ES2597841T3 - Detección, identificación y diferenciación de especies de Proteus utilizando la región espaciadora - Google Patents
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Abstract
Un conjunto de al menos dos sondas de polinucleótidos para la detección y/o identificación de especies de Proteus, comprendiendo cada sonda de 5 a 50 nucleótidos e hibridando dichas sondas específicamente en posiciones adyacentes separadas por no más de 25 nucleótidos entre dichas dos sondas en cualquiera de los ácidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 17, su forma de ARN en la que T se sustituye por U, la forma complementaria de las mismas, o polinucleótidos homólogos equivalentes que comparten al menos un 80 % de homología con los correspondientes polinucleótidos no modificados de las SEQ ID NO 1 a 17.
Description
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DESCRIPCION
Deteccion, identificacion y diferenciacion de especies de Proteus utilizando la region espaciadora CAMPO DE LA INVENClON
La presente invencion se refiere a nuevas secuencias de acidos nucleicos derivados de la region ITS (espaciador transcrito interno), entre los acidos ribonucleicos ribosomicos (ARNr) de 16S y 23S o entre los genes de ARNr, que se utilizaran para la deteccion y/o identificacion espedfica de especies de Proteus.
La presente invencion se refiere tambien a un procedimiento para la deteccion y/o identificacion espedfica de especies de Proteus, utilizando nuevas secuencias de acido nucleico derivadas de la region ITS.
Dicha secuencia o procedimiento puede utilizarse para detectar y/o identificar Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y/o Proteus penneri.
ANTECEDENTES DE LA INVENClON
El genero Proteus consiste en 8 especies: P. mirabilis, P. penneri, P. vulgaris, P. myxofaciens y P. hauseri y 3 genomospecies aun no nombradas.
Los miembros del genero Proteus se encuentran comunmente en el medio ambiente, aunque que a menudo tambien forman parte del tracto gastrointestinal. Clmicamente, P. mirabilis es la mas relevante como el organismo mas frecuentemente aislado, aunque las demas especies se pueden encontrar tambien en el ambito clmico.
P. mirabilis representa el 3 % de los aislamientos de infecciones nosocomiales, mientras que ocupa el segundo lugar, despues de Escherichia coli entre los aislamientos de infecciones del tracto urinario comunes y el tercero como agente causante de cistitis, pielonefritis y prostatitis sin complicaciones. P. mirabilis tambien se resena como agente etiologico de aquellas infecciones mortales tales como bacteriemia, meningoencefalitis neonatal, meningitis, empiema y osteomielitis. Ademas, otras infecciones tales como infecciones gastrointestinales y por heridas podnan ser causadas por P. mirabilis y especies relacionadas tales como P. penneri.
P. penneri, asf como P. mirabilis, se mostro que estan implicadas en la formacion de calculos renales, mientras que P. mirabilis se ha resenado como un agente etiopatogenico en la artritis reumatoide.
Actualmente, se identifican y diferencian las especies de Proteus mediante procedimientos basados en el cultivo y las pruebas bioqmmicas fenotipicas.
Una caractenstica tfpica de Proteus es la propiedad de movimiento en enjambre de la bacteria en agar de sangre de oveja. En combinacion con una prueba de oxidasa e indol las diferentes especies de Proteus se pueden diferenciar con exactitud, aunque no todos los casos pueden resolverse de una manera clara por los sistemas tradicionales. Los sistemas actuales disponibles en el mercado no dan una respuesta uniforme y unica en la identificacion y diferenciacion entre especies de Proteus.
Ademas de su resistencia inherente a nitrofurantoma y tetraciclina, la mayona de esas Proteus spp. son, como cepas de tipo silvestre, sensibles a amino/ureidopenicilinas, cefalosporinas, aminoglucosidos y carbapenemos. Sin embargo, informes recientes muestran la aparicion de resistencias contra varios agentes antimicrobianos, entre otros contra los mencionados, en particular en algunos hospitales. Un ensayo de identificacion rapida y espedfica para esos organismos podna constituir la base para una gestion antimicrobiana mas apropiada de las infecciones causadas por estos organismos bacterianos oportunistas tfpicos.
Teniendo en cuenta el creciente numero de infecciones nosocomiales, asf como el aumento de la resistencia al panel existente de agentes antimicrobianos y puesto que las pruebas basadas en el cultivo consumen todavfa mucho tiempo y requieren un alto volumen de trabajo de personal cualificado, se necesitan nuevos procedimientos de identificacion rapida y mas espedfica. En particular en el caso de infecciones graves, como la sepsis nosocomial, un ensayo rapido, espedfico y sensible es obligatorio, ya que es una cuestion de vida o muerte.
La solicitud de patente internacional WO 03/095677 describe unas pocas sondas de los genes de ARNr de 23S e ITS mal caracterizados de P. vulgaris para identificar esta especie espedfica, describiendo por accidente la sonda ATACGTGTTATGTGC de la region ITS.
Se ha dado a conocer un procedimiento para identificar bacterias en una muestra con la especie P. mirabilis del grupo Proteus solo presente mediante la amplificacion de una porcion del ADNr de 23S presente en la muestra en la solicitud de patente internacional WO 00/52203.
Sin embargo existe la necesidad de un procedimiento para identificar no solo si una especie de Proteus esta presente en una muestra, sino tambien el tipo de especie de Proteus que esta presente.
SUMARIO DE LA INVENCION
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Es un objeto de la presente invencion proporcionar nuevas secuencias de acido nucleico derivadas de los ITS de especies de Proteus, que se pueden utilizar para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus. Se proporcionan secuencias derivadas de los ITS de especies de Proteus, en particular de Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y/o Proteus penneri.
La presente invencion proporciona la materia objeto como se expone en todos y cada uno de los (i) a (viii) siguientes:
(i) Un conjunto de al menos dos sondas de polinucleotidos para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus, comprendiendo cada sonda 5 a 50 nucleotidos e hibridando dichas sondas espedficamente en posiciones adyacentes separadas por no mas de 25 nucleotidos entre dichas dos sondas en cualquiera de los acidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 17, su forma de ARN en la que T se sustituye por U, la forma complementaria de la misma o polinucleotidos homologos equivalentes que comparten al menos un 80 % de homologfa con los correspondientes polinucleotidos no modificados de las SEQ ID NO 1 a 17.
(ii) Un conjunto de al menos dos sondas de polinucleotidos como se expone en (i) anterior, en el que dichas sondas se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO 18 a 67.
(iii) Un conjunto de tres sondas de polinucleotidos como se expone en (i) o (ii) anteriores, comprendiendo cada sonda 5 a 50 nucleotidos e hibridando dichas sondas espedficamente en posiciones adyacentes separadas por no mas de 25 nucleotidos entre las sondas adyacentes en cualquiera de los acidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 17, su forma de ARN en la que T se sustituye por U, la forma complementaria de la misma, o polinucleotidos homologos equivalentes que comparten al menos un 80 % de homologfa con los correspondientes polinucleotidos no modificados de SEQ ID NO 1 a 17.
(iv) Una composicion que comprende al menos un conjunto de al menos dos sondas de polinucleotidos como se expone en uno cualquiera de (i) a (iii) anteriores.
(v) Un procedimiento para detectar o identificar especies de Proteus utilizando al menos un conjunto de al menos dos sondas de polinucleotidos como se expone en una cualquiera de (i) a (iii) anteriores, en el que dichas sondas se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO 18 a 67.
(vi) Un procedimiento como se expone en (v) anterior para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus en una muestra que comprende las etapas de:
(i) liberar, aislar y/o concentrar los acidos polinucleicos en la muestra;
(ii) amplificar la(s) region(es) espaciadora(s) de ARNr de 16S-23S, o al menos una de la(s) secuencia(s) diana que comprende(n) cualquier/cualesquiera molecula(s) de acido nucleico como se expone(n) en (i) anterior, con al menos un par de cebadores adecuados;
(iii) poner en contacto los acidos polinucleicos con al menos un conjunto de al menos dos sondas de polinucleotidos que hibridan espedficamente en posiciones adyacentes separadas por no mas de 25 nucleotidos entre sondas adyacentes, seleccionadas dichas sondas del grupo que consiste en las SEQ ID NO 18 a 67;
(iv) detectar los hfbridos formados y
(v) interpretar la(s) senal(es) obtenida(s) y deducir la presencia de especies de Proteus y/o identificar las especies de Proteus en la muestra.
(vii) Un procedimiento como se expone en (v) o (vi) anterior, en el que las dos sondas de polinucleotidos consisten en cualquier combinacion de los polinucleotidos de la Tabla 2.
(viii) Un kit para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus que comprende los siguientes componentes: -un conjunto de al menos dos sondas de polinucleotidos como se expone en uno cualquiera de (i) a (iii) anteriores,
-un tampon de hibridacion, o componentes necesarios para producir dicho tampon;
La presente memoria descriptiva describe una molecula de acido nucleico aislada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 67, sus formas complementarias, la forma de ARN de las mismas en la que T se sustituye por U y homologos.
De acuerdo con la presente memoria descriptiva, dichas moleculas de acido nucleico pueden ser utilizadas para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus.
La presente memoria descriptiva describe nuevos polinucleotidos para uso como sondas y/o cebadores, para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus, en particular de Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, y/o Proteus penneri.
La presente memoria descriptiva describe por tanto una molecula de acido nucleico aislada que hibrida
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espedficamente con una secuencia diana que comprende o que consiste en una molecula de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 18 a 67, sus formas complementarias, la forma de ARN de las mismas en la que T se sustituye por U, secuencias homologas de las mismas y fragmentos de las mismas, para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus.
La presente memoria descriptiva describe ademas conjuntos de sondas para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus, en particular de Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, y/o Proteus penneri en una muestra.
La presente memoria descriptiva tambien describe cebadores que permiten la amplificacion espedfica de la region espaciadora de ARNr de 16S-23S de especies de Proteus, en particular de Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, y/o Proteus penneri.
La presente memoria descriptiva describe ademas una composicion que contiene cualquiera de las nuevas secuencias descritas en esta memoria, o cualquiera de los nuevos conjuntos de sondas y/o cebadores descritos en el presente documento, o una combinacion de los mismos.
La presente memoria descriptiva describe ademas un kit en el que se utilizan dichas sondas y/o cebadores, para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus, en particular de Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y/o Proteus penneri.
La presente memoria descriptiva tambien describe un procedimiento de hibridacion rapido y fiable para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus, en particular de Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y/o Proteus penneri.
La presente memoria descriptiva describe ademas un procedimiento de hibridacion basado en PCR en tiempo real para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus, en particular Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y/o Proteus penneri.
LEYENDAS DE TABLA
Tabla 1: programa de amplificacion y curva de fusion usado en los ejemplos.
Tabla 2: diferentes combinaciones de HybProbes ensayadas
Tabla 3: lista de microorganismos ensayados para determinar la especificidad de la combinacion de HybProbes representadas por las SEQ ID NO 24 y 39.
