ES2611996T3 - Caracterización termo-óptica rápida de partículas - Google Patents

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ES2611996T3 ES07819870.2T ES07819870T ES2611996T3 ES 2611996 T3 ES2611996 T3 ES 2611996T3 ES 07819870 T ES07819870 T ES 07819870T ES 2611996 T3 ES2611996 T3 ES 2611996T3
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Stefan Duhr
Philipp Baaske
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Abstract

Procedimiento para la medición de las interacciones inter y/o intramoleculares de partículas en una solución con las etapas de: - proporcionar una sonda de muestra con partículas marcadas en una solución; - excitar con fluorescencia dichas partículas marcadas y detectar, en primer lugar, la fluorescencia de dichas partículas excitadas; - irradiar un haz de luz láser en la solución para obtener una distribución de temperatura espacial en la solución alrededor del haz de luz láser irradiado; - detectar, en segundo lugar, una fluorescencia de las partículas en la solución en un tiempo predeterminado después del inicio de la irradiación del láser en la solución, y - caracterizar las interacciones inter y/o intramoleculares de las partículas en base a dichas dos detecciones, en el que la irradiación del láser (30) y la detección de la fluorescencia se realiza desde el mismo lado con respecto a la sonda de muestra.

Description

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contexto de esta invención se refiere a una etapa de detección de dicha emisión después de la excitación. El experto en la técnica conoce en el contexto de esta invención que la longitud de onda de "excitación" y la longitud de onda de "emisión" tienen que estar separadas.
De acuerdo con una primera realización ilustrativa de la presente invención, el tiempo predeterminado (después del cual se detecta y/o se mide en segundo lugar una fluorescencia de las partículas/moléculas en la solución) es suficientemente pequeño para que los cambios de concentración inducidos por la termoforesis y el artefacto relacionado con o debido a la convección son insignificantes. En otras palabras, el tiempo predeterminado es suficientemente corto para separar la escala del tiempo de reacción inter e intramolecular de efectos de temperatura más lenta, por ejemplo, termoforesis, convección térmica. Por lo tanto, el tiempo predeterminado está preferiblemente dentro del intervalo de 1 ms a 250 ms, más preferiblemente entre 80 ms y 180 ms, en particular 150 ms. En particular, en los casos en los que la solución se proporciona en una cámara con buena conductividad térmica, por ejemplo, zafiro, diamante y/o silicio, un tiempo predeterminado más corto ya es suficiente, por ejemplo, 1 ms, 5 ms, 10 ms o 15 ms. Para la medición, es ventajoso que la cámara y la solución estén en un equilibrio térmico. En otras palabras, para cámaras con una buena conductividad térmica, la solución y la cámara son más rápidas en un equilibrio térmico de tal manera que son suficientes tiempos cortos predeterminados. En el caso de que la conductividad térmica sea deficiente, tarda más tiempo hasta que la cámara y la solución están en equilibrio térmico, es decir, el tiempo predeterminado es más largo, por ejemplo, 100 ms a 250 ms.
En realizaciones particulares de la invención, el tiempo de detección o de exposición está en el intervalo de 1 ms a 50 ms. El tiempo en el que se registra la señal de detección debe ser suficientemente corto para que el cambio de posición de una molécula individual sea insignificante para la detección durante la etapa de detección. Por ejemplo, en caso de que la detección se realice con una cámara CCD con una resolución de 320 x 200 píxeles, es ventajoso que durante el tiempo de detección una molécula/partícula individual sea detectada por sólo un píxel, ya que cada píxel representa una cierta temperatura. Si la posición de una partícula cambia demasiado, es decir, más de un píxel, la partícula puede estar expuesta a una temperatura diferente, lo que disminuye la precisión de medición. El uso de un dispositivo de cámara CCD para la detección también comprende el uso de una cámara con sólo una única línea de píxel (por ejemplo, cámara de línea) para la detección unidimensional.
En una realización particular de la invención, el haz láser se desenfoca de tal forma que un gradiente de temperatura dentro de la distribución de la temperatura está en el intervalo de 0,0 a 2K/µm, preferiblemente de 0,0 a 5 K/µm. Por lo tanto, los pequeños gradientes de temperatura aseguran que el movimiento de partículas termóforo es insignificante durante el tiempo desde el inicio de la irradiación láser hasta el final de la detección.
Al menos todas las temperaturas necesarias para detectar la desnaturalización térmica de una molécula tienen que estar dentro del campo de visión del dispositivo de cámara.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, el haz de láser se irradia a través de uno o una pluralidad de elementos ópticos en la solución. El enfoque del haz láser se realiza en algunas realizaciones realizadas de tal manera que los gradientes de temperatura se encuentran dentro de los intervalos definidos anteriormente. El enfoque del láser puede conseguirse, por ejemplo, por una única lente, una pluralidad de lentes o una combinación de una fibra óptica y una lente o una pluralidad de lentes o un objetivo donde la divergencia del haz láser incidente se ajusta adecuadamente. Además, pueden disponerse otros elementos ópticos para controlar el foco y/o la dirección del haz láser entre la solución y el láser.
De acuerdo con otra realización más de la presente invención, la distribución de temperatura alrededor del haz láser se mide mediante una medición adicional, por ejemplo, la distribución de la temperatura se mide en las mismas condiciones en base a la fluorescencia dependiente de la temperatura conocida del colorante, como se ilustra en las figuras adjuntas, en particular la Fig. 3a, 3b y 15). En particular, se puede determinar una distribución de temperatura en base a la fluorescencia detectada del colorante sensible a la temperatura, en la que dicho colorante sensible a la temperatura se calienta (a través de la solución) mediante el haz láser irradiado y la intensidad de fluorescencia espacial de fluorescencia se mide sustancialmente perpendicular alrededor del haz láser.
De acuerdo con un ejemplo, el tiempo predeterminado (después de lo cual (por ejemplo, una fluorescencia de) las partículas/moléculas en la solución se detectan y/o se miden en segundo lugar) es suficientemente largo para que los cambios de concentración basados en el movimiento termóforo puedan detectarse. Por lo tanto, el tiempo predeterminado está preferiblemente dentro del intervalo de 0,5 a 250 s. En dicho tiempo predeterminado, la concentración cambia dentro de la distribución de temperatura espacial en la solución debido a efectos termóforos, y tal cambio de concentración puede detectarse mediante un cambio en la distribución de fluorescencia.
En realizaciones particulares de la invención, el haz láser se enfoca de tal manera que se consigue un gradiente de temperatura dentro de la distribución de temperatura en el intervalo de 0,001 a 10 K/μm. La temperatura dentro del campo de visión (particularmente en el borde del campo de visión) no alcanza necesariamente el valor de la temperatura ambiente. Es ventajoso un aumento de temperatura a una distancia hasta el centro de calor (es decir, en el borde del campo de visión) del 10 % o menos (en ºC) en comparación con la temperatura máxima (en ºC).
De acuerdo con una realización adicional, la fluorescencia antes y después de la irradiación del láser se detecta con
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una cámara CCD. El uso de una cámara CCD proporciona la ventaja de que el cambio de la concentración puede detectarse en una pluralidad de posiciones de forma simultánea. En realizaciones particulares, la cámara CCD es una cámara CCD 2D (bidimensional), es decir, la matriz CCD comprende una pluralidad de píxeles de sensor (sensores fotoeléctricos de luz) en una primera y una segunda dirección, en la que las direcciones primera y segunda son preferiblemente perpendiculares entre sí. De acuerdo con una realización adicional, la cámara CCD es una cámara de línea o de exploración de línea, es decir, la matriz CCD comprende una pluralidad de píxeles de sensor en una primera dirección (una línea de píxeles de sensor) pero simplemente un píxel en una segunda dirección. Dicha cámara se denomina también como cámara CCD 1D (unidimensional). En otras palabras, una matriz unidimensional, usada en cámaras de barrido en línea, captura una única porción o línea de una imagen, mientras que una matriz bidimensional captura una imagen 2D entera. La matriz CCD de la cámara de línea también puede comprender tres líneas de sensores, cada una para un canal de color (rojo, verde y azul). Sin embargo, de acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, también es posible medir las características de las partículas basándose en un cambio de fluorescencia detectado de un único píxel del CCD. Por lo tanto, también es posible utilizar un fotodiodo o un fotomultiplicador en lugar de un solo píxel del CCD. En algunas realizaciones, el brillo de la fluorescencia antes y después de la irradiación del láser se mide con un fotodiodo o un único píxel con el CCD en el centro del haz láser.
Mediante la formación de imágenes en un dispositivo de cámara CCD, una cámara de línea o un fotodiodo PMT/Avalancha, la fluorescencia puede promediarse a lo largo de la altura de la lámina líquida usada. Por consiguiente, la solución tridimensional puede reducirse a dos dimensiones. Por lo tanto, el procedimiento descrito en las realizaciones es también aplicable a láminas lipídicas bidimensionales, típicamente usadas como sistemas modelo para procesos de membrana (por ejemplo, membrana lipídica bicapa unida a superficie soportada (tBLM, como se ilustra en las figuras adjuntas, particularmente la figura 38), o monocapas clásicas de Langmuir). Los compuestos marcados con fluorescencia que flotan en esta membrana (por ejemplo, lípidos, proteínas y similares) se mueven en gradientes de temperatura y se reordenan de acuerdo con su energía de solvatación. La redistribución de fluorescencia en estas capas o membranas lipídicas se puede emplear en el contexto de la invención, como la redistribución de los compuestos en solución para detectar propiedades o características bioquímicas o biofísicas, como cambios conformacionales, interacciones, radio hidrodinámico y similares. En el sistema de membrana, la distribución de la temperatura local se establece por la solución acuosa circundante, por ejemplo, la solución acuosa por encima de una superficie soportada por membrana. Por la conducción de calor, la capa lipídica por encima de una solución acuosa también adopta la temperatura correspondiente.
De acuerdo con el primer modo de realización ilustrativo de la invención, las partículas pueden ser biomoléculas y/o (nano o micro) partículas y/o perlas, en particular microperlas, y combinaciones de estos. Con el uso de nanopartículas modificadas/micropartículas/proteínas de microperlas, el ADN y/o ARN pueden ser detectados mediante uniones específicas de proteínas, ADN y/o ARN a las nanopartículas/microperlas, ya que la unión específica cambia el movimiento termóforo de las nanopartículas/microperlas. La velocidad de las partículas mayores de 100 nm puede detectarse por un único seguimiento de partículas.
La luz láser puede estar dentro del intervalo de 1200 nm a 2000 nm. Esta gama es ventajosa para soluciones acuosas. El grupo hidroxilo de agua se absorbe fuertemente en dicho intervalo de longitudes de onda. Además, otros disolventes con un grupo hidroxilo como el glicerol, pueden calentarse por calentamiento con láser infrarrojo). El láser es, en algunos modos de realización, un láser de alta potencia dentro del intervalo de 0,1 W a 10 W, preferiblemente de 1 W a 10 W, más preferiblemente de 4 W a 6 W. En algunos modos de realización, las concentraciones de partículas de una solución acuosa están dentro del intervalo de 1 atto Molar (por ejemplo, microperlas de partícula individual) a 1 Molar, preferiblemente de 1 atto Molar a 100 μMolar.
De acuerdo con una realización adicional, la solución puede ser una solución salina con concentraciones en el intervalo de 0 a 1 M.
De acuerdo con aún otra realización adicional de la invención, la distribución de la temperatura espacial generada por los haces láser está en un intervalo de 0,1 ºC a 100 ºC. La sensibilidad a la temperatura del material de interés establece los límites de la temperatura máxima utilizada en experimentos. En particular, se generan rangos de temperatura de 0,1 ºC hasta al menos 40 ºC, preferiblemente hasta al menos 60 ºC, más preferiblemente hasta al menos 80 ºC, e incluso más preferiblemente hasta al menos 100 ºC mediante el haz LÁSER para medir la estabilidad del ADN, por ejemplo. El experto en la técnica es consciente de que las temperaturas correspondientes se pueden lograr, por ejemplo, enfriando el sistema experimental, así como mediante el uso de LÁSER con la potencia correspondiente. El experto en la técnica también es consciente de que mediante enfriamiento de la muestra global es posible una mayor amplitud de aumento de temperatura (es decir, mediante calentamiento por láser) sin causar daño a los materiales sensibles a la temperatura. Los intervalos de temperatura ilustrativos, pero no limitativos, y las temperaturas máximas para diferentes materiales y caracterizaciones termo-ópticas, se dan en la tabla 1. Por consiguiente, también pueden alcanzarse temperaturas más altas en el centro del gradiente de calor (punto de potencia del láser máxima en y sobre la analizar/caracterizar) como se ilustra, entre otros, en la figura 3 adjunta. Dichas altas temperaturas pueden alcanzarse en cámaras de alta presión. Además, en algunos modos de realización, se crea un gradiente de temperatura dentro del intervalo de 0,1 nm a 500 μm de diámetro en torno al haz LÁSER.
