ES2586819T3 - Complemento para piensos - Google Patents

Abstract

Un complemento para piensos que comprende una fitasa y una enzima lipolítica, en el que dicha enzima lipolítica tiene actividad de lipasa a un pH en el intervalo de alrededor de pH 1,5 a alrededor de pH 3,5.

Description

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de 80% de los componentes enzimáticos que estaban presentes y eran activos en el aditivo antes de calentar hasta la temperatura especificada todavía están presentes y son activos después de que se enfríe hasta temperatura ambiente.

El complemento para piensos o al menos una enzima lipolítica y al menos una fitasa según la presente descripción pueden tener una vida útil de más de alrededor de 30 semanas; más de alrededor de 40 semanas; más de alrededor de 50 semanas; más de alrededor de 1 año; más de alrededor de 1,5 años. La vida útil significa que al menos alrededor de 80% de los componentes enzimáticos que estaban presentes y eran activos en el aditivo cuando se preparaba todavía están presentes y son activos.

Preferiblemente, el método para preparar un complemento para piensos según la presente descripción comprende una etapa de mezcladura que comprende mezclar la al menos una fitasa y al menos una enzima lipolítica opcionalmente con al menos un portador fisiológicamente aceptable.

En una realización particularmente preferida, el complemento para piensos se homogeneiza para producir un polvo.

En una realización preferida alternativa, el complemento para piensos se formula en gránulos según se describe en el documento WO2007/044968 (denominados gránulos de TPT).

En otras realizaciones preferidas, cuando el complemento para piensos se formula en gránulos, los gránulos comprenden una sal de barrera hidratada revestida sobre el núcleo proteínico. La ventaja de tal revestimiento salino es una termotolerancia mejorada, una estabilidad al almacenamiento mejorada y una protección contra otros aditivos del pienso que tienen un efecto adverso sobre la enzima.

Preferiblemente, la sal usada para el revestimiento salino tiene una actividad en agua mayor de 0,25 o una humedad constante mayor de 60% a 20°C.

Preferiblemente, el revestimiento salino comprende un Na2SO4.

El método para preparar un complemento para piensos también puede comprender la etapa adicional de nodulizar el polvo. El polvo se puede mezclar con otros componentes conocidos en la técnica. El polvo, o la mezcla que comprende el polvo, se puede forzar a través de una boquilla y las hebras resultantes se cortan en nódulos adecuados de longitud variable.

Opcionalmente, la etapa de nodulización puede incluir un tratamiento con vapor de agua, o fase de acondicionamiento, antes de la formación de los nódulos. La mezcla que comprende el polvo se puede colocar en un acondicionador, p. ej. un mezclador con inyección de vapor de agua. La mezcla se calienta en el acondicionador hasta una temperatura especificada, tal como de 60-100°C, temperaturas típicas serían 70°C, 85°C, 90°C o 95°C. El tiempo de permanencia puede ser variable de segundos a minutos e incluso horas. Tal como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minutos 2 minutos., 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos y 1 hora.

Se entenderá que el complemento para piensos de la presente invención es adecuado para la adición de cualquier material para piensos apropiado.

Según se usa en la presente memoria, el término material para piensos se refiere al material para piensos básico que va a ser consumido por un animal. Se entenderá además que este puede comprender, por ejemplo, al menos uno o más granos no procesados y/o material vegetal y/o animal procesado tal como harina de soja o harina de huesos.

En algunas realizaciones, el material para piensos comprenderá uno o más de los siguientes componentes: a) cereales, tales como granos pequeños (p. ej., trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de los mismos) y/o granos grandes tales como maíz o sorgo; b) subproductos procedentes de cereales, tales como harina de gluten de maíz, granos secos de destilería con solubles (DDGS, por sus siglas en inglés), salvado de trigo, moyuelo de trigo, granza de trigo, salvado de arroz, cáscaras de arroz, cáscaras de avena, almendra de palma y pulpa de cítricos; c) proteína obtenida de fuentes tales como soja, girasol, cacahuete, altramuz, guisantes, habas, algodón, colza, harina de pescado, proteína plasmática secada, harina de carne y huesos, proteína de patata, trigo, copra, sésamo; d) aceites y grasas obtenidos de fuentes vegetales y animales; e) minerales y vitaminas.

Será además evidente que el complemento para piensos de la presente invención es particularmente ventajoso cuando se añade a un material para piensos con alto contenido de fitato.

Según se usa en la presente memoria, el término comida para animales se refiere a un material para piensos al que se han añadido uno o más complementos para piensos.

Se entenderá por el experto que diferentes animales requieren diferentes comidas para animales, e incluso el mismo animal puede requerir diferentes comidas para animales, dependiendo del propósito para el que se cría el animal. Se entenderá además que dependiendo de la materia prima para piensos, la comida para animales puede ser una comida para animales alta en fibra o una comida para animales bajo en fibra.

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Preferiblemente, la comida para animales puede comprender materiales para piensos que comprenden maíz, trigo, cebada, triticale, centeno, arroz, tapioca, sorgo y/o cualquiera de los subproductos, así como componentes ricos en proteína como harina de soja, harina de semillas de colza, harina de Canola, harina de semillas de algodón, harina de semillas de girasol, harinas de subproductos animales y mezclas de las mismas. Más preferiblemente, la comida para animales puede comprender grasas animales y/o aceites vegetales.

Opcionalmente, la comida para animales también puede contener minerales adicionales tales como, por ejemplo, calcio, y/o vitaminas adicionales.

