ES2587511T3 - Sistema para detectar el nivel de estrés / malestar de animales acuáticos - Google Patents

Sistema para detectar el nivel de estrés / malestar de animales acuáticos Download PDF

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Abstract

Sistema para detectar el nivel de incomodidad de los animales acuáticos durante los estudios experimentales, comprendiendo el sistema: - un depósito de agua (1) - un electrodo de referencia (2) colocado en uno de los lados del depósito, - electrodos de registro (3, 3a, 3b), - un bio-amplificador (4) para amplificar una bio-señal recibida en el electrodo de registro, - un micro-procesador para el tratamiento de las señales - un filtro de paso bajo para el filtrado de las señales recibidas, caracterizado porque dichos electrodos de registro (3, 3a, 3b) están en la forma de placas de circuitos impresos (PCB) diseñadas para cubrir toda la superficie de otro lado del depósito de agua, y dicho filtro de paso bajo tiene una frecuencia de corte de 20 Hz.

Description

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DESCRIPCION
Sistema para detectar el nivel de estres / malestar de animales acuaticos Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un sistema para la vigilancia biologica; es decir, para detectar el nivel de estres o malestar que los animales acuaticos como peces o ranas sufren mientras se llevan a cabo estudios experimentales con ellos y tambien durante sus condiciones de vida normales mientras se mantienen en depositos de laboratorio, en casas particulares como hobby, en restaurantes para la exhibicion de animales acuaticos como peces o marisco a los clientes, en centros de acuicultura para la produccion de peces, etc. En particular, el sistema es del tipo que comprende un deposito de agua y una serie de electrodos utilizados para el registro de senales electromiograficas (EMG) y otras senales biologicas producidas por la actividad de los animales acuaticos presentes en el deposito.
Estado de la tecnica
Los animales acuaticos como peces y ranas son modelos de animales ampliamente conocidos que se utilizan ampliamente en medicina (para el estudio de enfermedades), farmacologfa (para probar nuevos medicamentos), ecotoxicologfa (para probar las respuestas de vertebrados a los contaminantes), etc. Los resultados de los experimentos in vivo llevados a cabo con animales acuaticos pueden verse afectados por varios factores. El estres juega el papel mas importante en este sentido. Fertilidad y respuesta al tratamiento, por ejemplo, se ven afectadas en gran medida por las condiciones de estres. Por lo tanto, se necesita una medida racional, cuantitativa del nivel de estres durante la experimentacion basada en animales acuaticos. Hacer caso omiso de este factor podna conducir a la mala interpretacion de los resultados finales de los experimentos in vivo.
El uso de senales biologicas para la deteccion de la actividad motora de los animales acuaticos se ha aplicado en dispositivos dirigidos a la utilizacion de animales acuaticos como sensores ecotoxicologicos para la determinacion de la calidad del agua. El dispositivo descrito en la patente US5307052, convierte el comportamiento ventilatorio de los peces en una senal y considera la senal una determinacion instantanea y directa de la calidad del agua que se esta probando. El sistema se basa en la amplificacion, filtrado y elaboracion de senales electricas obtenidas de peces colocados individualmente en una serie de depositos de agua de un tamano similar a la de los peces, que contiene el agua para ser probada y dos electrodos colocados en el interior del deposito para adquirir las senales.
El dispositivo descrito en la solicitud de patente JP2002085362 mide las bio-potenciales (es decir, senales electricas de origen biologico) de los organismos acuaticos a traves de electrodos colocados en el centro del deposito de agua. En esta solicitud, los autores reivindican que el dispositivo puede medir bio-potenciales de los organismos acuaticos en sus condiciones de vida.
En los dos casos antes mencionados (US5307052 y JP2002085362), los electrodos se colocan en el centro del deposito de agua y esto interfiere con el libre movimiento de los animales, alterando asf sus condiciones de vida y patrones de movimiento normales. Por otra parte, las senales producidas se pueden detectar solo si el animal se coloca en el espacio entre los dos electrodos. Estando estos colocados en el centro del deposito es obvio que si el animal se mueve en una parte del deposito no incluida entre los electrodos, no se detecta ninguna senal. En otras palabras, los sistemas antes mencionados no permiten el seguimiento de las senales producidas por los animales en sus condiciones de vida normales, con la excepcion de cuando se encuentran entre los dos electrodos.
