto ilustra la alta resolucion de la imagen archivada. Se pueden obtener imagenes similares para los estudios de union SHAL o inmunohistoqmmica.
De este modo, los investigadores que utilizan los arrays disponen de un facil acceso compartido a todos los estudios aplicados a los arrays.
La Figura 4A ilustra la organizacion del MUC-1 normal. El MUC-1 anomalo, tambien una buena diana, esta menos glicosilado, tiene un VNTR expuesto y una unidad de repeticion en tandem: 20
aa GVTSAPDTRPAPGSTAPPAH (SEC. ID. N°: 2). La Figura 4B ilustra las caractensticas
estructurales conservadas del dominio de repeticion en tandem de MUC-1. Estas caractensticas incluyen la repeticion y protuberancia de estructuras en forma de nudos que consisten en giros inversos secuenciales que abarcan interfaces de repeticion en tandem (residuos 17-27, 37-47) y una region ampliada que consiste en poliprolina II y estructura de cadena beta (residuos 10-15, 30-25, 50-55). Los residuos 2-3 del extremo N-terminal y C-terminal no estan ordenados debido a la ausencia de repeticiones en tandem contiguas.
La Figura 5 ilustra un array tisular de un cancer de prostata tenido con anticuerpos monoclonales antimud.
La Figura 6 muestra que el cancer de prostata presentaba una mayor tincion del peptido MUC-1 asociada con el grado y la fase.
La Figura 7 muestra un peptido core MoAb BrE-3 anti MUC1 que demuestra el epftopo
diana en un cancer de prostata de grado 4. Los nudos del MUC-1 difieren en los diferentes grados del cancer de prostata. Por consiguiente, se pueden disenar SHAL que se unen a los nudos y que se pueden utilizar para asignar un grado al tejido maligno.
La Figura 8 muestra la alineacion de la secuencia de aminoacidos de las moleculas de HLA-DR con estructuras de cristales conocidas. Los codigos PDB identifican las secuencias de moleculas HLA- DR1(1aqd), HLA-DR2(1bx2), HLA-DR3(1a6a) y HLA-DR4 (1dm5). 1i3r es una protema de fusion de MHC homologa. Hla_DR10:(SEC. ID. N°: 3), 1aqd_B:(SEC. ID. N°: 4), 1d5m_B(SEC. ID. N°: 5), 1bx2_B:(SEC. ID. N°: 6), 1a6a_B:(SEC. ID. N°: 7), 1i3r_B:(SEC. ID. N°: 8).
Figura9 Modelo de homologfa de la subunidad beta de HLA-DR10 que muestra los dos dominios estructurales (vease el color en el Apendice).
La Figura 10 muestra la superposicion de la estructura de cristal de HLA-DR3 (atomos transparentes, azul claro) y el modelo de homologfa de HLA-DR10 (atomos coloreados, azul oscuro) que demuestra la similitud estructural en la region de la subunidad beta que comprende el epftopo Lym-1. Los residuos de aminoacidos crfticos para la union de Lym-1 se muestran como atomos que rellenan los espacios.
La Figura 11 muestra graficos de superficie de subunidades beta de HLA-DR10 y HLA-DR3 que muestran las diferencias en la estructura de las "hendiduras" de la region de la protema que comprende el epftopo Lym-1. La distribucion de la carga se muestra en azul oscuro (positiva o basica), rojo (negativa o acida) y azul claro (neutra o hidrofoba). El atomo de azufre de la cistema se muestra en amarillo.
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La Figura 12 ilustra la ubicacion de dos "hendiduras", designadas punto 1 (rojo) y punto 2 (azul), que rodean a los aminoacidos cnticos para la union de Lym-1 (amarillo) a la
subunidad beta de HLA-DR10. Estos dos puntos eran las dianas para la union del ligando y se utilizaron en los estudios de docking por ordenador.
Las Figuras 13A y 13B ilustran SHAL bidentados sintetizados mediante combinacion
de los pares adecuados de los ligandos individuales identificados por unirse a HLA-DR10. La Figura 13a ilustra las tres moleculas. La Figura 13B ilustra dos SHAL, sintetizados mediante union de desoxicolato y 5-leu-encefalina, que han demostrado unirse a HLA-DR10 aislados con afinidades nM. La parte roja es un ligando (desoxicolato), la verde es el otro ligando (por ejemplo, 5-leu-encefalina), la azul es una lisina utilizada para producir en enlace mas corto, y la negra es una combinacion de cosas: las moleculas PEG usadas para alargar el enlace entre los dos ligandos, y una molecula de biotina unida al SHAL a efectos del ensayo.
La Figura 14 ilustra la estructura de una version bivalente de JP459B. El rojo es
desoxicolato; el verde es 5-le-encefalina; el azul es el conector de lisina; y el negro es el enlace PEG y biotina.
La Figura 15 ilustra un diagrama de flujo que describe los principales pasos de la elaboracion de modelos de protemas basados en homologfas.
La Figura 16 ilustra un algoritmo de DOCK. (1) Se genera una "imagen negativa" rellenando una hendidura de esferas. (2) Se recupera un ligando candidato de una base de datos. (3) Se equiparan las distancias internas entre un subconjunto de centros de esferas y atomos de ligandos (normalmente se eligen entre tres y ocho centros). (4) El ligando se orienta hacia el punto activo. (5) La interaccion para esa orientacion es evaluada mediante una funcion de puntuacion; el proceso se repite para otras orientaciones —tfpicamente se generan 10 000 orientaciones por ligando. La orientacion con la puntuacion mas alta se conserva. El proceso se repite para un nuevo ligando de la base de datos.
Las Figuras 17A y 17B ilustran la union de SHAL JP459B a celulas que presentan HLA-DR10. La Figura 17A ilustra la union aumentada de SHAL JP459B y Lym-1 Mab en el linfoma de celulas grandes en comparacion con el linfoma de celulas pequenas (paneles A-D) y la union selectiva de celulas Raji vivas (cristal tenido de violeta) pero de ningun otro tipo de celulas en las placas recubiertas con peroxidasa de rabano-estreptavidina (SHRP) y SHAL biotinilado (paneles E-H). (paneles A-D) Los SHAL fueron preincubados con SAHRP y detectados mediante reactivo DAB. La union de Lym-1 se detecto con un MAb anti-raton biotinilado, seguido de SAHRP y DAB. Panel A) SHAL en linfoma de celulas grandes Panel B) SHAL en linfoma de celulas pequenas Panel C) Lym-1 MAb en linfoma de celulas grandes y Panel D) Lym-1 MAb en linfoma de celulas pequenas. (Paneles E-H) Las imagenes muestran la union selectiva de SHAL JP459B a celulas Raji vivas (Panel E), pero no a las lmeas de celulas no de linfoma LnCAP (Panel F), 22RV (Panel G) o DU145 (Panel H). La Figura 17B muestra que SHAL JP459B se une unicamente a celulas tumorales cultivadas vivas que contienen HLA-DR10. , las placas se recubren con estreptavidina hasta el dfa siguiente, se lavan y se anade el SHAL, se incuban durante dos horas y, a continuacion, se lavan de nuevo para retirar el SHAL no adherido. A continuacion se anaden las celulas. Las celulas se lavan y se tinen con Cresyl Violet.
La Figura 18 muestra una seccion de tejido de linfoma NH que ilustra que la tincion con JP459B de las celulas de linfoma se localiza en la membrana celular.
La Figura 19 ilustra una biodistribucion 111In-DOTA [SHAL 070804(LeacPLD)2LPDo] en ratones con tumores en Raji.
La Figura 20 ilustra la union de SHAL bidentado univalente y SHAL bidentado bivalente 070804LeacPLDB a celulas Raji en presencia y ausencia de anticuerpo Lym-1.
La Figura 21 ilustra diversas clases de dianas SHAL.
La Figura 22 ilustra SHAL unidos a DOTA. La parte roja es un ligando (desoxicolato), la verde es el otro ligando (5-leu-encefalina), la azul es una lisina utilizada para producir el enlace mas corto, y la negra es una combinacion de cosas: las moleculas PEG empleadas para alargar el enlace entre los dos ligandos, un anillo DOTA unido a SHAL para unir el metal radioactivo.
La Figura 23 muestra formulas para SHAL JP7001.2 y triyodotironina-desoxicolato.
Las Figuras 24A y 24B muestran estructuras qmmicas en dos dimensiones y acronimos para el SHAL tridentado (Figura 24A) DvLPLLCtPCbPLDo; (dabsil-L-valina PEG lisina lisina 3-(2-([3-cloro-5- trifluorometil)-2-piridinil]oxi)-anilino)-acido 3-oxopropanionic PEG 4-[4-(4-clorovencilo)piperazino]-3-acido nitrobencencarboxflico lisina-DOTA con el ligando Ct (Figura 24Ainsert); y el SHAL tridentado dimerico (Figura 24B) (DvLPLLCtPCbPPP)2LLDo; ((dabsil-L-valina PEG lisina lisina 3-(2-([3- cloro-5-trifluorometil)- 2-piridinil]oxi)-anilino)-3-acido oxopropanionico PEG 4-[4-(4- clorobencil)piperazino]-3-acido nitrobencencarboxflico PEG PEG PEG)2 lisina lisina- DOTA. En diversas realizaciones, los SHAL
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biotinilados analogos difieren unicamente con respecto a la sustitucion de biotina para el quelato DOTA, en la parte superior derecha de cada SHAL.
Las Figuras 25A y 25B ilustran estructuras de SHAL dimerico SHAL (DvLPBaPPP)2LLDo (Figura 25A) y el analogo de hexa-arginina(DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo (Figura 25B).
Las Figuras 26 ilustran la union de SHAL radioetiquetado 111In (DvLPBaPPP) 2LLDo y su analogo de hexa-arginina (DvLPBaPPP) 2LArg6AcLLDo a celulas Raji. Total 111In- (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo unidos a celulas Raji (sin lavar), cuadrados coloreados; total 111In-(DvLPBaPPP)2LLDo unidos a celulas Raji (sin lavar), cuadrados sin colorear. Los pellets celulares que conteman 106 celulas fueron resuspendidos en 150pl de solucion tampon 5%BSA/PBS que contema 0-25ng de SHAL 111In etiquetado y se incubaron en RT durante una hora. Las muestras se centrifugaron para separar las celulas del supernatante y ambas se contaron en un contador de pocillos gamma calibrado para cuantificar los SHAL unidos y no unidos. Se incluyen barras de error para cada punto de datos, aunque en la mayona de los casos el error es inferior al punto de datos y la barra de error no es visible.
La Figura 27 muestra la microscopfa confocal en 3-D fluorescente de la union de SHAL matriz (DvLPBaPPP)2LLDo (fila superior) a celulas Raji vivas en comparacion con el analogo de hexa-arginina (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo (fila media). Se muestran los dos planos focales de media celula en las celulas Raji (izquierda a derecha). Las celulas de Jurkat tratadas con (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo (panel izquierdo, fila inferior) muestran una absorcion de SHAL minima. Lym-1 (panel derecho, fila inferior) muestra principalmente la union de la membrana de superficie celular a celulas Raji. El SHAL matriz muestra union intracelular, mientras que el analogo de hexa-arginina demuestra no solamente
la union citoplasmica marcada, sino tambien orientacion intranuclear. DAPI se utiliza como tincion nuclear y AlexaFlor 6l0 demuestra la ubicacion de SHAL en estas imagenes con laser secuencial fusionadas.
Figura 28. La estructura del SHAL tridentado que contiene el ligando Ct mostrado como una estructura esquematica en 2D (arriba) y como una estructura molecular en 3D con los espacios rellenos (abajo). Los ligandos utilizados para producir este SHAL fueron dabsil-L-valina (Dv), 4-[4-(4-clorobencilo)piperazina]- acido 3-nitrobencencarboxflico (Cb) y (3-(2-([3-cloro-5- trifluorometil)-2-piridinil]oxi)-anilino)-acido 3- oxopropanionico) (Ct). El primer residuo de lisina proporciono una amina libre para la union covalente de fracciones como macrociclos de union a metales y biotina. Se utilizaron otros residuos de lisina para crear puntos ramificados en el enlazador y se utilizaron monomeros PEG para proporcionar la distancia adecuada entre los ligandos. Los tres ligandos se identificaron por docking en las cavidades en la subunidad beta de HLA-DR10, donde el hecho de flanquear el aminoacido arginina 70 resulto cntico para la union de Lym-1 y la citotoxicidad. Se pueden incorporar moleculas funcionales en posiciones concretas a lo largo del enlazador, insertando residuos de lisina adicionales y uniendolos a la amina epsilon libre de la lisina primaria.
Figura 29. Titulacion de la actividad citotoxica de SHAL en HLA-DR10 humano en la lmea celular Raji expresando celulas de linfoma. El numero absoluto de celulas no viables se observo 1,2 o 3 dfas despues de la adicion de SHAL a las concentraciones mostradas. A los dos dfas se determino que el umbral de SHAL y las concentraciones de IC50 eran de 0,7 y 2,5 nM (medios pm/ml), respectivamente (media ± desviacion tfpica).
Figura30. Prueba fotografica de curacion en un raton con un xenoinjerto de Raji;
antes del tratamiento con SHAL (arriba), una semana despues de la dosis inicial y de una segunda dosis de 100 ng de SHAL intraperitoneal (i.p.). Tres semanas despues de la dosis inicial, el xenoinjerto habfa experimentado una regresion completa, lo que represento una curacion que persistio durante el periodo de observacion del raton (>84 dfas; mas bajo).
Figura31. Efecto de supervivencia total del SHAL en ratones con xenoinjertos de linfoma de Raji o Jurkat establecidos. Los ratones con xenoinjertos de Raji o Jurkat fueron tratados con 100 ng de SHAL i.p., una vez a la semana durante tres semanas consecutivas, o no recibieron tratamiento alguno. Los ratones con xenoinjertos de Raji (cfrculo coloreado) presentaron la supervivencia mas prolongada, mientras que los ratones con xenoinjertos de Jurkat tratados (cuadrado) no sobrevivieron mas de 56 dfas. Dos ratones no tratados (cfrculo vado) con xenoinjertos aumentando de tamano sobrevivieron 84 dfas.
Figura 32. Micrograffas de electrones de los xenoinjertos de Raji realizadas con un raton no tratado y un raton 24 horas despues del tratamiento con SHAL. Las estructuras celulares fueron normales para este xenoinjerto agresivo, no tratado (izquierda), mientras que las celulas del xenoinjerto tratado con SHAL presentaban una cromatina condensada y fragmentada y perdida de estructuras citoplasmicas coherentes con la muerte autofagica (derecha) (barra, 5 pm).
Descripcion detallada
Esta invencion se refiere al desarrollo de una nueva clase de moleculas de union definidas en las reivindicaciones, que se pueden utilizar para la union espedfica a practicamente cualquier molecula diana. Esta clase de moleculas de union se denominan en el presente ligandos de alta afinidad selectivos polidentados (SHAL). Los SHAL se pueden utilizar de manera analoga a los anticuerpos en una amplia
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variedad de contextos, entre los que se incluyen, entre otros, para capturar reactivos en columnas de afinidad para la purificacion de materiales biologicos o de otro tipo, como agentes de union en biosensores, agentes para la union de nanopartfculas o nanomaquinas, con fines de diagnostico y terapeuticos.
Los SHAL tambien se pueden utilizar para detectar firmas moleculares que pueden distinguir entre diversos tipos de patogenos o cepas. Los SHAL tambien se pueden utilizar en aplicaciones de biodefensa para la deteccion de firmas proteicas unicas presentes en toxinas y en las superficies de organismos patogenos, asf como para distinguir estos agentes de bioamenaza de los materiales no peligrosos naturalmente presentes. Dado que los SHAL pueden ser relativamente estables cuando se exponen al entorno, resultan particularmente adecuados para el uso en biosensores para aplicaciones de biodefensa y diagnostico, entre otras.
En determinadas realizaciones preferibles, los SHAL estan disenados para ser utilizados en el diagnostico y/o tratamiento del cancer. En estas realizaciones, los SHAL estan dirigidos a puntos unicos y/o espedficos (por ejemplo, marcadores espedficos del cancer) que se encuentran en las superficies de las celulas cancerosas (por ejemplo, diversas celulas malignas).
En determinadas realizaciones, los SHAL pueden tener un efecto terapeutico cuando se administran per se (por ejemplo, de manera analoga al terapeutico con anticuerpos Herceptin™). Un SHAL, como un anticuerpo, puede tener un efecto directo sobre una celula maligna que provoca la muerte celular, porque el SHAL actua como agonista contra una via normal, iniciando asf o bloqueando funciones celulares cnticas y causando la muerte de la celula maligna. Un SHAL tambien puede actuar como una vacuna porque facilita la identificacion de la celula maligna, bien porque representa un marcador de superficie celular anomalo o porque intensifica un marcador habitual de las celulas malignas.
Adicional, o alternativamente, el/los SHAL se pueden utilizar como diana (cuando se unen a la celula diana) o como vehuculos (fracciones de union) para otros efectores, entre los que se incluyen, entre otros, agentes como agentes citotoxicos, marcadores para la identificacion por el sistema inmunitario, etiquetas detectables (para la captura de imagenes) y similares.
Los radioisotopos son ejemplos atractivos de efectores citotoxicos que se pueden unir al vehuculo SHAL para administrar una radioterapia selectiva a la celula o celulas malignas.
Esta terapia se puede administrar en forma de terapia de agente unico o en combinacion con reconstitucion medular, a fin de conseguir una mayor intensidad de la dosis, u otros farmacos que puedan mejorar los efectos de la radiacion de la celula maligna. A pesar de que existen multiples farmacos diferentes, quimioterapeuticos y biologicos entre otros, que se pueden combinar con el SHAL, los taxanos son un ejemplo atractivo.
Entre los ejemplos de agentes citotoxicos se incluyen radioisotopos, inmunotoxinas, quimioterapeuticos, inhibidores de enzimas, biologicos, etc. Entre los ejemplos interesantes se incluyen las senales apoptoticas y enzimas como las caspasas. Los radioisotopos representan agentes citotoxicos interesantes que han demostrado ser efectivos conjuntamente con sistemas de anticuerpo-antfgeno y ligando-receptor. A efectos de tratamiento, de acuerdo con la presente invencion, se considera que, en algunas realizaciones, es preferible etiquetar con un emisor de partfculas como beta-,beta + (positron). En algunos casos resulta apropiado etiquetar con un emisor alfa o emisor de electrones Auger. Existen multiples ejemplos de radioisotopos terapeuticos, incluyendo el itrio-90 o yodo-131 que generan un gran interes en la actualidad.
Para determinados propositos de captura de imagenes, de acuerdo con la presente invencion, se considera que el tecnecio-99, indio-111, yodo-123 o yodo-131 resultan atractivos para la captura de imagenes de foton unico, mientras que es probable que los emisores beta+ (positrones) como el cobre-64, itrio-86, galio-68, etc., resulten particularmente atractivos cuando se unen a un SHAL con fines de diagnostico.
Un SHAL se compone de dos o mas ligandos (tambien denominados fracciones de union) que se unen directamente o a traves de un enlace para generar una molecula "polidentada" core (SHL) que ha sido disenada para unirse de forma espedfica a practicamente cualquier diana deseada (por ejemplo, puntos unicos o espedficos (hendiduras) de una molecula de superficie de una celula maligna diana). Los ligandos (fracciones de union) que comprenden el SHAL pueden incluir basicamente cualquier fraccion capaz de unirse a un punto de la diana. Estas fracciones de union pueden incluir, entre otros, diversos qmmicos (por ejemplo, moleculas organicas pequenas), protemas, azucares, carbohidratos, lectinas, lfpidos, metales, acidos nucleicos, analogos de acidos nucleicos y peptfdicos, y similares.
Aunque no es necesario, los ligandos individuales que comprenden el SHAL a menudo presentan una afinidad relativamente baja (por ejemplo, inferior a aproximadamente 10'6 M) con la diana. Por el contrario, el SHAL polidentado (que comprende una pluralidad de ligandos) tfpicamente muestra una avidez relativamente alta (por ejemplo, mayor que 10-6 M, preferiblemente mayor que 10-8 o 10-9 o 10-10 M, mas preferiblemente mayor que 10-11M, y todavfa mas preferiblemente mayor que 10-12 M, aproximadamente).
En determinadas realizaciones, donde la diana a la que se va a dirigir el SHAL es una protema, los
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ligandos que comprenden el SHAL se pueden seleccionar para unirlos a determinados puntos no- funcionales de la protema. Normalmente una protema tiene una serie (algunas mas de 50) de "hendiduras" o cavidades distribuidas por su superficie. Estas cavidades se producen cuando la protema se pliega en una estructura tridimensional para hacer la protema funcional. Esta observacion permite plantearse el diseno de SHAL que exhibe una especificidad de union mucho mayor para una protema determinada de lo que se podfa hasta ahora. Al unir dos fracciones que se unen a hendiduras unicas de la superficie de una protema solo con afinidades micromolares, resulta posible disenar moleculas polidentadas (SHAL) que se unen con afinidades nanomolares a picomolares y que son altamente selectivas y no presentan reacciones cruzadas con otras moleculas relacionadas funcionalmente. En el caso de las protemas con una estructura conocida o predicha, se pueden utilizar metodos computacionales para generar un mapa tridimensional de la superficie molecular e identificar hendiduras de un tamano adecuado que sean estructuralmente unicas para esa protema tal y como se ha descrito en el presente.
Se puede realizar una seleccion en bases de datos que contienen las estructuras de moleculas pequenas conocidas para determinar su capacidad para unirse a hendiduras de la protema diana utilizando un programa "docking". A continuacion, se puede someter a ensayo a los principales candidatos utilizando diversas tecnicas experimentales, como las descritas en el presente, para identificar las moleculas que realmente se unen a la protema, asf como aquellas que no se unen al punto correcto. Los pares o tripletes de ligandos (por ejemplo, uno de cada grupo) se pueden unir a continuacion a los extremos opuestos de un enlace de longitud adecuada, utilizando un qmmico en fase de solucion o solido para generar SHAL bidentados (Figura 1) o SHAL tridentados. A continuacion, los SHAL con una afinidad mas elevada y mas selectivos se pueden identificar realizando estudios de union convencionales.
Resulto sorprendente descubrir que la union de dos o mas ligandos pequenos que se unen ligeramente a la diana (por ejemplo, una protema) y que presentan una selectividad escasa o insuficiente puede resultar en la produccion de una molecula que se une a su diana prevista (por ejemplo, una protema diana) con una magnitud entre tres y seis veces mayor y con elevada selectividad.
Sin animo de limitarse a una teona concreta, se cree que a pesar de que cabna esperar que la presencia de dos o mas ligandos en el SHAL aumente las probabilidades de que la molecula se pueda unir a una variedad mas amplia de protemas, hemos observado que esta union noespedfica es debil (aproximadamente la misma que en el caso del ligando libre) y las moleculas unidas a protemas no diana solo a traves de uno de los ligandos no permaneceran unidas durante mucho tiempo. La afinidad y selectividad mejoradas observadas cuando los dos ligandos de un SHAL bidentado o todos los ligandos que comprenden un SHAL polidentado se unen a sus respectivas dianas (por ejemplo, a las hendiduras de una protema diana) se debe a tres factores que estan relacionados con la naturaleza de la interaccion SHAL-diana: En primer lugar, la presencia del enlace impide que los ligandos individuales que comprenden el SHAL que se disocian de su diana se aparten de la superficie diana, aumentando de forma notable la cantidad de ligandos libres que se vuelven a unir. En segundo lugar, la reduccion de la tasa de liberacion del SHAL bidentado o polidentado viene dada por el hecho de que la probabilidad de que los dos ligandos (o todos) que comprenden el SHAl se liberen de forma simultanea de su diana es notablemente inferior que la probabilidad de que se libere uno. La separacion entre los ligandos que comprenden el SHAL, que viene determinada por el qmmico de union (por ejemplo, el enlazador), permite que los ligandos que comprenden el SHAL se unan simultaneamente a su diana unicamente cuando los ligandos estan separados por la distancia correcta. Si algun ligando del SHAL se une independientemente a otra diana, su escasa afinidad (una afinidad micromolar de 1-10 es la tfpica en los ligandos que identificamos) provocana que el ligando se desprendiese rapidamente (la tasa de liberacion sena elevada). Por tanto, la unica situacion en la que el SHAL bidentado o polidentado se unina estrechamente a la diana prevista (afinidad nanomolar o superior) sena aquella en la que los dos ligandos que comprenden el SHAL se unen simultaneamente a la molecula diana (por ejemplo, protema diana). Una vez que los dos ligandos o todos ellos se han unido, la tasa de liberacion de la molecula entera (el SHAL) se reducina de forma drastica. Si se seleccionan correctamente los puntos de union del ligando (por ejemplo, seleccionando regiones con diferentes secuencias de aminoacidos o estructuras en el caso de una protema diana), resulta altamente improbable que se encuentren puntos identicos en otra diana separada por la misma distancia. Si se diese este hecho extremadamente improbable, se puede identificar un punto de union adicional del ligando (por ejemplo, un tercer punto de union adyacente al Punto 1 y al Punto 2), y se puede incorporar un ligando adicional al SHAL (por ejemplo, para crear un SHAL tridentado, cuatridentado, etc.).
Los SHAL ofrecen ciertas ventajas respecto a los anticuerpos, particularmente en aplicaciones terapeuticas y/o de diagnostico. Tfpicamente, los SHAL tienen un tamano significativamente menor que los anticuerpos. Por consiguiente, pueden conseguir una mayor penetracion en el tumor. En determinadas realizaciones, tambien son capaces de cruzar la barrera hematoencefalica, por ejemplo para el tratamiento de tumores cerebrales. Se cree que los SHAL tambien suelen ser menos inmunogenicos que los anticuerpos y a menudo se eliminan de la circulacion mas lentamente.
En determinadas realizaciones, los SHAL descritos en el presente son tipicamente polidentados, es decir que el SHAL comprende dos o mas ligandos, que se unen directamente o traves de uno o mas
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enlazadores. En determinadas realizaciones, los ligandos se unen a diferentes partes de la diana (por ejemplo, diferentes epttopos de una unica protema) a la que va dirigido el SHAL. En determinadas realizaciones, los ligandos se unen a diferentes moleculas, por ejemplo diferentes marcadores del cancer de una celula cancengena, a diferentes protemas que comprenden un receptor y similares. En determinadas realizaciones, se pueden utilizar SHAL poliespedficos para la reticulacion del mismo o diferentes antigenos de la misma celula, mejorando asf la transduccion de la senal, o para una preseleccion de la diana, por ejemplo cuando un SHAL esta disenado para focalizar celulas malignas y esta unido a otros SHAL disenados para "atrapar" un vefuculo administrado posteriormente de un agente citotoxico (por ejemplo, radiometal quelado, etc.), para llevar una celula inmunologicamente activa (por ejemplo, un macrofago, celula T, etc.) al punto, para activar un profarmaco en el SHAL focalizado, etc.
En determinadas realizaciones, esta "especificidad multiple" se consigue mediante el uso de SHAL polivalentes. Los SHAL polivalentes son moleculas en la que se unen dos o mas SHAL (por ejemplo, dos o mas SHAL bidentados). Los diferentes SHAL que comprenden el SHAL polivalente se pueden dirigir a la misma diana o a dianas diferentes, por ejemplo como se ha descrito anteriormente.
(a)Construccion de los SHAL
Los SHAL de esta invencion se crean identificando ligandos (fracciones de union) que se unen, y en algunas realizaciones se unen espedficamente (o preferencialmente), a diferentes regiones de la molecula o moleculas diana. Los ligandos que se unen a diferentes regiones de las moleculas diana se unen a continuacion directamente o a traves de un enlazador para producir un SHAL bidentado que comprende dos fracciones de union diferentes o un SHAL polidentado que comprende dos o mas fracciones de union diferentes. A continuacion el SHAL se puede seleccionar por su capacidad para unirse a la diana prevista.
La identificacion inicial de ligandos que se unen a diferentes regiones de la diana se puede realizar utilizando metodos in silico virtuales (por ejemplo, metodos computacionales) y/o metodos empmcos, por ejemplo como los descritos en el presente.
Una vez que se han identificado dos o mas ligandos adecuados (fracciones de union), pueden, opcionalmente, ser seleccionados (validados) por su capacidad para unirse a la diana en diferentes puntos.
A continuacion, los ligandos de union adecuados se pueden unir directamente o a traves de un enlace para formar un SHAL bidentado o polidentado que despues se puede seleccionar, opcionalmente, por su capacidad para unirse a la diana.
A)Seleccion de la diana
Virtualmente cualquier molecula, receptor o combinacion de moleculas puede servir de diana para un SHAL (vease, por ejemplo, la Figura 2l). La seleccion de la diana viene determinada por la aplicacion para la que esta previsto utilizar el SHAL. Asf, por ejemplo, cuando el SHAL se va a incorporar a una columna de afinidad (por ejemplo, para purificar una protema o acido nucleico), la diana es la molecula (por ejemplo, protema, acido nucleico, etc.) que se va a purificar utilizando la columna de afinidad que comprende el SHAL.
Cuando se va a utilizar el SHAL en el tratamiento y/o diagnostico de un cancer,
la diana es tfpicamente una molecula, coleccion de moleculas, receptor, enzima u otra estructura caractenstica del cancer (por ejemplo, que permite que el SHAL se una preferentemente a la celula cancengena con respecto a una celula sana normal).
Los expertos en la tecnica conocen los diversos marcadores espedficos del cancer.
Estos marcadores incluyen, entre otros, el epftopo Lym-1, Muc-1, C-myc, p53, Ki67, erbB-2, Her2, Her4, BRCA1, BRCA2, Lewis Y, CA 15-3, G250, el antfgeno de superficie celular HLA-DR, CD2, CD3, CD7, CD19, CD20, CD22, integrina, EGFr, AR, PSA, antfgeno carcinoembrionico (CEA), el antfgeno de superficie celular L6 (vease, por ejemplo, Tuscano et al. (2003) Neoplasia, 3641-3647; Howell et al. (1995) Int J Biol Markers 10:126-135; Marken et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:3503-3507,1992), receptores del factor de crecimiento y/o diversas dianas intracelulares (por ejemplo, receptores, acidos nucleicos, fosfoquinasas, etc.) y similares.
En determinadas realizaciones, se pueden generar SHAL para protemas diana de la membrana de la superficie celular que influyen en funciones intracelulares, promoviendo asf estas funciones (agonista) o inhibiendo estas funciones (antagonista) al bloquear otra union molecular o causar una senal intracelular inhibitoria o mejorada, como senales de fosfoquinasa.
Los SHAL se pueden generar para protemas diana de la membrana de la superficie celular, tales como antfgenos y anticuerpos que se pueden internalizar en la celula. Al igual que los anticuerpos que focalizan la interiorizacion de antfgenos y los ligandos peptfdicos que focalizan la interiorizacion de receptores, estos SHAL seran interiorizados en la celula en la que pueden tener efectos agonistas o antagonistas sobre funciones celulares cnticas como protooncogenes, fosfoquinasas, lisosomas y ADN/ARN/ARNm por
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sus funciones agonistas o antagonistas o porque administran una carga de toxina o radioisotopo. Los SHAL apuntan varias ventajas con respecto a los anticuerpos y ligandos peptidicos. Tienen un tamano pequeno y el rango de carga que se puede utilizar para permitir el libre movimiento hacia y en el interior de la celula cuando una molecula intracelular es la diana principal.
Los SHAL se pueden utilizar para seleccionar preferentemente celulas espedficas por las dianas de su membrana y, tras la disociacion de la membrana de la superficie celular diana pueden moverse libremente a traves de la membrana de la superficie celular para acceder al interior de la celula. Se puede producir un SHAL multiespedfico de forma que cuando se internalice, o cuando se disocie y penetre por la membrana de la superficie celular, la segunda especificidad pueda permitir la focalizacion de las moleculas internas de la celula, como fosfoquinasas, enzimas liposomales, receptores de hormonas, productos proteicos de un gen y protooncogen, ADN/ARN/ARNm y similares. En determinadas realizaciones, se pueden generar SHAL uniespedficos pero multivalentes enfocados a las moleculas de la superficie celular y, al mismo tiempo, y reticular estas moleculas dando lugar a los efectos biologicos mejorados que han sido descritos para los sistemas reticulados antigeno-anticuerpo.
A diferencia de los anticuerpos y ligandos peptfdicos que tfpicamente no se pueden penetrar directa y facilmente en las membranas de la superficie celular, debido al pequeno tamano de los SHAL, y la capacidad para seleccionar el caracter hidrofobo o hidrofilo del SHAL, se pueden producir SHAL capaces de penetrar en la membrana celular y diversos compartimentos intracelulares. Esto hace que resulte posible generar SHAL espedficamente al objeto de llegar hasta moleculas intracelulares de importancia para la funcion celular, como protooncogenes, fosfoquinasas, enzimas lisosomales y otras enzimas, ADN/ARN/ARNm, etc. Esta capacidad hace posible focalizar todas las clases de moleculas intracelulares de importancia cntica para la funcion celular, una capacidad que previamente no se podfa conseguir por moleculas diana espedficas. Ademas de dirigir los efectos de estos SHAL, se pueden utilizar como vehmulos de cargas como las que se describen en el presente documento.
Los productos de protooncogenes son un ejemplo de una clase de dianas intracelulares a las que se pueden focalizar los SHAL y generar un efecto util en el tratamiento del cancer. Cabe senalar que las protemas Ras, codificadas por protooncogenes, han actuado como dianas in vitro por los anticuerpos inyectados en las celulas y este bloqueo ha dado lugar a celulas que ya no se dividen. La mutacion se ha relacionado con una actividad de control mermada de estos productos.
Muchas vfas de senalizacion son susceptibles de interferencia al focalizar el SHAL en un paso (directamente intracelular) o dos pasos (focalizacion de membrana seguida por internalizacion) de las moleculas intracelulares. Estas incluyen, entre otras, vfas fundamentales como senales de protema "G" y la actividad de protema quinasa espedfica de tirosina, como EGFR, Neu, etc. Las multiples intervenciones del receptor de hormonas tambien se pueden focalizar por los SHAL para crear un cambio en la funcion celular y/o el crecimiento celular. Se puede producir la union a dianas de hormonas o enzimas y bloquearse la funcion. Los bloqueos del receptor de hormonas que pueden resultar utiles incluyen el uso de SHAL para bloquear la union de moleculas similares al ER (receptor de estrogeno) y efectos similares al AR (receptor de androgeno). Esto a su vez interferina con la union de ADN del complejo, con la interferencia resultante en la viabilidad y el crecimiento de las celulas tumorales sensibles a hormonas.
Esta divulgacion tambien contempla el uso de SHAL para tratar enfermedades infecciosas (por ejemplo, SIDA, gripe, etc.) mediante la union primaria del agente infeccioso y/o mediante bloqueo de la invasion celular, y/o mediante el bloqueo de vfas metabolicas cnticas para la propagacion del agente infeccioso (por ejemplo, bloqueando CCR5 para evitar la infeccion VIH de las celulas).
Cuando la diana a la que esta dirigido el SHAL comprende una protema, en determinadas divulgaciones, al menos uno de los ligandos (fracciones de union) que comprende el SHAL se une a una hendidura de la protema. En determinadas divulgaciones, al menos dos de las fracciones de union que comprenden el SHAL se unen a hendiduras de la protema y estos dos ligandos se unen a hendiduras diferentes. En determinadas divulgaciones, todos los ligandos que comprenden el SHAL se unen a hendiduras en la protema diana. Esto no sugiere que todos los ligandos que comprenden el SHAL se deban unir a hendiduras de protemas. Se contemplan determinadas divulgaciones donde un ligando se une a una hendidura y otro ligando se une a una region que no es una hendidura o en las que ninguno de los ligandos se unen a una hendidura.
Cuando no se dispone de informacion estructural para una diana concreta (por ejemplo, un marcador del cancer o un dominio o epftopo dentro de un marcador cancengeno), entonces la diana o dominio dentro de la diana se puede modelar para identificar puntos de union de ligandos para el diseno de un SHAL para esta diana espedfica. Si la diana se ha caracterizado estructuralmente, entonces la estructura cristalina o NMR de las moleculas relacionadas se puede utilizar de esta manera. En caso de que no se disponga de informacion, una circunstancia menos usual, se pueden emplear enfoques empmcos para identificar los ligandos adecuados para la construccion de un SHAL como el descrito aquf
Los planteamientos empmcos descritos aquf tambien se pueden utilizar para acelerar el proceso de desarrollo del SHAL. En esta circunstancia, la elaboracion de modelos y otros pasos analtticos se pueden realizar tras el desarrollo empmco de un SHAL deseado para comprender mejor el SHAL y/o para guiar las generaciones posteriores de desarrollo del SHAL.
