ES2595094T3 - Cepas de Bordetella vivas, atenuadas, como vacuna de dosis única contra la tos ferina - Google Patents
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Abstract
Una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos: (a) un gen de toxina pertussis (ptx) mutado, en el cual la porción S1 de dicho gen ptx mutado codifica una toxina, que es enzimáticamente inactiva pero no está afectada inmunológicamente, (b) un gen dermonecrótico (dnt) eliminado o un gen dnt mutado, donde dicho gen dnt mutado está mutado por mutación puntual o por inserción de una secuencia genética o un plásmido que interrumpe el marco de lectura abierto del gen dnt, y en donde dicho gen dnt mutado codifica una proteína DNT enzimáticamente inhibida, y (c) un gen ampG de E. coli que sustituye el gen ampG de Bordetella, donde dicha cepa expresa menos de 5% de actividad de TCT residual.
Description
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DESCRIPCION
Cepas de Bordetella vivas, atenuadas, como vacuna de dosis unica contra la tos ferina Campo de la invencion
La solicitud describe una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo. La invencion se refiere a una cepa de Bordetella mutada, mas particularmente a una cepa de Bordetella atenuada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo segun se define en las reivindicaciones. La cepa de Bordetella mutada, atenuada, se puede utilizar en una composicion inmunogena o una vacuna para el tratamiento o la prevencion de una infeccion por Bordetella. En la solicitud se describen el uso de la cepa de Bordetella atenuada para la fabricacion de una vacuna o composiciones inmunogenas, asf como a metodos para proteger a los mairnferos contra la infeccion por Bordetella. La invencion se refiere a composiciones inmunogenas y vacunas, asf como a los usos de una cepa de la invencion en la fabricacion de vacunas.
Antecedentes de la invencion y estado de la tecnica relacionado
La tos ferina sigue estando entre las principales causas de muerte en todo el mundo, y su incidencia esta aumentando incluso en pafses con alta cobertura de vacuna. Aunque todas las edades son susceptibles, es mas grave en los ninos demasiado pequenos para ser protegidos por las vacunas disponibles en la actualidad.
La tos ferina o pertussis es una enfermedad infantil grave responsable de altos tasas de mortalidad antes de la introduccion de vacunas eficaces en la segunda mitad del siglo Xx. El exito de estas vacunas ha llevado a la opinion de que la enfermedad esta esencialmente bajo control, aunque todavfa se registran anualmente en todo el mundo 200 000 a 400 000 muertes vinculadas a la tos ferina, y la enfermedad todavfa ocupa el sexto lugar entre las causas de mortalidad debido a agentes infecciosos [1]. Aunque sobre todo es frecuente en los pafses en desarrollo, la enfermedad tambien esta resurgiendo en el mundo desarrollado [2, 3], incluso en Estados Unidos, donde la incidencia ha aumentado cinco veces en los ultimos veinte anos [4]. Inesperadamente, la epidemiologfa de la tos ferina ha cambiado en pafses con alta cobertura de vacuna, donde los casos de tos ferina de adolescentes y adultos son cada vez mas frecuentes [5]. Esto se debe probablemente a la progresiva disminucion de la inmunidad inducida por la vacuna durante la adolescencia. La tos ferina a menudo atfpica y por lo tanto diffcil de diagnosticar, no es generalmente mortal en adultos y en muchos casos pasa desapercibida. Sin embargo, los adultos infectados constituyen un importante reservorio para la transmision de la enfermedad a ninos muy pequenos, demasiado pequenos para ser vacunados completamente, y por lo tanto que corren riesgo de sufrir la enfermedad grave asociada a altas tasas de mortalidad.
La vacuna contra la tos ferina comienza generalmente a los dos meses de edad y la proteccion total requiere al menos tres vacunas a intervalos de uno a dos meses. Por lo tanto, los recien nacidos no quedan totalmente protegidos antes de los 6 meses de edad con las vacunas disponibles en la actualidad. Para reducir la incidencia de tos ferina en los grupos etarios muy jovenes y mas vulnerables, sena muy deseable la inmunizacion temprana, posiblemente al nacer. Sin embargo, numerosos estudios en humanos y en modelos animales han sugerido que el sistema inmunitario neonatal es demasiado inmaduro para inducir eficazmente inmunidad protectora mediante una vacuna [6, 7]. Especialmente la produccion de IFN-y, indicativa de una respuesta Th1 que es esencial para el desarrollo de la inmunidad protectora a la tos ferina [8], parece reducirse significativamente en humanos recien nacidos, en comparacion con ninos mayores o con los adultos [9]. Esto tambien se refleja en el hecho de que solo se producen cantidades importantes de IFN-y en respuesta a antfgenos espedficos despues de varios meses (> 6 meses) en los ninos vacunados con vacunas contra la tos ferina, especialmente con las vacunas acelulares (aPV) [10].
Se ha considerado durante mucho tiempo que la infeccion natural con Bordetella pertussis induce una inmunidad fuerte y duradera, que disminuye mucho despues que la inmunidad inducida por la vacuna [5, 11]. Ademas, la infeccion con B. pertussis induce una respuesta inmunitaria medible tipo Th1 espedfica para el antfgeno, incluso en ninos muy pequenos (de tan solo un mes de edad) [12]. Estas observaciones sugieren que las vacunas de microorganismos vivos aplicables por via nasal para imitar tanto como sea posible la infeccion natural, pueden ser alternativas atractivas respecto a las vacunas disponibles en la actualidad.
Se conocen muchas composiciones de vacunacion para tratar infecciones por Bordetella en el area. Sin embargo, estas composiciones inmunogenas no se utilizan para el tratamiento de los ninos recien nacidos o en los casos en que se requiere una inmunidad epidemica y protectora rapida.
Por lo tanto, la patente francesa FR 0206666 y la solicitud PCT WO 03/102170 dan a conocer cepas de Bordetella vivas que se han tornado deficientes en al menos dos toxinas entre PTX, DNT, AC y TCT. Esta patente da a conocer la sobreexpresion de un gen ampG endogeno mediante la adicion de un promotor fuerte y la adicion de 11
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aminoacidos terminales del gen ampG de E. coli.
Mielcarek et al., Vaccine (2006; 24S2: S2/54-S2-55) dan a conocer una cepa de Bordetella pertussis atenuada de PTX", DTN" y TCT" para utilizar en la inmunizacion de ratones. Esta referencia da a conocer que para reducir la produccion de citotoxina traqueal, se debe sobreexpresar el gen ampG. Sin embargo, con la evaluacion posterior, los autores se dieron cuenta de que mediante la sobreexpresion del gen ampG hay un aumento en la citotoxina traqueal y no una disminucion como se penso originalmente.
Mielcarek et al in Advance Drug Delivery Review 51 (2001) pags. 55-69 dan a conocer que las vacunas de microorganismos vivos pueden inducir respuestas sistemicas y en las mucosas cuando se administran por via oral o nasal.
Roduit et al en Infection and Immunity (2002 Jul; 70(7): 3521-8) describen la vacunacion de neonatos y lactantes con cepas de Bordetella mutadas con una composicion de DTP.
Mattoo et al., en Frontiers of Bioscience 6, e168-e186 (2001), sugieren reemplazar el gen ampG endogeno de Bordetella con el gen ampG de E. coli, lo que resulta en una disminucion de la cantidad de TCT producida.
Mattoo y Cherry 2005 (Clinical Microbiology Reviews 18(2): 326-382) se refieren a la patogenia molecular, la epidemiologfa y las manifestaciones clmicas de las infecciones respiratorias por Bordetella pertussis y otras subespecies de Bordetella.
Por lo tanto, el estado anterior de la tecnica aunque da a conocer varios tipos de composiciones de vacunacion no aborda el problema de proporcionar una vacuna o una composicion inmunogena que pueda proporcionar proteccion a un recien nacido antes de los seis meses. Ademas, el estado anterior de la tecnica no da a conocer un sistema inmunogeno o una vacuna que proporcione rapida inmunidad protectora contra una infeccion por Bordetella. El estado anterior de la tecnica tambien falla en dar a conocer una composicion inmunogena o una vacuna que proporcione rapida inmunidad protectora contra una infeccion por Bordetella, donde dicha inmunidad protectora aumente durante al menos los dos meses siguientes a la vacunacion.
Por lo tanto, un objetivo de la invencion es superar las deficiencias del estado anterior de la tecnica.
Otro objetivo de la invencion es producir una posible vacuna de microorganismo vivo atenuado o una composicion inmunogena, a traves de la atenuacion genetica de una cepa de Bordetella como B. pertussis o B. parapertussis a fin de disminuir la patogenicidad, manteniendo la capacidad de colonizar e inducir inmunidad protectora.
Otro objetivo de la invencion es producir una vacuna o una composicion inmunogena que induzca proteccion en los recien nacidos despues de una sola administracion intranasal que sea superior a la proteccion proporcionada por la aPV actual.
Aun otro objetivo de la invencion es proporcionar proteccion contra la infeccion por Bordetella parapertussis asf como por Bordetella pertussis que no se observo despues de la vacunacion con aPV.
Otro objetivo de la invencion es inducir inmunidad protectora fuerte en recien nacidos contra la infeccion por Bordetella.
Todavfa otro objetivo de la invencion es proporcionar una vacuna o una composicion inmunogena que induzca inmunidad en las mucosas y sistemica.
Otro objetivo de la invencion es producir una cepa de Bordetella pertussis viva, atenuada, como una vacuna nasal monodosis en los primeros anos de vida, denominada BPZE1.
Aun otro objetivo de la invencion es proporcionar una vacuna que no solo pueda ser utilizada para vacunar a los recien nacidos, sino que pueda ser utilizada en todos los mairnferos de cualquier edad en el caso de una epidemia de tos ferina.
Otro objetivo de la invencion es proporcionar una vacuna contra la infeccion por Bordetella que induzca una rapida inmunidad protectora y/o una inmunidad protectora que aumente durante al menos los dos meses siguientes a la vacunacion.
Todavfa otro objetivo de la invencion es proporcionar prevencion o tratamiento contra la infeccion por Bordetella que tenga costos de produccion relativamente bajos.
Estos y otros objetivos se logran mediante la invencion como lo demuestran el resumen de la invencion, la
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descripcion de las realizaciones preferidas y las reivindicaciones.
Resumen de la invencion
Las reivindicaciones definen la materia para la cual se busca proteccion, cualquier afirmacion que vaya mas alla de lo que se define en las reivindicaciones se proporciona unicamente con fines informativos.
La invencion proporciona una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen de toxina pertussis (ptx) mutado, un gen de toxina dermonecrotica (dnt) eliminado o mutado y un gen ampG heterologo segun se define en las reivindicaciones.
En otro aspecto la invencion se refiere a una composicion inmunogena que comprende una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen de toxina pertussis (ptx) mutado, un gen de toxina pertussis dermonecrotica (dnt) eliminado o mutado y un gen ampG heterologo segun se define en las reivindicaciones.
Aun en otro aspecto la invencion proporciona una vacuna que comprende la cepa de Bordetella atenuada que comprende al menos un gen de toxina pertussis (ptx) mutado, un gen de toxina pertussis dermonecrotica (dnt) eliminado o mutado y un gen ampG heterologo segun se define en las reivindicaciones.
Aun en otro aspecto, la invencion proporciona el uso de una cepa de Bordetella atenuada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo segun se define en las reivindicaciones, para la fabricacion de una vacuna destinada a la prevencion de una infeccion por Bordetella.
Todavfa en otro aspecto, la invencion proporciona el uso de una cepa de Bordetella atenuada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo segun se define en las reivindicaciones, para la fabricacion de una vacuna destinada a inducir una respuesta inmunitaria dirigida preferentemente a la via Th1 contra dicha Bordetella atenuada.
La solicitud tambien proporciona un metodo de proteccion de un mairnfero contra la enfermedad causada por la infeccion por Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis que comprende administrar a dicho marnffero que necesita dicho tratamiento una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo.
Tambien es parte de la solicitud un metodo para proporcionar una rapida inmunidad protectora contra una infeccion por Bordetella que comprende administrar a dicho marnffero que necesita dicho tratamiento una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo.