Tabla 4: lista de las SEQ ID NO 1 a 69.
Las SEQ ID de esta tabla se derivan de los siguientes organismos:
- SEQ ID
- Organismo SEQ ID Organismo
- 1
- P. mirabilis (glu) 25 PROTEUS
- 2
- P. mirabilis (glu) 26 PROTEUS
- 3
- P. mirabilis (glu) 27 P. mirabilis (glu)
- 4
- P. mirabilis (flu) 28 P. mirabilis (glu)
- 5
- P. mirabilis (ile-ala) 29 P. mirabilis (glu)
- 6
- P. mirabilis (ile-ala) 30 PROTEUS
- 7
- P. mirabilis (ile-ala) 31 PROTEUS
- 8
- P. mirabilis (ile-ala) 32 PROTEUS
- 9
- P. mirabilis (ile-ala) 33 PROTEUS
- 10
- P. mirabilis (ile-ala) 34 P. mirabilis (ile-ala)
- 11
- P. vulgaris 35 P. mirabilis (ile-ala)
- 12
- P. vulgaris 36 PROTEUS
- 13
- P. vulgaris 37 P. mirabilis (glu)
- 14
- P. penneri 38 P. mirabilis (glu)
- 15
- P. penneri 39 P. mirabilis (glu)
- SEQ ID
- Organismo SEQ ID Organismo
- 16
- P. penneri 40 PROTEUS
- 17
- P. penneri 41 PROTEUS
- 18
- P. vulgaris (glu) 42 PROTEUS
- 19
- P. vulgaris (glu + ilelala) 43 PROTEUS
- 20
- P. vulgaris (glu + ilelala) 44 PROTEUS
- 21
- P. mirabilis (glu) 45 PROTEUS
- 22
- P. mirabilis (glu) 46 PROTEUS
- 23
- P. mirabilis (glu) 47 PROTEUS
- 24
- P. mirabilis (glu) 48 P. mirabilis
- 49
- PROTEUS 60 P. vulgaris
- 50
- P. vulgaris + P. penneri (glu) 61 PROTEUS
- 51
- P. mirabilis 62 PROTEUS
- 52
- P. vulgaris + P. penneri (glu) 63 PROTEUS
- 53
- PROTEUS 64 PROTEUS
- 54
- P. mirabilis (ilelala) 65 P. mirabilis
- 55
- P. mirabilis (ilelala) 66 P. mirabilis
- 56
- P. vulgaris (ilelala) 67 P. mirabilis
- 57
- P. vulgaris (ilelala) 68 CEBADORES
- 58
- PROTEUS 69 CEBADORES
- 59
- PROTEUS
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Las siguientes definiciones sirven para ilustrar los terminos y expresiones usados en las diferentes formas de realizacion de la presente invencion como se expone mas adelante.
Los terminos "espaciador" e "ITS" (espaciador transcrito interno) son terminos abreviados que hacen referencia 5 ambos a la region entre el ARNr de 16S y de 23S o entre los genes de ARNr 16S y 23S.
El termino "sonda" hace referencia a un oligonucleotido monocatenario o un polinucleotido que tiene una secuencia que es suficientemente complementaria para hibridar con una secuencia diana.
Una secuencia diana es una secuencia a detectarse que comprende cualquier molecula de acido nucleico representada por cualquiera de las SEQ ID NO 1 a 17, su forma complementaria, la forma de ARN de las mismas, 10 homologos o fragmentos de las mismas.
Una secuencia diana puede ser bien ADN genomico o bien ARN precursor, o versiones amplificadas de los mismos.
Preferiblemente, las sondas descritas en el presente documento son aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, o mas de aproximadamente un 95 % homologas al complemento exacto de la secuencia diana.
15 Las sondas descritas en el presente documento se pueden preparar clonando (y cultivando) plasmidos recombinantes que contienen insertos que incluyen las secuencias de nucleotidos correspondientes, si es necesario escindiendo los ultimos de los plasmidos clonados usando las nucleasas adecuadas y recuperandolas, por ejemplo, mediante fraccionamiento de acuerdo con el peso molecular.
Las sondas descritas en el presente documento tambien se pueden sintetizar qmmicamente, por ejemplo mediante 20 el procedimiento de fosfotriester convencional.
El termino acidos nucleicos "complementarios" como se utiliza en el presente documento significa que las
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secuencias de acidos nucleicos pueden formar una doble cadena de bases apareadas perfectamente entre sr
Los terminos "acido polinucleico", "acido nucleico" y "polinucleotido" corresponden a bien ADNc bicatenario o monocatenario o bien ADN o ARN genomico que contiene al menos 5, 10, 15, 20, 30, 40 o 50 nucleotidos contiguos. Se hace tambien referencia a un acido polinucleico, que es menor de 100 nucleotidos de longitud como un "oligonucleotido".
Los polinucleotidos descritos en el presente documento pueden contener tambien nucleotidos modificados tales como inosina o nucleotidos que contienen grupos modificados que no alteran esencialmente sus caractensticas de hibridacion.
Las moleculas de acido polinucleico descritas en el presente documento se representan siempre desde el extremo 5' al extremo 3'. Pueden utilizarse en cualquier forma, es decir en su forma bicatenaria o monocatenaria (cualquiera de las dos hebras), en su forma de ADN o ARN (en la que T se sustituye por U), modificada o no.
El termino "vecino mas cercano" significa el taxon que se sabe que es o que se espera que sea el mas estrechamente relacionado en terminos de homologfa del ADN y que tiene que diferenciarse del organismo de interes.
La expresion "hibridacion espedfica del taxon" o "sonda espedfica del taxon" significa que la sonda solo hibrida con el ADN o ARN del taxon para el que fue disenado y no con ADN o ARN de otros taxones.
El termino taxon puede hacer referencia a un genero completo o a un subgrupo dentro de un genero, una especie o incluso un subtipo dentro de una especie (subespecies, serovares, secuevares, biovares...).
El termino "amplificacion espedfica" o "cebadores espedficos" hace referencia al hecho de que dichos cebadores solamente amplifican la region relevante de los organismos para los que fueron disenados y no de otros organismos.
El termino "amplificacion espedfica de espaciador" o "cebadores espedficos de espaciador" hace referencia al hecho de que dichos cebadores amplifican solo la region espaciadora de los organismos para los que fueron disenados y no de otros organismos.
El termino "sonda espedfica" hace referencia a sondas que solo hibridan con la region correspondiente de los organismos para los que fueron disenados y no con la region correspondiente de otros organismos, ni con ninguna otra region.
El termino "sonda espedfica de espaciador" hace referencia a sondas que solo hibridan con el espaciador relevante de los organismos para los que fueron disenados y no con separadores de otros organismos.
El termino "sensibilidad" hace referencia al numero de falsos negativos: es decir, si 1 de las 100 cepas a detectar se deja pasar, la prueba muestra una sensibilidad de (100-1/100) % = 99 %.
El termino "especificidad" hace referencia al numero de falsos positivos: es decir, si de 100 cepas detectadas, 2 parecen pertenecer a organismos para los que la prueba no esta disenada, la especificidad de la prueba es de (100- 2/100) %= 98 %.
Los oligonucleotidos o polinucleotidos seleccionados como "preferentes" muestran una sensibilidad y una especificidad de mas del 80 %, preferiblemente mas del 90 % y lo mas preferiblemente mas del 95 %.
El termino "soporte solido" puede hacer referencia a cualquier sustrato al que se pueda acoplar una sonda de polinucleotidos, a condicion de que retenga sus caractensticas de hibridacion y a condicion de que el nivel de fondo de hibridacion se mantenga bajo. Habitualmente, el sustrato solido sera una placa de microvaloracion, una membrana (por ejemplo nailon o nitrocelulosa) o una microesfera (perla), sin limitarse a estos ejemplos. Antes de la aplicacion a la membrana o fijacion, puede ser conveniente modificar la sonda de acido nucleico a fin de facilitar la fijacion o mejorar la eficiencia de la hibridacion. Dichas modificaciones pueden englobar prolongacion con homopolfmeros, acoplamiento con diferentes grupos reactivos tales como grupos alifaticos, grupos NH2, grupos SH, grupos carboxflicos, o acoplamiento con biotina, haptenos o protemas.
El termino "marcado" hace referencia al uso de acidos nucleicos marcados. El marcaje se puede llevar a cabo mediante el uso de nucleotidos marcados incorporados durante la etapa de polimerizacion de la amplificacion tal como se ilustra por Saiki et al. (1988) Science 239: 487-491; Gilbertson, et al. ((1990) Mol Cell Probes 4:353-365) o mediante el uso de cebadores marcados, o mediante otro procedimiento conocidos por la persona experta en la tecnica. La naturaleza del marcador puede ser isotopica (33P, 35S, etc.) o no isotopica (biotina, digoxigenina, tinte fluorescente, enzima, etc.).
El termino "senal" hace referencia a una serie de ondas electromagneticas (por ejemplo fluorescencia), o cambios en la corriente electrica que transportan informacion. La senal puede ser directamente visible, o puede hacerse visible y/o interpretable por diferentes medios o dispositivos.
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Una muestra puede comprender cualquier material biologico. Este material biologico puede ser tomado bien directamente del ser humano o animal infectado, o bien despues de cultivo o enriquecimiento, o bien de los alimentos, del medio ambiente, etc.
El material biologico pueden ser por ejemplo esputos de cualquier clase, lavados bronquiales, sangre, tejido cutaneo, biopsias, material de cultivo de linfocitos en sangre, colonias, etc. Dichas muestras pueden prepararse o extraerse de acuerdo con cualquiera de las tecnicas conocidas en la materia.
De acuerdo con la presente memoria descriptiva, las especies de Proteus que son clmicamente relevantes pueden ser Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Proteus penneri.
Diferentes especies de Proteus muestran dos tipos diferentes de espaciador en funcion del tipo de gen de ARNt insertado en la region espaciadora, ARNt glu o ARNt ile-ala. Ademas, para cada tipo de espaciador y para cada especie de Proteus, pueden distinguirse diferentes agrupaciones o grupos.
Por ejemplo, de las nueve cepas de P. mirabilis, teniendo en cuenta el primer tipo de separador, es decir, con la insercion de ARNtglu, podnan definirse cuatro grupos diferentes, representados respectivamente por las SEQ ID NO 1 a 4.
Teniendo en cuenta el segundo tipo, es decir, con la insercion de ARNtile-ala, podnan definirse seis grupos diferentes, representados respectivamente por las SEQ ID NO 5 a 10.
Para detectar y/o identificar todas las especies de Proteus o cada especie de Proteus o cualquier combinacion de al menos dos especies de Proteus, la presente invencion proporciona un conjunto de al menos dos nuevas moleculas de acido nucleico.
