ES2607649T3 - Ensayo para biomarcadores predictivos de la eficacia antiestrogénica - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para identificar un tumor tratable con un antiestrógeno, antagonista del receptor de estrógeno o inhibidor de aromatasa, que comprende: a) exponer las células cancerosas o un espécimen de tejido tumoral que contiene células cancerosas obtenidas de un paciente a un anticuerpo antirreceptor de estrógeno en las condiciones apropiadas para la unión del anticuerpo a los receptores de estrógeno en los núcleos de las células cancerosas; y b) detectar la presencia o ausencia de unión focal del anticuerpo a los receptores de estrógeno en los núcleos; donde la presencia de unión focal indica la sensibilidad del tumor al tratamiento con el antiestrógeno, antagonista del receptor de estrógeno o inhibidor de aromatasa y la ausencia de unión focal indica la falta de sensibilidad del tumor al tratamiento con el antiestrógeno, el antagonista del receptor de estrógeno o el inhibidor de aromatasa.

Description

DESCRIPCION

Ensayo para biomarcadores predictivos de la eficacia antiestrogenica.

5 CAMPO TECNICO

La presente invencion se refiere a biomarcadores asociados a la sensibilidad de los antiestrogenos en canceres, metodos para detectar y cuantificar los biomarcadores, y metodos para tratar pacientes de cancer que muestran los biomarcadores.

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ANTECEDENTES

Se utilizan habitualmente biomarcadores pronosticos y predictivos en la gestion clfnica de los pacientes con cancer de mama, y su evaluacion se ha convertido en obligatoria como base para la toma de decisiones terapeuticas. Uno 15 de tales biomarcadores es el receptor de estrogeno (ER), que es un factor de transcripcion nuclear activado por los estrogenos para regular el crecimiento y la diferenciacion de las celulas epiteliales normales de mama. El estrogeno tambien estimula el crecimiento de las celulas tumorales que expresan ERa, y la expresion de ER en tumores es un buen factor pronostico para pacientes de cancer de mama. Sin embargo, la expresion de ERa es tambien altamente predictiva de la sensibilidad tumoral a la intervencion terapeutica con antiestrogenos. Los antiestrogenos incluyen 20 antagonistas directos del receptor (por ejemplo, tamoxifeno y falzodex) e inhibidores de aromatasa (por ejemplo, anastrozol, letrozol y exemestano). Los antiestrogenos representan el mejor tratamiento disponible actualmente para el cancer de mama en el entorno adyuvante. Desafortunadamente, en la actualidad no existe ningun metodo para predecir con exactitud la eficacia de tales terapias adyuvantes para un tumor particular en un paciente particular, ya que el fracaso del tratamiento no es reconocible hasta recafda. Sin embargo, se sabe que en el tratamiento del 25 cancer metastasico y cuando se expresa ER por los tumores, solo el 50 % de estos canceres responde al tratamiento antiestrogeno. Esto indica claramente que, mientras que la ausencia de receptores predice la ausencia de efecto, solo un subconjunto de canceres que expresan ER se beneficiara del tratamiento antiestrogeno.

La expresion de ERa en los tumores se evalua en ensayos inmunohistoqufmicos utilizando anticuerpos marcados 30 dirigidos al receptor, lo que da como resultado una tincion visible. Tfpicamente, los especfmenes de tumor incluidos en parafina fijados con formalina se evaluan bajo visualizacion microscopica directa, y el numero de celulas tenidas se cuantifica como un porcentaje de celulas totales. Existe una variacion significativa en la positividad por este metodo, y los tumores que expresan ERa pueden contener de casi el 0 a casi el 100 % de celulas positivas. Aunque no existe una correlacion real entre la probabilidad de respuesta clfnica a las terapias hormonales y el nivel de 35 expresion ERa, es notable que incluso los tumores que expresan niveles muy bajos (por ejemplo, 1-10 % de celulas positivas) pueden mostrar una respuesta significativa, mientras que tumores negativos a ERa son basicamente totalmente insensibles. Por esta razon, se ha usado generalmente un umbral del 1 % de celulas positivas como la definicion de positividad a ERa.

40 Los ensayos inmunohistoqufmicos que se han descrito anteriormente proporcionan solo una cuantificacion del propio receptor de estrogeno. Es decir, que no tienen en cuenta si se une o no a su ligando en el ADN, el elemento receptor de estrogeno (ERE), o si tiene algun papel funcional. Por lo tanto, los ensayos inmunohistoqufmicos actuales no proporcionan ninguna informacion sobre si el receptor de estrogenos que se detecta tambien esta biologica o transcripcionalmente activado o no. Al igual que otros receptores de esteroides, los receptores de estrogeno estan 45 predominantemente presentes en el nucleo de la celula. En ausencia de union al ERE, el receptor de estrogenos se observa como una tincion difusa nuclear en ensayos de inmunofluorescencia. Los estudios academicos en biologfa experimental han indicado que los receptores nucleares, tal como el receptor de estrogeno, forman agregados nucleares o focos en presencia de ligando que son visibles por microscopfa. Estas estructuras subnuclear tambien pueden denominarse como motas y los nucleos que los contienen como nucleos hipermoteados. Tras la union al 50 ligando el receptor se mueve en la estructura del agregado subnuclear para activar la transcripcion de una amplia diversidad de genes.

Los metodos mas utilizados comunmente en estudios que visualizan la formacion de focos receptores de estrogenos han empleado lfneas celulares transfectadas transitoriamente con ERa etiquetado con protefna verde fluorescente 55 (GFP). Un ensayo disponible en el mercado de este tipo es el ensayo Redistribution® de ERa de Thermo Scientific (Biolmage Products, Lafayette, CO). Este ensayo esta disenado para ensayar compuestos para determinar su capacidad para modular la acumulacion de ERa en focos nucleares usando GFP para controlar la translocacion. Los focos nucleares son detectados y analizados por un algoritmo de analisis de imagenes, revelando el movimiento regulado por ligandos de los receptores de estrogeno transfectados en focos subnucleares. La distribucion nuclear

de los receptores endogenos tambien se ha detectado en lineas celulares utilizando inmunofluorescencia, pero ha habido muy pocos estudios que examinen la distribucion de receptores nucleares en los tejidos primarios humanos o animales. Aunque estos tipos de ensayos son utiles para dilucidar los posibles mecanismos biologicos de la formacion de focos de receptores de estrogeno, no proporcionan ninguna informacion sobre el proceso, como se 5 produce, o su relevancia para la enfermedad en canceres de origen natural. Los informes de reacciones de ER focales observadas en la tincion inmunohistoqufmica de una seccion de tejido o frotis aspiracion con aguja fina son en realidad un artefacto de fijacion inadecuada o heterogeneidad de la tincion en el tejido canceroso. Vease, por ejemplo, M. Nadji y col. (2005) Am. J. Clin. Pathol. 123: 21-27.Tal tincion focal de tejido canceroso heterogeneo puede observarse a bajo aumento y, a diferencia de los focos de ER subnucleares, no se refiere a una estructura 10 molecular especffica.

De hecho, la investigacion academica basica en este campo muestra que los sistemas de modelos disponibles no son representativos de la variabilidad clfnica del cancer. A partir de 2005 se han desarrollado mas de 140 lineas celulares de cancer de mama humano, pero solo aproximadamente un tercio de ellas expresan receptores de 15 estrogeno y/o receptores de estrogeno. Se han desarrollado aproximadamente 50 lineas celulares de raton y solo unos pocos expresar el receptor de estrogeno o el receptor de estrogeno. Por el contrario, en el ambito clfnico el 75 % de las pacientes de cancer de mama tienen tumores que son positivos para los receptores de hormonas. Estas estadfsticas ilustran la insuficiencia de los sistemas modelo in vitro con respecto al desarrollo de metodos mejorados para la seleccion del tratamiento de cancer apropiado para las pacientes de cancer de mama individuales.

20

En los canceres de origen natural, ERa unido al ligando en focos activados activa o inactiva potencialmente miles de genes. Por lo tanto, se ha sugerido que el ensayo inmunohistoqufmico utilizado actualmente para identificar pacientes de cancer de mama positivo a ERa y para determinar si el tratamiento antiestrogeno es apropiado podrfa mejorarse mediante el desarrollo de ensayos que analizan firmas de pronostico y predictivas multigenicas. Este 25 enfoque se basa en el supuesto de que la respuesta a las terapias hormonales es biologicamente demasiado compleja para predecirse con precision midiendo la expresion de un unico gen (es decir, la expresion de solo el ERa). (D. C. Allred, Modern Pathology (2010) 23, S52-S59). Sin embargo, el ensayo de miles de genes para determinar un perfil predictivo o el intento de identificar los que son mas relevantes es una estrategia costosa y a muy largo plazo. Ademas, debido a que el objetivo de los ensayos de receptores de estrogeno es principalmente 30 para determinar que tipos de cancer son propensos a responder al tratamiento con antiestrogenos, y cuales no, el estado de los genes individuales (es decir, activados o suprimidos) es poco probable que sea relevante para el objetivo clfnico de antagonizar los efectos colectivos de estrogenos sobre la biologfa del cancer (vease, por ejemplo, el documento WO2005/028681).

35 Por lo tanto, existe la necesidad de mejorar los ensayos de receptores de estrogeno, incluyendo ensayos de ERa, que pueden identificar con mas precision y sensibilidad pacientes con cancer de mama que son mas propensos a responder a la terapia antiestrogeno. Dichos ensayos definen mejor que pacientes se beneficiaran del tratamiento antiestrogeno. Tambien hay una clara necesidad de metodos que mejoren la capacidad de identificar tumores positivos a receptores de estrogenos que probablemente se dirijan con mas precision por la terapia antiestrogeno. 40 Un mejor direccionamiento ayuda a evitar un tratamiento innecesario y al desarrollo de estrategias de tratamiento mas relevantes. Por ejemplo, si se sabfa que los antiestrogenos de antemano a son ineficaces en un tumor en particular (particularmente en un tumor que es positivo a ERa por metodos convencionales), se evitara un tratamiento innecesario y podran iniciarse otras opciones de tratamiento mas rapidamente con mejores resultados esperados. La capacidad para predecir la eficacia antiestrogeno en un tumor particular tambien permitira la seleccion 45 temprana de combinaciones de tratamiento sinergicas, tal como un inhibidor de mTOR (por ejemplo, everolimus).

