ES2598878B1 - METHOD AND DEVICE FOR ANALYSIS OF BIOLOGICAL MATERIAL, METHOD OF OBTAINING AND USING THE SAME - Google Patents

Abstract

Método dispositivo para análisis de material biológico, método de obtención y uso del mismo.#Se detalla en este documento un método de fabricación de un dispositivo de detección de material biológico, dispositivo que presenta una serie de micromotores que pueden ser selectivamente funcionalizados y guiados por el interior de un dispositivo microfluídico en el cual se insertan de tal manera que se puede llevar a cabo de detección de aquellos analitos que se requieran de manera rápida y eficaz. El dispositivo hace uso de nanomotores autónomos que se fabrican mediante diversas técnicas de deposición y/o pulverización catódica.Device method for analysis of biological material, method of obtaining and using it. # A method of manufacturing a device for detecting biological material is detailed in this document, a device that presents a series of micromotors that can be selectively functionalized and guided by the inside of a microfluidic device in which they are inserted in such a way that detection of those analytes that are required quickly and efficiently can be carried out. The device makes use of autonomous nanomotors that are manufactured by various deposition and / or sputtering techniques.

Description

OBJETO DE LA INVENCiÓN En este documento se proponen un dispositivo y un método que hace uso de dicho dispositivo para poder llevar a cabo análisis de distintos analitos, preferentemente material biológico. OBJECT OF THE INVENTION This document proposes a device and a method that makes use of said device in order to carry out analyzes of different analytes, preferably biological material.

El objeto de la invención va dirigido al campo de la química analítica, más concretamente a la química analítica basada en microsistemas analíticos constituidos por una serie de microcanales. The object of the invention is directed to the field of analytical chemistry, more specifically to analytical chemistry based on analytical microsystems constituted by a series of microchannels.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN BACKGROUND OF THE INVENTION

La microfl uídica y tecnologías "Iab-on-a-chip" (LOe ) han generado microsistemas analíticos constituidos por una serie de microcanales y reservonas adecuadamente interconectados, que permiten la integración en un dispositivo miniaturizado de las distintas etapas necesarias para llevar a cabo un análisis. Los distintos fluidos pueden ser movidos en su interior mediante la utilización de microbombas y actuadores, o más simplificadamente, mediante flujos electrocinéticos donde el movimiento es fácilmente controlado mediante la aplicación de campos eléctricos. Estos dispositivos LOe se caracterizan por mejorar las propiedades analíticas reduciendo los tiempos de análisis, disminuyendo el consumo de reactivos, muestras y el riesgo de contaminación, consumiendo menos energía, incrementando la fiabilidad, funcionalidad y sensibilidad a través de la automatización, integrando el análisis multiplexado (varios analitos), y especialmente, favoreciendo la portabilidad y por tanto posibilitando el análisis "in-situ". The micro microfl and "Iab-on-a-chip" (LOe) technologies have generated analytical microsystems consisting of a series of suitably interconnected microchannels and reservoirs, which allow the integration into a miniaturized device of the different stages necessary to carry out a analysis. The different fluids can be moved inside by using micropumps and actuators, or more simply, by electrokinetic flows where movement is easily controlled by the application of electric fields. These LOe devices are characterized by improving analytical properties by reducing analysis times, reducing the consumption of reagents, samples and the risk of contamination, consuming less energy, increasing reliability, functionality and sensitivity through automation, integrating multiplexed analysis (several analytes), and especially, favoring portability and therefore enabling "in-situ" analysis.

Los micromotores son vehículos ultra pequeños, diseñados para realizar movimientos mecánicos determinados en respuesta a estímulos específicos. Estos micromotores son capaces de transformar energía química en movimiento. Dentro de ellos, los micromotres catalíticos (microcohetes) actúan como motores impulsados por burbujas. El mecanismo principal de funcionamiento de estos micromotores consiste en la generación de burbujas de oxígeno a partir de la descomposición espontánea de peróxido de hidrógeno en la capa catalítica interna y su eyección a través de la apertura del microcono. Además se caracterizan por su elevada energía propulsora, su control direccional (mediante fuerzas magnéticas) y su capacidad de interacción con analitos diana (pick-up), lo que los hace muy atractivos para diversas aplicaciones tales como la detección "en-chip" en dispositivos LOC. Por tanto, una clara aplicación, se centra en el sensado de los biomarcadores característicos de sepsis neonatal. Para ello, tras su fabricación según se detalla a continuación, serán funcionalizados adecuadamente (anticuerpos específicos de cada analito) para la captura selectiva de las distintas moléculas diana. Micromotors are ultra-small vehicles, designed to perform specific mechanical movements in response to specific stimuli. These micromotors are capable of transforming chemical energy into motion. Within them, catalytic micromotors (micro-rockets) act as motors driven by bubbles. The main mechanism of operation of these micromotors consists in the generation of oxygen bubbles from the spontaneous decomposition of hydrogen peroxide in the internal catalytic layer and its ejection through the opening of the microcono. They are also characterized by their high propellant energy, their directional control (by magnetic forces) and their ability to interact with target analytes (pick-up), which makes them very attractive for various applications such as "on-chip" detection in LOC devices Therefore, a clear application focuses on the sensing of the biomarkers characteristic of neonatal sepsis. To do this, after manufacturing as detailed below, they will be properly functionalized (specific antibodies of each analyte) for the selective capture of the different target molecules.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN DESCRIPTION OF THE INVENTION

En un aspecto de la invención se detalla un método de fabricación de un dispositivo para análisis de material biológico, dispositivo que presenta unos micromotores poliméricos catalíticos que se insertan en el interior de un dispositivo microfluídico y cuya fabricación se lleva a cabo preferentemente mediante electrodeposición sobre moldes de membranas de policarbonato de distintos diámetros de poro por ejemplo (2 IJm o 5 IJm); dicho procedimiento consta de· In one aspect of the invention there is detailed a method of manufacturing a device for analysis of biological material, a device that has catalytic polymeric micromotors that are inserted inside a microfluidic device and whose manufacture is preferably carried out by electrodeposition on molds of polycarbonate membranes of different pore diameters for example (2 IJm or 5 IJm); This procedure consists of

1. one.