Una secuencia de ITS descrita en el presente documento comprende o consiste en una molecula de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 17, sus formas complementarias, la forma de ARN de las mismas en la que T se sustituye por U y cualquier secuencia homologa de las mismas.
Tambien se describen secuencias homologas que se encuentran en el ITS de cualquier especie de Proteus, a las que tambien se hace referencia en lo sucesivo como "homologos". El grado de homologfa es mayor del 80 % u 85 %, preferiblemente mayor del 90 % y mas preferiblemente mayor del 95 %.
"Homologos" pueden ser secuencias homologas de cualquiera de las SEQ ID NO 1 a 17 o de cualquier fragmento de las mismas de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 nucleotidos localizado en la region ITS de cualquier especie de Proteus.
Las SEQ ID NO 1 a 10 derivan de P. mirabilis, las SEQ ID NO 11 a 13 derivan de P. vulgaris y las SEQ ID NO 14-17 de P. penneri.
La presente memoria descriptiva tambien describe nuevas moleculas de acido nucleico derivadas de los ITS para la deteccion de cualquier especie de Proteus, resolviendo los problemas generados por una variabilidad muy alta debido al hecho de que hay diferentes tipos de ITS habiendo considerado el ARNt insertado, comprendiendo cada tipo diferentes grupos.
De hecho, se ha descubierto que las nuevas moleculas de acido nucleico que consisten en las SEQ ID NO 44, 53, 58, 59 y 61 se encuentran en los dos tipos de separadores de todas las especies de Proteus ensayadas, en particular en las especies de Proteus que son clmicamente relevantes.
Los polinucleotidos espedficos mencionados, cualquier fragmento de los mismos de al menos 10, 15, 20, 25, 30 y preferiblemente de aproximadamente 20 nucleotidos (18, 19, 20, 21 o 22), la forma de ARN de los mismos y la forma complementaria de los mismos, a los que tambien se hace referencia como polinucleotidos espedficos de genero, son regiones espedficas del ITS que se pueden utilizar para el diseno de cebadores y/o sondas para la deteccion de una cualquiera o de todas las especies de Proteus, en particular, de las tres especies de Proteus que son clmicamente relevantes.
Tambien se proporcionan nuevos polinucleotidos para uso como sondas y/o cebadores para la deteccion y/o identificacion de una, dos o mas especies de Proteus.
En otras palabras, la presente memoria descriptiva describe nuevos polinucleotidos para uso como sondas y/o cebadores, que hibridan con las secuencias diana descritas en el presente documento para la deteccion y/o identificacion de una, dos o mas especies de Proteus.
En particular, la presente memoria descriptiva describe una molecula de acido nucleico aislada que hibrida espedficamente con una secuencia diana que comprende o que consiste en un acido nucleico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 17, su forma de ARN en la que T se sustituye por U, la forma complementaria de la misma, cualquier homologo de la misma y fragmentos de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 150, 200 o 300 nucleotidos contiguos de la misma.
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Las sondas de polinucleotidos preferidas son de entre aproximadamente 5 a aproximadamente 50 bases de longitud, mas preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 nucleotidos y son suficientemente homologas a la secuencia diana.
Los polinucleotidos de SEQ ID NO 18 a 67 o cualquiera de sus homologos, la forma complementaria de los mismos o la forma de ARN de los mismos se pueden utilizar como sondas.
Los cebadores preferidos descritos en el presente documento son polinucleotidos de ADN monocatenarios capaces de actuar como un punto de iniciacion para la smtesis de la secuencia diana. La longitud y la secuencia del cebador descrito en el presente documento deben ser tales que permitan cebar la smtesis de los productos de extension.
Preferiblemente un cebador descrito en el presente documento es de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 nucleotidos de longitud, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 35, mas preferiblemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 25. Su longitud y secuencia espedficas han de elegirse en funcion de las condiciones utilizadas, tales como temperatura y fuerza ionica.
Los cebadores descritos en el presente documento amplifican las secuencias diana. En otras palabras, los cebadores descritos en el presente documento amplifican una molecula de acido nucleico que comprende cualquiera de las SEQ ID NO 1 a 17, su hebra complementaria y/o sus homologos.
Pueden usarse cebadores universales localizados en las regiones flanqueantes conservadas del espaciador de ARNr, es decir, en el gen de 16S y el gen de 23S. Si estan presentes especies de Proteus en la muestra, el producto de amplificacion, la(s) secuencia(s) diana, comprenderan entonces una molecula de acido nucleico que consiste en cualquiera de las SEQ ID NO 1 a 17 y/u homologos.
Preferiblemente, la(s) secuencia (s) diana consiste(n) en cualquier/cualesquiera molecula(s) de acido nucleico seleccionada(s) del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 17 y/u homologos, flanqueada(s) por no mas de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nucleotidos respectivamente de ARNr de 16S y 23S.
Para algunas aplicaciones puede ser apropiado amplificar no las diferentes bacterias presentes en la muestra, sino mas espedficamente las especies de Proteus.
En este caso un par de cebadores se deriva de las secuencias de ITS descritas en el presente documento, por ejemplo de los polinucleotidos representados por las SEQ ID NO 44 y 53.
El hecho de que los cebadores de amplificacion no tengan que coincidir exactamente con la secuencia de molde correspondiente para garantizar la amplificacion apropiada esta ampliamente documentado en la bibliograffa (Kwok et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 999).
El procedimiento de amplificacion utilizado puede ser bien la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki et al, ((1988), Science 239: 487-491), bien la reaccion en cadena de la ligasa (LCR; Landgren et al, ((1988), Science 241: 1077-1080), Wu y Wallace, ((1989) Genomics 4: 560-569); Barany, ((1991), Proc Natl Acad Sci. USA 88: 189-193); bien la amplificacion basada en la secuencia de acido nucleico (NASBA; Guatelli et al, ((1990), Proc Natl Acad Sci. USA 87: 1874-1878), Compton, ((1991), Nature 350: 91-92); bien el sistema de amplificacion basado en la transcripcion (TAS; Kwoh et al, (1989) Proc Natl Acad Sci. USA 86: 1173-1177), bien la amplificacion por desplazamiento de hebra (SDA; Duck, ((1990) Biotechniques 9: 142-147); Walker et al, ((1992) Proc Natl Acad Sci. USA 89: 392-396) o bien la amplificacion por medio de replicasa QU (Lizardi et al, ((1988) Bio/Technology 6: 11971202), Lomeli et al, ((1989) Clin Chem. 35: 1826-1831) o bien cualquier otro procedimiento adecuado para amplificar moleculas de acido nucleico conocido en la materia.
Los polinucleotidos preferidos descritos en el presente documento para su uso como cebadores o como sondas, o para disenar nuevos cebadores y sondas a utilizarse en los procedimientos descritos en el presente documento, estan representados por las SEQ ID NO 18 a 67.
Los polinucleotidos descritos en el presente documento pueden diferir en la secuencia de cualquiera de los polinucleotidos representados por las SEQ ID NO 18 a 67, ya sea por adicion o por eliminacion de cualquiera de sus respectivos extremos de uno o varios nucleotidos, o por cambio de uno o mas nucleotidos dentro de dichas secuencias, o una combinacion de ambos, a condicion de que los equivalentes asf obtenidos hibriden todavfa con la secuencia diana. Dichos polinucleotidos equivalentes comparten al menos el 80 % de homologfa, preferiblemente mas del 85 %, mas preferiblemente mas del 90 % de homologfa con los polinucleotidos no modificados correspondientes.
Cuando se utiliza un equivalente de un polinucleotido, puede ser necesario modificar las condiciones de hibridacion para obtener la misma especificidad que el polinucleotido no modificado correspondiente.
Como consecuencia de ello, tambien sera necesario modificar por consiguiente la secuencia de otros polinucleotidos cuando los polinucleotidos se vayan a utilizar en un conjunto en las mismas condiciones de hibridacion. Estas modificaciones pueden hacerse de acuerdo con principios tales como los descritos en Hames B y Higgins S (Eds):
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“Nucleic acid hybridization. Practical approach.” IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1985.
Los cebadores y/o sondas de polinucleotidos descritos en el presente documento pueden comprender tambien analogos de nucleotidos tales como fosforotioatos (Matsukura et al., ((1987) Proc Natl Acad Sci. USA 84 (21): 77067710), alquilfosforotioatos (Miller et al, ((1979), Biochemistry 18 (23): 5134-5143) o acidos peptidonucleicos (Nielsen et al, ((1991) Science 254 (5037): 1497-1500); Nielsen et al, ((1993) Nucl Acids Res. 21 (2): 197-200) o pueden contener agentes intercalantes (Asseline et al, (1984), Proc. Natl Acad Sci. USA 81(11): 3297-3301), etc.
Los cebadores o sondas modificadas requieren adaptaciones con respecto a las condiciones en las que se utilizan con el fin de obtener la especificidad y sensibilidad requeridas. Sin embargo los resultados de la hibridacion debenan mantenerse fundamentalmente iguales que los obtenidos con los polinucleotidos no modificados.
La introduccion de estas modificaciones puede ser ventajosa a fin de influir en algunas caractensticas tales como cinetica de hibridacion, reversibilidad de la formacion de tubridos, estabilidad biologica de las moleculas de polinucleotidos, etc.
Las sondas y cebadores descritos en el presente documento se utilizan en procedimientos, para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus, en particular de Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y/o Proteus penneri.
La deteccion y/o identificacion de las secuencias diana se puede efectuar mediante el uso de un procedimiento de electroforesis, un procedimiento de hibridacion o un procedimiento de secuenciacion.
De acuerdo con la memoria descriptiva, un procedimiento para la deteccion de una o mas especies de Proteus en una muestra puede comprender las etapas siguientes:
- En primer lugar y si es necesario, los acidos nucleicos presentes en la muestra se hacen disponibles para amplificacion y/o hibridacion.
- En segundo lugar y tambien si es necesario, los acidos nucleicos, si estan presentes, se amplifican con uno u otro sistema de amplificacion de diana. Por lo general, se necesita la amplificacion para mejorar la senal de hibridacion subsiguiente. Sin embargo para algunas muestras, o para algunos sistemas de amplificacion de senal altamente sensibles, la amplificacion podna no ser necesaria.
-En tercer lugar, los acidos nucleicos presentes en la muestra o el producto amplificado resultante se ponen en contacto con sondas y se permite proceder a la hibridacion.
- Por ultimo, los hfbridos se detectan usando un sistema de deteccion conveniente y compatible. A partir de la(s) senal(es) o patron(es)de hibridacion observado(s), puede deducirse la presencia o ausencia de una, dos o mas especies de Proteus.
Para la etapa de amplificacion, pueden utilizarse los cebadores situados en las regiones flanqueantes conservadas (gen 16S y 23S) del espaciador de ARNr, tambien llamados cebadores universales. El par de cebadores representados por las SEQ ID NO 68 y 69 es un ejemplo de un par de cebadores universal.