Será evidente para el experto que el complemento para piensos de la presente invención será particularmente beneficioso cuando se usa en una comida para animales que comprende alto contenido de calcio. Más particularmente, una comida para animales que comprende alto contenido de calcio y alto contenido de fitato.

Será evidente para un experto que el nivel de calcio que representa una dieta alta en calcio puede variar dependiendo del tipo de animal e incluso del uso para el que se cría el animal. Por ejemplo, para gallinas ponedoras, una dieta con >3% sería una dieta alta en Ca. Para pollos de engorde y todos los pavos, una dieta con >1% de Ca sería una dieta alta en Ca. Para los propósitos de la presente invención, se considera que una dieta alta en calcio es una dieta que comprende al menos 1-2% de calcio.

Será además evidente para un experto que una dieta alta en fitato es una que comprende >0,90% en peso de ácido fítico.

Según se define en la presente memoria, comida para animales baja en fibra es una comida para animales que comprende uno o más materiales para piensos, que contiene un contenido máximo de paredes celulares insolubles en agua de alrededor de 25%, y/o un contenido máximo de polisacáridos que no son de almidón solubles de alrededor de 4%. Más preferiblemente, un contenido máximo de paredes celulares insolubles en agua de alrededor de 22,5%, alrededor de 20%, alrededor de 17,5%, alrededor de 15%, alrededor de 12,5%; y/o un contenido máximo de polisacáridos que no son de almidón solubles de alrededor de 3%, alrededor de 2,5%, alrededor de 2%, alrededor de 1,75%, alrededor de 1,5%, alrededor de 1,25%.

En realizaciones preferidas, el complemento para piensos o al menos una enzima lipolítica y al menos una fitasa según la presente descripción se mezcla con al menos un material para piensos bajo en fibra, por ejemplo, maíz, trigo, una harina de subproductos animales o soja y/o cualquiera de los subproductos para proporcionar una comida para animales baja en fibra.

Preferiblemente, la comida para animales es una mezcla de harina de maíz y soja.

Preferiblemente, el material para piensos es salvado de arroz no desgrasado.

En realizaciones preferidas, la comida para animales comprende fitasa en un nivel de alrededor de 250 FT U/kg a alrededor de 15.000 FT U/kg de comida para animales (p. ej. de 250 a 10.000 FT U/kg, 400-7.500 FT U/kg y también 500-5.000 FT U/kg).

En realizaciones preferidas adicionales, la comida para animales comprende enzima lipolítica en un nivel de alrededor de 125 LIP U/kg a alrededor de 45.000 LIP U/kg de comida para animales (p. ej. de 500 a 30.000 LIP U/kg, 1.000-20.000 LIP U/kg y también 3.000-10.000 LIP U/kg).

Será claramente evidente para el experto que a fin de que el complemento para piensos de la presente invención proporcione las ventajas reivindicadas, debe estar presente fitato en el material para piensos o la comida para animales. También será claramente evidente que este fitato debe estar presente de forma natural como un constituyente del material para piensos, o se puede añadir como un complemento adicional en un nivel deseado.

En otro aspecto, se proporciona un método para producir una comida para animales. La comida para animales se produce típicamente en fábricas de piensos en las que las materias primas se trituran en primer lugar hasta un tamaño de partícula adecuado y a continuación se mezclan con aditivos apropiados. La comida para animales se puede producir a continuación como una pasta o nódulos; lo último implica típicamente un método mediante el cual la temperatura se eleva hasta un nivel buscado y a continuación el pienso se hace pasar a través de una boquilla para producir nódulos de un tamaño particular. Los nódulos se dejan enfriar. Posteriormente, se pueden añadir aditivos líquidos tales como grasa y enzima. La producción de comida para animales también puede implicar una etapa adicional que incluye extrusión o expansión antes de la nodulización -en particular mediante técnicas adecuadas que pueden incluir al menos el uso de vapor de agua.

La comida para animales puede ser una comida para animales para un animal monogástrico, tal como aves de corral (por ejemplo, pollos de engorde, gallinas ponedoras, variedades de engorde, pavos, patos, gansos, aves acuáticas), cerdos (todas las categorías de edad), mascotas (por ejemplo perros, gatos) o peces.

Opcionalmente, la comida para animales puede comprender aditivos adicionales. Por ejemplo, se puede añadir calcio a la comida para animales en cualquier cantidad para complementar la dieta del animal y/o como un agente

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La Figura 13 muestra los resultados de una prueba en la que la fitasa se extraía del producto Ronozyme revestido y se formulaba en trigo integral triturado para estudiar la temoestabilidad de la molécula de fitasa sin protección.

Las Figuras 14-17 muestran la actividad de las fitasas para el uso en la presente invención y controles contra fitato a diversos pH.

Las Figuras 18 y 19 son cromatogramas de HPLC que muestran claramente que la fitasa procedente de variantes de Buttiauxella catalizaba la hidrólisis de ácido fítico a una temperatura mayor de 85°C.

La Figura 20 muestra el pDONR221::lip 3 que contiene el ADN genómico de lipasa 3 de Aspergillus tubingensis.

La Figura 21 muestra la construcción de expresión de lipasa final ATlipasa3Trex.

La Figura 22 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID Nº: 11) que codifica fitasa de Buttiauxella silvestre.

La Figura 23A muestra coeficientes de digestibilidad ileal de energía de cerdos canulados (EEM=0,0009). Las barras con diferentes letras difieren en un nivel de P<0,05.