Tabla 1: Intervalos de temperatura ilustrativos para el análisis termo-óptico Tabla 1: (continuación)
Caract.termo-óptica*Material de lasmuestras
Análisis deestabilidad Interacción,eventos cinéticos Longitud del radiohidrodinámico conformación,estructura, modificaciónquímica Trampa termo-óptica
Ácidos nucleicos(ADN, ARN, etc.)
p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 20 ºC -95 ºC ms. p. 30 ºC-80 ºC ms. p. 30 ºC-85 ºC p. 0 ºC-80 ºC mr.p. 20 ºC-80 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-80 ºC mr.p. 20 ºC-80 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-100 ºCmr.p. 10 ºC-90 ºC ms.p. 20 ºC-90 ºC p. 0 ºC-80 ºC mr.p. 20 ºC -60 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC
proteínas
p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 20 ºC -95 ºC ms. p. 30 ºC-85 ºC p.0 ºC-40 ºC mr.p. 0 ºC-30 ºC mr.p. 10 ºC-20 ºC mr. p. 15 ºC-20 ºC ms. p. 20 ºC-25 ºC p. 0 ºC-60 ºC mr.p. 0 ºC-40 ºC mr.p. 10 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-80 ºCmr.p. 20 ºC-60 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 0 ºC-60 ºC p. 0 ºC-40 ºC mr.p. 10 ºC-30 ºC mr.p. 15 ºC-30 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC
vesículas, liposomas
p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 20 ºC -95 ºC ms. p. 30 ºC-85 ºC p. 0 ºC-40 ºC mr.p. 10 ºC-50 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 30 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-25 ºC p. 0 ºC-60 ºC mr.p. 0 ºC-40 ºC mr.p. 10 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-80 ºCmr.p. 20 ºC-60 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºCms.p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-40 ºC mr.p. 10 ºC-30 ºC mr.p. 15 ºC-30 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC
(Micro) partículas(por ejemplo, sílice,poliestireno, etc.)
p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 20 ºC -95 ºC ms. p. 30 ºC-85 ºC p. 0 ºC-60 ºC mr.p. 10 ºC-50 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-80 ºC mr.p. 0 ºC-60 ºC mr.p. 10 ºC-50 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-100 ºCmr.p. 10 ºC-60 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºCms.p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-80 ºCmr.p. 20 ºC-60 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºCms.p. 20 ºC-30 ºC
PEG
p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 20 ºC-95 ºC ms. p. 30 ºC-85 ºC p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 10 ºC-50 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-80 ºC mr.p. 0 ºC-60 ºC mr.p. 10 ºC-50 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-100 ºCmr.p. 10 ºC-60 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºCms.p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-80 ºCmr.p. 20 ºC-60 ºCmr.p. 20 ºC-40 ºCms.p. 20 ºC-30 ºC
Polímeros deazúcar (porejemplo, alginato,ácidoshialurónicos)
p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 20 ºC -95 ºC ms. p. 30 ºC-85 ºC p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 10 ºC-50 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-60 ºC mr.p. 0 ºC-50 ºCmr.p. 10 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-40 ºC p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 10 ºC-60 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-80 ºC mr.p. 20 ºC-60 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC
capas lipídicasbidimensionales(por ejemplo, quecontienenproteínas)
p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 20 ºC -95 ºC ms. p. 30 ºC-85 ºC p.0 ºC-40 ºC mr.p. 10 ºC -40 ºC mr.p. 20 ºC -40 ºC mr. p. 30 ºC -40 ºC ms. p. 20 ºC-25 ºC p. 0 ºC-60 ºC mr.p. 0 ºC-40 ºC mr.p. 10 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-80 ºC mr.p. 20 ºC-60 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 0 ºC-60 ºC p. 0 ºC-40 ºC mr.p. 10 ºC-30 ºC mr.p. 15 ºC-30 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC
(Nano) partículas
p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 20 ºC -95 ºC ms. p. 30 ºC-85 ºC p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 10 ºC -50 ºC mr.p. 20 ºC -40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-80 ºC mr.p. 0 ºC-60 ºC mr.p. 10 ºC-50 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 10 ºC-60 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-80 ºC mr.p. 20 ºC-60 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC
Compuestos decarbonoinorgánico (porejemplo,nanotubos de
p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 20 ºC -95 ºC ms. p. 30 ºC-85 ºC p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 10 ºC -50 ºC mr.p. 20 ºC -40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-80 ºC mr.p. 0 ºC-60 ºC mr.p. 10 ºC-50 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-100 ºC mr.p. 10 ºC-60 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC p. 0 ºC-80 ºC mr.p. 20 ºC-60 ºC mr.p. 20 ºC-40 ºC ms. p. 20 ºC-30 ºC
La temperatura indicada aquí proporciona los intervalos de temperatura preferidos de la muestra a la que pueden medirse las*propiedadestermo-ópticas. El aumento de la temperatura inducido por el calentamiento por láser puede comprender sólo una pequeña porción de latemperatura total, por ejemplo, una caracterización termo -óptica de nanopartículas puede realizarse a 75 ºC de temperatura de muestraglobal con un aumento de la temperatura por calentamiento de láser de 5 ºC; una caracteriza ción de proteínas puede realizarse en unamuestra enfriada a 10 ºC y se calienta con un láser infrarrojo hasta una temperatura máxima de 30 ºC.p.: preferiblemente, mr. p.: más preferiblemente, ms.p.: mucho más preferiblemente
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En el contexto de la invención, el término LÁSER es equivalente al término "láser" y viceversa.
Un ejemplo se refiere a un dispositivo para medir las características termo-ópticas de las partículas en una solución. Tal dispositivo de este tipo comprende un medio de recepción para recibir partículas/moléculas, particularmente partículas o moléculas marcadas o etiquetadas, dentro de la solución, medios para excitar las partículas/moléculas, particularmente las partículas/moléculas marcadas o etiquetadas, medios para detectar la excitación de las partículas/moléculas, en particular las partículas/moléculas marcadas o etiquetadas, y medios para obtener una distribución de temperatura espacial en la solución. Tal dispositivo conocido como dispositivo de acuerdo con la presente invención para la medición de interacciones inter y/o intramoleculares de partículas en una solución como se define en la reivindicación adjunta 26, comprende un medio de recepción para recibir las partículas marcadas dentro de una solución, medios para excitar con fluorescencia las partículas marcadas, medios para detectar la fluorescencia excitada en dicha solución, y un láser para irradiar un haz de luz láser en la solución para obtener una distribución de temperatura espacial en la solución alrededor del haz de luz láser irradiada, en el que el láser y los medios para detectar la fluorescencia excitada se disponen en el mismo lado con respecto a los medios de recepción.
Particularmente, la luz láser puede enfocarse localmente en la solución y la distribución de temperatura espacial puede obtenerse mediante la conducción de la energía absorbida como calor en la solución. Mediante el ajuste del ancho de enfoque de la radiación IR electromagnética, se pueden ajustar las dimensiones espaciales de la distribución de temperatura, es decir, se consigue una distribución de temperatura amplia o estrecha. Se pueden conseguir ajustes adicionales con respecto a la geometría de la distribución de la temperatura escogiendo un material para la cámara de microfluidos/capilar que presenta cierta conductividad térmica (por ejemplo, alta conductividad térmica, estrecha distribución de la temperatura y viceversa). De acuerdo con c/c0 = exp[-(DT/D)(T-T0)], la amplitud de estado estacionario de la señal termo-óptica está relacionada exponencialmente con el aumento de temperatura. Utilizando la relación que se ha mostrado anteriormente, una distribución de la temperatura espacial se puede ajustar exactamente a la distribución de la concentración espacial ajustando los coeficientes DT y D. El tiempo que tarda el sistema en alcanzar el estado estacionario tiene, además de una dependencia de D, también una fuerte dependencia de DT y el gradiente de temperatura. El producto del gradiente de temperatura y la movilidad termófora DT da la velocidad con la que las partículas se mueven a lo largo del gradiente de temperatura. Como regla empírica, cuanto más fuerte es el gradiente de temperatura y mayor es la movilidad termófora, más corto es el tiempo necesario para medir las propiedades termo-ópticas. Por lo tanto, es ventajoso que se establezca una distribución de temperatura en escalas de longitud microscópicas (por ejemplo, 250 μm) para obtener un fuerte gradiente de temperatura.
De acuerdo con realizaciones adicionales de la presente invención, los medios para excitar con fluorescencia las partículas/moléculas o partículas/moléculas marcadas pueden ser cualquier dispositivo adecuado seleccionado del grupo que consiste en láser, fibra láser, diodo-láser, LED, halógeno, HBO (las lámparas HBO son, por ejemplo, lámparas de arco corto en las que se quema el arco de descarga en una atmósfera de vapor de mercurio a alta presión), HXP (las lámparas HXP son, por ejemplo, lámparas de arco corto en las que el arco de descarga se quema en una atmósfera de vapor de mercurio a una presión muy alta. Por ejemplo, a diferencia de las lámparas HBO funcionan a una presión sustancialmente más alta y emplean un ciclo halógeno. Las lámparas HXP generan luz UV y visible, incluida una porción significativa de luz roja. También se utilizan preferiblemente medios adicionales para la excitación como se menciona en la memoria descriptiva.
De acuerdo con realizaciones particulares de la presente invención, los medios para detectar la fluorescencia, en la solución, pueden ser cualquier dispositivo adecuado seleccionado del grupo que consiste en una cámara CCD (CCD 2D o exploración lineal), cámara de línea, tubo fotomultiplicador (PMT), fotodiodo de avalancha (APD), cámara CMOS. Los medios adicionales de detección a los que se hace referencia en la memoria descriptiva también se utilizan en realizaciones particulares.
Los medios de recepción para recibir las partículas marcadas dentro de una solución pueden ser una cámara, una cámara de microfluidos delgada, una cubeta o un dispositivo para proporcionar la muestra en forma de una única gotita. Es ventajoso proporcionar la sonda de muestra dentro de una cámara que tiene un espesor en la dirección del haz de luz láser de 1 μm a 500 μm, en particular de 1 μm a 250 μm, en particular de 1 μm a 100 μm, en particular de 3 μm a 50 μm, en particular de 5 μm a 30 μm. Un experto en la técnica entenderá que el término cámara también se refiere, por ejemplo, a un capilar, un chip de microfluido o una placa de múltiples pocillos. En algunas realizaciones, la cámara tiene la misma anchura que la dimensión en la dirección de la luz láser (por ejemplo, un capilar). En combinación con una geometría elipsoidal de calentamiento láser correspondiente, tal sistema puede reducirse de una simetría radial a una sola dimensión, ya que puede usarse una cámara CCD con una única línea de píxeles (CCD de exploración de línea) para integrar la fluorescencia de toda la anchura de la cámara. En una realización particular, los medios de recepción para recibir las partículas marcadas dentro de un soporte de muestra de alias de solución se unen a un elemento óptico, tal como un objetivo. Tal configuración evita movimientos relativos del porta-muestras con respecto al objetivo. También se usan en algunas realizaciones medios adicionales de recepción a los que se hace referencia en la memoria descriptiva.
El láser para la irradiación de la luz láser puede ser, por ejemplo, un láser IR, por ejemplo, un láser con una longitud de onda entre 1200 y 2000 nm, preferiblemente de 1455 nm y/o 1480 nm y una potencia de radiación de 0,1 a 10 W.
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los ejemplos y figuras adjuntos, particularmente en la Fig. 34).
Una micropartícula es una partícula con una longitud característica de menos de 1 mm y más de 100 nm sin restricción del material (por ejemplo, partículas de sílice/vidrio/biodegradables recubiertas o no recubiertas, partículas de poliestireno/recubiertas/de citometría de flujo/de PMMA/melamina/NIST, partículas de agarosa, partículas magnéticas, partículas de oro o partículas de plata recubiertas o sin recubrir, u otros metales, metales de transición, materiales biológicos, semiconductores, partículas orgánicas e inorgánicas, microesferas de poliestireno fluorescente, microesferas de poliestireno no fluorescente, materiales compuestos, liposomas, células y similares).
Una nanopartícula es una partícula con una longitud característica de menos de 100 nm sin restricción del material (por ejemplo, puntos cuánticos, nanocristales, nanocables, pozos cuánticos).
Las partículas o perlas de acuerdo con esta invención pueden modificarse de tal manera que, por ejemplo, las biomoléculas, por ejemplo, ADN, ARN o proteínas, pueden ser capaces de unirse (en algunas realizaciones específicamente y/o covalentemente) a las partículas o perlas. Por lo tanto, dentro del alcance de esta invención se encuentra el análisis termo-óptico de las características de perlas y/o partículas y en particular de moléculas unidas a o unidas a tales perlas o partículas. En particular, tales moléculas son biomoléculas. En consecuencia, la expresión "micro(perlas)/(nano o micro)partículas modificadas", en particular, se refiere a perlas o partículas que comprenden moléculas adicionales a analizar o caracterizar (un ejemplo no limitativo para el caso de nanopartículas se muestra en las figuras y ejemplos adjuntos, particularmente en la Fig. 34). Las micropartículas/(nano o micro)partículas modificadas o no modificadas pueden interactuar con otras partículas/moléculas, tales como biomoléculas (por ejemplo, ADN, ARN o proteínas) en solución. El experto entiende que las propiedades termóforas de las partículas modificadas cambiarán tras la unión de las biomoléculas en solución a las biomoléculas unidas a la partícula como modificación. Tal interacción puede influir en la fuerza que actúa sobre la partícula/molécula (modificada). Mediante el ajuste de la irradiación láser IR, el movimiento resultante puede verse influenciado de tal manera que la partícula/perla queda atrapada. El "atrapamiento" de la partícula/perla, en particular partículas/perlas que comprenden biomoléculas, significa que la partícula/perla permanece dentro de una cierta posición, mostrando únicamente fluctuaciones comparativamente bajas. Estas fluctuaciones son diferentes de las fluctuaciones basadas en movimientos Brownianos. Cuando una biomolécula de solución se une a la partícula modificada biomolecularmente, la fuerza que actúa sobre la partícula/perla cambiará debido a un cambio de las propiedades termóforas, lo que puede dar como resultado el movimiento de la partícula fuera de la posición determinada donde la partícula/perla se atrapó o/y en un cambio de las fluctuaciones de la partícula/perla. El procedimiento descrito aquí se denomina "trampa termo-óptica" y es particularmente útil en ciertos ejemplos descritos en el presente documento. La "trampa termo-óptica" también se ilustra en los ejemplos y figuras adjuntos. Otros sinónimos para la "trampa termo-óptica" son "trampa optotérmica", "trampa termófora", así como "pinzas optotérmicas" o "pinzas termóforas".