Para algunas aplicaciones puede ser apropiado amplificar no todas las bacterias presentes en la muestra, sino uno o varios generos, o una o varias especies de Proteus.
En este ultimo caso, esto puede lograrse mediante el uso de cebadores espedficos de genero o cebadores espedficos de especie derivados de la region ITS de especies de Proteus.
De acuerdo con la memoria descriptiva, "un procedimiento para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus en una muestra” puede comprender las etapas de:
(i) opcionalmente, aislar y/o concentrar los acidos polinucleicos presentes en la muestra;
(ii) amplificar opcionalmente la(s) region(es) espaciadoras de ARNr de 16S-23S, o al menos una de las secuencias diana o fragmento(s) de la misma, con al menos un par de cebadores adecuados;
(iii) poner en contacto los acidos polinucleicos con al menos una sonda de polinucleotido que hibrida con al menos una de las secuencias diana seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 17, homologas de las mismas, su forma de ARN en la que T se sustituye por U, la forma complementaria de las mismas y fragmentos de las mismas;
(iv) detectar los dbridos formados y
(v) interpretar la(s) senal(s) obtenida(s) y deducir la presencia de especies de Proteus y/o la identificacion de especies de Proteus en la muestra.
Un fragmento, como se menciona por ejemplo en las etapas de amplificacion o hibridacion de cualquier procedimiento descrito en el presente documento, puede comprender o consistir en aproximadamente 10, 15, 20, 25,
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30, 50, 100, 200, 300 nucleotidos contiguos de una molecula de acido nucleico descrita en el presente documento.
Preferiblemente, las sondas descritas en el presente documento hibridan en condiciones de alto rigor.
En condiciones de alto rigor, se forman solo los Idbridos de acido nucleico complementary. Por consiguiente, el rigor de las condiciones de ensayo determina la cantidad de complementariedad necesaria entre dos hebras de acido nucleico que forman un Imbrido. El rigor se elige para maximizar la diferencia en estabilidad entre el Imbrido formado con el acido nucleico diana y el acido nucleico no diana.
En cualquier caso, las condiciones de hibridacion apropiadas se eligen de tal manera que la senal de hibridacion obtenida cuando un polinucleotido descrito en el presente documento hibrida espedficamente con una secuencia diana es diferente de la senal obtenida cuando dicho polinucleotido hibrida con una secuencia diana de manera no espedfica.
En la practica, las diferentes senales pueden visualizarse, por ejemplo, cuando su intensidad es dos, cinco, diez o mas veces mas fuerte con una hibridacion espedfica con la diana, en comparacion con la hibridacion no espedfica con la secuencia diana. El sistema LiPA es un buen ejemplo en este sentido.
Las diferentes senales tambien pueden visualizarse cuando se trazan diferentes picos en un analisis de curva de fusion, por ejemplo cuando se utiliza un procedimiento de PCR en tiempo real.
En una realizacion, una tecnica muy conveniente y ventajosa para la deteccion de secuencias diana que estan posiblemente presentes en la muestra es el procedimiento de PCR en tiempo real.
Existen diferentes formatos para la deteccion de ADN amplificado que puede utilizarse, en particular sondas TaqMan™, sondas Molecular Beacons, "Scorpions" o sondas de hibridacion FRET.
En cuanto a las sondas TaqMan™, se marca una sonda de hibridacion monocatenaria con dos componentes. Cuando el primer componente, el denominado agente fluorescente, se excita con luz de una longitud de onda adecuada, se transfiere la energfa absorbida al segundo componente, el denominado apagador, segun el principio de transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia. Durante la etapa de reasociacion de la reaccion de pCr, la sonda de hibridacion se une al ADN diana y se degrada por la actividad exonucleasa 5'-3 'de la polimerasa, por ejemplo polimerasa Taq, durante la fase de elongacion. Como resultado el componente fluorescente excitado y el apagador se separan espacialmente entre sf y por tanto se puede medir una emision de fluorescencia del primer componente (patente EP 543.942 y patente de EE.UU. 5.210.0l5).
Con respecto a las sondas de Molecular Beacons, las sondas tambien se marcan con un primer componente y con un apagador, estando preferiblemente situados los marcajes en extremos diferentes de una sonda al menos parcialmente autocomplementaria. Como resultado de la estructura secundaria de la sonda, ambos componentes estan en cercama espacial en solucion. Despues de la hibridacion con los acidos nucleicos diana, ambos componentes se separan entre sf de tal manera que despues de excitacion con luz de una longitud de onda adecuada pueda medirse la emision de fluorescencia del primer componente (patente de EE.UU. 5.118.801).
En cuanto a "Scorpions", una sonda y un cebador estan contenidos en una molecula. Al igual que en el sistema de Molecular Beacons, cada sonda esta marcada con un primer componente y con un apagador, estando situados los marcajes en diferentes extremos de una sonda al menos parcialmente autocomplementaria. Un cebador esta ligado a cada sonda por el intermedio de un bloqueador de pCr, que impide que la estructura secundaria se abra en ausencia de la secuencia diana espedfica. (Whitcombe, D. et al. (1999) Nature Biotechnology 17, 804-807; Thelwell, N. et al. (2000) Nucleic Acids Research vol. 28, n.° 19, 3752-3761; Svanvik et al Analytical Biochemistry 287, 179182 (2000).
El formato de prueba de sonda de hibridacion por Transferencia de Energfa de Resonancia de Fluorescencia (FRET) es especialmente util para todo tipo de ensayos de hibridacion homogeneos (Matthews, J. A. y Kricka, L. J., Anal Biochem 169 (1988) 1-25). Se caracteriza por dos sondas de hibridacion monocatenarias que se utilizan simultaneamente y son complementarias a sitios adyacentes de la misma hebra de un acido nucleico diana (amplificado). Ambas sondas estan marcadas con diferentes componentes fluorescentes. Cuando se excita con luz de una longitud de onda adecuada, un primer componente transfiere la energfa absorbida al segundo componente de acuerdo con el principio de transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia, de modo que se puede medir una emision de fluorescencia del segundo componente cuando ambas sondas de hibridacion se unen en posiciones adyacentes a la molecula diana que se va a detectar.
Cuando se reasocian con la secuencia diana, las sondas de hibridacion deben estar situadas muy cerca entre sf, en una disposicion de cabeza a cola. Por lo general, el hueco entre el extremo 3' marcado de la primera sonda y el extremo 5' marcado de la segunda sonda es lo mas pequeno posible y en particular consiste en aproximadamente 0 a 25 bases y preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 bases. Esto permite una cercama estrecha del compuesto donante de FRET y el compuesto aceptor de FRET, que es tfpicamente de 10 a 100 Angstrom.
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De forma alternativa a la monitorizacion del incremento en la fluorescencia del componente aceptor de FRET, tambien es posible monitorizar la disminucion en la fluorescencia del componente donante de FRET como una medida cuantitativa del evento de hibridacion.
Entre todos los formatos de deteccion conocidos en la tecnica de la PCR en tiempo real, se ha probado que el formato de sonda de hibridacion de FRET es altamente sensible, exacto y fiable (documentos WO 97/46707; WO 97/46712 y WO 97/46714). Sin embargo, el diseno de secuencias de sondas de hibridacion FRET apropiadas en ocasiones puede estar limitado por las caractensticas especiales de la secuencia de acido nucleico diana a detectarse.
Como alternativa al uso de dos sondas de hibridacion de FRET, tambien es posible el uso de un cebador marcado fluorescentemente y solo una sonda polinucleotidica marcada (Bernard, P. S., et al., Anal. Biochem. 255 (1998); 101-7). A este respecto, se puede elegir arbitrariamente si el cebador esta marcado con el compuesto donante de FRET o con el aceptor de FRET.
La fluorescencia se puede medir durante la etapa de elongacion, generando curvas de amplificacion a partir de las que, dependiendo de los cebadores y/o sondas utilizadas, de su Tm y de las condiciones de hibridacion, es posible deducir la presencia de las especies de Proteus para detectar o deducir que especies de Proteus esta(n) presentes.
Las sondas de hibridacion FRET (tambien llamadas HybProbes o sondas FRET) tambien se puede utilizar para el analisis de curva de fusion (documentos WO 97/46707; WO 97/46712 y WO97/46714). En dicho ensayo, el acido nucleico diana se amplifica en primer lugar en una reaccion de pCr tfpica con cebadores de amplificacion adecuados. Las sondas de hibridacion pueden estar ya presentes durante la reaccion de amplificacion o marcarse posteriormente. Despues de la terminacion de la reaccion de PCR, la temperatura de la muestra se aumenta consecutivamente. La fluorescencia se detecta siempre que la sonda de hibridacion se una al ADN diana. A la temperatura de fusion, la sonda de hibridacion se libera de su diana y la senal fluorescente disminuye inmediatamente hasta el nivel de fondo. Esta disminucion se monitoriza con una grafica temporal de fluorescencia frente a temperatura apropiada de tal forma que pueda calcularse el negativo de una primera funcion derivada. El valor de temperatura correspondiente al maximo obtenido de dicha funcion se toma a continuacion como la temperatura de fusion determinada de dicho par de sondas de hibridacion FRET.
Las mutaciones puntuales o polimorfismos en el acido nucleico diana dan como resultado una complementariedad de menos del 1O0 % entre el acido nucleico diana y las sondas FRET, lo que da por tanto como resultado una disminucion de la temperatura de fusion. Esto permite una deteccion comun de un grupo de variantes de secuencia por medio de hibridacion FRET HybProbe mientras que, posteriormente, pueden discriminarse diferentes miembros de dicho grupo por medio de la practica de analisis de curva de fusion.
En lugar de sondas de hibridacion FRET, se puede utilizar de forma alternativa Molecular Beacons para el analisis de curva de fusion.
Tras la disponibilidad de PCR en tiempo real y analisis homogeneo de curva de fusion de PCR en tiempo real, se ha hecho posible la discriminacion de ciertos tipos de especies o cepas utilizando tintes de union a ADN bicatenario tales como SybrGreen™ I. o, de forma alternativa, sondas de hibridacion disenadas espedficamente que hibridan con diferentes secuencias diana pero similares.
En el primer caso, tiene que determinarse la temperatura de fusion del producto de PCR bicatenario generado. Sin embargo, este procedimiento solo tiene aplicaciones limitadas ya que pocas diferencias no pueden monitorizarse de manera eficiente, debido a que variaciones menores en la secuencia solamente dan como resultado diferencias de temperatura de fusion imperceptibles.
De forma alternativa, las sondas de hibridacion se pueden utilizar de tal manera que se determine la temperatura de fusion del dbrido sonda/acido nucleico diana.