La Figura 23B muestra coeficientes de digestibilidad ileal de proteína bruta de cerdos canulados (EEM=0,0009). Las barras con diferentes letras difieren en un nivel de P<0,05.

La Figura 24 muestra coeficientes de energía digerible en el tracto total de cerdos (EEM=0,009). Las barras con diferentes letras difieren en un nivel de P<0,05.

La Figura 25A muestra la retención de calcio en el tracto total de cerdos (EEM=0,027). Las barras con diferentes letras difieren en un nivel de P<0,05.

La Figura 25B muestra la retención de fósforo en el tracto total de cerdos (EEM=0,030). Las barras con diferentes letras difieren en un nivel de P<0,05.

La Figura 26 muestra la secuencia de aminoácidos de fitasa de E. coli silvestre que incluye la secuencia de señal (SEQ ID Nº: 12).

La Figura 27 muestra la secuencia de aminoácidos de fitasa de E. coli silvestre madura (SEQ ID Nº: 13).

La Figura 28 muestra la secuencia de nucleótidos que codifica la fitasa de E. coli silvestre (SEQ ID Nº: 14).

La Figura 29 muestra la producción de ácido graso libre a partir de un pienso de maíz-soja cuando se incuba con diversas combinaciones de enzima lipolítica/fitasa.

La Figura 30 muestra la producción de un complejo resistente a fitasa de ácido fítico y calcio y la inversión al añadir ácidos grasos libres. La Figura 30A muestra el efecto sobre la actividad de fitasa de incrementar la concentración de CaCl2. La Figura 30B muestra el efecto sobre la actividad de fitasa de añadir ácidos grasos libres a la mezcla de reacción que contiene 15 mM.

La Figura 31 muestra la producción de un complejo resistente a fitasa de ácido fítico y calcio y la inversión al añadir una mezcla de reacción de lipasa que incluye lipasa. La Figura 31A muestra el efecto sobre la actividad de fitasa de incrementar la concentración de CaCl2 y la Figura 31B muestra el efecto sobre la actividad de fitasa de añadir una mezcla de reacción de lipasa a la mezcla de reacción de fitasa que contiene CaCl2 30 mM.

La Figura 32 muestra el perfil de pH de lipasa 3 y lipasa pancreática en una dieta de maíz-soja.

La Figura 33 muestra el coeficiente de digestibilidad ileal de fósforo en pollos de engorde. Las barras con diferentes letras difieren en un nivel de P<0,05.

La Figura 34 muestra el coeficiente de digestibilidad ileal de calcio en pollos de engorde. Las barras con diferentes letras difieren en un nivel de P<0,05.

La Figura 35 muestra el coeficiente de retención en el tracto total de fósforo en pollos de engorde. Las barras con diferentes letras difieren en un nivel de P<0,05.

Figura 36. Coeficiente de retención en el tracto total de calcio en dos experimentos con pollos de engorde. Las barras con diferentes letras difieren en un nivel de P<0,05.

La Figura 37 muestra la hipótesis de los inventores del mecanismo implicado en la interacción de lipasa y fitasa en el tracto digestivo de aves de corral. La figura muestra una representación esquemática del posible mecanismo detrás del efecto sinérgico observado entre lipasa y fitasa. Debido a la acción de la lipasa 3 bajo condiciones ácidas, los ácidos grasos libres (FFA) se liberan en una fase más temprana en la digestión en comparación con la situación sin lipasa 3. Estos FFA se pueden unir con calcio (Ca) en exceso para formar jabones en el intestino. Entonces, hay menos Ca libre disponible para unirse a ácido fítico (IP6) y formar el complejo resistente a fitasa. Finalmente, más

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que cargan un coste relativamente alto por la existencia de un hueco y una penalización menor por cada residuo posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos más comúnmente usado. Por supuesto, las altas penalizaciones de huecos producirán alineamientos optimizados con menos huecos. La mayoría de los programas de alineamiento permiten que se modifiquen las penalizaciones por huecos. Sin embargo, se prefiere usar los valores por defecto cuando se usa tal software para las comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se usa el paquete de programas GCG Wisconsin Bestfit, la penalización por huecos por defecto para secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión.

Por lo tanto, el % de homología máximo requiere en primer lugar la producción de un alineamiento óptimo, teniendo en cuenta las penalizaciones por huecos. Un programa informático adecuado para llevar a cabo tal alineamiento es el paquete de programas GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Ejemplos de otro software que puede realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas BLAST (véase Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4ª Ed -Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y el conjunto de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponible para la búsqueda sin conexión y con conexión a la red (véase Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7-58 a 7-60).

Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa GCG Bestfit. También está disponible una nueva herramienta, llamada BLAST 2 Sequences, para comparar secuencias de proteínas y nucleótidos (véanse FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Left 1999 177(1): 187-8 y [email protected]).

Aunque el % de homología final se puede medir en cuanto a la identidad, el propio procedimiento de alineamiento no se basa típicamente en la comparación de pares por todo o nada. En cambio, se usa generalmente una matriz de puntuación de similitud a escala que asigna puntuaciones a cada comparación por pares basada en la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de tal matriz comúnmente usado es la matriz BLOSUM62 -la matriz por defecto para el conjunto de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin usan generalmente bien los valores por defecto públicos o bien una tabla de comparación de símbolos personalizada si se suministra (véase el manual del usuario para detalles adicionales). Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores por defecto públicos para el paquete de programas GCG o, en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Alternativamente, el porcentaje de homologías se puede calcular usando la característica de alineamiento múltiple en DNASIS™ (Hitachi Software), basada en un algoritmo, análoga a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).