La solicitud de patente WO9944057 describe un dispositivo analogo en el que las bio-potenciales se miden mediante la disposicion de una placa de electrodos de referencia en la parte inferior del deposito y una segunda placa de electrodos flotante en la superficie del agua. De esta manera los autores reivindican permitir la movilidad libre de los animales, disminuyendo el estres de los animales y facilitando la limpieza y el mantenimiento del sistema. El problema que este sistema podna causar se debe al hecho de que una placa de electrodos superficial flotante podna moverse con el movimiento natural del agua y, aunque muy leve, este movimiento distorsionana la senal detectada producida por los animales. Por otra parte, la presencia de una placa superior que cubre la totalidad de la superficie del deposito de agua bloquea la entrada de la luz que es necesaria para las condiciones normales de vida de los animales acuaticos.
En US6273026, los electrodos se colocan en un deposito de agua y se aplica una corriente entre ellos; la variacion de la forma de onda proporciona una indicacion del comportamiento del animal. A pesar de que esto podna funcionar para pruebas de comportamiento espedficas, el sistema no es adecuado para probar el nivel de estres / bienestar de los animales acuaticos, ya que la aplicacion de una corriente a traves de los electrodos sera fuertemente percibida por los animales y causara condiciones de gran estres, alterando sus condiciones de vida normales.
Entre otras tecnicas anteriores relevantes, se incluyen US6393899 B1, JP3657044 B, JP2007-064783 A, JP2010- 223590 A, WO2009/089339 A2.
Por lo tanto, las soluciones existentes utilizan electrodos que perturban y condicionan negativamente el estado y el comportamiento de los animales acuaticos que estan siendo estudiados. Ademas, los dispositivos de la tecnica
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anterior estan disenados para las pruebas en animales de uno en uno, mientras que los animales acuaticos son generalmente gregarios y viven en grupos. Ademas, ninguno de los dispositivos de la tecnica anterior tiene en cuenta la mera presencia de agua en la calidad de los registros, el ruido electromagnetico de fondo, ni es capaz de distinguirlo de las senales reales.
Sumario de la invencion
La presente invencion resuelve los problemas expuestos anteriormente proporcionando un dispositivo capaz de medir cuantitativamente el nivel de estres en los animales acuaticos; estableciendo un sistema de medicion conjunto y facilitando el desarrollo de una "escala de estres" espedfica para ser introducida de forma rutinaria en los experimentos con peces. Esto se consigue mediante:
° Nuevos tipos de electrodos y disposiciones de electrodos optimas para la deteccion de las senales biologicas.
° Filtrado de las senales obtenidas para reducir el nivel de ruido electromagnetico en las mismas.
° Medios para el procesamiento y la interpretacion de las senales biologicas.
La invencion se define en la reivindicacion independiente 1. La invencion comprende un deposito de agua, una serie de electrodos utilizados para el registro de senales electromiograficas (EMG) u otras senales biologicas producidas por la actividad de los animales acuaticos presentes en el deposito, un bio-amplificador para la amplificacion de la senal, un micro-procesador y un filtro de paso bajo.
Los electrodos de referencia y de senal pueden fabricarse del mismo material, preferiblemente de aluminio, cobre o plata. Los electrodos de registro tienen la forma de placas de circuitos impresos (PCB) disenadas para cubrir toda la superficie de un lado del deposito. El filtro de paso bajo esta configurado para filtrar las senales por encima de 20 Hz.
Breve descripcion de los dibujos
Para completar la descripcion y con el fin de proporcionar una mejor comprension de la invencion, se proporciona un conjunto de dibujos. Dichos dibujos ilustran un modo de realizacion preferido de la invencion, que no debe interpretarse como una restriccion del alcance de la invencion, sino solo como un ejemplo de como la invencion se puede realizar.
La figura 1es una representacion esquematica del dispositivo de la invencion.