Por consiguiente, un ejemplo también se refiere a una trampa optotérmica. Los términos "termo-ópticos", "termoóptico", "optotérmico" y "opto-térmico" se utilizan como sinónimos. Este ejemplo particular ilustra que los objetivos dados, por ejemplo, perlas/partículas modificadas marcadas con fluorescencia con un tamaño de 100 nm hasta varios μm (por ejemplo, perlas de poliestireno o perlas de sílice) y vesículas y células de lípidos muestran un movimiento dirigido a la temperatura máxima de una distribución de temperatura espacial generada aplicando radiación láser IR a una solución acuosa como se ilustra en las figuras adjuntas, particularmente la figura 39.
Como se muestra en el ejemplo adjunto, los dispositivos y los procedimientos de la presente invención definida por las reivindicaciones adjuntas, también se pueden emplear para la captura termófora de moléculas o partículas, incluyendo las estructuras lipídicas (como vesículas o liposomas), así como los componentes celulares de incluso células. También se prevé que los dispositivos y procedimientos de la presente invención se pueden usar para la captura termófora de células o componentes celulares, como núcleos celulares, cromosomas, mitocondrias, cloroplastos y similares. El atrapamiento termóforo como se muestra en el presente documento, es particularmente útil para estudiar interacciones de, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, con otras proteínas, por ejemplo, interacciones anticuerpo-antígeno y similares), para estudiar eventos de transporte a través de membranas (por ejemplo, vesículas o liposomas), para la determinación de actividad de proteínas de membrana comprendidas en membranas/vesículas/liposomas biológicos, como bombas de iones, transportadores de membrana y similares. Además, la mera presencia de moléculas, partículas, liposomas, vesículas, perlas, células o componentes celulares en dicha solución puede detectarse y/o analizarse mediante el uso de los dispositivos y procedimientos de captura termóforos descritos en el presente documento. Las moléculas, partículas, vesículas, perlas, células o componentes celulares y similares atrapados termóforamente pueden transportarse y moverse dentro de la solución de análisis (véanse también las figuras adjuntas). Se prevé que las moléculas, partículas, liposomas, vesículas, perlas, células o componentes celulares atrapados termóforamente queden expuestos a diferentes soluciones de tampón para ciertas aplicaciones, es decir, el tampón en torno a las moléculas, partículas, vesículas, perlas, células o componentes celulares atrapados, etc. se pueden intercambiar y se pueden realizar mediciones correspondientes.
También se proporcionan en los ejemplos adjuntos ejemplos adicionales en el contexto del atrapamiento termóforo. Es evidente para el experto en la técnica que los conceptos de termoforesis como se divulgan en el presente documento también pueden emplearse, por ejemplo, en la clasificación de vesículas, componentes celulares (como, por ejemplo, mitocondrias, cloroplastos, núcleos, cromosomas) o incluso células enteras. Por consiguiente, el presente ejemplo también proporciona un procedimiento para atrapar termo-ópticamente moléculas, partículas,
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vesículas, perlas, liposomas, células o componentes celulares, etc., comprendiendo dicho procedimiento las etapas de proporcionar una sonda de muestra con moléculas, partículas , vesículas, perlas, liposomas, células o componentes celulares (preferiblemente marcados); irradiar un haz de luz láser en la solución para obtener una distribución de temperatura espacial en el haz de luz láser irradiado; detectar opcionalmente las moléculas, partículas, vesículas, perlas, células o componentes celulares (preferiblemente marcados); y atrapar las moléculas, partículas, vesículas, liposomas, perlas, células o componentes celulares (preferentemente marcados) de acuerdo con la movilidad termófora de dichas moléculas, partículas, vesículas, perlas, células o componentes celulares. Por ejemplo, las moléculas, partículas, vesículas, perlas, células o componentes celulares (preferiblemente marcados) pueden quedar atrapados en el centro del punto de calor generado por láser (en particular cuando la movilidad termófora de las moléculas, las partículas, las vesículas, los liposomas, las perlas, las células o los componentes celulares atrapados, etc. es negativa). Sin embargo, las moléculas, partículas, vesículas, perlas, células o componentes celulares (preferiblemente marcados) también pueden quedar atrapados en una temperatura mínima (global o local), en particular, cuando la movilidad termófora de las moléculas, partículas, vesículas, perlas, células o componentes celulares atrapados, etc. es positiva. El experto en la materia es consciente de que la expresión "movilidad termófora", DT se refiere a un coeficiente que relaciona la velocidad (v) de una molécula/partícula/perla, etc. dada al gradiente de temperatura (∇T), de acuerdo con v = -DT∇T.
Los ejemplos proporcionados en el presente documento anteriormente en el contexto del procedimiento para la medición de características termo-ópticas de las partículas/moléculas, etc. en una solución, se aplican al procedimiento de atrapamiento termo-óptico de moléculas, partículas, vesículas, perlas, liposomas, células o componentes celulares, etc. mutatis mutandis. También se proporcionan en el presente documento dispositivos para el atrapamiento termo-óptico y también se ilustran en las figuras adjuntas, por ejemplo, el dispositivo como se muestra en la figura 19 o 24 adjunta. Un dispositivo correspondiente comprende, por consiguiente, un láser IR para irradiar un haz láser en la solución que contiene las moléculas, partículas, vesículas, perlas, liposomas, células o componentes celulares (preferiblemente marcados) a atrapar, para obtener una distribución de temperatura espacial en dicha solución en torno al haz de luz láser irradiado. Por lo tanto, dicho dispositivo para atrapar de forma termoóptica moléculas, partículas, vesículas, perlas, liposomas, células, componentes celulares, etc., (preferiblemente marcados), puede comprender: (a) un medio de recepción para recibir moléculas, partículas, vesículas, perlas, células, componentes celulares (opcionalmente marcados), etc. dentro de una solución; (b) (opcionalmente) medios para excitar con fluorescencia las partículas marcadas; (c) (opcionalmente) medios para detectar la fluorescencia excitada en dicha solución; y (d) un láser IR para irradiar un haz de luz láser en la solución para obtener una distribución de temperatura espacial en la solución alrededor del haz de luz láser irradiado.
El movimiento de moléculas, partículas, vesículas, liposomas, perlas, células, componentes celulares, etc., puede describirse por una fuerza termófora que actúa sobre la partícula. Suponiendo un equilibrio termodinámico, esta fuerza puede derivarse de la entalpía libre de Gibbs a presión constante.
F= -1/2* ST * kB*grad(T2)
donde ST es el coeficiente Soret y kB la constante Boltzmann.
La temperatura T es una función de x e y: T = T(x,y). Por ejemplo, en una geometría simétrica radial como la distribución de temperatura espacial generada por un láser IR enfocado (como se ilustra en las figuras adjuntas, particularmente en la Fig. 3a), puede verse fácilmente que la fuerza puede atraer una partícula al máximo de la distribución de la temperatura espacial. Si ST < 0 da como resultado una fuerza que atrapa la partícula/perla objetivo dada, por ejemplo, una micropartícula de sílice, preferiblemente una micropartícula de sílice recubierta, al máximo (local o global) de la distribución de temperatura.
A diferencia de las pinzas ópticas/atrapamiento óptico que se conoce en la técnica, la trampa termo-óptica de acuerdo con el presente ejemplo se basa en diferentes principios. En lugar de usar un gradiente de campo electromagnético como se usa para el pinzamiento óptico, se utiliza un gradiente de temperatura para atrapar, mover y controlar una partícula de acuerdo con la presente invención. Por lo tanto, no es necesaria una óptica confocal sofisticada en algunos ejemplos de la trampa termo-óptica. El uso de gradientes de temperatura también permite la atracción de moléculas desde distancias de 1 μm a varios cientos de micrómetros de distancia al foco láser, dependiendo del ancho del gradiente de temperatura (por ejemplo, el ancho del foco láser IR). En comparación con la trampa termo-óptica, la región de captación para pinzas ópticas es muy estrecha del orden de unos pocos micrómetros.
Como se muestra en el Ejemplo 1 adjunto, el coeficiente de Soret ST es una función del área superficial A de la partícula diana, por ejemplo, la perla, la carga cuadrática eficaz σeff σeff y la entropía de hidratación específica de área de partícula Shyd-Así, la fuerza termófora también será proporcional a estas propiedades de las partículas.
Si una de estas propiedades cambia (preferiblemente la carga eficaz o la entropía de hidratación), la fuerza de atrapamiento cambia también. Si cambia la fuerza de atrapamiento/el potencial de atrapamiento, también cambian las fluctuaciones (como también se ilustra en la Fig. 32 adjunta) registrando las fluctuaciones de la partícula, se puede detectar un cambio en las propiedades termóforas de la partícula y, por lo tanto, se puede detectar la unión de, por ejemplo, biomoléculas a esta partícula/perla.
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En el caso de una partícula/perla, por ejemplo, una micropartícula de sílice, preferiblemente una micropartícula de sílice recubierta, más preferiblemente una micropartícula de sílice revestida con grupos especiales en su superficie (por ejemplo, proteínas). Estos grupos pueden ser capaces de unirse específicamente a proteínas, anticuerpos, moléculas pequeñas, ADN, ARN, etc. Si hay una unión de una de estas especies al grupo específico en la perla/partícula, las propiedades (por ejemplo la superficie A) de la partícula, por ejemplo, la perla, cambian, lo que puede dar como resultado un ST diferente y, por lo tanto, una fuerza termófora diferente F (por ejemplo, el signo/dirección de la fuerza puede cambiar).
Un ejemplo particular se refiere a la medición de las fluctuaciones de tal partícula/molécula diana dada en el máximo de la distribución de la temperatura mediante la detección de su posición a través de la medición de la fluorescencia
o similares. Cuando la partícula/molécula está atrapada en la distribución de temperatura, la solución a su alrededor se puede intercambiar fácilmente con una solución que contiene moléculas no marcadas o marcadas que se prevé que se unan a la partícula "atrapada", por ejemplo, al modificarse de una manera que permita la unión específica (por ejemplo, por anticuerpos). Un evento de unión puede detectarse por un cambio en la amplitud de las fluctuaciones (es decir, el potencial en el que la partícula se atrapa cambia debido a la unión de moléculas a la superficie de la partícula). Mediante la detección de las características dependientes del tiempo de la variación en la amplitud, se puede medir y establecer una cinética de unión.
En otro ejemplo particular, puede aprovecharse el cambio en el signo de ST de la partícula diana. Si ST <0, una partícula, por ejemplo, una perla o una micropartícula de sílice fluorescente, con grupos/sitios de unión específicos, queda atrapada a la temperatura máxima en la distribución de temperatura espacial. Si S T de la partícula diana cambia su signo tras, por ejemplo, la aglomeración o unión de los grupos de unión con moléculas, por ejemplo, moléculas pequeñas, la partícula diana se aleja forzosamente del máximo de la distribución de temperatura espacial y la partícula, por ejemplo, la perla, experimenta una repulsión en lugar de la atracción, dando lugar a un cambio cualitativo detectable del comportamiento de la partícula diana. Por ejemplo, si la fuerza cambia de atracción a repulsión, la partícula puede alejarse del máximo de la distribución espacial de la temperatura. De este modo, pueden detectarse las moléculas, por ejemplo, las moléculas pequeñas, que se unen a dichos grupos de unión en la superficie de la partícula/perla. La unión de moléculas, por ejemplo, moléculas pequeñas, se pueden medir fácilmente mediante simples procedimientos de seguimiento de partículas. La partícula puede llevarse a condiciones cercanas a un cambio de signo cambiando las condiciones del tampón (por ejemplo concentración de sal), la temperatura de la solución o por modificaciones específicas, por ejemplo, con moléculas hidrófobas o cargadas. Es evidente que la expresión "partícula diana" o "perla diana" también se refiere en este ejemplo a partículas y perlas modificadas de forma correspondiente, como partículas/perlas que comprenden o están ligadas a biomoléculas o partículas/perlas recubiertas con dichas biomoléculas. Por lo tanto, las realizaciones que se han mencionado anteriormente para "partículas/perlas" y en particular, partículas/perlas modificadas, se aplican mutatis mutandis.
La fuerza que actúa sobre la partícula diana, por ejemplo, una micropartícula de sílice recubierta con grupos especiales, se puede medir rastreando su posición mediante un procedimiento apropiado, como fluorescencia (si la partícula puede excitarse por fluorescencia), contraste de fase, interferencia, formación de imágenes en campo lejano, etc.
También es posible aplicar una segunda fuerza sobre la partícula diana, por ejemplo, una micropartícula magnética recubierta específicamente, de tal manera que la fuerza resultante es una superposición de la fuerza termófora y la segunda fuerza (por ejemplo, una fuerza magnética). La segunda fuerza puede ser, por ejemplo, una fuerza magnética (para partículas magnéticas) o una fuerza eléctrica (para partículas cargadas) o una fuerza hidrodinámica u otra fuerza óptica, como la que genera una pinza óptica.
Entonces se puede medir la superposición de fuerzas resultante, por ejemplo midiendo las fluctuaciones de la partícula (como también se ilustra en la Fig. 32 adjunta). Esta superposición puede utilizarse para aumentar la sensibilidad del procedimiento, por ejemplo, utilizando fuerzas de oposición de tal manera que un pequeño cambio en una de las propiedades de la partícula/perla diana, dará como resultado un movimiento de la partícula/perla diana, mientras que sin un cambio en las propiedades de la partícula/perla, la partícula/perla permanece en el mismo lugar. El aumento de la sensibilidad puede deberse a la posibilidad de ajuste de la segunda fuerza (por ejemplo, una fuerza magnética).
La "trampa termo-óptica" también se puede usar para mover una partícula/molécula diana, por ejemplo, una perla/partícula, en dos dimensiones perpendiculares al eje de la radiación incidente láser IR. Si el foco del láser IR se mueve, por ejemplo, mediante el uso de espejos galvánicos o un deflector óptico acústico (AOD), el máximo resultante de la distribución de la temperatura espacial también se mueve, así como la partícula/molécula/perla diana. O viceversa, la cámara se puede mover y el foco de láser IR se mantiene fijo (también como se ilustra en las figuras adjuntas, particularmente la Fig. 34).