Tambien es otro aspecto de la solicitud un metodo para proporcionar una rapida inmunidad protectora contra una infeccion por Bordetella que comprende administrar a un marnffero que necesita dicho tratamiento una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo, o una vacuna que comprende dicha cepa de Bordetella mutada, donde dicho metodo proporciona ademas un aumento en dicha inmunidad protectora durante al menos dos meses despues de la vacunacion.
Aun es otro aspecto de la invencion el uso de la cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo segun se define en las reivindicaciones, para la preparacion de una vacuna polivalente (es decir, una vacuna para prevenir o tratar las infecciones causadas por diferentes patogenos) destinada al tratamiento de las enfermedades respiratorias.
Tambien es parte de la solicitud, el uso de una cepa de Bordetella atenuada de la invencion, mediante administracion a los mamnferos que necesitan una rapida inmunidad protectora contra una infeccion por Bordetella, donde dicha inmunidad protectora aumenta durante al menos dos meses despues de la administracion.
Todavfa es otro aspecto de la solicitud, un metodo para proporcionar una respuesta en las mucosas y una respuesta sistemica para tratar infecciones por Bordetella en mamfferos o proteger contra ellas.
La invencion se refiere a una cepa de Bordetella mutada como se define en las reivindicaciones, asf como a una composicion inmunogena que comprende una cepa de Bordetella mutada de la invencion, a una vacuna de una cepa de Bordetella atenuada de la invencion, a una cepa de Bordetella mutada de la invencion para utilizar como vector para expresar al menos un antfgeno heterologo, al uso de una cepa de Bordetella atenuada de la invencion para la fabricacion de una vacuna destinada a la prevencion de una infeccion por Bordetella, al uso de una cepa de Bordetella atenuada de la invencion para la fabricacion de una vacuna para la prevencion simultanea de una infeccion por B. pertussis y B. parapertussis y al uso de una cepa de Bordetella mutada de la invencion para la preparacion de una vacuna polivalente destinada al tratamiento de enfermedades respiratorias.
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Breve descripcion de las figuras
Fig. 1 es un grafico de barras que ilustra la TCT presente en los sobrenadantes de cultivos de BPSM y BPZE1 expresada como las medias de nM/DO540nm (± error estandar) de 3 cultivos separados para cada cepa.
Fig. 2 es un analisis de inmunotransferencia enzimatica de la produccion de PTX en los sobrenadantes del cultivo de BPSM (carril 1) y BPZE1 (carril 2). Los tamanos de los marcadores Mr se expresan en kDa y se indican en el margen izquierdo.
Fig. 3 es un analisis de transferencia de Southern del locus dnt en BPSM (carril 1) y BPZE1 (carril 2). Las longitudes de los marcadores de tamano se indican en pares de bases (bp) y se muestran en el margen izquierdo.
Fig. 4 es un grafico que ilustra el ritmo de crecimiento de BPSM (lmea negra) y BPZE1 (lmea punteada) en cultivo lfquido.
Fig. 5 son micrograffas electronicas representativas de BPSM (izquierda) y BPZE1 (derecha) cultivados en medio lfquido durante 24 h.
Fig. 6 es un grafico que ilustra la adherencia in vitro de BPSM (columnas negras) y BPZE1 (columnas blancas) a celulas epiteliales pulmonares humanas A549 (izquierda) y a celulas muridas tipo macrofagos J774 (derecha). Los resultados se expresan como las medias de los porcentajes de bacterias que se unen en relacion con las bacterias presentes en el inoculo de tres experimentos diferentes.
Fig. 7 es un grafico que ilustra la colonizacion pulmonar por BPSM (lmeas negras) y BPZE1 (lmeas punteadas) de ratones adultos infectados por via intranasal con 106 ufc de BPZE1 o BPSM. Los resultados se expresan como la media (± error estandar) de unidades formadoras de colonias de tres a cuatro ratones por grupo y son representativos de dos experimentos independientes.* , P = 0.004.
Fig. 8 son fotograffas de un analisis histologico de los pulmones de ratones adultos infectados con BPZE1 (panel superior) o BPSM (panel central) en comparacion con los controles que recibieron PBS (panel inferior). Una semana despues de la infeccion, los pulmones se extrajeron asepticamente y se fijaron en formaldehndo. Los cortes se tineron con hematoxilina y eosina y se examinaron por microscopfa de luz.
Fig. 9 son graficos que ilustran la proteccion contra B. pertussis en ratones adultos (a) y ratones recien nacidos (b) o B. parapertussis en ratones recien nacidos (d). Los ratones inmunizados con BPZE1, aPV o PBS (sin exposicion) fueron provocados con BPSM (a y b) o B. parapertussis (d), y se determinaron los recuentos de UFC pulmonares 3 h (barras blancas) o 7 dfas (barras negras) mas tarde. Los resultados se expresan como la media (± error estandar) de unidades formadoras de colonias de 3-4 ratones por grupo y son representativos de dos experimentos independientes. (b,*, P = 0.009; d,*, P = 0.007) (c) recuentos de UFC 3 h despues de la provocacion con BPSM en ratones adultos vacunados con BPZE1 o aPV, en comparacion con los controles. Los resultados de 3 experimentos independientes se expresan como porcentajes de UFC de cada raton en relacion con la media de UFC en el grupo de no vacunados del mismo experimento.
Fig. 10 son graficos de barras que ilustran las respuestas inmunitarias inducidas por inmunizacion con BPZE1 o aPV. (a) tftulos de IgG(H+L) anti-FHA y (b) cocientes IgG1/IgG2a antes (barras blancas) o 1 semana despues de la provocacion con BPSM (barras negras) en ratones inmunizados con BPZE1 o aPV, en comparacion con los controles. (c) cocientes entre IFN-y e IL-5 producidos por esplenocitos de ratones estimulados con FHA, PTX o ConA vacunados 2 meses antes con BPZE1 (barras negras) o aPV (barras blancas), en comparacion con los controles (barras grises). Se midieron los anticuerpos y las citocinas en cada raton, y los resultados se expresan como la media de los valores (± error estandar) para los 4 ratones por grupo analizados, por triplicado.
Fig. 11 es la secuencia de aminoacidos de la toxina pertussis (SEQ ID NO: 1) (protema S1 activadora de islotes). Los primeros 34 aminoacidos son la secuencia senal, mientras que los aminoacidos 35 a 269 son la cadena madura.
Fig. 12 en la secuencia de aminoacidos de la toxina dermonecrotica (SEQ ID NO:2).
Fig. 13 en la secuencia de aminoacidos de AmpG de Bordetella pertussis (SEQ ID NO:3).
Fig. 14 en la secuencia de aminoacidos de AmpG de Escherichia coli (SEQ ID NO:4).
Descripcion de las realizaciones preferidas de la invencion
Segun se usa en este documento, la abreviatura "PTX" se refiere a la toxina pertussis, que sintetiza y segrega una toxina ADP-ribosilante. PTX esta compuesta por seis polipeptidos S1 a S5, la porcion enzimaticamente activa se denomina S1. PTX tiene una secuencia senal de 34 aminoacidos, mientras que la cadena madura consiste en los aminoacidos 35 a 269. PTX es el factor de virulencia principal expresado por B. pertussis. La porcion A de estas toxinas tiene actividad de ADP-ribosiltransferasa y la porcion B hace de mediadora de la union de la toxina a los receptores de las celulas huesped y la traslocacion de A a su sitio de accion (57).
Segun se usa en este documento la abreviatura "DNT" se refiere a la toxina pertussis dermonecrotica, que es una toxina termolabil que induce lesiones localizadas en ratones y otros animales de laboratorio cuando se inyecta por
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v^a intradermica. Es mortal para los ratones cuando se inyecta en dosis bajas por via intravenosa (58 a 61). DNT se considera un factor de virulencia para la produccion de atrofia del cornete nasal en la rinitis atrofica porcina (62, 63).
Segun se usa en este documento la abreviatura "TCT" se refiere a la citotoxina traqueal, que es un factor de virulencia sintetizado por Bordetellae. TCT es un fragmento de peptidoglicano y tiene la capacidad de inducir la produccion de interleucina-1 y oxido mtrico sintasa. Tiene la capacidad de causar estasis ciliar y tiene efectos mortales en las celulas epiteliales respiratorias.
El termino "mairnfero" abarca cualquiera de los diversos animales vertebrados de sangre caliente de la clase Mammalia, incluidos los seres humanos, caracterizados por una cubierta de pelo sobre la piel y en las hembras, glandulas mamarias productoras de leche para alimentar a las cnas.
El termino "atenuada" significa una cepa de Bordetella debilitada, menos virulenta que es capaz de estimular una respuesta inmunitaria y crear inmunidad protectora, pero no causa ninguna enfermedad.
La terminologfa "rapida inmunidad protectora" significa que la inmunidad contra la Bordetella es conferida en un plazo corto despues de la administracion de la cepa de Bordetella mutada de la invencion. Por "plazo corto" se quiere dar a entender vacunados y provocados una semana mas tarde. Mas espedficamente, hay una rapida expansion de los linfocitos perifericos espedficos para los patogenos, CD8+ efectores citotoxicos (CTL) y linfocitos cooperadores CD4+. Los linfocitos cooperadores CD4+ inducen la maduracion de los linfocitos B y la produccion de anticuerpos. Por lo tanto, los linfocitos con el acumulo de memoria estan a punto de proliferar rapidamente en el momento de la infeccion subsiguiente.
La expresion "cepa de Bordetella" abarca cepas de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis y Bordetella bronchiseptica.
La expresion "Infeccion por Bordetella" significa una infeccion causada por al menos una de las tres cepas siguientes: Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis y Bordetella bronchiseptica.
Por “nino” se entiende una persona o un mai^ero entre 6 meses y 12 anos de edad.
Mediante la expresion "recien nacido" se entiende, una persona o un marnffero entre 1 dfa de edad y 24 semanas de edad.
El termino "tratamiento" segun se usa en este documento no se restringe a curar una enfermedad y eliminar sus causas sino particularmente significa curar, mitigar, eliminar o disminuir los smtomas asociados a la enfermedad de interes, o prevenir o reducir la posibilidad de contraer cualquier trastorno o cualquier disfuncion del organismo del huesped.
Los terminos "proteccion" y "prevencion" se utilizan aqu indistintamente y significan que una infeccion por Bordetella es impedida.
"Vacuna profilactica" significa que esta vacuna previene la infeccion por Bordetella en una futura exposicion.
Por "preferencialmente hacia la via Th1" significa que la via Th1 es favorecida respecto a la via Th2.
La expresion "composicion inmunogena" significa que la composicion puede inducir una respuesta inmunitaria y por lo tanto es antigenica. Por "respuesta inmunitaria" se quiere dar a entender cualquier reaccion del sistema inmunitario. Estas reacciones incluyen la alteracion en la actividad del sistema inmunitario de un organismo en respuesta a un antfgeno y pueden implicar, por ejemplo, la produccion de anticuerpos, la induccion de inmunidad mediada por celulas, la activacion del complemento o el desarrollo de tolerancia inmunologica.
Mas espedficamente, la invencion proporciona una cepa de Bordetella al menos triplemente mutada que puede ser utilizada como una composicion inmunogena o una vacuna. Se apreciara que la cepa de Bordetella al menos triplemente mutada contiene un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo. El producto del gen ampG heterologo reduce en gran medida la cantidad de citotoxina traqueal que se produce.
La invencion no se limita solo a los triplemente mutantes descritos antes. Se pueden llevar adelante otras mutaciones adicionales como mutantes deficientes en adenilato ciclasa (AC) (64), mutantes deficientes en lipopolisacarido (LPS) (65), hemaglutinina filamentosa (FHA) (66) y cualquiera de los componentes regulados por bvg (67).
La cepa de partida que se muta puede ser cualquier cepa de Bordetella como Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis y Bordetella bronchiseptica. En un aspecto la cepa de partida utilizada para obtener la cepa de
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Bordetella mutada es B. pertussis.