Deposición de una capa de oro conductora mediante sputtering (70-80 nm de espesor) en una mebrana de policarbonato dotada de poros, que actuará como electrodo de trabajo y como molde para que el material a depositar en dichas cavidades, polímero conductor, de lugar a las microestructuras como pueden ser los microtubos. A continuación, se ensamblará esta membrana en una celda de electrodeposición, utilizando papel de aluminio como contacto para el electrodo de trabajo. Un hilo de platino y un electrodo Ag/AgCI actuarán como electrodos auxiliar y de referencia, respectivamente. Los poros de la membrana tienen forma esencialmente cilíndrica de distintas secciones transversales o de doble cono unido por sus bases, cuando la membrana presenta 1 micra de diámetro de poro la forma es más cilíndrica. Deposition of a conductive gold layer by sputtering (70-80 nm thick) in a pore-endured polycarbonate membrane, which will act as a working electrode and as a mold for the material to deposit in said cavities, conductive polymer, of place to microstructures such as microtubes. This membrane will then be assembled in an electrodeposition cell, using aluminum foil as a contact for the working electrode. A platinum wire and an Ag / AgCI electrode will act as auxiliary and reference electrodes, respectively. The pores of the membrane have essentially cylindrical shape of different cross-sections or double cone joined by their bases, when the membrane has 1 micron pore diameter the shape is more cylindrical.

2. 2.

Electrodeposición amperométrica del polímero conductor en el interior de los poros de la membrana, a partir de una disolución inicial conteniendo el monómero adecuado para cada aplicación (anilina, pirrol, EDOT) y los aditivos adecuados para favorecer la deposición y solubilización del monómero. Preferentemente se emplearán Amperometric electrodeposition of the conductive polymer inside the pores of the membrane, from an initial solution containing the appropriate monomer for each application (aniline, pyrrole, EDOT) and the appropriate additives to favor the deposition and solubilization of the monomer. They will preferably be used

mezclas de monómeros conteniendo grupos carboxílicos (polipirrol carboxílico) que dotarán a la superficie del micromotor resultante con numerosos grupos carboxílicos expuestos, simplificando su posterior funcionalización con anticuerpos específicos. mixtures of monomers containing carboxylic groups (carboxylic polypyrrole) that will provide the surface of the resulting micromotor with numerous exposed carboxylic groups, simplifying its subsequent functionalization with specific antibodies.

3. 3.

Deposición de diferentes capas catalíticas metálicas en el interior del microtubo resultante. En un primer lugar, se depositará una capa de Pt mediante un método galvanostático, con el objetivo de crear una superficie altamente conductora que favorecerá la posterior deposición de una capa magnética de Ni (mediante amperometría), esencial para el control magnético del micromotor y su orientación adecuada para entre los distintos reservarios del chip propuesto. Por último, se deposita una tercera capa catalítica de Pt esencial para la descomposición del peróxido de hidrógeno y generación de las burbujas de oxígeno necesarias para el movimiento del micromotor. Deposition of different metal catalytic layers inside the resulting microtube. In the first place, a layer of Pt will be deposited by a galvanostatic method, with the aim of creating a highly conductive surface that will favor the subsequent deposition of a magnetic layer of Ni (by amperometry), essential for the magnetic control of the micromotor and its adequate guidance for the different reserves of the proposed chip. Finally, a third catalytic layer of Pt is deposited, essential for the decomposition of hydrogen peroxide and the generation of oxygen bubbles necessary for the movement of the micromotor.

4. Four.

Liberación de los microrockets de la membrana a través de la eliminación de la capa conductora de oro mediante pulido mecánico con una mezcla de alúmina yagua. A continuación se disolverá la membrana con diclorometano y los micromotores resultantes se lavarán secuencialmente con isopropanol, etanol yagua destilada; separando los mismos de cada disolución mediante centrifugación. Release of the membrane microrockets through the removal of the conductive layer of gold by mechanical polishing with a mixture of alumina and water. The membrane will then be dissolved with dichloromethane and the resulting micromotors will be washed sequentially with isopropanol, ethanol and distilled water; separating them from each solution by centrifugation.

Una vez constituidos los micromotores, y en función de sus aplicaciones en el campo del análisis de material biológico se procede a una funcionalización de los micromotores que no contengan grupos carboxílicos en su superficie, por incorporación de una capa de oro mediante sputtering o el recubrimiento de la superficie con nanopartículas de oro utilizando la técnica "Iayer-by-Iayer". Incorporación de los anticuerpos específicos para los distintos biomarcadores en la superficie de los micromotores parcialmente modificada. En esta etapa los micromotores, en buffer salino, se incubarán con los anticuerpos específicos, permitiendo que los grupos amino-éster mencionados anteriormente reaccionen con los grupos amino primarios presentes en la superficie de los anticuerpos. Posteriormente, los grupos reactivos residuales se bloquearan con una disolución de etanolamina. Once the micromotors are constituted, and depending on their applications in the field of biological material analysis, micromotors that do not contain carboxylic groups on their surface are functionalized, by incorporating a layer of gold by sputtering or coating the surface with gold nanoparticles using the "Iayer-by-Iayer" technique. Incorporation of specific antibodies for the different biomarkers on the surface of partially modified micromotors. At this stage the micromotors, in saline buffer, will be incubated with the specific antibodies, allowing the aforementioned amino-ester groups to react with the primary amino groups present on the surface of the antibodies. Subsequently, the residual reactive groups will be blocked with an ethanolamine solution.