Usando una diversidad de puntos focales láser IR, los lotes de partículas/perlas/moléculas pueden moverse simultáneamente, dando la oportunidad de multiplexar y también de combinar diferentes partículas diana, por ejemplo, micropartículas específicamente recubiertas, entre sí. Por lo tanto, si hay una partícula diana con un anticuerpo y otra partícula diana con el antígeno correspondiente, las partículas diana pueden moverse por dos focos láser IR hasta que estén en contacto y el anticuerpo se una al antígeno. De esta manera, las
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de carbono, buckyballs, etc.), polietilenglicol (PEG). Las moléculas que se han mencionado anteriormente muestran, por ejemplo, diferencias en la estabilidad de la temperatura. Los intervalos de temperatura específicos de las moléculas ilustrativas para la medición de las respectivas propiedades termo-ópticas se dan en la Tabla 1.
Los ejemplos de usos de los medios, procedimientos y dispositivos divulgados en el presente documento no han de ser considerados como limitantes e ilustran la invención. En particular, la presente invención definida por las reivindicaciones adjuntas, y sus correspondientes medios y procedimientos no se limitan al uso de la detección, medición y/o verificación de biomoléculas, como ácidos nucleicos o proteínas/estructuras proteínicas. Como es evidente a partir de la invención como se divulga en el presente documento, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, también se puede adaptar cualquier sistema sensible a la temperatura a los procedimientos y dispositivos divulgados en el presente documento.
Por ejemplo, es factible medir también reacciones químicas, como reacciones inorgánicas u orgánicas.
El experto en la técnica es consciente de que la invención, como se divulga en el presente documento, sólo está restringida por el hecho de que la reacción a medir, detectar, verificar y evaluar tiene que tener lugar en una solución que puede calentarse ópticamente mediante luz láser.
En algunos modos de realización, el dispositivo de acuerdo con la presente invención se basa en una configuración de microscopía de fluorescencia con un medio de excitación, por ejemplo, un diodo emisor de luz (LED) para la excitación, un conjunto de filtros de excitación/emisión, un soporte de muestras para una cámara de microfluidos y una cámara CCD rápida para el registro espacial resuelto de la intensidad de fluorescencia. Esta configuración de microscopía de fluorescencia está bien establecida en las ciencias biológicas y otras áreas. De acuerdo con un modo de realización ejemplar de la presente invención, tal configuración común se extiende mediante un láser infrarrojo (IR) cuya radiación está enfocada. El láser puede estar dispuesto por debajo del porta-muestras de modo que la radiación se enfoca desde debajo del porta-muestras hasta la cámara de microfluidos mediante una lente corregida por infrarrojos (como se ilustra en las figuras adjuntas, particularmente la Fig. 1). Sin embargo, de acuerdo con la invención, el láser, el medio de detección y el medio de excitación pueden disponerse en un lado común del porta-muestras, por ejemplo, por debajo del porta-muestras como se representa, por ejemplo, en la Fig. 2. En un modo de realización ejemplar, el portamuestras se une al objetivo. Tal configuración evita movimientos relativos del porta-muestras con respecto al objetivo. De acuerdo con un modo de realización adicional, es posible mover el láser libremente en el plano del objeto usando dos espejos de infrarrojos impulsados por tensión. Además, es ventajoso el uso de películas líquidas delgadas (aprox. de 1 μm a 500 μm, preferiblemente de 1 μm a 50 μm, más preferiblemente de 1 μm a 20 μm, aún más preferiblemente de 1 μm a 10 μm), por ejemplo, en cámaras de líquido fino, de soluciones de biomoléculas con radiación IR coherente local. Sin embargo, el procedimiento de la presente invención no está limitado a cámaras de líquido fino. Es posible una extensión a μl gotas o nl gotas de soluciones acuosas, capilares y placas de micro-pocillos como se ilustra en las figuras adjuntas, por ejemplo, la Figura 2 y 16 a
24. De acuerdo con otra realización ejemplar, el calentamiento por infrarrojos y la detección de fluorescencia se realizan a través del mismo objetivo, lo que hace que la configuración sea mucho más flexible y compacta (véase, por ejemplo, la Figura 2 y 16 a 24). El uso de un objetivo para enfocar tanto la radiación electromagnética de la parte infrarroja como visible del espectro comprende la necesidad de que el objetivo lo haga ambas con alta calidad óptica. En particular, la radiación infrarroja no debe presentar una dispersión fuerte por el objetivo. Una dispersión fuerte conducirá a una compensación de alta temperatura y un gradiente de temperatura comparativamente fuerte a distancias desde el centro caliente. Esta situación se evita en algunas realizaciones descritas aquí. La fuerte dispersión aumenta el tiempo de medición y disminuye la precisión. Sin quedar limitado a la teoría, esto puede deberse a un aumento de la escala de longitud donde la termoforesis es fuerte, por lo que el sistema necesita más tiempo para alcanzar el estado estacionario. El segundo efecto puede deberse al hecho de que la corrección de blanqueo no lineal sólo es precisa si la termoforesis es despreciable a mayor distancia del punto de calor. Esto se logra cuando la difracción de la radiación infrarroja es baja. Por consiguiente, y de acuerdo con esta invención, sólo se puede usar una dirección en el espacio para la detección y la manipulación. El procedimiento descrito y los dispositivos divulgados en el presente documento pueden integrarse en instrumentos establecidos y sistemas de alto rendimiento.
El agua muestra una fuerte absorción de radiación en el régimen de infrarrojos mayor de 1200 nm. La energía absorbida se convierte en calor. Las lentes coherentes LÁSER IR e IR permiten la creación de una densidad de potencia muy alta de la radiación infrarroja en solución. Mediante el control de la óptica LÁSER, el foco LÁSER se puede mover y cambiar. Esto incluye la óptica que cambia la relación de aspecto del haz láser radial simétrico para producir un foco en forma de línea. Esto es particularmente útil si las mediciones se realizan en un capilar. Puesto que toda la sección transversal se calienta homogéneamente, sólo existe un perfil de temperatura espacial a lo largo de la longitud del capilar. Un gradiente de temperatura en una única dirección de espacio aumenta la precisión de la medición ya que se pueden promediar todos los píxeles con la misma distancia desde el centro caliente. En particular, esto permite el uso de una cámara CCD con una única línea de píxeles. En este caso, la integración de fluorescencia se obtiene por hardware. Usando un fotodiodo o fotomultiplicador, se mide la fluorescencia de un elemento de volumen finito (es decir, del centro del punto/línea de calor), sin ninguna resolución espacial. Una resolución espacial de detección de fluorescencia sólo es necesaria en los casos en los que el radio hidrodinámico es la propiedad termo-óptica de interés. La técnica de calentamiento óptico permite la creación de amplias distribuciones de temperatura y gradientes de temperatura fuertes a escala micrométrica. En la posición del foco
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LÁSER se encuentra la temperatura más alta. Este límite de temperatura superior puede ajustarse controlando la potencia del LÁSER y la forma del foco láser. Con el aumento de la distancia al foco láser, la temperatura de una solución acuosa está disminuyendo debido a la conductividad térmica. El límite inferior de la temperatura puede fijarse por la temperatura del material de la cámara circundante. Este material puede enfriarse, por ejemplo, hasta 0 ºC. De esta manera, es posible generar una distribución de temperatura que contenga todas las temperaturas entre 100 ºC (con alta potencia láser) en el foco láser y 0 ºC a mayores distancias con respecto al punto de calor.
Con el procedimiento de la presente invención, es posible calentar y analizar soluciones, en particular soluciones acuosas de una manera termo-óptica. No hay necesidad de materiales conductores de calor como transductores de calor de un elemento de calentamiento (alambre de cobre, Peltiers, etc.). La propia solución se calienta directamente mediante la luz LÁSER. Debido a que el enfoque por láser sólo está limitado por difracción, se pueden observar simultáneamente distribuciones de temperatura que abarquen todas las temperaturas entre 0 ºC y 100 ºC (la fase líquida completa del agua) en una escala de longitud de unos pocos cientos de micrómetros.
Con el procedimiento de la presente invención, las mediciones son 3000-10000 veces más rápidas que los sistemas de medición disponibles más rápidos conocidos en la técnica. El procedimiento de la presente invención permite obtener todas las temperaturas entre 0 ºC y 100 ºC al mismo tiempo ya que se utiliza una distribución de temperatura espacial. La temperatura no se crea por contacto con un elemento de calentamiento, sino dentro de la propia muestra. Mediante el uso de la óptica de exploración infrarroja, se pueden crear patrones de temperatura bidimensionales arbitrarios en solución. De esta manera, cualquier estructuración de la superficie está obsoleta. Además, todos los materiales transparentes para la radiación en el infrarrojo se pueden utilizar para construir una cámara de medición de microfluidos (vidrio, zafiro, plástico, silicio, cristales).
Además, el procedimiento de la presente invención también se puede usar para crear distribuciones de temperatura en la solución acuosa cerca de una superficie. Debido a la continuidad de la temperatura, la superficie también adopta una distribución de temperatura. Por lo tanto, es posible calentar tanto la superficie, como la solución. Una posible aplicación es el análisis de micromatrices de ADN. Se pueden usar gradientes de temperatura cercanos a una superficie para mover moléculas hacia una superficie o lejos de una superficie. Estos cambios de concentración locales pueden medirse precisamente por el sistema de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) mostrado en las figuras adjuntas, particularmente las figuras 24 y 36, o cualquier sistema óptico (1) con capacidad para realizar una TIRF. Este movimiento termóforo en la dirección de la luz láser incidente puede usarse para dirigir moléculas a una estructura de microfluido para capturarlas y/o concentrarlas. Por lo tanto, los gradientes de temperatura generados de acuerdo con la presente invención también pueden usarse para capturar y/o concentrar moléculas/partículas. La captura y concentración de moléculas/partículas depende de sus propiedades termoópticas (por ejemplo, el signo del efecto termóforo).
Una manera de suprimir los efectos secundarios relacionados con las temperaturas no homogéneas en solución puede suprimirse eligiendo la geometría de la cámara de microfluidos correcta. Por ejemplo, la convección se aborda utilizando sólo una fina lámina de líquido. Esto también significa que es ventajoso para mediciones reproducibles y precisas que la altura de la lámina delgada de líquido no varíe de una medición a otra. La velocidad del flujo convectivo, que va acompañada de la distribución espacial de la temperatura, depende cuadráticamente de la altura de la lámina líquida. Esta no linealidad significa que cambios ligeros en la altura de la cámara conducen a cambios comparativamente fuertes en la velocidad del flujo convectivo, que a su vez efectúa el perfil de concentración y de temperatura de una manera muy complicada. Por lo tanto, los experimentos se realizan preferiblemente en cámaras de medición de microfluido de altura definida (por ejemplo, capilares). Puesto que, de acuerdo con los medios y procedimientos de esta invención, la temperatura se genera en el presente documento por la generación de calor debido al proceso de absorción, la altura constante también es ventajosa para obtener distribuciones de temperatura reproducibles. Las diferencias de altura conducirán a desviaciones debidas a las diferencias en la cantidad de energía absorbida y a las diferencias en la relación volumen/superficie. Esta relación determina la velocidad de transferencia de calor al entorno y, por lo tanto, también la distribución de temperatura en solución. La reproducibilidad del perfil de temperatura determina la máxima precisión de medición posible.
Otra manera es medir aún más rápido para evitar perturbaciones por convección abriendo la posibilidad de medir en gotas únicas o placas de micro-pocillos (lámina de líquido más gruesa). Dado que el láser IR se absorbe en una escala de longitud de 300 μm (1/e) de muestras delgadas, por ejemplo, se calientan las cámaras finas homogéneamente en la dirección z (altura).
Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento mejorado para medir interacciones inter y/o intramoleculares de partículas/moléculas en una solución, como se define en la reivindicación 1 adjunta, con las etapas de (a) proporcionar una sonda de muestra con partículas/moléculas marcadas en una solución; (b) excitar con fluorescencia dichas partículas marcadas y, en primer lugar, detectar la fluorescencia de dichas partículas/moléculas excitadas; (c) irradiar un haz de luz láser en la solución para obtener una distribución de temperatura espacial en la solución alrededor del haz de luz láser irradiado; (d) detectar en segundo lugar una fluorescencia de las partículas/moléculas en la solución en un tiempo predeterminado después de que se ha iniciado la irradiación del láser en la solución, y caracterizar las interacciones inter y/o intramoleculares de partículas/moléculas en base a dichas dos detecciones, en las que la irradiación del láser y la detección de la fluorescencia se realiza desde el mismo lado con respecto a la sonda de muestra.
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anticuerpo/anticuerpos (o fragmentos o derivados de los mismos), una o más moléculas de fusión de ácido nucleico a proteína, PNA, uno o más ADN bloqueados (LNA) y un biopolímero(s) (polímero de azúcar, ácidos hialurónicos, alginato, etc.). Además, las interacciones intra o intermoleculares, por ejemplo, plegado de proteínas/desplegado, están dentro del alcance de la invención.
Un ejemplo se refiere a un procedimiento para medir termo-ópticamente las características físicas, químicas o biológicas de partículas/moléculas en una solución con las etapas de (a) proporcionar una sonda de muestra con partículas/moléculas marcadas en una solución en un capilar; (b) excitar con fluorescencia dichas partículas/moléculas marcadas y detectar en primer lugar la fluorescencia de dichas partículas/moléculas excitadas unidimensionalmente a lo largo de la longitud del capilar; (c) irradiar un haz de luz láser en la solución para obtener una distribución de temperatura lineal en la solución alrededor del haz de luz láser irradiado a lo largo de la longitud del capilar; y (d) detectar en segundo lugar una fluorescencia de las partículas/moléculas en la solución en un tiempo predeterminado después de que se ha iniciado la irradiación del láser en la solución, y caracterizar las partículas basándose en dichas dos detecciones.