La figura 2es un diagrama de Bode del agua, que muestra los diferentes niveles de atenuacion producida por el agua en funcion de la frecuencia de la senal.
La figura 3es un diagrama que muestra solamente ruido (A) y senal + ruido (B) filtrado con un filtro de paso bajo para reducir la amplitud del ruido.
La figura 4 es un grafico de la relacion senal-ruido para diferentes areas de los electrodos con senales de diferentes frecuencias.
La figura 5 es un grafico que muestra la atenuacion progresiva de la senal (ganancia negativa, medida en decibelios) para frecuencias mas altas.
La figura 6 es un grafico que muestra una configuracion (A) y un estudio de correlacion entre la senal adquirida con el sistema y la registrada en video (B).
Descripcion de la invencion
Con referencia a la figura 1, la invencion comprende un electrodo de referencia (2), situado en uno de los lados del deposito de agua (1) de manera que cubra la totalidad de su superficie. Por lado se entiende cualquiera de las paredes del deposito, incluyendo tambien su parte inferior. Al menos una matriz de electrodos de registro, que adquieren las senales biologicas producidas por los animales, esta colocada en al menos uno de los otros lados del deposito. Los electrodos de registro (3a, 3b, ...) estan acoplados a un bio-amplificador a traves de cables (5). Las senales asf amplificadas son enviadas a un micro-procesador que esta a cargo del filtrado y la interpretacion de las mismas. Los electrodos pueden estar impresos o incrustados en los lados del deposito, o se pueden proporcionar en soportes (tambien imprimidos o incrustados), o como placas independientes.
° Electrodo de referencia
Como cualquier sistema electronico, la presente invencion necesita un electrodo para ser usado como referencia de voltaje. Este electrodo se llama electrodo de referencia o de tierra. Cuanto mas grande es el electrodo de referencia, se obtendran las senales mas claras y estables. Por lo tanto, la situacion ideal es cuando este electrodo es tan grande como uno de los lados del deposito (incluyendo su parte inferior), suponiendo un tipo de deposito cuadrado.
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En un tipo circular, el electrodo podna ponerse en su parte inferior o, arqueandolo, ocupando la mitad del cilindro.
Hay dos formas principales de adquirir una senal: monopolar o bipolarmente. En el caso monopolar, la medicion se realiza entre un electrodo y un electrodo de referencia. En el caso bipolar, la medicion se realiza entre dos electrodos similares (en este caso, tambien se necesita un electrodo de referencia de todos modos para proporcionar una referencia fija, estable).
La posicion de la matriz de electrodos de registro con respecto al electrodo de referencia influye en gran medida en la deteccion de la senal. Cuanto mayor sea la distancia entre la matriz de registro con respecto al electrodo de referencia, mas grande sera la amplitud de la senal detectada. Por ejemplo, en el caso del acero inoxidable, esa relacion es casi lineal (R 2> 0,95); es decir, la amplitud de la senal registrada aumenta 2 veces si el electrodo esta a una distancia el doble de grande del electrodo de referencia.
° Matriz de electrodos de registro
Debido a la amplitud extremadamente baja de las senales bio-potenciales producidas por animales acuaticos, los registros originales deben ser de calidad superior para permitir una correcta interpretacion de las senales. En la presente invencion, se han desarrollado electrodos y configuraciones de electrodos espedficos para alcanzar esto. Sus caractensticas se describen a continuacion.
Material: El cobre, la plata y el aluminio han demostrado experimentalmente ser los materiales mas adecuados para la construccion de los electrodos. En concreto, estos metales tienen una alta conductividad, una alta relacion senal- ruido, no se oxidan, su rendimiento no se ve afectado por el ambiente acido y su comportamiento electrico es independiente de la frecuencia de la senal. Todas estas caractensticas son esenciales para permitir que el electrodo detecte las senales muy bajas a partir de la actividad biologica de los animales acuaticos, y hacerlo de una manera fiable y resistente, a pesar de las duras condiciones ambientales.