En otra posible realización de la invención se propone también el desarrollo de nanohilos Au-Ni-Au, cuya superficie se puede modificar con bioreceptores específicos (Iectinas, antiproteína A) para la interacción selectiva con las bacterias objeto de análisis (Staphylococcus epidermidis, S. haemolylicus, S. saprophylicus). El método de fabricación es el mismo empleado anteriormente, pero en este caso se emplean membranas de alumina de 200 nm de diametro de poro y disoluciones comerciales del metal deseado. El movimiento de estos nanohilos se basa principalmente en el gradiente de presión generado por las ondas de ultrasonidos, que penetran en la parte cóncava final del motor y lo propulsan hacia adelante. Es posible también realizar su guiado dirigido mediante medios magnéticos como puede ser un imán. In another possible embodiment of the invention, the development of Au-Ni-Au nanowires is also proposed, the surface of which can be modified with specific bioreceptors (Iectins, antiprotein A) for selective interaction with the bacteria under analysis (Staphylococcus epidermidis, S. haemolylicus, S. saprophylicus). The manufacturing method is the same as previously used, but in this case, 200 nm alumina membranes of pore diameter and commercial solutions of the desired metal are used. The movement of these nanowires is mainly based on the pressure gradient generated by the ultrasound waves, which penetrate the final concave part of the motor and propel it forward. It is also possible to conduct guided guidance by magnetic means such as a magnet.

DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica de la misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente: To complement the description that is being made and in order to help a better understanding of the characteristics of the invention, according to a preferred example of practical implementation thereof, a set of drawings is attached as an integral part of said description. where, for illustrative and non-limiting purposes, the following has been represented:

Figura 1. Muestra un esquema de la formación de los microtubos a partir de la membrana porosa. Donde los poros de dicha matriz aparecen simétricos. Figure 1. It shows a scheme of microtube formation from the porous membrane. Where the pores of said matrix appear symmetrical.

Figura 2. Muestra un esquema de la funcionalización de los micromotores. Figure 2. It shows a scheme of micromotor functionalization.

Figura 3. Muestra un esquema del método de análisis de material biológico de un aspecto de la invención. Figure 3. Shows a scheme of the method of analysis of biological material of an aspect of the invention.

REALIZACiÓN PREFERENTE DE LA INVENCiÓN PREFERRED EMBODIMENT OF THE INVENTION

En un primer aspecto de la invención se tiene un método de fabricación de un dispositivo para análisis de material biológico, dicho dispositivo presenta una serie de micromotores (5) que se fabrican mediante deposición una capa de material conductor, preferiblemente oro y de un espesor comprendido entre 70 nm y 80 nm, mediante pulverización catódica sobre una membrana (4) porosa que actúa como matriz y comprende una pluralidad de poros (41) tal y como la que se aprecia en la In a first aspect of the invention there is a method of manufacturing a device for analysis of biological material, said device has a series of micromotors (5) that are manufactured by deposition a layer of conductive material, preferably gold and of a thickness comprised between 70 nm and 80 nm, by sputtering on a porous membrane (4) that acts as a matrix and comprises a plurality of pores (41) as seen in the

figura 1, membrana (4) porosa que está destinada a actuar como molde o matriz para material depositado y como electrodo de trabajo. Figure 1, porous membrane (4) that is intended to act as a mold or matrix for deposited material and as a working electrode.

El resultado del paso anterior se ensambla en una celda de electrodeposición, utilizando papel de aluminio como contacto para el electrodo de trabajo; donde un hilo de platino y un electrodo de Ag/AgCI actúan como electrodos auxiliar y de referencia, respectivamente, para proceder a una electrodeposición amperométrica de un polímero conductor en el interior de al menos uno de los poros (41) de la membrana The result of the previous step is assembled in an electrodeposition cell, using aluminum foil as a contact for the working electrode; where a platinum wire and an Ag / AgCI electrode act as auxiliary and reference electrodes, respectively, to proceed with an amperometric electrodeposition of a conductive polymer inside at least one of the pores (41) of the membrane

(4) actuando como molde para generar al menos un microtubo (3), pudiendo tener los poros (41 ) de la membrana (4) una forma esencialmente cilíndrica de distintas secciones transversales, forma bicónica o forma de doble cono unido por sus bases. Dicha electropolimerización amperométrica se lleva a cabo a partir de una disolución inicial comprendiendo: un monómero que se selecciona de entre anilina, pirrol y EDOT, y aditivos para favorecer la deposición y solubilización del monómero. El monómero puede comprender grupos carboxílicos , expuestos en superficie del micromotor (5), simplificando una posterior funcionalización con anticuerpos específicos. (4) acting as a mold to generate at least one microtube (3), the pores (41) of the membrane (4) having an essentially cylindrical shape of different cross sections, biconic shape or double cone shape joined by their bases. Said amperometric electropolymerization is carried out from an initial solution comprising: a monomer that is selected from aniline, pyrrole and EDOT, and additives to favor deposition and solubilization of the monomer. The monomer may comprise carboxylic groups, exposed on the surface of the micromotor (5), simplifying subsequent functionalization with specific antibodies.

Una vez se tiene el microtubo (3) se procede a depositar diferentes capas (31 ,32,33) metálicas en el interior del microtubo (3 ), más concretamente se realiza una deposición de una primera capa (31 ) mediante un método galvanostático en las paredes interiores del microtubo (3), que comprende Pt, con el objetivo de crear una superficie altamente conductora para posteriormente realizar una deposición sobre la primera capa (31 ) de una segunda capa (32), que se realiza mediante amperometría, segunda capa (32) que es magnética y comprende Ni, para a continuación llevar a cabo una deposición sobre la segunda capa (32) de una tercera capa (33) que es catalítica y comprende Pt. Once you have the microtube (3) proceed to deposit different metal layers (31, 32,33) inside the microtube (3), more specifically a deposition of a first layer (31) is performed by a galvanostatic method in the inner walls of the microtube (3), which comprises Pt, with the aim of creating a highly conductive surface to subsequently make a deposition on the first layer (31) of a second layer (32), which is performed by amperometry, second layer (32) which is magnetic and comprises Ni, to then carry out a deposition on the second layer (32) of a third layer (33) which is catalytic and comprises Pt.