Tambien existe la necesidad de metodos de ensayo que predicen con mas precision y sensibilidad la eficacia del tratamiento antiestrogeno en pacientes con cancer de mama individuales, porque actualmente no hay medios para saber que el tratamiento ha fallado hasta que el paciente ha recidivado. La capacidad para predecir en su lugar el 50 potencial fracaso del tratamiento antiestrogeno en el momento del diagnostico proporciona un gran valor a la decision de realizar el programa actual de 5 anos de terapia adyuvante con antiestrogenos. Por lo tanto, un conocimiento temprano del potencial fracaso del tratamiento antiestrogeno puede evitar innecesariamente poner al paciente en riesgo de efectos secundarios del tratamiento, tal como el cancer de endometrio, y apoyar las decisiones tempranas para seleccionar estrategias de tratamiento mas adecuadas en un momento en el que las posibilidades 55 de exito son mejores.

La presente invencion satisface estas necesidades. A diferencia de los ensayos de la tecnica anterior, tales como el ensayo Thermo Scientific Estrogen Receptor alpha Redistribution®, la presente invencion proporciona un analisis de focos de ER en el tejido del tumor primario, independientemente de la presencia de un ligando de ER o un farmaco.

En un aspecto, los metodos ejemplares descritos en el presente documento se refieren a la presencia de focos de ER en los nucleos de las celulas en los tumores de origen natural que indican una anomalfa que se puede utilizar para predecir la eficacia en ese paciente de un antiestrogeno que tiene propiedades antagonistas de ER. En otro aspecto, se ha descubierto que la caracterizacion de ER activado de forma constitutiva en la clfnica es un nuevo y 5 util indicador de tumores y canceres que son susceptibles al tratamiento con antiestrogenos.

RESUMEN

Los solicitantes han determinado que las anteriores necesidades en la tecnica para la mejora de los ensayos de 10 receptores de estrogeno (incluyendo ERa) que emplean muestras de tejido de cancer de mama primario se pueden satisfacer mediante ensayos inmunohistoqufmicos o citologicos que distinguen los canceres en los que el receptor de estrogeno se activa biologicamente de aquellos en los que el receptor de estrogeno esta presente pero biologicamente inactivo. Estos ensayos detectan la presencia de focos de eR o agregados en los nucleos de celulas cancerosas (ER biologicamente, transcripcionalmente activo) como una indicacion del estado positivo a ER del 15 tumor, en oposicion al estado negativo a ER indicado por la tincion nuclear difusa (ER biologicamente inactivo) y/o ninguna tincion nuclear. La presencia de ER biologicamente activo proporciona una indicacion de que el receptor de estrogeno que esta presente esta involucrado en la biologfa del tumor y, por lo tanto, es una diana apropiada para la terapia antiestrogeno. Por el contrario, la tincion nuclear difusa de los receptores de estrogeno indica que, aunque el tumor se considerara positivo a ER por metodos convencionales, es poco probable que sea sensible a la terapia 20 antiestrogeno debido al estado biologicamente inactivo del receptor.

Por lo tanto, la presente invencion proporciona un metodo para la identificacion de un subconjunto de tumores positivos a ERcon mas probabilidades de beneficiarse del tratamiento con antiestrogenos, tales como tamoxifeno, falzodex, anastrozol, letrozol y exemestano. La formacion de focos de receptores de estrogeno se ha estudiado en 25 modelos experimentales homogeneos y artificiales. Sin embargo, cada tumor de origen natural es diferente y cada tumor de origen natural es heterogeneo. La importancia clfnica de distinguir las celulas tumorales que expresan el receptor de estrogenos en forma biologicamente activa (es decir, unido a ligando en focos o agregados) a partir de celulas tumorales que expresan un receptor de estrogenos en forma biologicamente inactiva (no unida a ligando y en una distribucion nuclear difusa) no se reconocio previamente. La expresion de receptores de estrogeno 30 biologicamente activos (es decir, transcripcionalmente activos), visualizados como focos dentro de los nucleos de las celulas cancerosas, proporciona una diana potencial para la intervencion por los antiestrogenos y la alteracion de las rutas estimuladas por estrogenos del crecimiento de celulas tumorales. Es decir, en tales celulas tumorales, los antiestrogenos pueden inactivar potencialmente el ligando activado u otro ER activado de forma aberrante. Por el contrario, la expresion de ER transcripcionalmente inactivo, visualizado como una tincion nuclear difusa en la 35 evaluacion inmunohistoqufmica o citologica, indicara que, a pesar de la presencia del receptor de estrogenos en las celulas tumorales, es poco probable que sea una diana apropiada para la intervencion del antiestrogeno. Este enfoque proporcionara un marco racional para la comprension de la eficacia terapeutica del antiestrogeno en los canceres de mama, porque la mayorfa de las pacientes de cancer de mama son postmenopausicas y no se esperara ningun impacto fisiologico del antiestrogeno. La identificacion de los tumores que expresan ER activado de 40 forma aberrante por el fondo biologico patologico proporcionara una justificacion directa y plausible para el tratamiento.

Por lo tanto, los focos de ER en las celulas tumorales pueden servir como un biomarcador para la seleccion de un tratamiento apropiado, incluyendo la decision de si emplear o no antiestrogenos en la terapia adyuvante. El 45 reconocimiento de este biomarcador permite el desarrollo de un ensayo que pueda servir como un indicador de la probabilidad de que una paciente de cancer de mama se beneficie de la terapia con antiestrogenos.

En una primera realizacion, el ensayo de diagnostico es un metodo para la identificacion de pacientes que tienen tumores que expresan ER activado (es decir, focos de ER activados o "AEF"). Estos pacientes tienen mas 50 probabilidades de beneficiarse del tratamiento con un antiestrogeno que los pacientes que no expresan ER activado (tfpicamente visto como una tincion nuclear difusa). La inactivacion de los AEF por un antiestrogeno se puede producir por cualquiera de una diversidad de mecanismos, incluyendo la disociacion de los focos y la inhibicion de la activacion de los focos sin alterar sustancialmente su estructura. Los pacientes que no expresan focos de ER activados (AEF) pueden incluir los que son negativos a los receptores de estrogeno mediante el ensayo 55 convencional, o los que son positivos a los receptores de estrogenos positivos mediante el ensayo convencional. Se cree que cualquier tumor que muestre AEF es un candidato para el tratamiento con este tipo de antiestrogenos, incluyendo el cancer de mama.

En una segunda realizacion, la invencion se refiere a un metodo in vitro para identificar un tumor que se puede tratar

con un farmaco AEF-activo, que comprende:

a) exponer las celulas cancerosas o un especimen de tejido que contiene celulas cancerosas obtenidas de un paciente a un anticuerpo antirreceptor de estrogeno en las condiciones apropiadas para la union del anticuerpo a los

5 receptores de estrogeno en los nucleos de las celulas cancerosas; y

b) detectar la presencia o ausencia de union focal del anticuerpo a los receptores de estrogeno en los nucleos;

donde la presencia de union focal indica la sensibilidad del tumor al tratamiento con el farmaco AEF-activo y la ausencia de union focal indica la falta de sensibilidad del tumor al tratamiento con el farmaco AEF-activo.

10

Se desvela adicionalmente el tratamiento de un paciente positivo para la union focal del anticuerpo con un antagonista del receptor de estrogeno. Sin embargo, se desvela adicionalmente un tratamiento de un paciente positivo para la union focal del anticuerpo con un inhibidor de aromatasa.

15 En otra realizacion mas, la union focal del anticuerpo se detecta en ausencia de union difusa del anticuerpo en los nucleos.

En otra realizacion mas, la union focal del anticuerpo se detecta ademas de la union difusa del anticuerpo en los nucleos.

20

En otra realizacion mas, las celulas cancerosas son celulas de cancer de mama o el especimen de tejido tumoral primario es un especimen de cancer de mama.

En otra realizacion mas, la presencia o ausencia de union focal se detecta por fluorescencia.

25

En otra realizacion mas, la presencia o ausencia de union focal se detecta en una reaccion colorimetrica, tal como una reaccion enzimatica.

En otra realizacion mas, el metodo comprende adicionalmente detectar la presencia o ausencia de union focal de 30 una manera cuantitativa o semi-cuantitativa.

Se desvela un metodo para tratar un tumor, que comprende:

a) exponer las celulas cancerosas o un especimen tisular que contiene las celulas cancerosas obtenidas de un 35 paciente a un anticuerpo antirreceptor de estrogeno en las condiciones apropiadas para la union del anticuerpo a los

receptores de estrogeno en los nucleos de las celulas cancerosas;

b) detectar la presencia o ausencia de union focal del anticuerpo a los receptores de estrogeno en los nucleos; y

c) tratar al paciente con un antiestrogeno AEF-activo si esta presente una union focal.

40 En otra realizacion mas, la invencion se refiere al uso de un antiestrogeno AEF-activo para tratar un tumor, tras la identificacion de la presencia de union focal del anticuerpo antirreceptor de estrogeno a los receptores de estrogeno en los nucleos de las celulas cancerosas.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, la presencia de union focal puede significar que el 1-100 %, 5-100 %, 45 25-100 % o el 50-100 % de los nucleos de las celulas cancerosas muestran union focal.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, cuando la union focal esta presente, la intensidad o la densidad de tal union focal puede cuantificarse.

50 En cualquiera de las realizaciones anteriores, el antiestrogeno AEF-activo puede ser un antagonista receptor o un inhibidor de aromatasa, o el tumor de interes puede ser cancer de mama.