Un ejemplo proporciona un dispositivo particular para medir termo-ópticamente las características físicas, químicas o biológicas de partículas/moléculas en una solución como se describe en cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que el dispositivo comprende: un capilar para recibir partículas/moléculas marcadas dentro de una solución; medios para excitar con fluorescencia las partículas/moléculas marcadas; medios para detectar la fluorescencia excitada en dicha solución de manera unidimensional a lo largo de la longitud de dicho capilar; un láser para irradiar un haz de luz láser en la solución para obtener una distribución de temperatura lineal en la solución alrededor del haz de luz láser irradiado.
El dispositivo de acuerdo con la presente invención con un microscopio de fluorescencia y calentamiento láser infrarrojo local también se puede usar para medir el efecto de los gradientes de temperatura (es decir, temperatura en homogeneidades) en moléculas disueltas (véase el segundo modo de realización de la presente invención). Casi todas las moléculas disueltas comienzan a moverse en un gradiente de temperatura, ya sea a regiones calientes o frías. Este efecto se denomina termoforesis o efecto Soret y se conoce desde hace 150 años. Pero el mecanismo del movimiento de las moléculas en los líquidos permaneció incierto. Recientemente se ha dado un importante paso hacia una comprensión teórica de la termoforesis en líquidos.
Con el procedimiento y el dispositivo según la invención, la estabilidad, la conformación, el tamaño y/o la longitud de las moléculas, en particular las biomoléculas, se pueden caracterizar y/o determinar. La interacción de (bio)moléculas con otras moléculas o partículas, por ejemplo, (bio)moléculas, nanopartículas o perlas adicionales, por ejemplo, microperlas, se caracteriza en realizaciones particulares de la invención. Las moléculas a analizar también pueden estar unidas (por ejemplo covalentemente o no covalentemente) a perlas o partículas, por ejemplo, las perlas o partículas pueden recubrirse con moléculas (por ejemplo, biomoléculas) a analizar, caracterizadas de acuerdo con esta invención.
A continuación, se analizaran dos procedimientos ilustrativos de acuerdo con la presente invención que se basan en un protocolo de medición muy similar pero analizan parámetros de moléculas muy diferentes. Sólo en el procedimiento de la segunda realización ilustrativa de la presente invención se utiliza el movimiento termóforo de las partículas. En el procedimiento de la primera realización ilustrativa, este efecto debe excluirse. Además, se explicarán en detalle realizaciones particulares de la presente invención con referencia a las figuras y con referencia a los ejemplos detallados adjuntos. Dichas referencias a las figuras y ejemplos no se consideran limitantes.
Primer modo de realización ilustrativo de la invención
El procedimiento de acuerdo con una primera realización ilustrativa es, en particular, útil en una medición de la estabilidad de la temperatura de las moléculas, en particular, las biomoléculas. Sin embargo, ha de apreciarse de nuevo que los medios y procedimientos proporcionados en el presente documento no se limitan a la detección, verificación y/o medición de biomoléculas. El procedimiento descrito e ilustrado como un ejemplo no limitante, a continuación permite, por ejemplo, la medición de las temperaturas de fusión (figura 3) (estabilidad, parámetros termodinámicos como dS (cambio de entropía), dH (cambio de entalpía) y dG (cambio en la energía libre de Gibbs)) de biomoléculas (las proteínas, (ds)RNA bicatenario, dsDNA que era una cadena de ácido nucleico también pueden estar unidos a una (nano)partícula, microperlas, superficie, etc.). Con dicho procedimiento se han realizado mediciones de curvas de fusión de dsDNA y horquillas de ADN. Los resultados son muy bien comparables con los respectivos valores bibliográficos. Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención es particularmente útil en la medición de biomoléculas en general. De forma ilustrativa, se muestra en la presente que, por ejemplo, los SNP (polimorfismos de un único nucleótido) en las cadenas de ADN (cortas) pueden detectarse fácilmente (véase también la figura 4).
A continuación se explicará una realización particular del primera procedimiento ilustrativo. Los ácidos nucleicos con una etiqueta de fluorescencia se dan en una cámara de microfluidos fina (es decir, por ejemplo, 40 μm, 20 μm, 10 μm, o 5 μm, preferiblemente 20 μm). La modificación de ácidos nucleicos con etiquetas, como marcadores fluorescentes es una técnica bien establecida que se usa ampliamente. Antes de que comience el calentamiento, se observa la fluorescencia para determinar el nivel de fluorescencia del 100 % de moléculas no fundidas. Es
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importante que la etiqueta de fluorescencia usada reaccione sobre la fusión de las dos cadenas de ADN (o las cadenas de ARN o la estructura proteica, o la fluorescencia de una nanopartícula reaccione si el ssDNA/ARN o dsDNA/ARN se unen a esta). Esto puede realizarse utilizando, por ejemplo, un par fluoróforo/supresor (par donante/supresor, particularmente par donante/aceptor: Transferencia de energía (ET), por ejemplo, transferencia de energía de resonancia (RET), particularmente transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET)) o por la disociación de una tinción de ácido nucleico intercalante (por ejemplo, SYBR verde/POPO/YOYO) o una tinción de proteína (por ejemplo, SYPRO naranja (Invitrogen)). En el caso de, por ejemplo, nanopartículas de oro, la fluorescencia cambia cambiando el índice de difracción por unión al ADN. El láser acoplado al microscopio se desenfoca y se ajusta de tal manera que los gradientes de temperatura son lo suficientemente bajos para disminuir la deriva de partículas termóforas a valores despreciables. Al mismo tiempo, el enfoque debe ser lo suficientemente ajustado para alcanzar la temperatura lo suficientemente alta como para fundir las moléculas Las mediciones se realizan en algunos modos de realización particulares realizadas con alta resolución temporal en el rango de microsegundos, ya que la medición tiene que realizarse en un lapso de tiempo en el que el movimiento termóforo sigue siendo insignificante pero se completa el proceso de calentamiento de la cámara de microfluidos. La medición depende en gran medida de las condiciones experimentales. Los datos necesarios para determinar la temperatura de fusión se obtienen típicamente en 200 ms, en 150 ms, en 100 ms o en 50 ms, preferiblemente en 150 ms. Esto es muy sorprendente y apoya la esencia de esta invención. Incluso son posibles períodos de tiempo más cortos. En el contexto de esta invención, por ejemplo, para una discriminación cualitativa de diferentes especies o ácidos nucleicos. Se toma una primera imagen antes de encender el láser IR para obtener el nivel de fluorescencia del 100 % en moléculas no fundidas. Una segunda imagen se toma 100 ms, preferiblemente 50 ms, más preferiblemente 40 ms después de que el láser se encienda (si la cámara ha alcanzado su temperatura de estado estacionario). Estas dos imágenes contienen toda la información necesaria. La primera imagen contiene la fluorescencia de la molécula no fundida. La imagen tomada mientras el láser está encendido permite observar el porcentaje de moléculas fundidas a diferentes temperaturas simultáneamente, que varían del 0 % lejos del punto de calor (frío) hasta el 100 % en el centro del punto de calor (caliente). A partir de una medición independiente, se conocen las temperaturas de todos los píxeles en el experimento de fusión. Trazar el porcentaje de, es decir, las cadenas de ADN fundidas frente a la temperatura, permite determinar la estabilidad de la molécula (es decir, la temperatura de fusión) y derivar los parámetros termodinámicos.
En resumen, la primera realización ilustrativa de la presente invención conecta la medición de una distribución de temperatura espacial en la escala micrométrica con la medición de las reacciones químicas/bioquímicas dependientes de la temperatura y las interacciones dependientes de la temperatura entre moléculas/biomoléculas/nanocristales/microperlas. Para las mediciones, son importantes las temperaturas absolutas, no los gradientes de temperatura. Se puede considerar cada volumen de detección (mapeado en un CCD-cámara-píxel) como un microrreactor. Para la medición es muy importante que cada molécula permanezca en este microrreactor durante el tiempo de medición. Por lo tanto, la medición debe ser tan rápida como para evitar que la termoforesis y la convección muevan la partícula fuera del área tratada como microrreactor. Este requisito se cumple con un tiempo de medición de 150 ms.
Con el procedimiento y el dispositivo de acuerdo con la primera realización ilustrativa, se puede discriminar entre moléculas dsDNA con un único desajuste de nucleótidos (SNP, polimorfismo de un único nucleótido), así como diferencias dependientes de la sal y dependientes de la longitud en la estabilidad. Las diferencias en las estabilidades también se pueden medir para las horquillas de dsRNA, ADN y ARN (emparejamiento de bases de ssDNA/ARN consigo mismos) y proteínas. También se puede medir la influencia de diferentes sistemas de tapones acuosos en la estabilidad (pH, concentración de sales, valencia de iones). Las biomoléculas también pueden acoplarse a (nano)partículas, (micro)perlas. La fluorescencia de estas partículas modificadas cambia dependiendo de si, por ejemplo, ssDNA/RNA o dsDNA/RNA (u otras biomoléculas) están unidos a ésta. El calentamiento de tales soluciones conduce al mismo resultado sin la necesidad de marcadores fluorescentes específicos unidos a la biomolécula. Además de una discriminación cualitativa, también es posible un análisis termodinámico cuantitativo. Dado que los tiempos de medición están, en algunos casos, por debajo de los tiempos de relajación de las reacciones intermoleculares, no es posible determinar directamente en todos los casos los parámetros termodinámicos como dS (cambio de entropía), dH (cambio de entalpía) y dG (cambio de energía libre de Gibbs). Sin embargo, al utilizar la termodinámica de no equilibrio, estos pueden calcularse fácilmente. Para la discriminación cualitativa de (es decir) polimorfismos de un único nucleótido, trabajar en condiciones de no equilibrio puede aumentar las diferencias medidas en la estabilidad de las moléculas comparadas. La medición de los desajustes en las secuencias de nucleótidos es de gran importancia en el diagnóstico médico. El procedimiento permite identificar enfermedades hereditarias. También puede usarse en detecciones farmacéuticas de alto rendimiento para la unión de compuestos de bajo peso molecular a ácidos nucleicos. Además, la fusión de ácidos nucleicos bicatenarios (ds) permite determinar su longitud.
Las curvas de fusión medidas de la presente invención reproducen los resultados medidos por técnicas establecidas, pero hasta 3000 veces más rápido que los procedimientos basados en el baño Peltier o de calentamiento, como los procedimientos de ciclador de PCR o fluorímetro. El procedimiento de la invención es mucho más rápido, ya que no es necesario calentar el volumen por contacto directo, y la reacción de las moléculas a una temperatura específica entre 0 ºC y 100 ºC se observa al mismo tiempo. De nuevo, la esencia de esta realización es que las temperaturas se generan y se miden con resolución espacial en lugar de temporal. No hay
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retrasos debido a los tiempos de calentamiento y enfriamiento, lo que hace que el procedimiento de la presente invención sea muy rápido. Al mismo tiempo, sólo se utilizan láminas delgadas de líquidos que disminuyen el volumen de muestra necesario. Además la manipulación y el análisis de las moléculas se produce ópticamente sin el riesgo de contaminación. Esto es esencial si el análisis se combina con reacciones de PCR en las que cualquier contaminación con, por ejemplo, ADN humano, hace imposible un análisis.
Mediante la realización de la desnaturalización térmica en, por ejemplo, 100 ms, preferiblemente 50 ms, es posible medir el efecto de las sustancias sobre la estabilidad de ADN/proteína que son sensibles a temperaturas elevadas (por ejemplo, proteínas de unión a ADN, sustancias como monofosfato de adenosina cíclico (cAMP)). Estas sustancias se dañarán o se degradarán en un experimento con técnicas de la técnica anterior y no es detectable un efecto sobre la estabilidad térmica con tales técnicas de la técnica anterior.
Dentro de la distribución espacial de la temperatura hay gradientes de temperatura. Si el tiempo de medición es más largo de 150 ms (para el espesor de cámara aquí propuesto de, por ejemplo, 20 µm), se puede medir el movimiento termóforo de las biomoléculas (moléculas, nanopartículas, microperlas). A partir de estas mediciones se puede recopilar información adicional.
Segundo modo de realización ilustrativo de la invención
El procedimiento de acuerdo con un segundo modo de realización ilustrativo (es decir, el procedimiento que se ha mencionado anteriormente relativo a mediciones en el que el tiempo predeterminado en dicha segunda detección del procedimiento de la invención está dentro de un intervalo de 0,5 segundos a 250 segundos, preferiblemente dentro de un intervalo de 0,5 s a 50 s, más preferiblemente dentro de un intervalo de 0,5 s a 40 s) es particularmente útil para medir la movilidad de las moléculas en un gradiente de temperatura y su uso para la caracterización de biomoléculas. El procedimiento del primer modo de realización que se ha descrito anteriormente analiza moléculas en una distribución de temperatura en una corta escala de tiempo de milisegundos. Los efectos dinámicos, como la termoforesis, pueden insignificantes en este corto intervalo de tiempo. Si se observan las moléculas durante un período de tiempo en el orden de segundos, la termoforesis se establece y las moléculas comienzan a moverse en el gradiente de temperatura. Este efecto conduce las moléculas análogas a la electroforesis a lo largo de un gradiente a temperaturas más bajas (en algunos casos también se observa lo contrario). La velocidad de las moléculas es directamente proporcional al gradiente de temperatura con un coeficiente específico para la molécula DT (movilidad termófora): v = -DTT.
Inesperadamente, las movilidades termóforas de los biopolímeros varían fuertemente con la longitud de la cadena/molécula.
La movilidad termófora de estas moléculas varía fuertemente con los parámetros de moléculas que cambian la entropía de solvatación, tamaño, carga, tipo de superficie, el tamaño de la superficie, radio hidrodinámico etc. Esto abre la posibilidad de discriminar biomoléculas y detectar una interacción entre ellas (también entre nanopartículas/microperlas y biomoléculas) (como se ilustra en las figuras adjuntas, particularmente la Figura 4).