Los microtubos (3) se liberan de la membrana (4) mediante: la eliminación de la capa de oro conductora, mediante pulido mecánico con una mezcla de alúmina y agua, y posteriormente mediante disolución de la membrana (4) en diclorometano se liberan los micromotores (5). The microtubes (3) are released from the membrane (4) by: removing the conductive gold layer, by mechanical polishing with a mixture of alumina and water, and subsequently by dissolving the membrane (4) in dichloromethane the micromotors (5).

Una vez se tienen micromolores (5) fabricados, éstos se pueden lavar secuencialmente y favorecer su dispersión en medio acuoso mediante tratamiento con disoluciones de polaridad intermedia, en el siguiente orden: i) isopropanol, ii) etanol, ¡ii) agua, para posteriormente proceder a separar los micromotores (5) de cada disolución mediante centrifugación. Los micromotores (5), para realizar su función en el dispositivo de analisis, pueden ser funcionalizados como se aprecia en la figura 2 mediante deposición sobre el micromotor (5) de una capa de oro para posteriormente incorporar anticuerpos específicos para los distintos biomarcadores en la superficie de los micromotores (5) parcialmente modificada, y producir un bloqueo de grupos reactivos residuales mediante una disolución de etanolamina. Once micromolors (5) are manufactured, they can be washed sequentially and favor their dispersion in aqueous medium by treatment with solutions of intermediate polarity, in the following order: i) isopropanol, ii) ethanol, ii) water, for later proceed to separate the micromotors (5) from each solution by centrifugation. The micromotors (5), to perform their function in the analysis device, can be functionalized as shown in Figure 2 by deposition on the micromotor (5) of a gold layer to subsequently incorporate specific antibodies to the different biomarkers in the surface of the micromotors (5) partially modified, and produce a blockage of residual reactive groups by means of an ethanolamine solution.

Con los micromotores (5) fabricados se procede a insertarlos en un dispositivo microfluídico (2) que a su vez comprende canales (21 ) Y pocillos (221 ,222,223) obteniendo así un dispositivo de análisis que comprende el citado dispositivo microfluídico (2) y los micro motores (5) en su interior. With the micromotors (5) manufactured, they are inserted into a microfluidic device (2) which in turn comprises channels (21) and wells (221, 222,223) thus obtaining an analysis device comprising said microfluidic device (2) and the micro motors (5) inside.

En un segundo aspecto de la invención se tiene un dispositivo para análisis de material biológico obtenible según el método del primer aspecto de la invención , dicho dispositivo comprende el dispositivo microfluídico (2) y los micromotores (5) en su interior. In a second aspect of the invention there is a device for analysis of biological material obtainable according to the method of the first aspect of the invention, said device comprises the microfluidic device (2) and the micromotors (5) inside.

Un tercer aspecto de la invención es el uso del dispositivo para análisis de material biológico del dispositivo del segundo aspecto de la invención para reconocimiento específico de biomarcadores y bacterias características de sepsis neonalal. A third aspect of the invention is the use of the device for analysis of biological material of the device of the second aspect of the invention for specific recognition of biomarkers and bacteria characteristic of neonalal sepsis.

Este tercer aspecto de la invención se detalla a continuación a modo de ejemplo de la misma. Se describe un ejemplo de realización de la presente invención en reconocimiento específico de biomarcadores y bacterias características de sepsis neonatal que se centra en la determinación de reactantes de fase aguda y bacteriológicas. Estos incluyen los niveles de proteína C reactiva (PCR), procalcitonina (PCT), citoquinas (lL-6), así como la determinación de bacterias del grupo estafilococo coagulasa negativo (Staphylococcus epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus), gérmenes más frecuentemente relacionados con esta infección. This third aspect of the invention is detailed below by way of example thereof. An embodiment of the present invention is described in specific recognition of biomarkers and bacteria characteristic of neonatal sepsis that focuses on the determination of acute and bacteriological phase reactants. These include the levels of C-reactive protein (PCR), procalcitonin (PCT), cytokines (I-6), as well as the determination of bacteria of the negative coagulase staphylococcus group (Staphylococcus epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus), germs more frequently related to this infection.

Se proponen tres posibles realizaciones diferentes del tercer aspecto de la invención en función del tipo de detección utilizada, ya sea óptica (fluorimetría) o electroqu ímica (voltamperometría). Todas ellas están basadas en la utilización de micromolores (5) como soporte de inmovilización para una metodología ELlSA, que gracias a su movimiento autónomo y autopropulsado permiten la determinación de compuestos diana en el interior de una plataforma microfluídica sin la necesidad de utilizar el movimiento de fluidos. Three different possible embodiments of the third aspect of the invention are proposed depending on the type of detection used, either optical (fluorimetry) or electrochemical (voltammetry). All of them are based on the use of micromolors (5) as an immobilization support for an ELlSA methodology, which thanks to its autonomous and self-propelled movement allow the determination of target compounds inside a microfluidic platform without the need to use the movement of fluids

Una realización preferente del tercer aspecto de la invención viene dada por una detección fluorescente; la cual se basa en la utilización de distintas moléculas fluorescentes (Quantum dots -ODs-) como marcadores específicos de cada ana lito, que emiten radiación electromagnética a distintas longitudes de onda y con gran intensidad. Esto permite una detección simultánea y en un único sistema monocanal de los distintos analitos objeto de análisis. Dicho método de análisis se detalla a continuación de manera esquematizada. A preferred embodiment of the third aspect of the invention is given by a fluorescent detection; which is based on the use of different fluorescent molecules (Quantum dots -ODs-) as specific markers of each analyte, which emit electromagnetic radiation at different wavelengths and with great intensity. This allows simultaneous and single-channel detection of the different analytes under analysis. Said method of analysis is detailed below in a schematic manner.