En otra realizacion mas, la invencion proporciona un metodo in vitro para analizar un farmaco antitumoral o candidato de farmaco antitumoral para determinar la actividad de inactivacion de AEF que comprende:

55

a) proporcionar celulas cancerosas o un especimen de tejido tumoral que contiene celulas cancerosas, donde las celulas cancerosas expresan un grado inicial de distribucion focal de AEF y los AEF se tinen de forma detectable con un anticuerpo receptor de estrogeno;

b) exponer las celulas cancerosas o el especimen de tejido tumoral al farmaco antitumoral o el candidato de farmaco

antitumoral; y

c) detectar un descenso en el grado de distribucion focal de los AEF con respecto al valor inicial como una indicacion de la actividad de inactivacion de AEF del farmaco antitumoral o el candidato farmacologico, o no detectar ningun descenso sustancial en el grado de distribucion focal de los AEF con respecto al valor inicial como una indicacion de 5 la falta de actividad de inactivacion de AEF del farmaco antitumoral.

En ciertas realizaciones de metodos para analizar un farmaco antitumoral o farmaco antitumoral candidato para determinar la actividad de inactivacion de AEF, el nivel inicial de AEF puede expresarse como el porcentaje de celulas que muestran AEF o el numero medio de AEF por celula. Un descenso en la tincion detectable de AEF tras 10 la exposicion al farmaco o el farmaco candidato se expresara entonces como un porcentaje reducido de celulas que expresan AEF o un numero medio reducido de AEF por celula con respecto al valor inicial. Como alternativa, una reduccion en el tamano medio de los AEF puede usarse para indicar la actividad de inactivacion de AEF del farmaco o farmaco candidato.

15 En otras realizaciones de los metodos para analizar un farmaco antitumoral o farmaco antitumoral candidato para determinar la actividad de inactivacion de AEF, las celulas cancerosas pueden proporcionarse como una lfnea de celulas cancerosas que expresa un nivel inicial de AEF. Como alternativa, el especimen de tejido tumoral puede ser un especimen de tejido primario o un tejido obtenido de una biopsia.

20 En cualquiera de las realizaciones anteriores, el receptor de estrogenos detectado puede ser un ERa y el anticuerpo antirreceptor de estrogeno usado puede ser un anti-ERa.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

25 La figura 1 ilustra los resultados del Ejemplo 5. La grafica muestra la correlacion del porcentaje de positividad de ER de biopsias de cancer de mama usando metodos convencionales (eje y) con el estado de aEf usando los metodos de la invencion (eje x).

DESCRIPCION DETALLADA

30

Como se usa en el presente documento, los terminos "celulas cancerosas" y "celulas tumorales" son generalmente intercambiables y se refieren a celulas malignas que pueden estar presentes en un tumor solido o que pueden estar circulando en la sangre. El tumor solido puede ser un tumor primario o un tumor metastasico, y cualquier celula cancerosa circulante puede derivarse de cualquier tipo de tumor solido. El analisis de tumores solidos para los fines 35 de la invencion (es decir, el analisis histologico) puede realizarse usando una muestra de biopsia primaria. Como alternativa, las celulas cancerosas o tumorales para el analisis (es decir, el analisis citologico) se pueden obtener por aspiracion con aguja fina de un tumor solido, asf como por la separacion de la sangre.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "tratar un tumor", "tratamiento de un tumor" y similares, se 40 refieren a inhibir la replicacion de las celulas tumorales, inhibir la propagacion del tumor, reducir el tamano del tumor, disminuir o reducir el numero de celulas tumorales en el cuerpo, o mejorar o aliviar los sfntomas de la enfermedad causada por el tumor. Los tumores incluyen canceres. El tratamiento se considera terapeutico si hay un descenso de la mortalidad y/o la morbilidad, o hay una disminucion de la carga de la enfermedad como se puede manifestar por un numero reducido de celulas tumorales en el cuerpo o la disminucion del tamano del tumor.

45

Como se usa en el presente documento, la expresion "receptor de estrogeno" incluye el receptor de estrogenos dimerizado, el receptor ERa y el receptor ERp.

Como se usa en el presente documento, la expresion "antiestrogeno AEF-activo" y sus equivalentes se refieren a un 50 farmaco antiestrogeno que muestra una capacidad para inactivar, disolver o disociar focos de ER activados (AEF) en los nucleos de las celulas, lo que indica que su mecanismo de accion es a traves de la ruta de activacion de ER de la celula. Estos terminos pretenden incluir el receptor de estrogenos dimerizado, asf como el receptor ERa y el receptor ERp.

55 Las expresiones "positivo a AEF", "positivos a focos de ER", "ER activado", "ER en un estado funcional" y similares, se refieren a la presencia de agregados del receptor de estrogeno en los nucleos de las celulas. Estas expresiones pretenden incluir el receptor de estrogenos dimerizado, asf como el receptor ERa y el receptor ERp. Las expresiones incluyen ER patologicamente activado, es decir, ER que puede no activarse por los agonistas fisiologicos habituales, tales como estradiol o tamoxifeno. La identificacion de AEF implica que la activacion es a traves de un mecanismo

anormal.

La expresion "grado de distribucion focal" se refiere al numero relativo de celulas positivas a AEF frente a las celulas totales en una muestra. El grado de distribucion focal puede determinarse cuantitativamente o cualitativamente. En 5 un ejemplo, el grado de distribucion focal se expresa como un porcentaje de celulas positivas a AEF, es decir, el porcentaje de celulas que contienen agregados del receptor de estrogenos (cuantitativo). En un ejemplo alternativo, el grado de distribucion focal puede expresarse en expresiones relativas que describen el numero de celulas que contienen agregados del receptor de estrogenos, tal como "pocos" o "muchos" (cualitativo).

10 Por ejemplo, el uso de un ligando colorimetrico, enzimatico, o radiomarcado tal como un anticuerpo antirreceptor de estrogeno, se puede utilizar para unirse a los receptores de estrogeno en los nucleos celulares. El grado de distribucion focal se puede determinar cuantitativamente, por ejemplo, determinando el numero de celulas que tienen intensidad de color, fluorescencia o radiactividad emitida por el anticuerpo marcado que esta asociado a AEF en lugar de un patron de tincion difusa. El grado de distribucion focal se puede comparar con una muestra de control 15 que no contiene celulas positivas a AEF o que tiene un grado de distribucion focal que se considera por debajo de un umbral inferior usando un microscopio de luz a un aumento apropiado o tecnicas que incluyen, pero sin limitacion, micromatriz de ADN, perfiles de protefnas, radiomarcado, u otros sustitutos para medir focos de ER.

La expresion "patron difuso" se refiere a un patron finamente granular que es indicativo de la ausencia de 20 distribucion focal.

El termino "estrogeno" se refiere a una sustancia estrogenica natural o sintetica que imita algunas o todas las acciones del estradiol, tambien se denomina como moduladores del de estrogeno (ERM) o moduladores selectivos del receptores de estrogeno (SERM).

25

El termino "antiestrogeno" se refiere a una sustancia que inhibe la formacion, transporte, o accion de, o que inactiva los agentes progestacionales, incluyendo, pero sin limitacion, fulvestrant, tamoxifeno, toremifeno, e inhibidores de aromatasa, tales como letrozol, anastrozol, vorozol, exemestano, foremestano y atemestano. Un ERM o SERM puede tener algunas propiedades antiestrogenicas, y puede considerarse un antiestrogeno o un estrogeno 30 dependiendo del contexto de uso.

Un "farmaco AEF-activo" es un farmaco que disocia los AEF o de otro modo reduce el numero, tamano o intensidad de la tincion de los AEF en los nucleos celulares. En un ejemplo, un farmaco AEF-activo causa la conversion de un patron de tincion A o AD en un patron de tincion D en la celula. Los farmacos AEF-activos incluyen antiestrogenos y 35 antagonistas de los receptores de estrogeno, asf como farmacos que presentan actividad contra AEF pero no actuan mediante un mecanismo anti-hormonal.

El termino "anticuerpo" o "anticuerpos" se refiere a una protefna que es capaz de unirse especfficamente a un antfgeno e incluye cualquier sustancia, o grupo de sustancias, que tiene una afinidad de union especffica para el 40 antfgeno al que se dirige, con poca o ninguna afinidad de union por otras sustancias. En general, el termino "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos derivados de seres humanos o animales, anticuerpos humanizados (por ejemplo, porciones sin union derivadas de un ser humano, porciones de union derivadas de un animal) y fragmentos de los mismos.

45 Los terminos "anticuerpo anti-ERa" y "anticuerpo anti-ERp" se refieren a anticuerpos dirigidos a las isoformas alfa y beta del receptor de estrogeno, respectivamente. "Anticuerpo anti-ER" se refiere genericamente a un anticuerpo capaz de unirse a ER. Los anticuerpos especfficos adecuados para su uso de acuerdo con los aspectos en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, los anticuerpos monoclonales anti-ER CONFIRM SP1 de Ventana Medical Systems (Tucson, AZ) y los anticuerpos monoclonales anti-ERa y anti-ERp NOVOCASTRA disponibles en 50 Leica Biosystems (Buffalo Grove, IL).

En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para inhibir el crecimiento de un tumor susceptible a la inhibicion del crecimiento por antiestrogenos mediante la determinacion del grado de union focal del anticuerpo anti-ER en los nucleos de celulas en una muestra de celulas o tejido obtenido de un paciente y que se sospecha que contiene 55 celulas tumorales. Si el grado de distribucion focal es mayor de aproximadamente el 5 %, por ejemplo de aproximadamente del 5 % al 100 %, el 25-100 % o el 50-100 %, un antiestrogeno o se administra al paciente para inhibir el crecimiento del tumor. Los antiestrogenos potencialmente utiles incluyen fulvestrant ((7R,8R,9S,13S,14S,17S)-13-metil-7-[9-(4,4,5,5,5-pentafluoropentilsulfinil)nonil]-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17- decahidrociclopenta[a]fenantren-3,17-diol), Tamoxifeno (2-[4-[(Z)-1,2-difenilbut-1-enil]fenoxi]-N,N-dimetiletanamina),

Toremifeno (2-[4-[(Z)-4-cloro-1,2-difenilbut-1-enil]fenoxi]-N,N-dimetiletanamina), inhibidores de aromatasa, tal como Letrozol (4-[(4-cianofenil)-(1,2,4-triazol-1-il)metil]benzonitrilo), Anastrozol (2-[3-(2-cianopropan-2-il)-5-(1,2,4-tiazol-1- ilmetil)fenil]-2-metilpropanonitrilo), Vorozol (6-[(4-clorofenil)-(1,2,4-triazol-1-il)metil]-1-metilbenzotiiazol), Exemestano ((8R,9S,10R,13S,14S)-10,13-dimetil-6-metiliden-7,8,9,11,12,14,15,16-octahidrociclopenta[a]fenantren-3,17-diona),

5 Foremestano ((8R,9S,10R,13S,14S)-4-hidroxi-10,13-dimetil-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-decahidro-1H-

ciclopenta[a]fenantren-3,17-diona), y Atemestano ((8R,9S,10S,13S,14S)-1,10,13-trimetil-7,8,9,11,12,14,15,16- octahidro-6H-ciclopenta[a]fenantren-3,17-diona)), y combinaciones de los mismos.