Una vez que el software ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología, preferiblemente el % de identidad de secuencia. Típicamente, el software hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

En un aspecto preferible de la presente invención, se usan el software y los ajustes siguientes para calcular el porcentaje de homología/identidad de secuencia. Para secuencias de aminoácidos, el porcentaje de identidades (homología) o "positivos" se calcula mediante el AlignX VectorNTI (Vector NTI Advance 9.1 de Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, EE.UU. de A.) para cada posible par de secuencias de aminoácidos. Los ajustes son parámetros por defecto (penalización por apertura de hueco -10, penalización por extensión de hueco 0,1).

Para secuencias de ácido nucleico, el porcentaje de identidades (homología) o "positivos" se calcula mediante el programa AlignX VectorNTI de Informax Inc. (EE.UU. de A.) para cada posible par de secuencias de ácido nucleico. Los ajustes son ajustes por defecto para ADN y son: Penalización por apertura de hueco: 15 y Penalización por extensión de hueco: 6,66. (los mismos ajustes para alineamientos múltiples).

Preferiblemente, la identidad de los aminoácidos (homología) se calcula a lo largo de toda la secuencia de aminoácidos o para un ácido nucleico para un polinucleótido correspondiente que codifica la secuencia de aminoácidos de longitud completa respectiva.

Las secuencias también pueden tener eliminaciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácido que producen un cambio sinónimo y dan como resultado una sustancia funcionalmente equivalente. Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos deliberadas basándose en las propiedades de los aminoácidos (tales como polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los residuos) y por lo tanto es útil agrupar entre sí los aminoácidos en grupos funcionales. Los aminoácidos se pueden agrupar entre sí basándose en las propiedades de su cadena lateral sola. Sin embargo, es más útil incluir además datos de mutaciones. Es probable que los conjuntos de aminoácidos así derivados se conserven por razones estructurales. Estos conjuntos se pueden describir en la forma de un diagrama de Venn (Livingstone C.D. y Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl Biosci. 9: 745-756)(Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J.Theor.Biol. 119; 205-218). Las sustituciones conservativas se pueden hacer, por ejemplo, según la tabla posterior que describe un agrupamiento de aminoácidos en un diagrama de Venn generalmente aceptado.

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CONJUNTO

SUBCONJUNTO

Hidrófobo

FWYHKMILVAGC Aromático FWYH

Alifático

ILV

Polar

WYHKREDCSTNQ Cargado HKRED

Cargado positivamente

HKR

Cargado negativamente

ED

Pequeño

VCAGSPTND Minúsculo AGS

La presente descripción también abarca la sustitución homóloga (sustitución y reemplazo se usan ambos en la presente memoria para indicar el intercambio de un residuo de aminoácido existente por un residuo alternativo) que se puede producir, es decir la sustitución de similar por similar tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. También se puede producir una sustitución no homóloga, es decir de una clase de residuo por otra o alternativamente que implica la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (mencionada posteriormente en la presente memoria como Z), ácido diaminobutírico-ornitina (mencionados en la presente memoria posteriormente como B), norleucina-ornitina (mencionadas en la presente memoria posteriormente como O), piridilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.

Los reemplazos también se pueden hacer por aminoácidos no naturales.

El término "proteína", según se usa en la presente memoria, incluye proteínas, polipéptidos y péptidos.

Los términos "residuo de aminoácido equivalente a", "aminoácido correspondiente a" y equivalentes gramaticales de los mismos se usan en la presente memoria para referirse a un residuo de aminoácido de una proteína que tiene la posición y el efecto similares a los indicados en una secuencia de aminoácidos particular de una proteína particular. El experto en la técnica conocerá la equivalencia de residuos especificados en proteínas comparables.

El término "propiedad" o equivalentes gramaticales del mismo en el contexto de un polipéptido, según se usa en la presente memoria, se refieren a cualquier característica o atributo de un polipéptido que se pueda seleccionar o detectar. Estas propiedades incluyen, pero no se limitan a, estabilidad oxidativa, especificidad para el sustrato, actividad catalítica, estabilidad térmica, perfil de actividad de temperatura y/o pH, estabilidad de procesamiento del pienso y capacidad para ser secretado.

Según se usa en la presente memoria, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo con el término "polipéptido" y/o el término "proteína". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo con el término "péptido". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo con el término "enzima".

La secuencia de aminoácidos se puede preparar/aislar de una fuente adecuada, o se puede elaborar sintéticamente

o se puede preparar mediante el uso de técnicas de ADN recombinante.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan intercambiablemente en la presente memoria. En la divulgación y las reivindicaciones presentes, se usan los códigos convencionales de una letra y tres letras para los residuos de aminoácido. El código de 3 letras para los aminoácidos se define de acuerdo con the IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). También se entiende que un polipéptido puede ser codificado por más de una secuencia de nucleótidos debido a la degeneración del código genético.

El término "secuencia de señal" o "péptido de señal" se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos que pueda participar en la secreción de las formas madura o precursora de la proteína. Esta definición de secuencia de señal es una funcional, destinada a incluir todas las secuencias de aminoácidos codificadas por la porción Nterminal del gen proteínico, que participa en la consecución de la secreción de proteína. A menudo, pero no universalmente, se unen a la porción N-terminal de una proteína o a la porción N-terminal de una proteína precursora.