El análisis implica la utilización de distintas poblaciones de micromotores (5) funcionalizados con anticuerpos, en adelante Ab, específicos de cada una de las moléculas y bacterias que se van a analizar. La inmovilización de los Ab sobre la superficie de los micromotores (5) se llevará a cabo siguiendo alguna de las químicas de reacción publicadas en la bibliografía, ya comentadas en el epígrafe anterior. El análisis está basado en una metodología ELlSA en formato sándwich. The analysis involves the use of different populations of micromotors (5) functionalized with antibodies, hereinafter Ab, specific to each of the molecules and bacteria to be analyzed. The immobilization of the Ab on the surface of the micromotors (5) will be carried out following one of the reaction chemistries published in the literature, already mentioned in the previous section. The analysis is based on an ELlSA sandwich methodology.

1. one.

Esta batería de distintos micromotores (5), donde cada uno de los tipos lleva inmovilizada una molécula de reconocimiento específico del analito diana, es añadida a un primer pocillo (221), denominado pocillo de reconocimiento, junto a un mínimo volumen de muestra (nL-IJL), además del "combustible" necesario para el movimiento del micromotor que pueden ser disoluciones acuosas comerciales de peróxido de hidrogeno (1-10%). Gracias a este movimiento autónomo y autopropulsado, dichos micromotores (5) navegarán por la disolución encontrando y uniendo las correspondientes moléculas diana específicas de cada población de micromotor (5). This battery of different micromotors (5), where each type carries a specific recognition molecule of the target analyte immobilized, is added to a first well (221), called the recognition well, together with a minimum sample volume (nL -IJL), in addition to the "fuel" necessary for the movement of the micromotor that may be commercial aqueous solutions of hydrogen peroxide (1-10%). Thanks to this autonomous and self-propelled movement, said micromotors (5) will navigate the solution finding and joining the corresponding specific target molecules of each micromotor population (5).

2. 2.

Una vez se han producido los eventos de reconocimiento molecular, se lleva a cabo la orientación y guiado de los micromolores (5), gracias a la utilización de campos magnéticos u otro tipo de inducción como puede ser ultrasonidos, siendo Once the molecular recognition events have occurred, the orientation and guidance of the micromolors (5) is carried out, thanks to the use of magnetic fields or other induction such as ultrasound, being

conducidos a través de los canales (21) y pocillos (221,222,223) de tal manera que se lleva del primer pocillo (221 ) al segundo pocillo (222). conducted through the channels (21) and wells (221,222,223) such that it is taken from the first well (221) to the second well (222).

3. 3.

Una disolución en este segundo pocillo (222), denominado pocillo de marcaje, contiene las distintas poblaciones de Ab secundarios específicos de los diferentes analitos. Cada tipo de Ab secundarios se inmovilizará sobre la superficie de partículas (mesoporosas (41 ) como sílica) que además ca-inmovilizan varias moléculas de un compuesto marcador (QOs de una característica longitud de onda de emisión). De este modo se favorece la amplificación de la señal correspondiente al evento de reconocimiento. Al igual que en el apartado 1, este pocillo contiene el "combustible" necesario para que los micromotores (5) puedan navegar y se favorezca este segundo evento de reconocimiento molecular. A solution in this second well (222), called the labeling well, contains the different specific secondary Ab populations of the different analytes. Each type of secondary Ab will be immobilized on the surface of particles (mesoporous (41) as silica) that also ca-immobilize several molecules of a marker compound (QOs of a characteristic emission wavelength). In this way the amplification of the signal corresponding to the recognition event is favored. As in section 1, this well contains the "fuel" necessary for the micromotors (5) to navigate and this second molecular recognition event is favored.

4. Four.

Del mismo modo que en el apartado 2, se produce el guiado de los micromotores (5) por el microcanal (21 ) hacía un tercer pocillo (223), denominado pocillo de detección. In the same way as in section 2, the micromotors (5) are guided by the microchannel (21) towards a third well (223), called the detection well.

En este tercer pocillo (223), tiene lugar la etapa de detección Es importante remarcar que únicamente llegarán a este tercer pocillo (223) aquellas moléculas fluorescentes (QDs) inmovilizadas en la superficie de los micro motores (5) como consecuencia de la reacción de afinidad a través del analito. Este tercer pocillo (223) contendrá una disolución que producirá la liberación de las moléculas fluorescentes, mediante la ruptura de la unión de estas moléculas con las partículas que los contienen. De este modo, en este tercer pocillo (223) se encontrarán distintas concentraciones de cada uno de los QOs en función de la concentración de cada analito en la muestra. In this third well (223), the detection stage takes place It is important to note that only these third well (223) will reach those fluorescent molecules (QDs) immobilized on the surface of the micro motors (5) as a result of the reaction of affinity through the analyte. This third well (223) will contain a solution that will produce the release of the fluorescent molecules, by breaking the union of these molecules with the particles that contain them. Thus, in this third well (223) different concentrations of each of the QOs will be found depending on the concentration of each analyte in the sample.

La detección fluorescente puede realizarse fácilmente iluminando este tercer pocillo Fluorescent detection can be easily performed by illuminating this third well.

(223) (223)

con una única longitud de onda de absorción, a la que se excitan los distintos QDs, obteniéndose señales diferenciadas de cada uno de los distintos QDs por su emisión característica a distintas longitudes de onda. Para evitar la posible dispersión de radiación por la presencia de los micromotores (5) en disolución, este tercer pocillo with a single absorption wavelength, to which the different QDs are excited, obtaining differentiated signals from each of the different QDs by their characteristic emission at different wavelengths. To avoid possible radiation dispersion due to the presence of micromotors (5) in solution, this third well

(223) (223)

no contendrá combustible por lo que no se moverán y podrán ser fácilmente retenidos en el fondo del tercer pocillo (223) mediante la utilización de un campo it will not contain fuel so it will not move and can be easily retained at the bottom of the third well (223) by using a field

magnético. magnetic.