En un aspecto, la invencion se refiere a un metodo para identificar un tumor tratable con un farmaco AEF-activo, que 10 comprende:

a) exponer las celulas cancerosas o un especimen de tejido tumoral que contiene celulas cancerosas obtenidas de un paciente a un anticuerpo antirreceptor de estrogeno en las condiciones apropiadas para la union del anticuerpo a los receptores de estrogeno en los nucleos de las celulas cancerosas; y 15 b) detectar la presencia o ausencia de union focal del anticuerpo a los receptores de estrogeno en los nucleos; donde la presencia de union focal indica la sensibilidad del tumor al tratamiento con el farmaco AEF-activo y la ausencia de union focal indica la falta de sensibilidad del tumor al tratamiento con el farmaco AEF-activo.

El ensayo anterior para la union a ER focal proporciona una prueba mas sensible y predictiva que los ensayos de ER 20 convencionales usados actualmente, y la union a ER focal puede identificarse en pacientes clasificados en ensayos de ER convencionales como negativos a ER, asf como aquellos que son convencionalmente positivos a ER. Los pacientes clasificados en ensayos de ER convencionales como negativos a ER, asf como aquellos que son convencionalmente positivos a ER pueden mostrar un resultado positivo para la union nuclear de ER focal y, por lo tanto, pueden considerarse candidatos para el tratamiento con antiestrogenos. La ausencia de focos de ER en 25 pacientes probados convencionalmente como positivos a ER explicara el resultado aparentemente anomalo de que los antiestrogenos son ineficaces en algunos de estos pacientes. Por lo tanto, el metodo de ensayo de la invencion hace del tratamiento hormonal una eleccion eficaz para un mayor numero de pacientes de cancer.

Las celulas cancerosas analizadas en cualquiera de los ensayos para la union focal pueden estar contenidas en una 30 muestra de tejido tumoral tomada directamente de un paciente. Estas muestras se denominan tfpicamente como biopsias primarias, y se pueden derivar de tumores solidos, ya sean primarios o metastasicos (un analisis histologico). Como alternativa, las celulas cancerosas analizadas en cualquiera de los ensayos para la union focal pueden ser celulas cancerosas individuales o pequenos grupos de celulas cancerosas obtenidas, por ejemplo, por aspiracion con aguja de un tumor o por separacion de las celulas cancerosas de la sangre (un analisis citologico). El 35 analisis citologico tiene varias ventajas, incluyendo ser menos invasivo para el paciente y proporcionar un analisis del compartimiento celular relevante sin interferencia de la arquitectura tisular circundante.

Se describen ciertos metodos inmunohistoqufmicos adecuados para su uso en la invencion por M. Nadji, y col. (Am. J. Clin. Pathol. (2005) 123: 21-27) y D. C. Allred (Modern Pathology (2010) 23: S52-S59). A modo de ejemplo, los 40 especfmenes de tejido de biopsia de tumor primario para el analisis se pueden preparar como secciones de parafina del tejido canceroso como se conoce en la tecnica para ensayos de Er convencionales. Si se usan secciones de parafina, la parafina se funde primero calentando los portaobjetos, y se desparafinan con xileno. Los portaobjetos se rehidrataron entonces, en grados descendentes de etanol y se exponen a un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, que se une especfficamente a ERa, ERp, o ambos. La union del anticuerpo se detecta 45 entonces utilizando uno cualquiera de los metodos conocidos en la tecnica para la deteccion de union a anticuerpo. Dado que ERa es un biomarcador de uso comun para el cancer de mama, los anticuerpos que se unen especfficamente a ERa pueden ser mas apropiados para los metodos de la invencion.

Ciertos metodos citologicos adecuados para su uso en la invencion incluyen metodos inmunocitoqufmicos aplicados 50 a los materiales de aspiracion con aguja fina, por ejemplo como se describe por N. H. Hafez, y col. (J. Egyptian Nat. Cancer Inst. (2010) 22: 217-225). Los portaobjetos de citologfa por aspiracion pueden fijarse en alcohol (por ejemplo, alcohol isopropflico al 95 %, 10 min a 18 h) y se tinen para visualizar el receptor de estrogenos. Los portaobjetos fijados pueden exponerse a un anticuerpo primario especffico para el ER, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, que se une a ERa, ERp, o ambos. La union del anticuerpo puede detectarse utilizando uno cualquiera de los 55 metodos conocidos en la tecnica para la deteccion de la union del anticuerpo.

Un metodo apropiado para la deteccion de union de un anticuerpo a su diana es un ensayo colorimetrico, tfpicamente un ensayo colorimetrico enzimatico. Uno de tales metodos emplea peroxidasa para producir un tinte de color visible bajo el microscopio optico. La peroxidasa endogena en el especimen de tejido se bloquea usando

peroxido de hidrogeno y la biotina endogena se bloquea usando un reactivo de bloqueo de la biotina antes de la incubacion con el anticuerpo o anticuerpos. En un ejemplo, la union del anticuerpo primario se sigue del anticuerpo secundario biotinilado que se dirige al anticuerpo primario. La union del anticuerpo secundario se detecta entonces usando avidina o estreptavidina conjugada con peroxidasa, tfpicamente peroxidasa de rabano picante (HRP). El 5 conjugado se anade para unir la enzima al complejo anticuerpo-diana. El ER se visualiza por la conversion enzimatica del sustrato cromogenico 3,3'-diaminobencidina (DAB) en un tinte de color marron en el sitio de localizacion de ER. Si el anticuerpo primario es un anticuerpo de raton, se une posteriormente a una inmunoglobulina anti-raton biotinilada. El especimen citologico o tisular puede contrastarse con verde rapido para aumentar la visibilidad de la mancha de peroxidasa.

10

Como alternativa, se puede utilizar un metodo de fluorescencia para detectar la union del anticuerpo a ER-a, EAR-p o ambos. En este caso, un anticuerpo primario marcado de forma fluorescente se puede unir a la diana de ER y se detecta directamente bajo un microscopio de fluorescencia. Sin embargo, un metodo que emplea la union de un anticuerpo primario no marcado al ER seguido de la union de un anticuerpo secundario marcado por fluorescencia 15 (por ejemplo, inmunoglobulina anti-raton) al anticuerpo primario puede reducir la fluorescencia no especffica. Cualquier marcador fluorescente conocido para su uso en ensayos inmunocitologicos o inmunohistoqufmicos se puede utilizar en los metodos de la invencion, por ejemplo FITC.

Ambos anticuerpos monoclonales y policlonales pueden ser utiles en los presentes metodos. Una lista no exhaustiva 20 de anticuerpos monoclonales adecuados esta disponible en el mercado en Santa Cruz Biotechnology, Inc., que incluye tanto anticuerpos anti-ERa como anti-p (
http://www.scbt.com/table-estrogen_receptor.html)

La union del anticuerpo a ER se detecta tfpicamente por la observacion del portaobjetos tenido con un microscopio optico o un microscopio de fluorescencia segun sea apropiado. La ampliacion es tfpicamente de aproximadamente 25 40X o 50X; sin embargo, para mejorar la sensibilidad para la deteccion de AEF puede ser deseable para evaluar los portaobjetos a aproximadamente 80X o 100X para facilitar el estudio de las estructuras subnucleares. La ampliacion se puede ajustar segun sea necesario, como se conoce en la tecnica, para identificar mas claramente los diversos fenotipos de ER descritos en el presente documento.

30 Las muestras que son aparentemente negativas por microscopfa pueden evaluarse por citometrfa de flujo para detectar la positividad que esta por debajo del umbral de microscopfa de luz o de fluorescencia. Si la citometrfa de flujo indica celulas positivas raras, puede usarse alta microscopfa de aumento (100X-400X, 400X o 900X, por ejemplo, 800X) para estudiar las estructuras subnucleares e identificar los AEF. Sin embargo, si las celulas positivas detectadas por citometrfa de flujo son demasiado raras para ser detectadas de forma fiable por microscopfa para el 35 analisis de AEF, puede usarse un clasificador de celulas activadas por fluorescencia (FACS) para separar las celulas positivas de las celulas en suspension en base a su fluorescencia. Segun se concentran las celulas positivas, pero sin danar por este proceso, se aumenta sustancialmente la fiabilidad y la probabilidad de visualizar con exito los AEF en la evaluacion microscopica posterior.

40 La presencia o ausencia de AEF en los nucleos de celulas tumorales individuales puede detectarse visualmente bajo un microscopio optico o de fluorescencia, o por cualquier otro medio adecuado, tal como fluorescencia o mediciones colorimetricas. Tfpicamente, se usaran medios visuales para la deteccion. Los resultados de la tincion se pueden cuantificar simplemente observando la presencia o ausencia de AEF, o contando el numero o porcentaje de celulas positivas. Como alternativa, las caracterfsticas especfficas de la tincion se pueden cuantificar. Por ejemplo, la 45 deteccion puede incluir la notacion de si la union focal en forma de AEF esta acompanada o no por tincion nuclear difusa, cuantificacion de celulas positivas en numero o porcentaje, y/o cuantificacion de la intensidad o el numero/densidad de AEF. Tamano relativo de AEF tambien se puede utilizar para caracterizar, clasificar y cuantificar. La cuantificacion de la densidad de AEF puede determinarse como el numero medio de focos/celula, o usando una escala arbitraria (por ejemplo, "poca", "moderada" o "mucha"). De forma similar la intensidad puede 50 determinarse usando una escala arbitraria, por ejemplo, baja/media/alta o una escala numerica, tal como 1-5. Tfpicamente, los resultados del analisis del tejido tumoral del paciente se compararan con controles positivos y/o negativos.