Existen diferentes plataformas de PCR en tiempo real que pueden utilizarse, tales como los equipos ABI/Prism™ y en particular el aparato LightCycler™, todos basados en el mismo principio que consiste en medir la emision de luz, monitorizar continuamente el pico de emision durante el ciclo de fusion, determinar y visualizar las temperaturas (picos de fusion) a la que las sondas marcadas se desprenden de los productos de amplificacion. Los datos de los picos de fusion son caractensticos de una secuencia [sonda: diana] particular debido a que los desapareamientos entre sonda y diana afectan a la cinetica de la fusion, produciendo diferentes picos de fusion para cada especie de interes.
La plataforma LightCycler ™ ofrece muchas ventajas y en particular, una ganancia de tiempo y el posible uso de varios sistemas de deteccion de sonda fluorescente espedficos de secuencia diferentes tales como sondas de hibridacion (HybProbes), sondas TaqMan™, Molecular Beacons, sondas Scorpion y bisondas (SYBR Green I).
En un procedimiento preferido descrito en el presente documento, se utiliza el sistema HybProbe, que consiste en dos sondas de polinucleotidos adyacentes derivadas de las secuencias diana descritas en el presente documento, en una orientacion de cabeza a cola, separadas por unos pocos nucleotidos, generalmente de 0 a 25,
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preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5. Una de las sondas se marca en su extremo 3 'por un tinte donante, la otra se marca con una molecula aceptora en su extremo 5' y se bloquea el fosfato en el extremo 3 '(para evitar su actuacion como cebador). El tinte donante es generalmente fluorescema y la molecula aceptora en general, LC Red 610, 640, 670 o 705.
La deteccion de una secuencia diana descrita en el presente documento puede conseguirse tambien mediante una hebra de PCR marcada interna y una sonda de deteccion situada en la hebra opuesta. La senal depende de la aproximacion espacial de los tintes y depende de la cantidad de diana.
Cuando ambas sondas hibridan con su secuencia diana la luz emitida del donante se transmite al fluoroforo aceptor por transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia (FRET) y la fluorescencia emitida (610, 640, 670 o 705 nm) se puede detectar. La intensidad de la fluorescencia emitida aumenta en paralelo con el ADN diana, producto de la amplificacion.
Las sondas LightCycler ofrecen la ventaja frente a las sondas TaqMan™ de que no requieren hidrolisis y por lo tanto, ninguna extension adicional de los tiempos de PCR (reasociacion-elongacion < 12 s). Por lo tanto, es posible tomar ventaja de la ciclacion termica de alta velocidad de la LightCycler y completar el programa de PCR en solo 45 minutos.
Y las recientes generaciones de plataformas de PCR en tiempo real son capaces de monitorizar varias sondas en una sola reaccion, lo que permite la deteccion y/o identificacion de diferentes especies de Proteus a nivel de especie y/o la distincion de los diferentes tipos de separadores de Proteus.
Ademas, se ha demostrado que los procedimientos disenados para la tecnologfa TaqMan se pueden convertir facilmente a la tecnologfa HybProbe con resultados equivalentes (Haematologica vol. 85 (12) pag. 1248-1254, diciembre de 2000).
Segun la presente memoria descriptiva, en los conjuntos de al menos dos sondas de polinucleotidos, a las que posiblemente se hace referencia como HybProbes, ambas HybProbes pueden hibridar con la misma secuencia diana, adyacentes entre sf, con no mas de 25 nucleotidos entre dichas 2 HybProbes, preferiblemente con no mas de 15 nucleotidos, mas preferiblemente con no mas de 10 nucleotidos, en particular con no mas de 5 nucleotidos.
Cuando hay dos HybProbes, una se marca con un fluoroforo aceptor y la otra con un donante de tal manera que, tras la hibridacion de las dos HybProbes con la secuencia diana, los fluoroforos donador y aceptor estan preferiblemente a 0 a 25 nucleotidos entre sf, mas preferiblemente a 0 a 10 nucleotidos entre sf y lo mas preferiblemente a 0 a 5 nucleotidos entre sf.
Cuando hay mas de dos HybProbes, al menos una esta marcada con un fluoroforo aceptor y las demas con un donante (o viceversa) de tal manera que, tras la hibridacion de las HybProbes con la secuencia diana, los fluoroforos donador y aceptor estan preferiblemente a 0 a 25 nucleotidos entre sf, mas preferiblemente a 0 a 10 nucleotidos entre sf y lo mas preferiblemente a 0 a 5 nucleotidos entre sf.
Para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus, en particular las especies de Proteus que son clmicamente relevantes, puede utilizarse un conjunto de al menos dos sondas de polinucleotidos, hibridando dichas sondas con al menos una de las secuencias diana seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 17, sus formas de ARN en las que T se sustituye por U, las formas complementarias de las mismas y los homologos de las mismas, en el que hay preferiblemente no mas de 25 nucleotidos, mas preferiblemente no mas de 10 nucleotidos y lo mas preferiblemente no mas de 5 nucleotidos entre dichas sondas.
Un conjunto de sondas de la invencion tambien puede consistir en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas, sondas, pero preferiblemente se compone de 2 a 5 sondas.
Los conjuntos de sondas enumerados en la Tabla 2 y sus homologos son conjuntos preferidos de la invencion.
Grupos de tres polinucleotidos, dos para uso como cebador y el otro para su uso como sonda, tambien se pueden utilizar. Luego uno de dichos cebadores y dicha sonda hibridan con al menos una de las secuencias diana seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO 1 a 17, sus formas de ARN en las que T se sustituye por U, las formas complementarias de las mismas y homologos de las mismas, por lo que hay preferiblemente no mas de 25 nucleotidos, mas preferiblemente no mas de 10 nucleotidos y lo mas preferiblemente no mas de 5 nucleotidos entre dicho cebador y dicha sonda.
Los conjuntos de al menos dos polinucleotidos de la invencion se utilizan en procedimientos para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus. En particular, P. mirabilis, P. vulgaris y/o P. penneri pueden detectarse y/o identificarse.
Un procedimiento descrito en el presente documento para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus en una muestra, en particular de P. mirabilis, P. vulgaris y/o P. penneri, puede comprender las etapas de:
(i) opcionalmente, liberar, aislar y/o concentrar los acidos polinucleicos presentes en la muestra;
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(ii) opcionalmente, amplificar la region espaciadora de ARNr de 16S-23S, o al menos una secuencia diana, o un fragmento de la misma, con al menos un par de cebadores adecuados;
(iii) poner en contacto los acidos polinucleicos con al menos un conjunto de al menos dos HybProbes que hibridan con al menos una secuencia diana seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 17, sus formas de ARN en las que T se sustituye por U, las formas complementarias de las mismas, cualquier homologo y un fragmento de al menos 10 y preferiblemente al menos 20 nucleotidos contiguos de las mismas;
(iv) detectar los tnbridos formados en la etapa (iii);
(v) deducir la presencia de especies de Proteus, o identificar las especies de Proteus en la muestra a partir de las senales de hibridacion diferenciales obtenidas en la etapa (iv).
Por ejemplo, un par de cebadores utilizado en la etapa de amplificacion es cualquier combinacion de un cebador directo derivado de cualquiera de los polinucleotidos representados por las SEQ iD NO 53 o 61 o sus homologos y un cebador inverso derivado de cualquiera de los polinucleotidos representados por las SEQ ID NO 44, 58 o 59, o sus homologos.
Por ejemplo, un conjunto de dos HybProbes utilizadas en la etapa de hibridacion puede ser cualquier combinacion de la HybProbe representada por la SEQ ID NO 22 con cualquiera de las HybProbes representadas por las SEQ ID NO 37, 38 y 39, o sus homologos.
La HybProbe representada por la SEQ ID NO 22 puede estar marcada con fluorescema y las demas puede estar marcadas con cualquiera de LCR610, LCR640, LCR670 o LCR705.
Una de las ventajas del sistema HybProbes reside en el hecho de que permite la deteccion de variacion de secuencia, incluyendo mutaciones, polimorfismos y otras especies de acidos nucleicos variantes, basandose en el concepto molecular siguiente: una de las HybProbe es una "sonda de anclaje" unida estrechamente, mientras que la "sonda sensora” adyacente se extiende por la region de variacion de secuencia. Durante la fusion del producto de PCR final, la alteracion de secuencia se detecta como un cambio en la temperatura de fusion (Tm) de la sonda sensora.
Por ejemplo, si la muestra contiene solo la SEQ ID NO 1, utilizando HybProbes que hibridan espedficamente con dicha SEQ ID NO 1, se generana un unico pico de fusion. Si hay tambien un homologo en la muestra, utilizar las mismas dos HybProbes generana dos picos, siempre que haya al menos una base no apareada que generalmente induce un cambio de temperatura facilmente observable.
Dependiendo del formato de las sondas utilizadas para la deteccion de los productos de amplificacion, de los polinucleotidos seleccionados (o disenados), de su Tm y de las condiciones de hibridacion, la fluorescencia se puede medir durante la etapa de amplificacion, generando entonces curvas de amplificacion, o despues de la etapa de amplificacion para un analisis de la curva de fusion, generando curvas de fusion.
Asf la(s) senal(es) obtenida(s) puede(n) visualizarse en forma de curvas de amplificacion o en la forma de curvas de fusion, de las que es posible deducir la presencia de especies de Proteus y/o deducir que una(s) de la(s) especie(s) de Proteus esta(n) presente(s).
En particular, un procedimiento para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus en una muestra comprende tambien las etapas de
(i) si es necesario, liberar, aislar y/o concentrar los acidos polinucleicos presentes en la muestra;
(ii) amplificar al menos una de las secuencias diana seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 17, sus formas de ARN en las que T se sustituye por U, las formas complementarias de las mismas, cualquier homologo y un fragmento de al menos 20 contiguos de las mismas, con un par de cebadores uno de los cuales esta marcado,
(iii) poner en contacto los acidos polinucleicos con al menos una HybProbe que hibrida, adyacente a dicho cebador marcado con menos de 25 nucleotidos entremedias, con dicha(s) secuencia(s) diana,
(iv) detectar los tnbridos formados y
(v) deducir la presencia de especies de Proteus, y/o la identificacion de las especies de Proteus en la muestra a partir de las senales obtenidas en la etapa (iv).
De acuerdo con la presente memoria descriptiva, el procedimiento descrito en el presente documento que utiliza el sistema HybProbes se puede adaptar para la deteccion e identificacion de una o varias especies de Proteus, permitiendo su distincion de otras especies de Proteus.
En particular, un procedimiento descrito en el presente documento que utiliza el sistema HybProbes se puede adaptar para la deteccion e identificacion de Proteus mirabilis, lo permite su distincion de otras especies de Proteus.
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Entonces, en la etapa de amplificacion, los cebadores adecuados son pares de cebadores que amplifican espedficamente la(s) secuencia(s) diana seleccionada(s) de un grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 10, sus formas de ARN en las que T se sustituye por U, las formas complementarias de las mismas y homologos de las mismas.