Dado que la termoforesis acumula gradientes de concentración, el efecto se contrarresta por una difusión ordinaria. La interacción entre estos dos efectos conduce a un perfil de concentración de estado estacionario
que se expresa mediante la siguiente ecuación imagen11. La concentración en cualquier punto dado en una distribución de temperatura depende únicamente de la diferencia de temperatura y no del gradiente de temperatura. El cociente de la movilidad termófora DT y la constante de difusión ordinaria D se denomina coeficiente de Soret ST y describe la magnitud de la termoforesis en estado estacionario. Depende exponencialmente de la diferencia de temperatura. Por lo tanto, la precisión de la medición depende en gran medida de la reproducibilidad del perfil de temperatura.
Un procedimiento de medición típico de acuerdo con el segundo modo de realización se describirá a continuación. Alprincipio se toma una imagen sin calentamiento LÁSER IR para determinar la intensidad de fluorescencia del nivel de concentración relativa del 100 %. A continuación, se enciente el LÁSER. En esta configuración experimental, es posible enfocar el láser firmemente con una anchura media por debajo de 6 μm para crear gradientes de temperatura fuertes o usarlo desenfocado (como se ha descrito anteriormente con una anchura media de perfil de temperatura de, por ejemplo, 200 μm). Esto influye en la velocidad de las moléculas y la rapidez con la que se alcanza el estado estacionario. El aumento de temperatura necesario varía entre 0,1 ºC y 80 ºC por encima de la temperatura ambiente (20 ºC). Si la cámara se enfría, por ejemplo, a 0 ºC, puede realizarse un intervalo de temperatura entre 0,1 ºC y 100 ºC, dependiendo de la estabilidad térmica de la muestra y de la magnitud del efecto termóforo. En general, no es necesaria una alta resolución temporal del registro de la imagen para determinar el efecto termóforo de las (bio)moléculas, (nano)partículas, o (micro)perlas. La señal medida está en el estado estacionario o cerca de la concentración de estado estacionario, que en la mayoría de los casos se alcanza después de algunos segundos. Las señales de la mayoría de las moléculas difieren suficientemente entre sí antes de alcanzar el estado estable para identificarlas sin ninguna duda. Para el análisis de los datos junto a la concentración
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Fig. 26: muestra una única molécula que se une a nanopartículas.
Fig. 27: muestra un ejemplo particular del dispositivo
Fig. 28: muestra la caracterización de la conformación de proteínas
Figuras 29-30: muestran mediciones con una muestra de albúmina sérica bovina marcada con fluorescencia (BSA).
Fig. 31: muestra la medición de las propiedades termo-ópticas de dos muestras con/de la proteína verde fluorescente (GFP).
Fig. 32: muestra una medición de una partícula que está atrapada en un pocillo potencial creado por una distribución de temperatura espacial
Fig. 33: muestra una serie temporal del movimiento termóforo de las perlas de sílice en una cámara de microfluidos.
Fig. 34: muestra otro ejemplo de la "Trampa Optotérmica".
Fig. 35: muestra la determinación del coeficiente de Soret de complejos de nanocristales (= punto cuántico QD) y biomoléculas.
Figuras 36-37: muestran modos de realización particulares del dispositivo de acuerdo con la presente invención.
Fig. 38: muestra un ejemplo de un sistema bicapa lipídico.
Fig. 39: muestra termoforesis y atrapamiento termóforo de vesículas lipídicas
Descripción detallada de dibujos:
En la siguiente descripción de ejemplos de modos de realización preferidos de la invención, los elementos que tienen el efecto técnico o físico comparable tienen los mismos números de referencia.
La Fig. 1a muestra un microscopio de barrido de fluorescencia IR de acuerdo con un ejemplo. El microscopio de barrido IR se basa en una configuración de microscopía de fluorescencia estándar (por ejemplo Zeiss AxioTech, Vario). Dicho dispositivo comprende: una o más fuentes de luz 32, preferiblemente un LED de alta potencia (por ejemplo, V-Star, Luxeon) para excitar las partículas. La señal de las partículas puede recogerse con un sistema óptico 1, preferiblemente un objetivo de aceite 40x y se separa de la luz de la fuente de luz por uno o más elementos de separación de luz 4, preferiblemente un espejo dicroico. Dicha señal se registra con uno o más detectores 31, preferiblemente una cámara CCD (por ejemplo, SensiCam QE, PCO). El haz de un LÁSER IR 30 (por ejemplo, IPG, de fibra Raman RLD-5-1455) se acopla a la cámara de microfluidos 45 (por ejemplo, una placa multipocillo). El sistema puede comprender otros componentes como se encontrarán habitualmente en microscopios de fluorescencia y campo amplio. Pueden encontrarse ejemplos de medios de excitación y detección de fluorescencia en: Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic / Plenum Publishers (1999).
La Fig. 1b muestra un ejemplo adicional de un microscopio de barrido IR de fluorescencia similar al ejemplo mostrado en la Fig. 1a. Sin embargo, la fuente de luz 32 está orientada de una manera diferente con respecto al espejo dicroico 4. La muestra de ensayo 50 está intercalada entre dos piezas de vidrio 51, preferiblemente cubreobjetos.
La Fig. 2 muestra un modo de realización ejemplar de un microscopio de barrido IR de acuerdo con la invención. De acuerdo con este ejemplo de modo de realización de la presente invención, la muestra de ensayo 50 se proporciona en forma de una única gota con las partículas marcadas. El volumen (preferiblemente de algunos nanolitros hasta algunos microlitros) de tal gota puede ajustarse fácilmente de modo que también sean predecibles las dimensiones, es decir, el grosor de la gota que se irradia con el haz de láser. En este modo de realización ejemplar, el haz láser, la luz de excitación fluorescente de la fuente de luz 32, preferiblemente un LED, así como la luz fluorescente medida, están todos enfocados por un sistema óptico común 1, preferiblemente un objetivo de microscopio con alta apertura numérica y, más preferiblemente, un objetivo con alta apertura numérica y alta transmisión IR. Por lo tanto, el LED, el LÁSER 30 y el detector 31, preferiblemente un CCD, pueden disponerse a un lado común con respecto a la muestra. La luz de excitación se separa de la luz fluorescente mediante un elemento de separación de luz 5, preferiblemente un espejo dicroico, que separa preferiblemente diferentes partes del espectro de luz que el elemento de separación de luz 4.
Las Fig. 3a-d muestran cómo se pueden tomar las curvas de fusión con una radiación de 150 ms, (a) mediante la medición de la fluorescencia de un colorante sensible a la temperatura, la distribución de temperatura se puede medir en la cámara de microfluidos, (b) muestra el promedio radial de las temperaturas medidas por fluorescencia,
(c) aprox. 150 ms después de que el LÁSER IR se encienda, se toma una imagen del ADN marcado con fluorescencia. La alta intensidad muestra ADN ds fundido. A partir de (a) y (c), la curva de fusión se puede determinar muy rápidamente (d).
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La Fig. 4 muestra una detección de SNP rápida. Un 16mer de dsDNA con un único desajuste de nucleótidos en el centro (azul) se compara con el tipo silvestre (negro). En 150 ms, ambas especies pueden discriminarse claramente. La ordenada describe la fracción de dsDNA disociado. El punto de fusión se define por moléculas disociadas al 50 %. Se desplaza en 15 ºC por un único desajuste.
La Fig. 5a-5b muestra la movilidad en un gradiente de temperatura. Las figuras muestran el cambio de concentración en el píxel central de un punto de calor a lo largo del tiempo. Unos segundos después del inicio de la medición, el láser se enciende y la concentración disminuye hasta alcanzar un estado estacionario. La señal permite distinguir entre un dsDNA de 20 mer y 50 mer (a), así como entre ssDNA de 20 bases y dsDNA de 20 pares de bases (b).
La Fig. 6 es un ejemplo de un colorante de fluorescencia que se usará en los procedimientos de la presente invención (6-carboxi-2',4,4',5',7,7'-hexaclorofluoresceína (HEX, SE; C20091) de Invitrogen).
Las Figuras 7-14 muestran información adicional con respecto a un ejemplo detallado de acuerdo con la presente invención. Estas figuras muestran en particular:
Fig. 7: muestra cómo la termodifusión manipula la concentración de ADN mediante pequeñas diferencias de temperatura dentro de la solución a granel. Una fina película de agua se calienta en 2 K a lo largo de las letras "ADN" con un láser infrarrojo. Para una cámara enfriada a 3 ºC, el ADN marcado con fluorescencia se acumula en las letras cálidas. Sin embargo, a temperatura ambiente, el ADN se mueve hacia el frío, mostrando una fluorescencia reducida. La cámara es de 60 μm de espesor, que contiene ADN 50 nM en tampón TRIS 1 mM. Cada 50 par de bases está etiquetado con TOTO-1.
La Fig. 8 ilustra la dependencia de la sal, (a) la termodifusión en el agua está dominada por el blindaje iónico y la hidratación con agua, (b) coeficiente de Soret ST frente a la longitud de Debye para perlas de poliestireno modificadas con carboxilo de diámetro 1,1, 0,5 y 0,2 μm. Representación lineal (izquierda) y representación logarítmica (derecha). Los coeficientes de Soret se describen mediante la ecuación (2) con una carga superficial imagen14
eficaz de σeff = 4500 e/μm2 conocida a partir de la electroforesis. La intersección
se ajusta con una entropía de hidratación por superficie de partícula de Shyd = -1400 J/(molKμm2).
La Fig. 9 muestra una dependencia de la temperatura, (a) La dependencia de la temperatura está dominada por el cambio lineal en la entropía de hidratación Shyd. Cambia la termodifusión dependiente de la sal ST(λDH) a valores inferiores. El tamaño de partícula es de 1,1 μm. (b) El coeficiente de Soret ST aumenta linealmente con la temperatura según se espera para una entropía de hidratación Shyd(T). Depende de la especie de la molécula, no de su tamaño, como se observa a partir de los coeficientes de Soret redimensionados para el ADN con diferentes longitudes.
La Fig. 10 muestra una dependencia de tamaño, (a) Para las cuentas perlas de poliestireno, el coeficiente de Soret se escala con la superficie de partícula en cuatro órdenes de magnitud. Las mediciones se describen por la ecuación
(2) con una densidad de carga superficial eficaz de σeff = 4500 e/μm2 y una entropía de hidratación insignificante. La desviación para la perla con un diámetro de 20 nm se puede entender a partir de un aumento de la carga eficaz debido al inicio de la normalización de la carga para un ≤ λDH. (b) Por consiguiente, el coeficiente de termodifusión imagen15
DT se escala linealmente con el diámetro de la perla, (c) El coeficiente de Soret del ADN se escala según con la longitud L del ADN en base a la ecuación (2) con una carga eficaz por par de bases de 0,12 e. (d) El
La Fig. 11: muestra una carga eficaz de la termodifusión. Se deduce la carga eficaz de la termodifusión usando la ecuación (3). Se miden perlas de poliestireno (20.000 nm) (a) y ADN (50 -50.000 pb) (b) en un intervalo de gran tamaño, imposible con electroforesis. Como era de esperar, la carga eficaz de las perlas se escala con la superficie de las partículas y linealmente con la longitud del ADN.
La Fig. 12: muestra la dependencia de la termodifusión de la concentración en el tiempo, (a) El coeficiente de difusión D se obtuvo a partir de la difusión posterior después de apagar la fuente de calor, (b) D se varía hasta que la simulación de elementos finitos coincida con el experimento, (c) El agotamiento radial del ADN de un punto de calor a 2 K enfocado se controla en el tiempo, (d) La comparación con la simulación con D conocido produce DT y ST.
La fig. 13 muestra una escala de coeficientes de difusión de ADN. Los coeficientes de difusión se miden en este estudio a temperatura ambiente. La escala sobre la longitud del ADN coincide con los valores de la bibliografía con dos regímenes de escala con exponente -1 para el DNA33 corto y -0,6 para el largo. Como aproximación, la difusión a través de los dos regímenes de escala se describe bien con un exponente general de -0,75.
La Fig. 14: muestra una simulación de calentamiento de microfluido, (a) Una película de agua delgada de 10 μm se encierra entre paredes PS. La baja conducción térmica de las paredes de la cámara permite un perfil de temperatura independiente del espesor, confirmado por el cálculo de elementos finitos mostrado, (b) La convección es lenta a velocidades máximas de 5 nm/s debido a la cámara delgada y el enfoque de calentamiento amplio comparable.
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puede dañar los componentes o afectar negativamente a las características espectrales de la fuente de iluminación. Mediante la transmisión de longitudes de onda de luz visible mientras refleja el infrarrojo, los espejos calientes también pueden servir como divisores de haz dicromáticos para aplicaciones especializadas en microscopía de fluorescencia.
La Fig. 21 muestra un modo de realización ejemplar de la invención de acuerdo con la Fig. 20, en el que se añade un obturador 33 para controlar la radiación láser IR.
La Fig. 22 muestra un modo de realización ejemplar de la invención de acuerdo con la Fig. 20, en el que un obturador 33 y un módulo de formación de línea 12, preferiblemente un sistema de lente que comprende una, dos o más lentes, o más preferiblemente una lente Powell, se añaden para controlar la radiación láser IR.
La Fig. 23 muestra un modo de realización ejemplar de la invención de acuerdo con la Fig. 16, en el que el módulo de exploración 20 se reemplaza por un espejo fijo 21, preferiblemente un espejo de plata, y en el que se añade un elemento adicional de separación de luz 5, preferiblemente un espejo dicroico que separa preferiblemente partes del espectro de luz diferentes que el elemento de separación de luz 4, y en el que se añade un filtro de emisión 8, que transmite preferiblemente otro intervalo de longitud de onda que el filtro de emisión 7 y en el que se añade un segundo detector 31 que detecta la señal que pasa a través del filtro 8.