Un especimen de tejido citologico o tumoral se juzga como positivo a AEF cuando el grado de distribucion focal es 55 del 1-100 %, 5-100 %, 25-100 % o 50-100 % de las celulas en el especimen que muestran AEF. Dado que la eficacia terapeutica de un farmaco AEF-activo o antiestrogeno tambien puede estar correlacionada con la intensidad de la tincion de AEF o con el numero, el tamano o la densidad de AEF, estos parametros tambien se pueden usar para determinar la sensibilidad del tumor al tratamiento con el farmaco AEF-activo o antiestrogeno. En general, se preve que la sensibilidad del tumor al tratamiento con farmacos AEF-activos o antiestrogenos aumentara con el

grado de distribucion focal (por ejemplo, aumento del numero o porcentaje de celulas positivas, el aumento de intensidad de AEF y/o aumento del numero o tamano de AEF) en las celulas del especimen de tejido citologico o tumoral.

5 Los metodos anteriores para la determinacion de la sensibilidad de un tumor a farmacos AEF-activos o antiestrogenos pueden ser manuales (por ejemplo, deteccion visual usando un microscopio de fluorescencia) o pueden automatizados o semi-automatizados usando metodos para la exploracion rapida, deteccion y cuantificacion de muestras citologicas o tisulares marcadas colorimetricamente o por fluorescencia. Por ejemplo, un sistema de exploracion y analisis totalmente automatizado puede desarrollarse y usarse en la presente invencion. A diferencia 10 del sistema de inmunohistoqufmica cuantitativa (IHC) de ER/PR InScape®, que requiere la seleccion manual de regiones especfficas a analizar, el presente sistema de escaneo y analisis de AEF en los nucleos celulares se disenaran para proporcionar la exploracion automatizada de todo el especimen y el analisis del especimen tenido de inmunohistoqufmica especffico de antfgeno. El reconocimiento de imagenes creara una imagen digital de toda la seccion de tejido tenida. Un algoritmo informatico especffico del antfgeno analizara despues los resultados de la 15 imagen digital que representa todo el especimen. Para su uso en los metodos de la invencion, el software distinguira focos de tincion de fondo difusa en el nucleo, y medira la intensidad de la fluorescencia y el tamano de los focos en una base celula por celda o grupo por grupo, repitiendo el proceso para cada celula o grupo sobre todo el especimen. Estos metodos automatizados daran como resultado una mejor precision mediante la realizacion de una funcion que no es posible de forma manual, con un coste reducido. La completa automatizacion tambien hara la 20 prueba accesible para los centros medicos no expertos.

Los presentes metodos para determinar la sensibilidad de un tumor a los farmacos AEF-activos o antiestrogenos permiten a los medicos identificar un subconjunto de pacientes con tumores que son mas susceptibles de beneficiarse de dicho tratamiento. Es decir, mediante la clasificacion en primer lugar del tumor como positivo a AEF 25 o negativo a AEF en el metodo de diagnostico, el medico es capaz de seleccionar el tratamiento mas adecuado para el paciente. Por consiguiente, en otro aspecto, la divulgacion tambien proporciona un metodo para tratar un tumor en un paciente, que comprende:

a) exponer las celulas cancerosas o un especimen de tejido que contiene celulas cancerosas obtenidas del paciente 30 a un anticuerpo antirreceptor de estrogeno en las condiciones apropiadas para la union del anticuerpo a los

receptores de estrogeno en los nucleos de las celulas cancerosas;

b) detectar presencia o ausencia de union focal del anticuerpo a los receptores de estrogeno en los nucleos; y

c) tratar al paciente con un farmaco AEF-activo si esta presente una union focal.

35 Los detalles de la deteccion del grado de distribucion focal (incluyendo la presencia o ausencia de union focal del anticuerpo a los receptores de estrogeno) en los nucleos de las celulas se han analizado anteriormente. La decision de si tratar o no al paciente en base a los resultados del ensayo de diagnostico se basara en el numero/porcentaje, intensidad, tamano y/o densidad de AEF cuando estan presentes. Puede tomarse la decision de tratar al paciente con un farmaco AEF-activo o antiestrogeno cuando el grado de distribucion focal en el ensayo de diagnostico es del 40 1-100 %, 5-100 %, 25-100 % o el 50-100 % de nucleos de las celulas cancerosas. En general, se preve que la eficacia del tratamiento con un farmaco AEF-activo o antiestrogeno aumentara con el aumento del numero o porcentaje de celulas positivas, el aumento de la intensidad de AEF y/o el aumento del numero o el tamano de los AEF en las celulas del especimen de tejido de tumor o muestra de celulas cancerosas. E base a estos parametros, el medico tambien puede determinar la dosificacion, el momento y la duracion del tratamiento. Por consiguiente, en 45 otra realizacion, la invencion se refiere al uso de un antiestrogeno AEF-activo para el tratamiento de un tumor positivo a AEF.

El tumor a identificar o tratar de acuerdo con los metodos anteriores puede incluir cualquier tumor canceroso o no canceroso en el que se producen los AEF, y en el que la presencia de AEF puede determinarse. El tejido tumoral o 50 las celulas cancerosas para el analisis o el tratamiento se pueden seleccionar del grupo que consiste en tejido o celulas de mama, prostata, ovario, endometrio, pulmon y de utero. Dichos canceres incluyen en particular cancer de mama.

El farmaco AEF-activo o antiestrogeno de los metodos de tratamiento anteriores pueden ser cualquier farmaco que 55 tenga la capacidad de inactivar AEF (por ejemplo, disolviendo o disociando los agregados). Tales farmacos incluyen antagonistas de ER y/o inhibidores de aromatasa, pero tambien se incluyen para su uso otros con la capacidad de inactivar AEF como el mecanismo de accion. En ciertos aspectos, el antiestrogeno se selecciona del grupo que consiste de fulvestrant, tamoxifeno, toremifeno, o inhibidores de aromatasa, tales como letrozol, anastrozol, vorozol, exemestano, foremestano, y atemestano, y combinaciones de los mismos.

Aun en otro aspecto, el farmaco AEF-activo o antiestrogeno se administra a un paciente que tiene un tumor positivo a AEF en una cantidad de 10 a aproximadamente 200 mg por dfa dependiendo de la potencia, la biodisponibilidad, y el perfil de seguridad del antiestrogeno seleccionado o combinacion de antiestrogenos. Sin desear quedar ligado a la 5 teona, se cree que mediante la identificacion de pacientes con tumores que son mas susceptibles al tratamiento con antiestrogenos, puede usarse una dosis mas baja del antiestrogeno se puede usar, dando como resultado un menor riesgo de efectos secundarios toxicos. Por lo tanto, un intervalo de dosificacion inferior de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mg se puede utilizar para pacientes que muestran mas del 5 % de union focal de AEF. En un aspecto, la clasificacion altamente positiva a aEf de ER en un tumor puede dar como resultado un regimen de 10 dosificacion diferente a la clasificacion como las celulas de tincion tanto positiva como difusamente de AEF, debido a un mayor grado de activacion en el tumor altamente positivo a AEF. Por el contrario, no se garantiza un patron de tincion predominantemente difuso (que indica ER no activado) indicara que el tratamiento con un farmaco AEF- activo o antiestrogeno.

15 En otro aspecto mas, la invencion proporciona metodos para el cribado de farmacos antitumorales y farmacos antitumorales candidatos para determinar la capacidad de inactivar AEF. Estos metodos son utiles para identificar farmacos AEF-activos adicionales, incluyendo antiestrogenos, que pueden ser candidatos para su uso en el tratamiento de tumores positivos a AEF de acuerdo con los metodos de la invencion. Por consiguiente, el metodo para seleccionar un farmaco antitumoral o farmaco antitumoral candidato para la actividad de inactivacion de AEF 20 comprende:

a) proporcionar celulas cancerosas o un especimen de tejido tumoral que contiene celulas cancerosas, donde las celulas cancerosas expresan un grado inicial de distribucion focal de AEF y los AEF se tinen de forma detectable con un anticuerpo receptor de estrogeno;

25 b) exponer las celulas o el especimen de tejido tumoral al farmaco antitumoral o candidato de farmaco antitumoral; y c) detectar un aumento en el grado de distribucion focal de los AEF con respecto al grado de distribucion focal inicial de los AEF como una indicacion de la actividad de inactivacion de AEF del farmaco antitumoral o el farmaco candidato, o no detectar ningun descenso sustancial en el grado de distribucion focal de los AEF con respecto al grado de distribucion focal inicial de los AEF como una indicacion de la falta de la actividad de inactivacion de AEF 30 del farmaco antitumoral o el farmaco candidato.