La construccion de la cepa de Bordetella mutada comienza con el remplazo del gen ampG de Bordetella en la cepa con un gen ampG heterologo. Se puede usar cualquier gen ampG heterologo en la invencion. Estos incluyen todas las bacterias gramnegativas que liberan muy pequenas cantidades de fragmentos de peptidoglicano en el medio por generacion. Los ejemplos de bacterias gramnegativas incluyen, pero no exclusivamente, Escherichia coli, Salmonella, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Legionella y similares.
Al reemplazar el gen ampG de Bordetella con un gen ampG heterologo, la cantidad de citotoxina traqueal (TCT) producida en la cepa resultante expresa menos del 1% de actividad de TCT residual. En otra realizacion, la cantidad de toxina TCT expresada por la cepa resultante esta entre 0.6% y 1% de actividad de TCT residual o entre 0.4% y 3% de actividad de TCT residual o entre 0.3% y 5% de actividad de TCT residual.
PTX es un factor de virulencia importante responsable de los efectos sistemicos de las infecciones por B. pertussis, asf como uno de los principales antfgenos protectores. Debido a sus propiedades, el gen ptx natural es reemplazado por una version mutada de modo que la porcion enzimaticamente activa S1 codifica una toxina enzimaticamente inactiva, pero las propiedades inmunogenas de la toxina pertussis no son afectadas. Esto se puede lograr reemplazando la arginina (Arg) de la posicion 9 de la secuencia con una lisina (Lys). Ademas, se reemplaza un acido glutamico (Glu) de la posicion 129 con una glicina (Gly).
Se pueden llevar a cabo otras mutaciones como las descritas en la patente de Estados Unidos 6,713,072, asf como cualquier mutacion conocida u otras capaces de reducir la actividad de la toxina a niveles indetectables. Se usa primero intercambio alelico para eliminar el operon ptx y luego insertar la version mutada.
Finalmente, el gen dnt es eliminado de la cepa de Bordetella mediante intercambio alelico. Ademas de la eliminacion total, la actividad enzimatica tambien puede ser inhibida por una mutacion puntual. Dado que DNT esta constituida por un dominio de union a receptores en la region N-terminal y un dominio catalttico en la parte C-terminal, una mutacion puntual en el gen dnt para reemplazar Cys-1305 con Ala-1305 inhibe la actividad enzimatica de DNT (68). DNT ha sido identificada como una toxina importante de Bordetella bronchiseptica y muestra una actividad letal luego de la inyeccion de cantidades diminutas (26).
Ademas del intercambio alelico para insertar el gen ptx mutado y el gen dnt inhibido o eliminado, el marco de lectura abierto de un gen puede ser interrumpido por insercion de una secuencia genetica o un plasmido. Este metodo tambien esta contemplado en la invencion.
La cepa triplemente mutada de la invencion se denomina una cepa BPZE1 y fue depositada en la Coleccion Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM) en Paris, Francia el 9 de marzo de 2006 con el numero CNCM I- 3585. Las mutaciones introducidas en BPZE1 resultan en la atenuacion drastica, pero permiten a las bacterias colonizar y persistir. Por lo tanto, en otra realizacion la invencion proporciona BPZE1, que puede inducir inmunidad en las mucosas e inmunidad sistemica al ser administrada. En otro aspecto, BPZE1 se administra por via intranasal.
Las cepas mutadas de Bordetella de la invencion pueden ser utilizadas en composiciones inmunogenas. Dichas composiciones inmunogenas son utiles para aumentar una respuesta inmunitaria, ya sea una respuesta de anticuerpos y/o preferentemente una respuesta de linfocitos T, en los mairnferos. Ventajosamente, la respuesta de los linfocitos T es tal, que protege a un mai^ero contra la infeccion por Bordetella o contra sus consecuencias.
Las cepas de Bordetella mutadas de la invencion se pueden utilizar en las vacunas o composiciones inmunogenas como cepas vivas o cepas muertas eliminadas qmmica o termicamente. En un aspecto, se utilizan las cepas vivas para la administracion nasal, mientras que las cepas muertas eliminadas qmmica o termicamente se pueden utilizar para la administracion sistemica o en las mucosas.
La composicion inmunogena puede contener ademas un excipiente, portador y/o vehfculo farmaceuticamente adecuado, cuando se utiliza para la administracion sistemica o local. Los vetnculos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no exclusivamente, soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua destilada, emulsiones tales como emulsiones de un aceite en agua, diversos tipos de soluciones esteriles de humectantes y similares.
La composicion inmunogena de la invencion tambien puede contener adyuvantes, es decir, cualquier sustancia o compuesto capaz de promover o aumentar una respuesta mediada por linfocitos T y particularmente una respuesta inmunitaria mediada por CD4+ o CD8+ contra el principio activo de la invencion. Se pueden utilizar adyuvantes como peptidos muramnlicos por ejemplo MDP, IL-12, fosfato de aluminio, hidroxido de aluminio, alumbre o Montanide®, en las composiciones inmunogenas de la invencion.
Un experto en el area apreciara que se utilizan adyuvantes y emulsiones en las composiciones inmunogenas cuando se utilizan en las vacunas o composiciones inmunogenas cepas de Bordetella mutadas tratadas qmmica o
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termicamente.
Las composiciones inmunogenas de la invencion contienen ademas al menos una molecula con un efecto profilactico contra una infeccion por Bordetella o los efectos perjudiciales de la infeccion por Bordetella, como un acido nucleico, una protema, un polipeptido, un vector o un farmaco.
La composicion inmunogena de la invencion se utiliza para provocar una respuesta inmunitaria de los linfocitos T en un huesped al cual se administra la composicion. Todas las composiciones inmunogenas descritas antes se pueden inyectar en un huesped a traves de diferentes vfas: inyeccion subcutanea (s.c.), intradermica (i.d.), intramuscular (i.m.) o intravenosa (i.v.), administracion oral y administracion intranasal o inhalacion.
Cuando se formula para inyeccion subcutanea, la composicion inmunogena o vacuna de la invencion, comprende preferentemente entre 10 y 100 |jg de la cepa de Bordetella por dosis de inyeccion, mas preferentemente de 20 a 60 jg/dosis, especialmente alrededor de 50 jg/dosis, en una unica inyeccion.
Cuando se formula para la administracion intranasal, la cepa de Bordetella se administra en una dosis de aproximadamente 1 x 103 a 1 x 106 bacterias, dependiendo del peso y la edad del mairnfero que la recibe. En otro aspecto, se puede utilizar una dosis de 1 x 104 a 5 x 106
Las cepas de Bordetella mutadas de la invencion se pueden utilizar como una vacuna atenuada para proteger contra futuras infecciones por Bordetella. En este sentido, una ventaja de la invencion es que se puede administrar una unica dosis a los marnfferos y la proteccion puede persistir durante al menos mas de dos meses, particularmente mas de seis meses. La vacuna de la invencion puede ser administrada a los recien nacidos y protege contra la infeccion de tos ferina. Esto es especialmente importante ya que la tasa de mortalidad de las infecciones por Bordetella pertussis es de alrededor de 1.3% para recien nacidos menores de 1 mes.
Por otra parte, las vacunas de la invencion se pueden utilizar en marnfferos adultos cuando hay una epidemia o en adultos mayores mayores de 60 anos, puesto que el riesgo de complicaciones puede ser mas alto que el de los ninos mayores o los adultos sanos.
Las vacunas se pueden formular con los excipientes fisiologicos indicados antes de la misma manera que en las composiciones inmunogenas. Por ejemplo, los vehfculos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no exclusivamente, soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua destilada, emulsiones tales como emulsiones de un aceite en agua, diversos tipos de soluciones esteriles de humectantes y similares. Se pueden utilizar adyuvantes como peptidos muramflicos por ejemplo MDP, IL-12, fosfato de aluminio, hidroxido de aluminio, alumbre y/o Montanide®, en las vacunas.
Las vacunas de la invencion son capaces de inducir altos tftulos de IgG serica contra FHA. El analisis de los patrones de citocinas espedficas de los antfgenos revelo que la administracion de las cepas de Bordetella mutadas, atenuadas, de la invencion favorecio una respuesta TH1 fuerte.
Las vacunas de la invencion proporcionan un alto nivel de proteccion contra una infeccion por Bordetella, es decir, un nivel de proteccion superior al 90%, particularmente superior al 95%, mas particularmente superior al 99% (calculado 7 dfas despues de la infeccion como se detalla en el ejemplo 9). El nivel de proteccion de la vacuna que contiene la cepa BPZE1 alcanza mas del 99.999% en comparacion con ratones no vacunados (sin exposicion), al menos dos meses despues de la vacunacion.
Las vacunas se pueden administrar por inyeccion subcutanea (s.c.), intradermica (i.d.), intramuscular (i.m.) o intravenosa (i.v.), administracion oral y administracion intranasal o inhalacion. La administracion de la vacuna es generalmente en una unica dosis. Alternativamente, la administracion de la vacuna de la invencion se hace una primera vez (vacunacion inicial), seguida por al menos un refuerzo (administracion subsiguiente), con la misma cepa, composicion o vacuna, o con vacunas acelulares, o una combinacion de ambas.
En un aspecto, se lleva a cabo la administracion intranasal o inhalacion de las vacunas, este tipo de administracion tiene bajo costo y permite la colonizacion por las cepas atenuadas de la invencion del aparato respiratorio: el aparato respiratorio superior (nariz y fosas nasales, senos paranasales y garganta o faringe) y/o las vfas respiratorias (caja de voz o laringe, traquea, bronquios y bronqmolos) y/o los pulmones (bronqmolos respiratorios, conductos alveolares, sacos alveolares y alveolos).
La administracion intranasal se lleva a cabo con una composicion inmunogena o una vacuna en forma de solucion lfquida, suspension, emulsion, liposoma, una crema, un gel o similar como una composicion multifasica. Las soluciones y suspensiones se administran como gotas. Las soluciones tambien se pueden administrar como una niebla fina desde un frasco de aerosol nasal o desde un inhalador nasal. Los geles se dispensan en jeringas pequenas que contienen la dosis necesaria para una aplicacion.
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La inhalacion se lleva a cabo con una composicion inmunogena o una vacuna en forma de soluciones, suspensiones y polvos; estas formulaciones se administran a traves de un aerosol o un inhalador de polvo seco. Los polvos compuestos se administran con insufladores o sopladores.
Aun otro aspecto de la invencion es el uso de las cepas de Bordetella mutadas que comprenden al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo para la preparacion de una vacuna polivalente destinada al tratamiento de enfermedades respiratorias. En este sentido, la cepa de Bordetella mutada, atenuada, descrita antes, se puede usar como una plataforma de expresion heterologa para transportar antigenos heterologos a la mucosa respiratoria. Por lo tanto, patogenos respiratorios tales como Neisseria, Pneumophila, Yersinia, Pseudomonas, micobacterias, el virus de la gripe y similares, pueden prevenir la infeccion utilizando BPZE1 como un portador.
Tambien esta comprendido por la invencion el uso de las cepas vivas mutadas, atenuadas, de Bordetella descritas aqm, para la fabricacion de una vacuna destinada al tratamiento o la prevencion de la infeccion por Bordetella. En este sentido, la vacuna se puede usar para el tratamiento simultaneo o la prevencion de una infeccion por B. pertussis y B. parapertussis.
Tambien esta comprendido por la invencion el uso de la vacuna para proporcionar rapida inmunidad protectora en caso de una epidemia de tos ferina.
Tambien esta comprendido por la invencion el uso de la vacuna para proporcionar una rapida inmunidad protectora, que aumente durante los al menos dos meses siguientes a la vacunacion.
La vacuna o composicion inmunogena tambien se proporcionan en un kit. El kit comprende la vacuna o composicion inmunogena y un prospecto con las instrucciones para la inmunizacion.
La aplicacion de un metodo para la induccion de respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T y particularmente una respuesta inmunitaria mediada por CD4+ -o una respuesta inmunitaria mediada por CD8+, que comprende administrar las cepas de Bordetella vivas atenuadas de la solicitud a un mairnfero no humano o un marnffero humano.