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Aunque los ejemplos ilustran una realizacion preferible en la que el SHAL
esta previsto como vehmulo para la captura de imagenes y radioisotopos terapeuticos, como indio-111 e itrio-90, para el diagnostico y tratamiento, y la diana prevista es la molecula de superficie celular HLA-DR que se encuentra en linfocitos B malignos y normales, y por tanto resultan utiles en la mayona de los linfomas y leucemias, cabe senalar que esta es solo una de las multiples realizaciones incluso por lo que respecta a las leucemias y linfomas de celulas B. Por ejemplo, se conocen anticuerpos para identificar varios otros antigenos de superficie celular que resultan atractivos para actuar sobre leucemias y linfomas de celulas B. Estos tambien se podnan utilizar para los mismos fines y de la misma manera que los del HLA-DR. Tambien es interesante senalar que la region focalizada por los SHAL disenados para actuar sobre el HLA-DR se encuentra en el area de la fosa conocida para la presentacion del peptido de importancia para la identificacion inmunitaria y el rechazo. Mas importante aun es que los antigenos y epftopos han sido caracterizados y se ha demostrado que son importantes para la focalizacion de anticuerpos de adenocarcinomas de todo tipo, incluyendo patologfas malignas de mama, prostata y colon. Las mucinas aberrantes de los adenocarcinomas y los CEA encontrados abundantemente en multiples adenocarcinomas tambien proporcionan dianas atractivas que han sido bastante bien caracterizadas.
En determinadas realizaciones, se cree que la repeticion en tandem de la protema core de la mucina (MUC1) (vease, por ejemplo, la Figura 4) proporciona una buena diana para los SHAL focalizados al cancer. Se ha demostrado que MUC-1 se regula al alza y se encuentra facilmente presente en canceres epiteliales, como cancer de prostata, mama, colon y ovarios (veanse, por ejemplo, las Figuras 5, 6 y 7).
La radioinmunoterapia (RIT), usando Y-90 en una serie de anticuerpos monoclonales (mAbs), incluyendo aquellos contra MUC-1, ha demostrado resultados prometedores en estudios preclmicos y ensayos con pacientes. Estos estudios han demostrado que se pueden focalizar eficazmente los canceres epiteliales utilizando mAbs radioetiquetados y que MUC-1 es una de las dianas mas atractivas. Sin embargo, los anticuerpos completos no se concentran facilmente y por lo general no penetran en los canceres solidos. Por consiguiente, el mdice terapeutico para estas fracciones ha resultado ser relativamente bajo.
Sin embargo, se espera que los SHAL dirigidos a MUC-1 elaborados, por ejemplo, segun los metodos descritos aqrn, dirigidos contra la repeticion en tandem de la protema core de MUC-1, un epftopo que ha demostrado en estudios preclmicos y ensayos RIT en pacientes que es un epftopo antigenico unico regulado al alza en canceres epiteliales, resulten altamente efectivos. Los SHAL (ligandos de alta afinidad selectivos) son bastante pequenos (unos 2000 Daltons) en comparacion con los anticuerpos completos (unos 150000 D) o incluso con fragmentos variables de cadena simple (25000 D), por lo que los SHAL penetran facilmente y se concentran en los tumores malignos o son rapidamente eliminados o excretados por los rinones.
En determinadas realizaciones, se elige un ligando o ligandos adicionales, mas alla de uno o dos elegidos para los puntos de docking en la region epitopica de interes, para los puntos de docking fuera de la region de interes de la diana. Esto proporciona una mayor selectividad y una afinidad "efectiva". En el caso de una diana multimerica, por ejemplo, HLA-DR, se pueden dirigir ligandos adicionales a la misma subunidad de la diana o a otra diferente. En concreto, en el caso del HLA-DR, se puede dirigir uno o dos ligandos a puntos de docking conocidos en la region epitopica definidos para la reactividad del anticuerpo monoclonal Lym-1 y se pueden elegir ligandos adicionales para los puntos de docking del mismo multimero o de otro diferente, por ejemplo, la subunidad beta o la subunidad alfa de HLA-DR.
Otros ejemplos son los SHAL con ligandos elegidos para reaccionar con repeticiones en tandem de mucinas, como MUC-1, tal y como se ha descrito anteriormente. En este ejemplo, la protema core es repetitiva a intervalos de 10 mer para que los SHAL de naturaleza similar o identica se puedan unir para proporcionar enlaces multivalentes para repeticiones identicas o similares pero diferentes de distancia conocida (o desconocida). Alternativamente, el SHAL puede tener un tercer ligando que es identico a uno
de los ligandos iniciales pero unido a una distancia para el docking en puntos de una region remota de la repeticion en tandem de la protema core de MUC-1.
Asimismo, los puntos de docking pueden ser protrusiones ademas de cavidades, aunque estas ultimas es probable que permitan una mayor afinidad en virtud del potencial de un mayor numero de interacciones de contacto.
B)Compuestos (ligandos putativos/fracciones de union) a seleccionar
Se puede seleccionar practicamente cualquier agente por su capacidad para unirse a una diana y, por tanto, por su idoneidad para su incorporacion a un SHAL segun los metodos de esta invencion. Entre estos agentes se incluyen, entre otros, acidos nucleicos, protemas/peptidos, analogos de acidos nucleicos o peptidos, metales, azucares, polisacaridos, glicoprotemas, ftpidos, lectinas, moleculas organicas grandes y pequenas, CDR de anticuerpos y similares.
En una divulgacion preferible, los metodos de seleccion de alta produccion implican proporcionar una biblioteca de qmmica combinatoria que contiene un gran numero de ligandos potenciales (fracciones de union). Estas "bibliotecas de qmmica combinatoria" se seleccionan despues en uno o mas ensayos, como se ha descrito aqrn, para identificar los miembros de la biblioteca (especies qmmicas concretas o
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subclases) que presentan la actividad de union deseada. Los compuestos identificados de este modo pueden servir como componente de un SHAL.
Una biblioteca de qmmica combinatoria es una coleccion de diversos compuestos qmmicos generados por smtesis qmmica o smtesis biologica mediante combinacion de una serie de "bloques de construccion" qmmicos como reactivos. Por ejemplo, una biblioteca de qmmica combinatoria lineal como una biblioteca de polipeptidos (por ej. mutema) se forma combinando un conjunto de bloques de construccion qmmicos denominados aminoacidos en todas las formas posibles para una longitud determinada del compuesto (es decir, el numero de aminoacidos en un compuesto polipeptfdico). Se pueden sintetizar millones de compuestos qmmicos a traves de esta mezcla combinatoria de bloques de construccion qmmicos. Por ejemplo, un comentarista ha observado que la mezcla combinatoria sistematica de 100 bloques de construccion qmmicos intercambiables resulta en la smtesis teorica de 100 millones de compuestos tetramericos o 10 000 millones de compuestos pentamericos (Gallop et al. (1994) J. Med. Chem., 37(9): 1233-1250).
La preparacion de bibliotecas de qmmica combinatoria es bien conocida por los expertos en la tecnica. Estas bibliotecas de qmmica combinatoria incluyen, entre otras, bibliotecas de peptidos (vease, por ej. la Patente USA 5 010 175; Furka (1991) Int. J. Pept. Prot. Res., 37: 487-493; Houghton et.al. (1991) Nature, 354: 84-88). Las smtesis de peptidos no es ni mucho menos el unico metodo previsto y pensado para ser utilizado con la presente invencion. Tambien se pueden utilizar otros procesos qmmicos para generar bibliotecas de diversidad qmmica. Estos procesos qmmicos incluyen, entre otros, peptoides (Publicacion PCT n° WO 91/19735), peptidos codificados (Publicacion PCT WO 93/20242), bio-oligomeros aleatorios (Publicacion PCT wO 92/00091), benzodiacepinas (Pat. USA n° 5 288 514), diversomeros como hidantomas, benzodiacepinas y dipeptidos (Hobbs et aI., (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913), polipeptidos vimlogos (Hagihara et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:6568), peptidomimeticos no peptfdicos con estructura beta-D-glucosa (Hirschmann et al., (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218), smtesis organicas analogas de bibliotecas de pequenos compuestos (Chen et al. (1994) J. Amer. Chem. Soc. 116:2661), oligocarbamatos (Cho, et al., (1993) Science 261:1303), y/o fosfonatos peptidflicos (Campbell et al., (1994) J. Org. Chem. 59: 658). Vease, en general, Gordon et al., (1994) J. Med. Chem. 37:1385, bibliotecas de acidos nucleicos (vease, por ejemplo, Strategene, Corp.), bibliotecas de acidos nucleicos peptfdicos (vease, por ejemplo, Patente USA n° 5 539 083), bibliotecas de anticuerpos (vease, por ejemplo, Vaughn et al. (1996) Nature Biotechnology, 14(3): 309-314), y PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (vease, por ejemplo, Liang et al. (1996) Science, 274: 1520-1522, y la Patente USA 5 593 853), y bibliotecas de moleculas organicas pequenas (vease, por ejemplo, benzodiacepinas, Baum (1993) C&EN, 18 de enero, pag. 33, isoprenoides, Patente USA n° 5 569 588, tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente USA n° 5 549 974, pirrolidinas, Patentes USA n° 5 525 735 y 5 519 134, compuestos de morfolino, Patente USA n° 5 506 337, benzodiacepinas 5 288 514 y similares).
Los dispositivos para la preparacion de bibliotecas combinatorias se encuentran disponibles en el mercado (vease, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, mA).
En determinadas divulgaciones, la seleccion inicial de ligandos (fracciones de union) con los que construir el SHAL se puede realizar mediante un metodo de seleccion in silico virtual y, en este caso, no es necesario disponer de los compuestos ffsicos. En tales casos las bases de datos de estructuras qmmicas proporcionan una amplia serie de fracciones que se pueden seleccionar por su idoneidad para ser incluidas en un SHAL como se ha descrito aqm.
Las bases de datos de estructuras qmmicas son bien conocidas por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, el MDL® Available Chemicals Directory (MDL ACD) es actualmente la base de datos de busqueda de estructuras de compuestos qmmicos comercialmente disponibles mas grande del mundo y esta disponible en MDL Information Systems, Inc., San Leandro, California. Esta base de datos se indica meramente a tttulo enunciativo y sin caracter limitador. Otras bases de datos de estructuras qmmicas (por ejemplo, ChemSpider, ZINC, etc.) son bien conocidas por los expertos en la tecnica e incluyen, entre otras, diversas bases de datos de estructuras de moleculas organicas, peptidos, carbohidratos o acidos nucleicos.
C)Identificacion computacional de ligandos que se unen a la diana
Utilizando un metodo in silico virtual, se pueden usar metodos computacionales para caracterizar (por ej. modelar) la diana (por ej. protema diana) y para identificar moleculas (fracciones de union) que se espera que se unan espedficamente a determinadas regiones de la diana. El uso de metodos computaciones para identificar moleculas que se unen espedficamente a una diana concreta se suele denominar "DOCKING".
Los metodos de docking son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Dos enfoques de docking son el "docking de molecula ngida" en el que las moleculas implicadas son tratadas como objetos ngidos que
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no pueden cambiar su forma espacial durante el proceso de docking, y el soft docking (flexible), donde se permite que las moleculas (computacionalmente) cambien de forma mientras se produce el docking.
Hay diversas fuerzas ffsicas y qmmicas que interaction entre las dos moleculas. Estas fuerzas se utilizan para definir diversas puntuaciones de docking que miden la calidad de cada solucion. Estas puntuaciones tienen en cuenta la solidez de estas fuerzas y la viabilidad de la solucion de docking. Las fuerzas mas significativas tfpicamente consideradas en los algoritmos de docking incluyen fuerzas electricas, fuerzas van der Walls y enlaces de hidrogeno.
El problema del docking se suele manifestar formalmente como sigue: Suponiendo que A,B son dos moleculas ngidas (por ejemplo, la diana y el potencial ligando que se va a unir a la diana) con su representacion geometrica en R3. Si queremos hallar una transformacion ngida T:R3-->R3 de forma que la superficie de contacto entre T-A y B es maxima. La superficie de contacto se define tfpicamente como la superficie en la que la distancia entre las moleculas es inferior a un determinado umbral. Tfpicamente los algoritmos de docking intentan alcanzar una superficie de contacto que sea "suficientemente grande" en lugar de "maxima" y que intentemos maximizar no el tamano de la superficie de contacto sino una puntuacion que mide la calidad de las soluciones de docking propuestas. Estos dos parametros estan correlacionados pero no son equivalentes.
1. Docking ngido
Un planteamiento para el algoritmo de docking ngido fue descrito por by Kuntz et al. (1982) J. Mol. Biol., 161: 269-288. El algoritmo de Kuntz et al. se utiliza principalmente para resolver el docking de ligando- proterna, al tiempo que se intenta centrar en puntos "de interes" sobre la superficie de las moleculas. Las fases basicas del algoritmo implican primero computar la superficie molecular utilizando el metodo de Connolly (vease, por ejemplo, Connolly (1983) J. Appl. Crystallography, 16: 548-558; Connolly (1983) Science, 221: 709-713)). Esto produce una serie de puntos en la superficie molecular "alisada" con sus normales. Despues se utiliza un "generador de esferas" (por ejemplo, SPHGEN) para crear una nueva representacion de la superficie molecular de la diana (por ej. proterna) y el ligando utilizando "pseudoatomos" y despues utiliza esta representacion para encontrar puntos de docking viables sobre la superficie molecular — estos puntos de docking que busca SPHGEN son cavidades en la superficie del receptor.
SPHGEN normalmente se compone de las fases siguientes: En primer lugar, para cada par en los puntos de Connolly pi,pj, una esfera que pasa por este par se situa de forma que su centro se encuentre en uno de los puntos de la normal. El algoritmo a continuacion define Snorm(i) ={Esferas cuyo centro se encuentra en la normal de pi}. Dando por supuesto que hay n puntos de Connolly, entonces para cada 1=i<=n y pi se encuentra en la superficie de la diana, retiramos todas las esferas de Snorm(i) y dejamos unicamente la que tiene el radio mas pequeno. De este modo se retiran todas las esferas que penetran en la superficie de la diana. Entonces el algoritmo tfpicamente solo deja las esferas donde Theta (por ej. el angulo entre la pi normal y el radio de pj al centro de la esfera) < 90°. De lo contrario, los puntos que definen la esfera, pi y pj, estan demasiado cerca entre sf y, por tanto, no estan ubicados en una cavidad de la superficie de la diana. A continuacion el algoritmo tfpicamente para cada atomo deja unicamente la esfera con el radio maximo. Este paso deja unicamente las esferas que "tocan" la superficie del atomo. Por ultimo, si los puntos que definen la esfera, pi y pj, pertenecen a dos atomos diferentes y la distancia entre estos atomos en la secuencia molecular es menor a 4- la esfera es descartada. Esto se hace porque la longitud de una curva de una helice alfa es de 3,6 y estos puntos tfpicamente no son tratados como puntos de docking posibles.
Las restantes esferas se denominan pseudoatomos. La siguiente fase busca grupos de interseccion de pseudoatomos. La existencia de este tipo de grupos indica la existencia de una cavidad en la superficie molecular, que se considera un buen punto para el docking.
Una vez realizado todo esto en la diana, se repite lo mismo con el ligando, pero esta vez tomamos los puntos y los vectores opuestos a sus normales, para crear las esferas dentro de la superficie y no fuera de la superficie. El resultado de SPHGEN en la diana a menudo se denomina la "imagen negativa" y en el ligando se denomina la "imagen positiva". En determinadas realizaciones, los vectores con respecto al ligando y a la diana se pueden invertir (por ejemplo, encontrar elementos de la diana que se acoplan en el interior de cavidades del ligando).
Entonces se realiza tfpicamente un "emparejamiento". En esta operacion, para cada punto de docking, el algoritmo trata de encontrar una transformacion T que ofrece una buen correspondencia entre los centros de los pseudoatomos de la diana y los del ligando (en algunos casos, se utilizan los centros de los atomos reales del ligando, en lugar de los centros de sus pseudoatomos). En algunas versiones de DOCK, los grupos de pseudoatomos se separan en subgrupos con el fin de mejorar la complejidad de esta etapa. Una forma de hacerlo consiste en descartar la esfera mas grande del cluster, que en ocasiones causa que el cluster se divida en dos subclusteres.
En el problema del emparejamiento del docking ngido se realiza una busqueda para encontrar una traslacion y una rotacion de una molecula, de manera que se forme un buen emparejamiento entre los puntos de interes de ambas moleculas. En determinadas realizaciones, las distancias entre el punto
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utilizado en lugar de las ubicaciones de los puntos: Para cada molecula, la diana (T) y el ligando (L), se define una matriz de distancia apropiada - dT i,j y dL j respectivamente. A continuacion se realiza una busqueda para intentar encontrar dos subconjuntos en T y L de forma que sus distancias sean las mismas, con cierta tolerancia de error. Estos dos subconjuntos definen dos subgraficos con unas distancias casi similares entre sus vertices. Esto se puede hacer utilizando un metodo similar al arbol de interpretacion de Grimson y Lozano-Perez.
Otra forma de resolver el problema de emparejamiento consiste en encontrar un grupo "lo suficientemente grande" en un grafico de emparejamiento. Si hay n puntos en la diana y m puntos en el ligando, el grafico de emparejamiento tiene n*m vertices donde cada vertice representa un punto de la diana y un punto del ligando. Supongamos que G=(V,E) es el grafico de emparejamiento y que u, v son los vertices en V, donde u representa ul y ut (puntos en el ligando y en la diana, respectivamente) y v representa vl y vt. Se anadira un margen e=(u,v) a E unicamente cuando ABS [dL(uL,vL) - dT (ut,vt)] < tolerancia. Por tanto, un grupo en el grafico de emparejamiento define subconjuntos de puntos en el ligando y el receptor con distancias similares.
A fin de evaluar la calidad del emparejamiento se calcula una puntuacion. La puntuacion preferiblemente tiene en cuenta el tamano de la superficie de contacto entre las moleculas y tfpicamente no permite que una molecula penetre en la otra. El algoritmo DOCK utiliza una cuadncula cubica que rellena el punto de union y todas las celulas de esta cuadncula tienen una puntuacion en funcion de su distancia desde el centro de los atomos del receptor: 1 si la distancia es 2,8A - 4,5A, -127 si la distancia es inferior a 2,8 A, y 0 si la distancia es superior a 4,5A. (En algunos casos, la distancia 2,8A es sustituida por 2,4A). Para cada transformacion propuesta, se calcula la posicion de los puntos del ligando (es decir, los centros de sus atomos o pseudoatomos) en la cuadncula y la puntuacion viene determinada por la suma de las puntuaciones de estos puntos. Las diversas versiones del algoritmo pueden utilizar puntuaciones adicionales o alternativas. Por ejemplo, en una version se puede calcular una puntuacion de energfa de van der Waals para las transformaciones que tienen buenas puntuaciones de emparejamiento.
Construccion de un modelo informatico de HLA-DR10. Utilizando las estructuras cristalinas que se han determinado para cuatro moleculas de HLA-DR humano estrechamente relacionadas (HLA-Dr 1-4), la identificacion de "hendiduras" unicas en la superficie de la protema, la identificacion de ligandos que se unen a determinadas hendiduras unicas y la construccion de SHAL utilizando estos ligandos se ilustran en el presente en los ejemplos.
La anterior descripcion tiene por objeto ilustrar un planteamiento para el docking ngido sin caracter limitador. Otros planteamientos son conocidos por los expertos en la tecnica. Cabe senalar que los programas SPHGEN y DOCK estan disponibles en el mercado (por ej., se pueden adquirir directamente en la Universidad de California y diversos fabricantes de software).
2. Soft Docking (flexible)
Los algoritmos de soft docking son bien conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ej., Jiang y Kim (1991) J. Mol. Biol., 219: 79-102; Katchalski-Katzir el al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU, 89(6): 2195-2199, etc.).
En el metodo descrito por Jiang y Kim, supra, se realiza una enumeracion en el espacio
sexadimensional de la transformacion ngida y se asignan puntuaciones a estas transformaciones en funcion de su valor energetico. Ambas moleculas se colocan en una cuadncula y se evalua el emparejamiento utilizando las distancias entre las celulas de la cuadncula, el numero de penetraciones y las direcciones de las normales de los puntos. El algoritmo funciona con el producto del algoritmo de Connolly y en la totalidad de la superficie molecular (es decir no se buscan cavidades, a diferencia del algoritmo de DOCK). Para reducir la enumeracion, el algoritmo utiliza tfpicamente dos resoluciones: baja y fina. La resolucion baja utiliza unos 0,3 puntos por angstrom cuadrado y la fina aproximadamente 1 punto por angstrom cuadrado.
Cada celula de la cuadncula es marcada como "superficie" (si contiene al menos un punto de Connolly) o como "volumen" (si no contiene ningun punto de Connolly). Habitualmente, cada celula de superficie contiene 2-3 puntos de Connolly.
Se realiza una enumeracion sobre las rotaciones de una de las moleculas (normalmente la mas pequena). Para cada rotacion se realiza lo siguiente: Se calcula la superficie y el volumen de la molecula. Suponiendo que hay al menos un par de celulas de superficie (una de cada molecula) y que son emparejadas por la transformacion, se realiza una enumeracion en todas estas parejas. Se calcula la transformacion para cada pareja y se evalua comprobando las direcciones de las normales, el numero de parejas de superficie a superficie y el numero de penetraciones. Las buenas transformaciones son aquellas que tienen un pequeno numero de penetraciones y muchas parejas de superficie a superficie. Esto se hace primero a baja resolucion y los mejores resultados se calculan de nuevo en resolucion fina con la adicion de una puntuacion energetica aproximada. La puntuacion energetica aproximada se calcula en funcion del numero de interacciones "favorables" y "desfavorables". Hay varias categonas para los atomos de cada molecula y las combinaciones de estas categonas estan marcadas como "favorables" si
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realizan una buena contribucion a la viabilidad energetica del emparejamiento y como "desfavorables" en el caso contrario.
Por ejemplo, es desfavorable que un atomo con carga positiva se coloque cerca de otro atomo con carga positiva, pero es favorable si dos atomos son adyacentes y uno de ellos es un donador-H y el otro un aceptor-H.
El planteamiento de Katchalski-Katzir et.al., supra, consiste en realizar una enumeracion sobre las posibles traslaciones, al tiempo que se utiliza el algoritmo FFT para calcular eficientemente la puntuacion de emparejamiento. De forma similar a lo que ocunia con el algoritmo anterior, ambas moleculas se colocan en una cuadncula tridimensional, pero aqu se definen tres tipos de celulas de la cuadncula: "volumen", "superficie" e "intermedia". Si las moleculas son A y B, las matrices Ai,m,n y Bi,m,n se definen como sigue (l,m,n son las coordenadas de la cuadncula): Ai,m,n = { 1 - si (l,m,n) es una celulas de "superficie", q - si (l,m,n) es una celula "intermedia", 0 - de lo contrario}, y Bi,m,n = { 1 - si (l,m,n) es una celula de "superficie", r - si (l,m,n) es una celula "intermedia", 0 - de lo contrario}.
En determinadas divulgaciones, se seleccionan parametros de forma que q<0 y r>0 mientras que |q| es grande y |r| es pequeno. El producto escalar de estas matrices se puede calcular de forma eficiente utilizando FFT, mejorando asf el rendimiento del algoritmo considerablemente.
Una vez mas, cabe senalar que la anterior descripcion tiene por objeto ilustrar un planteamiento para el docking ngido sin caracter limitador. Otros planteamientos son conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, otros planteamientos/programas incluyen, entre otros, los siguientes: FlexX de Tripos (
http://www.biosolveit.de/FlexX/) que se utiliza habitualmente para la seleccion de alto rendimiento. Emplea una funcion de puntuacion empmca. Permite el docking flexible girando alrededor de enlaces de torsion. Se comercializa como un modulo del programa Sybyl (distribuido por Tripos, Inc., St. Louis). GOLD de CCDC (
http://www.ccdc.cam.ac.uk/prods/gold/) que utiliza un algoritmo genetico para generar los elementos que componen un ligando. Permite la personalizacion de la energfa torsional dentro de fragmentos mas pequenos de la molecula y admite la flexibilidad de la protema local. Autodock UCSD (
http://www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock/) utiliza un algoritmo genetico de Lamarckian para generar los elementos que componen un ligando. AutoDock da mejores resultados cuando solamente hay unos pocos ligandos y las energfas de union necesitan ser mas precisas. Algunas revisiones recomendables sobre Docking incluyen Lyne (2002) Drug Discovery Today. 7 (20): 1047, y Taylor el al. (2002) J. Computer-Aided Mol. Design., 16: 151.
D)Planteamientos empiricos y verificacion de la union del ligando
El uso de metodos computacionales para identificar ligandos para su uso en la construccion de un SHAL requiere al menos cierta informacion relativa a la estructura de la molecula o las moleculas diana. Esta invencion contempla asimismo el uso de metodos que no requieren conocimiento de la estructura de la diana a la que se va a dirigir el SHAL.
En determinadas divulgaciones "empmcas", se seleccionan los ligandos individuales o las bibliotecas de ligandos en funcion de las celulas y/o moleculas diana, bacterias, virus, etc., que presentan la molecula o moleculas diana, a fin de identificar los ligandos que se unen a la diana deseada (al menos con baja afinidad). Se identifican los ligandos que se unen a diferentes regiones de la molecula o las moleculas diana. En determinadas realizaciones, se identifican ligandos que se unen a diferentes regiones de las moleculas diana y que no se excluyen entre sf de esa union.
Los ligandos que se pueden unir simultaneamente a la diana sin excluirse entre sf se pueden unir juntos, directamente o a traves de un enlace, para crear un SHAL polidentado que puede, opcionalmente, ser seleccionado posteriormente por su capacidad para unirse a la molecula o moleculas diana, por ejemplo con una afinidad elevada.
Ademas de su uso en planteamientos empmcos para la identificacion de ligandos, los metodos de seleccion ffsicos tambien resultan recomendables para validar la union de los ligandos identificados utilizando los planteamientos in silico virtuales anteriormente descritos. Tambien puede resultar recomendable determinar adicionalmente la orientacion de la union de dos o mas ligandos, por ejemplo para confirmar que los ligandos se unen a diferentes puntos de la diana y/o calcular la separacion cuando los ligandos se incorporan a un SHAL.
Los ensayos para detectar la union de uno o mas ligandos a una diana son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, en una realizacion, los ligandos pueden ser etiquetados con una etiqueta detectable y ponerse en contacto con la molecula o moleculas diana que se encuentran inmovilizadas sobre un sustrato. Despues de aplicar un lavado, la deteccion de las etiquetas en asociacion con la molecula o moleculas diana inmovilizadas indica que los ligandos se unen a la diana. En determinadas realizaciones, se pueden etiquetar diferentes ligandos con diferentes etiquetas (por ejemplo, etiquetas fluorescentes de diferentes colores) para poder visualizar la union simultanea de multiples ligandos.
Alternativamente, se pueden realizar ensayos de union competitiva. En estos ensayos, la molecula o moleculas diana se ponen en contacto con un ligando que se sabe que se une a la diana. La diana
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tambien se pone en contacto con el ligando "de ensayo" y se evalua la capacidad del ligando de ensayo para unirse a la diana en presencia del primer ligando.
Tambien se pueden realizar ensayos en fase ftquida. Por ejemplo, el ligando o ligandos y las dianas se pueden etiquetar con diferentes etiquetas. Los ligandos se pueden poner en contacto con la molecula o moleculas diana y se puede evaluar la union de los dos facilmente, por ejemplo utilizando una citometna de flujo. Los metodos de citometna de flujo son bien conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Omerod (1994) Flow Cytometry: A Practical Approach. IRL Press, Oxford.; Shapiro Practical Flow
Cytometry. 3a Edicion. Alan R Liss, Inc.; Givan (1992) Flow Cytometry. First Principles. Wiley-Liss, New York; Robinson (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods, Wiley- Liss, Nueva York y similares).
La determinacion de la union del ligando y de su orientacion tambien se puede realizar usando diferentes metodos. Entre ellos se incluye, entre otros, resonancia magnetica nuclear (NMR) por diferencia de transferencia de saturacion (Mayer y Meyer (1999) Angew Chem Int Edit, 38:1784-1788) y espectroscopia de NMR NOE de transferencia (trNOE) (Henrichsen et al. (1999) Angew Chem Int Edit., 38:98-102; Cosman et al. (2002) Chem Res Toxicol 15: 1218-1228). Estos metodos se pueden utilizar para seleccionar los ligandos en mezclas de varios a varios cientos por experimento para determinar que ligandos se unen a la molecula o moleculas diana, por ejemplo en condiciones biologicamente relevantes, y para determinar que ligandos se unen a los mismos puntos (o a puntos diferentes). Tambien se pueden realizar experimentos de difusion (Lin et al. (1997) J. Organic Chem., 62: 8930-8931) con aquellos ligandos para los que se ha determinado que se unen, a fin de valorar la afinidad de union relativa de cada compuesto.
Otros planteamientos para detectar la union de los ligandos a la molecula o moleculas diana incluyen, entre otros, la resonancia de plasmones superficiales (ensayo BIAcore), espectroscopia de resonancia magnetica nuclear por diferencia de transferencia de saturacion, otras mediciones de la espectroscopia de la resonancia magnetica nuclear, espectrometna de masas, microarrays de captura, ensayos con bibliotecas basados en granulos y otros ensayos de union ffsicos.
Los anteriores ensayos se citan unicamente a tftulo ilustrativo y sin caracter limitador. Utilizandolas ensenanzas proporcionadas en el presente, otros ensayos para detectar la union del ligando a la molecula o moleculas diana seran conocidos por los expertos en la tecnica.
Tras la identificacion de un conjunto de ligandos que se unen a la molecula o moleculas diana (por ejemplo, HLA-DR10), se pueden realizar experimentos de competencia, por ejemplo mediante NMR, para determinar si se unen a una de las hendiduras que comprende la molecula o moleculas diana (por ejemplo, en el caso del HLA-DR10, a una de las hendiduras que comprenden el epftopo Lym-1.
Como se ha indicado anteriormente, esto se puede realizar facilmente preparando un complejo entre la diana y un ligando de union conocido, y determinando si un segundo ligando se puede unir al complejo. Asf, por ejemplo, en el caso de la diana de HLA-DR10, se puede preparar un complejo de Lym-1/HLA- DR10 y el conjunto de ligandos que se unen a HLA-DR10 puede ser sometido a un nuevo ensayo para determinar si todavfa se uniran a la protema cuando el anticuerpo de Lym-1 se haya unido.
Los ligandos que ya no se unen al complejo Lym-1/HLA-DR10 pueden ser identificados (estos ligandos se unen a los puntos unicos que diferencian al HLA-DR10 de las demas moleculas del HLA-DR) y utilizados en un segundo juego de experimentos de competencia para identificar aquellas moleculas que se unen a diferentes puntos dentro del epftopo Lym-1. En experimentos realizados con pares de ligandos, los efectos Overhauser nucleares transferidos (trNOE) que se producen entre los ligandos unidos y la protema de HLA-DR10 (Cosman et al. (2002) Chem Res Toxicol 15: 1218-1228), en ausencia del anticuerpo de Lym-1, pueden ser utilizados para identificar los ligandos que se unen a los mismos puntos y a puntos diferentes. Los ligandos unidos emiten senales NOE negativas, mientras que los ligandos no unidos presentan senales positivas (Id.). Si se observa que los dos ligandos de la pareja se unen a la protema al mismo tiempo, los resultados indicaran que los dos ligandos se deben unir a puntos diferentes. Por tanto, la seleccion permite identificar facilmente grupos de ligandos que se unen a diferentes puntos de la molecula o moleculas diana (por ejemplo, a diferentes puntos (Punto 1 y Punto 2) dentro del epftopo Lym-1 del HLA-DR10).
Una vez que se han identificado los conjuntos de ligandos que se unen a diferentes puntos de la diana, se puede evaluar tambien opcionalmente la orientacion de los ligandos en los puntos de union utilizando simulaciones clasicas de dinamica molecular. Los metodos para realizar simulaciones de dinamica molecular se describen claramente en los Ejemplos. Para ejemplo, para cada ligando se pueden simular entre una y tres orientaciones en la hendidura de union durante 500 pseg. Esto ayudara a determinar que grupos funcionales de los ligandos probablemente estaran en contacto con la diana y que grupos funcionales resultan accesibles mediante solvente. Esta informacion se puede utilizar para identificar analogos con grupos funcionales modificados o diferentes que se pueden someter a ensayo para determinar su capacidad para unirse a la diana y confirmar que un grupo funcional concreto se puede utilizar como punto para la union del enlazador sin alterar la union del ligando a la diana.
El uso de estos metodos para identificar ligandos que se unen a puntos espedficos de diversas dianas
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esta documentado en la bibliograffa. Por ejemplo, estos metodos se han utilizado para identificar ligandos que se unen a puntos espedficos del dominio diana de la neurotoxina del tetanos (Cosman et al. (2002) Chem Res Toxicol 15:1218-1228; Lightstone et al. (2000) Chem. Res. Toxicol., 13: 356-362), asf como 11 ligandos que ya hemos identificado que se unen a HLA- DR10.
Otros estudios anteriores que han utilizado un planteamiento similar para identificar ligandos que se unen a dos puntos del dominio diana de la neurotoxina del tetanos (Id.) han requerido la seleccion de menos de 30 ligandos experimentalmente. Se observo experimentalmente la union de mas de la mitad de los ligandos que se prevefa que se uman a la protema. Por tanto, creemos que la seleccion de un conjunto de 30 ligandos por punto debena proporcionar un numero suficiente de compuestos que se unen para iniciar la smtesis del sHaL. Sin embargo, si en algunas realizaciones, no se ha identificado un numero adecuado de ligandos (por ejemplo, entre tres y cinco) que se unen en una primera ronda de selecciones por NMR, se pueden seleccionar y analizar series adicionales de ligandos hasta encontrar los ligandos adecuados que se unen a dos puntos diferentes de la diana.
En determinadas divulgaciones, la seleccion de los pares de ligandos (u otras combinaciones de multiples ligandos) a unir se basa en los criterios siguientes (en orden de importancia descendente): 1) punto de union (los dos ligandos que componen un par preferiblemente se unen a puntos diferentes); 2) fiabilidad de la informacion obtenida sobre grupos funcionales disponibles que se puede utilizar para unir las moleculas al enlazador sin alterar la union (se concede prioridad a los analogos con derivados conocidos cuya union se ha confirmado, lo que indica que la modificacion de un grupo funcional concreto no afecta a la union); 3) la facilidad prevista de union del ligando al enlace (los ligandos tienen preferiblemente grupos funcionales que facilitan la qmmica de union asimetrica para poner un ligando diferente en extremos opuestos del enlace); 4) la afinidad de union relativa, por ejemplo determinada mediante experimentos de difusion por NMR (normalmente se seleccionan primero los ligandos que presentan la union mas solida a la protema); 5) informacion conocida acerca de su toxicidad en animales o seres humanos (normalmente se da prioridad al uso de ligandos que se sabe que no son toxicos o cuyo uso en otros productos farmaceuticos ya ha sido aprobado); y 6) coste del ligando.
Dado que es probable que algunos de los ligandos individuales (fracciones de union) puedan presentar una union debil con otras protemas, no sera necesario (ni significativo) preseleccionar los ligandos individuales para determinar si se unen a otras protemas que se podnan encontrar en la circulacion antes de utilizarlos en la produccion de SHAL. Se preve que la union de cualquier ligando individual (la mitad del par utilizado para crear un SHAL bidentado) a otras protemas sera debil (micromolar a lo sumo). Por consiguiente, la disociacion de la molecula sera alta y el SHAL que unicamente se une a traves de un ligando a otras protemas se eliminara rapidamente del tejido y la circulacion. Tfpicamente solo se obtendran afinidades elevadas (y bajas disociaciones) cuando los dos ligandos del par se unan simultaneamente a puntos separados por la distancia adecuada, que viene dictada por la longitud del enlace que los conecta. Estos dos criterios solamente se cumpliran cuando el SHAL entre en contacto con la diana prevista. Una vez unido, se preve que la disociacion se reducira entre 1000 y 1 000 000 de veces (basandonos en estudios previos) respecto a la observada para cualquier ligando individual. Por esta razon, no se espera que la reactividad cruzada suponga una complicacion significativa.
E)Metodos computacionales/empiricos combinados
La union de un SHAL a la region o regiones de su diana se basa en el ajuste y la carga, y es dependiente de la estructura 3D y de los componentes de las fracciones de union. En el metodo computacional anteriormente descrito, la generacion de SHAL puede implicar la definicion/identificacion de una region o regiones atractivas sobre la molecula diana. Asf, por ejemplo, se pueden elaborar modelos de protemas de todo tipo, incluyendo antfgenos, receptores y protemas de senalizacion, para encontrar puntos de acoplamiento molecular y ligandos. Posteriormente los ligandos se pueden someter a ensayo utilizando metodos empmcos. Estos metodos requieren tfpicamente el conocimiento de las moleculas integrantes que se incluiran en los modelos.
Los metodos empmcos anteriormente descritos se basan en la seleccion de bibliotecas (por ejemplo, bibliotecas combinacionales) de potenciales ligandos para encontrar los agentes ligantes adecuados. En este metodo no se requiere ningun conocimiento previo ademas de la disponibilidad de una diana (por ejemplo, protema, celula, etc.) de interes.