Bajo un punto de vista biologico, los electrodos construidos con esos materiales y configuraciones de la forma en que lo estan en el dispositivo presentado no son toxicos para la vida animal, no liberan iones en los medios acuaticos, y son visualmente irrelevantes para los animales: no causan ningun estres visual o restriccion de movimientos de los animales. Estos metales pueden cortarse facilmente en placas singulares que actuen como electrodos, o incrustarse en otros materiales de soporte como el plastico para crear hojas facilmente portatiles, o incluso para incrustarse en las paredes de los acuarios. Tambien se pueden obtener usando el proceso tecnico habitual de placas de circuitos impresos, que permite el diseno de electrodos muy eficaces que pueden ser disenados para cubrir toda la superficie de uno de los lados del deposito de agua, optimizando la adquisicion de la senal y al mismo tiempo permitiendo un facil transporte y sustitucion. Una tecnica similar (fabricacion de pelfcula delgada) se puede utilizar para crear electrodos flexibles, imprimiendolos directamente en una hoja delgada de plastico.
Los electrodos tambien se pueden fabricar con cables de alta calidad habiendo retirado su proteccion de plastico, de modo que los alambres finos internos esten expuestos al agua.
Los electrodos no necesariamente tienen que ser planos; pueden ser, por ejemplo, esfericos. En ese caso, en lugar de colocarlos incrustados en las paredes, varios de ellos podnan colocarse colgando de una estructura en forma de tela de arana para que puedan insertarse al mismo tiempo en el deposito, permaneciendo cerca de las paredes para evitar molestias a los animales en el deposito.
Disposiciones de electrodos: hay algunos parametros a tener en cuenta en el diseno de los electrodos de registro:
• Area de los electrodos: el tamano del electrodo influye en la calidad de la senal obtenida. Usando la relacion senal-ruido como figura de merito, la figura 4 muestra como la calidad de la senal registrada (su relacion senal- ruido) aumenta cuando aumenta el area de los electrodos. Y esto sucede para todas las frecuencias de la senal. Como cuestion de hecho, existe una relacion casi lineal (R 2> 0,99) entre el area del electrodo y la relacion senal- ruido. Por lo tanto, cuanto mayor sea el area del electrodo, mayor sera la calidad de la senal registrada. Como inconveniente, electrodos mas grandes tienen menos resolucion espacial, por lo que se reducira la informacion acerca de en que parte del deposito se esta llevando a cabo la actividad de los animales.
• Distancia entre la fuente de senal y el electrodo: esta distancia tambien influye en la calidad de la senal obtenida como se muestra en la figura 5. La atenuacion progresiva de la senal (como se ve por su ganancia negativa, medida en decibelios -dB) debido a la distancia entre la fuente de senal y el electrodo de registro es sin embargo menos importante que la sufrida por las frecuencias mas altas. Numericamente, para un electrodo de cobre, existe una diferencia media en la atenuacion de menos de 0,5 dB para una diferencia de 30 cm de distancia. Por otra parte, hay una diferencia media en la atenuacion de casi 8 dB para una diferencia de 3 ordenes de magnitud de la frecuencia de la senal de fuente. Esta diferencia en la atenuacion es mas importante en las frecuencias mas bajas (hasta 10 Hz), donde la relacion es logantmica. Por lo tanto, dependiendo del tamano del deposito, tienen que tenerse en cuenta estas caractensticas de la combinacion de agua + electrodo.
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° Bio-amplificador
El bio-amplificador es un instrumento muy sensible capaz de detectar y amplificar las pequenas senales biologicas producidas por la actividad del (de los) animal(es) (EMG, ECG, etc.) de manera que puedan llegar a ser de amplitud apreciable. Dada la pequena entidad de las bio-senales de los animales acuaticos, el uso de este instrumento es esencial.
° Micro-procesador
Una vez amplificadas, las senales se transmiten a un micro-procesador que esta a cargo del filtrado y la interpretacion de las mismas.
° Filtrado de las senales
Algunos de los problemas que no se han considerado en invenciones anteriores son el hecho de que la presencia de agua en el sistema puede afectar a la calidad de los registros y el hecho de que el nivel de ruido puede enmascarar las senales bio-potenciales completamente.