Otra realizacion de la solicitud es un metodo para proteger a un mamffero contra una infeccion por Bordetella que comprende administrar a dicho marnffero que necesita dicho tratamiento una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo. Este metodo abarca tratar o prevenir infecciones por Bordetella pertussis y/o Bordetella parapertussis. En un aspecto, se usa la cepa BPZE1 en este metodo.
Tambien esta comprendido por la solicitud un metodo para proporcionar una rapida inmunidad protectora contra una infeccion por Bordetella que comprende administrar a dicho marnffero que necesita dicho tratamiento una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen heterologo ampG. En un aspecto, se usa la cepa BPZE1 en este metodo.
Ademas, las cepas de Bordetella vivas mutadas, atenuadas, de la solicitud inducen inmunidad en las mucosas, asf como inmunidad sistemica. Por lo tanto, en otro aspecto la solicitud tambien se refiere a un metodo para inducir inmunidad en las mucosas e inmunidad sistemica al administrar a un marnffero que necesita dicho tratamiento las cepas de Bordetella vivas mutadas atenuadas de la solicitud. En un aspecto se usa la cepa BPZE1 en este metodo.
Ademas de su papel en la prevencion y/o el tratamiento de la infeccion por Bordetella, la cepa mutada de la invencion se puede usar como un vector, para que porte al menos una secuencia adicional de acido nucleico heterologo que codifique un ARN (como el ARN antisentido) o una protema de interes. Esto significa que la cepa mutada tiene al menos una secuencia adicional de acido nucleico heterologo ademas del gen ampG heterologo. En un aspecto, la protema codificada por esta al menos otra secuencia de acido nucleico heterologo es una protema cuya expresion se desea en el aparato respiratorio. En otro aspecto, la protema de interes es un antfgeno, como un antfgeno viral, bacteriano o tumoral, contra el cual se desea una respuesta inmunitaria. Por consiguiente, la cepa de Bordetella mutada que porta al menos otra secuencia de acido nucleico heterologo tambien se puede usar como una vacuna. Las definiciones brindadas antes para la administracion de la vacuna o composicion inmunogena tambien aplican a una vacuna que contiene una cepa de Bordetella mutada que porta al menos otra secuencia de acido nucleico heterologo. Los ejemplos de protemas heterologas son antfgenos de patogenos que causan infecciones o enfermedades asociadas al aparato respiratorio: poliomielitis, gripe (virus de la gripe de la familia Orthomyxoviridae) o antfgenos de neumococos (como Streptococcus pneumoniae).
La solicitud describe los aspectos siguientes:
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1. Una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen de toxina pertussis (ptx) mutado, un gen (dnt) eliminado o mutado y un gen ampG heterologo.
2. La cepa de Bordetella mutada segun el aspecto 1, que es una cepa de Bordetella pertussis.
3. La cepa de Bordetella mutada segun el aspecto 1 o 2, en la que el gen ampG de Bordetella es reemplazado por un gen ampG de E. coli.
4. La cepa de Bordetella mutada segun cualquiera de los aspectos 1 a 3, donde la cepa resultante expresa menos de 5% de actividad de TCT residual.
5. La cepa de Bordetella mutada segun cualquiera de los aspectos 1 a 3, donde la cepa resultante expresa menos de 1% de actividad de TCT residual.
6. La cepa de Bordetella mutada segun cualquiera de los aspectos 1 a 5, en la que la mutacion del genl ptx consiste en la sustitucion de un aminoacido implicado en la union al sustrato y/o un aminoacido implicado en la catalisis.
7. La cepa de Bordetella mutada segun el aspecto 6, que es una cepa de Bordetella pertussis en la que la sustitucion del aminoacido implicado en la union al sustrato es R9K y la sustitucion del aminoacido implicado en la catalisis es E129G.
8. La cepa de Bordetella mutada segun cualquiera de los aspectos 1 a 7 que es una cepa triplemente mutante.
9. La cepa de Bordetella triplemente mutada segun el aspecto 8, que es una cepa BPZE1 depositada en la Coleccion Nacional de Cultivo de Microorganismos (C.N.C.M.) el 9 de marzo de 2006, con el numero I-3585.
10. La cepa de Bordetella mutada segun cualquiera de los aspectos 1 a 9 que es atenuada.
11. Una composicion inmunogena que comprende una cepa de Bordetella mutada segun cualquiera de los aspectos 1 a 10.
12. La composicion inmunogena segun el aspecto 11, que contiene ademas un excipiente, vehuculo y/o portador farmaceuticamente adecuado.
13. La composicion inmunogena segun el aspecto 11 o 12, que contiene ademas un adyuvante.
14. La composicion inmunogena segun cualquiera de los aspectos 11 a 13, que comprende ademas una molecula con un efecto profilactico contra una infeccion por Bordetella o los efectos perjudiciales de la infeccion por Bordetella.
15. La composicion inmunogena segun alguno de los aspectos 11 a 14, en la que dicha cepa de Bordetella mutada es BPZE1.
16. Una vacuna que comprende la cepa de Bordetella atenuada del aspecto 10.
17. Una vacuna segun el aspecto 16, formulada para la administracion intranasal.
18. Un kit que comprende una vacuna segun el aspecto 16 o 17, y un prospecto.
19. La cepa de Bordetella atenuada segun el aspecto 10 para usar como una vacuna contra las infecciones causadas por especies de Bordetella.
20. La cepa de Bordetella atenuada segun el aspecto 19 para usar como una vacuna profilactica contra las infecciones causadas por especies de Bordetella.
21. La cepa de Bordetella atenuada segun el aspecto 19 o 20, donde la especie de Bordetella es B. pertussis o B. parapertussis.
22. La cepa de Bordetella atenuada del aspecto 10 o de cualquiera de los aspectos 19 a 21, donde dicha cepa de Bordetella mutada es BPZE1.
23. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun el aspecto 10 para la fabricacion de una vacuna destinada a la prevencion de una infeccion por Bordetella.
24. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun el aspecto 10 para la fabricacion de una vacuna
destinada a la prevencion simultanea de una infeccion por B. pertussis y B. parapertussis.
25. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun el aspecto 10, para la fabricacion de una vacuna
destinada a inducir una respuesta inmunitaria dirigida preferentemente hacia la via Th1 contra dicha Bordetella
atenuada.
26. El uso de una Bordetella atenuada segun cualquiera de los aspectos 23 a 25, donde la vacuna se administra por via subcutanea (s.c.), intradermica (i.d.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.), oral o intranasal, por inyeccion o por inhalacion.
27. El uso de una Bordetella atenuada segun cualquiera de los aspectos 23 a 25, donde la vacuna se administra por via intranasal.
28. El uso de una Bordetella atenuada segun cualquiera de los aspectos 23 a 25,donde la vacuna se administra a mairnferos que necesitan una rapida inmunidad protectora contra una infeccion por Bordetella.
29. El uso de una Bordetella atenuada segun el aspecto 28, donde la vacuna se administra a recien nacidos.
30. El uso de una Bordetella atenuada segun el aspecto 28, donde la vacuna se administra a ninos.
31. El uso de una Bordetella atenuada segun cualquiera de los aspectos 28 a 30, donde la vacuna se administra por via intranasal.
32. El uso de una Bordetella atenuada segun cualquiera de los aspectos 28 a 31, donde la vacuna se administra una vez en una unica dosis.
33. El uso de una Bordetella atenuada segun cualquiera de los aspectos 23 a 27, que comprende a) administrar una cepa segun el aspecto 10 o cualquiera de los aspectos 19 a 22; y b) llevar a cabo al menos un refuerzo con la misma cepa o con una vacuna acelular o una combinacion de ambas.
34. El uso de una Bordetella atenuada segun el aspecto 23, donde la vacuna se administra a marnfferos que
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necesitan una rapida inmunidad protectora contra una infeccion por Bordetella, donde dicha inmunidad protectora aumenta durante al menos dos meses despues de la vacunacion.
35. El uso de la cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo para la preparacion de una vacuna polivalente destinada a tratar enfermedades respiratorias.
36. El uso segun cualquiera de los aspectos 23 a 35, donde dicha cepa de Bordetella mutada es BPZE1.
37. El uso segun cualquiera de los aspectos 23 a 36, donde el nivel de proteccion contra una infeccion por Bordetella es superior al 95%, particularmente superior al 99%.
38. El uso segun el aspecto 37, donde dicho nivel de proteccion contra una infeccion por Bordetella alcanza mas del 99.999%.
39. Un metodo para proteger a un mairnfero contra una enfermedad causada por una infeccion por Bordetella que comprende administrar a dicho marnffero que necesita dicho tratamiento una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo.
40. Un metodo para proporcionar una rapida inmunidad protectora contra una infeccion por Bordetella que comprende administrar a dicho marnffero que necesita dicho tratamiento una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo.
41. El metodo segun el aspecto 39 o 40, donde dicha infeccion por Bordetella es por Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis.
42. El metodo segun cualquiera de los aspectos 39 a 41, donde dicho mai^ero es un recien nacido.
43. El metodo segun cualquiera de los aspectos 39 a 41, donde dicho mai^ero es un nino.
44. El metodo segun cualquiera de los aspectos 39 a 43, donde dicha cepa de Bordetella mutada se administra por via subcutanea (s.c.), intradermica (i.d.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.), oral o intranasal, por inyeccion o por inhalacion.
45. El metodo segun cualquiera de los aspectos 39 a 43, donde dicha cepa de Bordetella mutada se administra por via intranasal.
46. Un metodo para proporcionar una respuesta en las mucosas y una respuesta sistemica para tratar infecciones por Bordetella en mamfferos donde dicho metodo comprende administrar a los mamfferos que necesitan dicho tratamiento la cepa de Bordetella atenuada segun el aspecto 10.
47. Un metodo para proporcionar una rapida inmunidad protectora contra una infeccion por Bordetella que comprende administrar a dicho marnffero que necesita dicho tratamiento una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos un gen ptx mutado, un gen dnt eliminado o mutado y un gen ampG heterologo, donde dicho metodo proporciona ademas un aumento de dicha inmunidad protectora durante al menos dos meses despues de la vacunacion.
48. El metodo del aspecto 39, 40 o 47, donde dicha cepa de Bordetella mutada es BPZE1.
49. El metodo de cualquiera de los aspecto 39 a 41 o del 47, donde el nivel de proteccion contra una infeccion por Bordetella es superior al 95%, particularmente superior al 99%.
50. El metodo segun el aspecto 49, donde dicho nivel de proteccion contra una infeccion por Bordetella alcanza mas de 99.999%.
51. La cepa de Bordetella mutada segun cualquiera de los aspectos 1 a 10, que comprende ademas al menos una secuencia de acido nucleico heterologo que codifica un aRn o una protema.
52. La cepa de Bordetella mutada segun el aspecto 51, donde dicha al menos una secuencia de acido nucleico heterologo codifica un antfgeno.
53. La cepa de Bordetella mutada segun el aspecto 52, donde dicha al menos una secuencia de acido nucleico heterologo codifica un antfgeno viral o bacteriano.
54. El uso de una cepa de Bordetella mutada segun cualquiera de los aspectos 1 a 10 como un vector para expresar al menos un antfgeno heterologo.
55. Una cepa de Bordetella mutada segun cualquiera de los aspectos 51 a 53, para usar como una vacuna. Ejemplos
Materiales y metodos
Ejemplo 1 - Cepas de Bordetella y condiciones de cultivo
Las cepas de B. pertussis utilizadas en este estudio se derivaron de B. pertussis BPSM [13] y B. parapertussis es un derivado resistente a la estreptomicina de la cepa 12822 (amablemente provista por el Dr. N. Guiso, Instituto Pasteur, Paris, Francia). Todas las cepas de Bordetella se cultivaron en agar Bordet-Gengou (BG) (Difco, Detroit, Michigan) complementado con 1% de glicerol, 20% de sangre de carnero desfibrinada y 100 de pg/ml de estreptomicina. Para los ensayos de adherencia celular, se inoculo B. pertussis en crecimiento exponencial a una densidad optica de 0.15 a 600 nm, en 2.5 ml de medio de Stainer-Scholte modificado [14] que contema 1 g/l de heptakis(2,6-di-o-metil) 13-ciclodextrina (Sigma) y complementado con 65 pCi/ml de L-[35S]metionina mas L- [35S]cistema (NEN, Boston, Massachusetts) y se cultivo durante 24 h a 37 °C. Las bacterias se recogieron por centrifugacion, se lavaron tres veces en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendieron en RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, N. Y.) a la densidad deseada.