Las bibliotecas se desechan de forma selectiva para hallar los agentes ligantes. Esto se puede realizar mediante competencia con una
molecula, como un anticuerpo, peptido o qrnmico (ligando), que se sabe que reacciona con la molecula en la region elegida a focalizar. Este metodo permite la eliminacion de peptidos o qrnmicos de union que no son de interes, asf como la definicion de los que se unen a la region de interes.
Un tercer metodo tiene una naturaleza intermedia y utiliza los conocimientos previos de moleculas diana atractivas y de las regiones de estas moleculas para la seleccion competitiva inicial y la contraseleccion. Asf por ejemplo, se pueden expresar computacionalmente las dianas iniciales o los componentes de las bibliotecas de ligandos. A continuacion la diana o coleccion de dianas optimizada y la biblioteca optimizada se pueden someter a seleccion y contraseleccion como se ha descrito en el presente para
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identificar los agentes ligantes optimos.
F)Seleccion de bibliotecas basadas en perlas
Un metodo para la seleccion de ligandos que se unen a las moleculas diana implica la produccion de una biblioteca combinacional que comprende un gran numero de potenciales ligandos, cada uno de ellos unido a un soporte solido/perla diferente. La biblioteca combinacional puede ser una biblioteca "aleatoria" o puede ser sintetizada para proporcionar numeros de variantes que tienen, por ejemplo, una qmmica esencial concreta (por ejemplo, optimizada).
Los metodos sinteticos combinacionales son bien conocidos y se utilizan para producir rapidamente grandes "bibliotecas" de compuestos distintos. En diversas realizaciones, el material de partida (por ejemplo, un aminoacido) se une covalentemente a un soporte solido. A esto le sigue la adicion gradual de monomeros (tfpicamente monomeros protegidos), tales como aminoacidos, nucleotidos, moleculas organicas pequenas y similares. Se pueden crear millones de moleculas distintas variando el numero de pasos y el numero de reactivos (por ejemplo, en un enfoque de smtesis de combinar y dividir),, pero tipicamente cada perla solo contiene un compuesto.
Los compuestos comprendidos en la biblioteca se pueden seleccionar mientras todavfa se encuentran unidos a las perlas. Se pueden utilizar metodos colorimetricos, fluorometricos, radiograficos o de otro tipo para visualizar las perlas positivas (de union). Estas pueden ser capturadas (por ejemplo, con una pipeta, una varilla metalica si las perlas son magneticas) y, a continuacion, se puede caracterizar el compuesto.
Asf, por ejemplo, se puede sintetizar una biblioteca de ligandos peptfdicos que se unen a las moleculas de HLA-DR10. La qmmica de smtesis de peptidos esta bien desarrollada. Sin embargo, para obtener ligandos peptfdicos que tienen una vida util mas prolongada in vivo, se podna optar por producir una biblioteca de ligandos peptfdicos donde los peptidos comprenden D-aminoacidos. Se espera que estos peptidos sean mas resistentes a la proteolisis in vivo. Por otra parte, por lo general los D-aminoacidos se consideran no toxicos.
El epftopo Lym-1 del HLA-DR10 es altamente polar. Por tanto, al sintetizar la biblioteca de potenciales agentes ligantes, se pueden seleccionar D-aminoacidos polares para la smtesis (por ejemplo, Ser, Asp, etc.). Utilizando la smtesis de combinar y dividir (vease, por ejemplo, la Patente uSa 5 574 656), se crea una biblioteca de D-peptidos unidos a las perlas.
A continuacion se anade HLA-DR10 marcado HRP a la mezcla de perlas. La etiqueta de color HRP es visualizada y se extraen las perlas positivas. A continuacion las perlas positivas se pueden someter a ensayo contra, por ejemplo, las lmeas de celulas HLA-DR10 positivas. A continuacion, las perlas que dan un resultado positivo en este ensayo se pueden someter a ensayo contra, por ejemplo, un panel de tejido para garantizar que la union es espedfica para HLA-DR10. Los agentes ligantes espedficos de este ensayo se pueden caracterizar a continuacion (por ejemplo, secuenciarse utilizando la degradacion de Edman, espectrometna de masas, etc.).
Alternativamente, hay estrategias para codificar la identidad de cada compuesto durante la smtesis de la biblioteca (veanse, por ejemplo, las Patentes USA 5 565 324; 5 723 598;
5 834 195; 6 060 596;6 503 759; 6 507 945; 6 721 665; 6 714 875; y similares). Utilizando
estas estrategias de "marcacion", la identidad de los agentes ligantes positivos se puede determinar facilmente.
G)Union de los ligandos (fracciones de union) para producir un SHAL polidentado
Una vez que se identifican dos ligandos mas (fracciones de union) que se unen a diferentes puntos de la diana, los ligandos se enlazan directamente o a traves de un enlazador para producir un SHAL polidentado. Cuando se unen solamente dos ligandos el SHAL es bidentado. Cuando se unen tres ligandos el SHAL es tridentado y asf sucesivamente.
Los expertos en la tecnica conocen diversos metodos qmmicos para unir moleculas directamente o a traves de un enlazador. La qmmica espedfica empleada para unir los ligandos (fracciones de union) entre sf para formar un SHAL dependera de la naturaleza qmmica del ligando o los ligandos y del espacio deseado entre ligandos. Tfpicamente los ligandos contienen diversos grupos funcionales, por ejemplo acido carboxflico (COOH), grupos amino libres (-NH2), que estan disponibles para la reaccion con un grupo funcional adecuado de un enlazador o del otro ligando para unirse al ligando.
Alternativamente, el ligando o ligandos se pueden derivatizar para exponer o unir otros grupos funcionales reactivos. La derivatizacion puede implicar la union de cualquiera de una serie de moleculas enlazadoras, como las comercializadas por Pierce Chemical Company, Rockford (Illinois).
Un "enlazador", a efectos del presente, es una molecula que se utiliza para unir dos o mas ligandos (fracciones de union) para formar un SHAL polidentado. El enlazador se selecciona tfpicamente para ser capaz de formar enlaces covalentes con todos los ligandos incluidos en el SHAL. Los enlazadores adecuados son bien conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen, entre otros, enlazadores de
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carbono de cadena recta o ramificada, enlazadores de carbono heterodclicos, aminoacidos, acidos nucleicos, dendnmeros, poKmeros sinteticos, enlazadores peptidicos, analogos de peptidos y acidos nucleicos, carbohidratos, polietilenglicol y similares. Cuando uno o mas de los ligandos incluidos en el SHAL son polipeptidos, los enlazadores se pueden unir a los aminoacidos integrados a traves de sus grupos laterales (por ejemplo, a traves de un enlace disulfuro a la cistema) o a traves de los grupos amino o carboxilo del carbono alfa de los aminoacidos terminales.
En determinadas realizaciones, se puede utilizar un enlazador bifuncional que tiene un grupo funcional reactivo con un grupo del primer ligando y otro grupo reactivo con un grupo funcional del segundo ligando para formar el SHAl deseado. Alternativamente, la derivatizacion puede implicar el tratamiento qmmico del ligando o ligandos, por ejemplo el clivaje del glicol de la fraccion de azucar de la glicoprotema, el carbohidrato o acido nucleico con periodato para generar grupos aldehfdo libres. Los grupos aldehfdo libres se pueden hacer reaccionar con los grupos amino o hidrazina libres de un enlazador para unir el enlazador al ligando (vease, por ejemplo, la Patente USA n.° 4 671 958). Los procedimientos para la generacion de grupos sulfhidrilo libres en el polipeptido, como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, tambien son conocidos (vease la Patente USA n.° 4 659 839).
En determinadas realizaciones, se utilizan enlazadores basados en lisina, acido glutamico y polietilenglicol (PEG) de diferente longitud para acoplar los ligandos. Diversos SHAL se han sintetizado utilizando una combinacion de lisina y PEG para crear los enlazadores (veanse, por ejemplo, los Ejemplos y la Figura 13). La qmmica de la conjugacion de moleculas con PEG es bien conocida por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Veronese (2001) Biomaterials, 22:405-417; Zalipsky y Menon-Rudolph (1997) Pp. 318-341 In: Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications. J.M. Harris y X. Zalipsky (eds)., Am. Chem. Soc. Washington, D.C.; Delgado et al. (1992) Drug Carrier Syst., 9:249-304; Pedley et al. (1994) Br. J. Cancer, 70:1126-113-0; Eyre y Farver (1991) Pp.377-390 In: Textbook of Clinical Oncology, Holleb et al. (eds), Am.Cancer Soc., Atlanta GA; Lee et al. (1999) Bioconjug. Chem., 10:973-981; Nucci et al. (1991) Adv. Drug Deliv.,6:133-151; Francis et al. (1996) J. Drug Targeting, 3: 321-340).
Una caractenstica favorable del esquema sintetico utilizado para crear estos SHAL es que el enfoque permite la union de practicamente cualquier tipo de molecula a un tercer punto del enlazador. En la primera ronda de smtesis de SHAL, la biotina se ha unido a este punto para facilitar los estudios de union in vitro. El marcador de biotina hace posible medir rapidamente la union a la protema aislada por resonancia de plasmones superficiales y examinar la selectividad del SHAL para unirse a secciones de tejido y celulas vivas.
Una vez que el SHAL se ha sometido a ensayo y que se ha confirmado que se une a la diana (por ejemplo, HLA-DR10), se pueden anadir quelantes de metales como DOTA (u otros efectores) en la ronda final de smtesis para permitir la administracion de radionuclidos u otros efectores en las celulas portadoras diana (por ejemplo, celulas tumorales).
Despues de volver a someter a ensayo los conjugados efector-SHAL para reconfirmar su capacidad para unirse a la diana, los conjugados que presentan la mejor selectividad para sus dianas pueden,opcionalmente, someterse a ensayo para determinar su biodistribucion en organismos de ensayo (por ejemplo, ratones). Tambien se pueden anadir otras moleculas unicas a este punto en estudios futuros, por lo que estos mismos SHAL se pueden utilizar tambien, por ejemplo, para probar la utilidad de enfoques pre-focalizacion para la administracion de radioisotopos.
HISintesis gradual de SHAL en fase solida
En determinadas realizaciones, la smtesis de SHAL se produce a traves de un planteamiento de smtesis gradual en fase solida. En este enfoque cada componente del enlazador o ligando se une a una molecula creciente (SHAL) unida covalentemente a la superficie de una resina. Despues de cada reaccion qmmica la resina se puede lavar abundantemente para eliminar los productos que no han reaccionado.
En un enfoque, el DOTA se unio al enlazador al comienzo de la smtesis. Una vez lavado el exceso de DOTA, se realizaron multiples reacciones qmmicas adicionales sobre la resina para anadir los diversos enlazadores y ligandos, y tras cada reaccion se lavaron de nuevo los productos que no habfan reaccionado. Para el momento en el que la smtesis del SHAL se habfa completado, la cantidad de DOTA libre presente en la muestra era indetectable por HPLC y espectroscopia de masas. El enlace de DOTA es extremadamente estable, por lo que una vez que se ha unido no se desprende del SHAL.
I)Seleccion de SHAL en funcion de la afinidad y selectividad
En determinadas divulgaciones, una biblioteca de SHAL que comprende diferentes ligandos (fracciones de union) y/o que comprende enlazadores de diferente longitud se selecciona para identificar los SHAL que presentan la mejor afinidad y/o selectividad para la diana. Estos ensayos de seleccion se pueden realizar en diversos formatos incluyendo, entre otros, la seleccion por union a dianas aisladas, para seleccion por union a celulas en cultivo, la seleccion por union a celulas en arrays de tejidos y la seleccion por union in vivo a la diana deseada.
I.Union de SHAL a dianas aisladas (por ejemplo, protemas)
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En determinadas realizaciones, las afinidades de union de los mejores SHAL se puede estimar por espectrometna de masas de los complejos SHAL-diana, seguida de una medicion por espectroscopia de resonancia de plasmones superficiales (SPR) mas precisa (Shuck (1997) Annu Rev Biophys Biomol Struct.,26:541-566; Van Regenmortal (2o0l) Cell Mol Life Sci.,58:794-800) de la afinidad de union SHAL- diana utilizando, por ejemplo, los instrumentos IASYS Plus o BiaCore. A fin de realizar la medicion SPR, se puede anadir biotina al enlazador a traves de un tercer grupo funcional (como el anteriormente descrito) y el SHAL se puede unir a partfculas revestidas de estreptavidina disponibles en el mercado. En determinadas divulgaciones preferibles, solo se pueden considerar utiles los SHAL que presentan afinidades de union nM o superiores. Los SHAL que presentan la mayor afinidad se pueden someter a ensayo a continuacion para determinar su selectividad. Se pueden realizar experimentos para someter a ensayo la selectividad de los SHAL que se unen a las dianas en presencia de moleculas relacionadas con las dianas. Asf, por ejemplo, cuando el SHAL se dirige al HLA-DR10, se puede evaluar la capacidad del SHAL para unirse a moleculas diana en presencia de protemas de superficie de celulas Raji extrafdas y separadas por cromatograffa de afinidad. Despues de tratar el gel con el SHAL biotinilado y enjuagar el exceso de SHAL no unido, se puede detectar la ubicacion del SHAL unido mediante tincion con estreptavidina etiquetada con rodamina. En determinadas realizaciones, los SHAL que se considera que presentan una selectividad razonable por la protema pueden ser aquellas moleculas en las que el 95% o mas de la fluorescencia esta asociada con los picos de multimero y monomero de HLA-DR10.
2. Union de SHAL a celulas en cultivo
Cuando la diana del SHAL es un marcador en una celula (por ejemplo, un marcador de una celula cancengena), puede resultar recomendable valorar la especificidad de union del SHAL a las celulas intactas.
Los estudios de union de las celulas se pueden realizar con los SHAL biotinilados (o etiquetados de otro modo), utilizando por ejemplo la fluorescencia de la estreptavidina etiquetada con rodamina unida para confirmar los SHAL que se unen a celulas diana (por ejemplo, Raji). Si se observa que el SHAL se une, las mediciones SPR se pueden realizar para determinar la afinidad de las celulas intactas al SHAL. En determinadas realizaciones, los SHAL que presentan al menos una diferencia de dos veces, preferiblemente al menos de cinco veces y mas preferiblemente al menos de diez veces en la intensidad de tincion de las celulas diana (por ejemplo, tumor) sobre los controles se pueden seleccionar para su posterior ensayo y desarrollo. Los analogos de los SHAL mas prometedores se pueden sintetizar con una molecula DOTa unida al enlazador, y se pueden realizar experimentos de union utilizando SHAL etiquetados con radionuclidos para obtener mas datos cuantitativos y tambien para intentar determinar si el SHAL se mantiene en la superficie de la celula o se internaliza utilizando NanoSIMS u otros metodos.
Esta informacion resulta util para decidir acerca del tipo de radioisotopo que se va a cargar en el quelante. Si el SHAL permanece en la superficie, el SHAL se utiliza tfpicamente solo o con efectores que no requieren internalizacion (por ejemplo, emisores alfa como 90itrio, diversas etiquetas detectables y similares). Si se obtienen pruebas que sugieren que el SHAL es internalizado tras la union a las celulas diana, se puede utilizar el SHAL con efectores que son activos cuando se internalizan.
3. Analisis de selectividad celular utilizando arrays de tejidos
La tecnologfa array de tejidos se puede utilizar para seleccionar SHAL al objeto de determinar la especificidad del tejido (por ejemplo, reactividad del tejido maligno y normal en caso de SHAL anti-tumor). Los arrays de tejidos son bien conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Kononen et al. (1998) Nat Med.,4:844- 847; Torhorst et al. (2001) Am J Pathol., 159:2249-2256; Nocito et al. (2001) Int J Cancer, 94:1-5, y similares). En su forma basica, los microarrays de tejidos se forman tomando pequenos nucleos de cada caso/bloque de tumor individual y montando los nucleos en un unico bloque (Id.). Al seccionar este nuevo bloque, se pueden utilizar tecnicas de inmunohistoqmmica estandar e hibridacion in situ. Por tanto, se pueden someter a ensayo cientos de muestras de tejido en un experimento en lugar de tener que realizar cientos de experimentos diferentes. Las Figuras 2 y 3 resaltan como se pueden utilizar los arrays de tejidos y muestran un diagrama de un array de tejido ilustrativo.
En una divulgacion, para el array de tejidos normal hemos identificado 80 tejidos unicos, que incluyen orofaringe, corazon, pulmon, estomago, bazo, fugado, rinon, intestino, medula espinal, pancreas, vejiga, musculo, tejido adrenal, mama, cerebro, tejido prostatico normal y piel para la colocacion en el microarray de tejidos. Para un array de tejidos espedfico de linfocitos, hemos incluido lmeas de linfocitos neoplasicos, xenoinjertos y material de un paciente recogido del Human Biological Specimen Repository de UC Davis. Usando estos arrays de tejidos u otros similares, se puede determinar la union no espedfica de los SHAL a tejido normal y la union espedfica a neoplasias linfodticas y prostaticas. La hibridacion de los SHAL a los arrays de tejidos es directa. Utilizando SHAL biotinilados como los descritos en el presente, se puede utilizar facilmente estreptavidina etiquetada (por ejemplo, estreptavidina etiquetada con rodamina) para identificar las celulas que se unen a los SHAL. Cuando es necesario, los resultados de los microarrays de tejidos se pueden verificar mediante inmunohistologfa o histologfa convencional.
En un enfoque ilustrativo, se pueden perforar 2-4 cilindros de tejido, con un diametro de 0,6 mm desde las areas seleccionadas de cada bloque de tejido del "donante" e introducirse en un bloque de parafina receptor a fin de producir el microarray de tejido, utilizando un Tissue Microarrayer (por ejemplo, Beecher
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Instruments, Silver Spring, Maryland) y las tecnicas descritas por Kononen et al. (1998) Nat Med., 4:844847. A continuacion se pueden seccionar los portaobjetos con microarrays de tejido que contienen, por ejemplo, 200-400 nucleos, con un grosor de 4 pm. La tincion rutinaria con hematoxilina y eosina se puede realizar para verificar que cada nucleo representa su histopatolog^a seleccionada. Para la inmunohistoqmmica, se pueden utilizar microondas en un tampon de citrato para la recuperacion del anrtgeno. Las imagenes de los portaobjetos se pueden capturar mediante escaner confocal (ScanScope, Mountain View, CA) y visualizarse con MrSid Viewer 2.0 (LizardTech, Inc.) como se describe a continuacion. La capacidad para visualizar las imagenes del array de tejido en un ordenador en lugar de un microscopio aumenta drasticamente la eficiencia del analisis.
El principal obstaculo para la patolog^a digital ha sido la representacion de portaobjetos de vidrio en un formato digital. A diferencia de la radiologfa, que comienza por una representacion digital de un paciente por CR, MRI o ahora "pelfcula plana digital", la patologfa requiere que todas las muestras de tejido sean procesadas y convertidas en secciones de tejido tenidas montadas en portaobjetos de vidrio para la interpretacion. La nueva tecnologfa produce imagenes de todo el portaobjetos de vidrio, produciendo asf una verdadera representacion digital de la muestra histopatologica completa (Whole Slide Imaging). La mayona de los instrumentos actuales utilizan un microscopio equipado con una camara digital y una platina robotica para capturar miles de imagenes individuales. Cada imagen es enfocada por el experto en contenidos. Una vez capturadas, estas imagenes son rtpicamente cosidas (o dispuestas en forma de baldosas) para formar la representacion final del portaobjetos. El proceso lleva mucho tiempo y, debido al elevado numero de imagenes que implica, a menudo no estan bien alineadas.
ScanScope, (Aperio® Technology) es un nuevo tipo de escaner digital que
escanea un portaobjetos de microscopio en 3-5 minutos, capturando imagenes de 8-10 gigabytes a 50.000 dpi. A continuacion las imagenes se comprimen, procesan y almacenan para su presentacion (vease a continuacion).
MrSid® de Lizardtech® comprime las grandes imagenes de 8-10 gigabytes utilizando un formato Jpeg de ondfcula multicapa propio con ratios de compresion que alcanzan un ratio de 10:1 sin una degradacion significativa de la imagen. Las imagenes se pueden ver localmente o se pueden alojar en un servidor
web. A diferencia de las imagenes fijas estandar de la web, que normalmente se descargan para verlas con un navegador, las imagenes procesadas de MrSid se visualizan desde la web y la aplicacion del navegador nunca descarga la imagen completa. Dado que las imagenes se obtienen a su resolucion maxima, el servidor construye vistas de una imagen con un aumento "inferior". Utilizando la combinacion de ScanScope y el navegador Zoomify, se pueden capturar imagenes completas (12 gigabytes) y procesarse en menos de 20 minutos.
4.Analisis de selectividad in vivo
Por supuesto, la selectividad in vivo de un SHAL tambien se puede determinar con facilidad. Esto se puede conseguir administrando el SHAL a un animal de ensayo (por ejemplo, una rata de laboratorio) que comprende una celula o tejido que contiene la diana a la que esta dirigida el SHAL. Cuando ha transcurrido un tiempo suficiente, el animal puede ser sacrificado y el tejido o los tejidos diana y los tejidos normales se pueden examinar (por ejemplo, histologicamente) para evaluar la especificidad y la cantidad de administracion de SHAL. En determinadas realizaciones, el SHAL puede estar unido a un reactivo de captura de imagenes que permite la captura no invasiva de imagenes y, por tanto, permite la evaluacion de la farmacodinamica en tiempo real.
A tftulo ilustrativo, se pueden realizar estudios farmacocineticos y dosimetricos de radiacion con ratones, por ejemplo, en los SHAL ilustrados en los Ejemplos, para generar datos con los que seleccionar uno para los ensayos clmicos de farmacocinetica y dosimetna de radiacion en pacientes, utilizando los metodos establecidos. El estudio farmacocinetico se puede realizar en una hembra de raton nude que porta xenoinjertos de linfoma humano Raji de un tamano definido utilizando los metodos establecidos (DeNardo et al. (1998) Clin. Cancer Res.,4:2483-2490; Kukis etal. (1995) Cancer Res., 55:878-884). A los ratones se les pueden inyectar SHAL etiquetados con DOTA conteniendo 111In o 90Y y los ratones pueden ser sacrificados, por ejemplo, en cada uno de al menos cinco puntos temporales a fin de obtener muestras para el analisis. Los estudios iniciales se pueden realizar en los extremos de los puntos temporales temprano y tardfo previstos para estas pequenas moleculas, al objeto de poder determinar los puntos temporales intermedios. Se pueden utilizar los datos para los peptidos a fin de definir los puntos temporales extremos. Cuando se utiliza 111In o 90Y como trazador, el punto temporal mas largo sena rtpicamente de unos cinco dfas. La eliminacion completa del organismo se puede determinar utilizando un sistema detector de yoduro de sodio. La eliminacion de la sangre se puede controlar tomando muestras de sangre periodicas de las venas de la cola del raton. En el momento del sacrificio se puede extraer el xenoinjerto y tejidos normales, pesarse y contarse en un contador gamma de pocillos para obtener los datos de distribucion en los organos.
A fin de valorar el efecto (total) de la dosis de SHAL, se pueden realizar estudios, por ejemplo, a niveles de cinco dosis, una vez mas comenzando con pequenas y grandes cantidades de SHAL para guiar la seleccion de las cantidades intermedias a estudiar. Dado que los SHAL son algo novedoso, la seleccion
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de puntos temporales del estudio y los niveles de dosis tipicamente se guiaran por la informacion disponible para los estudios con anticuerpos (por ejemplo, Lym-1) en ratones y para, por ejemplo, los ligandos peptidicos del receptor de somatostatina.
En determinadas realizaciones, la dosimetna y farmacocinetica ideales a conseguir con nuestros SHAL son aquellas que se aproximan a lo que se ha conseguido utilizando yoduro de sodio (NAL) en el tratamiento de tumores de tiroides. Los SHAL seran los suficientemente pequenos como para penetrar completamente en la celula maligna y se excretaran facilmente por la orina. Tfpicamente, una afinidad de union y reconocimiento de la diana de al menos un orden de magnitud mejor para los linfomas y las leucemias que el de los anticuerpos actuales proporcionara la selectividad deseada de las celulas tumorales. A pesar de que la rapida eliminacion de la circulacion de las moleculas de menor tamano, como los SHAl, podna considerarse una desventaja, la notable efectividad del Nal en el tratamiento de tumores de tiroides ha demostrado que esta "desventaja" se puede convertir en una ventaja si el reactivo tiene la combinacion adecuada de afinidad y selectividad. Si se seleccionan bien los SHAL, tienen como diana unicamente una familia espedfica de celulas (por ejemplo, linfocitos B y sus afines malignos), se unen con fuerza con bajas tasas de desprendimiento, y se eliminan rapidamente del sistema, la dosis recibida por el tejido normal (respecto del maligno) sena sustancialmente menor que la obtenida utilizando los anticuerpos existentes dirigidos a una diana.
Utilizando los metodos establecidos (DeNardo et al. (2000) J. Nucl. Med., 41:952-958; DeNardo et al. (1999; J. Nucl. Med., 40:1317-1326; DeNardo et al. (1999; J. Nucl. Med., 40:302- 310; Shen et al. (1994) J. Nucl. Med., 35:1381-1389; Siegel (1994) J. Nucl. Med., 35:1213-1216) como directrices, se pueden desarrollar facilmente protocolos para realizar estudios farmacocineticos y de dosimetna de radiacion en pacientes con enfermedades linfomatosas de celulas B u otros canceres. Los niveles (totales) de la dosis de SHAL previstos se pueden determinar utilizando los datos generados en ratones y ajustarse para la BSA relativa de los ratones y pacientes utilizando los metodos conocidos (vease, por ejemplo, Freireich et al. (1996) Cancer Chemother. Rep., 50: 219-244). En determinadas realizaciones, se selecciona un protocolo que proporciona el nivel de dosis optimo utilizando informacion sobre los indices terapeuticos para tumor en medula para una estrategia no mieloablativa y tumor en organo no medular limitador de dosis para una estrategia mieloablativa.
J)Qptimizacion de la afinidad, selectividad y metabolismo del SHAL variando la longitud de enlazador y la estructura del enlazador y del ligando
La afinidad, selectividad y metabolismo del SHAL pueden optimizarse variando la longitud del SHAL y/o la estructura del enlazador y del ligando, utilizando modelos informaticos y estudios experimentales. Las longitudes de los enlazadores pueden reducirse o aumentarse para mejorar la afinidad del SHAL con su diana. Tambien se pueden realizar cambios en los ligandos individuales utilizados para crear el SHAL o introducir alteraciones en la estructura de los ligandos individuales para mejorar la union, la selectividad de la diana y optimizar la eliminacion de los SHAL no unidos del organismo. Las modificaciones en la estructura del propio enlazador tambien pueden plantearse para facilitar la eliminacion del SHAL, si procede, de los tejidos normales y de la sangre periferica a traves de la incorporacion de enlaces clivables (por ejemplo, un peptido u otro enlazador clivable) para unir el quelante al SHAL.
Si se observa que un SHAL concreto presenta una union no espedfica (por ejemplo, a muchas protemas en los extractos celulares o tanto a celulas Raji como de control), se pueden sintetizar SHAL adicionales utilizando diferentes pares de ligandos hasta que se identifique un SHAl con la especificidad adecuada.
I.Maximizacion de la afinidad de union del SHAL para la molecula(s) diana
La afinidad de union de los reactivos multidentados con las dianas de la protema o la superficie celular puede aumentarse uno o varios ordenes de magnitud cambiando y optimizando la longitud del enlazador que separa a los ligandos. Sin limitarse a una teona concreta, se cree que este aumento esta relacionado con la consecucion de la separacion optima entre los ligandos para permitir que estos se unan a sus puntos individuales, asf como con el hecho de facilitar una flexibilidad rotacional suficiente dentro del propio enlazador para permitir la interaccion optima de cada ligando dentro de su punto de union (por ejemplo, hendidura de union).
En determinadas realizaciones, la longitud inicial del enlazador elegido para su uso en los SHAL iniciales se identifica calculando la distancia entre los dos (o mas) ligandos unidos que se van a enlazar entre sf. Una vez que se determina que una combinacion concreta de ligandos enlazados realmente se une a la diana, se pueden realizar modelos adicionales para perfeccionar mas la longitud del enlazador y optimizar la afinidad de union de los SHAL.
Por ejemplo, cuando la diana es HLA-DR10, se pueden realizar modelos de la estructura de la subunidad beta de HLA-DR10 con los dos ligandos unidos en sus respectivas hendiduras y enlazadores PEG de diversas longitudes interconectando los ligandos (veanse, por ejemplo, los Ejemplos del presente documento). Con estudios de dinamica molecular se pueden evaluar las orientaciones de los ligandos unidos para mejorar el diseno del enlazador. Se pueden realizar otras simulaciones de dinamica molecular para incluir los enlazadores y los ligandos, simulando asf los ligandos polidentados que interactuan con la
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diana, por ejemplo, como los descritos aqrn.
Una vez que se obtienen los resultados de estos experimentos con modelos, puede sintetizarse un conjunto adicional de SHAL con enlazadores con un rango de los tamanos calculado como optimo, y sus afinidades de union pueden someterse a ensayos experimentales.
2.Optimizacion de la selectividad de la diana y del metabolismo del SHAL
Tambien pueden utilizarse metodos computacionales para determinar si los cambios en la estructura de los ligandos individuales que se enlazan para producir el SHAL mejoran la selectividad de la diana y optimizan el metabolismo del SHAL y su eliminacion de los tejidos normales y la circulacion periferica. Esto se puede conseguir, por ejemplo, examinando los tipos de grupos funcionales presentes en el interior de una hendidura de union establecida como diana y su ubicacion respecto al ligando unido.
Pueden realizarse estudios de dinamica molecular utilizando diferentes conformaciones del ligando y analogos de ligandos seleccionados para facilitar la identificacion de derivados de los ligandos que se ajustan de forma optima a cada punto de union (por ejemplo, hendidura). Pueden realizarse experimentos de difusion NMR (Lin et al. (1997) J. Organic Chem., 62:8930-8931) para comparar y clasificar las afinidades de un subconjunto de los analogos de los ligandos. Los analogos concretos elegidos para el analisis se seleccionan tfpicamente en funcion de los resultados proporcionados por modelos informaticos y por la disponibilidad en el mercado de estos analogos o por la facilidad de smtesis. Si se identifican experimentalmente analogos con una afinidad superior, puede sintetizarse un conjunto de SHAL nuevos y someterse a ensayo para determinar su afinidad, selectividad de union a dianas y propiedades metabolicas recomendables (por ejemplo, eliminacion rapida de la circulacion periferica, el hngado y el rinon).
En determinadas realizaciones, el pequeno tamano del SHAL puede provocar que se elimine de los tejidos con demasiada rapidez como para ser efectivo en la administracion de una cantidad adecuada del efector en las celulas diana. Si pasa esto, pueden utilizarse diversos enfoques para optimizar el tiempo de retencion del SHAL en el tejido diana. Uno implica el uso de un punto de union de biotina en el enlazador para anadir un tercer ligando que se una a otro punto de la diana. Se espera que esto aumente la afinidad del SHAL a niveles subpicomolares y reducir la tasa de desprendimiento de la molecula unida de forma drastica. Alternativamente, el tamano efectivo del SHAL puede aumentarse sustancialmente mediante la union a moleculas PEG multibrazo de mayor tamano y/o a otras moleculas.
KIEiemplos ilustrativos de SHAL
Utilizando las ensenanzas proporcionadas aqrn, puede prepararse facilmente una serie de SHAL diferentes que se unan, por ejemplo, a marcadores cancengenos (por ejemplo, el HLA-DR10). En determinadas realizaciones, los SHAL incluyen, entre otros, SHAL bidentados (comprendiendo dos ligandos de union), SHAL tridentados (comprendiendo tres ligandos de union), SHAL tetradentados (comprendiendo cuatro ligandos de union), SHAL pentadentados (comprendiendo cinco ligandos de union), etc. En diversas divulgaciones pueden ser multfmeros (por ejemplo, estructuras y/o complejos que comprenden dos, tres, cuatro, cinco o mas SHAL). Los SHAL pueden ser homomultimeros (comprendiendo dos, tres, cuatro, cinco o mas SHAL del mismo tipo) o heteromultimeros (comprendiendo, por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco o mas SHAL, donde al menos hay dos especies diferentes de SHAL).
En determinadas realizaciones, los SHAL comprenden uno o mas, preferiblemente dos o mas, o tres o mas ligandos descritos en cualquiera de las Tablas 1, 5, 6, 7 u 8 y/o analogos de estos. Determinados SHAL preferentes incluyen, entre otros, SHAL bidentados (veanse, por ejemplo, las Figuras 22 y 23), SHAL tridentados (vease, por ejemplo, la Figura 24A), SHAL bidentados dimericos, SHAL (bis) tridentados bimericos (vease, por ejemplo, la Figura 24B) y similares. En determinadas realizaciones, los SHAL comprenden uno o mas de los ligandos mostrados en la Tabla 1.
Tabla 1. Ejemplos ilustrativos de ligandos que se pueden incluir en los SHAL descritos aqrn. Algunos de estos (marcados con *) se podnan utilizar en lugar del ligando Ct o unirse al enlazador como un cuarto componente, lo que servina no para ayudar al SHAL a unirse mejor a la protema sino como inhibidor una vez que el SHAL entrase en el interior de la celula.
1
BOC-4-aminometil-L-Fe
2
*4[[5-(Trifluorometil)piridin-2-il]oxi]fenil]N-fenilcarbamato
3
*Acido (R)-2-[4-(5-cloro-3-fluoro-2-piridiloxi)fenoxi]propionico
4
*2-(((3-cloro-5(trifluorometil)piridin-2-iloxi)fenoxi)metil)acrilatos
5
*2-(((3-cloro-5(trifluorometil)piridin-2-iloxi)fenil)metil)acrilatos
6
*2-(((3-cloro-5(trifluorometil)piridin-2-iloxi)fenil)metil)acrilonitrilos
7
*Acido 3-(3-cloro-4-{[5-(trifluorometil)-2-piridinil]oxi}anilino)-3-oxopropanoico
8
*Setoxidim
9
*Cletodim
10
*Acido 5-(Tetradeciloxi)-2-furoico
11
*Acido 2-[(2,6-Diclorofenil)amino]bencenacetico
12
*Acido 2-[4-(4-Clorofenoxi)fenoxi]propanoico
13
*Acido (RS)-2-{4-[3-cloro-5-(trifluorometil)-2-piridinil]oxi]fenoxi}propanoico
14
*Acido (RS)-2-[4-(6-cloro-l,3-benzoxazol-2-iloxi)fenoxi]propanoico
15
*Acido (RS)-2-[4-(2,4-diclorofenoxi)fenoxi]propanoico
16
*Acido (RS)-2-{4-[5-(trifluorometil)-2-piridiloxi]fenoxijpropanoico
17
*Acido (RS)-2-[4-(6-cloroquinoxalin-2-iloxi)fenoxi]propanoico
18
*Acido (RS)-2-[4-(a,a,a-trifluoro-p-toliloxi)fenoxi]propanoico
19
5-([4,6-Diclorotriazin-2-il]amino)fluorescein hidrocloruro
20
Acido 3-[N-(4-acetilfenil)carbomoil]piridina-2-Carbox^lico
21
Acido 3-(2-{[3-cloro-5-(trifluorometil)-2-piridinil]oxi}anilino)-3-oxopropanoico
22
L-ornitina-beta-alanina
23
Acido 2-Metil-l-(3-lTlorfolinopropil)-5-fenil-lH-pirrol-3-carbox^lico
24
Acido hipurico
25
Hipuril-D-lisina
26
Hipuril-L-fenilalanina
Determinados ejemplos ilustrativos de SHAL tambien se muestran en laTabla2.
Tabla2. Listade ejemplos ilustrativos de SHAL multidentados, multidentados y quimericos y su peso molecular (MW en daltons). DOTA en el SHAL aporta otros 400 (o 244 en el caso de la biotina) daltons.