Por "fragmento funcional" se entiende un fragmento del polipéptido que retiene esas propiedades características de ese polipéptido. En el contexto de la presente invención, un fragmento funcional de una fitasa o enzima lipolítica es un fragmento que retiene la capacidad de escisión de toda la proteína de la fitasa o la enzima lipolítica.

El término "aislado", "recuperado" o "purificado" se refiere a un material que se retira de su ambiente original. El término "sustancialmente purificado" significa que el material se ha purificado hasta al menos un grado sustancial.

En un aspecto, preferiblemente, el nucleótido o la secuencia de aminoácidos está en una forma aislada. El término "aislado" significa que la secuencia está al menos sustancialmente libre de al menos otro componente con el que la secuencia está naturalmente asociada en la naturaleza y según se encuentra en la naturaleza.

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Otras definiciones de términos pueden aparecer a lo largo de la memoria descriptiva. Antes de que se describan con más detalle las realizaciones ejemplares, se debe entender que esta divulgación no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que estas, por supuesto, pueden variar. También se ha de entender que la terminología usada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente divulgación se limitará solamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporcione un intervalo de valores, se entiende que también se divulga específicamente cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto dicte claramente otra cosa, entre los límites superior e inferior de ese intervalo. Cada intervalo menor entre cualquier valor indicado o valor intermedio en un intervalo indicado y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado está abarcado dentro de esta divulgación. Los límites superior e inferior de estos intervalos menores se pueden incluir o excluir independientemente en el intervalo, y cada intervalo en el que estén incluidos cualquiera, ninguno o ambos límites en los intervalos menores también está abarcado dentro de esta divulgación, sujeto a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluya uno o ambos límites, los intervalos que excluyan cualquiera o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en esta divulgación.

Se debe apuntar que según se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno(a)" y "el(la) " incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "un gen" incluye una pluralidad de tales posibles agentes y la referencia a "la célula" incluye la referencia a una o más células y equivalentes de las mismas conocidos por los expertos en la técnica, etc.

Las publicaciones analizadas en la presente memoria se proporcionan solamente para su divulgación antes de la fecha de publicación de la presente solicitud. Nada en la presente memoria se ha de considerar como una admisión de que tales publicaciones constituyan técnica anterior a las reivindicaciones adjuntas a la presente memoria.

Las enzimas para el uso en la presente invención se pueden producir mediante cultivo bien sólido o bien sumergido, incluyendo procedimientos discontinuos, de alimentación por lotes o de flujo continuo. El cultivo se efectúa en un medio de crecimiento que comprende un medio acuoso de sales minerales, factores de crecimiento orgánicos, el material de fuente de carbono y energía, oxígeno molecular y, por supuesto, un inóculo de partida de una o más especies de microorganismo particulares que se van a emplear.

Además de la fuente de carbono y energía, el oxígeno, el nitrógeno asimilable y un inóculo del microorganismo, es necesario suministrar cantidades adecuadas en proporciones apropiadas de nutrientes minerales para asegurar el crecimiento apropiado de los microorganismos, maximizar la asimilación de la fuente de carbono y energía por las células en el proceso de conversión microbiana y alcanzar rendimientos celulares máximos con densidad celular máxima en el medio de fermentación.

La composición del medio mineral acuoso puede variar a lo largo de un amplio intervalo, dependiendo en parte del microorganismo y el sustrato empleados, como se sabe en la técnica. Los medios minerales deben incluir, además de nitrógeno, cantidades adecuadas de fósforo, magnesio, calcio, potasio, azufre y sodio, en formas iónicas y combinadas asimilables solubles adecuadas, y también deben estar presentes preferiblemente ciertos oligoelementos tales como cobre, manganeso, molibdeno, cinc, hierro, boro y yodo, y otros, de nuevo en forma asimilable soluble adecuada, todo como se sabe en la técnica.

La reacción de fermentación es un procedimiento aeróbico en el que el oxígeno molecular necesario es suministrado por un gas que contiene oxígeno molecular tal como aire, aire enriquecido en oxígeno o incluso oxígeno molecular sustancialmente puro, proporcionado para mantener el contenido del recipiente de fermentación con una presión parcial de oxígeno adecuada eficaz para ayudar a la especie de microorganismo a crecer de un modo próspero. En efecto, al usar un sustrato de hidrocarburo oxigenado, el requerimiento de oxígeno para el crecimiento del microorganismo se reduce. No obstante, se debe suministrar oxígeno molecular para el crecimiento, puesto que la asimilación del sustrato y el crecimiento correspondiente de los microorganismos es, en parte, un procedimiento de combustión.

Aunque la velocidad de aireación puede variar a lo largo de un intervalo considerable, la aireación se efectúa generalmente a una velocidad que está en el intervalo de alrededor de 0,5 a 10, preferiblemente alrededor de 0,5 a 7,  volúmenes (a la presión empleada y a 25°C) de gas que contiene oxígeno por volumen de líquido en el fermentador por minuto. Esta cantidad se basa en aire de contenido de oxígeno normal que se suministra al reactor, y en cuanto a oxígeno puro, los intervalos respectivos sería de alrededor de 0,1 a 1,7, o preferiblemente de alrededor de 0,1 a 1,3, volúmenes (a la presión empleada y a 25°C) de oxígeno por volumen de líquido en el fermentador por minuto.