En una realizacion alternativa del metodo de seleccion anterior, pueden usarse con fines de comparacion dos espedmenes de tejido de tumor que expresan AEF o dos muestras de celulas cancerosas de expresion de AEF del mismo tumor. En esta realizacion, ambos espedmenes de tejido tumoral o muestras de celulas cancerosas se tinen 35 de forma detectable para determinar los AEF con un anticuerpo antirreceptor de estrogeno, despues, uno de los espedmenes o muestras se expone al farmaco antitumoral o el farmaco antitumoral candidato y el otro no. Si la tincion de los AEF en el especimen o muestra tratada se disminuye en comparacion con el especimen o muestra sin tratar, el farmaco antitumoral o el farmaco antitumoral candidato, el farmaco candidato farmaco antitumoral o antitumoral tiene actividad de inactivacion de AEF. Por el contrario, si la tincion de los AEF en el especimen o 40 muestra tratada no se disminuye en comparacion con el especimen o muestra sin tratar, el farmaco antitumoral o farmaco antitumoral candidato, el farmaco antitumoral o farmaco antitumoral candidato no tiene actividad de inactivacion de AEF. El metodo de seleccion anterior proporcionara mas comprension del mecanismo de accion de antiestrogenos conocidos y antiestrogenos aun por descubrir. Los que son AEF-activos (es decir, tienen actividad de inactivacion de AEF) probablemente seran utiles en el tratamiento de tumores en poblaciones de pacientes 45 identificadas como de tumores positivos a AEF utilizando los metodos de la invencion. Los ejemplos de antiestrogenos que pueden seleccionarse como AEF-activos incluyen cualquiera de los antiestrogenos aprobados para su uso por las autoridades reguladoras y cualquiera de los antiestrogenos no aprobados en el desarrollo.

Si un farmaco antitumoral es negativo para la actividad de AEF en el metodo de seleccion que se ha descrito 50 anteriormente, la falta de capacidad para inactivar AEF se puede interpretar como una indicacion de que el farmaco antitumoral puede ser eficaz en terapia de combinacion con un antiestrogeno AEF-activo debido a la complementariedad de los diferentes mecanismos de accion. Por ejemplo, puede usarse un antiestrogeno AEF- activo en combinacion con el tratamiento hormonal adicional que no actua mediante un mecanismo de inactivacion de AEF (por ejemplo, anti-progestinas) para lograr una mejor eficacia terapeutica en comparacion con cualquier 55 agente en solitario. Como alternativa, puede usarse un antiestrogeno AEF-activo en combinacion con uno o mas agentes quimioterapeuticos convencionales que son negativos para la actividad AEF en el ensayo de seleccion para lograr una mejor eficacia terapeutica en comparacion con cualquier agente en solitario (por ejemplo, everolimus, trastuzumab, TM1-D, farmacos anti-HER2, bevacizumab, o quimioterapia con agentes tales como paclitaxel, docetaxel, taxanos, doxorrubicina, doxorrubicina liposomal, doxorrubicina liposomal pegilada, antraciclinas,

antracenodionas, carboplatino, cisplatino, 5-FU, gemcitabina y ciclofosfamida). Por ejemplo, everolimus es un inhibidor de mTOR que esta indicado en combinacion con un inhibidor de aromatasa y puede, en el futuro, indicarse basado en ERF.

5 En otro aspecto mas, la deteccion de la presencia de distribucion focal del anticuerpo a los AEF en los nucleos se puede usar como una indicacion de que el tumor de un paciente previamente tratado con un farmaco antitumoral, que se ha vuelto resistente a ese medicamento, sigue siendo sensible a un antiestrogeno de inactivacion de AEF. En un aspecto, el metodo se puede adaptar para determinar si la quimiorresistencia de un tumor resultante de la quimioterapia anterior puede invertirse por tratamiento con un antiestrogeno de inactivacion de AEF. La inversion de 10 tal quimiorresistencia puede basarse en los diferentes mecanismos de accion de la quimioterapia anterior y el antiestrogeno de inactivacion de AEF.

Ejemplo 1

15 Se seleccionaron especfmenes tumorales de pacientes con cancer de mama (carcinoma ductal invasivo) y cancer de endometrio de los archivos de Oscar Lambret Cancer Center (Lille, Francia), departamento anatomopatologico. Los pacientes habfan dado el consentimiento para el uso de sus tejidos con fines de investigacion. Se obtuvieron muestras de tejidos de tumor de mama o endometrio que se habfan fijado en fijador de formalina al 4 % y se habfan incluido en parafina.

20

La inmunohistoqufmica (IHC) se realizo en secciones de 3-4 pm de los tejidos de tumor de mama o de endometrio de archivo. Las secciones se desparafinaron, se hidrataron y se lavaron en tampon de trabajo (0,05 mol/l de Tris/HCl, 0,15 mol/l de NaCl, Tween 20 al 0,05 %, pH 7,6, Dako, Dinamarca, codigo S3006). La recuperacion del antfgeno se realizo con la solucion de recuperacion de diana Dako (tampon de citrato modificado, pH 6,1, Dako, 25 Dinamarca, codigo S1699) en un bano de agua a 98 °C durante 20 min. Despues, las secciones se cubrieron con la solucion de bloqueo de peroxidasa Dako para bloquear peroxidos endogenos a temperatura ambiente (TA) durante 5 min (Kit +/HRP de raton (DAB+) Dako EnVision®, Dako, Dinamarca, codigo K4007), se lavo y se incubo con los anticuerpos primarios a las diluciones optimas adecuadas a TA durante 60 min en una camara humidificada (Tabla 1). Tras un lavado de 5 min con tampon de trabajo, el polfmero etiquetado Dako (kit +/HRP de raton (DAB+) Dako 30 EnVision®, Dako, Dinamarca, codigo K4007) se uso para la deteccion de la union del anticuerpo primario a TA durante 30 min. Despues, se uso cromogeno (DAB) con un lote de sustrato a temperatura ambiente durante 510 min y las secciones se contrastaron ligeramente con hematoxilina de Gill.

Los controles negativos se obtuvieron por sustitucion de los anticuerpos primarios con IgG1 de raton de control de 35 isotipo (Tabla 1) o con diluyente de anticuerpo en solitario (control negativo de tampon de lavado) en el procedimiento de tincion inmunohistoqufmica.

Tabla 1. Anticuerpos usados para la inmunohistoqufmica

Anti-ERa

Raton Monoclonal | IgG1 | Clon 6F11 | AbD serotecMCA1799(1 ml)

Recomendaciones: desenmascaramiento: tampon de citrato Dilucion: 1/40 a 1/80 Lote 270412 Exp. NP Conc. entre 10 y 50 mg/

http://www.abdserotec.com/product/6f11-antiestrogen-receptor-alpha-antibody-mca1799.html

Anti-ER

Coneio monoclonal IgG Clon SP1 Thermo ScientificMA1-39540(1 Conejo monoclonal IgG Clon SP1 ml)

Recomendaciones: Desenmascaramiento: Tampon citrato, ebullicion durante 10 min , enfriamiento durante 20 min Dilucion: 1/200, 30 minutos a temperatura

Lote 1574651 Exp. NC Conc. NC

ambiente

http://www.pierce-antibodies.com/Estrogen-Receptor-antibody-clone-SP1-Monoclonal-MA139540.html

40 El analisis de inmunohistoqufmica se realizo con un microscopio Zeiss Axioscope, equipado con una camara digital Imaging Model ROHS. Las senales inmunorreactivas se clasificaron como etiquetado marron inequfvoco de nucleos de celulas tumorales. La intensidad de marcado se definio como 0 para el negativo, + para el debil, ++ para moderado y +++ para fuerte.

45 Ejemplo 2

Las muestras de cancer de mama se analizaron con dos anticuerpos diferentes. Se procesaron 15 muestras para el analisis de inmunohistofluorescencia (IHF) adicional.

5 La inmunohistofluorescencia se realizo con un microscopio de fluorescencia Zeiss equipado con una camara CCD y el software Smart Capture, especffica para la captura de imagenes fluorescentes. La IHF se realizo en secciones de 3-4 pm de los tejidos tumorales de mama de archivo. Las secciones se desparafinaron, se hidrataron y se lavaron en tampon de trabajo (0,05 mol/l de Tris/HCl, 0,15 mol/l de NaCl, Tween 20 al 0,05 %, pH 7,6, Dako, Dinamarca, codigo S3006). La recuperacion del antfgeno se realizo con la solucion de recuperacion de diana Dako (tampon de citrato 10 modificado, pH 6,1, Dako, Dinamarca, codigo S1699) en un bano de agua a 98 °C durante 20 min. Despues, las secciones se incubaron con los anticuerpos primarios a las diluciones optimas adecuadas a TA durante 60 min en una camara humidificada negra (Tabla 2). Despues de un lavado de 5 minutos con tampon de trabajo, se utilizo el anticuerpo secundario apropiado conjugado con Alexa Fluor 488 para la deteccion de la union del anticuerpo primario a TA durante 30 min (IgG anti-raton (H+L), F(ab')2, Senalizacion celular, Estados Unidos, codigo 4408S, 15 dilucion 1: 1000; IgG anti-conejo (H+L), F(ab')2, Senalizacion celular, Estados Unidos, codigo 4412S, dilucion 1:1000). Despues, se lavaron todos los portaobjetos y las cubiertas se cerraron usando Vectashield® Hardset Mounting Medium (Vector Labs, Estadis Unidos, codigo H-1400) y se almacenaron en refrigeracion en la oscuridad hasta su analisis, para conservar la fluorescencia. Los controles negativos se obtuvieron por la sustitucion de los anticuerpos primarios con IgG1 de raton de control de isotipo o suero de conejo (vease la tabla IHC) o con diluyente 20 de anticuerpo en solitario (control negativo de tampon de lavado) en el procedimiento de tincion de inmunohistofluorescencia.

Posteriormente, se analizo una muestra mayor en IHC con el anticuerpo anti-ER alfa.

25 Se procesaron 70 canceres de mama y 20 muestras de cancer de endometrio. Para cada muestra de tumor

etiquetada, se definio la distribucion focal positiva como el porcentaje de celulas tumorales etiquetadas en todo el tejido tumoral, excluyendo las areas necroticas.

Se observaron dos patrones de tincion basicos tras la tincion de muestras de tejidos con anticuerpos anti-ER usando 30 IHC. El primer patron era un patron de color marron, finamente granular y difuso denominado en el presente

documento como "D". El segundo patron era un patron moteado aglomerado que representa un patron de union

focal positiva denominado en el presente documento como "A". Se observaron los mismos dos patrones basicos en las muestras procesadas con IHF. Tanto el patron difuso D como el patron de union focal moteado y aglomerado A observados con IHF eran similares al resultado de IHC. Los patrones difuso D y de union focal A eran similares a los 35 resultados obtenidos en las celulas modificadas geneticamente que expresan un receptor fluorescente cuando no esta presente ningun esteroide o ningun agonista de esteroide. (Arnett-Manfield y col., 2004, 1C Control, 1D y 1E) y en el tejido endometrial humano normal y en cancer de endometrio (Arnett-Manfield y col., 2004, 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F).