Acronimo
Identidad MW
Multidentado
LeacPLD
acetilado 5-leuencefalin PEG lisina desoxicolato 1.505
ItPLD
triiodotironina PEG lisina desoxicolato 1.559
DvLPBaPL
acido dabsil-L-valina lisina PEG N-benzoil-L-arginil-4-amino-benzoico PEG lisina 1.317
CtLPTPL
Acido 3-(2-([3-cloro-5-trifluorometil)-2-piridinil]oxi)- anilino)-3- oxopropanionico lisina PEG L-tironina PEG lisina 1.163
CtLPBaPL
Acido 3-(2-([3-cloro-5-trifluorometil)-2-piridinil]oxi)- anilino)-3- oxopropanionico lisina PEG acido N-benzoil-L- arginil-4-amino-benzoico PeG lisina 1.287
DvPLLCtPCbL
dabsil-L-valina PEG lisina lisina acido 3-(2-([3-cloro-5- trifluorometil)-2- piridinil]oxi)-anilino)-3- oxopropanionico PEG acido 4-[4-(4- clorobencil)piperacino]-3-nitrobencencarbox^lico 1.765
Dimerico, multidentado
(LeacPLD)2LP
(acetilado 5-leuencefalin PEG lisina desoxicolato)2 lisina PEG 3.006
(ItPDP)2LL
(triyodotironina PEG desoxicolato PEG)2 lisina lisina 3.113
5
10
15
20
25
(DvLPBaP)2LL
(Acido dabsil-L-valina lisina PEG N-benzoil-L-arginil-4- aminobenzoico PEG)2 lisina lisina 2.626
(DvLPBaPP)2LL
(Acido dabsil-L-valina lisina PEG N-benzoil-L-arginil-4- aminobenzoico PEG PEG)2 lisina lisina 2.921
(DvLPBaPPP)2LL
(Acido dabsil-L-valina lisina PEG N-benzoil-L-arginil-4- aminobenzoico PEG PEG PEG)2 lisina lisina 3.210
(DvLPBaPPPP)2LL
(Acido dabsil-L-valina lisina PEG N-benzoil-L-arginil-4- aminobenzoico PEG PEG PEG PEG)2 lisina lisina 3.501
(DvLCsPBaPPP)2CsLL
(Acido dabsil-L-valina lisina cisteico PEG acido N-benzoil-L- arginil-4- aminobenzoico PEG PEG PEG)2 acido cisteico lisina lisina 3.666
(DvPLLCtPCbPPP)2LL
(dabsil-L-valina PEG lisina lisina acido 3-(2-([3-cloro-5- trifluorometil) -2- piridinil] oxi) - anilino)- 3 - oxopropanionico PEG acido 4-[4-(4- clorobencil)piperacino]-3-nitrobenzencarboxflico PEG PEG PEG)2 lisina lisina 4.267
Se ha descubierto que diversos SHAL descritos aqu son efectivos solo para
inhibir el crecimiento y/o la proliferacion de una celula cancengena y en determinados casos matar la celula cancengena. Por tanto, los SHAL pueden utilizarse solos o unidos a uno o mas efectores, por ejemplo como los descritos aqm.
L)SHAL unidos a peptidos de transduccion
En determinadas realizaciones los SHAL incluyen (por ejemplo, estan unidos a) uno o mas peptidos de transduccion. Un peptido de transduccion es un peptido que actua como "lanzadera transmembrana", facilitando la entrada del peptido en una celula (por ejemplo, facilitando la penetracion en la membrana celular). Los peptidos de transduccion son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Estos peptidos incluyen, entre otros, la senal de localizacion nuclear (NLS) del antigeno T del virus del simio 40 (SV40) ((Yoneda (1997) J. Biochem., 121: 811-817), el dominio de transduccion de protema de la protema Tat del VIH (peptido Tat) (Vives et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:16010-16017; Schwarze et al. (1999) Science 285:1569-1572; Torchilin et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Set, EE.UU, 100: 1972-1977.), el peptido de union a integrina (peptido RGD) (Hart et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:12468-12474), el dominio de union a heparina de vitronectina (Vn peptide) (Vogel et al. (1993) J. Cell Biol. 121: 461 —468), protema antennapedia de Drosophila (vease, por ejemplo, Joliot et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 88: 1864-1868), penetratina (Tseng et al. (2002) Mol Pharmacol.,62:864-887), protemas intactas que pasan naturalmente a traves de membranas celulares (la protema del herpes virus VP22 (Phelan et al. (1998) Nat Biotechnol., 16: 440-443), transportadores de peptidos cationicos sinteticos como oligoarginina (Tung y Weissleder (2003) Adv. Drug Delivery Rev., 55: 281-294; Futaki (2005) Adv. Drug 20 Delivery Rev., 57: 547-558), poli-L-lisina lactosilada (Midoux et al. (1993) Nucl Acids Res., 21: 871-878), secuencias peptfdicas cortas seleccionadas de bibliotecas que presentan fagos (Kamada et al. Biol Pharm Bull. 30: 218-223; veanse tambien los peptidos 1-6 de la Tabla 3) que presentan similitudes de secuencia con lanzaderas de peptidos conocidos y similares.
Tabla 3: Ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoacidos de peptidos de transduccion.
Peptido
Secuencia Sec. ID. N.°
1
S-G-E-H-T-N-G-P-S-K-T-S-V-R-W-V-W-D 9
2
S-M-T-T-M-E-F-G-H-S-M-I-T-P-Y-K-I-D 10
3
Q-D-G-G-T-W-H-L-V-A-Y-C-A-K-S-H-R-Y 11
4
M-S-D-P-N-M-N-P-G-T-L-G-S-S-H-I-L-W 12
5
S-P-G-N-Q-S-T-G-V-I-G-T-P-S-F-S-N-H 13
6
S-S-G-A-N-Y-F-F-N-A-I-Y-D-F-L-S-N-F 14
8
G-T-S-R-A-N-S-Y-D-N-L-L-S-E-T-L-T-Q 15
Tatl3
G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R-P-P-Q 16
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Antennapedia
R-Q-I-K-I-WF-Q-N-R-R-M-K-WK-K 1
VP22
N-A-K-T-R-R-H-E-R-R-R-K-L-A-I-E-R 2
hexa-Arg
R-R-R-R-R-R 3
La anterior lista de peptidos de transduccion tiene unicamente caracter ilustrativo y no limitador. Un experto en la tecnica conocera y obtendra con facilidad otros peptidos de transduccion y utilizando las ensenanzas proporcionadas aqu podra incorporarlos/unirlos a un SHAL. Puede encontrarse una revision de ejemplos ilustrativos de peptidos de transduccion en Derossi et al. (1998) Trends Cell Biol. 8: 84-87.
(b)Fracciones quimericas que comprenden SHAL (por ejemplo, SHAL especificos del cancer)
Los SHAL de esta invencion definidos en las reivindicaciones se seleccionan para unirse de forma espedfica a dianas concretas. Cuando las dianas son marcadores caractensticos de un tipo de celula concreto (por ejemplo, una celula tumoral), los SHAL pueden utilizarse para administrar de forma espedfica uno o mas efectores en la celula diana.
En la invencion, los SHAL se unen espedficamente a las celulas cancengenas. En estas realizaciones, los SHAL se pueden utilizar solo como terapeuticos (por ejemplo, para inhibir el crecimiento y/o la proliferacion de una celula cancengena) y/o se pueden acoplar a un efector para conseguir una administracion eficiente y espedfica del efector (por ejemplo, una molecula efectora como una citotoxina, una radioetiqueta, etc.) en diversas celulas cancengenas (por ejemplo, celulas aisladas, celulas metastasicas, celulas tumorales solidas, etc.).
En determinadas realizaciones preferibles, los SHAL de esta invencion se utilizan en una estrategia de "preseleccion de la diana" (resultante en la formacion de una fraccion quimerica en el punto diana tras la administracion de la fraccion efectora) o en una estrategia de "seleccion de la diana" en la que el SHAL se une a una molecula efectora antes de su utilizacion para obtener una molecula quimerica.
Por molecula quimerica o composicion quimerica o fraccion quimerica se entiende una molecula o composicion en la que dos o mas moleculas que existen por separado en su estado natural se unen para formar una unica molecula que tiene la funcionalidad deseada de las moleculas que la componen. Tfpicamente, una o mas de las moleculas que componen una molecula quimerica es una "molecula de seleccion de diana", en este caso uno o mas SHAL. La molecula de seleccion de diana actua para dirigir la molecula quimerica a su diana concreta (por ejemplo, una celula cancengena).
Otro componente de la molecula quimerica es un "efector". Por molecula efectora se entiende una molecula o grupo de moleculas que se transporta espedficamente hasta la diana (por ejemplo, una celula cancengena). Cabe senalar que en este contexto dicho transporte espedfico no tiene que ser necesariamente hasta una celula cancengena, sino que basta simplemente con que proporcione una administracion preferencial del efector en la celula cancengena con respecto a las celulas sanas normales.
La molecula efectora tfpicamente tiene una actividad caractenstica que se ha de administrar a la celula diana. Entre las moleculas efectoras se incluyen, entre otras, citotoxinas, etiquetas, radionuclidos, ligandos, anticuerpos, farmacos, liposomas, nanopartfculas, partfculas virales, citoquinas y similares.
En determinadas realizaciones, el efector es una etiqueta detectable, donde las etiquetas detectables preferibles incluyen radionuclidos. Entre los radionuclidos y etiquetas utiles en los conjugados de radionuclido-quelante (por ejemplo, biotina) de la presente invencion, los emisores de gamma, emisores de positrones, emisores de rayos X y emisores de fluorescencia resultan adecuados para la localizacion, el diagnostico y/o la determinacion de la fase, y/o la terapia, mientras que los emisores de beta y alfa y los agentes de captura de electrones y neutrones, como el boro y el uranio, tambien se pueden utilizar para la terapia.
Las etiquetas detectables se pueden utilizar conjuntamente con un detector externo y/o un detector interno y proporcionar medios para localizar de forma efectiva y/o visualizar celulas cancengenas de prostata. Esta deteccion/visualizacion puede resultar util en diversos contextos que incluyen, entre otros, entornos preoperatorios e intraoperatorios. Por tanto, una determinada realizacion de esta invencion se refiere a un metodo para detectar intraoperatoriamente canceres en el cuerpo de un mairnfero. Estos metodos implican tfpicamente la administracion al mamffero de una composicion que comprende, en una cantidad suficiente para la deteccion a traves de un detector (por ejemplo, una sonda de deteccion de gamma), un SHAL espedfico del cancer con una etiqueta detectable (por ejemplo, anticuerpos de esta invencion etiquetados con un radioisotopo como 161Tb, 123I, 125I, y similares) y, despues de dejar que la sustancia activa sea absorbida por el tejido diana, y preferiblemente despues de la eliminacion de la etiqueta de la sangre, someter al mamffero a una tecnica de radioinmunodeteccion en el area correspondiente del cuerpo (por ejemplo, utilizando una sonda de deteccion gamma).
El SHAL unido a una etiqueta puede ser utilizado en la tecnica de cirugfa radioguiada, donde los tejidos correspondientes del cuerpo de un sujeto pueden detectarse y localizarse intraoperativamente a traves de
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un detector (por ejemplo, una sonda de deteccion de gamma). El cirujano puede, intraoperativamente, utilizar esta sonda para encontrar los tejidos en los que se ha producido la absorcion del compuesto etiquetado con un radioisotopo, que es, por ejemplo, un emisor de fotones gamma de baja energfa.
Ademas de etiquetas detectables, entre los efectores preferibles se incluyen las citotoxinas (por ejemplo, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, toxina de difteria y similares), o farmacos citotoxicos o profarmacos, en cuyo caso la molecula quimerica puede actuar como un potente agente para matar las celulas que dirige espedficamente la citotoxina a las celulas cancengenas.
En otras realizaciones, el efector puede incluir un liposoma que encapsula un farmaco (por ejemplo, un farmaco contra el cancer como doxirrubicina, vinblastina, taxol, etc.), un antigeno que estimula el reconocimiento de la celula unida por parte de los componentes del sistema inmunitario, un anticuerpo que se une espedficamente a componentes del sistema inmunitario y los dirige hasta el cancer, y similares.
A)Determinados efectores preferibles 1)Imagenes de las composiciones
En determinadas realizaciones, las moleculas quimericas de esta invencion pueden utilizarse para dirigir etiquetas detectables al punto de un tumor. Esto puede facilitar la deteccion y/o localizacion de un tumor. En determinadas realizaciones particularmente preferibles, el componente efector de la molecula quimerica es una etiqueta "radiopaca", por ejemplo una etiqueta que se puede visualizar con facilidad con rayos X. Los materiales radiopacos son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Los materiales radiopacos mas comunes incluyen el yodo, bromo o las sales de bario. Otros materiales radiopacos tambien son conocidos e incluyen, entre otros, derivados organicos del bismuto (vease, por ejemplo, la Patente USA 5 939 045), poliuretanos radiopacos (vease, por ejemplo, la Patente USA 5 346 981, compuestos de organobismuto (vease, por ejemplo, la Patente USA 5 256 334), complejos de polfmero de bario radiopacos (vease, por ejemplo, la Patente USA 4 866 132) y similares.
Los SHAL de esta invencion pueden unirse directamente a la fraccion radiopaca o pueden unirse a un "paquete" (por ejemplo, un quelato, un liposoma, una microperla de polfmeros, etc.) que porta o contiene el material radiopaco como se describe mas abajo.
Ademas de etiquetas radiopacas, otras etiquetas tambien resultan adecuadas para su uso en la presente invencion. Entre las etiquetas adecuadas para su uso como componente de la molecula efectora de las moleculas quimericas de la presente invencion se incluye cualquier composicion detectable por medios espectroscopicos, fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunoqmmicos, electricos, opticos o qmmicos.
Entre las etiquetas utiles de la presente invencion se incluyen perlas magneticas (por ejemplo, Dynabeads™), tintes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluorescema rojo texas, rodamina, protema fluorescente verde y similares), radioetiquetas (por ejemplo, 3H, 1251, 35S, 14C, 32P, 18F, etc.) u otras etiquetas para la captura de imagenes, enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rabano, fosfatasa alcalina y otras habitualmente utilizadas en un ensayo ELISA), y etiquetas colorimetricas como perlas de oro coloidal o plastico o cristal coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, latex, etc.).
Las diversas radioetiquetas preferibles incluyen, entre otras, 99Tc, 203Pb, 67Ga,
68Ga, 72As, 111In, 113mIn, 97Ru, 62Cu, 641Cu, 52Fe, 52mMn, 51Cr, 186Re, 188Re, 77As, 90Y, 67Cu,
169Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 159Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, and 111Ag.
Los medios para detectar estas etiquetas son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Asf, por ejemplo, se pueden detectar radioetiquetas utilizando pelfcula fotografica, detectores de centelleo y similares. Los marcadores fluorescentes se pueden detectar utilizando un fotodetector para detectar la iluminacion emitida. Las etiquetas enzimaticas se detectan tfpicamente proporcionando a la enzima un sustrato y detectando el producto de reaccion producido por la accion de la enzima sobre el sustrato, y las etiquetas colorimetricas se detectan simplemente visualizando la etiqueta coloreada.
2)Radiosensibilizadores
En otra realizacion, el efector puede ser un radiosensibilizador que mejora el efecto citotoxico de la radiacion ionizante (por ejemplo, como la que podna producir el 60Co o una
fuente de rayos X) sobre una celula. Se conocen numerosos agentes radiosensibilizadores e incluyen, entre otros, compuestos derivados de la benzoporfirina (vease, por ejemplo, la Patente USA 5 945 439), oxidos de 1,2,4- benzotriacina (vease, por ejemplo, la Patente USA 5 849 738), compuestos que contienen determinadas diaminas (vease, por ejemplo, la Patente USA 5 700 825), BCNT (vease, por ejemplo, la Patente USA 5 872 107), derivados de amida de acido nitrobenzoico radiosensibilizadores (vease, por ejemplo, la Patente USA 4 474 814), diversos derivados heterodclicos (vease, por ejemplo, la Patente USA 5 064 849), complejos de platino (vease, por ejemplo, la Patente USA 4 921 963) y similares.
3)Radiois6topos
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En determinadas realizaciones, el efector comprende uno o mas radioisotopos que cuando se administran a una celula diana provocan la muerte de la celula inducida por radiacion.
Con fines medicos, los tipos de deterioro celular mas importantes son la emision de gamma, beta, alfa y la captura de electrones. Las partfculas gamma emitidas por un radionuclido, como 131I, salen del cuerpo, permitiendo el uso de imagenes de gammograffa externas para determinar la biodistribucion de los anticuerpos radioetiquetados (el rango de energfa optimo para la inmunogammagraffa es 100-250 keV). Por el contrario, las partfculas beta depositan la mayor parte de su enerafa a unos cuantos milfmetros del punto de deterioro. Las emisiones de beta de radionuclidos como 131I o “Y que tienen como diana celulas tumorales positivas en antfgeno pueden matar las celulas cercanas antigeno-negativas a traves del efecto de "fuego cruzado".
El ittrium-90, un emisor de beta puro, tiene diversas propiedades que lo convierten en una
opcion atractiva para la radioinmunoterapia: 1) una energfa beta elevada (Emax=2,29 MeV;
rango maximo de energfa de partfculas en tejido =11,9 mm) que le permite matar celulas tumorales adyacentes; 2) qrnmica de metal, que facilita la smtesis de conjugados radioisotopo-anticuerpo y el uso de un enfoque de preseleccion de la diana; y 3) una vida util ffsica lo suficientemente prolongada (2,67 dfas) para su uso en SHAL intactos, que pueden tardar 1-3 dfas en alcanzar su concentracion maxima en tumores.
En determinadas realizaciones, el efector puede incluir un emisor alfa, es decir un
isotopo radiactivo que emite partfculas alfa y/o emisor electron Auger. Recientemente se ha demostrado que los emisores alfa y los emisores electron Auger resultan efectivos en el tratamiento del cancer (vease, por ejemplo, Bodei et al. (2003) Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, 18:861). Los emisores alfa adecuados incluyen, entre otros, 212Bi, 213Bi,211At, y similares.
La Tabla 4 ilustra algunos radionuclidos adecuados para la radioinmunoterapia.
La lista se ofrece a tftulo ilustrativo y sin caracter limitador.
Tabla4: Ejemplos ilustrativos de radionuclidos adecuados para radioinmunoterapia.
Radio nuclido
Modo deterioro Vida 1 ffsica Ene^a particulada max. (%) Ventajas Desventajas
1-131
P,Y 8d 807 keV (1)* 606 keV (86)* 336 keV(13)* Qrnmica yodo, economico Deshalogenacion, preocupaciones seguridad radiacion
Cu-67
P,Y 62h 577keV (20)* 484 keV (35)* 395 keV(45)* Imagenes, qrnmica metal, larga retencion en tumor Escaso
Lu-177
P,Y 6.7d 497keV (90)* 384 keV (3)* 175 keV(7)* Imagenes Escaso, detector hueso
Re-186
P,Y electron captura 91h 1.07MeV (77)* 934 keV (23)* Qrnmica 99mTc Escaso
Y-90
P 64h 2,29 MeV (100)* Qrnmica metal Sin imagenes, detector hueso
Re-188
P 17h 2,13 MeV (100)* Escaso, vida util corta
Bi-212
a, P 1h 6,09 MeV (27)** Sin imagenes, vida util corta, producto obtenido inestable
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At-211
a, captura de electron 7h 5,87 MeV (100)** RBE elevada, hipoxia menos importante, rango corto Sin imagenes, vida util corta, producto obtenido inestable
1-125
captura de electron 60d 35 keV (100) Rango corto Sin imagenes, vita util larga
* irradiacion beta
** irradiacion alfa
RBE, efectividad biologica relativa
4) Ligandos
En diversas realizaciones, la molecula efectora tambien puede ser un ligando, un marcador de epftopo o un anticuerpo. En particular, el ligando y los anticuerpos preferibles son aquellos que se unen a los marcadores de superficie de las celulas inmunes. La moleculas quimericas que utilizan estos anticuerpos como moleculas efectoras actuan como enlazadores bifuncionales que establecen una asociacion entre las celulas inmunes que portan el vinculante de union para el ligando o el anticuerpo y la celula o celulas del cancer de prostata.
5) Quelatos
Muchos de los productos farmaceuticos y/o radioetiquetas descritos aqu se proporcionan preferiblemente en forma de quelatos, en particular cuando se utiliza una estrategia de preseleccion de la diana. La molecula quelante se une tfpicamente a una molecula (por ejemplo, biotina, avidina, estreptavidina, etc.) que se une espedficamente a un marcador de epftopo unido a un anticuerpo espedfico para el cancer de prostata de esta invencion.
Los grupos quelantes son bien conocidos por los expertos en la tecnica. En determinadas realizaciones, los grupos quelantes se obtienen de acido diamina tetra-acetico (EDTA), acido dietileno triamina penta- acetico (DTPA), acido ciclohexil 1,2-diamina tetra-acetico (CDTA), acido ethilenglicol-0,0'-bis(2-aminoetil)- N,N,N',N'-tetra-acetico (EGTA), acido N,N- bis(hidroxibencil)-etilendiamina-N,N-diacetico (HBED), acido trietileno tetramina hexa-acetico (TTHA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N-,N",N"-tetra-acetico (DOTA), acido hidroxietildiamina triacetico (HEDTA), acido 1,4,8,11-tetra-azaciclotetradecano- N,N',N",N"'-tetra-acetico (TETA), DTPA sustituido, EDTA sustituido y similares (vease, por ejemplo, la Figura 22).
Entre los ejemplos de determinados quelantes preferibles se incluyen 2-iminotiolanos y 2- iminotiaciclohexanos, no sustituidos o sustituidos, en particular 2-imino-4-mercaptometiltiolano.
Un agente quelante, el acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N, N, N", N'"-tetraacetico (DOTA), resulta de particular interes por su capacidad para quelar una serie de metales importantes desde el punto de vista diagnostico y terapeutico, tales como radionuclidos y radioetiquetas.
Se han descrito conjugados de DOTA y protemas, tales como anticuerpos. Por ejemplo, la Patente USA n.° 5 428 156 explica un metodo para conjugar DOTA con anticuerpos
y fragmentos de anticuerpos. Para producir estos conjugados, un grupo de acido carboxflico de DOTA se convierte en un ester activo que puede reaccionar con un grupo amino o sulfhidrilo del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Lewis et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5: 565-576, describe un metodo similar
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en el que un grupo carboxilo del DOTA se convierte en un ester activo, y el DOTA activado se mezcla con un anticuerpo, uniendo el anticuerpo al DOTA a traves del grupo epsilon-amino de un residuo de lisina del anticuerpo, convirtiendo asf un grupo carboxilo del DOTA en una fraccion amida.
Alternativamente, el agente quelante se puede unir, directamente o a traves de un enlazador, a un marcador de epftopo o a una fraccion que se une a un marcador de epftopo. Se han descrito conjugados de DOTA y biotina (vease, por ejemplo, Su (1995) J. Nucl. Med., 36 (5 Supl):154P, que divulga la union de DOTA con biotina a traves de derivados de la biotina con una cadena lateral amino, tales como DOTA-LC- biotina o DOTA-bencil-4-(6-amino-caproamida)-biotina). Yau et al., WO 95/15335, divulgan un metodo para producir compuestos de nitro-bencil-DOTA que se pueden conjugar con biotina. El metodo comprende una reaccion de ciclizacion a traves de la proyeccion transitoria del grupo hidroxi; tosilacion de una amina; desproteccion del grupo hidroxi transitoriamente protegido; tosilacion del grupo hidroxi desprotegido; y ciclizacion del tosilato intramolecular. Wu et al. (1992) Nucl. Med. Biol., 19(2):239-244 divulgan una smtesis de 5 agentes quelantes macrodclicos para radioetiquetar protemas con 111In e 90Y. Wu et al. producen un conjugado de DOTA-biotina etiquetado para estudiar la estabilidad y biodistribucion de conjugados con avidina, un modelo de protema para los estudios. Este conjugado se produjo utilizando una hidrazida de biotina que conterna un grupo amino libre para reaccionar con un derivado de DOTA activado generado in situ.
Cabe senalar que el agente quelante macrodclico acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N”,N”'-
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tetraacetico (DOTA) se une a Y y In con una estabilidad extraordinaria. Los estudios cineticos en tampones seleccionados para calcular los tipos de reaccion del radioetiquetado en un etiquetado radiofarmaceutico prospectivo se pueden realizar para determinar las condiciones optimas de radioetiquetado para proporcionar elevados rendimientos del producto coherentes con los requisitos de la FDA
para un producto radiofarmaceutico. Cabe senalar asimismo que los protocolos para producir quelatos Yttrio-90-DOTA se describen detalladamente en Kukis et al. (1998) J. Nucl. Med., 39(12):2105-2110.
6)Citotoxinas
Los SHAL de la presente invencion se pueden utilizar para proporcionar una variedad de farmacos citotoxicos, incluyendo farmacos terapeuticos, un compuesto que emite radiacion, moleculas de plantas, protemas biologicas de origen fungico o bacteriano y mezclas de estos. Los farmacos citotoxicos pueden ser farmacos citotoxicos que actuan a nivel intracelular, como emisores de radiacion de corto alcance, entre los que se incluyen, por ejemplo, emisores alfa de alta energfa y corto alcance como los anteriormente descritos o inhibidores de enzimas.
Entre los ejemplos de toxinas y fragmentos de estas enzimaticamente activos se incluyen el fragmento A de la toxina de la difteria, fragmentos activos no vinculantes de toxina de la difteria. exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de la ricina, cadena A de la abrina, cadena A de la modeccina, alfa- sarcina, determinadas protemas de Aleurites fordii proteins, determinadas protemas de Dianthin, protemas de Phytolacca americana (PAP, PAPII y PAP-S), inhibidor de Morodica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogillina, restrictocina, fenomicina y enomicina, entre otros.
Entre las citotoxinas particularmente preferibles se incluyen las exotoxinas de Pseudomonas exotoxins, toxinas de difteria, ricina y abrina. La exotoxina A de Pseudomonas (PE) es una protema monomerica extremadamente activa (peso molecular 66 kD), secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la smtesis protemica en celulas eucariotas a traves de la inactivacion del factor de elongacion 2 (EF-2) catalizando su ADP-ribosilacion (catalizando la transferencia de la fraccion ADP-ribosil de la NAD oxidada en el EF-2).
La toxina contiene tres dominios estructurales que actuan conjuntamente para causar la citotoxicidad. El dominio la (aminoacidos 1-252) media en la union de la celula. El dominio II (aminoacidos 253-364) es responsable de la translocacion en el citosol y el dominio III (aminoacidos 400-613) media en la ribosilacion de ADP del factor de elongacion 2 que inactiva la protema y provoca la muerte celular. La funcion del dominio Ib (aminoacidos 365-399) todavfa no se ha definido, aunque una gran parte de este (aminoacidos 365-380) se puede eliminar sin perdida de citotoxicidad (vease, por ejemplo, Siegall et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 14256-14261).
Cuando el SHAL esta unido a la PE, una molecula preferible de PE es aquella en la que el dominio Ia (aminoacidos 1 a 252) es eliminado y los aminoacidos 365 a 380 han sido eliminados del dominio Ib. Sin embargo, tanto el dominio Ib como una porcion del dominio II (aminoacidos 350 a 394) pueden ser eliminados, en particular si las secuencias eliminadas son sustituidas por un peptido de union como GGGGS (SEC. ID N.°: 20).
Por otra parte, las moleculas de PE tambien se pueden modificar utilizando mutagenesis dirigida al punto u otras tecnicas conocidas, con el objeto de alterar la molecula para una aplicacion deseada concreta. Tambien se pueden utilizar medios para alterar la molecula de PE de forma que no afecte sustancialmente
a las ventajas funcionales que proporcionan las moleculas de PE descritas aqrn y se pretende que estas moleculas resultantes esten cubiertas en este documento.
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Para las maximas propiedades citotoxicas de una molecula de PE preferible, se recomiendan varias modificaciones de la molecula. Una secuencia terminal carboxilo adecuada para la molecula recombinante resulta preferible para translocar la molecula en el citosol de las celulas diana. Entre las secuencias de aminoacidos que se ha descubierto que son efectivas se incluyen, REDLK (SEC. ID. N.°: 21) (como en la PE nativa), REDL (SEC. ID. N.°: 22), RDEL (SEC. ID. N.°: 23) o KDEL (SEC. ID. N.°: 24), las repeticiones de estas, u otras secuencias que funcionan para mantener o reciclar protemas en el retfculo endoplasmatico, denominadas aqu "secuencias de retencion endoplasmatica". Vease, por ejemplo, Chaudhary et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:308-312 y Seetharam et al, J. Biol. Chem. 266:17376-17381. Las formas preferibles de PE comprenden la molecula de PE designada PE38QQR. (Debinski et al. Bioconj. Chem., 5:40 (1994)), y PE4E (vease, por ejemplo, Chaudhary et al. (1995) J. Biol. Chem., 265:16306).
Los metodos para clonar genes que codifican PE y para unir estas citotoxinas a las fracciones de seleccion de diana son bien conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Siegall et al. (1989) FASEB J., 3: 2647-2652; y Chaudhary et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 84: 4538- 4542, y las referencias de estos).
Al igual que la PE, la toxina de difteria (DT) mata las celulas mediante ribosilacion de ADP del factor de elongacion 2, inhibiendo asf la smtesis protemica. Sin embargo, la toxina de la difteria se divide en dos cadenas, A y B, unidas por un puente de disulfuro. A diferencia de la PE, la cadena B de DT, que se encuentra en el extremo carboxilo, es responsable de la union del receptor y la cadena A, que se encuentra presente en el extremo amino, contiene la actividad enzimatica (Uchida et a/.(1972) Science, 175:901-903;
Uchida et al. (1973) /. Biol. Chem., 248:3838-3844).
En realizaciones preferibles, el SHAL-moleculas quimericas de la toxina de la difteria
de esta invencion tiene el dominio de union del receptor nativo eliminado mediante truncamiento de la cadena B de la toxina de la difteria. Particularmente preferible resulta la DT388, una DT en la que se elimina la secuencia terminal carboxilo que comienza en el residuo 389. Chaudhary et al. (1991) Bioch. Biophys. Res. Comm., 180: 545-551. Al igual que las citotoxinas quimericas de PE, las moleculas de DT se pueden conjugar qmmicamente con el anticuerpo espedfico del cancer de prostata, pero en determinadas realizaciones preferibles el anticuerpo se fusionara con la toxina de la difteria por medios recombinantes (vease, por ejemplo, Williams et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 11885-11889).
7)Particulas virales
En determinadas realizaciones, el efector comprende una partfcula viral. El SHAL
se puede conjugar con la partfcula viral, por ejemplo a traves de una protema expresada en la superficie de la partfcula viral (por ejemplo, un fago filamentoso). La partfcula viral puede incluir adicionalmente un acido nucleico que se pretende administrar a la celula diana (cancer de prostata). El uso de partfculas virales para administrar acidos nucleicos a las celulas se describe en detalle en WO 99/55720.
8) Otras fracciones terapeuticas
Otras moleculas efectoras adecuadas incluyen agentes farmacologicos o sistemas de encapsulacion que contienen diversos agentes farmacologicos. De este modo, el SHAL se puede unir directamente a un farmaco que se va a administrar directamente en el tumor. Estos farmacos son bien conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen, entre otros, doxorrubicina, vinblastina, genistema, una molecula antisentido y similares.
Alternativamente, la molecula efectora puede comprender un sistema de encapsulacion, como una capside vmca, un liposoma, o una micela que contiene una composicion terapeutica como un farmaco, un acido nucleico (por ejemplo, un acido nucleico antisentido u otro acido nucleico que se pretende administrar a la celula) u otra fraccion terapeutica que esta preferiblemente protegida frente a la exposicion directa al sistema circulatorio. Los medios de preparacion de liposomas unidos a anticuerpos son bien
conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, la Patente USA n.° 4 957 735, Connor et al. (1985) Pharm. Ther., 28: 341-365) y se pueden utilizar metodos similares para unir los SHAL.
B)Union del SHAL al efector
Un experto en la tecnica apreciara que los SHAL de esta invencion y la molecula o moleculas efectoras se pueden unir en cualquier orden. Asf, en diversas realizaciones, el efector se puede unir a cualquier ligando que comprende el SHAL y/o al enlazador que se une a los diversos ligandos que comprenden el SHAL.
Al SHAL y el efector se puede unir cualquier numero de medios bien conocidos por los expertos en la tecnica. Tfpicamente el efector se conjuga, directamente o a traves de un enlazador (separador), con el SHAL.
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En una realizacion, el SHAL se conjuga qmmicamente con la molecula efectora (por ejemplo, una citotoxina, una etiqueta, un ligando, o un farmaco o liposoma, etc.). Los medios para conjugar qmmicamente las moleculas son bien conocidos por los expertos en la tecnica.
El procedimiento para unir un efector con un SHAL variara en funcion de la estructura qmmica del efector y/o el SHAL. Los ligandos comprendiendo el SHAL
y/o el enlazador que se une a los ligandos pueden contener una variedad de grupos funcionales; por ejemplo, acido carbox^lico (COOH), amina libre (-NH2), hidroxil (-OH), tiol (-SH), y otros grupos, que estan disponibles para la reaccion con un grupo funcional adecuado de una molecula efectora o de un enlazador unido a la molecula efectora para unir efectivamente el efector al SHAL.
Alternativamente, el ligando o los ligandos que comprenden el SHAL y/o el enlazador que se une a los ligandos se pueden derivatizar para exponer o unir los grupos funcionales reactivos adicionales. La derivatizacion puede implicar la union de cualquiera de una serie de moleculas enlazadoras como las descritas anteriormente para unir los ligandos entre sf.
En algunas circunstancias, resulta deseable liberar el efector del SHAL cuando la molecula quimerica ha alcanzado su punto diana. Por tanto, los conjugados quimericos que comprenden enlaces que son clivables, por ejemplo, en los alrededores del punto diana se pueden utilizar cuando el efector se va a liberar del SHAL. El clivaje del enlace para liberar el agente del anticuerpo se puede provocar mediante la actividad enzimatica o por las condiciones a las que esta sometido el conjugado, por ejemplo dentro de la celula diana o en los alrededores del punto diana. Cuando el punto diana es un tumor, se puede utilizar un enlazador que es clivable en las condiciones presentes en el punto del tumor (por ejemplo, cuando esta expuesto a enzimas asociadas al tumor o pH acido).
En determinados ejemplos, el enlazador clivable puede ser un peptido que se puede someter a proteolisis. En determinadas realizaciones, el enlazador clivable comprende un peptido que tiene un punto de reconocimiento para una proteasa.
Una serie de enlazadores diferentes son conocidos por los expertos en la tecnica.
Veanse las Patentes USA N.° 4 618 492, 4 542 225 y 4 625 014. Los mecanismos para la liberacion de un agente de estos grupos de enlazadores incluyen, por ejemplo, la irradiacion de un enlace fotolabil y la hidrolisis acida catalizada. La Patente USA n.° 4 671 958, por ejemplo, incluye una descripcion de inmunoconjugados que comprenden enlazadores que son clivados en el punto diana in vivo por las enzimas proteolfticas del sistema del complemento del paciente. En vista del gran numero de metodos que se han documentado para conseguir una variedad de compuestos de radiodiagnostico, compuestos radioterapeuticos, farmacos, toxinas y otros agentes para anticuerpos, un experto en la tecnica sera capaz de determinar un metodo adecuado para unir un agente dado a un anticuerpo u otro polipeptido.
1) Coniugacion de quelatos
En determinadas realizaciones preferibles, el efector comprende un quelato que se une a un anticuerpo o a un marcador de epftopo. El SHAL espedfico del cancer porta el correspondiente marcador de epttopo o anticuerpo para que el simple contacto del SHAL con el quelato provoque la union del SHAL al efector. El paso de combinacion se puede realizar antes de utilizar la fraccion (estrategia de seleccion de diana) o el tejido diana se puede unir al SHAL antes de administrar el quelato. Los metodos para producir quelatos apropiados para la union a diversas fracciones de seleccion de diana son bien conocidos en la tecnica (veanse, por ejemplo, las Patentes USA n.° 6 190 923, 6 187 285, 6 183 721, 6 177 562, 6 159 445, 6 153 775, 6 149 890, 6 143 276, 6 143 274, 6 139 819, 6 132 764, 6 123 923, 6 123 921, 6 120 768,
6 120 751, 6 117 412, 6 106 866, 6 096 290, 6 093 382, 6 090 800, 6 090 408, 6 088 613, 6 077 499,
6 075 010, 6 071 494, 6 071 490, 6 060 040, 6 056 939, 6 051 207, 6 048 979, 6 045 821, 6 045 775,
6 030 840, 6 028 066, 6 022 966, 6 022 523, 6 022 522, 6 017 522, 6 015 897, 6 010 682, 6 010 681,
6 004 533, 6 001 329 y similares).
(c)SHAL que inhiben receptores, enzimas y otras biomoleculas
En determinadas realizaciones, esta invencion proporciona SHALs que inhiben la actividad de enzimas, receptores o la actividad de otras biomoleculas. Tfpicamente estos SHAL comprenden ligandos que se unen a diferentes puntos alrededor o cerca del punto activo o del punto de union de la enzima o el receptor. En determinadas realizaciones, los ligandos se seleccionan para unirse a una primera hendidura y una segunda hendidura de la enzima, el receptor u otra protema de union, donde la primera y la segunda hendidura flanquean los lados opuestos del punto activo o punto de union de dicha enzima, receptor u otra protema de union, o donde la primera hendidura comprende o esta ubicada en el punto activo y la segunda hendidura se encuentra cerca/adyacente a la primera hendidura, o cualquiera de las hendiduras o ambas se encuentran en el punto o lo suficientemente cerca del punto utilizado por la protema, la enzima o receptor para unirse a otra molecula, de forma que la union de un ligando a una de las hendiduras o a ambas interrumpe o bloquea la union de la enzima, el receptor u otra biomolecula con su ligando afm. Cuando el SHAL se pone en contacto con su diana, se une a la diana efectivamente bloqueando el punto activo y/o el punto de union, inhabilitando asf la actividad de la enzima, el receptor u otra biomolecula.