La presión empleada para el procedimiento de conversión microbiana puede variar ampliamente. Las presiones generalmente están en el intervalo de alrededor de 0 a 0,34 MPa (50 psig), actualmente preferiblemente alrededor de 0 a 0,21 MPa (30 psig), más preferiblemente al menos ligeramente sobre la presión atmosférica, como un equilibrio de equipo y coste de funcionamiento frente a la solubilidad de oxígeno alcanzada. Presiones mayores que la atmosférica son ventajosas ya que tales presiones tienden a incrementar una concentración de oxígeno disuelto en el fermento acuoso, que a su vez puede ayudar a incrementar las velocidades crecimiento celular. Al mismo

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ultrafiltración, evaporación o precipitación. La precipitación de los componentes proteínicos del sobrenadante o el filtrado se puede efectuar por medio de una sal, p. ej., sulfato amónico. Una purificación adicional se puede alcanzar opcionalmente mediante cristalización o mediante una variedad de procedimientos cromatográficos, p. ej., cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o procedimientos reconocidos en la técnica similares.

Fitasas.

El ácido fítico (hexaquisfosfato de mioinositol) es un importante constituyente de cereales, legumbres y cultivos oleaginosos. La forma salina, el fitato, es la principal forma de almacenamiento de fósforo en estas plantas.

Según se usa en la presente memoria, el término "fitasa" o "actividad de fitasa" se refiere a una proteína o un polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de fitato en (1) mioinositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetra-y/o pentafosfatos del mismo y (3) fosfato inorgánico. Por ejemplo, enzimas que tienen la actividad catalítica que se define en Enzyme Commission EC número 3.1.3.8 o EC número 3.1.3.26.

Algunas fitasas, además del fitato, son capaces de hidrolizar al menos algunos de los fosfatos de inositol de grados de fosforilación intermedios.

Los términos "variante de fitasa" o "variante" o "forma modificada" se refieren a una enzima fitasa con una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de una fitasa parental que tiene una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos, que conjuntamente se denominan "mutaciones".

Los términos "fitasa parental" o "enzima parental" se refieren a una enzima fitasa de la que se deriva una variante de fitasa. Una fitasa parental puede ser una fitasa silvestre u otra variante de fitasa. En particular, en la presente invención, una "fitasa parental" se puede derivar de una Buttiauxella sp. o E. coli según se describe en los documentos WO 99/08539 US 5876997, US 6190897 y AU 735371 EP 1003379 y JP 2001514869. Adecuadamente, la "fitasa parental" se deriva de la cepa P1-29 de Buttiauxella depositada bajo en número de registro NCIMB41248 según describía el documento WO2006/043178.

Los términos "fitasa de E. coli" y "fitasa de Buttiauxella sp." significan que las enzimas no necesitan haberse obtenido de una fuente de E. coli o Buttiauxella sp. En cambio, las enzimas preferiblemente tienen que tener las mismas características funcionales o secuencia que las de la fitasa de E. coli o Buttiauxella sp.. Por ejemplo, la fitasa de Buttiauxella sp. puede ser una variante derivada de una Buttiauxella sp., pero que no está presente naturalmente en especies de Buttiauxella.

El término "Buttiauxella" se refiere a un género de bacterias facultativamente anaerobias gramnegativas de la familia Enterobacteriaceae y Buttiauxella spp incluyen B. agrestis, B. brennerase, B. ferragutiae, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae y B. warmboldiae. Cepas de las especies de Buttiauxella están disponibles, por ejemplo, de the American Type Culture Collection (ATCC) y DSMZ, the German National Resource Centre for Biological Material.

Las fitasas de Buttiauxella se identifican preferiblemente a partir de Buttiauxella spp mediante los métodos descritos en el documento WO 2006/043178.

En una realización alternativa, la fitasa parental o la fitasa se puede derivar de Citrobacter sp. según se describe n el documento WO2006/038062.

Los términos "fitasa silvestre" o "silvestre", según se usan en la presente memoria, describen una enzima fitasa con una secuencia de aminoácidos encontrada en la naturaleza. En particular, la fitasa de Buttiauxella silvestre es la mostrada como SEQ ID. Nº 1. La fitasa de E. coli silvestre se muestra como SEQ ID Nº 13 (Figura 27).

El término "variante de fitasa", según se usa en la presente memoria, significa una enzima fitasa con una secuencia de aminoácidos que difiere en al menos una sustitución, inserción y/o eliminación de aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácidos de la fitasa de SEQ. ID Nº: 1 o SEQ ID Nº 13. Los términos "variante" y "variación", según se usan en la presente memoria, significan meramente que hay una diferencia entre la secuencia de la secuencia de aminoácidos de la variante de fitasa y la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID Nº: 1 o 13, y no significa que una secuencia de aminoácidos de SEQ. ID Nº: 1 o 13 o cualquier otra fitasa sirva como una materia prima de ningún modo y/o estuviera físicamente variada, mutada, modificada o bloqueada de otro modo para dar la variante. Indicado simplemente, las variantes de fitasa para el uso en la presente invención se pueden preparar mediante cualquier método, y los expertos estarán muy familiarizados con numerosos métodos, algunos de los cuales se describen en la presente memoria, para elaborar las variantes de fitasa.