40 El patron activo A observado en tejido de tumor incluido en parafina fijado en formalina puede diferir de las imagenes obtenidas en las celulas frescas. Esto se espera porque el tejido de fijacion en formalina y de inclusion en parafina dara como resultado cambios en el contenido celular, dando como resultado asf un patron diferente de ER. Otra diferencia con respecto a las publicaciones de investigacion que utilizaron IHF, se refiere al metodo. En el marco de la investigacion, un microscopio confocal (es decir, que usa dos rayos laser) proporciona imagenes de alta 45 resolucion y tridimensionales. El patron de IHC resultante de una reaccion qufmica que modifica el contenido celular. A diferencia de la IHC, se usa un microscopio de campo amplio tradicional para la lectura de las rodajas de tumor estandar (por ejemplo, 4 micrometros). La tecnica de IHC descrita da como resultado cierta perdida de resolucion.

La tecnica de IHF es qufmicamente menos agresiva para los tejidos tumorales, ya que no altera la arquitectura 50 celular microscopica. La IHF requiere un equipo especializado, un patologo experimentado con la tecnica, y tarda mucho mas tiempo. La IHF no puede acoplarse facilmente con otros analisis patologicos tal como una histologfa estandar que requiere tejidos embebidos en parafina fijados con formalina. Por lo tanto, en un aspecto, la IHC se puede usar como un procedimiento de laboratorio patologico de rutina. En la tecnica de IHC desarrollada usada en el presente documento, secciones de tejido de 4 micrometros (un espesor usado comunmente para el analisis clfnico 55 de rutina) para todos los analisis.

Por lo tanto, se encontraron dos patrones basicos: una tincion nuclear de ER difusa "D" indica una ausencia de ER activados, y la tincion heterogenea "A", donde los agregados, que indican AEF, se pueden reconocer en el nucleo de las celulas. Los focos de ER son visiblemente mas grandes que los elementos de un patron difuso D, que son

sustancialmente mas pequenos.

Ejemplo 3

5 En total, se han identificado tres categorfas o fenotipos de la tincion de ER que se observan a mayor aumento (por ejemplo, 80X). Por el contrario, el aumento estandar (200-400X) se utiliza para la determinacion del estado de ER en una IHC convencional.

Las categorfas (observadas a alto aumento) son:

10

D: Tincion difusa, sin focos de ER (es decir, AEF)

AD: Area que contiene tanto celulas A como D, o que tiene una distribucion heterogenea de focos de ER (AEF) con tamanos menores que los observados en el fenotipo A A Focos grandes (AEF) distribuidos de una manera heterogenea.

15

Se evaluo esta clasificacion (D, AD, y A) en 90 casos (70 cancer de mama y 20 muestras de tejido de cancer de endometrio).

Se analizaron muestras de cancer de mama (61 casos) para la expresion de ER usando tecnicas convencionales. 20 De los 70 casos totales de cancer de mama, siete eran negativos a ER para todos los anticuerpos, y dos tenfan datos que faltaban. La Tabla 2 y la Tabla 3 muestran los resultados del ensayo convencional para el ER en celulas de cancer de mama y de cancer de endometrio, seguido del perfil de AEF respectivo:

25

Tabla 2

Celulas tumorales de cancer de mama positivas para el a

nticuerpo indicado

En Porcentajes

Numero de casos Media Min. Max.

Anti-ER

61 51% 5 % 100 %

Distribucion Focal (Cancer de Mama)

D: 34/61 (56 %) AD: 24/61 (39 %) A: 3/61 (5 %)

Tabla 3

Celulas de cancer endometrial positivas para el anticuerpo indicado

25 casos (14 casos negativos para el anticuerpo ER)

En Porcentajes Numero de casos positivos a ER Media Min. Max.

Anti-ER

11

36 % 5 % 15 %

Distribucion Focal (Cancer endometrial) Tipo D: 4/11

Tipo AD: 7/11_____________________

La seccion siguiente describe las frecuencias de los patrones A, AD, D y N (negativo, sin tincion de ER) en las muestras tumorales evaluadas previamente para determinar la positividad de ER usando metodos convencionales. 30 Todos los casos fueron analizados a gran aumento (100X). Algunos casos de cancer de mama no fueron evaluables. Los metodos convencionales de IHC para determinar el ER no pueden proporcionar informacion sobre el patron de tincion, ya que solo indican la presencia o ausencia de los receptores de hormonas. La expresion de los patrones de ER activados (por ejemplo, A y AD) es heterogenea en los tumores y en diferentes muestras, que es una caracterfstica de los canceres. Por el contrario, el fenotipo D es homogeneo, un patron consistente con la falta 35 de la funcion biologica de ER.

Ejemplo 4

La tasa de positividad a ER para 61 canceres de mama usando metodos convencionales para el analisis fue del 40 51 % con una desviacion estandar del 31 %. Estos tumores se consideraran positivos a ER y el tratamiento con antiestrogeno sera considerado para ser indicado. La positividad a ER tambien se puntuo utilizando una escala de 1 = debil a 3 = fuerte, para medir la calidad de la tincion. Sin embargo, se descubrio que el grado de tincion no estaba relacionado con el estado de ER activado como se muestra en la siguiente tabla:

Tabla 4

Puntuacion de ER

I AER

D AD A Total

1

8 11 1 20

2

17 11 1 29

3

9 2 1 12

Total

34 24 3 61

Ejemplo 5

5 La grafica de la figura 1 muestra el porcentaje de muestras de cancer de mama positivas a ER por metodos

convencionales (porcentaje de celulas tumorales que expresan ER, eje y) en comparacion con los tres patrones de

union (A, AD, y D) para los mismos canceres determinados por metodos de acuerdo con la invencion (eje x). El tumor se considera positivo a ER si mas del 1 % de las celulas son positivas. Normalmente, sin embargo, los medicos utilizan el 10 % de celulas positivas como el lfmite para la decision de administrar un tratamiento

10 antiestrogeno. Como se muestra en la figura 1, los tumores que tienen un estado de ER activado (AEF - A o AD) y

los tumores que tienen un estado de ER no activado (D) tienen ambos una tasa de positividad a ER similar, segun se determina por metodos convencionales, lo que indica que la positividad de ER convencional no predice el estado de AEF de la celula tumoral. Es decir, el valor de la mediana para los tres fenotipos basados en AEF se correlaciona con aproximadamente el 60 % de positividad a ER por metodos convencionales. Estos resultados apoyan la 15 conclusion de que un estado positivo a ER determinado por metodos convencionales no se correlaciona con la presencia de la AEF.

Ejemplo 6

20 La Tabla 5 muestra el porcentaje de celulas tumorales positivas a ER en biopsias de cancer de mama con el tipo AEF: A, AD o D. La figura 1 muestra el porcentaje de positividad para cada tipo de AEF. Se muestra que el tipo A, D, o AD no esta asociado con la tasa de ER convencional. Por lo tanto, los AEF no se predicen por la tasa de tincion de ER estandar.

25 Tabla 5 Porcentaje de celulas que expresan un patron de AEF

Porcentaje de celulas positivas a ER

Tipo AEF

5

AD

5

D

20

D

60

AD

60

D

70

D

100

D

100

AD

90

AD

5

AD

20

AD

5

D

5

D

80

AD

60

AD

40

AD

20

D

80

AD

70

D

70

D

90

AD

70

D

70

D

60

AD

90

D

5

D

5

D

70

D

5

D

50

D

60

D

70

AD

80

D

40

D

70

D

60

A

40

D

60

A

80

A

30

AD

5

AD

80

D

5

AD

80

D

30

D

40

D

30

AD

80

D

90

D

90

AD

30

D

5

AD

5

D

60

D

30

AD

90

D

5

D

50

D

90

AD

AD

30

AD

AD

5

D

Para los canceres endometriales, once casos fueron positivos para ER usando tecnicas convencionales. El porcentaje medio de celulas tumorales positivas a ER fue del 0,6 %, con un mfnimo del 0,05 % y un maximo del 0,15 %. Cuatro de estos tumores mostraron un patron D tras la tincion para AEF, y siete exhiben el patron de tincion 5 A o AD. Los cuatro canceres con el fenotipo D tenfan menos del 10 % de celulas positivas a ER. Los canceres del fenotipo A tenfan hasta el 15 % de celulas positivas con el anticuerpo utilizado. AEF esta presente en una minorfa de los casos. El uso de antiestrogenos en el cancer de endometrio se ve obstaculizado con datos inconsistentes. Es probable que la identificacion del subconjunto correcto de los pacientes de resultados mas fiables e interpretables y ayude a identificar a los pacientes adecuados que se beneficiaran de una hormoterapia especffica. Los pacientes 10 con receptores y AEF podrfan beneficiarse de los agentes que alteran los AEF, aquellos con ER inactivado pero presente podrfan beneficiarse de otros agentes endocrinos.

Ejemplo 7

15 Las lfneas de celulas tumorales se cultivan en monocapas, con un medio de cultivo adaptado para cada lfnea, despues de la amplificacion durante 3 dfas. Cada lfnea celular se cultiva en cualquiera de FBS normal o FBS dividido con carbon vegetal. Cada condicion del suero se expone a los factores de crecimiento o las hormonas: Vehfculo, RPMI, Oestradiol 10 nM Progesterona 30 ng/ml (es decir, 100 nM), EGF 10 ng/ml o FGF 2,5 ng/ml. Cada ajuste experimental se complemente con Vehfculo (DMSO), y una sustancia de ensayo antiestrogeno 100 nM o 1

|jM. La viabilidad celular se evalua con exclusion de azul de tripano.