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Ejemplo 2 - Construccion de B. pertussis BPZE1.
Para construir B. pertussis BPZE1, el gen ampG de B. pertussis se reemplazo con ampG de Escherichia coli usando intercambio alelico. Un fragmento de PCR denominado met y ubicado en la posicion 49,149 a 49,990 del genoma de B. pertussis (
http://www.sanger.ac.uk/Projects/B_perfussis/), en direccion 5' del gen ampG de B. pertussis, se amplifico utilizando oligonucleotidos A: 5'-TATAAATCGATATTCCTGCTGGTTTCGTTCTC-3' (SEQ ID No: 5) y B: 5'- TATAGCTAGCAAGTTGGGAAACGACACCAC-3' (SEQ ID No: 6) y ADN genomico de B. pertussis BPSM [13] como plantilla. Este fragmento de 634-bp se inserto en Topo PCRII (InVitrogen Life Technology, Groningen, los Pafses Bajos) y despues se escindio como un fragmento Clal-Nhel y se inserto en pBP23 digerido con Clal y Nhel [50], un vector suicida que contema el gen ampG de E. coli con ADN flanqueante de B. pertussis de 618 bp (de la posicion 50,474 a 51,092 del genoma de B. pertussis) y 379 bp (de la posicion 52,581 a 52,960 del genoma de B. pertussis) en el extremo 5' y 3' del ampG de E. coli, respectivamente. El plasmido resultante se transfirio a E. coli SM10 [51], que luego se conjugo con BPSM y se seleccionaron dos eventos de recombinacion homologa sucesivos como se describio [52]. Se analizaron diez colonias individuales por PCR como sigue. Las colonias se suspendieron en 100 pl de H2O, se calentaron durante 20 min a 95 °C y se centrifugaron durante 5 min a 15 000 x g. Se utilizo un pl de los sobrenadantes como plantilla para la PCR usando los oligonucleotidos A y C: 5'-
http://www.sanger.ac.uk/Projects/B_perfussis/), en direccion 5' del gen ampG de B. pertussis, se amplifico utilizando oligonucleotidos A: 5'-TATAAATCGATATTCCTGCTGGTTTCGTTCTC-3' (SEQ ID No: 5) y B: 5'- TATAGCTAGCAAGTTGGGAAACGACACCAC-3' (SEQ ID No: 6) y ADN genomico de B. pertussis BPSM [13] como plantilla. Este fragmento de 634-bp se inserto en Topo PCRII (InVitrogen Life Technology, Groningen, los Pafses Bajos) y despues se escindio como un fragmento Clal-Nhel y se inserto en pBP23 digerido con Clal y Nhel [50], un vector suicida que contema el gen ampG de E. coli con ADN flanqueante de B. pertussis de 618 bp (de la posicion 50,474 a 51,092 del genoma de B. pertussis) y 379 bp (de la posicion 52,581 a 52,960 del genoma de B. pertussis) en el extremo 5' y 3' del ampG de E. coli, respectivamente. El plasmido resultante se transfirio a E. coli SM10 [51], que luego se conjugo con BPSM y se seleccionaron dos eventos de recombinacion homologa sucesivos como se describio [52]. Se analizaron diez colonias individuales por PCR como sigue. Las colonias se suspendieron en 100 pl de H2O, se calentaron durante 20 min a 95 °C y se centrifugaron durante 5 min a 15 000 x g. Se utilizo un pl de los sobrenadantes como plantilla para la PCR usando los oligonucleotidos A y C: 5'-
TAAGAAGCAAAATAAGCCAGGCATT-3' (SEQ ID No: 7) para verificar la presencia del ampG de E. coli y usando los oligonucleotidos D: 5'-TATACCATGGCGCCGCTGCTGGTGCTGGGC-3'(SEQ ID No:8) y E: 5'-
TATATCTAGACGCTGGCCGTAACCTTAGCA-3'(SEQ ID No:9) para verificar la ausencia del ampG de B. pertussis. Se selecciono una de las cepas que contema el ampG de E. coli y carecfa del ampG de B. pertussis, y se secuencio todo el locus ampG. Esta cepa se uso despues para ingeniena adicional.
Los genes ptx se eliminaron del cromosoma de esta cepa como se describio [21] y luego se reemplazaron con ptx mutado que codifica a PTX inactiva. El fragmento EcoRI que contema el locus mutado ptx de pPT-RE [16] se inserto en el sitio EcoRI de pJQ200mp18rpsl [53]. El plasmido resultante se integro en el cromosoma de B. pertussis en el locus ptx por recombinacion homologa despues de la conjugacion via E. coli SM10. El locus ptx del cromosoma de la cepa B. pertussis resultante, se secuencio para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas. Se analizo la produccion de toxinas por inmunotransferencia enzimatica usando una mezcla de anticuerpos monoclonales IB7 [54] espedficos para la subunidad S1, y 11 E6 [55] espedficos para las subunidades S2 y S3 de PTX.
Finalmente, el gen dnt se elimino de la cepa B. pertussis resultante, a medida que se amplificaron las regiones flanqueantes de dnt por PCR usando el ADN genomico de BPSM como plantilla y los oligonucleotidos F: 5'- TATAGAATTCGCTCGGTTCGCTGGTCAAG G-3' (SEQ ID No:10) y G: 5'-
TATATCTAGAGCAATGCCGATTCATCTTTA-3' (SEQ ID No:11) para la region en direccion 5' de dnt y H: 5'- TATATCTAGAGCGGCCTT TATTGCTTTTCC-3' (SEQ ID No:12) e I: 5'-TATAAAGCTTCTCATGCACGCCG GCTTCTC-3' (SEQ ID No:13) para la region en direccion 3' de dnt , como cebadores. Los fragmentos de ADN resultantes de 799-bp y 712-bp se digirieron con EcoRI/XbaI y XbaI/HindIII, respectivamente, y se unieron con el kit Fast Link (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI). El fragmento ligado se amplifico por PCR usando los oligonucleotidos F e I, y el fragmento de PCR de 1505-bp se inserto luego en pCR2.1-Topo (Invitrogen), se volvio a aislar el plasmido resultante como un fragmento EcoRI y se inserto despues en el sitio unico EcoRI de pJQmp200rpsL18. El plasmido resultante se introdujo en B. pertussis por conjugacion via E. coli SM10. La eliminacion exitosa del gen dnt por intercambio alelico se verifico por analisis de transferencia de Southern en ADN genomico de B. pertussis digerido con Pvull empleando el fragmento de PCR correspondiente a la region en direccion 5' de dnt como sonda. La sonda se marco con digoxigenina (DIG) con el kit de marcado DIG Easy Hyb (Roche, Meylan, Francia). Se determinaron los tamanos de las bandas de hibridacion a partir de la distancia de migracion del marcador molecular III de ADN marcado con Dig (Roche). Se secuencio el locus dnt de esta cepa final, denominada BPZE1.
Ejemplo 3 - Analisis de la produccion de TCT.
Para la cuantificacion sensible de la produccion de TCT, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos de B. pertussis cultivado hasta la fase logantmica, se sometieron a extraccion en fase solida [15] y se derivatizaron con fenilisotiocianato (PITC, Pierce). Los derivados de feniltiocarbamilo (PTC) resultantes se separaron por HPLC de fase inversa utilizando una columna C8 (Perkin Elmer) y se detectaron a 254 nm. La cantidad de PTC-TCT de B. pertussis en cada muestra se determino por comparacion del area del pico y el tiempo de elucion del pico con un estandar de TCT procesado identicamente.
Ejemplo 4 - Ensayo de adherencia celular.
Para analizar las propiedades de adherencia de las cepas de B. pertussis, se midieron sus tasas de union a la lmea de celulas epiteliales pulmonares humanas A549 (ATCC N° CCL-185) y a la lmea celular de macrofagos muridos J774 (ATCC N° TIB-67) como se describio previamente [16].
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Ejemplo 5 - Microscopfa electronica de transmision.
El procedimiento de tincion negativa de una sola gota se utilizo como se describio previamente [17] con las modificaciones siguientes. Se absorbieron durante 2 min. 20 jl de una suspension de aproximadamente 109 bacterias/ml sobre rejillas de mquel recubiertas de formvard impregnada de carbono (400 mesh; Electron Microscopy Sciences EMS, Washington, PA). Despues de 30 segundos de secado al aire las rejillas se tineron durante 2 minutos con 20 jl de acido fosfotungstico al 2% (pH 7; EMS) y se examinaron despues de secar al aire con un microscopio electronico de transmision (Hitachi 7500, Japon) a 60 kvolts y alta resolucion.
Ejemplo 6 - Infeccion intranasal y vacunacion.
Se mantuvieron ratones hembra Balb/C de 3 semanas y 8 semanas de vida exentos de patogenos espedficos, y se llevaron a cabo todos los experimentos bajo las directrices de la Junta de estudios en animales del Instituto Pasteur de Lille. Los ratones se infectaron por via intranasal con aproximadamente 4 x 106 bacterias en 20 jl de PBS, y se midio la cinetica de las UFC en los pulmones como se describio previamente [18]. Para la vacunacion con aPV (Tetravac; Aventis-Pasteur, Francia), los ratones se inmunizaron por via intraperitoneal (i.p.) con 20% de la dosis humana y se les administro un refuerzo un mes mas tarde, usando la misma dosis.
Ejemplo 7 - Determinacion de anticuerpos.
Se recogieron los sueros y se estimaron los tttulos de los anticuerpos por enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA) como se describio previamente [18].
Ejemplo 8 - Ensayos de citocinas.
Se analizaron celulas de bazo de ratones individuales en diferentes momentos despues de la inmunizacion para la produccion de citocinas in vitro en respuesta a B. pertussis BPSM (106 celulas/ml) muerta, eliminada termicamente, 5.0 jg/ml de PTX (purificada de B. pertussis BPGR4 como se describio previamente [19] [20] e inactivada termicamente a 80 °C durante 20 min) 5.0 jg de hemaglutinina filamentosa (fHa, purificada de B. pertussis BPRA [21] como se describio previamente [22]) , 5 jg/ml de concanavalina A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) o solamente medio como control. Se retiraron los sobrenadantes de cultivos por triplicado despues de 72 h de incubacion a 37 °C y 5% de CO2, y se determinaron las concentraciones de IFN-y e IL-5 mediante inmunoensayos (sistema BD OptEIA, Pharmingen).
Ejemplo 9 - Infeccion intranasal y vacunacion: provocacion a 1, 2, 3 y 4 semanas.
Se uso un modelo de raton recien nacido (3 semanas de vida) [29] para comparar la eficacia de la vacunacion con BPZE1 con la de la vacunacion con vacuna a celular contra la tos ferina (aPv). Se infectaron por via intranasal ratones hembra Balb/C con aproximadamente 1 x 106 de cepa BPZE1 en 20 jl de PBS. Para la vacunacion con aPv (Tetravac; Aventis-Pasteur, Francia), los ratones se inmunizaron por via intraperitoneal con 20% de la dosis humana. Una, dos, tres o cuatro semanas despues de la vacunacion con BPZE1 o aPv, los ratones se provocaron por via intranasal con la cepa virulenta de B. pertussis BPSM/bctA-lacZ [53]. Esta cepa es un derivado de BPSM resistente a la gentamicina que permite la discriminacion con la BPZE1 (sensible a la gentamicina) en placas de agar de Bordet-Gengou que conteman 10 jg/ml de gentamicina y 100 jg/ml de estreptomicina (BGgs). El grupo de control correspondio a ratones sin exposicion provocados con BPSM/bctA-lacZ. Una semana despues de la infeccion de provocacion, se extrajeron asepticamente los pulmones, se homogeneizaron y se sembraron en placas en BGgs para la determinacion de UFC como se describio previamente [18].