Fig. 24 muestra un ejemplo de un dispositivo; 31: cámara CCD; 7: Filtro de emisión (por ejemplo, paso de banda o paso largo); 4: elemento de separación de luz, preferiblemente un espejo dicroico para dividir la trayectoria de la luz de excitación y la trayectoria de la emisión de luz; 1: Objetivo; 45: Cámara; 10: Sistema de lentes para enfocar el láser IR en la muestra; 20: módulo de exploración, puede ser espejos galvanométricos o un deflector óptico acústico;
16: Acoplador de fibra láser con óptima de colimación; 15: Fibra láser; 30: Láser IR; 6: Filtro de excitación; 10: sistema óptico para la excitación, puede ser un sistema de lentes que comprende una, dos o más lentes; 32: Fuente de luz (HXP, LED); 46: Fase de traducción de xyz para el posicionamiento del láser, puede ser automatizada, preferiblemente puede ser automatizada para la exploración de la cámara. 47: sistema óptico de conformación del haz del láser IR, puede ser un sistema de lentes que comprende una, dos o más lentes, o puede ser un objetivo, preferiblemente con alta transmisión de IR.
Fig. 25: muestra una cuantificación de la interacción entre biomoléculas. Se titulan 100 nM de un anticuerpo marcado con fluorescencia (anti-interleucina 4) con varias cantidades de interleuquina, (izquierda) Se mide la distribución espacial de fluorescencia en estado estacionario. Se muestran de forma ejemplar tres curvas con 5 nM, 80 nM y 300 nM. La señal cambia drásticamente desde la disminución de fluorescencia hasta un aumento de fluorescencia. La integración del perfil de fluorescencia hasta 80 μm (distancia desde el centro calentado) permite determinar el número de complejos en solución. (derecha) La concentración de interleuquina 4 libre se puede calcular gráficamente frente al complejo formado por la concentración. Estos datos se pueden ajustar para determinar el KD.
La Fig. 26 muestra una única molécula que se une a nanopartículas. El coeficiente de Soret de nanocristales en complejo con moléculas de PEG se mide mediante la evaluación del perfil de concentración en estado estacionario. El coeficiente de Soret aumenta linealmente con el número de moléculas de PEG unidas covalentemente a la partícula. Las moléculas de PEG con un peso molecular más alto muestran un aumento más pronunciado en el coeficiente de Soret. Las moléculas de PEG mostradas aquí son comparables en tamaño a proteínas o moléculas de ADN cortas, que pueden detectarse de la misma manera.
La Fig. 27 muestra un ejemplo de un dispositivo. Los medios de recepción para recibir la sonda de muestreo 50 son un capilar 40 con un diámetro interior de 5 μm a 500 μm, de manera que el espesor de la sonda de muestra es pequeño en la dirección perpendicular al haz láser. La primera válvula 41 y la segunda válvula 42 se proporcionan para la entrada/salida controlada de la sonda de muestra 50 en/desde el capilar 40. El capilar está montado sobre un soporte sólido 43, preferiblemente un material con buena conductividad térmica, por ejemplo, aluminio, cobre. El elemento Peltier 44 está montado sobre el soporte sólido 43 de manera que el capilar 40 puede enfriarse.
La Fig. 28 muestra la caracterización de la conformación de proteínas. La caracterización termo-óptica proporciona los medios para caracterizar la conformación de una proteína en solución. La temperatura de una solución que contiene albúmina de suero bovino (BSA) se enfría a 0 ºC. A partir de esta temperatura, el coeficiente de Soret se mide a diferentes temperaturas que se aumentan gradualmente hasta 60 ºC. El coeficiente de Soret es negativo, hasta valores cercanos a la desnaturalización térmica, donde se observa un salto repentino a los coeficientes de Soret positivos. A temperaturas fisiológicas (30-40 ºC), el coeficiente de Soret no cambia mucho. En este intervalo de temperatura la proteína tiene que tener propiedades similares para realizar sus tareas. Debido a la estrecha relación entre la estructura y la función, la conformación se conserva en este intervalo de temperatura. Los resultados se confirman por el experimento mostrado a la derecha, que comienza a altas temperaturas. Los coeficientes de Soret siguen siendo positivos por debajo de 50 ºC, ya que las mediciones son más rápidas que el tiempo que la proteína necesita para replegarse. Después de un cierto intervalo de tiempo (es decir, 20 minutos), los valores alcanzan los coeficientes de Soret negativos obtenidos en las mediciones iniciadas a bajas temperaturas. Un posterior aumento de temperatura reproduce el coeficiente de Soret negativo medido en el experimento comenzando a bajas temperaturas.
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atrapada por calentamiento, por ejemplo, un círculo alrededor de ella.
La Fig. 34 muestra otro ejemplo de la "Trampa Optotérmica". Otro ejemplo de la "Trampa Optothermal": Varias perlas de 1 μm están atrapadas en el punto brillante en el centro de la imagen. La cámara se mueve mientras que el foco láser se mantiene fijo. La imagen es una adición de aproximadamente 30 imágenes individuales. Como se puede observar, todas las perlas se movieron con la cámara, por lo que la adición de las imágenes individuales como resultado líneas para las partículas individuales. Las cuentas atrapadas se mantuvieron en una posición. No se detectó ningún movimiento de las perlas atrapadas. El halo y la alta intensidad de las perlas atrapadas es el resultado de la adición de las imágenes individuales.
La Fig. 35 muestra la determinación del coeficiente de Soret de complejos de nanocristales (= punto cuántico QD) y biomoléculas. El Coeficiente de Soret de complejos de nanocristales (= punto cuántico QD) y biomoléculas se determina relacionando la distribución de concentración espacial con una distribución de temperatura espacial. Se han analizado tres muestras diferentes. Primero se mide un nanocristal sin modificación de proteínas (QD), seguido de una muestra de nanocristales modificados con la proteína estreptavidina (QD + Strep.) (aproximadamente 5 proteínas por nanocristal). Al unir la proteína al nanocristal, el coeficiente de Soret aumenta fuertemente. Mediante la adición de un ADN monocatenario a la muestra (un ADN por Partícula), el coeficiente de Soret se aumenta adicionalmente (QD + Strep. + ADN).
La Fig. 36 muestra otro modo de realización ejemplar de la invención de acuerdo con la Fig. 20, en el que una fase 43 que lleva un elemento de control de temperatura 44 y la cámara 45 se conecta al sistema óptico a través de conectores 48. El sistema óptico 1 también puede comprender un objetivo TIRF (fluorescencia de reflexión interna total) de manera que se pueda medir la termoforesis en la dirección del haz láser.
La Fig. 37 muestra otro modo de realización ejemplar de la invención de acuerdo con la Fig. 20, en el que se añaden un obturador 33 y un módulo de formación de línea 12, preferiblemente un sistema de lentes que comprende una, dos o más lentes, o más preferiblemente una lente Powell, para controlar la radiación láser IR, y en el que el filtro de emisión 7 se reemplaza por un instrumento óptico 22 que puede ser un espectrógrafo, policromador o monocromador o combinaciones de uno o más de éstos, por ejemplo, un instrumento óptico que transforma diferentes intervalos de longitud de onda/frecuencia de luz en diferentes intervalos de ángulos/distancias o lugares diferentes, por ejemplo, en un CCD.
La Fig. 38 muestra un ejemplo de un sistema modelo de bicapa lipídica. Una fracción de la capa que constituye los lípidos se acopla a una superficie (por ejemplo, a través de un péptido sulfhidrilo a una superficie de oro). Las proteínas transmembrana o proteínas asociadas a la membrana se insertan en la bicapa lipídica. Además, también pueden estar presentes proteínas solubles en la solución acuosa en la parte superior de la membrana. Mediante absorción por láser infrarrojo de la solución acuosa puede establecerse un gradiente de temperatura dentro de la membrana. De esta manera, las propiedades termo-ópticas como la estabilidad, la interacción y la conformación pueden medirse para un compuesto marcado con fluorescencia (es decir, un lípido, proteína de membrana o proteína soluble).
La Fig. 39 muestra termoforesis y atrapamiento termóforo de vesículas lipídicas Las imágenes (200 x 200 μm) muestran una solución de vesículas unilamelares, sin (a) y después de 10 segundos de calentamiento por láser infrarrojo, (a) muestra una distribución uniforme de las vesículas. El láser infrarrojo calienta la solución localmente a una temperatura máxima de 15 ºC por encima de la temperatura ambiente de 20 ºC, ya que (b) muestra que el aumento de la temperatura local atrae a las vesículas (es decir, termoforesis negativa) y confina su posición a una región cercana al centro del punto de calor. La región alrededor del punto de calor está agotada de vesículas. Las vesículas más cercanas al borde del campo de visión experimentan sólo un pequeño gradiente y no son atraídas dentro del lapso de tiempo de 10 segundos. La ampliación del perfil de temperatura también atraerá estas partículas mucho más rápidamente.
Ejemplos
El siguiente ejemplo detallado ilustra la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas, sin ser limitante.
Ejemplo 1: Termodifusión
Las moléculas se desplazan a lo largo de los gradientes de temperatura, un efecto denominado termoforesis, efecto de Soret o termodifusión. En los líquidos, su fundamento teórico es objeto de un debate entableado desde hace tiempo. Mediante el uso de un nuevo procedimiento de fluorescencia de microfluidos totalmente óptica, se presentan resultados experimentales para ADN y perlas de poliestireno sobre una amplia gama de tamaños de partícula, concentración de sal y temperatura. Los datos apoyan una teoría unificadora basada en la entropía de la solvatación. Expresado en términos generales, el coeficiente de Soret viene dado por la entropía negativa de la solvatación, dividida por kT. La teoría predice la termodifusión de perlas de poliestireno y ADN sin parámetros libres. Se asume un equilibrio termodinámico local de las moléculas de disolvente alrededor de la molécula. Este supuesto se cumple para gradientes de temperatura moderados por debajo del criterio de fluctuación. Por encima de este criterio, la termodifusión se vuelve no lineal. Tanto para el ADN como para las perlas de poliestireno, el movimiento termóforo cambia de signo a temperaturas inferiores. Esta termofilicidad hacia temperaturas más bajas se atribuye a
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una creciente entropía positiva de hidratación, mientras que la termofobicidad generalmente dominante se explica por la entropía negativa del blindaje iónico. La comprensión de la termodifusión establece el escenario para el sondeo detallado de las propiedades de solvatación de coloides y biomoléculas. Por ejemplo, se determina con éxito la carga eficaz de ADN y perlas en un intervalo de tamaño que no es accesible con electroforesis.
Introducción. La termodifusión se conoce desde hace mucho tiempo, pero su explicación teórica para las moléculas en líquidos todavía está en discusión. La búsqueda de la comprensión teórica está motivada por el hecho de que la termodifusión en el agua podría conducir a poderosos procedimientos de selección totalmente ópticos para biomoléculas y coloides. Igualmente bien, la termodifusión maneja y mueve las moléculas ópticamente por completo y, por lo tanto, puede complementar procedimientos bien establecidos, como por ejemplo electroforesis o pinzas ópticas. Para esto último, las fuerzas de las pinzas ópticas se escalan con un volumen de partículas y limitan este procedimiento a las partículas sólo mayores de 500 nm. La electroforesis no sufre limitaciones de fuerza, pero es difícil de miniaturizar debido a las reacciones electroquímicas en los electrodos.
Por otro lado, la termodifusión permite la manipulación a microescala incluso de pequeñas partículas y moléculas. Por ejemplo, el ADN de 1000 pb se puede modelar arbitrariamente en agua a granel (Figura 7). El "ADN" del patrón de temperatura, calentado en 2 K, se escribió en una película de agua con un microscopio de exploración de láser infrarrojo. La concentración de ADN de 1000 pb se formó en imagen usando una etiqueta de ADN fluorescente. En una cámara enfriada en su totalidad a 3 ºC, el ADN se acumula hacia las letras calientes "ADN" (efecto Soret negativo), mientras que a temperatura ambiente, el ADN es termófobo (efecto Soret positivo) como se observa por las letras oscuras.
En el pasado, la aparente complejidad de la termodifusión impedía una descripción teórica completa. Como se observa para el ADN en la Figura 13, las moléculas se agotan característicamente de regiones con un aumento de temperatura, pero también pueden mostrar el efecto inverso y acumularse3. Además, la escala de tamaño de la termodifusión registrada por fraccionamiento de flujo de campo térmico (ThFFF) mostró leyes de potencia fraccional con una diversidad de exponentes que son difíciles de interpretar4. Este último efecto se resolvió recientemente mediante la revelación de la deriva termófora no lineal para los fuertes gradientes térmicos utilizados en ThFFF.
Se utilizaron una diversidad de procedimientos para medir la termodifusión, principalmente en el régimen no acuoso. Varían desde la desviación del haz3,7, dispersión holográfica8,9, calentamiento eléctrico a lentes térmicas. Recientemente, se ha desarrollado una técnica de formación de imágenes de microfluidos de fluorescencia13,14 que permite la medición de la termodifusión en un amplio intervalo de tamaños de molécula sin artefactos inducidos por la convección térmica. Las suspensiones altamente diluidas pueden medirse y, por lo tanto, las interacciones partícula-partícula no tienen influencia. Sólo se aplican gradientes moderados de temperatura. A continuación, se usó este procedimiento para confirmar una explicación teórica directa de la termodifusión.