En la etapa de hibridacion, las HybProbes deben hibridar espedficamente por ejemplo con cualquiera de las SEQ ID NO 21 a 24, 27 a 29, 37 a 39, 47 a 49, 51, 54, 55 y 65 a 67 o con su forma de ARN en la que T se sustituye por U, o con la forma complementaria de las mismas.
Por lo tanto, las cepas de Proteus mirabilis se pueden distinguir de manera inequvoca de todos los demas organismos examinados por analisis de la curva de fusion.
No se obtienen senales relevantes con especies no de Proteus ni con ADN genomico humano.
Un conjunto preferido de 2 HybProbes consiste en las SEQ ID NO 24 u homologas y la SEQ ID NO 39 u homologas.
Este conjunto de HybProbes constituido por las SEQ ID NO 24 y 39 es ajustable a Proteus mirabilis con una alta sensibilidad.
Ademas, el procedimiento descrito en el presente documento que utiliza el sistema HybProbes puede adaptarse tambien para la deteccion y/o identificacion de Proteus vulgaris o Proteus penneri, permitiendo la distincion de la primera o la ultima de las demas especies de Proteus.
Entonces, para la deteccion y/o identificacion de Proteus vulgaris en la etapa de amplificacion, los cebadores adecuados son pares de cebadores que amplifican espedficamente la(s) secuencia(s) diana seleccionadas de un grupo que consiste en las SEQ ID NO 11 a 13, sus formas de ARN en las que T se sustituye por U, las formas complementarias de las mismas y homologos.
En la etapa de hibridacion, las HybProbes deben hibridar espedficamente por ejemplo con cualquiera de las SEQ ID NO 18 a 20, 56 y 57 o con su forma de ARN en la que T se reemplaza por U, o con la forma complementaria de las mismas.
De acuerdo con la presente memoria descriptiva, cada polinucleotido enumerado en la Tabla 4, que corresponde a las SEQ ID NO 18 a SEQ ID NO 67 y cualquiera de sus homologos, se puede utilizar en cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento como cebador y/o como sonda, solo o en combinacion.
Una segunda realizacion basada tambien en un procedimiento de hibridacion es la tecnica de ensayo de sonda lineal. El ensayo de sonda lineal (LiPA) es un formato de hibridacion inversa (Saiki et al. (1989). Proc. Natl Acad Sci. USA 86: 6230-6234) que utiliza tiras de membrana sobre las que pueden aplicarse convenientemente varias sondas de polinucleotidos (incluyendo polinucleotidos de control negativo o positivo) como lmeas paralelas. La tecnica LiPA, como se describe por Stuyver et al. ((1993) J. Gen Virology 74: 1093-1102) y en la patente europea EP 637342, proporciona una prueba de hibridacion rapida y facil de usar. Los resultados se pueden leer en el plazo de 4 h. despues del inicio de la amplificacion. Despues de la amplificacion, durante la que por lo general se incorpora un marcaje no isotopico al producto amplificado y la desnaturalizacion alcalina, el producto amplificado se pone en contacto con las sondas en la membrana y se lleva a cabo la hibridacion durante aproximadamente 1 a 1,5 h. En consecuencia, los dbridos formados se detectan por un procedimiento enzimatico que da como resultado un precipitado de color purpura-marron visible. El formato de LiPA es completamente compatible con dispositivos de barrido comercialmente disponibles, haciendo de este modo posible la interpretacion automatica de los resultados. Todas estas ventajas hacen al formato de LiPA susceptible de uso en un entorno rutinario.
El formato de LiPA es una herramienta ventajosa para la deteccion y/o identificacion de patogenos a nivel de especies, pero tambien a niveles taxonomicos superiores o inferiores. Por ejemplo, pueden seleccionarse las configuraciones de sonda en tiras de LiPA de tal manera que puedan detectar el genero completo de Proteus o puedan identificar especies dentro del genero (por ejemplo, P. mirabilis, P. vulgaris y/o Proteus penneri, etc.) o puedan, en algunos casos, incluso detectar subtipos dentro de una especie.
La capacidad de generar simultaneamente resultados de hibridacion con un gran numero de sondas es otro beneficio de la tecnologfa de LiPA. En muchos casos, la cantidad de informacion que puede obtenerse por una combinacion particular de sondas supera en gran medida los datos obtenidos mediante el uso de ensayos de sondas individuales. Por lo tanto la seleccion de sondas en la tira de membrana es de suma importancia, ya que un conjunto optimizado de sondas generara el maximo de informacion posible.
Estas sondas pueden aplicarse a tiras de membrana en lugares diferentes y el resultado se interpreta como positivo si al menos una de estas sondas es positiva. De forma alternativa estas sondas pueden aplicarse como una mezcla en el mismo lugar, reduciendo por este medio el numero de lmeas en una tira. Esta reduccion puede ser conveniente a fin de hacer la tira mas breve o de poder aumentar el numero total de sondas en una tira.
Otro enfoque es el uso de sondas degeneradas, que pueden simplificar considerablemente los procedimientos de
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fabricacion de las tiras de LiPA.
Aun otro enfoque son sondas quimericas que comprenden dos oligonucleotidos descritos en el presente documento. Por ejemplo, las secuencias de SEQ ID NO 37 y 55 son ambas necesarias para detectar los dos tipos de forma de ITS de P. mirabilis. En esta alternativa, puede sintetizarse una sonda que tiene la secuencia de nucleotidos de la primera SEQ ID NO seguida de la secuencia de nucleotidos de la segunda. Esta sonda tendra las caractensticas combinadas de las dos sondas de secuencias SEQ ID NO 37 y 55.
Estos dos enfoques tambien se pueden utilizar en cualquiera de las realizaciones o procedimientos descritos en el presente documento.
En virtud de las propiedades mencionadas anteriormente, el sistema de LiPA puede considerarse como un formato eficiente para un procedimiento de hibridacion en el que varios organismos deben detectarse simultaneamente en una muestra.
Sin embargo, debe quedar claro que se puede utilizar cualquier otro ensayo de hibridacion, en el que se utilicen diferentes sondas en las mismas condiciones de hibridacion y lavado, para los procedimientos de deteccion y/o seleccion anteriormente mencionados. Por ejemplo, puede ser posible inmovilizar el acido nucleico diana sobre un soporte solido y utilizar mezclas de diferentes sondas, todas marcadas de forma diferente, lo que da como resultado una senal de deteccion diferente para cada una de las sondas hibridadas con la diana. Y hoy en dfa estan disponibles muchos soportes diferentes.
A modo de ejemplo, el procedimiento a seguir para la deteccion de una o mas especies de Proteus en una muestra utilizando el formato de LiPA se resume a continuacion:
- En primer lugar y si es necesario, los acidos nucleicos presentes en la muestra se hacen disponibles para amplificacion y/o hibridacion.
- Opcionalmente, los acidos nucleicos se amplifican con uno u otro sistema de amplificacion de diana. Por lo general, se necesita la amplificacion para mejorar la senal de hibridacion subsiguiente.
- En tercer lugar, eventualmente despues de una etapa de desnaturalizacion, los acidos nucleicos presentes en la muestra o el producto amplificado resultante se ponen en contacto con las tiras de LiPA sobre las que se inmovilizan una o mas sondas, lo que permite la deteccion de los organismos de interes y se permite proceder a la hibridacion.
- Por ultimo, eventualmente despues de haber efectuado una etapa de lavado, se detectan los tnbridos utilizando un sistema de deteccion conveniente y compatible. A partir de la(s)senal(es) de hibridacion o patron(es) observado(s) se puede deducir la presencia o ausencia de uno o varios organismos cribados en esa muestra biologica particular.
Pueden usarse cebadores universales localizados en las regiones flanqueantes conservadas del espaciador de ARNr, es decir, en el gen de 16S y el gen de 23S.
Para algunas aplicaciones puede ser apropiado amplificar no las diferentes bacterias presentes en la muestra, sino mas espedficamente las especies de Proteus.
De acuerdo con la presente memoria descriptiva, un procedimiento para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus en una muestra puede comprender las etapas de:
(i) si es necesario, liberar, aislar y/o concentrar los acidos polinucleicos presentes en la muestra;
(ii) si es necesario, amplificar la region espaciadora de ARNr de 16S-23S, o una parte de ella, con al menos un par de cebadores adecuados;
(iii) poner en contacto los acidos polinucleicos con al menos una sonda que hibrida con la secuencia diana que consiste en las SEQ ID NO 1 o 17, o las formas de ARN de dichas SEQ ID NO 1 o 17 en las que T se sustituye por U, o las formas complementarias de las mismas, o en cualquier homologo, o en un fragmento de al menos 10 y preferiblemente al menos 20 nucleotidos contiguos de las mismas;
(iv) detectar los tnbridos formados en la etapa (iii);
(v) detectar y/o identificar el/los microorganismo(s) presentes en la muestra a partir de las numerosas senales de hibridacion diferencial obtenidas en la etapa (iv).
La parte de los ITS mencionada en la etapa de amplificacion es un polinucleotido que comprende la secuencia diana, o la secuencia diana misma, consistiendo la secuencia diana en cualquiera de las SEQ ID NO 1 a 17, o en sus formas de ARN en las que T se sustituye por U, o en las formas complementarias de las mismas, o en cualquier homologo, o en un fragmento de al menos 20 nucleotidos contiguos de las mismas.
Preferentemente, la presente memoria descriptiva da a conocer un procedimiento como se describe anteriormente
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en el que al menos 2 microorganismos se detectan simultaneamente.
Un conjunto de sondas como se describe en la etapa (iii) comprende al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o mas sondas descritas en el presente documento.
En un procedimiento preferido descrito en el presente documento, un conjunto de sondas como se describe en la etapa (iii) comprende al menos dos sondas.
Las sondas preferidas son polinucleotidos de SEQ ID NO 18 a 67, sus formas de ARN en la que T se sustituye por U, las formas complementarias de las mismas, cualquiera homologos y fragmentos de aproximadamente 10 nucleotidos contiguos de las mismas, con la condicion de que se excluya la molecula de acido nucleico ATACGTGTTATGTGC, son mas preferidos fragmentos de aproximadamente 20 nucleotidos contiguos de las mismas.
La presente memoria descriptiva tambien describe un procedimiento como se describe anteriormente, en el que las sondas como se especifican en la etapa (iii) se combinan con al menos una sonda distinta, preferentemente tambien de la region espaciadora de ARNr de 16S-23S, lo que permite la deteccion simultanea de diferentes bacterias patogenas susceptibles de estar presentes en la misma muestra.
Las sondas preferidas se disenan para lograr un rendimiento optimo en las mismas condiciones de hibridacion de modo que puedan utilizarse en conjuntos para hibridacion simultanea; esto aumenta en gran medida la facilidad de uso de estas sondas y da como resultado una ganancia significativa en tiempo y mano de obra.