Los ratones se vacunaron con BPZE1 o aPv y se provocaron con B. pertussis virulenta una, dos, tres o cuatro semanas despues de la vacunacion. Los recuentos de unidades formadoras de colonias pulmonares se determinaron 3 horas o 7 dfas mas tarde. Los resultados se expresan como la media de unidades formadoras de colonias (± error estandar) de tres a cinco ratones por grupo. Los niveles de proteccion se calculan para cada infeccion de provocacion como la media de los porcentajes de UFC de cada grupo en relacion con el promedio de UFC en el grupo no inmunizado, 7 dfas despues de la infeccion de provocacion (Tablas 2 a 5).
Ejemplo 10 - Analisis estadfstico.
Los resultados se analizaron utilizando la prueba t de Student con datos no apareados y el test de Kruskal-Wallis seguido del post-test de Dunn (programa GraphPad Prism) cuando procedfa. Las diferencias se consideraron significativas a P <0.05.
Resultados
Construccion de B. pertussis BPZE1
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Tres factores de virulencia fueron modificados geneticamente: la citotoxina traqueal (TCT), la toxina pertussis (PTX) y la toxina dermonecrotica (DNT).
TCT es responsable de la destruccion de las celulas ciliadas de la traquea de huespedes infectados [24, 25] y por lo tanto puede estar implicada en el smdrome de tos. TCT es un producto de descomposicion del peptidoglicano de la pared celular de bacterias gramnegativas, que generalmente la internalizan en el citosol mediante la protema transportadora AmpG para ser reutilizada durante la biosmtesis de la pared celular. AmpG de B. pertussis es ineficaz para internalizar los productos de descomposicion del peptidoglicano. Por lo tanto sustituimos el gen ampG de B. pertussis por ampG de E. coli. La cepa resultante expreso menos de 1% de actividad de TCT residual (Fig. 1).
PTX es un factor de virulencia importante responsable de los efectos sistemicos de las infecciones por B. pertussis y esta compuesta por una porcion enzimaticamente activa, denominada S1 y una porcion responsable de la union a los receptores de las celulas blanco (por una revision, vease 26). Sin embargo, tambien es uno de los principales antfgenos protectores, lo que nos ha llevado a sustituir los genes ptx naturales por una version mutada que codifica una toxina enzimaticamente inactiva. Esto se logro mediante la sustitucion de Arg-9 por Lys y Glu-129 por Gly en S1, dos residuos claves involucrados en la union al sustrato y la catalisis, respectivamente. Se uso primero intercambio alelico para eliminar el operon ptx y luego para insertar la version mutada. La presencia de los analogos de la toxina pertinentes en los sobrenadantes de los cultivos de B. pertussis se evaluo por analisis de inmunotransferencia enzimatica (Fig. 2).
Finalmente, se uso intercambio alelico para eliminar el gen dnt (Fig. 3). Aunque el papel de DNT en la virulencia de B. pertussis no es seguro, ha sido identificada como una toxina importante en la especie estrechamente relacionada Bordetella bronchiseptica y muestra actividad letal luego de la inyeccion de cantidades diminutas (por una revision, vease 26).
Caracterizacion in vitro de B. pertussis BPZE1
Como algunas de las alteraciones geneticas en BPZE1 pueden afectar potencialmente la smtesis de la pared celular bacteriana, se compararon el tamano y la forma asf como el ritmo de crecimiento in vitro de BPZE1 con los de la cepa parental BPSM. El ritmo de crecimiento de BPZE1 no difirio del de BPSM (Fig. 4), y no se detectaron diferencias en la forma ni el tamano bacterianos entre BPZE1 y BPSM, segun lo evidenciado por el analisis de microscopfa electronica (Fig. 5). Sin embargo, la pared celular de BPZE1 parecio ser uniformemente algo mas delgada que la de BPSM.
Para determinar si la ausencia o las alteraciones de cualquiera de las toxinas modificadas en BPZE1 afectan las propiedades de adherencia de B. pertussis, las tasas de union de BPZE1 se compararon con las de BPSM, utilizando la lmea de celulas epiteliales pulmonares humanas A549 y la lmea celular de macrofagos muridos J774, como dos modelos celulares de uso frecuente para el estudio de la adherencia de B. pertussis. No se observo ninguna diferencia significativa en la capacidad de adherencia a ninguna de las lmeas celulares entre las dos cepas (Fig. 6).
Atenuacion de B. pertussis BPZE1
Para determinar si las mutaciones introducidas en B. pertussis BPZE1 habfan resultado en atenuacion, pero permitiendo al organismo colonizar el aparato respiratorio, se infectaron por via intranasal ratones Balb/C con BPZE1 o BPSM y Se siguio la colonizacion en el tiempo. BPZE1 fue capaz de colonizar y persistir en los pulmones de los ratones tanto tiempo como BPSM (Fig. 7). Sin embargo, el pico de multiplicacion observado 7 dfas despues de la infeccion con BPSM falto constantemente en ratones infectados con BPZE1. Los estudios realizados con cepas mutadas en los genes individuales de la toxina indicaron que esto se debe a las mutaciones en el locus ptx (no se muestran los datos). Cuando se examinaron los pulmones en busca de cambios histopatologicos e infiltracion inflamatoria, se encontro que la infeccion con BPSM induce infiltrados peri-bronquiovasculares fuertes y reclutamiento de celulas inflamatorias 7 dfas despues de la infeccion, asociados a una fuerte hipertrofia de las celulas epiteliales bronquiolares (Fig. 8). En contraposicion, no se observaron cambios de ese tipo en animales infectados con BPZE1, y la histologfa de los ratones infectados con BPZE1 fue similar a la de los ratones de control que habfan recibido PBS en lugar de las bacterias. La inflamacion inducida por la infeccion con BPSM duro al menos dos meses (no se muestran los datos). Estos resultados indican que las mutaciones introducidas en BPZE1 resultaron en una atenuacion drastica, pero permitiendo a las bacterias colonizar y persistir en los pulmones.
Proteccion contra la provocacion con B. pertussis luego de la vacunacion intranasal de ratones adultos con BPZE1
Para evaluar la proteccion ofrecida por BPZE1, se comparo el efecto de una sola administracion intranasal de esta cepa en ratones Balb/C de 8 semanas de vida en la colonizacion subsiguiente por la cepa de provocacion de tipo natural BPSM con la de dos vacunas i.p. de 1/5 de una dosis humana de aPV. Este protocolo de inmunizacion con aPV ha sido descrito como el que mejor se correlaciona con la eficacia de la vacuna de tos ferina en ensayos
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clmicos en humanos [27, 28]. Como se muestra por la depuracion total de recuentos de colonias bacterianas en los pulmones siete d^as despues de la infeccion de provocacion, una sola administracion intranasal de BPZE1 y dos inmunizaciones i.p. con aPV proporcionan niveles de proteccion similares (Fig. 9a). Se encontraron altas cargas bacterianas en los ratones de control que habfan recibido dos inyecciones de PBS en lugar de la vacuna.
Proteccion contra la provocacion con B. pertussis luego de la vacunacion intranasal de ratones recien nacidos con BPZE1
Puesto que los principales objetivos de las nuevas vacunas contra la tos ferina son los bebes pequenos, que no estan protegidos con las vacunas disponibles en la actualidad, se desarrollo un modelo de raton recien nacido (3 semanas de vida) [29] y se uso para comparar la eficacia de la vacunacion con BPZE1 con la de la vacunacion con aPV. Una sola administracion nasal de BPZE1 protegio totalmente a ratones recien nacidos contra la infeccion de provocacion (Fig. 9b), puesto que se observo la depuracion bacteriana total en los pulmones una semana despues de la provocacion. En contraposicion, una cantidad considerable de bacterias permanecio en los animales vacunados con aPV una semana despues de la infeccion de provocacion. La diferencia en la carga bacteriana entre los ratones vacunados con BPZE1 y los vacunados con aPV fue estadfsticamente significativa, lo que indica que en el modelo de raton recien nacido una sola administracion intranasal de BPZE1 ofrece una mejor proteccion que dos administraciones sistemicas de aPV.
Ademas, se observo regularmente una fuerte reduccion en la carga bacteriana de la cepa de provocacion, 3 horas despues de la administracion cuando los ratones habfan sido inmunizados con BPZE1 en comparacion con los animales inmunizados con aPV (Fig. 9c), lo que indica que la vacunacion con BPZE1 reduce la susceptibilidad a la infeccion por la cepa de provocacion. Este efecto se observo tanto en ratones de 8 semanas de vida como en recien nacidos. Por el contrario, aPV no tuvo efecto sobre los recuentos bacterianos 3 horas despues de la infeccion, en comparacion con los ratones de control.
Proteccion contra provocacion con B. parapertussis despues de la vacunacion intranasal con BPZE1
Hay una preocupacion creciente sobre la infeccion por B. parapertussis en ninos, especialmente en las poblaciones vacunadas [30, 31]. B. parapertussis causa un smdrome semejante a la tos ferina, mas leve, cuya frecuencia esta probablemente en gran medida subestimada. Ademas, la incidencia de infecciones por B. parapertussis se ha incrementado en las ultimas decadas, posiblemente debido a que se sabe que las vacunas contra la tos ferina tienen una eficacia muy baja o no protegen contra B. parapertussis [32, 33]. En contraste, se ha informado recientemente que la infeccion por B. pertussis protege contra la infeccion por B. parapertussis [34]. Tambien se evaluo BPZE1 en relacion con la proteccion contra B. parapertussis utilizando el modelo de raton recien nacido. Mientras que dos administraciones de aPV no ofrecieron ninguna proteccion contra B. parapertussis, segun lo informado previamente, una sola administracion intranasal de BPZE1 proporciono una fuerte proteccion, medida por los bajos recuentos de B. parapertussis en los pulmones de los ratones vacunados, 1 semana despues de la provocacion (Fig. 9d).
Respuestas inmunitarias inducidas por la vacunacion con BPZE1
Aunque los mecanismos de la inmunidad protectora contra la infeccion por B. pertussis aun no se comprenden completamente, se ha demostrado en ratones una clara evidencia de un papel tanto de los linfocitos B como del IFN- Y [28]. La vacunacion ya sea con una dosis nasal de BPZE1 o dos administraciones i.p. de aPV indujeron altos tttulos de IgG serica contra FHA, un importante antfgeno de superficie de B. pertussis [35], tambien presente en aPV (Fig. 10a). Tras la provocacion con B. pertussis, se midieron las respuestas positivas anamnesicas en animales vacunados con BPZE1 y aPV, segun se indico por el aumento de tftulos de IgG anti-FHA, en comparacion con las respuestas primarias antes de la infeccion con B. pertussis. El examen de los cocientes IgG1 anti-FHA/IgG2a mostraron que esos cocientes fueron superiores despues de la administracion de aPV, caractenstico de una respuesta tipo Th2, que despues de la vacunacion con BPZE1 (Fig. 10b). Aunque el cociente IgG1-anti-FHA/IgG2a disminuyo despues de la provocacion en los ratones vacunados con aPV, siguio siendo sustancialmente superior que en los animales vacunados con BPZE1 despues de la provocacion con B. pertussis.
El analisis de los patrones de citocinas espedficas del antfgeno de B. pertussis inducidas por vacunacion con BPZE1 o aPV confirmo que la administracion de BPZE1 favorece una respuesta tipo Th1 mas fuerte que la vacunacion con aPV. Esto fue revelado por el hecho de que los cocientes entre IFN-y y IL-5 producidos por los esplenocitos estimulados con FHA o PT, o con el activador policlonal ConA, fueron significativamente mayores en los ratones vacunados con BPZE1 que en los ratones vacunados con aPV (Fig. 10c).