Nuestros resultados muestran que el agua dulce puesta en un deposito de agua actua como un filtro de paso bajo. En otras palabras, actua como un filtro que deja pasar las senales de baja frecuencia pero reduce considerablemente la amplitud de las senales con frecuencias superiores a la frecuencia de corte, que en este caso es de aproximadamente 2 Hz; es decir, las frecuencias superiores a 2 Hz se atenuan al menos - 3 dB (es dear, al menos 1.000 veces). Vease la figura 2 en la que se muestra un diagrama de Bode del agua. El agua atenua completamente los componentes de alta frecuencia de las senales producidas por los animales acuaticos, pero el ruido electromagnetico de alrededor puede llegar a los electrodos sin cruzar mucho volumen de agua, por lo que los componentes de alta frecuencia registrados por los electrodos son sin duda solo ruido, no senales procedentes de los animales. Esa es la razon por la cual el filtrado de paso bajo es tan cntico.
El ruido electromagnetico encontrado en la medicion de bio-potenciales de los animales acuaticos se identifico como ruido blanco; una senal aleatoria con una densidad espectral de potencia plana. En otras palabras, la senal contiene la misma potencia dentro de un ancho de banda fijo en cualquier frecuencia central, excepto alrededor de la frecuencia de la red electrica (50 Hz en Europa).
Se llevo a cabo un estudio para identificar la frecuencia de las bio-potenciales de los animales acuaticos. De hecho, con el fin de desarrollar un sistema capaz de detectar senales biologicas de animales de manera eficiente, es necesario identificar en que ancho de banda de frecuencia necesitamos filtrar para poder eliminar el ruido y retener la senal procedente de la actividad de los animales. Con este fin, se obtuvieron registros con animales puestos en un deposito de agua y se filtraron usando diferentes filtros de paso de banda. Las senales registradas se filtraron con 11 filtros diferentes de paso banda y la relacion senal-ruido se calculo para cada ancho de banda (de 10 a 1000 Hz). Los resultados indicaron que la relacion senal-ruido mas alta se encuentra en las frecuencias mas bajas, lo cual indica que la senal producida por el animal (despues de cruzar el agua en el deposito) estaba en las frecuencias bajas. Por esta razon, un filtro de paso bajo de 0 Hz a 20 Hz es esencial para la invencion, ya que elimina tanto ruido como sea posible de los registros, pero al mismo tiempo conserva gran parte de la senal original.
Un filtro de paso bajo es un filtro electronico o de software que permite el paso de senales de baja frecuencia, pero atenua (reduce la amplitud de) senales con frecuencias superiores a la frecuencia de corte. Un filtro de paso bajo de software se puede implementar mediante, por ejemplo, una media movil ponderada exponencialmente, que viene dada por la siguiente ecuacion:
k
st = t wnxt+1-n = W1Xt + W2Xt-1 + - + WkX-k+1
t Wn = 1
donde {W1, W2, ... , wk} es un conjunto de factores de ponderacion de tal manera que n=1 ,
x es la senal original, y s la senal filtrada.
En nuestra solicitud, un filtro de este tipo nos permite definir un umbral, las amplitudes por debajo del cual se consideran como ruido (vease la figura 3), y por lo tanto separar la senal objetivo de la senal de fondo.
° Interpretacion de la senal
La senal detectada y procesada es entonces correlacionada con el nivel de movimiento y la actividad de los animales mediante una escala de actividad 0 a 100 % de la siguiente manera:
• Para el 0 %, se realiza un registro con el sistema con el deposito lleno de agua, pero sin ningun animal en el mismo. Por lo tanto, este nivel corresponde a la amplitud del ruido electromagnetico presente en el ambiente.
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• Para el 100 %, se realiza un registro de varios animales, uno por uno, muy cerca de los electrodos, en condiciones de estres, por lo que el animal hace varios movimientos fuertes. La media de este tipo de registros nos da una estimacion del nivel maximo de la senal que podemos esperar de un animal colocado lo mas cerca posible del electrodo. A continuacion, la escala se ajusta multiplicando esa media por la cantidad de animales presentes en el deposito en cada momento.