Se da a conocer tambien un kit que contiene cualquiera de los polinucleotidos descritos en el presente documento.
De acuerdo con la presente memoria descriptiva, un kit puede comprender los siguientes componentes:
- al menos un polinucleotido que hibrida con la secuencia diana que consiste en cualquiera de las SEQ ID NO 1 a 17, su forma de aRn en la que T se sustituye por U, la forma complementaria de la misma, u homologos de la misma;
- un tampon de hibridacion, o componentes necesarios para producir dicho tampon;
De acuerdo con la presente memoria descriptiva, un kit preferido puede comprender
- al menos un conjunto de dos HybProbes de hibridacion adyacentes entre sf, a menos de 25 nucleotidos, preferiblemente menos de 5 nucleotidos, de la secuencia diana que consiste en cualquiera de las SEQ ID NO 1 a 17, su forma de ARN en la que T se sustituye por U, la forma complementaria de la misma o cualquier homologo de la misma;
- un tampon de hibridacion, o componentes necesarios para producir dicho tampon;
Para concluir, al utilizar ITS de Proteus como diana, es posible disenar sondas para utilizar en diferentes procedimientos de deteccion y/o identificacion.
Con el procedimiento de PCR en tiempo real, por una parte, es posible detectar e identificar el genero Proteus - en particular P. mirabilis, P. vulgaris y P. penneri, usando un solo conjunto de HybProbe que genera un pico de fusion unico en el sistema LightCycler (ejemplo 4).
Por otra parte, se puede obtener una senal espedfica de la especie mediante la presencia de un pico de fusion espedfico de una especie en particular (P. mirabilis en el ejemplo 3), o por la presencia de un pico a una Tm que es espedfico de una especie en particular (veanse P. vulgaris y P. penneri en los ejemplos 5 y 6).
Tambien secuenciacion de la region de ITS completa y la comparacion con una secuencia de referencia como se indica aqrn se pueden utilizar como un procedimiento para detectar e identificar especies de Proteus (ejemplo 7).
La descripcion anterior o los ejemplos que siguen no deben interpretarse como limitantes de la invencion a las realizaciones dadas a conocer espedficamente en la misma.
EJEMPLOS
Para los ejemplos descritos a continuacion, se amplifico el espaciador transcrito interno (ITS) de 16S-23S usando cebadores disenados en regiones conservadas de ARNr de 16S y ARNr de 23S, respectivamente.
Ejemplo 1: Protocolo de LightCycler
El ADN se preparo de acuerdo con procedimientos estandar y se utilizaron aproximadamente 104 equivalentes de genoma como diana para la amplificacion.
Una muestra se senalo como positiva si estaban presentes una curva de cuantificacion y un pico de fusion para esa muestra.
Las sondas se disenaron para trabajar como HybProbes en LightCycler v1.2 (software v4), lo que permite una deteccion de PCR de fluorescencia en tiempo real.
Se marco una HybProbe en su extremo 3' con un tinte de fluorescema, mientras que se marco la HybProbe vecina en su extremo 5' con un tinte LC-red 640 o LC-red 705.
5 Siguiendo las instrucciones del fabricante del kit LC-FastStart DNA Master Hybridization Probes (n.° de cat. 3.003.248 o n.° 2.239.272):
- puede utilizarse cualquier material de muestra adecuado para PCR en terminos de pureza, concentracion y ausencia de inhibidores;
- los cebadores deben estar a una concentracion final de 0,3 a 1 pM cada uno;
10 - las HybProbes a una concentracion final de 0,2 pM cada una, o doble;
- la concentracion de MgCh debe optimizarse y puede variar de 1 a 5 mM;
- y se debe ejecutar un control negativo.
Las condiciones de amplificacion y de fusion se describen despues en el presente documento. Se utilizo la version 4 del software de LC. Los ajustes de cuantificacion fueron F2/back F1 (muestras). Para el ajuste del valor de referencia, 15 se utilizo el modo aritmetico. El calculo del punto de corte (Ct) se baso en el maximo de la segunda derivada. El procedimiento de calculo para el pico de fusion fue polinomico. El area del pico se utilizo para calcular la Tm.
Tabla 1: Programa de amplificacion y curva de fusion:
45x
- Temp. (°C) Tiempo de espera Pendiente (°C/s) Modo adquisicion de
- Desnaturalizac
- 95 10 min 20 Ninguno
- ion
- Ciclos
- 95 10 s 20 Ninguno
- 50 15 s 20 SIMPLE
- 72 30 s 20 Ninguno
- Fusion
- 95 60 s 20 Ninguno
- 40 60 s 20 Ninguno
- 80 0 s 0,1 CONTINUO
- Enfriamiento
- 30 0 s 20 Ninguno
Ejemplo 2: Diferentes conjuntos de HybProbes
En este ejemplo, se marco una HybProbe en su extremo 3' con un tinte de fluorescema, mientras que se marco la 20 HybProbe vecina en su extremo 5' con tinte LC-Red 640 o LC Red 705.
Se aplico el mismo protocolo LightCycler como se describe en el ejemplo 1.
Tabla 2: Resultados de diferentes combinaciones ensayadas
- SEQ ID NO marcadas con fluorescema
- SEQ ID NO marcados con LC- red Objetivo del diseno Cepas detectadas/cepas ensayadas Preferido/ma s preferido
- P. mirabilis
- P. vulgaris P. penneri Otras bacterias
- 21
- 37 Espedfico de P. mirabilis 17/17 0/1 0/2 + +
- 23
- 37 Espedfico de P. mirabilis 17/17 0/1 0/2 + +
- 21
- 38 Espedfico de P. mirabilis 2/2 0/1 0/1 +
- SEQ ID NO marcadas con fluorescema
- SEQ ID NO marcados con LC- red Objetivo del diseno Cepas detectadas/cepas ensayadas Preferido/ma s preferido
- P. mirabilis
- P. vulgaris P. penneri Otras bacterias
- 23
- 38 Espedfico de P. mirabilis 2/2 0/1 0/1 +
- 24
- 37 Espedfico de P. mirabilis 4/4 +
- 24
- 38 Espedfico de P. mirabilis 4/4 +
- 24
- 39 Espedfico de P. mirabilis 42/42 0/3 0/3 0/56 + +
- 22
- 37 Espedfico de P. mirabilis 42/42 0/3 0/3 0/56 + +
- 22
- 38 Espedfico de P. mirabilis 4/4 +
- 22
- 39 Espedfico de P. mirabilis 4/4 +
- 25
- 40 Genera Proteus 2/2 1/1 1/1 +
- 25
- 41 Genera Proteus 2/2 1/1 1/1 +
- 26
- 40 Genera Proteus 2/2 1/1 1/1 +
- 26
- 41 Genera Proteus 2/2 1/1 1/1 +
- 27
- 42 Genera Proteus 2/2 1/1 1/1 +
- 28
- 42 Genera Proteus 2/2 1/1 1/1 +
- 29
- 42 Genera Proteus 2/2 1/1 1/1 +
- 30
- 43 Genera Proteus 19/19 2/2 2/2 0/8 + +
- 30
- 44 Genera Proteus 2/2 1/1 1/1 +
- 31
- 43 Genero Proteus 42/42 3/3 3/3 0/56 + +
- 31
- 44 Genero Proteus 2/2 1/1 1/1 +
- SEQ ID NO marcadas con fluorescema
- SEQ ID NO marcados con LC- red Objetivo del diseno Cepas detectadas/cepas ensayadas Preferido/ma s preferido
- P. mirabilis
- P. vulgaris P. penneri Otras bacterias
- 32
- 45 Genero Proteus 2/2 1/1 1/1 +
- 32
- 46 Genero Proteus 2/2 1/1 1/1 +
- 33
- 45 Genero Proteus 19/19 2/2 2/2 0/8 + +
- 33
- 46 Genero Proteus 2/2 1/1 1/1 +
Ejemplo 3: HybProbes especificas de P. mirabilis
Las HybProbes representadas por las SEQ ID NO 24 y SEQ ID NO 39 se utilizaron en un protocolo LightCycler como se describe en el ejemplo 1. La primera (SEQ ID NO 24) se marco con fluorescema y la segunda (SEQ ID NO 39) se marco con LC-Red 640.
5 Se aplico el mismo protocolo LightCycler como se describe en el ejemplo 1 y la muestra utilizada contema una de las cepas de P. mirabilis. Se observo un pico de fusion espedfico a 53 °C.
La sensibilidad de este conjunto HybProbe se evaluo usando 42 cepas de P. mirabilis (10 procedentes de Europa occidental, 10 del Reino Unido, 10 de Europa meridional, 10 de los Estados Unidos y 2 de Japon). Todas las cepas de P. mirabilis teman una curva de cuantificacion visible con valores de Ct variables de 19,95 a 22,81.
10 Se observo un pico de fusion de 53 °C (DESVESTA 0,60 °C) para todas las cepas de P. mirabilis ensayadas, mostrando una sensibilidad del 100 % para P. mirabilis con este conjunto de HybProbes.
Para ensayar la especificidad, se ensayaron 3 cepas de P. vulgaris y 3 cepas de P. penneri. No se obtuvieron ninguna curva de cuantificacion ni curvas de fusion, mostrando una especificidad del 100 % con respecto a las demas especies de Proteus clmicamente relevantes.
15 Ademas de estas especies de Proteus, se ensayo un gran panel de otros organismos (vease la Tabla 3) y se realizo un experimento adicional con ADN humano. Ni el ADN humano ni los microorganismos ensayados dieron ninguna curva de cuantificacion ni pico de fusion alguno, lo que confirma la especificidad de HybProbes del 100 %.
Tabla 3: Lista de los microorganismos ensayados para determinar la especificidad.
- Acinetobacter baumannii
- Bartonella henselae
- Aspergillus fumigatus
- Bordetella pertussis
- Candida albicans
- Borrelia burgdorferi
- Candida glabrata
- Burkholderia cepacia
- Candida krusei
- Campylobacter jejuni
- Candidia parapsilosis
- Cardiobacterium hominis
- Candida tropicalis
- Citrobacter freundii
- Enterobacter aerogenes
- Clostridium perfringens
- Enterobacter cloacae
- Corynebacterium jeikeium
- Enterococcus faecalis
- Cryptococcus neoformans
- Enterococcus faecium
- Gemella haemolysans
- Escherichia coli
- Histoplasma capsulatum
- Klebsiella oxytoca
- Haemophilus influenzae
- Klebsiella pneumoniae
- Legionella pneumophila
5
10
15
20
25
- Pseudomonas aeruginosa
- Listeria monocytogenes
- Serratia marcescens
- Moraxella catarrhalis (Branhamella)
- Staphylococcus aureus
- Morganella morganii
- Staphylococcus epidermidis
- Mycobacterium fortuitum
- Staphylococcus haemolyticus
- Mycobacterium tuberculosis
- Stenotrophomonas maltophilia
- Mycoplasma pneumoniae
- Streptococcus sanguinis grupos "sanguinis"
- Neisseria meningitidis
- Streptococcus agalactiae
- Pantoea agglomerans
- Streptococcus pneumoniae
- Peptostreptococcus magnus
- Streptococcus pyogenes
- Porphyromonas gingivalis
- Actinobacillus actinomycetemcomitans
- Prevotella denticola
- Aeromonas hydrophila
- Propionibacterium acnes
- Bacillus cereus
- Salmonella enterica venteritidis
- Bacteroides fragilis
- Yersinia enterocolitica
Este conjunto de HybProbes es capaz de detectar e identificar P. mirabilis de una manera espedfica.