Inmunidad protectora de BPZE1 en el tiempo (desde 1 semana hasta 4 semanas)
Como se muestra en las tablas 1 a 5 a continuacion, aunque la administracion de aPv proporciono proteccion limitada (reduccion del 75% de la carga bacteriana en comparacion con ratones no vacunados a 1 semana) contra B. pertussis, una sola administracion intranasal de BPZE1 ya proporciono un alto nivel de proteccion (reduccion del
97.64% de la carga bacteriana) contra una infeccion provocada con B. pertussis realizada una semana despues de la vacunacion. Cuando la infeccion de provocacion ocurrio dos semanas despues de la vacunacion, el nivel de proteccion inducido por BPZE1 alcanzo mas del 99. 999% en comparacion con los ratones no vacunados y es significativamente superior a la proteccion inducida por la vacuna aPv (aproximadamente el 92% en comparacion 5 con ratones no vacunados). Por lo tanto, la eficacia de la vacuna con BPZE1 contra la provocacion con B. pertussis ya es significativa una semana despues de la vacunacion y aumenta durante los al menos dos meses siguientes.
Tabla 1: Cinetica de la eficacia de las vacunas contra la provocacion con B. pertussis en ratones recien nacidos.
- Tiempo entre la vacunacion y la provocacion
- Tiempo entre la recuperacion de los pulmones y la provocacion Log10 ufc / pulmones de ratones
- Sin exposicion
- Vacunados con aPv Vacunados con BPZE1
- 1 semana
- 3 horas 5.71 ± 0.03 5.8 ± 0.07 5.74 ± 0.01
- 7 dfas
- 6.71 ± 0.06 5.97 ± 0.20 4.86 ± 0.35
- 2 semanas
- 3 horas 5.77 ± 0.10 5.60 ± 0.02 5.49 ± 0.05
- 7 dfas
- 6.49 ± 0.08 5.31 ± 0.16 3.22 ± 0.33
- 3 semanas
- 3 horas 6.03 ± 0.11 5.88 ± 0.04 5.33 ± 0.08
- 7 dfas
- 6.58 ± 0.09 5.62 ± 0.11 3.14 ± 0.38
- 4 semanas
- 3 horas 6.31 ± 0.01 6.15 ± 0.02 5.83 ± 0.05
- 7 dfas
- 6.36 ± 0.04 5.21 ± 0.11 1.83 ± 0.46
10 Tabla 2: Nivel de proteccion de los ratones vacunados con aPv y vacunados con BPZE1 en comparacion con los ratones no vacunados a 1 semana.
- Ratones no vacunados
- Numero de bacterias en los pulmones Media del numero de bacterias
- No vacunados 1
- 4.7 x 106
- No vacunados 2
- 3.8 x 106
- No vacunados 3
- 8.2 x 106 5.36.106
- No vacunados 4
- 4.1 x 106
- No vacunados 5
- 6 x 106
- Numero de bacterias en los pulmones Porcentaje de bacterias J (1) restantes Media del porcentaje de bacterias restantes Nivel de proteccion
- Ratones vacunados con aPv
- aPv1
- 1.95 x 106 36.38 25% 75%
- aPv2
- 2.9 x 106 54.1
- aPv3
- 2.9 x 105 5.41
- aPv4
- 3.6 x 105 6.72
- aPv5
- 1.2 x 106 22.39
Ratones vacunados con BPZE1
- BPZE1-1
- 3.2 x 105 5.97
- BPZE1-2
- 2 x 104 0.004 2.36% 97.64%
- BPZE1-3
- 6 x 104 1.12
(1) Porcentaje de bacterias restantes = numero de bacterias por cada raton / media del numero de bacterias de todos los ratones no vacunados
Tabla 3: Nivel de proteccion de ratones vacunados con aPv y ratones vacunados con BPZE1 en comparacion con 15 ratones sin vacunar a 2 semanas.
- Ratones no vacunados
- Numero de bacterias en los pulmones Media del numero de bacterias
- No vacunados 1
- 5 x 106 3.34 x 106
- No vacunados 2
- 3.6 x 106
- No vacunados 3
- 1.7 x 106
- No vacunados 4
- 2.4 x 106
- No vacunados 5
- 4 x 106
- Numero de bacterias en los pulmones Porcentaje de bacterias restantes (1) Media del porcentaje de bacterias restantes Nivel de proteccion
- Ratones vacunados con aPv
- aPvl
- 9.5 x 104 2.84 8.11% 91.89%
- aPv2
- 2.9 x 105 8.68
- aPv3
- 1 x 105 2.99
- aPv4
- 6.8 x 105 20.36
- aPv5
- 1.9 x 105 5.69
Ratones vacunados con BPZE1
- BPZE1-1
- 9.5 x 103 2.8 x 10-3
- BPZE1-2
- 450 1.35 x 10-4 1.03 x 10'3% 99.999%
- BPZEI-3
- 3500 1.05 x 10-3
- BPZE1-4
- 500 1.5 x 10-4
(1) Porcentaje de bacterias restantes = numero de bacterias por cada raton / media del numero de bacterias de todos los ratones no vacunados
Tabla 4: Nivel de proteccion de ratones vacunados con aPv y ratones vacunados con BPZE1 En comparacion con ratones sin vacunar a 3 semanas.
- Ratones no vacunados
- Numero de bacterias en los pulmones Media del numero de bacterias
- No vacunados 1
- 1.8 x 106 4.04 x 106
- No vacunados 2.
- 5.75 x 106
- No vacunados 3
- 4.7 x 106
- No vacunados 4
- 3.2 x 106
- No vacunados 5
- 4.75 x 106
- Numero de bacterias en los pulmones Porcentaje de bacterias restantes (1) Media del porcentaje de bacterias restantes Nivel de proteccion
- Ratones vacunados con aPv
- aPv1
- 1.99 x 105 4.94 11.26% 88.74%
- aPv2
- 6 x 105 14.85
- aPv3
- 6 x 105 14.85
- aPv4
- 4.2 x 105 10.40
- Ratones vacunados con BPZE1
- BPZE1-1
- 3640 9.01 x 10-4 8.65 x 10-4% 99.999%
- HPZE1-2
- 9720 2.4 x 10-3
- Ratones vacunados con BPZE1
- BPZE1-3
- 300 7.43 x 10-5
- BPZE1-4
- 340 8.42 x 10-5
- (1) Porcentaje de bacterias restantes = numero de bacterias por cada raton / media del numero de bacterias de todos los ratones no vacunados
Tabla 5: Nivel de proteccion de ratones vacunados con aPv y ratones vacunados con BPZE1 en comparacion con ratones sin vacunar a 4 semanas.
- Ratones no vacunados
- Numero de bacterias en los pulmones Media del numero de bacterias
- No vacunados 1
- 2.1 x 106 2.36 x 106
- No vacunados 2
- 2.2 x 106
- No vacunados 3
- 3.1 x 106
- No vacunados 4
- 2.6 x 106
- No vacunados 5
- 1.8 x 106
- Numero de bacterias en los pulmones Porcentaje de bacterias restantes (1) Media del porcentaje de bacterias restantes Nivel de proteccion
- Ratones vacunados con aPv
- aPv1
- 2.52 x 105 10.68 7.76% 92.24%
- aPv2
- 3.28 x 105 13.90
- aPv3
- 1.04 x 105 4.41
- aPv4
- 8.4 x 105 3.56
- aPv5
- 1.48 x 105 6.27
- Ratones vacunados con BPZE1
- BPZE1-1
- 190 8.05 x 10-5 7.13 x 10'5% 99.999%
- BPZE1-2
- 0 0
- BPZE1-3
- 110 4.66 x 10-5
- BPZE1-4
- 320 1.36 x 10-4
- BPZE1-5
- 220 9.32 x 10-5
- (1) Porcentaje de bacterias restantes = numero de bacterias por cada raton / media del numero de bacterias de todos los ratones no vacunados
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Discusion
La tos ferina es la primera enfermedad infecciosa cuya incidencia esta aumentando en los pafses con alta cobertura de vacuna. Esta situacion paradojica esta probablemente ligada a los cambios epidemiologicos observados desde la 10 introduccion masiva de vacunas sumamente eficaces. En contraste con la epoca de prevacunacion, los casos de tos ferina en adolescentes y adultos son ahora cada vez mas frecuentes. Aunque generalmente no es mortal en este grupo etario, los adultos infectados con B. pertussis son un reservorio importante para la infeccion de los ninos muy pequenos, demasiado pequenos para ser protegidos por la vacunacion. La vacunacion temprana, posiblemente al nacer, sena por lo tanto muy deseable, pero es obstaculizada por la inmadurez del sistema inmunitario de los recien 15 nacidos y lactantes. Sin embargo, el hecho de que la infeccion con B. pertussis natural, incluso muy precozmente en la vida, sea capaz de inducir una fuerte respuesta de tipo Th1 en ninos [12] nos impulso a desarrollar una cepa para vacuna de B. pertussis viva, atenuada, que se administre por via nasal, como una alternativa a las vacunas disponibles en la actualidad.
20 Basandose en las infecciones experimentales de primates, Huang et al. ya en 1962 llegaron a la conclusion de que la maxima proteccion contra la tos ferina segrna probablemente a una inoculacion de B. pertussis viva [36]. En medicina veterinaria, se han utilizado las cepas de Bordetella atenuadas para vacunar contra bordetelosis en perros y cerdos. Una cepa de Bordetella bronchiseptica viva, atenuada, mostro que proporcionaba una fuerte proteccion contra la tos de las perreras (traqueobronquitis infecciosa canina) en perros [37] despues de la administracion nasal.
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Esta proteccion se observo tan pronto como a las 48 h despues de la vacunacion. La vacunacion intranasal con B. bronchiseptica viva, atenuada, tambien mostro que proteg^a contra la rinitis atrofica en cerdos de dos d^as de vida [38], lo que indica que las vacunas de Bordetella en forma viva, atenuada, pueden ser muy activas en animales recien nacidos.
Los intentos previos de atenuar geneticamente a B. pertussis como candidata para una vacuna de microorganismo vivo, han tenido un exito bastante limitado. Basandose en una estrategia utilizada para la atenuacion exitosa de cepas para vacuna de Salmonella [39], Roberts et al han eliminado el gen aroA de B. pertussis [40]. El mutante aroA fue en efecto muy atenuado, pero tambien perdio su capacidad para colonizar el aparato respiratorio de los animales vacunados por via intranasal e indujo inmunidad protectora solo despues de repetidas administraciones de dosis altas. Aprovechamos el conocimiento de los mecanismos moleculares de la virulencia de B. pertussis y desarrollamos la cepa muy atenuada BPZE1. Esta cepa contiene alteraciones geneticas que conducen a la ausencia o la inactivacion de tres toxinas principales, PTX, TCT y DNT. En contraste con el mutante aroA, esta cepa fue capaz de colonizar el aparato respiratorio del raton y de proporcionar proteccion completa despues de una sola administracion intranasal. La proteccion en ratones adultos fue indistinguible de la inducida por las dos administraciones de 1/5 de la dosis humana de aPV. Una diferencia importante, sin embargo, se observo en ratones recien nacidos, en los que una sola administracion de BPZE1 protegio completamente, mientras que aPV solo ofrecio proteccion parcial. En el contexto de las dificultades para inducir proteccion en los recien nacidos con las vacunas disponibles en la actualidad, precozmente en la vida, estos resultados proporcionan esperanza para el desarrollo de nuevas estrategias de vacunacion que se puedan utilizar en los ninos muy pequenos, posiblemente al nacer. Ademas, BPZE1 protegio contra B. parapertussis, mientras que aPV no lo hizo. Por lo tanto el uso de BPZE1 tambien debena tener un impacto sobre la incidencia de tos ferina causada por B. parapertussis en recien nacidos.