Realizaciones de fitasas variantes (p. ej., fitasas de Buttiauxella sp. variantes) para el uso en la presente invención se divulgan en WO 2006/043178, WO 2008/097619 y PCT/US2009/41011 y describen fitasas obtenibles de p derivadas de una Buttiauxella sp. parental y fitasas correspondientes a enzima fitasa de Buttiauxella sp.. Específicamente, el documento WO 2006/043178 describe la mutagénesis de una enzima fitasa silvestre que tiene la secuencia divulgada en la presente memoria como SEQ ID Nº: 3. Un número de mutaciones preferidas se muestra en el documento WO 2006/043178. El documento PCT/US2009/41011 muestra mutaciones preferidas

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Las secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que se pueden insertar entre dos residuos de aminoácido cualesquiera de la secuencia incluyendo grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo además de espaciadores de aminoácido tales como residuos de glicina o β-alanina. Una forma de variación adicional implica la presencia de uno o más residuos de aminoácido en forma peptoide, y será bien entendida por los expertos en la técnica. Para evitar dudas, la "forma peptoide" se usa para referirse a residuos de aminoácido variantes en los que el grupo sustituyente del carbono α está en el átomo de nitrógeno del residuo en vez del carbono α. Procedimientos para preparar péptidos en la forma peptoide se conocen en la técnica, por ejemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.

Otros componentes

El complemento para piensos de la presente invención se puede usar en combinación con otros componentes o portadores.

Portadores adecuados para enzimas para piensos incluyen maltodextrina, piedra caliza (carbonato cálcico), ciclodextrina, trigo o un componente del trigo, sacarosa, almidón, un antiespumante, Na2SO4, talco, PVA y mezclas de los mismos. Además, existe un número de técnicas de encapsulación incluyendo las basadas en la cobertura con cera/grasa, añadir gomas vegetales, etc.

Ejemplos de otros componentes incluyen uno o más de: espesantes, agentes gelificantes, emulsionantes, aglutinantes, modificadores de cristales, edulcorantes (incluyendo edulcorantes artificiales), modificadores de la reología, estabilizadores, antioxidantes, tintes, enzimas, portadores, vehículos, excipientes, diluyentes, agentes lubricantes, agentes saborizantes, colorantes, agentes de suspensión, desintegrantes, aglutinantes de granulación, etc. Estos otros componentes pueden ser naturales. Estos otros componentes se pueden preparar mediante el uso de técnicas químicas y/o enzimáticas.

Según se usa en la presente memoria, el término "espesante o agente gelificante", según se usa en la presente memoria, se refiere a un producto que evita la separación al frenar o evitar el movimiento de las partículas, ya sean gotículas de líquidos inmiscibles, aire o sólidos insolubles.

El término "estabilizador", según se usa en la presente, se define como un ingrediente o una combinación de ingredientes que evita que un producto (p. ej. un producto alimenticio) cambie a lo largo del tiempo.

El término "emulsionante", según se usa en la presente memoria, se refiere a un ingrediente (p. ej. un ingrediente de un producto alimenticio) que evita la separación de emulsiones.

Según se usa en la presente memoria, el término "aglutinante" se refiere a un ingrediente (p. ej. un ingrediente alimenticio) que une el producto entre sí a través de una reacción física o química.

El término "modificador del cristal", según se usa en la presente memoria, se refiere a un ingrediente (p. ej. un ingrediente alimenticio) que afecta a la cristalización bien de grasa o bien de agua.

"Portadores" o "vehículos" significa materiales adecuados para la administración de compuestos e incluyen cualquiera de estos materiales conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, cualquier líquido, gel, disolvente, diluyente líquido, solubilizante o similares, que sea atóxico y no interactúe con ningún componente de la composición de un modo perjudicial.

Ejemplos de portadores nutricionalmente aceptables incluyen, por ejemplo, un grano, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, ceras, vaselina, aceites vegetales, y similares.

Ejemplos de excipientes incluyen uno o más de: celulosa microcristalina y otras celulosas, lactosa, citrato sódico, carbonato cálcico, fosfato cálcico dibásico, glicina, almidón, azúcar de la leche y polietilenglicoles de alto peso molecular.

Ejemplos de desintegrantes incluyen uno o más de: almidón (preferiblemente almidón de maíz, patata o tapioca), almidón glicolato sódico, croscarmelosa sódica y ciertos silicatos complejos.

Ejemplos de aglutinantes de granulación incluyen uno o más de: polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, maltosa, gelatina y goma arábiga.

Ejemplos de agentes lubricantes incluyen uno o más de: estearato magnésico, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco.

Ejemplos de diluyentes incluyen uno o más de: agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.

Los otros componentes se pueden usar simultáneamente (p. ej. cuando están mezclados entre sí o incluso cuando se aportan mediante diferentes vías) o secuencialmente (p. ej., se pueden aportar mediante diferentes vías).

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(ii) cultivar la célula a un pH 4 A pH 5,5 bajo condiciones que permitan la expresión de dichas secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican dicha enzima lipolítica;

(iii) aislar, purificar o concentrar la enzima en un medio a pH 5,5 a pH 6,5.

En este aspecto, preferiblemente, la enzima lipolítica:

a) comprende una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID Nº: 7 o SEQ ID Nº: 8 o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 7 o 8; y/o

b) es codificada por un nucleótido que comprende la secuencia mostrada como SEQ ID Nº: 9 o SEQ ID Nº: 10 o que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 9 o SEQ ID Nº: 10; y/o

c) es codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida a SEQ ID Nº: 9 o SEQ ID Nº: 10 o comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 9 o SEQ ID Nº: 10 o el complemento de cualquiera de las mismas bajo condiciones rigurosas; y/o

d) al menos una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una enzima lipolítica en la que la secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID Nº: 9 o SEQ ID Nº: 10 excepto por la degeneración del código genético.