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IV) Composiciones farmaceuticas
Los SHAL y/o quelatos y/o moleculas quimericas de esta invencion (en particular aquellos espedficos para el cancer u otras celulas patologicas) resultan utiles para la administracion parenteral, topica, oral o local (por ejemplo, inyectada en el punto de un tumor), administracion mediante aerosol o transdermica, con fines profilacticos, aunque principalmente para el tratamiento terapeutico.
Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar en diversas formas de dosis unitarias, dependiendo del metodo de administracion. Por ejemplo, las formas de dosis unitarias adecuadas para la administracion oral incluyen formulaciones en polvo, comprimidos, pfldoras, capsulas y pastillas. Se reconoce que las composiciones farmaceuticas de esta invencion, cuando se administran por via oral, pueden estar protegidas de la digestion. Esto se consigue tipicamente produciendo un complejo con el componente activo (por ejemplo, el SHAL, la molecula quimerica, etc.) y una composicion para hacerlo resistente a la hidrolisis acida y enzimatica o encapsulando el ingrediente(s) activo en un vetnculo convenientemente resistente como un liposoma. Los medios para proteger los componentes frente a la digestion son bien conocidos en la tecnica.
Las composiciones farmaceuticas de esta invencion resultan particularmente utiles para la administracion parenteral, como la administracion intravenosa o la administracion en una cavidad corporal o el lumen de un organo. Las composiciones para la administracion comprenderan normalmente una solucion del SHAL y/o la molecula quimerica disuelta en un vetnculo farmaceuticamente aceptable, preferiblemente un vetnculo acuoso. Se pueden utilizar diversos vetnculos acuosos, por ejemplo una solucion tampon salina y similares. Estas soluciones son esteriles y por lo general no contienen materia no deseada. Estas composiciones se pueden esterilizar utilizando tecnicas de esterilizacion convencionales bien conocidas. Estas composiciones pueden contener las sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables necesarias para aproximarse a las condiciones fisiologicas, como agentes de ajuste del pH y tampon, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, tales como acetato sodico, cloruro sodico, cloruro potasico, cloruro calcico, lactato sodico y similares. La concentracion de la molecula quimerica en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionara sobre todo basandose en los volumenes del fluido, las viscosidades, el peso corporal y similares conforme con el modo de administracion particular seleccionado y de las necesidades del paciente.
Por tanto, una composicion farmaceutica tfpica para administracion intravenosa
sena de entre 0,1 y 10 mg por paciente y dfa. Se pueden utilizar dosis de entre 0,1 y unos 100 mg por paciente y dfa, particularmente cuando el farmaco se administra en un punto apartado y no en el torrente sangumeo, como una cavidad corporal o el lumen de un organo. Los metodos reales para preparar composiciones de administracion parenteral seran conocidos o evidentes para los expertos en la tecnica y se describen mas detalladamente en publicaciones como Remington's Pharmaceutical Science, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).
Las composiciones que contienen los SHAL y/o moleculas quimericas del presente
o un coctel de estos (es decir, con otros terapeuticos) se pueden administrar para tratamientos terapeuticos. En aplicaciones terapeuticas, las composiciones se administran a un paciente que sufre una enfermedad, como un cancer, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. La cantidad adecuada para conseguirlo se define como "dosis terapeuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso dependeran de la gravedad de la enfermedad y del estado de salud general del paciente.
Se pueden realizar administraciones unicas o multiples de las composiciones dependiendo de la dosis y la frecuencia necesarias y toleradas por el paciente. En cualquier caso, la composicion debera proporcionar una cantidad suficiente de los SHAL para tratar efectivamente al paciente.
Un experto en la tecnica apreciara que hay algunas regiones que no estan muy vascularizadas o que estan protegidas por celulas unidas mediante uniones solidas y/o mecanismos de transporte activo que reducen o impiden la entrada de macromoleculas presentes en el torrente sangumeo.
Un experto en la tecnica apreciara que en estos casos, las composiciones terapeuticas de esta invencion se pueden administrar directamente en el punto del tumor. Asf, por ejemplo, los tumores cerebrales se pueden tratar administrando la composicion terapeutica directamente en el punto del tumor (por ejemplo, a traves de un cateter implantado quirurgicamente).
Alternativamente, la composicion terapeutica se puede administrar en el punto diana mediante una formulacion de liberacion lenta. Estas formulaciones pueden incluir, por ejemplo, una esponja biocompatible u otro material de matriz inerte o reabsorbible impregnado con la composicion terapeutica, capsulas o microcapsulas de liberacion diferida con disolucion lenta y similares.
Tfpicamente el cateter o la formulacion de liberacion diferida se colocara en el punto del tumor como parte de un procedimiento quirurgico. Asf, por ejemplo, cuando se extraiga quirurgicamente una masa tumoral importante, el cateter de perfusion o la formulacion de liberacion diferida se puede emplazar en el punto del tumor como terapia adicional. Por supuesto, la extirpacion quirurgica de la masa tumoral puede
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resultar no deseable, no necesaria o imposible, en cuyo caso la administracion de las composiciones terapeuticas de esta invencion puede representar la modalidad terapeutica principal.
V. Kits.
Cuando se utiliza un radiactivo u otro efector como agente de diagnostico y/o terapeutico, a menudo resulta imposible poner a disposicion del usuario la composicion preparada para ser utilizada, debido a la reducida vida util del compuesto radioetiquetado y/o del radionuclido empleado. En estos casos el usuario puede realizar la reaccion de etiquetado con el radionuclido en el hospital clmico, en la consulta del medico o en el laboratorio. A tal efecto, o con otros fines, los diversos ingredientes de reaccion se pueden ofrecer al usuario en forma de lo que se denomina un "kit". El kit esta preferiblemente disenado para que las manipulaciones necesarias para realizar la reaccion deseada sean lo mas sencillas posibles, de forma que el usuario pueda preparar con el kit la composicion deseada utilizando las instalaciones de las que dispone. Por tanto, la invencion se refiere tambien a un kit para preparar una composicion segun esta invencion.
Este kit segun la presente invencion comprende preferiblemente un SHAL
como el que aqu se describe. El SHAL se puede proporcionar, si se desea, con un vehmulo inerte farmaceuticamente aceptable y/o se anaden agentes de formulacion y/o adyuvantes. Por otra parte, el kit incluye opcionalmente una solucion de una sal o un quelato de un radionuclido adecuado (u otro agente activo), e (iii) instrucciones de uso con una prescripcion para la administracion y/o reaccion de los ingredientes presentes en el kit.
El kit que se proporcionara al usuario tambien puede comprender el ingrediente(s) anteriormente definido, junto con instrucciones de uso, donde la solucion de una sal o quelato del radionuclido que pueda tener una vida util limitada se podra poner a disposicion del usuario por separado.
El kit puede contener, opcional o adicionalmente, un agente reductor y/o, si se desea, un quelato y/o instrucciones de uso de la composicion y/o una prescripcion para hacer reaccionar los ingredientes del kit para obtener la forma del producto o los productos deseados. Si se desea, los ingredientes del kit se pueden combinar, siempre que sean compatibles.
En determinadas realizaciones, la reaccion para formar el complejo con el SHAL se puede producir simplemente combinando los componentes en un medio neutro y provocando su reaccion. A tal efecto, el efector se puede presentar al SHAL en forma de un quelato.
Cuando se utiliza el integrante(s) del kit como componente(s) para la administracion farmaceutica (por ejemplo, en forma de lfquido inyectable) estara preferiblemente en condiciones de esterilidad. Cuando el integrante(s) se suministra en estado seco, el usuario debera utilizar preferiblemente una solucion de suero fisiologico esteril como solvente. Si se desea, el integrante(s) se puede estabilizar de forma convencional con estabilizadores adecuados, tales como acido ascorbico, acido gentfsico o sales de estos acidos, o puede comprender otros agentes auxiliares, por ejemplo compuestos de relleno, como glucosa, lactosa, manitol y similares.
Aunque los materiales de instruccion, cuando se incluyen, comprenden tfpicamente materiales escritos o impresos, no se limitan a eso. Cualquier medio capaz de recopilar estas instrucciones y comunicarlas a un usuario final se contempla en la presente invencion.
Estos medios incluyen, entre otros, medios de almacenamiento electronico (por ejemplo, discos magneticos, cintas, cartuchos, chips), medios opticos (CD ROM) y similares. Estos medios pueden incluir direcciones de sitios de Internet que proporcionan estos materiales de instruccion.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, sin caracter limitador, la invencion reivindicada.
Ejemplo 1
Creacion de SHAL especificos para HLA-DR10
Los estudios preclmicos y clmicos han revelado que la region epitopica (region unica reconocida por los anticuerpos) de la subunidad beta del HLA-DRlO y las protemas de la superficie celular del complejo mayor de histocompatibilidad HLA-DR relacionado resultan dianas particularmente atractivas para la terapia radioisotopica sistemica para las leucemias y linfomas de celulas B y aportan otras oportunidades para el tratamiento y prevencion del cancer. A pesar de que el HLA-DR10 tiene caractensticas en comun con otras protemas de superficie de las celulas B, como CD20, que lo convierten en una diana adecuada, presenta caractensticas diferenciadas que consideramos que lo dotan de un gran atractivo.
Al igual que el antfgeno CD20, la protema del HLA-DR se encuentra localizada en la superficie de los linfocitos B, persiste durante toda la diferenciacion de las celulas B, pero desaparece durante la transformacion del linfocito a la fase de celula plasmatica (Epstein et al. (1987) Cancer Res., 47:830-840).
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El epftopo del antigeno de Lym-1 discreto aparece en los precursores de celulas B comprometidos, pero no se expresa con anterioridad durante el desarrollo de las celulas B. Ademas, no se encuentra generalmente en celulas T ni en otras celulas normales. La expresion de moleculas del MHC de clase 2 en las celulas B se controla durante el desarrollo. Las celulas tempranas y pre-B son ARNm clase 2 negativas y no se pueden inducir para expresar antigenos de clase 2. El antfgeno del HLA-DR se adquiere durante la fase tardfa de la celula pre-B. Dado que el nivel basal de expresion de clase 2 en las celulas B es aproximadamente 100 veces menor que la que se encuentra en las lmeas de celulas B malignas (Rose et al. (1996) Cancer Immunol Immunother.,4326 30.; Rose et al. (1999) Mol Immunol., 36:789-797), esto explica la observacion de que solamente se necesitan 50 mg de anticuerpo Lym-1 para llegar a una diana de linfoma maligno extravascular (DeNardo et al. (1998) J Clin Oncol., 16:3246-3256), mientras que se requieren 50 mg de CD22 y cientos de mg de anticuerpos CD20 debido a la densidad de los antigenos de CD22 y CD20 en los linfocitos normales (Press (1999) Semin Oncol.,26:58-65; Knox et al. (1996) Clin Cancer Res.,2:457-470). La dosis de tratamiento de yodo-131, cobre-67 o itrio-90 unida a pequenas cantidades de Lym-1 cura a la mayona de los ratones con xenoinjertos de Raji (DeNardo et al. (1991) Antibody Immunoconj Radiophar., 4:777-785; DeNardo et al. (1997) Clin Cancer Res.,3:71-79), la lmea de celulas de linfoma maligno de Burkitt utilizada como inmunogeno para generar Lym-1 (Epstein et al. (1987) Cancer Res., 47: 830-840). Similarmente, estos radiofarmacos, en ensayos de fase I/II en pacientes con linfoma no Hodgkin de celulas B y un subconjunto de pacientes con leucemia linfocftica cronica, han inducido un elevada y duradera tasa de respuesta, con remisiones completas frecuentes y algunas supervivencias a largo plazo cuando se utilizan como terapia de agente unico. El HLA-DR proporciona la identificacion de las celulas y los peptidos antigenicos se muestran en el HLA-DR. Esto puede explicar supervivencias inusualmente prolongadas en un subconjunto de nuestros pacientes con linfoma agresivo en los que se ha documentado una cascada de anticuerpos idiotfpicos, incluyendo anticuerpos policlonales humanos citotoxicos para celulas Raji y tumores Raji (1998) Cancer Biother Radiopharm., 13:1-12; Lamborn et al. (1997) Clin Cancer Res., 3:1253-1260).
Sin embargo, a pesar de que estos anticuerpos funcionan, todavfa es necesario mejorarlos. El anticuerpo es una macromolecula que penetra las barreras vasculares y el tumor de forma deficiente e interactua con diversos receptores, lo que limita su selectividad como vehmulos de radioisotopos y se suma a su perfil de eventos adversos. La inmunogenicidad de reactivos basados en anticuerpos se puede minimizar, pero no eliminar, utilizando anticuerpos "humanizados" (Brown etal. (2001) Clin Lymphoma., 2:188-90; Kostelny et al. (2001) Int J Cancer, 93:556-65; Leonard et al. (2002) Semin Oncol., 29:81-6; Lundin et al. (2002) Blood, 100:768-73; Ligibel y Winer (2002) Semin Oncol., 29:38-43). La inmunogenicidad se puede evitar creando reactivos de base no protemica. Los anticuerpos completos tambien exhiben una reactividad apreciable (por ejemplo, interacciones de Fc) con celulas no diana, lo que reduce la selectividad y aumenta los eventos adversos. Incluso las pequenas mejoras de la selectividad del agente de seleccion de diana se pueden utilizar para minimizar los danos colaterales y mejorar el mdice terapeutico del farmaco.
Lym-1 es un anticuerpo monoclonal IgG-2a marino (MAb) que se une selectivamente a un protema altamente expresada en la superficie de las celulas B humanas malignas (Epstein et al. (1987) Cancer Res., 47: 830-840). Hemos mostrado que un epftopo discreto de HLA-DR10 fue el antfgeno original en celulas Raji que genero el MAb Lym-1 y que este epftopo no es compartido por todos los subtipos de HLA- DR (Rose et al. (1996) Cancer Immunol Immunother., 43: 26-30; Rose et al. (1999) Mol Immunol., 36: 789797). Nuestros datos sugieren que los residuos de union crfticos de Lym-1 se deben a las 19 diferencias en la secuencia de aminoacidos entre la subunidad beta de HLA-DR10 reactiva y las subunidades beta de HLA-DR3 y HLA-DR52 no reactivas practicamente identicas. Esto explica la selectividad del epftopo o el punto de union de Lym-1 entre los HLA-DR que contienen globulos blancos, al tiempo que sienta la base de la existencia de esta protema en practicamente todos los pacientes con celulas B malignas. De los 19 residuos que comprende la region de union crftica de Lym-1, solo los aminoacidos Q70 a R70, seguidos de R71 se encontraron en todas las muestras reactivas a Lym-1 y estaban ausentes en las muestras no reactivas a Lym-1. En muchas de las moleculas de HLA-DR no reactivas, estos dos residuos fueron a menudo sustituidos por D70 y/o E71. La hipotesis de que los subtipos que contienen los residuos de union supuestamente crfticos de Lym-1 (Q/R70-R71) senan los mas reactivos se ha confirmado en una serie de estudios, incluyendo amplios ensayos de citotoxicidad realizados en lmeas de celulas linfoblastoides de celulas de tipo B y T, incorporando 31 genotipos de HLA-DR (Rose et al. (1999) Mol Immunol., 36: 789797). Todas las celulas fuertemente reactivas expresaban al menos un alelo de HLA-DR que contema Q/R70-71, mientras que ninguna de las lmeas de celulas menos reactivas expresaba esa secuencia en la posicion 70-71 de la cadena beta. Los ensayos citotoxicos tambien demostraron que las primeras se vefan drasticamente mas afectadas que las segundas (Id.). A pesar de que Lym-1 reacciono con los linfocitos de la sangre periferica de donantes sanos, las avideces eran muy inferiores, lo que concuerda con una menor densidad de la protema del HLA-DR en los linfocitos normales y con la hipotesis de que se puede producir una union univalente en lugar de bivalente, lo que explica tambien la selectividad de Lym-1 por las celulas malignas en pacientes con linfoma (Id.). Por tanto, parece que tanto los residuos de glutamina/arginina crfticos de Lym-1 como el umbral de densidad del antfgeno contribuyen a la selectividad de la union de Lym-1 con las celulas B malignas frente a los linfocitos normales. En cualquier caso, los datos confirman que Lym-1 se une preferentemente a las celulas linfoblastoides frente a los PBL normales, lo que supone una atractiva diferencia con respecto a otras protemas que tienen como diana las celulas B malignas (Id.).
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Nuestra experiencia con la CMRIT nos ha permitido apreciar las complejidades de implementacion y darnos cuenta de que muchos pacientes con NHL avanzado no pueden ser tratados con BMT debido a su enfermedad y a una recogida de medula insuficiente. Por estas razones y dadas las oportunidades unicas de intensificar la dosis utilizando planteamientos novedosos para desarrollar moleculas de seleccion de diana que pueden mejorar drasticamente el mdice terapeutico, hemos desarrollado ligandos de alta afinidad (SHAL) que imitan el 131I-yoduro en el cancer de tiroides. El 131I-yoduro en el cancer de tiroides, el prototipo para la radioterapia sistemica focalizada en moleculas isotopicas, ha permitido la cura del cancer de tiroides, hasta entonces incurable, porque el 131I es atrapado rapidamente y retenido por el cancer o excretado en la orina, lo que proporciona un mdice terapeutico que se aproxima al infinito y la oportunidad de administrar radioisotopo practicamente ilimitado sin toxicidad significativa.
Creemos que las pequenas moleculas SHAL pueden aprovechar mejor el potencial de "RIT" y representar una extension natural de nuestras actividades translacionales en curso que implican al HLA-DR como diana para las moleculas de un vehmulo radioisotopico a fin de administrar radioterapia sistemica. Tal y como se describe a continuacion, hemos sintetizado una serie de SHAL bidentados y determinado que al menos uno de estos SHAL se une al HLA-DR10 aislado.
A)Desarrollo de un modelo informatico de la estructura molecular de la subunidad beta del HLA- DR10 que contiene la region que se ha demostrado que resulta critica para la union del anticuerpo de Lym-1 a las celulas B malignas y comparacion de la estructura con otras moleculas de HLA-DR.
Las estructuras de cristales de cuatro moleculas diferentes de HLA-DR estrechamente relacionadas (HLA- DR 1-4) han sido determinadas con anterioridad y depositadas en la base de datos de estructuras PDB por otros (Jardetzky et al. (1994) Nature, 368:711-718; Bolin et al. (2000) J. Med. Chem., 43:2135-2148; Nucci et al. (1998) J. Exp. Med., 188:1511-1520; Ghosh et.al. (1995) Nature, 378:457-462). Las secuencias protemicas de estas cuatro protemas, HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR3 y HLA-DR4, se alinearon con la secuencia de HLA-DR 10 y se compararon para identificar tanto las ubicaciones de los aminoacidos variables como aquellas regiones de la molecula de HLA-DR10 que contienen los residuos de aminoacidos que han sido identificados como el epftopo cntico del anticuerpo Lym-1 (Rose et al. (1996) Cancer Immunol Immunother., 43:26-30; Rose et al. (1999) Mol Immunol., 36:789-797). Esta alineacion revelo que las cinco protemas presentan un grado de similitud de la secuencia tan elevado (Figura 8) que no fuimos capaces de crear un modelo en 3D lo suficientemente preciso de la subunidad beta del HLA-DR10 mediante modelos de homologfa y utilizar las coordenadas del modelo para estudiar la union del ligando utilizando el programa DOCK.
Se utilizaron dos planteamientos diferentes para crear modelos de la subunidad beta del HLA-DR10 para el uso en el docking de ligandos. El primer enfoque utilizo las coordenadas de toda la estructura del HLA- DR3 como plantilla para crear el modelo de homologfa, y los 19 aminoacidos que difenan entre HLA-DR3 y HLA-DR-10 fueron mutados (cambiados) en la secuencia de HLA-DR3. Las coordenadas de los cuatro aminoacidos amino-terminales, que se encuentran presentes en HLA-DR10, HLA-DR21 y HLA-DR2 pero ausentes en HLA-DR3, se obtuvieron de la estructura de HLA-DR1 y se utilizaron para completar el modelo. En el segundo enfoque se genero un modelo hforido utilizando las coordenadas atomicas obtenidas de diferentes segmentos de las estructuras de cristales de HLA-DR1, HLA-DR2 y HLA-DR4. Los segmentos espedficos de las tres estructuras de cristales de HLA utilizados en el modelo fueron seleccionados basados en similitudes de sus elementos estructurales secundarios. Se generaron alineaciones de las estructuras de las secuencias utilizando los algoritmos de Smith-Waterman (Smith y Waterman (1981) J. Mol. Biol., 147:195-197), FASTA (Pearson (1991) Genomics, 11:635-650), BLAST y PSI-BLAST (Altschul et al.(1991) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402), y el eje central del modelo se creo automaticamente utilizando el sistema AS2TS (vease el punto web
http://sb9.llnl.gov/adamz/LGA/AL2TS/as2ts.html). Las coordenadas de los cuatro residuos amino- terminales de la estructura se tomaron de la estructura de cristales IseB del HLA-DR1, los residuos 5-122 se obtuvieron de la estructura laqd del HLA-DR1, los residuos 123-170 se tomaron de la estructura 1d5m del HLA DR4, y los residuos restantes (aa171-193) se obtuvieron de la estructura lbx2 del HLA-DR2. La construccion de las regiones terminales y helicoidales, las inserciones y deleciones de aminoacidos, y las comparaciones de la estructura del modelo de plantilla se realizaron utilizando el programa LGA desarrollado en LLNL (vease el sitio web
http://predictioncenter.llnl.gov/local/lga/lga.html). La mayona de coordenadas de los atomos de cadena lateral se incorporaron de las cuatro plantillas estructurales (senaladas anteriormente) debido a su elevado nivel de homologfa. Las cadenas laterales de regiones seleccionadas del modelo de protema se crearon utilizando el programa SCWRL (Id.). La minimizacion de energfa se aplico a ambas estructuras eliminar contactos inapropiados de las cadenas laterales y las estructuras resultantes se "optimizaron" utilizando dinamica molecular.
Los analisis de los modelos resultantes revelaron que los dos enfoques produjeron estructuras notablemente similares. La dinamica molecular ampliada aplicada parecio ofrecer ligeras mejoras adicionales. Los resultados de los modelos revelaron que la estructura de la molecula HLA-DR10 se compone de dos dominios unidos por una bisagra con uno de los residuos activos de Lym-1, V85, posicionado directamente adyacente a la bisagra (Figura 9).
Se observo que la mayona del nucleo de la estructura relajada del HLA-DR10, en comparacion con la estructura de cristales de HLA-DR3, es practicamente identica (Figura 10). Los otros tres aminoacidos que
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se observo que participan en la union de Lym-1, R70, R71 y A74 (A o E en esta posicion parece importante para la union de Lym-1) se encuentran todos en la superficie expuesta de una helice alfa larga (Figuras 9 y 10) ubicada inmediatamente adyacente a la bisagra.
B) Identificacion de puntos unicos en la superficie del HLADR10 dentro del epitopo de Lym-1 que se pueden seleccionar como diana para la union del ligando.
Las superficies accesibles por solvente de la protema del HLA-DR10 y la estructura de cristales del HLA- DR3 se calcularon utilizando las coordenadas atomicas obtenidas para el HLA-DR3 del Protein Data Bank y nuestro modelo del HLA-DR10. Se examino y comparo el punto que rodea a los tres aminoacidos principales del epttopo de Lym-1 (dentro de 6A). Tal y como se muestra en la Figura 11, los cambios de estos tres aminoacidos en la secuencia del HLA-DR10 (Q70R, K71R, y R74A) vanan tanto la distribucion de la carga como la topograffa de la superficie expuesta de la protema en esta region.
Se utilizo un programa desarrollado para identificar "hendiduras" en la superficie de la protema (SPHGEN) para identificar potenciales cavidades que podnan ser focalizadas para la union del ligando. Los detalles de los programas utilizados se describen en el Ejemplo 2. Dos hendiduras adyacentes (cavidades) en la superficie del modelo del HLA-DR10 se seleccionaron como puntos apropiados para la union del ligando (Figura 12), basandose en su proximidad entre sf, en los tres residuos reactivos de Lym-1 y en la exclusividad de los aminoacidos que recubren la hendidura. Un examen de las estructuras de los cristales de las otras cuatro moleculas de HLA-DR tambien demostro que existen hendiduras en estos puntos o en sus proximidades en cada molecula de HLA-DR, pero tal y como se esperaba (basado en las diferencias de la secuencia de aminoacidos de las cadenas peptfdicas de esta region de la estructura del HLA-DR) las hendiduras presentes en cada HLA-DR difieren en tamano, forma y en la distancia que las separa. Dado que el "panorama" de los aminoacidos que rodean estos dos puntos difieren de forma significativa en HLA-DR3 y HLA-DR10, cabna esperar que las actividades de docking realizadas en ambos puntos identificasen ligandos que se unen selectivamente a las hendiduras de HLA-DR10 pero no de HLA-DR3. Estos puntos, identificados como Punto 1 y Punto 2 y que se muestran rellenos de esferas rojas y azules en la Figura 12 flanquean ambos lados del aminoacido mas importante del epftopo de Lym-1, R70. Tambien se ha localizado y caracterizado un tercer punto unico, que se puede focalizar como reserva si no se pueden identificar los ligandos adecuados que se unen al Punto 1 o Punto 2.
C) Seleccion computacional de una biblioteca de ligandos "virtual" para identificar pequenas moleculas que se pueden unir a hendiduras especificas del HLA-DR10 que comprenden el epitopo de Lym-1.
El programa DOCK (UCSF) se utilizo para realizar una seleccion "virtual" en la base de datos de pequenas moleculas Available Chemical Directory, a fin de identificar las 1000 moleculas principales que se preve que se unan en las dos hendiduras unicas identificadas como Punto 1 y Punto 2. Los detalles de los procedimientos computacionales de docking se describen en el Ejemplo 2.
A continuacion se inspeccionaron visualmente las 2500 principales moleculas para seleccionar en orden descendente hasta 35 moleculas para ensayos de union en experimentos (Tabla 5). Este proceso de seleccion final se baso en las propiedades qmmicas, incluyendo interacciones hidrofobas, enlace de hidrogeno
y tamano molecular, asf como en criterios practicos incluyendo la disponibilidad en el mercado y el coste, la facilidad de union sintetica, y la diversidad estructural general del conjunto de moleculas.
Tabla5. Ligandos que se preve que se unan al Punto 1 de la subunidad beta del HLA-
DR10 mediante docking computacional
N.°
Compuesto
1.
7-Amino-4-clorometilcumarina, glicil-l-prolina amida, hidrocloruro
2.
5-([4,6-Diclorotriazin-2-il]amino)fluorescein hidrocloruro
3.
Acido 2-[2-[3-Cloro-5-(trifluorometil)-2-piridinil]carbohidrazonoil]benceno carboxflico
4.
Acido 4-[[2-(4-Ciano-3-fenil-5-isoxazolil)vinil]amino]bencencarboxflico
5.
Acido 4- [2-(2,4-Diclorofenil)hidrazino] -4-oxo-2-fenil-2-butenoico
6.
Acido 3-(2-[[3-cloro-5-(trifluorometil)-2-piridinil]oxi}anilino)-3-oxopropanoico
7.
Acido 3-[(4-Clorobencil)tio]imidazo[l,5-a]piridina-l-carboxflico
8.
Acido 2-[([ 1,1 '-Bifenil]-4-ilamino)carbonil]benzoico
9.
Bis [4-(3-aminofenoxi)fenil] sulfona
10.
4,4'-Bis(4-aminofenoxi)bifenil
11.
5(6)-Carboxitetrametilrodamina n-succinimidil ester
12.
1,4-Fenilenobis [ [4-(4-aminofenoxi)fenil] metanona]
13.
H-Tyr(Br-Z)-OEt
14.
'7-Amino-4-clorometilcumarina, 1-alanil-l-prolina amida, hidrocloruro
15.
'5-(N'-[2-aminoetil]tioureidofluorescema)
16.
Achatin I, sal de amonio
17.
Fmoc-Asp(OBzl)-OH
18.
Fmoc-Bip-OH
19.
Menai H535
20.
Acido 2'-Metoxi-5'-metil-3,4,5,6-tetracloroftalamlico
21.
4-Dimetilaminoazobenceno-4'-sulfonil-l-valina
22.
BigCHAP
23.
Arg-gly-asp-thr (SEC. ID. N.°: 25)
24.
n-Alil-2- [(1 -bencil-2-oxo-1,2-dihidro-3-piridinil)carbonil] -1 - hidrazinacarbotioamida
25.
n'-Metoxi-n- [7-(4-fenoxifenil) [ 1,2,4] triazolo [ 1,5-a]pirimidin- 2- il] iminoformamida
26.
n-[[6-(4-Clorofenoxi)-3-piridil]carbonil]-n'-[3-(trifluorometil)fenil]urea
27.
n-[[6-(4-Clorofenoxi)-3-piridil]carbonil]-n'-(4-(clorofenil)urea
28.
n,n'-Difenilbenzidina
29.
Rcl sl6,963-3
30.
N,N'-bis-(4-amino-2-cloro-fenil)-tereftalamida4-[[5-(trifluorometil)piridin- 2-il] oxi] fenil N-fenilcarbamato
31.
Acido metidiopropil etilenodiamina tetraacetico
32.
N-(4-[[3-Cloro-5-(trifluorometil)-2-piridinil]metil]fenil)- 4- yodobencenocarboxamida
33.
2-(4-Clorofenil)-2-[6-[(4-clorofenil)sulfanil]-3-piridacinil]acetamida
34.
6-Cloro-n4-(4-fenoxifenil)-2,4-pirimidinadiamina
35.
4-Amino-2-anilino-5-benzoil-3-tiofenocarbonitrilo
Este procedimiento se repitio para la identificacion de 35 potenciales moleculas de union para el Punto 2. La Tabla 6 recoge los ligandos que segun las previsiones del docking molecular se unen al Punto 2.
Tabla6. Ligandos que se preve que se unan al Punto 2 de la subunidad beta del HLA-DR10 mediante docking computacional
1.
Leu-encefalina
2.
Acido 4-[4-(4-Clorobencil)piperazino]-3-nitrobencenocarboxflico
3.
Beta-casomorfina (1-2)
4.
L-acido aspartico, alfa-(4,5-dimetoxi-2-nitrobencil) ester, hidrocloruro
5.
Cefadroxilo
6.
3,3',5-Triyodo-dl-tironina
7.
H- Glu(anilida) -OH
8.
H-Trp-phe-OH
9.
Glicilglicil-D,L-fenilalanina
10.
Timopoyetina II (33-36)
11.
Acido tiofosforico S-(3-(3-amino-propilamino)-propil) ester, di-hidrato
12.
Dinorfina A (13-17), Porcina
13.
l-Alanil-l-alanil-l-triptofano
14.
Asp-arg-val-tyr (SEC. ID. N.°: 26)
15.
A-VI-5
16.
Glu-thr-pro NH2 (SEC. ID. N.°: 27)
17.
(D-ala2)-Beta-casomorfina (1-5) (bovina)
18.
Sal Tyr-D-ala-gly-phe-D-met acetato (SEC. ID. N.°: 28)
19.
Arg-gly-asp-thr (SEC. ID. N.°: 29)
20.
N-Alfa,n-omega-di-cbz-l-arginina
21.
Sal Asp-lys acetato
22.
(+)-Alo-octopina
23.
Sodio 7-[(2-amino-2-fenilacetil)amino]-3-metil-8-oxo-5-tia-l-azabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxilato
24.
Val-ile-his-asn
25.
Acido 2-amino-8-(difenilfosfinil)-octanoico
26.
Glu-His-Pro NH2 (SEC. ID. N.°: 30)
27.
BAPABA
28.
H-glu(lys)-OH
29.
Bis-boc-l-arg
30.
H-arg(mtr)-OH
31.
4-aminometil-L-fenilalanina boc
32.
H-met-met-OH
33.
H-trp-ile-OH
34.
Acido N-alfa benzoil-arginina-4-amino benzoico
35.
(Thr46)-osteocalcina (45-49) (humana)
Como resultado del docking computacional, 30 compuestos de las listas del Punto 1 y del Punto 2 se examinaron experimentalmente mediante NMR. Se encontraron 11 compuestos que se unen a HLA- DR10, lo que produce un mdice de acierto del 37%. Estos ligandos se recogen en la Tabla 7.
5 Tabla 7. Ligandos examinados mediante NMR que se descubrio que se unen al HLA-DR10. Los ligandos estan separados por puntos de docking computacionalmente previstos
Punto 1:
Punto 2:
5(6) carboxitetrametilrodamina-n-succinimidil ester
Acido N-alfa benzoil-arginina-4-amino benzoico
Metidiopropil EDTA
5-leu-encefalina (YAGFM)
Acido desoxicolico
N alfa N omega dicarbobenzoxiarginina
FMOC-acido aspartico(O-bencil)-OH
Angiotensina II (DRVY)
4-dimetilaminoazobenceno-4'-sulfonil-L- valina
Bis-BOC-L-arginina
4- [ [5-(trifluorometil)piridin-2-il] oxi] fenil N-fenilcarbamato
De la Tabla 7, se sintetizaron cinco ligandos de alta afinidad sinteticos (SHAL), que conteman diferentes conjuntos de ligandos del Punto 1 y del Punto 2. Se ha demostrado que tres de estas moleculas (Figura 10 13A), donde todas ellas conteman los pares de ligandos desoxicolato y 5-leu-encefalina, se unen al HLA-
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DR10 aislado. Ninguno de estos tres SHAL se unen a albumina o estreptavidina. Se ha determinado que el primero de los tres que se iban a someter a ensayo mas extensamente, JP459B (Figura 13B), se une a HLA-DR10 con una Kd = 23 nM, utilizando la Resonancia de plasmones superficiales. Utilizando extractos de membrana de Raji, este SHAL competia con Lym-1 por la union a HLA-DR10. Los estudios de union realizados con celulas vivas demostraron que JP459B se unio a celulas de linfoma humano de Raji, pero no las celulas DU 145, LnCAP o 22RV normales (Figura 17E-H). Los experimentos utilizando secciones de tejido de linfoma humano congelado tambien demostraron la union de JP459B a linfoma de celulas grandes, con gran avidez, pero menos a las celulas de linfoma de celulas pequenas (Figura 17A-D). Con el anticuerpo Lym-1 se obtuvieron resultados similares. Los ensayos mas extensos con arrays de tejido tumoral y normal se estan realizando en estos momentos.
En estudios posteriores se ha demostrado que otros ligandos se unen al HLA-DR10. Estos se muestran en la Tabla 8. Tabla 8. Otros ligandos que se unen a HLA-DR10.
Ligando ID
especie
11
3,3',5-Triyodo-dl-tironina (Previsto Punto 2) (TI)
7
2-(4-Clorofenil)-2-[6-[(4-clorofenil)suflfanil]-3-piridazinil] acetamida (12F)
9
4-Amino-2-anilino-5-benzoil-3-tiofenocarbonitrilo (5K)
8
6-Cloro-n4-(4-fenoxifenil)-2,4-pirimidinadiamina (7L)
6
N- (4- [ [3 -Cloro- 5 (trifluorometil) -2-piridinil] metil] fenil) -4- yodobencenocarboxamida (6J)
Por otra parte, 1,4-fenilenobis [ [4-(4-aminofenoxi)fenil] metanona] se precipito en la protema diana. Ejemplo 2 Metodos computacionales para el uso en la creacion de SHAL A.Descripcion de las funciones y metodos de simulaciones moleculares
Tal y como se describe aqrn, se pueden utilizar modelos moleculares para identificar inicialmente ligandos para su uso en la construccion de SHAL y/o para la optimizacion de SHAL. En estos momentos no existe ninguna metodologfa de modelos moleculares que se pueda utilizar para elaborar modelos de moleculas diana, seleccionar ligandos de union, simular la union de un SHAL polidentado y predecir la estructura optima del SHAL. Sin embargo, se pueden utilizar diversos metodos de elaboracion de modelos bien establecidos para facilitar estas tareas tal y como se describe aqrn.
Partiendo en el nivel mas alto, la prediccion de moleculas diana de las estructuras terciarias (por ejemplo, marcadores de la protema del cancer) se realiza tfpicamente utilizando metodos altamente empmcos basados en la homologfa de la secuencia primaria con las protemas con una estructura experimentalmente conocida. La precision de los denominados metodos de prediccion de la estructura de la protema basada en la homologfa depende de la disponibilidad de estructuras de protema homologas y de los conocimientos del responsable individual de elaborar los modelos. Para identificar moleculas pequenas (ligandos) que se unen espedficamente a hendiduras de protemas, se puede utilizar el "docking" computacional que se describe aqrn. El docking utiliza un campo de fuerza empmco relativamente simple para describir la interaccion ligando-protema y, por tanto, se puede utilizar para seleccionar rapidamente 100 000 posibles ligandos. Para determinar conformaciones e interacciones macromoleculares preferibles, se puede utilizar la dinamica molecular clasica, que elabora modelos de las moleculas utilizando campos de fuerza empmcos de tipo bola y muelle. Por ultimo, para la prediccion precisa de estructuras e interacciones de moleculas pequenas, se pueden resolver computacionalmente las ecuaciones de mecanica cuantica que describen los electrones y los nucleos del interior de las moleculas. Este denominado planteamiento de los primeros principios se puede utilizar para determinar las estructuras y energfas de "instantaneas" estaticas de las moleculas o bien para simular los movimientos atomicos de los sistemas moleculares. El planteamiento anterior se denomina qrnmica cuantica ab initio, mientras que el planteamiento posterior se denomina dinamica molecular de primeros principios (en contraste con la dinamica molecular clasica) y constituye una simulacion de la naturaleza practicamente exacta.