Otra posible realización del tercer aspecto de la invención es la detección electroquímica, la cual se lleva a cabo de manera muy similar a la realización expuesta anteriormente del tercer aspecto de la invención en el que las moléculas utilizadas para su detección (QOs) son sustituidas por nanopartículas Inanobarras ("nanorods") de distintos metales, tantos como analitos se determinan. En este sentido, los Ab secundarios específicos de cada analito son ca-inmovilizados en las partículas (mesoporosas de sílica) junto a nanopartículas de un determinado metal. Another possible embodiment of the third aspect of the invention is electrochemical detection, which is carried out very similarly to the above-described embodiment of the third aspect of the invention in which the molecules used for its detection (QOs) are replaced by Inanobar nanoparticles ("nanorods") of different metals, as many as analytes are determined. In this sense, the specific secondary Ab of each analyte are ca-immobilized in the particles (silica mesoporoses) together with nanoparticles of a certain metal.

La detección se producirá tras la liberación de las distintas nanopartículas metálicas (un metal diferente por cada analito) y cuya cantidad vendrá dada por la concentración de ana lito en la muestra. Esta detección se realiza mediante una técnica electroquímica de redisolución sobre la superficie de un electrodo incluido en el tercer pocillo (223) o pocillo de detección. The detection will occur after the release of the different metal nanoparticles (a different metal for each analyte) and whose quantity will be given by the concentration of anaphyte in the sample. This detection is carried out by means of an electrochemical technique of redisolution on the surface of an electrode included in the third well (223) or detection well.

En una última posible realización del tercer aspecto de la invención se tiene una determinación enzimática, la cual se lleva a cabo de manera similar a las realizaciones anteriores del tercer aspecto de la invención, cuya diferencia fundamental estriba en la determinación independiente de los distintos biomarcadores. Esto se llevará a cabo en un único microchip que incorpora los canales (21 ) Y sus correspondientes pocillos (221,222,223), como sistemas paralelos para la determinación independiente y multiplexada de los distintos analitos. In a last possible embodiment of the third aspect of the invention there is an enzymatic determination, which is carried out in a manner similar to the previous embodiments of the third aspect of the invention, whose fundamental difference lies in the independent determination of the different biomarkers. This will be carried out in a single microchip that incorporates the channels (21) and their corresponding wells (221,222,223), as parallel systems for the independent and multiplexed determination of the different analytes.

Por tanto, las etapas del procedimiento se repiten para cada uno de los sistemas dedicados a un determinado ana lito y todos ellos incluidos en el mismo dispositivo. Therefore, the steps of the procedure are repeated for each of the systems dedicated to a certain analyte and all of them included in the same device.

1. one.

Ahora, en el primer pocillo (221 ) se añade una única población de micromotores (5) específicos para ese analito particular, junto al volumen de muestra y el combustible para su movimiento. Now, in the first well (221) a single population of micromotors (5) specific for that particular analyte is added, together with the sample volume and the fuel for its movement.

2. 2.

Los apartados 2 y 4 se mantiene igual que en los procedimientos anteriores. Sections 2 and 4 remain the same as in the previous procedures.

3. 3.

Los Ab secundarios (específicos para cada analito y en su sistema correspondiente) son ca-inmovilizados junto a numerosas moléculas de la enzima The secondary Ab (specific for each analyte and in its corresponding system) are ca-immobilized together with numerous enzyme molecules

peroxidasa (HRP) en las partículas (mesoporosas de silica). En este caso la amplificación de la señal se ve aumentada por la utilización de la enzima (por cada molécula de enzima se obtienen un gran número de moléculas de producto) favoreciendo una mejora en la sensibilidad analítica. peroxidase (HRP) in the particles (silica mesoporous). In this case the amplification of the signal is increased by the use of the enzyme (for each enzyme molecule a large number of product molecules are obtained) favoring an improvement in the analytical sensitivity.

5. El pocillo de detección (223) contendrá una disolución del substrato enzimático y mediador electroquímico (HQ), que tras la correspondiente reacción enzimática dará lugar a la formación de un producto electroactivo que puede ser detectado sobre una superficie electródica y será directamente proporcional a la concentración de analilo presente en la muestra. En este caso no es necesaria la liberación de las moléculas de enzima de las partículas de inmovilización, ya que su catálisis no se verá afectada significativamente por dicha inmovilización. Este mismo procedimiento puede llevarse a cabo con detección fluorescente, sustituyendo el mediador electroquímico por un substrato tal como el HPPA (3-p-hydroxyphenylproprionic acid» , cuyo producto de reacción con la enzima peroxidasa (HRP) de lugar a una molécula fluorescente 5. The detection well (223) will contain a solution of the enzyme substrate and electrochemical mediator (HQ), which after the corresponding enzymatic reaction will lead to the formation of an electroactive product that can be detected on an electrode surface and will be directly proportional to the concentration of analyl present in the sample. In this case it is not necessary to release the enzyme molecules from the immobilization particles, since their catalysis will not be significantly affected by such immobilization. This same procedure can be carried out with fluorescent detection, replacing the electrochemical mediator with a substrate such as HPPA (3-p-hydroxyphenylproprionic acid ”, whose reaction product with the enzyme peroxidase (HRP) instead of a fluorescent molecule