Ademas, se obtienen otros varios parametros a partir de las senales proporcionadas por los electrodos, tales como: donde pasan mas tiempo los animales (por ejemplo, parte superior o inferior del deposito), si existe un grupo compacto de animales o varios subgrupos y si hay un nivel constante de actividad o si hay picos repentinos de actividad, etc.
Con estos parametros, creamos un "vector de estado" a partir del cual se pueden realizar estudios de comportamiento (incluyendo la medicion del nivel de estres de los animales acuaticos) usando un clasificador automatico entrenado con un amplio conjunto de senales por un experto humano en el comportamiento de los animales.
Experimentos y corroboraciones
Con el fin de verificar si la correspondencia entre las senales biologicas adquiridas y el movimiento de los animales era fiable, se llevaron a cabo registros con una camara web al mismo tiempo que se registraron los bio-potenciales de los animales con el sistema.
La alta correlacion numerica encontrada entre esas dos senales valido que el sistema efectivamente es capaz de detectar la actividad de los animales a traves de la evaluacion de las senales biologicas. Vease la figura 6 como ejemplo de esa alta correlacion, donde puede verse que la misma es, como de costumbre, significativa (> 0,68).
En resumen, la invencion puede proporcionar una indicacion precisa, cuantificable y espedfica del nivel de estres / bienestar de los animales acuaticos en condiciones de vida normales asf como en condiciones experimentales, sin interferir con la vida de los animales, ya que no se aplica corriente electrica a los animales, la senal detectada es directamente la senal producida por la actividad de los animales y la posicion de los electrodos no interfiere con los movimientos de los animales.
Por lo tanto, las senales adquiridas con el sistema de la invencion pueden utilizarse: i) para controlar el estado de bienestar de los animales en experimentos de laboratorio, en casas particulares (como hobby); en restaurantes que muestran animales acuaticos comestibles, como pescado y marisco en depositos; en instalaciones de acuicultura, etc.; ii) como un enfoque alternativo / de apoyo a los sistemas basados en video en las pruebas de comportamiento y neurologicas; y iii) para probar la calidad del agua (con el animal actuado como un sensor viviente). Por otra parte, las senales adquiridas se pueden correlacionar con una escala espedfica que indica cuantitativamente el nivel de estres / bienestar de los animales.
Ha de apreciarse que en este texto, el termino "comprende" y sus derivaciones (tales como "que comprende", etc.) no han de entenderse en un sentido excluyente, es decir, estos terminos no deben interpretarse como excluyentes de la posibilidad de que lo que se describe y se define pueda incluir mas elementos, etapas, etc.
Por otra parte, la invencion, obviamente, no se limita al (a los) modo(s) de realizacion espedfico(s) descritos en el presente documento, sino que tambien abarca cualquier variacion que pueda ser considerada por cualquier persona experta en la tecnica (por ejemplo, en cuanto a la eleccion de materiales, dimensiones, componentes, configuracion, etc.), dentro del alcance general de la invencion tal como se define en las reivindicaciones.

Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Sistema para detectar el nivel de incomodidad de los animales acuaticos durante los estudios experimentales, comprendiendo el sistema:
    - un deposito de agua (1)
    5 - un electrodo de referencia (2) colocado en uno de los lados del deposito,
    - electrodos de registro (3, 3a, 3b),
    - un bio-amplificador (4) para amplificar una bio-senal recibida en el electrodo de registro,
    - un micro-procesador para el tratamiento de las senales
    - un filtro de paso bajo para el filtrado de las senales recibidas, caracterizado porque dichos electrodos de registro
    10 (3, 3a, 3b) estan en la forma de placas de circuitos impresos (PCB) disenadas para cubrir toda la superficie de otro
    lado del deposito de agua, y dicho filtro de paso bajo tiene una frecuencia de corte de 20 Hz.
  2. 2. Sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los electrodos de referencia y de senal (2, 3, 3a, 3b) estan fabricados del mismo material.
  3. 3. Sistema de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que los electrodos (2, 3, 3a, 3b) estan fabricados de aluminio, 15 cobre o plata.
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