Ejemplo 4: HybProbes para especies de Proteus
Se ensayaron cuatro muestras que contienen respectivamente dos cepas de P. mirabilis (cada cepa en una muestra), una de P. penneri y una de P. vulgaris.
Las HybProbes representadas por las SEQ ID NO 30 y SEQ ID NO 44 se utilizaron en un protocolo LightCycler como se describe en el ejemplo 1.
Cada cepa genero una curva de cuantificacion y se observo un pico de fusion a 55 °C.
Por lo tanto, este conjunto de HybProbes es capaz de detectar e identificar diferentes especies de Proteus, en particular las especies de Proteus que son clmicamente relevantes.
Ejemplo 5: HybProbes para distinguir P. penneri de otras especies de Proteus.
Se ensayaron cuatro muestras que contienen respectivamente dos cepas de P. mirabilis (cada cepa en una muestra), una de P. penneri y una de P. vulgaris con otro conjunto de HybProbes.
Las HybProbes representadas por las SEQ ID NO 27 y SEQ ID NO 42 se utilizaron en un protocolo LightCycler como se describe en el ejemplo 1.
Cada cepa genero una curva de cuantificacion. Despues de un analisis de la curva de fusion, P. penneri mostro un pico de fusion a 52,5 °C. Las otras tres mostraron un pico de fusion a 56 °C.
Este conjunto de HybProbes permite, por lo tanto, distinguir e identificar P. penneri de las demas especies de Proteus.
Ejemplo 6: HybProbes para distinguir P. vulgaris de otras especies de Proteus.
Se ensayaron cuatro muestras que contienen respectivamente dos cepas de P. mirabilis (cada cepa en una muestra), una de P. penneri y una de P. vulgaris con otro conjunto de HybProbes.
Las HybProbes representadas por las SEQ ID NO 32 y SEQ ID NO 45 se utilizaron en un protocolo LightCycler como se describe en el ejemplo 1.
Cada cepa genero una curva de cuantificacion. Despues de un analisis de la curva de fusion, P. vulgaris mostro un pico de fusion de 54,5 °C. Las otras dos mostraron un pico de fusion a 52,5 °C.
Este conjunto de HybProbes permite, por lo tanto, distinguir e identificar P. vulgaris de las otras especies de Proteus. Teniendo en cuenta las secuencias de ITS de cada especie, se esperaba solo un pico de fusion a 54,5 °C.
5
10
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20
25
El resultado obtenido significa que la cepa de P. que es responsable del cambio observado en la
Ejemplo 7: Deteccion e identificacion de nucleotidos de ITS.
Se recibio una muestra sin una indicacion clara de la especie de Proteus que se supoma que contema.
Se amplifico la region ITS de la especie a determinar utilizando cebadores universales situados en 16S y 23S.
Se clonaron los amplicones en el vector pGEM-T (Promega) y se derivaron las secuencias de nucleotidos de ITS de acuerdo con la qmmica de terminacion de la cadena didesoxi utilizando cebadores localizados en el vector de plasmido.
Se encontraron tanto un espaciador que contema ARNtIglu como un espaciador que contema ARNt ile-ala.
Estas secuencias de ITS se sometieron a analisis de secuencia y se compararon con los otros espaciadores ya secuenciados.
La secuencia de nucleotidos del espaciador de ARNt glu a identificar era completamente identica a la secuencia de nucleotidos del espaciador de consenso ARNt glu de P. mirabilis representada por la SEQ ID NO 4.
La secuencia de nucleotidos del espaciador de ARNt ile-ala de esta muestra difena en 3 pares de bases de 702 (99,4 % de homologfa) en comparacion con la secuencia de nucleotidos de consenso del espaciador de ARNt ile-ala de P. mirabilis representada por la SEQ ID NO 6.
En vista del alto grado de homologfa, se pudo deducir que la muestra contema P. mirabilis
Ejemplo 8: HybProbes para distinguir las tres especies de Proteus clinicamente relevantes.
Se disenaron un conjunto de tres HybProbes representadas por las SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51 y SEQ ID NO 52 para un protocolo de LightCycler como se describe en el ejemplo 1, para muestras conteniendo respectivamente P. mirabilis, P. penneri y P. vulgaris
La primera HybProbe (SEQ ID NO 50) marcada con fluorescema y las otras dos (SEQ ID NO 51 y SEQ ID NO 52) marcadas con LC-Red, permiten la distincion de P. mirabilis de P. vulgaris y P. penneri por medio de curvas de fusion, teniendo la que representa a P. mirabilis un pico de fusion a 63 °C y las otras dos a 67 °C.
vulgaris ensayada contiene un polimorfismo en su secuencia de ITS Tm.
Proteus spp. mediante determinacion de la secuencia de
Tabla 4
- SEQ ID NO.
- Secuencias
- 19
- acagtcagcgcaacatacattagtatgagcatggcage
- 20
- acgacgaaatgtaatctgcacagccatcaccacccagacgtcatyaagagaaacatcttcgggttgtga
- 21
- ggcgtaccacttatctgacg
- 22
- cgtaccacttatctgacg
- 23
- gcgtaccacttatctgacg
- 24
- cgtaccacttatctgac
- 25
- cacacagattgtctgatgaagacgagcaaa
- 26
- ctcacacagattgtctgatgaagaacgagcaaa
- 27
- cgccaatgcgcggt
- 28
- acgccaatgcgcggt
- 29
- gacgccaatgcgcggt
- 30
- tgaaaacaaatcaatatatcaccgaggtatat
- 31
- attgaaaacaaatcaatatatcaccgaggtatat
- 32
- tggaacaagctgaaaaattg
- 33
- ggaacaagctgaaaaattg
- 34
- gtgaattattatgctctttaacaatc
- 35
- ttaaaggtactccctttaaaag
- 36
- ggaacaactgaaaaattgaaaacaaatca
- 37
- agtcagagaataactaagctaattca
- 38
- agtcagagaataactaagctaattcaaa
- 39
- gagtcagagaataactaagctaattca
- 40
- gcgtctgcgaagctgac
- 41
- cgcgtctgcgaagctg
- 42
- tgagtgaaaggcgtace
- 43
- tgagtctctcaaaatctcaaa
- SEQ ID NO.
- Secuencias
- 44
- tgagtctctcaaaatctcaa
- 45
- aacaaatcaatatatcaccgaggtatattgatga
- 46
- aacaaatcaatatatcaccgaggtatattgat
- 47
- ggaacaagctgaaaaattgaaaacaaatc
- 48
- gtaagtaatcggtattaa
- 49
- atatattaccgaggtatattgatgagt
- 50
- gacgccaattgcgcggtatg agtgaa
- 51
- ggcgtaccacttatctgac
- 52
- ggcgtaccacactatagtctgat
- 53
- cctaagagatacgtagttatgtg
- 54
- taatctcttgratataaaacaatgattcagagtatattaggaatagtatactgygaattat
- 55
- atataaaacaatgattcagagtatattaggaatagtatactg
- 56
- taatctcttgaatataaaataataattcafaftatattagcaatagtatactgcgaattayttt
- 57
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Claims (8)
- 5101520253035REIVINDICACIONES1. Un conjunto de al menos dos sondas de polinucleotidos para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus, comprendiendo cada sonda de 5 a 50 nucleotidos e hibridando dichas sondas espedficamente en posiciones adyacentes separadas por no mas de 25 nucleotidos entre dichas dos sondas en cualquiera de los acidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 17, su forma de ARN en la que T se sustituye por U, la forma complementaria de las mismas, o polinucleotidos homologos equivalentes que comparten al menos un 80 % de homologfa con los correspondientes polinucleotidos no modificados de las SEQ ID NO 1 a 17.
- 2. Un conjunto de al menos dos sondas de polinucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dichas sondas se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO 18 a 67.
- 3. Un conjunto de tres sondas de polinucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, comprendiendo cada sonda de 5 a 50 nucleotidos e hibridando dichas sondas espedficamente en posiciones adyacentes separadas por no mas de 25 nucleotidos entre sondas adyacentes en cualquiera de los acidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1 a 17, su forma de ARN en la que T se sustituye por U, la forma complementaria de las mismas, o polinucleotidos homologos equivalentes que comparten al menos un 80 % de homologfa con los correspondientes polinucleotidos no modificados de las sEq ID NO 1 a 17.
- 4. Una composicion que comprende al menos un conjunto de al menos dos sondas de polinucleotidos descritas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
- 5. Un procedimiento para detectar o identificar especies de Proteus utilizando al menos un conjunto de al menos dos sondas de polinucleotidos como se expone en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas sondas se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO 18 a 67.
- 6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5 para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus en una muestra que comprende las etapas de:(i) si es necesario, liberar, aislar y/o concentrar los acidos polinucleicos presentes en la muestra;(ii) amplificar la(s) region(es) espaciadora(s) de ARNr de 16S-23S, o al menos una de la(s) secuencia(s) diana que comprende(n) cualquier/cualesquiera molecula(s) de acido nucleico como se describe(n) en la reivindicacion 1, con al menos un par cebador adecuado;(iii) poner en contacto los acidos polinucleicos con al menos un conjunto de al menos dos sondas de polinucleotidos que hibridan espedficamente en posiciones adyacentes separadas por no mas de 25 nucleotidos entre sondas adyacentes, seleccionadas dichas sondas del grupo que consiste en las SEQ ID NO 18 a 67;(iv) detectar los dbridos formados e(v) interpretar la(s) senal(es) obtenida(s) y deducir la presencia de especies de Proteus y/o la identificacion de las especies de Proteus en la muestra.
- 7. Un procedimiento segun la reivindicacion 5 o 6, en el que las dos sondas de polinucleotidos consisten en cualquier combinacion de los polinucleotidos de la Tabla 2.
- 8. Un kit para la deteccion y/o identificacion de especies de Proteus que comprende los siguientes componentes:- un conjunto de al menos dos sondas de polinucleotidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,- un tampon de hibridacion, o componentes necesarios para producir dicho tampon.
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