Finalmente, en un cuarto aspecto de la invención, tenemos un método de análisis de material biológico que hace uso del dispositivo del segundo aspecto de la invención, dicho método se encuentra representado en la figura 3 donde S es un sustrato (una molécula) que reacciona específicamente con una enzima E y P es un producto generado de esa reacción enzimática que es la molécula que realmente se mide al final basándose en alguna propiedad de la misma (óptica o electroquímica) como en el tercer aspecto de la invención; el método de análisis de material biológico que hace uso del dispositivo del cuarto aspecto de la invención comprende los siguientes pasos: -insertar en el primer pocillo (221) denominado pocillo de reconocimiento un volumen de muestra a analizar, -insertar en el primer pocillo (221) una serie de micromotores (5) que respectivamente comprenden inmovilizada una molécula de reconocimiento específico del ana lito diana para provocar uniones de las correspondientes moléculas diana específicas de molécula de reconocimiento específico del analito diana de micromotor (5), -insertar en el primer pocillo además "combustible" necesario para el movimiento del micromotor (5). -realizar una orientación y guiado del micromotor (5) desde el primer pocillo (221) hasta un segundo pocillo (222) del dispositivo, denominado pocillo de marcaje el cual contiene contiene moléculas secundarias específicas del analito, dicha orientación se Finally, in a fourth aspect of the invention, we have a method of analysis of biological material that makes use of the device of the second aspect of the invention, said method is represented in Figure 3 where S is a substrate (a molecule) that reacts specifically with an enzyme E and P is a product generated from that enzymatic reaction that is the molecule that is actually measured at the end based on some property of it (optical or electrochemical) as in the third aspect of the invention; The method of analysis of biological material that makes use of the device of the fourth aspect of the invention comprises the following steps: - insert a volume of sample to be analyzed in the first well (221), - insert in the first well ( 221) a series of micromotors (5) that respectively comprise immobilized a specific recognition molecule of the target analyte to cause binding of the corresponding specific target molecules of specific recognition molecule of the micromotor target analyte (5), -insert into the first well also "fuel" necessary for the movement of the micromotor (5). -make an orientation and guidance of the micromotor (5) from the first well (221) to a second well (222) of the device, called the marking well which contains specific secondary molecules of the analyte, said orientation is

puede hacer mediante inducción magnética y el guiado mediante propulsión por can be done by magnetic induction and guided by propulsion by

burbujas o ultrasonidos . bubbles or ultrasound.

realizar una orientación y guiado del micromotor (5) desde el segundo pocillo perform an orientation and guidance of the micromotor (5) from the second well

5 (222) hasta un tercer pocillo (223) del dispositivo, denominado pocillo de detección en el cual se produce una detección de concentración de analito presente en la muestra al igual que en el paso anterior, la orientación se puede hacer mediante mediante inducción magnética y el guiado mediante propulsión por burbujas o ultrasonidos. 5 (222) to a third well (223) of the device, called a detection well in which a detection of analyte concentration present in the sample occurs as in the previous step, the orientation can be done by magnetic induction and guided by bubble or ultrasound propulsion.

Claims (14)

REIVINDICACIONES 1.· Método de fabricación de un dispositivo para análisis de material biológico, método caracterizado porque comprende producir un micromotor (5) mediante las siguientes etapas: 1. · Method of manufacturing a device for analysis of biological material, a method characterized in that it comprises producing a micromotor (5) by the following steps:

i. i.

depositar una capa de material conductor mediante pulverización catódica sobre deposit a layer of conductive material by sputtering on

una a

membrana (4) porosa que comprende una pluralidad de poros (41) Y membrane (4) porous that understands  a plurality from pores (41) Y

destinada a actuar como molde para material depositado y como electrodo de intended to act as a mold for deposited material and as an electrode for

trabajo, job,

ii. ii.

ensamblar el resultado del paso anterior en una celda de electrodeposición, assemble the result of He passed previous in a cell of electrodeposition,

utilizando papel de aluminio como contacto para el electrodo de trabajo; donde un using aluminum foil as contact for the working electrode; where a

hilo de platino y un platinum thread and a

electrodo actúan como electrodos auxiliar y de referencia, electrode act as auxiliary and reference electrodes,

respectivamente, respectively,

¡ii. Ii.

realizar una electrodeposición amperométrica de un polímero conductor en el perform a amperometric electrodeposition of a conductive polymer in he

interior de al menos uno de los poros (41) de la membrana actuando como molde inside of at least one of the pores (41) of the membrane acting as a mold

para generar al menos un microtubo (3), to generate at least one microtube (3),

iv. iv.

deposición de diferentes capas (31,32,33) metálicas en el interior del microtubo deposition of different metallic layers (31,32,33) inside the microtube

(3) resultante del paso anterior, donde dicha deposición comprende a su vez: (3) resulting from the previous step, where said deposition includes:

a. to.

depositar una primera capa (31) en las paredes interiores del microtubo deposit a first layer (31) on the inner walls of the microtube

(3), que comprende Pt, con el objetivo de crear una superficie altamente (3), which comprises Pt, with the aim of creating a highly surface

conductora, conductive,

b. b.

depositar sobre la primera capa (31) una segunda capa (32) que es deposit over the first cap (31) a second cap (32) that is

magnética y comprende Ni y magnetic and comprises Ni and

c. C.

depositar, sobre la segunda capa (32), una tercera capa (33), que es deposit on the second layer (32), a third layer (33), which is

catalítica y comprende pt, catalytic and comprises pt,

v. eliminar la capa de material conductor para liberar los microtubos (3) de la membrana (4), v. remove the layer of conductive material to release the microtubes (3) from the membrane (4), vi. disolver la membrana (4) en diclorometano para generar los micromotores (5), e saw. dissolve the membrane (4) in dichloromethane to generate the micromotors (5), and vii. insertar los micromotores (5) en un dispositivo microfluídico (2) que a su vez comprende microcanales (21) conectando pocillos (221,222,223). vii. Insert the micromotors (5) into a microfluidic device (2) which in turn comprises microchannels (21) connecting wells (221,222,223). de material conductor depositada en el paso i es oro. of conductive material deposited in step i is gold. 3.· Método según reivindicación 1 Ó 2 caracterizado por que la capa de material conductor depositada en el paso i tiene un espesor comprendido entre 70 nm y 80 nm. 3. Method according to claim 1 or 2 characterized in that the layer of conductive material deposited in step i has a thickness between 70 nm and 80 nm. 4.-Método según reivindicación 1 caracterizado por que la electrodeposición amperométrica del paso ¡ii se lleva a cabo a partir de una disolución inicial comprendiendo: 4. Method according to claim 1 characterized in that the amperometric electrodeposition of step ¡ii is carried out from an initial solution comprising:

--

un monómero que se selecciona de entre: anilina, pirrol y EDOT, y a monomer that is selected from: aniline, pyrrole and EDOT, and

--

aditivos para favorecer la deposición y solubilización del monÓmero. additives to promote deposition and solubilization of the monomer.