B)Predicciones de la estructura proteinica basadas en la homologia
El concepto basico de la prediccion de la estructura proteinica basada en la homologfa depende de la observacion de que las caractensticas estructurales de las protemas se conservan durante la evolucion en un grado tan elevado que cabe esperar que sus secuencias y por tanto las protemas relacionadas incluso por una similitud de secuencia distante presenten estructuras en 3D similares (Chothia y Lesk (1986)
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EMBO J., 5:823-826). Por tanto, una vez que se ha determinado una estructura tridimensional para al menos un
representante de una familia de protemas, los modelos de otros miembros de la familia se pueden obtener utilizando la estructura conocida como plantilla. La elaboracion de modelos de protemas basada en homolog^as consiste en cuatro pasos principales: encontrar estructuras conocidas relacionadas con la secuencia de protemas de la que se pretende elaborar un modelo, alinear la secuencia con estas estructuras, elaborar un modelo tridimensional y valorar el modelo (Marti-Renom et al. (2000) Annu Rev Biophys Biomol Struct., 29: 291-325).
La prediccion de la estructura protemica basada en la homologfa (tambien denominada elaboracion de modelos comparativos) produce un modelo de todos los atomos de una secuencia basada en su alineacion con una o mas estructuras de protemas relacionadas. La elaboracion del propio modelo tridimensional incluye la elaboracion de modelos secuenciales o simultaneos del nucleo de la protema, las helices y las cadenas laterales.
La Figura 15 ilustra un diagrama de flujo que describe los principales pasos de la elaboracion de modelos de protemas basados en homologfas.
La precision de un modelo, elaborado utilizando la tecnica de elaboracion de modelos comparativos, normalmente esta relacionada con el porcentaje de identidad de la secuencia con la estructura en la que se basa. Los modelos comparativos de alta precision se basan en mas de un 50% de identidad de la secuencia con sus plantillas. Tienden a tener aproximadamente una media cuadratica (RMS) de 1A de error para los principales atomos de la cadena. Esta precision es comparable con la de la estructura por resonancia magnetica nuclear (NMR) de resolucion media o la estructura por rayos X de baja resolucion. Los errores en estos casos se limitan habitualmente a errores en la asignacion de rotameros de la cadena lateral, pequenos cambios o distorsiones en las regiones centrales de la cadena principal y ocasionalmente errores mas importantes en las helices.
Un planteamiento general de elaboracion de modelos sera similar al que se utilizaba con exito con anterioridad para elaborar modelos de protemas diana de alta y baja homologfa (Venclovas et al. (1999) Proteins-Structure Function and Genetics, 73-80). Dado que nuestros objetos de elaboracion de modelos (por ejemplo, marcadores cancengenos como HLA-DR10) pueden tener una elevada homologfa de secuencia (identidad de secuencia >50%), podemos confiar en la comparacion de pares de secuencias de modelos de dianas (consulta) con las protemas de estructuras conocidas (del Protein Data Bank (PDB)) para identificar las plantillas estructurales mas proximas. Para ello, se puede utilizar un algoritmo de comparacion sensible de pares de secuencias de Smith-Waterman (Smith y Waterman (1981) J. Mol. Biol, 147:195-197) implementado en el programa SSEARCH (Pearson (1991) Genomics 11:635-650). A un nivel elevado de homologfa de la secuencia, la alineacion de la estructura para las regiones estructurales conservadas se puede utilizar directamente en la elaboracion de modelos.
Cuando hay un numero de plantillas estructurales de similitud comparable disponible se puede utilizar MODELLER, un programa de elaboracion de modelos comparativos capaz de combinar automaticamente una serie de estructuras de plantilla para representar mejor la estructura de la consulta. Cuando hay regiones cnticas presentes en la molecula diana, se puede tener especial cuidado al asignar conformaciones a estas regiones. Las conformaciones candidatas para estas regiones se pueden producir realizando una busqueda en una base de datos de estructuras homologas de los fragmentos de longitud identica que tambien satisfacen las limitaciones estericas de estas regiones. Tanto la similitud de la secuencia como el contexto estructural cercano a la region se pueden tener en cuenta para seleccionar la conformacion real. Las cadenas laterales del modelo se pueden posicionar utilizando una biblioteca de rotameros dependientes del eje central (Bower et al. (1997) J. Mol. Biol. 267:1268-1282).
La evaluacion de los modelos obtenidos se puede realizar utilizando diversas tecnicas. Una de estas, Prosall (Sippl (1993) Proteins, 17:355-362,; Aloy et al. (2000) J Comput
Aided Mol Des. 14:83-92), que se utiliza para detectar errores en estructuras protemicas, crea un perfil de energfa a lo largo de la secuencia de la protema. Las regiones que tienen asignados valores de energfa elevados por Prosall normalmente sirven de buenos indicadores de errores en la representacion de la estructura de estas regiones concretas. Para las comprobaciones detalladas de modelos de estructuras, se puede utilizar el modulo de verificacion de estructuras del programa WHATIF (Vriend (1990) J. Mol. Graph 8: 52-56)
junto con la inspeccion visual. Si estas evaluaciones de calidad del modelo identifican algun problema en el modelo de la estructura, se repetiran los pasos apropiados (como la asignacion de la helice o el posicionamiento de la cadena lateral) de manera iterativa hasta obtener un modelo tridimensional de calidad aceptable.
Utilizando estos metodos se desarrollo un modelo informatico de la estructura molecular de la subunidad beta del HLA-DR10 que contiene la region que se ha demostrado que resulta cntica para la union del anticuerpo Lym-1 a las celulas B malignas y la estructura se comparo con la estructura de otras moleculas de HLA-DR (vease el Ejemplo 1 supra.). Este modelo se utilizo para desarrollar SHAL espedficos del
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HLA-DR10 como los descritos aquf
C)Docking computacional
Se han utilizado metodos computacionales como el docking para acelerar el proceso de descubrimiento de farmacos y diseno de inhibidores seleccionando grandes cantidades de moleculas y prediciendo si se unen o no a los puntos activos de protemas diana (Desjarlais et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87:6644-6648; Mao et al. (1998) Bioorganic and Medicinal Chem. Letts., 8:2213-2218; Olson y Goodsell (1998) Environmental Res., 8:273-285; Rutenber et al. (1993) J. Biol. Chem., 268:15343-15346). Estos esfuerzos han logrado un exito moderado en el diseno de nuevos farmacos efectivos contra protemas del VIH cnticas para la infeccion y transmision de la enfermedad.
En determinadas realizaciones, este planteamiento es generalmente util como primer paso en la identificacion de ligandos (fracciones de union) que se unen habitualmente a la molecula o moleculas diana del rango micromolar. Los protocolos detallados para los metodos de docking utilizando SPHGEN y DOCK han sido descritos en la bibliograffa. Por ejemplo, estos metodos se han utilizado para identificar ligandos que se unen a puntos espedficos del dominio diana de la neurotoxina del tetanos (Cosman et al. (2002) Chem Res Toxicol 15:1218-1228; Lightstone et al. (2000) Chem.
Res. Toxicol., 13:356-362).
Se utilizo el programa DOCK 4.0 para realizar una seleccion en el Available Chemical Directory de moleculas pequenas (unas 300 000), a fin de identificar las 2500 principales moleculas que se preve que se unen al Punto 1 y Punto 2 identificados (Figura 12).
El docking computacional se puede entender como un proceso de tres pasos: 1) identificacion del punto de la superficie de la protema; 2) docking de ligandos en el punto de union identificado; y 3) puntuacion y clasificacion de los ligandos (Halperin et al.(2002) Proteins: Structure, Function, and Genetics, 47:409443). Para la identificacion del punto, generalmente se calcula la superficie accesible solvente de la protema diana. Utilizando el programa SPHGEN, una herramienta en DOCK (Moustakas y Kuntz (2002). DOCK5.0 (San Francisco, UCSF)), se identificaron hendiduras concavas en la superficie de la protema, llenando las hendiduras con esferas de diferente tamano de radio. Basicamente, de este modo se calcula el volumen de la hendidura. La superficie de la protema puede tener entre treinta y cientos de hendiduras en base al tamano y forma de la protema. Una vez identificadas estas hendiduras, la inspeccion visual de las hendiduras identifico el punto de union en base al tamano de la hendidura y la evidencia experimental disponible, como los aminoacidos conocidos implicados en la union o catalisis. La hendidura de union seleccionada se utilizo posteriormente en el procedimiento de docking siguiente.
Los estudios de docking identifican moleculas pequenas que se podnan unir espedficamente al punto de union seleccionado en la protema. El programa DOCK 5.0 examina una base de datos de compuestos en el ordenador y predice que moleculas es probable que se unan con fuerza al punto de union. Este procedimiento se ilustra en la Figura 16. Utilizamos el Available Chemicals Directory (ACD) de MDL como nuestra base de datos de compuestos a seleccionar.
La base de datos se preparo realizando una seleccion previa para eliminar los jabones y tintes. Despues de calcular las cargas parciales para los compuestos utilizando cargas de Gasteiger-Marsili (Gasteiger y Marsili (1978) Tetrahedron Letts., 34: 3181-3184; Gasteiger y Marsili (1980) Tetrahedron 36: 3219-3288; Gasteiger y Marsili (1981) Organic Magnetic Resonance 15:353-360) en Sybyl, la base de datos se dividio por carga total del compuesto, y los compuestos con una carga formal >±3 se descartaron. Por otra parte, los compuestos con menos de 10 y mas de 80 atomos pesados (no hidrogenos) se descartaron para centrarse en los compuestos dentro del rango de tamano para los principales compuestos de farmacos (preliminar). Esta seleccion previa doto de una mayor eficiencia a la base de datos y elimino calculos innecesarios con los compuestos que se sabe que nunca se unen o que se unen de manera indiscriminada. Para simular una tecnica de docking flexible, se generaron 20 conformaciones unicas para cada compuesto de la base de datos. Cada una de estas conformaciones se sometio a docking ngido en el punto de union. Se examinaron diferentes orientaciones dentro del punto de union para cada una de las conformaciones de cada uno de los ligandos. Todos los compuestos fueron puntuados por minimizacion de energfa, donde las condiciones electrostaticas y de van der Waals intermoleculares se obtienen de AMBER (Weiner (1984) J. Am. Chem. Soc., 106: 765-784). A pesar de que las moleculas se clasifican en base a las puntuaciones, la funcion de puntuacion no predice las afinidades de union.
A continuacion se inspeccionaron visualmente las 2500 principales moleculas para seleccionar en orden descendente hasta 35 moleculas para ensayos de union en experimentos tal y como se describe en el Ejemplo 1. Los ligandos
se seleccionaron y los SHAL bidentados se construyeron y sometieron a ensayo tal y como se describe en el Ejemplo 1.
La union de los principales compuestos en la diana se puede mejorar en varios niveles de magnitud utilizando multiples compuestos (2-3) unidos. Para que el inhibidor sea efectivo, tiene que reconocer espedficamente la protema diana y unirse con una afinidad elevada.
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D)Calculos de qmmica cuantica
Se han desarrollado diversos metodos de simulacion qmmica, que abarcan desde modelos de mecanica molecular empmcos tipo bola y muelle hasta metodos de qmmica cuantica ab initio (primeros principios) que calculan soluciones aproximadas para las ecuaciones de mecanica cuantica exactas que describen los electrones y los nucleos. Tfpicamente, la seleccion de metodos implica concesiones entre la precision, el tamano del sistema qmmico y el coste computacional. Estos metodos de elaboracion de modelos se pueden dividir en terminos generales en metodos de dinamica molecular que simulan la evolucion temporal de procesos qmmicos y metodos estaticos que predicen propiedades moleculares independientes del tiempo, tales como la configuracion de energfa minima de una molecula o la ene^a de una reaccion qmmica. Se pueden utilizar los tres metodos de elaboracion de modelos moleculares que se describen a continuacion: qmmica cuantica ab initio, dinamica molecular clasica y dinamica molecular de primeros principios para el diseno y la optimizacion de los SHAL que se describen aqm.
I.Quimica cuantica ab initio (OM)
La qmmica cuantica ab initio implica la computacion de soluciones aproximadas para la ecuacion de Schroedinger no relativista exacta que describe un sistema molecular (Jensen (1999) Introduction to Computational Chemistry, New York, John Wiley y Sons). En principio estos metodos pueden predecir las propiedades de cualquier sistema qmmico conforme a una precision arbitraria, aunque en la practica el coste computacional limita la precision de estos metodos y el tamano de los sistemas moleculares a los que se pueden aplicar. Sin embargo, los calculos de qmmica cuantica ab initio se aplican rutinariamente para calcular estructuras precisas y energfas de reaccion para sistemas moleculares que incluyen hasta cientos de atomos.
Existe una jerarqma de diferentes metodos de qmmica cuantica ab initio que implican descripciones matematicas cada vez mas precisas de la funcion de onda electronica —la descripcion matematica de la distribucion de los electrones alrededor de los nucleos de una molecula (Id.). La aplicacion de qmmica cuantica tipicamente requiere la seleccion tanto de la descripcion de las interacciones electron-electron (nivel de teona) como de la flexibilidad espacial de los electrones (conjunto de base). Se ha desarrollado una clase relativamente nueva de metodos denominados Teona del Funcional de la Densidad (DFT) que incluye parametrizaciones empmcas de las interacciones electron-electron, y a menudo proporciona una precision comparable a los metodos de qmmica cuantica de alto nivel anteriores (tales como los metodos de Cluster Acoplado), pero con un coste computacional mucho menor. Los metodos DFT normalmente se denotan por el "funcional" electron-electron empmco empleado. Dos funcionales DFT ampliamente utilizados son el funcional de intercambio Imbrido de tres parametros de Becke (Becke (1993) J. Chem. Phys. 98: 5648-5652) y el funcional de correlacion de electrones por gradiente corregido de Lee-Yang- Parr (Lee et al. (1988) Chemical Physics 123: 1-25). Se ha demostrado ampliamente que estos producen estructuras qmmicas precisas y energfas de reaccion para la mayona de las moleculas cuando se utilizan con conjuntos de bases suficientes (Jensen (1999) Introduction to Computational Chemistry, Nueva York, John Wiley y Sons).
Las simulaciones de qmmica cuantica descritas en el presente se utilizan para estudiar procesos qmmicos que ocurren en el entorno extracelular inmediato. Los metodos de qmmica cuantica anteriormente descritos tipicamente describen unicamente una molecula aislada (normalmente descrita como "fase gas" y, por tanto, no incluyen el entorno qmmico, como moleculas solventes y contraiones, que con frecuencia es cntico para la estructura y la energfa de las moleculas biologicas. La inclusion explfcita de las moleculas de agua y los contraiones del entorno por lo general no resulta computacionalmente factible; sin embargo, se han desarrollado varios metodos dentro del enfoque de la qmmica cuantica para incluir efectivamente los efectos de las interacciones de los solventes. Tfpicamente estos metodos utilizan un modelo de solvente como un medio continuo que se polariza en respuesta a las cargas derivadas de la qmmica cuantica. A pesar de que hay muchas situaciones donde la inclusion explfcita del solvente es necesaria, los denominados modelos del continuum polarizable han resultado razonablemente precisos para predecir las propiedades qmmicas en fase solvente, incluyendo las energfas de disolucion totales y las constantes acidas (Schuurmann et al. (1998) J. Physical Chemistry A 102: 6706-6712; Tran y Colvin (2000) J. Molecular Structure, Theochem 532: 127-137).
El metodo dipolo de Langevin de Warshel esta relacionado con estos modelos de continuum polarizables, pero incluye una representacion mas realista del solvente polar. El metodo dipolo de Langevin modela el solvente como un amplio conjunto de dipolos polarizables en una cuadncula tridimensional fija (Luzhkov y Warshel (1992) J. Computational Chemistry 13:199-213). Este enfoque ha sido recientemente parametrizado para su uso con cargas de soluto obtenidas ab initio y se ha demostrado que produce energfas de disolucion para moleculas neutras e ionicas comparables o mejores que los metodos PCM anteriormente descritos (Florian y Warshel (1997a) J Am Chem Soc., 119:5473-5474).
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2.Dinamica molecular de primeros principios (IPMD)
Al combinar las fuerzas determinadas directamente por un metodo QM para impulsar el movimiento clasico de todos los atomos en una simulacion, se puede conseguir la precision de la mecanica cuantica (QM) con las ventajas de la dinamica molecular clasica. Este enfoque resulto computacionalmente viable con el desarrollo de una nueva tecnica basada en la teona del funcional de la densidad (DFT) (Kohn Sham (1965) Physical Review 140:A1133) que trata los grados electronicos de libertad al mismo tiempo que las ecuaciones nucleares del movimiento (Car y Parrinello (1985) Physical Review Letters 55:24712474; Galli y Parrinello (1991) Pp.283-304 en: Computer Simulation in Materials Science, Pafses Bajos, Kluwer Academic Publishers). Dado que el metodo emplea la teona QM para describir todo el sistema, a menudo se refiere como dinamica molecular de primeros principios (FPMD). En la aplicacion tfpica de la FPMD, solo los electrones de valencia qmmicamente activa se describen de forma explfcita con una expansion en una base de onda plana, mientras que los electrones de nucleo qmmicamente inerte son representados por pseudopotenciales (Galli y Pasquarello (1993) Pp.261-313 en: Computer Simulation in Chemical Physics, D. J. Tildesley, ed. Dordrecht, Kluwer; Yin y Cohen (1982) Physical Review B (Condensed Matter) 25:7403-7412). Dado que los pseudopotenciales son transferibles por diseno, este metodo no requiere reparametrizacion cuando se estudian nuevos sistemas. Ademas, el uso de un conjunto de base de onda plana se presta naturalmente a la aplicacion de condiciones limttrofes periodicas, por lo que el metodo resulta adecuado para sistemas de modelado en la fase condensada. Este metodo, combinado con varias otras mejoras computacionales (Gygi (1993) Physical Review B 48:11692-11700; Hutter et al. (1994) Computational Materials Science 2:244-248; Payne et al. (1992) Rev. Modern Physics 64: 1045-1097), ha resultado fundamental para resolver el problema de integrar la QM y la MD.
Las primeras aplicaciones de simulaciones de FPMD se limitaban a pequenos sistemas como el silicio (Car y Parrinello (1985) Physical Review Letters 55:2471-2474; Stich et al. (1989) Physical Review Letters 63:2240-2243). Dado que estos metodos han mejorado constantemente desde entonces y existen recursos computacionales avanzados disponibles (como los superordenadores de escala Teraflop DOE), ahora resulta posible investigar pequenos sistemas bioqmmicos que contienen varios cientos de atomos durante marcos temporales de picosegundos (Carloni y Alber (1998) Perspectives in Drug Discovery and Design 9/11:169-179; Pantano et al. (2000) J. Molecular Structure (Theochem) 530:177-181; Rovia y Parrinello (2000) International Journal of Quantum Chemistry 80:1172-1180). Por ejemplo, recientemente hemos simulado la dinamica conformacional de un pequeno modelo qmmico de la cadena de ADN en solucion. A medida que aumenta el numero de sistemas que se han investigado con este nuevo enfoque, cada vez es mas evidente que el aumento del gasto computacional se ve compensado en forma de propiedades estructurales y dinamicas extremadamente precisas. En particular, estos metodos permiten potencialmente simulaciones dinamicas muy precisas de fenomenos qmmicos, incluyendo las interacciones quelante-ion de metal y las reacciones catalizadas por enzimas.
E)Dinamica molecular clasica (MD)
La dinamica molecular clasica se puede utilizar para identificar la orientacion exacta de los ligandos en los puntos de union de la molecula o moleculas diana (por ejemplo, los puntos de union de HLA-DR10 (Punto 1 y Punto2)). Esta informacion se puede utilizar para disenar los ligandos multivalentes para transportar radioisotopos selectivamente hasta la molecula diana y/o hasta las celulas que presentan la molecula diana.
En concreto, estos datos estructurales ayudan a identificar que grupos funcionales del ligando(s) se pueden utilizar para unir sinteticamente el enlazador. Para todos los ligandos que estan experimentalmente verificados que se unen a la diana, la dinamica molecular clasica se puede aplicar sobre el ligando en los puntos de union a la diana para determinar la conformacion y orientacion del ligando y las interacciones espedficas que median en la especificidad de union (por ejemplo, enlaces de hidrogeno, interacciones electrostaticas y de Van der Waals). En determinadas realizaciones, las simulaciones de dinamica molecular incluiran la diana y los ligandos solvatados en una caja de agua periodica. Para cada ligando, se pueden realizar simulaciones de 500 ps a varios nanosegundos utilizando multiples orientaciones de partida.
Un componente importante de los SHAL polidentados de esta invencion es el enlazador molecular entre los ligandos individuales (fracciones de union) que comprenden el SHAL. Tfpicamente este enlazador adopta una conformacion de fase acuosa (o conjunto de conformaciones) que contiene los dos (o mas) ligandos a distancias apropiadas para unirse eficientemente a su punto de union en la superficie de la diana. Para ayudar a disenar este enlazador, se puede aplicar la dinamica molecular clasica sobre la molecula enlazadora solamente y sobre el enlazador unido a compuestos del ligando espedficos.
Se puede utilizar el programa CHARMM para realizar simulaciones de dinamica molecular clasica sobre diversos enlazadores. Por ejemplo, las simulaciones realizadas con enlazadores PEG pueden utilizar un numero diferente de unidades PEG (4, 6 y 8) en las moleculas. Las estructuras de partida para las cuatro simulaciones pueden tener las moleculas en una conformacion plenamente extendida. Estas moleculas extendidas se pueden solvatar en cajas de agua y anadir iones de sodio a cada caja para neutralizar los sistemas. Estos sistemas solvatados se calentaron, por ejemplo, a 300 K y se dejaron equilibrar durante
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200 picosegundos. Tfpicamente las simulaciones se pueden realizar a una temperatura constante (ensamble NVT) y las interacciones electrostaticas se pueden tratar anadiendo malla de partmula Ewald (PME).
Inicialmente los dos compuestos que se van a unir se pueden examinar visuunidos a la protema determinado por docking y dinamica molecular utilizando graficos informaticos. Por ejemplo, se puede producir un enlazador de polietilenglicol (PEG) utilizando software de diseno molecular (AMpAC) entre los dos compuestos. Esta estructura se puede simular despues utilizando dinamica molecular clasica en una caja de agua periodica, por ejemplo como se ha descrito antes durante varios nanosegundos. Se pueden analizar los datos resultantes sobre los movimientos dinamicos para medir la distancia media ligando- ligando y la orientacion relativa del ligando. Estos datos se pueden comparar con la distancia entre los ligandos y la orientacion relativa en la superficie de la diana para determinar la longitud optima para el enlazador.
Las simulaciones de dinamica molecular tambien se pueden utilizar para investigar algunas otras propiedades en el conjunto de los SHAL a fin de optimizar su efectividad terapeutica. En concreto, se pueden utilizar simulaciones de dinamica molecular para investigar algunas modificaciones entre las que se incluyen la estructura qmmica del propio enlazador y los dos ligandos de cada extremo. El objetivo de estas simulaciones consistira en identificar los probables efectos de estas modificaciones sobre la eficiencia de union a la diana y la especificidad antes de realizar modificaciones sinteticas caras.
Los metodos de dinamica molecular utilizan un campo de fuerza clasico obtenido empmcamente para simular el movimiento de cada atomo en un sistema qmmico. Esta metodologfa esta altamente desarrollada para la simulacion de acidos nucleicos, (Beveridge y McConnell (2000) Curr. Opinion in Structural Biology 10:182-196) y protemas (Brooks et al. (1983) J. Computational Chemistry 4/187-217; Cheatham y Brooks (1998) Theoretical Chemistry Accounts 99:279-288; Doniach y Eastman (1999) Curr. Opinion in Structural Biology 9: 157-163). Las simulaciones de dinamica molecular tfpicas publicadas implican 10-100 000 atomos (incluyendo tanto las biomoleculas que se van a simular como una pantalla de agua que las rodea y contraiones) que son simulados durante varios nanosegundos de tiempo. La simulacion mas grande publicada es una simulacion de un microsegundo de una protema pequena (Duan y Kollman (1998) Science 282:740-744). Sin embargo, la escala temporal de varios nanosegundos resulta suficiente para capturar la relajacion estructural y la reorganizacion del solvente, y es lo suficientemente larga en algunos casos para simular transiciones entre diferentes conformaciones macromoleculares (Cheatham y Kollman (1996) J. Mol. Biol., 259:434-444; Yang y Pettitt (1996) J. Physical Chemistry A 100:2564-2566).
Recientemente se ha publicado una simulacion de dinamica molecular de polietilenglicol (PEG) que resulta relevante para el diseno de enlazadores PEG para los SHAL. Heymann y
Grubmuller utilizaron la dinamica molecular clasica para describir las propiedades conformacionales y elasticas de cadenas de PEG individuales (Heymann y Grubmuller (1999) Chemical Physics Letters 307: 425-432; Young y Lovell (1992) Introduction to Polymeres, Nueva York, Chapman y Hall). Simularon un PEG de 18-mer (aprox. 1 kDalton de peso molecular) en la fase acuosa (solvatado con 1539 moleculas de agua) y en la fase gas (para aproximar la solvacion en un solvente no polar como hexadecano). Averiguaron que en la fase gas el PEG se colapsaba rapidamente para formar una estructura compacta sin estructura local, medida por el grado para el cual el pEg tema una estructura local helicoidal. En agua, el PEG se comporta de forma muy diferente. Muestra una reduccion del radio de giro en comparacion con la estructura plenamente extendida, pero conserva un marcado grado de helicidad y por tanto cierto grado de rigidez. Estas simulaciones indican que la rigidez local de la estructura de PEG esta causada por las moleculas de agua que forman los puentes por enlaces de hidrogeno entre sucesivos oxfgenos de la cadena de PEG. Tambien simularon el alargamiento de la cadena de PEG con un rango de fuerzas de entre 0 y 500 picoNewtons (esto imita estudios experimentales con Microscopios de fuerza atomica). Descubrieron un alto consenso en su fuerza prevista frente a las curvas de extension con los valores recientemente medidos en una unica molecula de PEG (Oesterhelt et al. (1999) New Journal of Physics 1/6.1-6.11).
Estos resultados demuestran que las simulaciones de dinamica molecular clasica de PEG pueden reproducir de forma precisa propiedades complejas como curvas de fuerza/extension y confirma con solidez la precision de las simulaciones de soportes PEGilados propuestas. A pesar de que el soporte PEGilado actualmente en uso (13,6 kDalton de peso molecular) es considerablemente mayor que el PEG 18-mer simulado por Heymann y Grubmiller, se encuentra perfectamente dentro del alcance de las simulaciones de dinamica molecular rutinarias.
Las simulaciones de dinamica molecular se pueden realizar facilmente con el paquete de software CHARMM (Brooks et al. (1983) J. Computational Chemistry 4:187-217) utilizando la serie de parametros de la version 22 (MacKerell et al. (1998). /. Physical Chemistry B 102:3586-3616). El analisis se puede realizar utilizando las herramientas de analisis distribuidas con CHARMM y VMD, una herramienta grafica para el analisis de la dinamica molecular (Humphrey et al. (1996) J. Molecular Graphics 14: 33-38).
Los pasos de una configuracion tfpica y del proceso de simulacion son los siguientes:
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A. Configuracion preliminar.
1.Calculo de cargas parciales para los tipos de atomos no incluidos en el campo de fuerza de CHARMM. Los modelos de compuestos que contienen los tipos de atomos no parametrizados se optimizaran a nivel de la teona de Hartree-Fock utilizando un conjunto de base de 6-31G(d). Tras la convergencia, las cargas parciales de cada atomo se computaran utilizando el metodo de ajuste de cargas de Merz-Kollman (Besler et al. (1990) J. Computational Chemistry 11:431-439). Estas cargas pueden sustituir a las cargas atomicas por defecto.
2.Moleculas a simular:
a. Construccion de estructuras moleculares
Las moleculas a simular se pueden producir utilizando QUANTA y las cargas atomicas se obtendran como en el paso uno anterior. A continuacion, se puede computar la carga neta del conjunto del compuesto.
b. Solvatacion de estructuras moleculares:
Las moleculas y los complejos de moleculas construidos en el paso 2a anterior se pueden
neutralizar utilizando iones Na+ que se posicionan utilizando el programa SOLVATE. A continuacion se puede solvatar todo el sistema en las moleculas de una caja de agua y esta caja de simulacion se puede ajustar posteriormente para producir la densidad adecuada.
B. Realizacion de la simulacion:
1.Equilibrado del sistema de molecula/agua/contraion:
a. Minimizacion: Para eliminar la tension residual que queda en las estructuras moleculares despues de la fase de construccion, las moleculas solvatadas del paso 2b anterior pueden ser minimizadas durante 10 000 pasos, de los que las 1 000 primeras iteraciones se realizan utilizando el descendiente mas profundo y el resto utilizando los metodos de Newton- Raphson adoptados.
b. Equilibrado: Tras la minimizacion, la temperatura se puede aumentar de 0K a 300K durante 10 ps y posteriormente mantenerse fija a 300K. El sistema se puede equilibrar durante 200 ps a temperatura constante. Las fuerzas de rango largo se manipulan por el metodo de malla de partfcula de Ewald (Essmann et al. (1995) J. Chemical Physics 103: 8577-8593.
Las moleculas de agua son TIP3P (Jorgensen et al. (1983) J. Chemical Physics 79: 926-935). Se puede utilizar un paso de tiempo de integracion de 2 femtosegundos, y se puede utilizar el algoritmo SHAKE para limitar todos los movimientos de los atomos de hidrogeno (Reichert y Welch (2001) Coordination Chemistry Reviews 212: 111-131).
c. Pasos de produccion: Para las simulaciones de produccion, se puede utilizar la dinamica molecular de temperatura constante (empleando el ensamble nVt). Se puede utilizar el metodo de malla de partfcula de Ewald (Essmann et al. (1995) J. Chemical Physics 103:8577-8593) para las fuerzas de rango largo. Durante la aplicacion de la dinamica, la serie completa de coordenadas atomicas se puede guardar cada 0,1 ps para su posterior analisis. Para las simulaciones preliminares, las simulaciones de dinamica molecular se realizaron en nuestros ordenadores Compac Alpha a una velocidad correspondiente a unas 625 cpu horas (unas 4 semanas) por nanosegundo; por tanto, las simulaciones de varios nanosegundos de estos sistemas resultaran rutinariamente viables en nuestra gran red de estaciones de trabajo.
Ejemplo 3 Sintesis y ensayo de un SHAL bidentado
El SHAL bivalente (LeacPLD)2LPDo fue sintetizado, purificado por HPLC y caracterizado por espectrometna de masas. Este SHAL tema dos ligandos bidentados JP459B interconectados a traves de un enlazador y un DOTA unido en el tercer brazo (vease, por ejemplo, la Figura 14).
Los SHAL se disenaron en torno a un residuo de lisina protegido ortogonalmente para facilitar la sintesis de la resina en fase solida. Se utilizo un mini-PEG similar a un acid amino protegido por Fmoc (2 CH2O's) como enlazador para aumentar incrementalmente la distancia entre las fracciones de encefalina y desoxicolato. Se utilizo Fmoc-biotinil-lisina para introducir biotina en los SHAL para los experimentos con Biacore. Todos los SHAL tienen la misma configuracion: CO2H:Biotina-lisina:lisina:(lisina a NH2: 0, 1, 2 enlazador mini-PEG, desoxicolato)(lisina g NH2: LFGGY-NHAc). El SHAL bidentado sigue la convencion: CO2H:Biotina-lisina:lisina:[(lisina a NH2: 0, 1, 2 enlazador mini-PEG, desoxicolato)(lisina NH2: LFGGY- NHAc)]2 -y, por tanto, es asimetrico cerca del segundo residuo de lisina.
Todas sustancias qmmicas utilizadas se adquirieron a Aldrich o Nova Biochem. Los SHAL se sintetizaron utilizando sintesis Fmoc de fase solida estandar de resina de clorotritilcloruro.
Los ligandos se clivaron de la resina y los grupos de proteccion se eliminaron utilizando los reactivos apropiados. Los esteres de acido trifluoroacetico formados en los alcoholes primarios de desoxicolato
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durante el clivaje de la resina se eliminaron mediante agitacion en bicarbonato de amonio. Los SHAL se purificaron mediante cromatograffa ftquida de alto rendimiento de fase inversa (HPLC). La HPLC analftica se realizo a 1 mL / min en una maquina Agilent 1100 (Waters Symmetry C18, columna de 5 mm, 4,2 x 150 mm) y la HPLC de preparacion se realizo a 10 mL / min en una maquina de preparacion Waters (Waters Symmetryprep C18, columna de 7 mm, 19 x 300 mm). Los SHAL se caracterizaron usando espectroscopia por resonancia magnetica nuclear (NMR) y espectrometna de masas por electrospray. Los espectros 1H y 13C de la NMR se registraron en un espectrometro Bruker DRX 500 MHz. Los espectros de masas se adquirieron en un espectrometro Micromass Quattro Micro API operando en modo ion positivo.
La espectrometna de masas del (LeacPLDALPDo demostro que no contiene ningun DOTA libre. No cabna esperar la presencia de DOTA libre basandose en el proceso usado para sintetizar el SHAL. Se sintetizo (LeacPLDALPDo uniendo cada componente enlazador o ligando a una cadena creciente covalentemente enlazada a la superficie de una resina. Despues de cada reaccion qmmica la resina se lavo abundantemente para eliminar los productos que no hadan reaccionado. El DOTA se unio al enlazador al comienzo de la smtesis. Una vez que se lavo el exceso de DOTA, se realizaron multiples reacciones qmmicas adicionales sobre la resina para anadir los diversos enlazadores y ligandos, y tras cada reaccion se lavaron de nuevo los productos que no hadan reaccionado. Para el momento en el que la smtesis del SHAL se hada completado, la cantidad de DOTA libre presente en la muestra era indetectable por examen con HPLC y espectroscopia de masas. El enlace de DOTA es extremadamente estable, por lo que una vez que se ha unido no se desprende del SHAL.
Durante la radioqmmica, entre los componentes que pueden estar presentes en el pico de desprendimiento temprano que pueden tener asociada una etiqueta radioisotopica se incluyen el tampon salino (bicarbonato de amonio), posiblemente trazas de trifluoroacetato eliminado de la hidrolisis del SHAL durante el paso final de la smtesis, y el exceso de EDTA y del isotopo libre o del complejo isotopo-EDTA que no se unio al DOTA. Puede que simplemente la dialisis no sea el metodo preferible para eliminar eficientemente todo este material. La dialisis inversa es un metodo preferible para la purificacion. Alternativamente, el lavado del quelato (EDTA) tras la radioqmmica se puede realizar utilizando una columna de perlas de EDTA para eliminar los radiometales que no han sido quelados por el DOTA o que mantienen una union debil de una manera no espedfica.
Para que el metal acceda al DOTA de forma eficiente, tambien es importante ajustar la mezcla de reaccion a un pH alcalino adecuado. Dado que el SHAL como molecula es bastante diferente de una molecula anticuerpo-DOTA, el metodo utilizado para aumentar el pH del complejo SHAL-DOTA preferiblemente tambien aumenta el pH lo suficiente en el SHAL. Se puede conseguir facilmente el acceso de otros metales al DOTA si estan presentes en alguna fase. Estos se pueden detectar comprobando el espectro de masas del compuesto. Hemos analizado el espectro de los SHAL purificados y observamos escasos metales o ninguno.
Los SHAL de desoxicolato-yodotironina biotinilados se sintetizan de manera analoga.
Los ensayos ELISA demostraron que el SHAL, LeacPLBD (el SHAL bidentado univalente), se une a las celulas que contienen HLA-DR10 y discrimina entre las que contienen y las que no contienen HLA-DR10 (vease la Figura 20).
Se realizaron diversos estudios farmacocineticos, de biodistribucion y captura de imagenes con resultados coherentes. En determinadas realizaciones, la biodistribucion de ”1In-DOTA [SHAL
070804(LeacPLD)2LPDo] se determino en ratones con tumores Raji (vease, por ejemplo, la Figura 19A).