Se ensayan las siguientes lfneas celulares:

Lfnea celular

Tipo Especie Origen

BT-474

Tumor mamario Ser humano ATCCa

CAMA-1

Tumor mamario Ser humano ATCCa

EVSA-T

Tumor mamario Ser humano ATCCa

HCC-1954

Tumor mamario Ser humano ATCCa

MCF-7

Tumor mamario Ser humano ATCCa

MDA-MB-231

Tumor mamario Ser humano ATCCa

T-47D

Tumor mamario Ser humano ATCCa

ZR-75-1

Tumor mamario Ser humano ATCCa

Ishikawa

Cancer endometrial uterino Ser humano ATCCa

HEC-1-A

Cancer endometrial uterino Ser humano ATCCa

5 Para los citobloques, WB y ensayos citotoxicos, las celulas se incubaron en matraces de 75 cm2, matraces de 25 cm2 y placas de 6 pocillos, respectivamente, y se trataron con hormonas y sustancia de ensayo antiestrogenos en T = 0 horas y se trataron de nuevo de forma similar en T = 4 dfas. Para los citobloques y WB, las celulas se recogen en T = 6 horas, T = 4 dfas y T = 7 dfas. Para ensayos citotoxicos, las celulas se observan en T = 7 dfas. El experimento se realiza dos veces con condiciones duplicadas en cada experimento.

10

La actividad citotoxica in vitro de la sustancia de ensayo se revela mediante un ensayo MTS. Para cada afeccion de tratamiento, la relacion entre el factor de crecimiento o afecciones tratadas unicamente con hormonas y control (RPMI) se calcula para mostrar el efecto de la hormona sobre el crecimiento. La relacion de sustancia de ensayo antiestrogeno + factor de crecimiento sobre el factor de crecimiento (o Control) se calcula para estimar un efecto 15 antiestrogeno de la afeccion de referencia.

Los citobloques de celulas incluidas en parafina fijadas con formalina se producen en el momento = 6 horas, 4 dfas y 7dfas. Los bloques de prueba se evaluan con hematina-Eosina Azafran e IHC para los receptores PR. Si la coloracion es demasiado intensa para el analisis nuclear, pueden realizarse portaobjetos HES separados e 20 inmunoqufmica de ER sin fondo.

La IHC se realiza en 3-4 jm. Las secciones se desparafinan, se hidratan y se lavan en tampon de trabajo. La recuperacion de antfgenos se realiza. Despues, las secciones se cubren con la solucion de bloqueo de Peroxidasa Dako para bloquear peroxidos endogenos a temperatura ambiente (TA) durante 5 min, se lavan y se incuban con los 25 anticuerpos primarios a las diluciones optimas adecuadas a TA durante 60 min en una camara humidificada. Tras un lavado de 5 min con tampon de trabajo, el polfmero etiquetado Dako se utiliza para la deteccion de la union del anticuerpo primario a TA durante 30 min. Despues, se realiza el cromogeno (DAB) con lote de sustrato a TA durante 5-10 min y las secciones se contrastan ligeramente con hematoxilina de Gill n.° 2. Los controles negativos se obtienen por sustitucion de los anticuerpos primarios con IgG1 de de raton de control de isotipo (Tabla 1) o con 30 diluyente de anticuerpo en solitario (control negativo de tampon de lavado) en el procedimiento de tincion inmunohistoqufmica. El analisis inmunohistoqufmico se realiza utilizando un microscopio Zeiss Axioscope, equipado con una camara digital o un escaner.

Las senales inmunorreactivas se analizan con un aumento de x40 y se clasifican como un etiquetado marron 35 inequfvoco de nucleos de las celulas de tumor. La intensidad del etiquetado se define como 0 para el negativo, + para debil, ++ para moderado y +++ para fuerte. Se calcula el porcentaje de celulas positivas a tumorales.

La IHC se realiza para ER-a, ER-p y ER. Posteriormente, la morfologfa subnuclear se analiza en un aumento x 100 usando un microscopio y las fotos se escanean a alta resolucion con XY (ref). Como se ha descrito previamente, se 40 describe la morfologfa subnuclear como difusa cuando se observa una tincion difusa o A cuando se observa un patron moteado. La muestra se determina como AD cuando se mezclan las celulas de los tipos D o A.

Se ha descubierto que cuando las celulas expresan el patron de tincion D no hay sensibilidad a la sustancia de ensayo antiestrogeno, incluso si las celulas son positivas a ER por metodos convencionales. Todas las celulas que 45 son sensibles a la sustancia de ensayo antiestrogeno son un patron de tincion A o AD. Tambien se observo que la celula convierte el patron A o AD en el patron D incluso cuando estan creciendo con diversos estfmulos distintos de las hormonas. Esto indica un efecto biologico que no afecta a la viabilidad cuando el estfmulo es de una naturaleza

diferente. En los controles, no hay ningun cambio en AEF presente al inicio.

Se demuestra que el propio ER no es predictivo de un efecto del farmaco, pero la expresion inicial de AEF es predictiva de un efecto del farmaco. Ademas, la conversion de AEF en un estado inactivo indica un evento biologico 5 relevante para el receptor.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   I. Un metodo in vitro para identificar un tumor tratable con un antiestrogeno, antagonista del receptor de estrogeno o inhibidor de aromatasa, que comprende:

   5

   a) exponer las celulas cancerosas o un especimen de tejido tumoral que contiene celulas cancerosas obtenidas de un paciente a un anticuerpo antirreceptor de estrogeno en las condiciones apropiadas para la union del anticuerpo a los receptores de estrogeno en los nucleos de las celulas cancerosas; y

   b) detectar la presencia o ausencia de union focal del anticuerpo a los receptores de estrogeno en los nucleos;

   10

   donde la presencia de union focal indica la sensibilidad del tumor al tratamiento con el antiestrogeno, antagonista del receptor de estrogeno o inhibidor de aromatasa y la ausencia de union focal indica la falta de sensibilidad del tumor al tratamiento con el antiestrogeno, el antagonista del receptor de estrogeno o el inhibidor de aromatasa.

   15 2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente detectar la presencia o ausencia de

   union difusa del anticuerpo a receptores de estrogeno en los nucleos.
2. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, donde la presencia o ausencia de union focal se detecta por fluorescencia o colorimetricamente.

   20
3. 4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la presencia o ausencia de union focal es cuantificada.
4. 5. El metodo de la reivindicacion 4, donde la presencia o ausencia de union focal se expresa como un 25 porcentaje de celulas positivas a los focos de ER activados (AEF).
5. 6. El metodo de la reivindicacion 4, donde la presencia o ausencia de union focal se expresa como una intensidad o densidad relativa de focos de receptores de estrogenos activados.

   30 7. Un metodo para seleccionar el tratamiento farmacologico para un tumor, que comprende:

   a) exponer las celulas cancerosas o un especimen de tejido tumoral que contiene celulas cancerosas obtenidas de un paciente a un anticuerpo antirreceptor de estrogeno en las condiciones apropiadas para la union del anticuerpo a los receptores de estrogeno en los nucleos de las celulas cancerosas;

   35 b) detectar la presencia o ausencia de union focal del anticuerpo a los receptores de estrogeno en los nucleos; y

   c) seleccionar un antiestrogeno, antagonista del receptor de estrogeno o inhibidor de aromatasa para su uso en el tratamiento del tumor si esta presente una union focal.
6. 8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el grado de distribucion focal de AEF en 40 las celulas cancerosas es del 1-1O0 %, 5-100 %, 25-100 % o del 50-100 %.
7. 9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde un antiestrogeno, antagonista del receptor de estrogeno o inhibidor de aromatasa se selecciona para su uso en el tratamiento del tumor.

   45 10. Un antiestrogeno, un antagonista del receptor de estrogeno o un inhibidor de aromatasa para su uso

   en el tratamiento de un tumor previamente identificado como positivo a AEF, donde el estado positivo a AEF del tumor se determina mediante;

   a) exposicion de las celulas cancerosas o un especimen de tejido tumoral que contiene celulas cancerosas 50 obtenidas de un paciente a un anticuerpo antirreceptor de estrogeno en las condiciones apropiadas para la union del

   anticuerpo a los receptores de estrogeno en los nucleos de las celulas cancerosas; y

   b) detectando presencia o ausencia de union focal del anticuerpo a los receptores de estrogeno en los nucleos;

   donde la presencia de union focal indica la sensibilidad del tumor al tratamiento con el antiestrogeno, antagonista del 55 receptor de estrogeno o inhibidor de aromatasa y la ausencia de union focal indica la falta de sensibilidad del tumor al tratamiento con el antiestrogeno, el antagonista del receptor de estrogeno o el inhibidor de aromatasa.

   II. Un antiestrogeno, antagonista del receptor de estrogeno o inhibidor de aromatasa para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, que es un antagonista de ER.
8. 12. Un antiestrogeno, antagonista del receptor de estrogeno o inhibidor de aromatasa para su uso de

   acuerdo con la reivindicacion 10, que es un inhibidor de aromatasa.

   5 13. Un metodo para analizar un farmaco antitumoral o candidato de farmaco antitumoral para determinar

   la actividad de inactivacion de AEF que comprende:

   a) proporcionar celulas cancerosas o un especimen de tejido tumoral que contiene celulas cancerosas, donde las celulas cancerosas expresan un grado inicial de distribucion focal de AEF y los AEF se tinen de forma detectable

   10 con un anticuerpo receptor de estrogeno;

   b) exponer las celulas o especimen de tejido al farmaco antitumoral o el candidato de farmaco antitumoral; y

   c) detectar un descenso en el grado de distribucion focal de los AEF con respecto al valor inicial como una indicacion de la actividad de inactivacion de AEF del farmaco antitumoral o el candidato de farmaco antitumoral, o no detectar ningun descenso sustancial en el grado de distribucion focal de los AEF con respecto al valor inicial como una

   15 indicacion de la falta de actividad de inactivacion de AEF del farmaco antitumoral o el candidato de farmaco antitumoral.
9. 14. El metodo o uso medico de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el anticuerpo antirreceptor

   de estrogenos es anti-ERa.

   20