5.-Método según reivindicación 4 caracterizado por que el monómero comprende grupos carboxílicos para que dotar a la superficie del micromotor con grupos carboxílicos expuestos, simplificando una posterior funcionalización con anticuerpos específicos. 5. Method according to claim 4 characterized in that the monomer comprises carboxylic groups to provide the surface of the micromotor with exposed carboxylic groups, simplifying a subsequent functionalization with specific antibodies. 6.~ Método según reivindicación 1 caracterizado por que la deposición de la primera capa 6. Method according to claim 1 characterized in that the deposition of the first layer (31) en las paredes interiores del microtubo (3) se realiza mediante un método galvanostático. (31) on the inner walls of the microtube (3) is performed by a galvanostatic method. 7.~ Método según reivindicación 1 caracterizado por que la deposición de la segunda capa (32) se realiza mediante amperometría. 7. Method according to claim 1 characterized in that the deposition of the second layer (32) is performed by amperometry. 8.~ Método según reivindicación 1 caracterizado por que la eliminación de la capa de material conductor del paso v se lleva a cabo mediante pulido mecánico con una mezcla de alúmina yagua. 8. Method according to claim 1 characterized in that the removal of the layer of conductive material from step v is carried out by mechanical polishing with a mixture of alumina and water. 9.~ Método según reivindicación 1 caracterizado por que adicionalmente comprende: 9. Method according to claim 1 characterized in that it additionally comprises:

• •

lavar los micromotores (5) resultantes secuencialmente y favorecer su dispersión en medio acuoso mediante tratamiento con disoluciones de polaridad intermedia, en el siguiente orden: 1) isopropanol, 2) etanol, 3) agua destilada, y wash the resulting micromotors (5) sequentially and favor their dispersion in aqueous medium by treatment with solutions of intermediate polarity, in the following order: 1) isopropanol, 2) ethanol, 3) distilled water, and

• •

separar los micromotores (5) de cada disolución mediante centrifugación. Separate the micromotors (5) from each solution by centrifugation.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque adicionalmente comprende una funcionalización de al menos uno de Method according to any one of the preceding claims characterized in that it additionally comprises a functionalization of at least one of micromotores (5), mediante: micromotors (5), by:

• •

deposición sobre el micromotor (5) de una capa de oro, deposition on the micromotor (5) of a layer of gold,

• •

incorporación de los anticuerpos específicos para los distintos incorporation of specific antibodies for different

biomarcadores en la superficie de los micromotores (5) parcialmente 5 modificada, y biomarkers on the surface of the micromotors (5) partially modified, and • bloqueo de grupos reactivos residuales mediante una disolución de • blocking of residual reactive groups by dissolving etanolamina. 11.· Método según reivindicación 1 caracterizado por que los poros (41) de la membrana ethanolamine 11. Method according to claim 1 characterized in that the pores (41) of the membrane (4) tienen forma esencialmente cilíndrica de distintas secciones transversales. (4) they have essentially cylindrical shape of different cross sections. 12. Método según reivindicación 1 caracterizado por que los poros (41) de la membrana 12. Method according to claim 1 characterized in that the pores (41) of the membrane (4) tienen forma de doble cono unido por sus bases. (4) They have a double cone shape joined by their bases. 13. Dispositivo para análisis de material biológico obtenible según un cualquiera de 15 las reivindicaciones 1 a 12. 13. Device for analysis of biological material obtainable according to any one of claims 1 to 12.

14. 14.

Uso del dispositivo para análisis de material biológico según reivindicación 13 para reconocimiento especifico de biomarcadores y bacterias características de sepsis neonatal. Use of the device for analysis of biological material according to claim 13 for specific recognition of biomarkers and bacteria characteristic of neonatal sepsis.

15. fifteen.

Método de análisis de material biológico que hace uso del dispositivo descrito en la reivindicación 13, método caracterizado porque comprende: -insertar en un primer pocillo (221) denominado pocillo de reconocimiento un volumen de muestra a analizar, Method of analysis of biological material that makes use of the described device in claim 13, a method characterized in that it comprises: - insert in a first well (221) called a recognition well a volume of sample to analyze,

25 -insertar en el primer pocillo (221) una serie de micromotores (5) que respectivamente comprenden inmovilizada una molécula de reconocimiento específico del analito diana para provocar uniones de las correspondientes moléculas diana específicas de molécula de reconocimiento específico del analito diana de micromotor 25 - inserting into the first well (221) a series of micromotors (5) that respectively comprise immobilized a specific recognition molecule of the target analyte to cause binding of the corresponding specific target molecules of specific recognition molecule of the micromotor target analyte (5), (5), 30 -insertar en el primer pocillo una disolución acuosa de peróxido de hidrogeno necesaria para el movimiento del micromotor (5), -realizar una orientación y guiado del micromotor (5) desde el primer pocillo (221) hasta un segundo pocillo (222) del dispositivo, denominado pocillo de marcaje el cual contiene contiene moléculas secundarias específicas del analito, y rea lizar una orientación y guiado del micromotor (5) desde el segundo pocillo 30 - insert into the first well an aqueous solution of hydrogen peroxide necessary for the movement of the micromotor (5), - perform an orientation and guidance of the micromotor (5) from the first well (221) to a second well (222) of the device, called the labeling well which contains specific secondary molecules of the analyte, and provides guidance and guidance of the micromotor (5) from the second well (222) hasta un tercer pocillo (223) del dispositivo. denominado pocillo de detección en el cual se produce una detección de concentración de analito presente en la muestra. (222) to a third well (223) of the device. called detection well in which a detection of analyte concentration present in the sample occurs. 16. Método según reivindicación 15 caracterizado por que la orientación y guiado de los micromotores (5) desde los pocillos (221 ,222,223) a través de los canales (21) se lleva a cabo mediante orientación magnética y el guiado mediante propulsión por burbujas o ultrasonidos. 16. Method according to claim 15 characterized in that the orientation and guidance of the micromotors (5) from the wells (221, 222,223) through the channels (21) is carried out by magnetic orientation and guided by bubble propulsion or ultrasound