Ejemplo 4
Desarrollo de ligandos sinteticos de alta afinidad que se unen a un epftopo estructural del receptor de celulas tumorales HLA-DR10
Se han identificado diversos receptores de protema de la superficie celular que distinguen entre las celulas malignas del cancer y sus homologas normales. A pesar de que se ha demostrado que algunos de estos receptores son mas abundantes en las celulas del cancer (por ejemplo, CD20, CD22), se ha confirmado que otros difieren estructuralmente (por ejemplo, HLA-DR10, Muc-1) de los mismos receptores u otros estrechamente relacionados en las celulas normales. Esto ha permitido desarrollar diversos reactivos de receptor espedfico basados en anticuerpos, conjugados con radioisotopos para su uso en radioinmunoterapia. Lym-1, un anticuerpo desarrollado para unirse a un epftopo estructural unico de un receptor de superficie celular abundante, HLA-DR10, que se encuentra unicamente en el linfoma humano y en los linfocitos de celulas B normales, se ha utilizado con bastante exito para el tratamiento del linfoma no Hodgkin. En un esfuerzo por desarrollar productos terapeuticos mas pequenos y efectivos para el tratamiento del linfoma no Hodgkin, hemos sintetizado el primero de una serie de ligandos de alta afinidad selectivos (SHAL) de pequeno tamano (<3kD) que se unen a este mismo epftopo estructural del HLA- DR10. Se creo un modelo de homologfa para HLA-DR10 utilizando cuatro estructuras de cristales conocidas de moleculas HLA-DR relacionadas. Se identificaron dos "hendiduras" unicas ubicadas en la superficie de la protema adyacente a aminoacidos clave necesarios para la union de Lym-1 y se utilizaron tecnicas de docking computacional para realizar una preseleccion en una amplia biblioteca de moleculas
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pequenas, a fin de predecir que compuestos se debenan unir a cada punto. Un reducido numero de estos compuestos se sometieron a ensayo experimentalmente utilizando espectroscopia NMR para confirmar su union a la protema del HLA-DR10 aislado, y se unieron pares de compuestos que se unen a las dos "hendiduras" diferentes utilizando qmmica sintetica de fase solida para crear una serie de reactivos bidentados con enlazadores de diferente longitud. Se ha demostrado que los SHAL que presentan la afinidad mas elevada al HLA-DR10 aislado (aprox. 23 nM) se unen selectivamente a nueve lmeas de celulas cultivadas diferentes que contienen HLA-DR10 y a secciones de tejido congeladas y fijadas obtenidas de pacientes con linfomas humanos de celulas pequenas y celulas grandes. Tambien se sintetizo una forma bivalente de este SHAL y se demostro que mejora la union celular.
Ejemplo 5
Absorcion mejorada por hexa-arginina y residualizacion de ligandos de alta afinidad selectivos por celulas del linfoma Raji
Diversas secuencias peptfdicas ricas en arginina similares a las que se encuentran en las protemas virales se han conjugado con otras moleculas para facilitar su transporte al citoplasma y al nucleo de las celulas diana. El ligando de alta afinidad selectivo (SHAL) (DvLPBaPPP)2LLDo, que se desarrollo para unirse unicamente a las celulas que expresan HLA-DR10, se ha conjugado con uno de estos dominios de transduccion peptfdica, hexa-arginina, para valorar el impacto del peptido sobre la absorcion de SHAL y la internalizacion en las celulas Raji, un linfoma de celulas B.
Se creo un analogo del SHAL (DvLPBaPPP)2LLDo que contiene un peptido de
hexa-arginina anadiendo seis residuos de D-arginina secuencialmente a una lisina insertada en el enlazador del SHAL. Se examino la union del SHAL, la internalizacion y la residualizacion en celulas Raji que expresan HLA-DR10 utilizando ensayos de union de celulas completas y microscopfa confocal. Se observo que las celulas Raji se unen dos veces mas al analogo del SHAL de hexa-arginina etiquetado con 111In que las celulas Raji tratadas con el SHAL relacionado. El SHAL de hexa-arginina manterna el triple de asociacion con las celulas Raji tras el lavado, lo que sugiere que el peptido tambien mejoro la residualizacion del mIn transportado a las celulas. La microscopfa confocal demostro que los dos SHAL se localizaron en el citoplasma de celulas Raji, mientras que una fraccion del SHAL de hexa-arginina se localizo en el nucleo.
La incorporacion de un peptido de hexa-D-arginina al enlazador del SHAL
(DvLPBaPPP)2LLDo mejoro tanto la absorcion como la residualizacion del analogo del SHAL por celulas Raji. En contraste con la abundante union a la superficie celular observada con el anticuerpo Lym-1, la mayona del (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo y del SHAL relacionado se internalizo. Parte del analogo del SHAL de hexa-arginina internalizado tambien se asocio con el nucleo. Estos resultados demuestran que varias propiedades importantes del SHAL, incluyendo la absorcion, internalizacion, retencion y posiblemente la distribucion intracelular, se pueden mejorar o modificar conjugando los SHAL con un polipeptido corto.
Antecedentes
Se han utilizado diversas estrategias para administrar selectivamente qmmicos toxicos o radiacion en celulas del cancer (DeNardo (2005) Semin Oncol., 32:S27-35; Torchilin (2007)
AAPS J., 9:E128-147), para la terapia genetica (Jeong et al. (2005) J Control Release 107:562-570; Xia et al. (2007) J Gene Med 10:306-315) o como herramientas para la transfeccion de celulas (Shigeta K J Control Release 118:262-270) y la silenciacion de genes (Liu (2007) Brief Funct Genomic Proteomic 6:112-119). Algunos de los planteamientos mas recientes utilizados para mejorar la absorcion celular de los terapeuticos y otras moleculas (tintes fluorescentes, enzimas, anticuerpos y otras protemas) implicaban la introduccion de las moleculas en liposomas o micelas (Constantinides et al. (2008) Adv Drug Deliv Rev 60:757-767; Samad et al. (2007) Curr Drug Deliv 4:297-305). Se ha demostrado que estas construcciones se fusionan con la membrana de la celula, introduciendo los contenidos en el interior de la celula o transfiriendo los componentes unidos al lfpido a la membrana de la celula. Otro enfoque altamente exitoso ha consistido en desarrollar anticuerpos que se focalizan en protemas de la membrana de celulas espedficas y en utilizar estos anticuerpos para administrar radionuclidos u otras moleculas citotoxicas en la superficie de una poblacion espedfica de celulas (Brumlik et al. Expert Opin Drug Deliv 5:87-103; DeNardo et al. (1998) Cancer Biother Radiopharm 13:239-254; Tolmachev et al. (2007) Cancer Res. 67:2773-2782). Mas recientemente, la administracion intracelular se ha realizado uniendo las moleculas a transportar a "lanzaderas", transmembrana naturalmente presentes, peptidos o protemas que atraviesan facilmente las membranas celulares. Una de las lanzaderas de mayor exito es un peptido de senal de localizacion nuclear obtenido del antfgeno T SV40 (Yoneda (1997) J Biochem 121:811-817). Esta secuencia, otras secuencias peptfdicas derivadas del dominio de transduccion de la protema Tat del VIH-1 (Schwarze et al. (1999) Science 285:1569-1572; Torchilin et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 100:1972-1977), penetratina (Tseng et al. (2002) Mol Pharmacol.,62:864-872), y protemas
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intactas como la protema del herpes virus VP22 (Phelan et al. (1998) Nat Biotechnol 16:440-443) y anticuerpos anti-ADN (Avrameas et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Set, eE.UU., 95:5601-5606) se utilizan actualmente para facilitar el transporte de liposomas, virus, enzimas, anticuerpos y varias otras protemas hasta las celulas. Tambien se ha conseguido un exito considerable utilizando transportadores de peptidos cationicos sinteticos como la oligoarginina (Futaki (2005) Adv Drug Deliv Rev 57:547-558; Han et al. (2001) Mol Cells 12:267-271; Kim et al. (2007) Int JPharm 335:70-78; Tung y Weissleder (2003) Adv Drug Deliv Rev 55:281-294), poli-L-lisina lactosilada (Midoux et al. (1993) Nucleic Acids Res 21:871-878) y secuencias peptfdicas cortas seleccionadas de bibliotecas que presentan fagos (Kamada et al. (2007) Biol Pharm Bull 2007, 30:218-223) que exhiben 10 similitudes de secuencia con lanzaderas de peptidos conocidas.
Recientemente, se han sintetizado varias reproducciones de anticuerpos de moleculas pequenas que parecen prometedoras como agentes de seleccion de diana para la captura de imagenes o la terapia del cancer [24-28]. Ademas de exhibir selectividades y afinidades (nM a pM) similares a los anticuerpos, estas moleculas ofrecen el potencial de minimizar algunas de las dificultades asociadas al uso de sistemas de administracion de farmacos basados en protemas. Estos conservan las propiedades farmacocineticas mas deseables de las moleculas pequenas, es menos probable que sean inmunogenicos, pueden resultar lo suficientemente estables para la administracion oral y los costes asociados a la produccion del farmaco se pueden reducir de forma significativa. La familia de los SHAL de las reproducciones de anticuerpos tambien se pueden modificar facilmente para transportar metales radiactivos, diversas etiquetas que permiten su uso como agentes de captura de imagenes y otras moleculas pequenas (por ejemplo, toxinas o inhibidores). Otra modificacion potencialmente util incluye alteraciones que facilitan la absorcion e internalizacion del SHAL por parte de la celula diana, lo que cabna esperar que aumente el tiempo de estancia en el tumor y que administre el SHAL en un entorno (el citoplasma o el nucleo) en el que pueda causar danos adicionales.
Trabajando con un SHAl desarrollado con anterioridad para focalizar en el HLA-DR10, un receptor de superficie celular abundante sobreexpresado en las celulas B malignas, sintetizamos un peptido analogo al SHAL conjugandolo con hexa-arginina, un peptido que se ha demostrado anteriormente que facilita el transporte de protemas y acidos nucleicos a las celulas. Los estudios de union realizados con el SHAL y su analogo de hexa-arginina in vitro utilizando celulas Raji que expresan HLA-DR10 demuestran que la secuencia de hexa-arginina cambio de forma significativa las propiedades de los SHAL, mejorando tanto la internalizacion del SHAL como la residualizacion del radionuclido.
Metodos
Diseno de SHAL
El proceso utilizado para crear un modelo de homologfa para el HLA-DR10, identificar cavidades de union unicas dentro del epftopo de Lym-1, seleccionar ligandos que se unen a estas cavidades y crear el (DvLPBaPPP)2LLDo SHAL ha sido documentado con anterioridad (Balhom et al. (2007) Clin Cancer Res 13:5621s-5628s). Se desarrollo un proceso para producir un analogo del peptido de hexa-arginina de este SHAL relacionado, (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo, modificando la smtesis para incluir la incorporacion de un residuo de lisina adicional en el medio del enlazador que conecta los dos monomeros del SHAL y unir un hexapeptido de arginina a la amina libre en esta lisina.
Smtesis de SHAL
Se sintetizaron los dos SHAL dimericos (DvLPBaPPP)2LLA y (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLA en resina de cloruro de clorotritilo utilizando residuos de lisina (L) protegidos ortogonalmente y miniPEG (P) para unir los dos ligandos pequenos Dv y Ba como se ha descrito anteriormente para (DvLPBaPPP)2LLA (Balhorn et al. (2007) Clin Cancer Res 13:5621s-5628s; Hok et al. (2007) Bioconjug Chem 18:912-921). Para producir el derivado amino del SHAL de hexa-arginina (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLA, se inserto un segundo residuo de lisina Dde-D-Lys(Fmoc)-OH en el enlazador durante la smtesis de SHAL realizando dos pasos de acoplamiento secuenciales de Dde-D-Lys(Fmoc)-OH. En la posicion alfa de la tercera lisina, se insertaron seis residuos de arginina consecutivos reaccionando la resina con Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH en seis ocasiones. El sexto residuo de Arg se protegio con un acetato (Ac) haciendolo reaccionar con antndrido acetico en N,N diisopropil-etilamina (DlEA)/dimetilformamida (DMF). Los grupos de guanidinio de los seis residuos de arginina permanecen protegidos con grupos de proteccion de 2,2,4,6,7- pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonil (Pbf) sensibles a acido trifluoroacetico (TFA) durante el resto de la smtesis. El resto de la smtesis se completo despues tal y como se ha descrito anteriormente para (DvLPBaPPP)2LLA (Id.). Se realizo una HPLC analftica y una espectrometna de masas tipo electrospray para confirmar la pureza y la identidad de los SHAL de amina libre (DvLPBaPPP)2LLA y (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLA.
(DvLPBaPPP)?LLA:
Partiendo de 50 mg (0,07 mmol) de resina y 30 mg (0.07 mmol) de Fmoc-D-
Lys(Boc)-OH, se aislaron 34 mg de (DvLPBaPPP)2LLA (Rt = 7,86 min, Waters Symmetry C18, 5 pm, columna de 4,2 x 150 mm, detector de array de diodos con un gradiente lineal del 95% de H2O, 1% de
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TFA a 80% de acetonitrilo (MeCN), 1% TFA durante 12 min) en forma de solido rojo tras la purificacion. ESI-MS: mlz calculado para C150H224N34O41S2 (M + 3H)3+ 1075,60, dio un resultado de 1075,62; calculado para (M + 4H)4+ 806,95, dio un resultado de 806,93; calculado para (M + 5H)5+ 645,76, dio un resultado de 645,68; calculado para (M + 6H)6+ 538,30, dio un resultado de 538,21.
(DvLPBaPPP)?LArgfiAcLLA:
Se aislaron 81 mg de (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLA (Rt = 8,30 min) partiendo de 90 mg
(0,12 mmol) de resina y 154 mg (0,29 mmol) de Fmoc-D-Lys(Boc)-OH en forma de solido rojo tras la purificacion. ESI-MS: mlz calculado para C194H310N60O49S2 (M + 3H)3+ 1444,71, dio un resultado de 1444,65; calculado para (M + 4H)4+ 1083,76, dio un resultado de 1083,78; calculado para (M + 5H)5+ 867,23, dio un resultado de 867,18; calculado para (M + 6H)6+ 722,86, dio un resultado de 722,78; calculado para (M + 7H)7+ 619,74, dio un resultado de 619,62.
Union del DOTA a los SHAL
El analogo de la amina del SHAL (precursor del DOTA-SHAL con una amina epsilon libre en la primera lisina) se disolvio en 500 pl de DMF anhidroso y 100 pl de DIEA. La sal de hexafluorofosfato (PF6) de DOTA N-hidroxisuccinimida (NHS) ester (933,36 g/mol, 1-1,5 equivalentes) se anadio a la mezcla en forma de solido. La mezcla se sometio a nutacion durante 15 minutos y la reaccion se controlo por HPLC analftico. Una vez completada, la solucion de la reaccion se diluyo con 300 pl de H2O y 300 pl de MeCN (ambos conteman un 1% de TFA) y se purifico por HPLC utilizando un gradiente de 85% de H20 (0,1% de TFA) para 70% de MeCN (0,1% de TfA) durante 25 min. Los DOTA-SHAL purificados resultantes fueron liofilizados y posteriormente analizados por HPLC analftico (Waters Symmetry C18, 5pm, columna de 4,2 x 150 mm, detector de array de diodos), utilizando un gradiente lineal de 95% de H2O (1% TFA) a 80% de MeCN (1% de TFA) durante 12 min) y se caracterizaron por ESI-MS.
(DvLPBaPPPWLLDo:
La reaccion del SHAL (DvLPBaPPP)2LLA amina (6,0 mg, 1,86 pmol) con DOTA NHS ester (2,0 mg, 2,14 pmol) dio una conversion del 100% (Rt = 7,664 min) por HPLC analftico en bruto y produjo (DvLPBaPPP)2LLDo (8,0 mg, solido rojo) tras la purificacion.
ESI-MS: m/z calculado para C166H250N38O48S2 (M + 2H)2+ 1806,09, dio un resultado de 1806,22; calculado para (M + 3H)3+ 1204,40, dio un resultado de 1204,49; calculado para (M + 4H)4+ 903.55, dio un resultado de 903,61; calculado para (M + 5H)5+ 723,04, dio un resultado de 723,07; calculado para (M + 6H)6+ 602,70, dio un resultado de 602,64.
(DvLPBaPPP)?LArgfiAcLLDo:
La reaccion del SHAL (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLA amina (15,0 mg, 3,46 pmol) con DOTA NHS ester (5,0 mg, 5,36 pmol) dio una conversion del 100% (Rt = 7,70 min) por HPLC analftico en bruto y produjo (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo (12,0 mg, solido rojo) tras la purificacion. ESI-MS: m/z calculado para
C210H336N64O56S2 (M + 3H)3+ 1573,51,
dio un resultado de 1573,54; calculado para (M + 4H)4+ 1180,38, dio un resultado de 1180,43; calculado para (M + 5H)5+ 944,51, dio un resultado de 944,52; calculado para (M + 6H)6+ 787,26, dio un resultado de 787,26; calculado para (M + 7H)7+ 674,94, dio un resultado de 674,88; calculado para (M + 8H)8+ 590,69, dio un resultado de 590,58.
Radioquimica
Tal y como se ha descrito anteriormente (Id.), los DOTA-SHAL se etiquetaron con 111InCh sin vehftculo (MDS Nordion, Vancouver, Canada) utilizando el metodo siguiente (DeNardo et al. (2007) J Nucl Med 48:1338-1347). Se anadio una parte aftcuota de 111 InCl3 (15-20 pl) a una solucion DOTA-ShAl (25-50 pg) en 0,1 M de NH4OAc, pH 5,3 (50 pl); se ajusto el pH final de la mezcla de la reaccion a 6,5 anadiendo 4M de NH4OAc y la mezcla se incubo durante 1 h a 37 °C; despues se anadieron 10-20 pl de 0,1 M de acido etilenodiaminotetraacetico (EDTA) para aislar el exceso de 111In3+ libre. El producto radioetiquetado se purifico utilizando HPLC, seguido de dialisis en tampon fosfato salino (PBS) con un corte de membrana de 1 kD. La pureza de los SHAL etiquetados con 111In se determino por cromatograffa de capa fina (TLC) (10% NH4OAc-MeOH 1:1), HPLC y electroforesis de acetato de celulosa (CAE). La CAE resolvio los 111In- DOTA-SHAL e 111In-EDTA; se observaron picos radiactivos a 2 3-3,0cm y > 6,5cm, respectivamente. En el ensayo de TLC se observaron resultados similares; los 111In-DOTA-SHAL mostraron una escasa migracion desde el punto de aplicacion (Rp = 0.25-0.3), mientras que mIn-EDTA se desplazo hacia la parte delantera del solvente (Rf =0.5). Conforme a la HPLC, 111In-EDTA se eluyo a 2,5-3,0 ml y 111In-DOTA- SHAL a 9,5-10 ml. Los SHAL etiquetados con 111In se purificaron utilizando RP-HPLC o una membrana de dialisis de 1kD en PBS, y se concentro utilizando un Savant Speedvac SCI110 (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA, EE.UU.). La pureza radioqmmica final se determino utilizando C18-RP-TLC (EM Science, DC-Plastikfolien kieselgel 60 F254, Cherry Hill, NJ), HPLC y CAE. El rendimiento del producto 111In-DOTA-SHAL se situo entre el 70 - 90% y la pureza del producto entre el 90 - 95%. El producto final se disolvio en 10% dimetilsulfoxido (DMSO) en PBS y se mantuvo estable durante 72 horas a temperatura ambiente.
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Union de SHAL a protema de HLA-DR10 aislada
Los experimentos de union de protema se realizaron utilizando la resonancia de plasmones superficiales en un Biacore 3000 (Biacore, Piscataway, NJ) a 25°C. Un fragmento inmovilizado de estreptavidina de grado investigacional (SA chip, Biacore) se preacondiciono y normalizo segun las instrucciones del fabricante. Los SHAL etiquetados con biotina se disolvieron en DMSO y se diluyeron en 1,05X PBS (Biacore) hasta una concentracion final de IX PBS pH 7,4, 5% DMSO, para equipararse al tampon de migracion. Estos SHAL se inyectaron en la celula de flujo para obtener una densidad de superficie de 500- 1000RU (unidades de respuesta). Se inyecto biotina (50|jM E-Z Link Amine-PE02-Biotin, Pierce) sobre todas las celulas durante un minuto a 20jl/min como bloqueo para reducir la union no espedfica. Se utilizo una celula de flujo como celula de referencia y se inmovilizo un SHAL diferente en cada una de las otras tres celulas.
Los experimentos para medir la union de HLA-DR10 a los SHAL se realizaron a una velocidad de flujo de 30jl/minuto en un tampon de migracion PBS pH7.4 utilizando las cuatro celulas de flujo. El HLA-DR10 aislado de celulas Raji (Rose et al. (1996) Cancer Immunol Immunother 43:26-30) se diluyo en tampon de migracion hasta una concentracion final de entre 10nM y 1jM, y se produjeron diversas concentraciones aleatoriamente por triplicado. Se inyecto protema durante tres minutos, se dejo disociar durante cinco minutos seguido de regeneracion de la superficie utilizando una inyeccion de un minuto de 0,1% de sodio dodecilsulfato (SDS) seguido de un paso de lavado con una inyeccion de dos minutos de tampon de migracion. Los datos, que doblemente referenciados por sustraccion de la superficie de referencia de blanco y una media de cinco inyecciones blanco, se procesaron utilizando el programa SCRUBBER (Universidad de Utah).
Ensayo de union celular
Las celulas B de linfoma de Burkitt humano Raji (American Type Culture Collection,
Manassas, VA) se mantuvieron en medios RPMI-1640 suplementados con 10% de suero bovino fetal, 2mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sodico, 1% de una solucion de aminoacidos no esenciales (GIBCO #11140-050), y 100 unidades/ml de penicilina G, 100jg/ml de estreptomicina, y 0,25 jg/ml de anfotericina B a 37°C en una atmosfera de CO2 humidificada al 5%. Las celulas Jurkat (American Type Culture Collection, Manassas, VA), una lmea de celulas T de leucemia aguda, se mantuvieron en el mismo medio anadiendo 10mM de acido 4-(2-hidroxietil)-l- piperazinaetanosulfonico (HEPES).
Se realizo una serie de experimentos para cuantificar la absorcion del SHAL relacionado etiquetado con 111In (DvLPBaPPP)2LLDo y de su analogo hexa-arginina (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo por parte de celulas Raji, una lmea de celulas que se habfa demostrado con anterioridad que expresa la variante HLA-DR10. Los ensayos se realizaron utilizando partes almuotas que conteman 106 celulas suspendidas en 150jl de PBS con 5% de albumina de suero bovino (BSA). Las partes almuotas de las celulas se trataron con 0,1, 1,5, 10 o 25 ng de (DvLPBaPPP)2LLDo etiquetado con 111In (DvLPBaPPP)2LLDo o
(DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo durante una hora a 4°C y 22°C. Los tubos que conteman las celulas tratadas se centrifugaron para separar las perlas de celulas del supernatante y las dos fracciones se sometieron a recuento en un contador gamma de pocillos para determinar la cantidad de SHAL unido y libre. La mitad de las perlas de celulas se lavaron dos veces con PBS y se incubaron a 22° C durante 15 min antes de centrifugarlas de nuevo. Los conjuntos de lavados y las perlas de celulas lavadas se sometieron posteriormente a recuento en el contador gamma de pocillos para valorar la cantidad de SHAL unido que se podna eliminar por lavado.
Microscopia confocal en 3D
La union de SHAL y la internalizacion en celulas Raji y Jurkat se valoraron utilizando el metodo anteriormente descrito por O'Donnell et al. (O'Donnell et al. (1998) Prostate 37:91-97). Se realizaron experimentos para comparar la union de (DvLPBaPPP)2LLDo (el SHAL principal), su analogo de hexa- arginina (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo, y Lym-1 quimerico (chLym-1) a celulas Raji. Todos los pasos se realizaron a 20° C, salvo indicacion.
Cuatro millones de celulas Raji (>92% de viabilidad) en crecimiento en fase logantmica se convirtieron en perlas a 300 x g, se lavaron y se bloquearon durante 30 min en 1 ml de un 1% BSA (fraccion V) en PBS, con rotacion constante. A continuacion, las celulas se incubaron durante 1 hora, a un millon por 250jl, con un 1% BSA en PBS o bien en un reactivo primario biotinilado: 10nM de chLym-1, 10 jM de SHAL relacionado, o 10 jM de SHAL de hexa-arginina. Despues de cuatro lavados (dos en 1% BSA en PBS, dos en PBS), 50jl de las suspensiones celulares se aplicaron sobre portaobjetos recien recubiertos con poli-L-lisina, y se dejo que las celulas se adhiriesen durante 10 min en una camara humeda. La fijacion y permeabilizacion se realizaron a -20° C utilizando la exposicion a metanol durante 4 min. Las celulas Jurkat se trataron de la misma manera como control.
A continuacion, los portaobjetos se lavaron dos veces en PBS y se bloquearon en un 10% de suero fetaplex (Gemini Bioproducts, West Sacramento, CA) en PBS durante 15 min y se lavaron una vez en PBS. El reactivo de deteccion, Streptavidin AlexaFluor 610 (Invitrogen, Carlsbad, CA) se diluyo 1/500 en diluyente, se aplicaron 100jl; se aplico una pelmula de parafina plastica sobre la solucion para evitar la
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evaporacion. Los portaobjetos se incubaron en una camara humeda durante 30 minutos, se lavaron cinco veces durante 5 min cada uno en PBS, y se enjuagaron brevemente en agua doblemente destilada. Una vez que los portaobjetos se secaron, se montaron cubreobjetos con ProlongGold con 4',6-diamidino-2- fenilindol (DAPI, Invitrogen, Carlsbad, CA) Los portaobjetos se visualizaron con un microscopio confocal de barrido laser FV1000 Olympus y los datos se recopilaron como Z-scans a 160X, con secciones focales de 1 pm de separacion en la celula.
Analisis estadistico
Los datos reflejados representan la media ± de la desviacion tipica. Las comparaciones estadfsticas se basaron en la prueba de la suma de rangos de Wilcoxont (Hollander y Wolfe (1973) Nonparametric statistical methods. Nueva York: Wiley Publications), un procedimiento basado en los rangos de los valores de dos grupos de ensayo. Las diferencias se consideraron significativas desde el punto de vista estadistico cuando los valores p eran < 0,05. Los valores p se determinaron por la transformacion Z = TANH_1r para los coeficientes de correlacion (CRC 15 Handbook of Tables for Probabilities and Statistics. 2a ed. Boca Raton, FL: CRC Press; 1968).
Resultados
Diseno y sintesis de SHAL
Dos formas del SHAL de amina libre, (DvLPBaPPP)2LLA, y el analogo de hexa-arginina, (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLA, se sintetizaron en cantidades de multimiligramos
y se purificaron por cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC). Se unio una biotina al grupo 8- amino de la amina terminal (A) tanto del (DvLPBaPPP)2LLA como del (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLA para producir formas biotiniladas para su uso en experimentos de union de celulas y protemas. Se unio acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA) tanto a (DvLPBaPPP)2LLA como a (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLA al mismo tiempo, para poder etiquetar los SHaL con 111In. El SHAL de DOTA (DvLPBaPPP^LLDo (Figura 25A) y el analogo del SHAL de hexa-arginina (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo (Figura 25B) se etiquetaron con 111In a alta eficiencia (>90 %) con actividades espedficas de entre 70-85 pCi/pg SHAL. Los analisis del SHAL radioetiquetado resultante por HPLC y electroforesis de acetato de celulosa (CAE) demostraron que la pureza del producto era superior al 90%. Se utilizaron D- isomeros de arginina incorporados durante la sintesis de la secuencia de hexa-arginina en (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo para minimizar la susceptibilidad proteolftica del peptido. A pesar de que es necesario realizar experimentos mas detallados para valorar convenientemente la estabilidad del SHAL in vivo, los datos obtenidos de un experimento preliminar con CAE no mostraron evidencia de degradacion cuando el analogo del SHAL de hexa-D-arginina se incubo en plasma humano a 37°C durante 24 horas (datos no mostrados).
Afinidad del SHAL con la proteina de HLA-DR10
Se realizaron estudios de union de resonancia de plasmones superficiales con los dos SHAL para estimar y comparar la afinidad de ambos con la proteina del HLA-DR10 aislado. En una serie de experimentos cineticos en los que las versiones biotiniladas de los SHAL se inmovilizaron sobre la superficie de un fragmento de estraptavidina, se observo que el SHAL relacionado (DvLPBaPPP)2LLDo se une a HLA- DR10 con una Kd aproximada de 21 nM. Se obtuvo una Kd similar (aprox. 34 nM) para el analogo que contiene hexa-arginina (DvLPBaPPP)2LArg6A cLLDo.
Analisis de la absorcion de SHAL por celulas Raji expresando HLA-DR10
Se realizaron experimentos de union de celulas in vitro utilizando el SHAL relacionado etiquetado con 111In y el analogo del SHAL de hexa-arginina para cuantificar la absorcion de SHAL y para evaluar el efecto de anadir el marcador de hexa-arginina. La absorcion se valoro utilizando celulas Raji, una lmea de celulas de linfoma expresando HLA-DR10. Las partes alfcuotas que conteman 106 celulas se incubaron con cantidades crecientes de SHAL que conteman SHAL etiquetado con 111In como trazador, y se midio el 111In asociado a celulas antes y despues de lavar las perlas de celulas.
Los analisis de las perlas de celulas no lavadas demostraron que las celulas Raji se unen tanto al SHAL relacionado como al SHAL de hexa-arginina. En ambos casos, el SHAL asociado a celulas aumento linealmente a medida que se incrementaba la concentracion de SHAL en los medios (Figura 26), y la cantidad de SHAL unido no mostro evidencia de alcanzar la saturacion en el rango de concentracion de SHAL sometido a ensayo. Las celulas Raji tratadas con el SHAL de hexa-arginina, a diferencia de las tratadas con el SHAL relacionado, se unen al SHAL dos veces mas (Tabla 9). Una proporcion mayor
del SHAL de hexa-arginina (67%) tambien fue retenida por las celulas tras el lavado en comparacion con el SHAL relacionado (aprox. 46%), provocando un contenido final del SHAL de hexa-arginina que triplicaba el de su SHAL relacionado.
Tabla 9. Retencion (residualizacion) de SHAL unido por celulas Raji. Las muestras de celulas identicas utilizadas en experimentos que se muestran en la Figura 27 se incubaron tal y como se ha descrito anteriormente con 5,3 pmoles de (DvLPBaPPP)2LLDo etiquetado con 111ln o (DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo y, a continuacion, se lavaron dos veces con BSA/tampon. A continuacion, las perlas de celulas se
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sometieron a conteo para obtener estimaciones del SHAL que permanece unido tras el lavado.
SHAL
pmoles SHAL unido/106 celulas Porcentaje SHAL
Sin lavado Con lavado retenido
(DvLPBaPPP)2LLDo
0,568 + 0,091 0,263 + 0,000 46
(DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo
1,300 + 0,038 0,876 + 0,017 67
Localizacion de SHAL por microscopia confocal en 3D
Las imagenes de fluorescencia obtenidas en pianos focales cercanos al centro de las celulas Raji tratadas con formas biotiniladas del SHAL relacionado y el SHAL de hexa-arginina durante solo una hora confirmaron que ambos SHAL eran absorbidos por las celulas Raji (Figura 27). A diferencia del anticuerpo Lym-1, que se une al HLA-DR10 en la superficie de la celula, las imagenes seccionadas tomadas del centro de las celulas mostraron que ambos SHAL se localizaron en el interior de las celulas Raji y se distribuyeron por todo el citoplasma. Las celulas Raji absorbieron una cantidad significativamente mayor del SHAl de hexa-arginina que del SHAL relacionado, tal y como se evidencia por la tincion mas intensa de los citoplasmas de las celulas tratadas con concentraciones equivalentes de los dos SHAL. La absorcion de SHAL no se observo en las celulas Jurkat de control (celulas que carecen del HLA-DR10). Una fraccion del SHAL de hexa-arginina tambien parecio estar asociada con el nucleo. La tincion nuclear no se observo en las celulas tratadas en el SHAL relacionado.
Debate
Numerosos peptidos que penetran en las celulas (CPP) obtenidos de protemas virales y otras protemas que atraviesan las membranas celulares y nucleares han sido empleados como lanzaderas para mejorar la eficiencia de transporte de liposomas, protemas y acidos nucleicos exogenos, y otras moleculas hasta el citoplasma y los nucleos de las celulas (Schwarze et al. (1999) Science 285:1569-1572; Torchilin et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 100:1972-1977; Tseng et al. (2002) Mol Pharmacol 62:864-872; Phelan et al. (1998) Nat Biotechnol 16:440-443; Avrameas et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 95:5601-5606; Futaki (2005) Adv Drug Deliv Rev 57:547-558; Han et al. (2001) Mol Cells 12:267-271; Kim et al. (2007) Int J Pharm 335:70-78; Tung y Weissleder (2003) Adv Drug Deliv Rev 55:281-294; Midoux et al. (1993) Nucleic Acids Res 21:871-878; Kamada et al. (2007) Biol Pharm Bull 2007,, 30:218-223). Los estudios que caracterizan la eficiencia de internalizacion de diferentes secuencias de CPP, todas ellas con un elevado contenido de residuos de arginina (Futaki (2006) Biopolymers 84:241-249), han demostrado que los homopolfmeros de arginina que contienen tan solo seis residuos
de arginina resultan altamente efectivos para transportar pequenas moleculas organicas (Kirschberg et al. (2003) Org Lett 5:3459-3462; Rothbard et al. (2000) Nat Med 6:1253-1257) y protemas de gran tamano hasta las celulas (Futaki et al. (2001) J Biol Chem 276:5836-5840).
En un esfuerzo por desarrollar SHAL que sean mas eficientemente internalizados y residualizados por sus celulas diana, sintetizamos un conjugado de hexa-arginina de (DvLPBaPPP)2LLDo, un SHAL que contiene los dos ligandos dabsilvalina (Dv) y acido N- benzoil-L-arginil-4-amino benzoico (Ba) que se habfa demostrado con anterioridad que se unen selectivamente a las lmeas de celulas que expresan HLA-DR10 (Balhorn et al. (2007) Clin Cancer Res 13:5621s-5628s). La hexa-arginina fue seleccionada como la primera secuencia de lanzadera sometida a ensayo para determinar su capacidad para facilitar el transporte de los SHAL a las celulas, porque se podna conjugar con un SHAL dimerico sin variar su masa molecular de forma significativa, preservando asf las propiedades deseables del SHAL como pequena molecula terapeutica. Los experimentos de resonancia de plasmones superficiales con los que se comparo la union del SHAL y del analogo del SHAL de hexa-arginina a la protema purificada del HLA- DR10 demostraron que la adicion del peptido de hexa-arginina al SHAL dimerico no interfena en la union del SHAL a la protema.
Los experimentos de microscopia confocal en 3D han revelado que tanto el SHAL principal como su analogo de hexa-arginina fueron absorbidos e internalizados por las celulas Raji expresando HLA-DR10. La absorcion de SHAL no se observo en las celulas Jurkat, una lmea de celulas que carece de HLA- DR10. Las secciones opticas tomadas de celulas Raji demostraron que la union del SHAL no se limitaba a la superficie celular, como es caractenstico en la union del anticuerpo Lym-1. Las secciones del plano medio tomadas de las celulas tratadas con los SHAL demostraron que la fluorescencia asociada al SHAL se puede distribuir por todo el interior de las celulas. En algunas imagenes, las areas de alta concentracion de SHAl en el citoplasma ocasionalmente aparedan asociadas con pequenas estructuras similares a organulos. La fluorescencia asociada al citoplasma era significativamente mayor en las celulas Raji tratadas con el analogo del SHAL de hexa-arginina, lo que sugiere que la adicion del peptido de hexa- arginina mejoro la absorcion celular del SHAL.
Los experimentos en los que se comparaba la union de (DvLPBaPPP)2LLDo etiquetado 111In y
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(DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo a celulas Raji vivas confirmaron que el marcador de hexa-arginina mejora la absorcion de SHAL. La presencia del marcador tambien aumento la cantidad de SHAL etiquetado 111In retenido por las celulas Raji. La cantidad de SHAL retenida tras el lavado no alcanzo la saturacion con respecto al rango de concentracion ensayado, lo que sugiere que se pueden acumular concentraciones incluso superiores de SHAL en el interior de las celulas expresando HLA-DR10 a las alcanzadas en estos experimented. A la concentracion maxima de SHAL de hexa-arginina ensayada en los estudios de union celular, la cantidad de SHAL residualizada era equivalente aproximadamente a 1,1 x 106 moleculas de SHAL por celula - el mismo numero de moleculas de HLA-DR10 cuya presencia sobre la superficie de celulas Raji se habfa documentado con anterioridad (Epstein etal. (1987) Cancer Res 47:830-840). Estos resultados, junto con las imagenes confocales que muestran que la mayona del SHAL de hexa-arginina se internaliza, indican que una fraccion significativa del SHAL se puede unir al grupo de HLA-DR10 que se sabe que esta presente en el interior de la celula.