Enfoque teórico. Para concentraciones diluidas, se asume generalmente que la velocidad de deriva termodifusiva depende linealmente del gradiente de temperatura imagen19T con una constante de proporcionalidad que equivale al coeficiente de termodifusión DT:
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= –DTT. En estado estacionario, la termodifusión se equilibra mediante difusión ordinaria. Los coeficientes difusión y termodifusión constante conducen a una ley de agotamiento exponencial16 c/c0 = exp[-(DT /D)(T–T0)], dependiendo la concentración c únicamente de la diferencia de temperatura T-T0. La concentración c se normaliza por la condición límite de la concentración C0 con la temperatura T0. El coeficiente de Soret se define como la relación ST = DT/D, que determina la magnitud de la termodifusión en el estado estacionario. Si bien la distribución exponencial anterior podría motivar un enfoque basado en las estadísticas de equilibrio de Boltzmann, se argumenta comúnmente que la termodifusión, sin excepción, es un efecto local de no equilibrio que requiere dinámica de fluidos, campos de fuerza o potenciales de disolventes de partículas17-20. Sin embargo, en dos documentos anteriores16 se demostró que para los gradientes moderados de temperatura, las fluctuaciones térmicas de la partícula son la base para un equilibrio local. Esto permite la descripción del estado estacionario termodifusor por una sucesión de leyes locales de Boltzmann, produciendo c/c0 = exp[(G(T0)-G(T))/kT] con G la entalpía libre de Gibbs del sistema de disolvente de partícula única. Tal enfoque sólo es válido si el gradiente de temperatura T está por debajo de un umbral T <(aST)-1 que se da por las fluctuaciones de las partículas con el radio hidrodinámico a y el coeficiente de Soret ST, como se muestra recientemente. Para gradientes de temperatura más grandes, la deriva termodifusiva no depende linealmente del gradiente de temperatura. En el presente estudio, los gradientes de temperatura por debajo de este límite se utilizaron para que la termodifusión se midiera en condiciones de equilibrio termodinámico local.
El equilibrio termodinámico local permite la derivación de una base termodinámica del coeficiente de Soret. La distribución local de Boltzmann relaciona pequeños cambios de concentración δc con pequeñas diferencias de energía libre de Gibbs: δc/c = -δG/kT. Se compara esta relación con un estado estacionario de termodifusión localmente linealizado dado por δc / c = -STδT, y así se encuentra el coeficiente de Soret por la derivada de temperatura de G.
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2000e/m 2. Este valor es prácticamente independiente de las concentraciones de sal utilizadas 29. Usando esta carga efectiva inferido, la ecuación (2) se ajusta el coeficiente de Soret para diferentes tamaños de grano y las concentraciones de sal así (Figura 8b, líneas continuas).
La intersección S T (λ DH = 0), donde las contribuciones iónicos son cero, también se escala con la superficie de las partículas y se describe mediante una hidratación entropía por unidad de superficie de las partículas de s = hyd 1400J/(molKμm 2). El valor coincide con los valores de la bibliografía para superficies similares razonablemente bien 30,31. Por ejemplo, dansilo-alanina, una molécula con grupos superficiales comparables con perlas de poliestireno, se midió para tener una entropía de hidratación 30 de -0,13 J/(molk) a una temperatura comparable. Escala lineal con su área de superficie mediante el uso de un radio de a = 2 resultados nm en un valor de S hyd = -2500 J/(molKμm 2), de acuerdo con nuestro resultado cualitativo. La entropía de hidratación es un parámetro molécula altamente informativo que es notoriamente difícil de medir, produciendo una aplicación interesante para termodifusión.
Dependencia de la temperatura. Entropías de hidratación S hyd en agua se sabe que aumenta linealmente con la disminución de las temperaturas de 30-32. Como la pendiente de la contribución iónica de S T frente DH λ es con la temperatura de alta precisión insensible para el agua (β (T)/(εT 2)  const), se espera que sólo el intercepto a disminuir a medida que la temperatura global de la cámara se reduce. Este es de hecho el caso, como se ve desde la dependencia de la temperatura de los granos con 1,1 m de diámetro (Figura 9a, T = 6 .. 29 ºC) Inferimos de la intersección S T (λ = 0 DH) que la entropía de hidratación cambia de signo a aproximadamente 20 ºC. Como se observa para el ADN en la Figura 7, la entropía de hidratación puede dominar termodifusión a bajas temperaturas y mover moléculas a la caliente (D <0 T).
Las propiedades de hidratación plomo entropía a un aumento lineal de S T sobre las temperaturas en la concentración de sal fija como midieron para 1.1 micrómetros perlas y ADN (Figura 9b). Normalizamos S T dividiendo con S T (30 ºC) para compensar la superficie molécula. Las pendientes de S T más de temperatura difieren entre los talones y el ADN. Sin embargo, la pendiente no se diferencia entre el ADN de diferente tamaño (50 pares de bases frente a 10000 pares de bases). Sobre la base de la ecuación (2), esto es de esperar ya que la dependencia de la temperatura de la entropía de hidratación solo depende del tipo de superficie de la molécula, no su tamaño. Medimos los coeficientes de difusión de las especies de ADN a la temperatura respectiva de forma independiente. Dentro del error experimental, los cambios en el partido D coeficiente de difusión con el cambio de la viscosidad del agua sin la necesidad de asumir cambios conformacionales de ADN sobre el rango de temperatura. Tenga en cuenta que el cambio del signo del coeficiente de ADN Soret está situado cerca del punto de máxima densidad del agua sólo por casualidad. Allí, el balance de dos contribuciones entrópicos. Para perlas de poliestireno en λ DH = 2 nm, por ejemplo, el cambio de signo se observa a 15 ºC (Fig. 9a). Un aumento del coeficiente de Soret sobre temperatura se informó de soluciones acuosas antes de 3, sin embargo, con una no linealidad distinta que atribuimos al remanente interacciones partícula-partícula.
Tamaño dependencia de las perlas. El coeficiente de Soret se midió para modificado carboxilo perlas de poliestireno de diámetro que van de 20 nm a 2 micrómetros (Molecular Probes, F-8888, M-8795, M-8823, M-8827). Las gotas de un diámetro de 0,2 m, 0,1 m, 0,04 my 0,02 m se diluyeron a concentraciones de 10 pM, 15 pM, 250 pM y 2 nM, y su fluorescencia mayor fue fotografiada con el tiempo para derivar D T y D 13,16 de la el agotamiento y posterior retrodifusión. Los granos más grandes con un diámetro de 1,9 m, 1,1 m y 0,5 m se diluyeron a concentraciones de 3,3 aM, 25 am y las 24:02, y se midió con el seguimiento de 6 sola partícula. Las soluciones fueron amortiguadas en 1 mM Tris pH 7,6 con λ = DH 9.6nm. En todos los casos las interacciones entre las partículas pueden ser excluidas. Se tuvo cuidado de mantener el gradiente de temperatura en el régimen de equilibrio local.
Nos encontramos con que el coeficiente de Soret con las escalas de superficie de las partículas de más de cuatro órdenes de magnitud (Figura 10a). Los datos se describe bien con la ecuación (2) con una densidad de carga de superficie efectiva de m 2 y la contribución hidratación entropía σ eff = 4,500 e/descuidado. El 5 veces demasiado baja predicción para la partícula más pequeño (20 nm de diámetro) se puede explicar por la renormalización de carga desde su radio es más pequeño que DH λ.
El coeficiente de difusión D para las esferas está dada por la relación de Einstein y escala inversamente con el radio D  1/a. Inserción de la ecuación (2) en S T = D T/D, se espera que el coeficiente de termodifusión D T a escala con un radio de la partícula. Esto se confirma experimentalmente más de dos órdenes de magnitud (Figura 10b). Estos hallazgos contradicen la nuestra de varios estudios teóricos que declaran que la D T debe ser independiente del tamaño de partícula 17-20,27, basado en resultados experimentales ambiguas de fraccionamiento campo térmico de flujo (ThFFF) 4 que fueron probablemente sesgada por thermodiffusion no lineal en grandes gradientes térmicos.
Dependencia del tamaño del ADN. Mientras que las perlas de poliestireno comparten una distribución de tamaño muy estrecha como una característica común con las moléculas de ADN, las perlas son un sistema modelo mucho menos complicado. Las perlas son esferas rígidas que interactúan con el disolvente únicamente en su superficie. Además, las cargas residen en la superficie donde la proyección tiene lugar. Por lo tanto, el hallazgo de que la termodifusión de ADN flexible y cargado homogéneamente se describe igualmente bien descrito con la ecuación (2) no se espera fácilmente y es bastante interesante (figura 10c, d).
Se mide el tamaño del ADN con 50 pares de bases con respecto a 48502 pares de bases en tampón TRIS 1 mM
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(λDH = 9-6 nm) a bajas concentraciones de moléculas entre 1 µM (50 pb) y 1 nM (48502 pb). Únicamente una de cada 50 pares de bases se tiñó con el colorante fluorescente TOTO-1. El coeficiente de difusión se midió por retrodifusión después de que el láser se apagara y depende de la longitud L del ADN de una forma no trivial. Los datos se ajustan bien con una escala de radio hidrodinámico una  L 0-75. Esta escala representa un medio efectivo de más de dos regímenes de ADN de longitud. Para las moléculas de ADN más largo que aproximadamente 1000 pares de bases, una escalada de 0,6 se encontró mientras que 33 más corta de ADN se escala con un exponente de  1 (ver material complementario).
Podemos describir el coeficiente de Soret medido más de tres órdenes de magnitud de ADN con longitudes de la ecuación (2) si se supone que la carga efectiva de la DNA está protegido en la superficie de una esfera con el radio hidrodinámico a. Debido a la concentración de sal baja (λ DH = 9,6 nm), tal blindaje globular es razonable. No sólo es con la raíz cuadrada de su longitud predijo
correctamente basa en la ecuación (2) , También el coeficiente de Soret se describe completamente en una manera cuantitativa (Figura 10C, línea continua), con una carga efectiva de 0,12 E por base, a juego bien con la bibliografía valores 34 que van desde 0,05 e/pb a 0,3 e/pb.
Como se muestra en la Figura 10d, el coeficiente de termodifusión para el ADN cae con la longitud de ADN de acuerdo con D T= TDS  Q 2/ef un 3  L 2/L 2.25  LT -0.25. Por lo tanto, el ADN más corto en realidad se desplaza más rápido en un gradiente de temperatura de ADN más larga. Es importante señalar que este resultado está en contradicción con los resultados experimentales de un D T constante en toda la longitud del polímero en entornos no acuosos 9. De acuerdo con la ecuación (1), el parámetro relevante termodinámico es el coeficiente de Soret, determinado por la energética de solvatación. El argumento de que los polímeros tienen que desacoplar en monómeros para mostrar una constante D T simplemente se convierte en el caso especial en que la energética de solvatación determinan tanto S T y D con igual pero invertida escala de tamaño. De acuerdo con nuestro argumento local de energía de equilibrio, S T y T D no domina thermodiffusion también para polímeros no acuosos cerca de una transición vítrea 35. Aquí, St es constante, mientras que la escala D T y D de acuerdo con un aumento de la fricción. Sin embargo, para un sistema de ADN en solución, donde van a largo blindaje parejas los monómeros, un D constante T sobre la longitud de polímero no se puede suponer a priori (Figura 10d).
Carga efectiva. El FEP efectiva la carga Q es un parámetro de gran importancia para la ciencia de coloides, la biología y la biotecnología. Hasta ahora sólo se podía deducir de la electroforesis, restringido a partículas más pequeñas que la longitud de Debye (a≤3λ DH) 36. Por desgracia, muchos coloides están fuera de este régimen. Como se muestra antes, una restricción de tamaño similar no se cumple para thermodiffusion. En muchos casos, hyd la entropía de hidratación s aporta menos del 15% (Figura 8) y se puede despreciar a niveles moderados de sal. Así, podemos invertir la ecuación (2) para obtener la carga Q eff eficaz para moléculas esféricas de
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La carga efectiva derivada de las mediciones thermodifftision de perlas de poliestireno y el ADN se representa en la figura 11 sobre varios órdenes de magnitud en tamaño. La carga efectiva de perlas de escala de forma lineal con la superficie de la partícula con una pendiente de confirmar la densidad de carga superficial efectiva de σ ef = 4500 e/m 2 que se infiere de la electroforesis sólo para partículas pequeñas. Promedio de las desviaciones de la escala lineal están por debajo del 8% (Figura 11a). La carga efectiva inferido a partir de mediciones thermodifftision de ADN utilizando la ecuación (3) escalas linealmente con la longitud de ADN con una carga efectiva de 0,12 e por par de bases. La escala de longitud se confirmó más de cuatro órdenes de magnitud con un error promedio de 12% (Figura 11b). Por lo tanto thermodifftision puede utilizarse para inferir la carga efectiva con errores bajas para una amplia gama de tamaños de partículas. Esto es aún más interesante para la caracterización de biomoléculas ya que las mediciones de thermodifftision se pueden realizar todo de forma óptica en volúmenes picolitros.
Conclusión. Describimos thermodifftision, la deriva a lo largo de gradientes de temperatura molécula, en líquidos con una teoría general, microscópico. Aplicado a soluciones acuosas, esta teoría predice thermodifftision de perlas de ADN y de poliestireno con una precisión media de 20%. Experimentalmente validar dependencias principales parámetros de la teoría: la linealidad y la longitud de detección λ DH y el área hidrodinámico molécula A, la dependencia cuadrática en la carga y la linealidad efectiva frente a la temperatura. Las mediciones de thermodifftision pueden ser miniaturizados a escala del micrón con la técnica de fluorescencia totalmente óptico utilizado y permite diferencias de temperatura microscópicas para manipular moléculas en base a sus propiedades de superficie (Figura 7). La descripción teórica permite extraer la entropía de solvatación y la carga eficaz de las moléculas y partículas en un amplio rango de tamaño.
Control de la temperatura por infrarrojos. Los gradientes de temperatura utilizadas para inducir movimientos thermodiffusive fueron creados por la absorción acuosa de un láser infrarrojo de longitud de onda a 1480 nm y 25 mW de potencia (Furukawa). El agua absorbe fuertemente a esta longitud de onda con una longitud de atenuación de k = 320 micrómetros. El rayo láser se centró moderadamente con una lente de 8 mm de distancia focal.
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