Aunque el reciente reemplazo en muchos pafses de vacunas de primera generacion de celulas enteras por nuevas aPV ha reducido significativamente las reacciones adversas sistemicas observadas con la vacuna de celulas enteras, no ha abolido la necesidad de vacunacion repetida para lograr la proteccion. Esto hace que sea poco probable obtener proteccion en los ninos muy pequenos (< 6 meses) que presentan el mayor riesgo de sufrir la enfermedad grave. Ademas, el uso extendido de aPV ha revelado nuevos problemas imprevistos. La administracion repetida de aPV puede causar una importante inflamacion en el sitio de inyeccion [41], que no se observo con vacunas de celulas enteras. En aproximadamente el 5% de los casos esta inflamacion abarca casi toda la extremidad y dura mas de una semana. Aunque todavfa no se ha caracterizado el mecanismo de esta inflamacion, se ha propuesto que se debe a una reaccion de hipersensibilidad de Arthus causada por niveles altos de anticuerpos inducidos por la inmunizacion primaria [42]. Sin embargo, tambien podna estar relacionada con el sesgo Th2 de la respuesta inmunitaria, ya que, en comparacion con las vacunas de celulas enteras, la administracion de aPV induce citocinas de tipo Th2 en ninos vacunados [10] y causa un retraso en el desarrollo de Th1 (Mascart et al., en preparacion). La maduracion tardfa de la funcion Th1 se ha asociado a un riesgo de atopia en individuos geneticamente predispuestos [33]. Los dos mecanismos no son mutuamente excluyentes. En comparacion con aPV, la respuesta inmunitaria a la administracion de BPZE1 esta menos sesgada hacia la rama Th2, y dado que BPZE1 se administra en las mucosas, no se produce ninguna reaccion de inflamacion.
El uso de bacterias vivas atenuadas como vacunas plantea el tema de la bioseguridad. Como tal, caen bajo las directivas y directrices para los organismos geneticamente modificados susceptibles de ser liberados en el medio ambiente. Estas directrices y directivas describen varios objetivos que se deben cumplir, que incluyen la identificacion de los peligros y la evaluacion del riesgo ambiental [44]. Se debe considerar cuidadosamente la potencial patogenicidad, especialmente en individuos inmunodeprimidos, como los infectados con VIH. La biologfa natural de B. pertussis es particularmente interesante en ese sentido. Aunque la tos ferina en sujetos infectados por el VIH se ha descrito ocasionalmente, es bastante rara en pacientes con SIDA [45]. En su forma geneticamente atenuada, no se esperana, por tanto, que B. pertussis causara grandes problemas en ninos infectados por el VIH, especialmente si el SIDA grave es un criterio de exclusion, como lo es para muchas vacunas. La colonizacion de B. pertussis esta estrictamente limitada al epitelio respiratorio, sin diseminacion extrapulmonar de la bacteria, lo que excluye naturalmente la bacteriemia sistemica de la cepa para vacuna BPZE1. Si, sin embargo, ocurrieran problemas de seguridad imprevistos, la cepa para vacuna puede ser facilmente eliminada mediante el uso de antibioticos macrolidos, como eritromicina, a los cuales esencialmente todas las cepas de B. pertussis son muy sensibles.
Otra preocupacion, como para cualquier vacuna, es la liberacion potencial de la cepa para vacuna en el medioambiente y las consecuencias de dicha liberacion. B. pertussis es un patogeno estrictamente humano, y no hay un animal vector o reservorio. Ademas, a diferencia de B. bronchiseptica, la supervivencia de B. pertussis de tipo natural en el medio ambiente es extremadamente limitada [46]. La tos ferina es propagada solo por individuos con tos y parece no haber portadores asintomaticos [47]. La tos no se puede evaluar en los modelos de raton utilizados en este estudio. No obstante, debido a la naturaleza de las alteraciones geneticas en BPZE1, en particular la fuerte reduccion de TCT y la inactivacion genetica de PTX, no se espera que esta cepa induzca tos. Se ha demostrado que es necesaria la PTX activa para la induccion de la tos en un modelo de tos en ratas, aunque se desconoce el mecanismo [48]. Si, no obstante, la cepa para vacuna fuera a transmitirse a individuos no vacunados,
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en el peor de los casos el resultado sena un aumento de la cobertura por vacunacion. Las consecuencias de cada uno de estos posibles peligros pueden ser calificadas por lo tanto como insignificantes y pueden ser controladas facilmente y rapidamente con antibioticoterapia si fuera necesario.
Las ventajas del uso de BPZE1 incluyen los costos de produccion relativamente bajos, lo que la hace especialmente atractiva para los pafses en desarrollo, su modo de administracion facil, sin aguja, y seguro, y su potencial para inducir inmunidad en las mucosas ademas de inmunidad sistemica. Aunque el papel de la inmunidad en las mucosas contra la tos ferina sorprendentemente no se ha abordado mucho, el hecho de que B. pertussis sea un patogeno estrictamente mucoso, hace probable que la respuesta inmunitaria de la mucosa pueda contribuir significativamente a la proteccion. Ninguna de las vacunas disponibles en la actualidad induce ninguna respuesta significativa en las mucosas.
Otras ventajas del uso de BPZE1 en la vacunacion son:
• la rapida respuesta inmunitaria protectora obtenida despues de una sola dosis intranasal de BPZE1, ya que la induccion de la inmunidad puede ser detectada 1 semana despues de la vacunacion,
• un aumento de la inmunidad protectora durante los al menos dos meses siguientes a la vacunacion, y
• la inmunidad protectora completa, dado que se obtiene un nivel de proteccion de mas del 99.999% 2 semanas despues de la vacunacion.
El uso de B. pertussis viva, atenuada, para la vacunacion en las mucosas ofrece otra ventaja. B. pertussis se puede utilizar para la presentacion de antfgenos heterologos a la mucosa respiratoria (por una revision vease 49). El uso de BPZE1 como plataforma de expresion heterologa puede, por lo tanto, ser util para la generacion de vacunas polivalentes contra diversos patogenos respiratorios. Sin embargo, puesto que la administracion intranasal de BPZE1 tambien induce fuertes respuestas inmunitarias sistemicas, como se muestra en este documento, tanto por los niveles de anticuerpos anti-FHA como por la produccion de IFN-y espedfico del antfgeno, tambien se puede usar para la produccion de antfgenos para los cuales se desea una respuesta inmunitaria sistemica.
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Claims (32)
- 51015202530354045505560REIVINDICACIONES1. Una cepa de Bordetella mutada que comprende al menos:(a) un gen de toxina pertussis (ptx) mutado, en el cual la porcion S1 de dicho gen ptx mutado codifica una toxina, que es enzimaticamente inactiva pero no esta afectada inmunologicamente,(b) un gen dermonecrotico (dnt) eliminado o un gen dnt mutado, donde dicho gen dnt mutado esta mutado por mutacion puntual o por insercion de una secuencia genetica o un plasmido que interrumpe el marco de lectura abierto del gen dnt, y en donde dicho gen dnt mutado codifica una protema DNT enzimaticamente inhibida, y(c) un gen ampG de E. coli que sustituye el gen ampG de Bordetella, donde dicha cepa expresa menos de 5% de actividad de TCT residual.
- 2. La cepa de Bordetella mutada segun la reivindicacion 1, en la que dicha mutacion puntual del gen dnt resulta en el reemplazo de Cys-1305 por Ala-1305.
- 3. La cepa de Bordetella mutada segun la reivindicacion 1 o 2, que es una cepa de Bordetella pertussis.
- 4. La cepa de Bordetella mutada segun la reivindicacion 3, donde dicha toxina enzimaticamente inactiva que mantiene sus propiedades inmunogenas se obtiene reemplazando la arginina de la posicion 9 por una lisina y el acido glutamico de la posicion 129 por una glicina.
- 5. La cepa de Bordetella mutada segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es una cepa triplementemente mutante.
- 6. La cepa de Bordetella triplementemente mutada segun la reivindicacion 5, que es una cepa BPZE1 depositada en la Coleccion Nacional de Cultivo de Microorganismos (C.N.C.M.) el 9 de marzo de 2006, con el numero I-3585.
- 7. La cepa de Bordetella mutada segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que esta atenuada.
- 8. La cepa de Bordetella mutada segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende ademas al menos una secuencia de acido nucleico heterologo que codifica un ARN o una protema.
- 9. La cepa de Bordetella mutada segun la reivindicacion 8, donde dicha al menos una secuencia de acido nucleico heterologo codifica un antfgeno.
- 10. La cepa de Bordetella atenuada segun la reivindicacion 7, para usar como una vacuna contra las infecciones causadas por especies de Bordetella, donde dicha(s) especie(s) de Bordetella es o son al menos una entre B. pertussis, B. parapertussis, y B. bronchiseptica.
- 11. La cepa de Bordetella atenuada segun la reivindicacion 10, para usar como una vacuna profilactica contra las infecciones causadas por especies de Bordetella, donde dicha(s) especie(s) de Bordetella es o son al menos una entre B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica.
- 12. Una composicion inmunogena que comprende una cepa de Bordetella mutada segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
- 13. La composicion inmunogena segun la reivindicacion 12, que contiene ademas un excipiente, vehmulo y/o portador farmaceuticamente adecuado.
- 14. La composicion inmunogena segun la reivindicacion 12 o 13, que contiene ademas un adyuvante.
- 15. Una vacuna que comprende la cepa de Bordetella atenuada de la reivindicacion 7.
- 16. Una vacuna segun la reivindicacion 15, formulada para la administracion intranasal.
- 17. Un kit que comprende una vacuna segun la reivindicacion 15 o 16 y un prospecto.
- 18. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun la reivindicacion 7, para la fabricacion de una vacuna destinada a la prevencion de una infeccion por Bordetella, donde dicha especie(s) de Bordetella es o son una entre B. pertussis, B. parapertussis, y B. bronchiseptica.
- 19. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun la reivindicacion 7, para la fabricacion de una vacuna51015202530354045destinada a la prevencion simultanea de una infeccion por B. pertussis y B. parapertussis.
- 20. El uso de una Bordetella atenuada segun la reivindicacion 18 o 19, donde la vacuna se administra por v^a subcutanea (s.c.), intradermica (i.d.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.), oral o intranasal, por inyeccion o por inhalacion.
- 21. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun la reivindicacion 18 o 19, donde la vacuna se administra por via intranasal.
- 22. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun la reivindicacion 18 o 19, donde la vacuna se administra a mairnferos que necesitan una rapida inmunidad protectora contra una infeccion por Bordetella.
- 23. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun la reivindicacion 22, donde la vacuna se administra a recien nacidos.
- 24. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun la reivindicacion 22, donde la vacuna se administra a ninos.
- 25. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, donde la vacuna se administra por via intranasal.
- 26. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, donde la vacuna se administra una vez en una sola dosis.
- 27. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun la reivindicacion 18 o 19, que comprende a) administrar una cepa segun la reivindicacion 7; y b) llevar a cabo al menos un refuerzo con la misma cepa o con una vacuna acelular o una combinacion de ambas.
- 28. El uso de la cepa de Bordetella mutada que comprende al menos (a) un gen ptx mutado, donde la porcion S1 de dicho gen ptx mutado codifica una toxina, que es enzimaticamente inactiva pero que no esta afectada inmunologicamente, (b) un gen dnt eliminado o un gen dnt mutado, donde dicho gen dnt mutado esta mutado por mutacion puntual o por insercion de una secuencia genetica o un plasmido que interrumpe el marco de lectura abierto del gen dnt, y donde dicho gen dnt mutado codifica una protema DNT inhibida enzimaticamente, y (c) un gen ampG de E. coli que reemplaza el gen ampG de Bordetella, donde dicha cepa expresa menos de 5% de actividad de TCT residual, para la preparacion de una vacuna polivalente destinada a tratar enfermedades respiratorias.
- 29. El uso de la reivindicacion 28, donde dicha mutacion puntual del gen dnt resulta en el reemplazo de Cys-1305 por Ala-1305.
- 30. El uso segun cualquiera de las reivindicaciones 18 a 29, donde el nivel de proteccion contra una infeccion por Bordetella es superior al 95%, preferentemente superior al 99%.
- 31. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun la reivindicacion 7, para la fabricacion de la vacuna destinada a proporcionar una respuesta en las mucosas y una respuesta sistemica para tratar las infecciones por Bordetella en mamfferos.
- 32. El uso de una cepa de Bordetella atenuada segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para utilizar como un vector destinado a expresar al menos un antfgeno heterologo.
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