La mejora observada en la residualizacion del SHAL de hexa-arginina etiquetado 111In por parte de las celulas Raji y la potencial asociacion de un fraccion de la etiqueta de 111In con el nucleo tambien son importantes porque la residualizacion y la internalizacion del radioisotopo han demostrado resultar altamente ventajosos para la terapia del cancer (Brouwers et al. (2003) Clin Cancer Res 9:3953S-3960S; Chen et al. (2006) J Nucl Med 2006, 47:827-836; Michel et al. (2002) Clin Cancer Res 8:2632-2639; Stein et al. (2995) Clin Cancer Res 11:2727-2734). Los terapeuticos para el cancer se han vinculado a diversos radioisotopos que emiten partteulas beta, partteulas alfa o electrones Auger. El rango de emisiones beta de los radioisotopos rutinariamente utilizados en la radioinmunoterapia, como el yodo-131, el itrio-90 y el renio-188, se amplfa en varios milfmetros, y los terapeuticos que portan estos radionuclidos generan un efecto de "fuego cruzado" (DeNardo (2005) Semin Oncol., 32:S27-35; Bischof 92003) Leuk Lymphoma 44 Suppl 4:S29-36) o “espectador” (Boyd et al. (2006) J Nucl Med 47:1007-1015) que destruye las celulas malignas a las que el agente de seleccion de diana no se une directamente. De este modo, los beta- emisores pueden potencialmente superar la resistencia debida a las celulas tumorales antfgeno negativas. Estas caractensticas hacen que la terapia de beta-partteulas resulte mas adecuada para tratar grandes tumores o enfermedades. Sin embargo, las beta-emisiones de rango mas largo tambien pueden destruir las celulas normales cercanas.
La internalizacion de agentes de seleccion de diana como el SHAL de hexa-arginina
(DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo se pueden explotar como medio para introducir el 111In que emite el electron Auger en el citoplasma y el nucleo de las celulas en las que los electrones Auger tienen una longitud de ruta subcelular muy limitada y una elevada transferencia de energfa lineal (Bodei et al. (2003) Cancer Biother Radiopharm 18:861-877; Kassis (2003) J Nucl Med 44:1479-1481; McDevitt et al. (1998) Eur J Nucl Med 25:1341-1351). Se ha estimado que la dosis de radiacion absorbida por el nucleo es dos veces y 35 veces mayor cuando 111In se descompone en el nucleo en comparacion con la absorbida cuando la descomposicion se produce en el citoplasma o en la superficie celular, respectivamente (Goddu et al. (1994) J Nucl Med 35:303-316; Hindorf et al. (2007) Cancer Biother Radiopharm 22:357- 366). Estas propiedades hacen que 111In y otros emisores de electrones Auger resulten altamente citotoxicos y nocivos para el ADN cuando se descompone en las proximidades del nucleo celular (Costantini et al. (2007) J Nucl Med 48:1357-1368). Con el acoplamiento de los emisores Auger a los agentes de seleccion de diana de residualizacion y altamente selectivos que se acumulan a concentraciones elevadas en el interior de las celulas tumorales, se puede desarrollar una clase muy potente de terapeuticos que son mas efectivos para tratar muchos tipos de cancer metastasico.
Conclusiones
La mejora de la internalizacion del SHAL de hexa-arginina por las celulas de linfoma expresando HLA- DR10 y la magnitud del aumento de la residualizacion del SHAL que se consigue al conjugar un peptido de hexa-arginina con el SHAL son importantes porque demuestran que se pueden disenar moleculas pequenas como los SHAL para llevar radionuclidos a las celulas malignas en condiciones que llevan a la residualizacion de concentraciones significativas de radionuclido dentro de la celula. Los SHAL que contienen radionuclidos que emiten electrones Auger pueden proporcionar un enfoque alternativo para aumentar el mdice terapeutico que se consigue con los SHAL por encima del alcanzado con la acumulacion de agentes de seleccion de diana marcados con radionuclido sobre la superficie de la celula tumoral. Estos resultados tambien son interesantes por la relevancia del enfoque basado en SHAL para tratar otras formas de cancer. Internalizando los SHAL de seleccion de diana bajoMUC1 glicosilado, tambien se podna desarrollar el receptor de androgeno y otras protemas de superficie celular espedficas tumorales que residualizan los radioisotopos que portan en forma de moleculas pequenas para una amplia variedad de otros tipos de cancer metastasico.
Abreviaturas utilizadas en este ejemplo.
Ac, acetato; Ba, acido N-benzoil-L-arginil-4-amino benzoico; Boc, butiloxicarbonilo terciario; BSA, albumina de suero bovino; CAE, electroforesis en acetato de celulosa; CPP, peptido de penetracion celular; DAPI, 4',6-diamidino-2-fenilindol; Dde, 1 -(4,4-dimetil- 2,6-dixoxciclohex-l-iliden)etilo; DIEA, N,N Diisopropil-etilamina; DMF, dimetilformamida; DMSO, dimetilsulfoxido; DOTA, acido 1,4,7,10- tetraazaciclododecano- 1,4,7,10-tetraacetico; Dv, dabsilvalina; EDTA, acido etilenodiaminatetraacetico;
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ESI- MS, espectrometna de masas de ionizacion por electrospray; Fmoc, fluorenilmetiloxi; HEPES, acido 4-(2- hidroxietil)-l-piperazinaetanosulfonico; HPLC, cromatograffa Kquida de alto rendimiento; MeCN, acetonitrilo; NHS, N-hidroxisuccinimida; Pbf, 2,2,4,6,7-Pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo; PBS, solucion tampon salina de fosfato; PF6, hexafluorofosfato; RP-HPLC, cromatograffa Kquida de alto rendimiento de fase inversa; SDS, dodecilsulfato de sodio; SHAL, ligando de alta afinidad selectivo; TFA, acido trifluoroacetico; TLC, cromatograffa de capa fina.
Ejemplo 6
Citotoxicidad selectiva celular y especifica molecular inducida por un nuevo compuesto sintetico que imita el anticuerpo HLA-DR para el linfoma y la leucemia.
Resumen.
Al igual que el rituximab, los anticuerpos monoclonales reactivos con el anffgeno de leucocito, humano ofrecen una potente actividad contra el linfoma. Sin embargo, su tamano limita su penetracion vascular y tisular. Para imitar la union del anticuerpo monoclonal, se han sintetizado nanomoleculas, que se ha demostrado que son espedficas para la subunidad B del HLA-DR10, y selectivas para las celulas expresando esta protema. Se residualizaron ligandos de alta afinidad selectivos (SHALs) que contienen el ligando de acido 3-(2- ([3-cloro-5- trifluorometil)-2-piridinil]oxi)-anilino)-3- oxopropanionico (Ct) y que teman una actividad antilinfoma frente a las celulas que lo expresan. En el presente documento, demostramos la extraordinaria potencia en ratones con xenoinjertos de linfoma humano de un SHAL tridentado que contiene este ligando. Tras la titracion de la actividad antilinfoma en un cultivo celular, se realizo un estudio preclmico aleatorizado de un SHAL tridentado que contiene el ligando Ct en ratones con xenoinjertos de linfoma humano establecidos y agresivos. Los ratones que teman xenoinjertos de linfoma T de Jurkat o linfoma B de Raji que expresaban HLA-DR10 fueron asignados aleatoriamente para recibir uno de los tratamientos con SHAL a una dosis de 100 ng i.p. semanal durante tres semanas consecutivas o al grupo sin tratamiento. Las variables de valoracion primarias fueron la curacion, las tasas de respuesta totales y la supervivencia. Tambien se evaluo la toxicidad en estos ratones y se realizo un estudio de seguridad general de la USFDA con ratones Balb/c sanos. En un cultivo de celulas Raji, las concentraciones maximas e IC50 para determinar la actividad citotoxica fueron de 0,7 y 2,5 nmol (medios de pm/ml), respectivamente. Cuando se comparo con los xenoinjertos de Jurkat tratados o los xenoinjertos no tratados, los xenoinjertos de Raji tratados con el SHAL demostraron una reduccion del 85% del riesgo de muerte (P=0,014; 95% de intervalo de confianza; 32-95% de reduccion). No se observaron evidencias de toxicidad ni siquiera despues de dosis i.p. 2000 veces superiores a la dosis de tratamiento asociada con la cura de la mayoffa de los ratones con xenoinjertos Raji. En comparacion con los grupos de control, el tratamiento mejoro selectivamente las tasas de respuesta y supervivencia en ratones con xenoinjertos de linfoma humano expresando HLA-DR10 a dosis no asociadas con eventos adversos y facilmente alcanzables en pacientes.
Introduccion
Las protemas de superficie celular, tales como CD20, CD22 y MHCII HLA-DR, han demostrado ser dianas atractivas para la terapeutica para el linfoma no Hodgkin (NHL). Una de estas protemas, el anffgeno del leucocito humano (HLA) se regula al alza sobre la superficie de los linfocitos B malignos en comparacion con los linfocitos B normales. Por otra parte, la protema del HLA-DR intracelular es incluso mas abundante. Las protemas del HLA-DR sirven de receptores de senalizacion transmembrana y citoplasmica y como lanzaderas de peptidos para el sistema inmunitario (Leveille et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:2282-2289; Klemmftf a/. (1998) Annu. Rev. Immunol, 16:569-592; Lane et al. (1990) /. Immunol, 144:3684-3692). El anticuerpo monoclonal (MAb), Lym-1, se une a un epftopo bien caracterizado de la subunidad p del HLA-DR y reacciona con el tejido del linfoma en aproximadamente un 90 y un 50% de los pacientes con linfoma de celulas B y leucemia, respectivamente (DeNardo et al (1998),J. Clin. Oncol, 16:3246-3256; Rose et al 91996) Cancer Immunol Immunother., 43:26-30; Rose et al. (1999) Mol Immunol, 36: 789-797). Aunque la union se limita a la superficie celular (Epstein et al. (1987) Cancer Res 47:830-840), Lym-1 es altamente activo frente a celulas B malignas en cultivo y en ratones (DeNardo et al (2005) Clin. Cancer Res., 11: 7075-7079; Tobin et al (2007) Leuk. Lymphoma 48:944-956, 2007; Zhang et al (2007) Cancer Biother. Radiopharm., 22:342-356).
Para imitar la union de MAb al HLA-DR 10, al tiempo que se reduce el tamano, se ha sintetizado una serie de ligandos de alta afinidad selectivos (SHAL) con un tamano inferior a <5 kDa para unir a la region epitopica Lym-1 de la subunidad B de la protema del HLA-DR basado en modelos in silico y estudios experimentales. Las versiones bidentadas de estas nanomoleculas novedosas mostraron multiples caracteffsticas deseadas in vitro y en ratones (Balhorn et al. (2007) Clin. Cancer Res., 13(Supl.18): S5621-S5628; DeNardo et al (2007) J. Nucl. Med., 48:1338-1347) pero no mostraron ninguna actividad antilinfoma (West et al (2006) Cancer Biother. Radiopharm., 21:645-654). Sorprendentemente, un SHAL tridentado conteniendo el ligando Ct (acido 3-(2-([3-cloro-5-trifluorometil)- piridinil]oxi)-anilino)- 3- oxopropanionico) se residualizo en el interior y fue citotoxico para las celulas de linfoma B en cultivo. Aqrn, titramos la actividad antilinfoma de la celula selectiva de este SHAL, demostramos su remarcable eficacia, selectividad y seguridad en ratones con xenoinjertos de linfoma humano y demostramos pruebas de
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microscopio electronico de la autofagia inducida por el SHAL.
Materiales y metodos Reactivos y lineas celulares
Se utilizo Lym-1 murino (Peregrine Pharmaceuticals, Tustin, CA) y quimerico (A. Epstein, Los Angeles, CA) que se une a la subunidad B del HLA-DR10 expresado en celulas B malignas (Epstein et al. (1987) Cancer Res 47: 830-840), y protema HLA-DR10 aislada de celulas B Burkitt de Raji utilizando una columna de afinidad de Lym-1, tal y como se ha descrito anteriormente (Balhom et al. (2007) Clin. Cancer Res., 13(Supl. 18): S5621-S5628) como referencias. Para estos experimentos se utilizo una lmea de celulas de linfoma B humano expresando HLA-DR10, Raji (American Type Culture Collection, Manassas, VA), cultivada en RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino, suplementado con piruvato de sodio, aminoacidos no esenciales y antibioticos (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA), a 37°C en atmosfera de CO2 humidificada al 5% y una lmea de celulas de linfoma T humano no expresante, Jurkat (American Type Culture Collection, Manassas, VA), cultivada conforme a las recomendaciones de la ATCC.
Diseno y quimica del farmaco
Utilizando modelos homologos, se mapearon los residuos de aminoacidos de HLA-DR cnticos para la union de Lym-1 en un modelo 3D de la subunidad p del HLA-DR10 (Balhom et al (2007) Clin. Cancer Res., 13(Suppl. 18):S5621-S5628). Las cavidades dentro de la superficie epitopica de Lym-1 de la protema se identificaron utilizando SpHGEN (Kuntz et al. (1982) J. Mol. Biol 161:269-288; Desjarlais et al. (1988) J. Med. Chem., 31:722-729). Tras el docking computacional del ligando para cada una de las cavidades, se utilizo una combinacion de espectroscopia NMR, resonancia de plasmones de superficie (BIAcore 3000; Biacore, Piscataway, NJ) y experimentos de union competitiva para confirmar la union del ligando a la protema HLA-DR10. Las series de ligandos se unieron a continuacion para crear un SHAL, tal y como se ha descrito anteriormente (Balhom et al. (2007) Clin. Cancer Res., 13(Supl. 18):S5621-S5628). Cada SHAL se sintetizo en una resina de clorotritilcloruro en una columna de polietileno (Pierce Biotechnology, Inc.) utilizando qmmica de fase solida Fmoc para conjugar unidades monomericas de PEG y ligandos seleccionados a traves de las aminas alfa y epsilon de la lisina S-terminal. Para sintetizar el SHAL tridentado, se unio un ligando de dabsilvalina (Dv) a la amina terminal de un separador PEG conjugado con la amina alfa del segundo residuo de lisina y se unio un acido 4-[4-(4- clorobenzil)piperazino]-3- nitrobenzenocarboxflico (Cb) a la amina terminal de un PEG conjugado con la amina alfa de la tercera lisina. Por ultimo, el ligando Ct tambien se unio a la amina epsilon de la tercera lisina (Figura 28). Se realizo la conversion a derivados SHAL DOTA (biotinilados), tal y como se ha descrito anteriormente. La reaccion se controlo por cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC) y los derivados DOTA (o biotinilados) se purificaron utilizando cromatograffa lfquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC). Se utilizo espectrometna de masas de ionizacion por electrospray (instrumento Agilent 1100, columna Waters Symmetry C18) para confirmar la composicion elemental y la masa del SHAL (peso molecular dentro del 0,07% del peso molecular teorico). Para examinar la union de SHAL a la protema del HLA-DR10 aislada o recombinante, se realizaron experimentos de resonancia de plasmones superficiales, como se ha descrito anteriormente (Id.). La union de SHAL fue mejor que la nanomolar y se bloqueo mediante la adicion de Lym-1.
Ensayo de citotoxicidad
Las celulas Raji cultivadas en fase de crecimiento log se centrifugaron, se volvieron a suspender en medio nuevo y se sometieron a recuento en 10% de colorante triptano azul para determinar la viabilidad inicial y posterior, tal y como se ha descrito anteriormente (West et al. (2006) Cancer Biother. Radiopharm., 21:645-654). Cuando no se trataron, las celulas continuaron multiplicandose y las celulas no viables, inicialmente menos del 5% de las celulas totales, se mantuvieron igual durante el transcurso de los ensayos. Para la titracion de la actividad citotoxica, el SHAL tridentado biotinilado a concentraciones de entre 0 y 7 nM (medio pm/ml) se incubo con 0,5x106 celulas/ml a 37°C en atmosfera de CO2, humidificada al 5% (NAPCO, Portland, OR). Despues de uno, dos y tres dfas, las celulas se volvieron a suspender en colorante triptano azul y se sometieron a recuento en un hemocitometro. Se determino la viabilidad fraccional y el numero absoluto de celulas viables y no viables (celulas/ml).
Eficacia y toxicidad en ratones
Las hembras de raton Balb/c nu/nu atfmicas de entre siete y nueve semanas de vida (Harlan Sprague Dawley, Inc., Frederick, MD) fueron mantenidas conforme a las directrices de cuidado animal de la Universidad de California en condiciones libres de patogenos y con una dieta ad libitum normal. Las celulas de Raji o Jurkat cultivadas en fase log y con una viabilidad superior al 95% fueron implantadas (6x106 celulas) subcutaneamente en el abdomen inferior 3-4 dfas despues de irradiar a los ratones (400 cGy) para suprimir el rechazo del xenoinjerto. Cuando los xenoinjertos alcanzaron los 20-500 mm3 medido por calibrador, los ratones se clasificaron en cuatro grupos en funcion del volumen de los xenoinjertos: ratones con xenoinjertos Raji tratados con SHAL, ratones con xenoinjertos Jurkat tratados con SHAL, ratones con xenoinjertos Raji no tratados y ratones con xenoinjertos Jurkat no tratados. A cada raton se le inyectaron 100 pl de PBS o 100 ng de SHAL tridentado quelado DOTA por via i.p. en los dfas 0, 7 y 14. El volumen del xenoinjerto y la supervivencia se controlaron durante >84 dfas. Los ratones tambien se
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pesaron 2-3 veces cada semana durante cuatro semanas y, a continuacion, semanalmente. Los recuentos sangumeos se midieron antes de cada dosis de SHAL o PBS y semanalmente durante cuatro semanas tras la dosis final utilizando un Z Series Coulter Counter (Beckman Coulter Inc., Hialeah, FL) y un microscopio de contraste de fase (Zeiss, Jena, Alemania).
Los volumenes de los xenoinjertos se calcularon mediante la formula para hemielipsoides (DeNardo et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3: 71-79). Las respuestas se caracterizaron como curacion, desaparicion completa del xenoinjerto sin reaparicion durante 84 dfas, remision completa (CR) el dfa formal censor (>210 dfas hasta el presente), desaparicion del xenoinjerto durante al menos siete dfas, aunque con reaparicion, y remision parcial (PR), reduccion del volumen del xenoinjerto al menos en un 75% que se mantuvo estable durante al menos siete dfas. Todas las curas a los 84 dfas en los ratones tratados con SHAL persistieron durante un tiempo de observacion de 210 dfas para los ratones. Si un xenoinjerto supero los 2000 mm3 el raton se sometio a eutanasia de acuerdo con las directrices de cuidado animal de la Universidad de California y se categorizo como muerte relacionada con la enfermedad.
Seguridad en ratones
A cada uno de los tres grupos de siete ratones Balb/c sanos se les administro PBS, 20 o 200 |jg de SHAL quelado DOTA por via i.p., es decir, 200 o 2000 veces la dosis de eficacia del SHAL.
Inmediatamente antes de la intervencion, los ratones fueron observados, pesados y sometidos a recuentos sangumeos (eritrocitos, leucocitos y plaquetas). A continuacion, los ratones fueron observados diariamente, se pesaron tres veces por semana y se sometieron a recuentos sangumeos semanalmente durante cuatro semanas tras la intervencion.
Microscopia electronica (EM)
Se cultivaron los xenoinjertos de Raji (53-132 mm3) para la EM de ratones sin tratar
(de control) y 2, 4 o 24 horas tras la administracion de 100 ng de SHAL biotinilado. Los xenoinjertos se fijaron, tal y como se describe (18) utilizando un 4% de paraformaldehndo en 0,1 M solucion tampon fosfato de Sorenson, pH 7.35. Tras el tratamiento con un 4% de uranil acetato en etanol 70% durante una hora y resina acnlica LR White durante toda la noche, se alcanzo la polimerizacion en un microondas (Pelco 34700 BioWave, Pella Inc., Redding, CA). Las secciones ultrafinas (Leica Ultracut UCT, Leica, Vienna, Austria) se capturaron sobre rejillas doradas, flotando en Strepavidin- 20 nm gold (BB International from Ted Pella Inc.), se enjuagaron y tineron con uranil acetato y citrato de plomo antes de la visualizacion con una lente Philips CM120 Biotwin Lens (FEI, Hillsboro, Or, fabricada en Eindhoven, Pafses Bajos y Gatan MegaScan, modelo 794/20, camara digital (2K X 2K), Pleasanton, CA. Gatan BioScan, modelo 792, Pleasanton, CA).
Metodos bioestadisticos
El analisis inicial comparo las tasas de respuesta mediante ensayos exactos y los tiempos de supervivencia mediante ensayos log-rank para los ratones Raji y Jurkat no tratados sin encontrar diferencias significativas, por lo que estos grupos se agruparon para el posterior analisis. Las tasas de respuesta para los Raji tratados, los Jurkat tratados y los ratones sin tratar se compararon mediante ensayos de x2 y exactos. Los tiempos de supervivencia se determinaron a los 84 dfas para los ratones que no habfan fallecido o que no se habfan sometido a eutanasia debido al crecimiento del tumor con anterioridad a esa fecha. Los tiempos se resumieron descriptivamente por curvas de Kaplan-Meier y se obtuvieron las medias de supervivencia y los lfmites de confianza del 95% mediante la estimacion del lfmite del producto.
Los dos grupos tratados se compararon con el grupo sin tratar utilizando un ensayo log-rank para determinar la homogeneidad entre grupos, seguido de un modelo de riesgos proporcionales para estimar el efecto del tratamiento en comparacion con la ausencia de tratamiento. Los analisis se realizaron con el software SAS/SAT® (SAS Institute, Inc. SAS/STAT Version 9.0. 2004. Cary, NC: SAS Institute). Todos los ensayos fueron bilaterales a nivel 0,05.
Resultados
Ensayo citotoxico.
Cuando no se trataron, las celulas Raji (muertas) no viables se mantuvieron por debajo del 5% de las celulas totales durante los tres dfas de observacion. Las celulas Raji tratadas con SHAL (en un rango de concentracion de 0-70 nM (medio pm/ML) mostraron mas celulas muertas, tanto en terminos fraccionales como absolutos, en el periodo de un dfa en comparacion con los controles sin tratar. El numero maximo de celulas no viables se observo el dfa 2 a concentraciones de SHAL de entre 2,3 y 7 nM, y las concentraciones citotoxicas IC50 SHAL y el umbral fueron de 0,5 y 2,5 nM (medio pm/ml), respectivamente (Figura 29).
Eficacia y toxicidad
La regresion en xenoinjertos Raji tratados tfpicamente comenzo aproximadamente a los siete dfas y
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alcanzo la remision completa aproximadamente a los 30 dfas del tratamiento inicial con el SHAL (Figura 30). A pesar de que se examinaron a los 84 dfas, todas las curas en xenoinjertos Raji tratados con SHAL han persistido hasta el presente, lo que supuestamente representa curas permanentes. Dado que no se observaron diferencias significativas en la respuesta y supervivencia de ratones Raji y Jurkat no tratados (P>0,08), estos se combinaron para la comparacion con los ratones tratados. Los ratones con xenoinjertos Raji y tratados con SHAL tuvieron una tasa de curacion del 69% y una tasa de respuesta total del 77%, unas cifras significativamente mejores que los ratones con xenoinjertos Jurkat tratados (0%) y que los ratones no tratados (respuesta del 15%) (P<0,001) (Tabla 10). Los tiempos de supervivencia medios fueron de 25 dfas en el caso de los ratones no tratados y de 21 dfas en el caso de los ratones con xenoinjertos Jurkat tratados. El tiempo de supervivencia medio de los ratones tratados con xenoinjertos Raji no fue estimable porque practicamente todos los ratones segrnan vivos a los 84 dfas (Figura 31). El modelo de riesgos proporcionales estimo que los ratones Raji teman una reduccion del -85% del riesgo de muerte en comparacion con los ratones Jurkat no tratados y tratados (P<0,001).
Tabla 10. Ratones atfmicos con xenoinjertos de linfoma, SHAL tratados o no tratados.
Tratamiento Grupo
Raton Respuesta (%) Cura (%) ORR (%)a
Raji
13 69 77
Jurkat
9 0 0
Sin tratar
13 15 15
aTasa de respuesta total.
Seguridad en ratones
Todos los ratones del estudio de seguridad general, incluyendo aquellos a los que se administro 2000 veces la dosis de SHAL utilizada en el ensayo de eficacia, ganaron peso, mostraron recuentos sangumeos estables y ningun efecto adverso durante cuatro semanas de observacion, superando por tanto las directrices para ensayos de "seguridad general" de la USFDA.
Microscopia electronica
La EM de xenoinjertos Raji de ratones no tratados mostraron celulas sanas con membranas celulares y nucleares bien definidas, y organulos citoplasmicos, incluyendo endotelio reticular, Golgi y liposomas (Figura 32). Por el contrario, la EM de Raji cultivada tras el tratamiento con SHAL se caracterizo por organulos fragmentados y cromatina nuclear altamente condensada, lo que representa unas conclusiones coherentes con la muerte celular por autofagia (programada).
Debate
Las protemas sobre ls superficie de las celulas malignas se han utilizado para identificarlas y para actuar como dianas para la terapia y la captura de imagenes. La histocompatibilidad principal clase II, antfgenos leucocitarios humanos (HLA) son abundantes tanto en la superficie como en el interior de los linfocitos B malignos (Epstein et al. (1987) Cancer Res 47: 830-840). Estas protemas son importantes receptores de senalizacion de la muerte celular (Leveille et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32: 2282-2289;
Lane et al. (1990) J. Immunol, 144: 3684-3692). A pesar de que los MAbs intactos reconocen las celulas malignas selectivamente, el tamano limita su eliminacion de la sangre y la penetracion en los tejidos. En base a las predicciones de los modelos in silico y ensayos empmcos, se han seleccionado pequenos ligandos organicos para unir a puntos de la region epitopica del MAb Lym-1 del HLA-DR10. Al unir covalentemente series de estos ligandos, se han generado SHAL para dirigir a leucemias y linfomas derivados de celulas B (Hok et al. (2007) Bioconjug. Chem., 18:912-921).
Estas novedosas nanomoleculas imitan la afinidad y selectividad de los MAbs debido a las interacciones tridimensionales que tienen lugar entre multiples ligandos en el SHAL y multiples puntos dentro del epftopo de la protema diana. Los SHAL son absorbidos rapidamente por los xenoinjertos expresando HLA-DR y se eliminan rapidamente de los tejidos normales (DeNardo et al (2007) J. Nucl Med., 48:13381347) porque el SHAL es -50 veces mas pequeno que una molecula de inmunoglobulina G. Los analisis histoqmmicos han demostrado que los SHAL se unen a los tejidos NHL de pacientes y ratones (Balhorn et al. (2007) Clin. Cancer Res., 13(Supl.18): 85621- S5628). Los estudios previos han demostrado que los SHAL entran rapidamente en las celulas, pero no abandonan las celulas expresando HLA-DR10 y HLA- DR relacionados, comportandose como una langosta y su trampa.
Estos SHAL cruzan las barreras celulares eficientemente, aparentemente no afectados en las celulas expresando HLA-DR10 por los mecanismos de bombeo celulares. Los SHAL conteniendo un ligando Ct (acido 3-(2-([3- cloro-5- trifluorometil)-2-piridinil]oxi)-anilino)-3-oxopropanionico) se residualizan en el interior y presentan una potente actividad antilinfoma contra las celulas de linfoma humano expresando
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HLA-DR10 (DeNardo et al. (2007)./. Nucl. Med., 48:1338-1347). Los presentes experimented demuestran que el ligando Ct que contiene el SHAL tridentado con un IC50 de 2,5 nM (medio pm/ml) para las celulas expresando HLA-DR10 en cultivo tambien presenta una remarcable eficacia en ratones con xenoinjertos Raji. Las curaciones permanentes se consiguieron en el 69% de estos ratones con una dosis de tratamiento de SHAL 2000 veces inferior a la dosis maxima ensayada y cuya seguridad se confirmo en ratones sanos. El efecto antilinfoma unicamente se observo en ratones con xenoinjertos expresando HLA- DR10; los xenoinjertos Jurkat no se vieron afectados por el tratamiento con el SHAL. Dado que los ratones tratados con una dosis de SHAL 2000 veces superior no mostraron signos de eventos adversos, parece que el SHAL dispone de un excepcional margen de seguridad como terapeutico potencial. En el futuro sera importante realizar un estudio de respuesta a las dosis con el SHAL tridentado en ratones, a fin de averiguar si la tasa de curacion se puede aumentar o no con una dosis de SHAL mayor.
Las micrograffas de electrones del tejido del xenoinjerto de los ratones tratados con el SHAL confirmaron la citotoxicidad del SHAL para las celulas de linfoma Raji. La extensa vacuolizacion y la perdida de estructura celular sugieren la posibilidad de que la union del SHAL al HLA-DR haya inducido una senal celular que en ultima instancia ha provocado la apoptosis y la muerte celular autofaga. Sera necesario realizar un estudio mas extenso para confirmar esta hipotesis e identificar el mecanismo de accion del SHAL. Los resultados proporcionan pruebas convincentes de que los SHAL ofrecen un extraordinario potencial como nanomoleculas novedosas para focalizar al linfoma y la leucemia para la terapia molecular. Los SHAL representan una alternativa atractiva a sus homologos biologicos, porque estos qrnmicos son unas 50 veces mas pequenos, menos caros, mas faciles de producir con uniformidad y estables, y se preve que tengan una vida util media prolongada y que resulten efectivos cuando se administran oralmente. Por otra parte, los terapeuticos basados en SHAL pueden transportar y residualizar otros agentes cerca de puntos cnticos en el interior de estas celulas malignas. La plataforma de produccion de SHAL es eficiente y flexible y permite la smtesis rapida y modificaciones.

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
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    1. Un ligando de alta afinidad selectivo (SHAL) que se une espedficamente a una celula cancerigena, donde dicho SHAL comprende:
    un primer ligando, un segundo ligando y un tercer ligando unidos entre si por un enlazador, donde el enlazador comprende polietilenglicol o comprende polietilenglicol y una lisina;
    el primer ligando comprende acido 3-(2-{ [3- cloro-5-(trifluorometil)-2- piridinil]oxi}anilino)-3-oxopropanoico (Ct); y
    el segundo ligando comprende acido 4-[4-(4-clorobencil)piperazino]-3- nitrobencenocarboxflico (Cb); y el tercer ligando comprende 4-(Dimetilamino)azobenceno-4’-sulfonil-L-valina
    (Dv).
  2. 2. El SHAL de la reivindicacion 1 donde dicho primer ligando y dicho segundo ligando se unen a puntos en un epftopo reconocido por el anticuerpo Lym-1.
  3. 3. El SHAL de la reivindicacion 1 donde dicho SHAL comprende la estructura siguiente:
    imagen1
    donde R1 es seleccionado del grupo compuesto por COOH, un enlazador, un efector, y un enlazador unido a un efector.
  4. 4.El SHAL de la reivindicacion 1 donde dicho SHAL comprende la estructura siguiente:
    imagen2
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    donde R2 comprende un efector.
  5. 5. El SHAL segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde dicho SHAL esta unido a un peptido de transduccion.
  6. 6. El SHAL de la reivindicacion 5, donde dicho peptido de transduccion se selecciona del grupo compuesto por hexa-arginina, senal de localizacion nuclear de SV40, el dominio de transduccion de protema de la protema Tat del VIH, el peptido de union a integrina (peptido RGD), el dominio de union a heparina de vitronectina (peptido VN), la protema antennapedia de Drosophila , VP22, oligoarginina, poli-L-lisina lactosilada u otro oligocation, S-G-E-H-T-N-G-P-S-K-T-S-V-R-W-V-W-D, S-M-T-T-M-E-F-G-H-S-M-I-T-P- Y-K-I-D, Q-D-G-G-T-W-H-L-V-A-Y-C-A-K-S-H-R-Y,M-S-D-P-N-M-N-P-G-T-L-G-S-S-H-I-L-W,S-P-G-N-Q-S- T-G-V-I-G-T-P-S-F-S-N-H, S-S-G-A-N-Y-F-F-N-A-I-Y-D-F-L-S-N-F, y G-T-S-R-A-N-S-Y-D-N-L-L-S-E-T-L- T-Q.
  7. 7.El SHAL segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde dicho SHAL se une a un efector, donde dicho efector se selecciona del grupo compuesto por un marcador de epftopo, un anticuerpo, un segundo SHAL, una etiqueta, una citotoxina, un liposoma, un radionuclido, un farmaco, un profarmaco, un inhibidor de enxima, una partmula viral, una citoquina, un quelato, particularmente donde el efector es (i) una citotoxina seleccionada del grupo compuesto por una toxina de difteria, una exotoxina de Pseudomonas, una ricina, una abrina y una timidina quinasa, (ii) un quelato que comprende un isotopo metalico seleccionado del grupo compuesto por 99Tc, 20 Pb, 67Ga, 68Ga, 72As, 11In, 113mIn, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 52Fe, 52mMn, 51Cr, 186Re, 188Re, 77As, 90Y, 67Cu, 169Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au,199Au, 161Tb, 1o9Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 159Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, y 111Ag, (iii) un quelato que comprende un emisor alfa, (v) un quelato que comprende DOTA, (vi) un ftpido o un liposoma, o (vii) seleccionado del grupo compuesto por acido 3-(2-([3-cloro-5-(trifluorometil)-2-piridinil]oxi)-anilino)-3- oxopropanoico (Ct), 4[[5-(Trifluorometil)piridin-2-il]oxi]fenil]N-fenilcarbamato, acido (R)-2-[4-(5-cloro-3- fluoro-2- piridiloxi)fenoxi]propionico, 2-(((3-cloro-5(trifluorometil)piridin-2- iloxi)fenoxi)metil)acrilatos, 2-(((3- cloro- 5(trifluorometil)piridin-2- iloxi)fenil)metil)acrilatos, 2-(((3-cloro- 5(trifluorometil)piridin-2- iloxi)fenil)metil)acrilonitrilos, acido 3-(3-cloro-4- {[5- (trifluorometil)-2- piridinil]oxi}anilino)-3-oxopropanoico, Sethoxydim, Clethodim, acido 5- (Tetradeciloxi)-2-furoico, acido 2-[(2,6-
    diclorofenil)amino]bencenoacetico, acido 2-[4-(4- clorofenoxi)fenoxi]propanoico, acido (RS)-2- {4-[3-cloro- 5-(trifluorometil)-2- piridinil]oxi]fenoxi}propanoico, acido (RS)-2-[4-(6-cloro-l,3-benzoxazol-2- iloxi)fenoxi] propanoico, acido (RS)-2-[4-(2,4-diclorofenoxi)fenoxi]propanoico, acido (RS)-2-{4-[5- (trifluorometil)-2- piridiloxi]fenoxi}propanoico, acido (RS)-2-[4-(6- cloroquinoxalin-2- iloxi)fenoxi]propanoico, y acido (RS)-2- [4-(a, a, a-trifluoro-p- toliloxi)fenoxi]propanoico.
  8. 8.Un ligando de alta afinidad selectivo (SHAL) polidentado segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en un metodo de inhibicion del crecimiento o la proliferacion de una celula cancengena que expresa un marcador del HLA-DR10, donde dicho metodo comprende: poner en contacto dicha celula cancengena con el ligando de alta afinidad selectivo (SHAL) polidentado.
  9. 9.Un metodo in vitro para detectar una celula cancengena, donde dicho metodo comprende:
    el contacto de una celula cancengena con una molecula quimerica que comprende un SHAL segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 unido a un marcador de epftopo;
    el contacto de dicha molecula quimerica con un quelato que comprende una fraccion detectable por la que dicho quelato se une a dicho marcador de epftopo, asociando asf dicha fraccion detectable con dicho quelato; y
    detectar dicha fraccion detectable.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, donde dicha fraccion detectable comprende (i) un radionuclido, (ii) una fraccion detectable seleccionada del grupo compuesto por un emisor gamma, un emisor de positrones, un emisor alfa, un emisor de rayos X y un emisor de fluorescencia; o (iii) un isotopo metalico seleccionado del grupo compuesto por 99Tc, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 72As, 111In, 113mIn, 7Ru, 62Cu, 641Cu 52Fe, 52mMn, 51Cr, 186Re, 188Re, 77As, 90Y, 67Cu, 169Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au,199Au, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 159Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, y 111Ag.
  11. 11. Una molecula quimerica que comprende un SHAL segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4 unido a un marcador de epftopo para el uso en un metodo de deteccion de una celula cancengena, donde dicho metodo comprende: el contacto de una celula cancengena con una molecula quimerica que comprende un SHAL segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 unido a un marcador de epftopo; el contacto de dicha molecula quimerica con un quelato que comprende una fraccion detectable por la que dicho quelato se une a dicho marcador de epftopo, asociando asf dicha fraccion detectable con dicho quelato; y detectar dicha fraccion detectable.
  12. 12. La molecula para el uso de la reivindicacion 11, donde dicha fraccion detectable comprende (i) un radionuclido, (ii) una fraccion detectable seleccionada del grupo compuesto por un emisor gamma, un emisor de positrones, un emisor alfa, un emisor de rayos X y un emisor de fluorescencia; o (iii) un isotopo metalico seleccionado del grupo compuesto por 99Tc, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 72As, 111In, 113mIn, 97Ru, 62Cu,
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