Adecuadamente, puede haber al menos una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la enzima lipolítica en la célula de Trichoderma reesei. Puede haber dos o más copias (es decir múltiples copias) de la o cada secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la enzima lipolítica según la presente descripción en la célula de Trichoderma reesei. Cada secuencia de nucleótidos heteróloga está asociada con y está bajo el control de un promotor. Adecuadamente, cada secuencia de nucleótidos heteróloga puede tener un promotor separado asociado con ella y estar bajo el control de ese promotor. Los promotores pueden ser iguales o diferentes.

Así, la célula de Trichoderma reesei puede comprender o ser transfectada o transformada con al menos 2 secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican la enzima lipolítica.

Adecuadamente, la (o cada) secuencia de nucleótidos heteróloga puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de señal, secuencia de nucleótidos que codifica dicho péptido de señal que está conectada operativamente a dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicha enzima lipolítica. Si existen múltiples secuencias de nucleótidos heterólogas y en las que más de una tiene una secuencia de señal asociada con las mismas, entonces las secuencias de señal pueden ser iguales o diferentes.

Adecuadamente, la enzima lipolítica puede comprender un péptido de señal endógeno o exógeno. Cuando el péptido de señal es endógeno -significa que el péptido de señal es el que está conectado naturalmente con la enzima lipolítica cuando se produce naturalmente. Por ejemplo, el péptido de señal puede ser el péptido de señal de Aspergillus tubingensis que está conectado naturalmente con la enzima lipolítica cuando se encuentra en Aspergillus tubingensis.

El término "heterólogo" según se usa en la presente memoria, significa que no está presente naturalmente en la célula de Trichoderma reesei. En otras palabras, es exógeno a la célula de Trichoderma reesei. Por ejemplo, el término "secuencia de nucleótidos heteróloga", según se usa en la presente memoria, significa que la secuencia de nucleótidos no está presente naturalmente en la célula de Trichoderma reesei. En otras palabras, la secuencia de nucleótidos es exógena a la célula de Trichoderma reesei. El término también incluye múltiples copias de la secuencia presente en la naturaleza ya que tales múltiples copias adicionales serían heterólogas.

La secuencia de nucleótidos heteróloga se puede obtener o ser obtenible a partir de un microorganismo, particularmente un hongo.

La secuencia de nucleótidos heteróloga se puede obtener o ser obtenible a partir de Aspergillus, particularmente Aspergillus tubingensis.

En realizaciones preferidas de los aspectos anteriores, dicha célula de Trichoderma reesei tiene al menos dos genes que codifican enzimas no lipolíticas suprimidas.

También se proporciona adicionalmente una enzima lipolítica obtenible mediante los métodos de la presente descripción.

También se proporciona una célula de Trichoderma reesei transformada o transfectada que comprende:

a) al menos una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una proteína de enzima lipolítica que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 7 o 8; y/o

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Tabla 1 -Enzimas lipolíticas con identidad de secuencia con la enzima lipolítica procedente de Aspergillus tubingensis (lipasa 3).

Enzimas lipolíticas procedentes de diferentes hongos

Nº de Registro Identidad de secuencias de aminoácidos %

A. niger CBS 513,88

XP_001397501.1 93

Aspergillus niger

ABG73613.1 93

Aspergillus niger

ABG37906.1 93

Aspergillus nidulans FGSCA4

XP 681315.1 61

Aspergillus clavatus NRRL 1

XP 001276337.1 57

Neosartorya fischeri NRRL 181

XP 001266329.1 60

Aspergillus fumigatus Af293

XP 748138.1 59

Aspergillus oryzae RIB40

XP 001818694.1 56

Aspergillus terreus NIH2624

XP_001218444.1 54

Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255

CAP96359.1 55

Aspergillus niger

ABG73614.1 54

Aspergillus niger

XP 001393532.1 53

Thermomyces lanuginosus

059952.1 50

Penicillium marneffei ATCC 18224

XP_002147144.1 49

Aspergillus oryzae R

XP 001824529.1 44

Phaeosphaeria nodorum SN15

XP 001796872.1 45

Penicillium cyclopium

P61869.1 42

Penicillium camemberti.

1TIA A. 42

La célula hospedadora de Trichoderma reesei puede ser cualquier célula de Trichoderma reesei. También se puede considerar que la célula es una célula de Trichoderma reesei silvestre. La célula de Trichoderma reesei puede ser

5 una de la que genes que codifican una o más celobiohidrolasas (CBHI o CBHII) secretadas se han eliminado o disociado de modo que no se expresen. Adecuadamente, la célula de Trichoderma reesei puede ser una célula no modificada genéticamente o un derivado de la misma, por ejemplo un derivado de la cepa RL-P37. Adecuadamente, la célula de Trichoderma reesei puede ser un derivado de la cepa RL-P37 que se produce usando el método indicado en el Ejemplo 10.

10 La enzima se puede producir en un fermentador que comprende de alrededor de 3 litros a alrededor de 20 litros de medio de cultivo. En otra realización, la presente invención se lleva a cabo como un fermentador a una escala de 1016 litros, preferiblemente 14 litros. En una realización, preferiblemente, la fermentación se lleva a cabo con más de alrededor de 12 litros, preferiblemente más de alrededor de 14 litros.

La célula hospedadora de Trichoderma reesei preferiblemente es adecuada para el uso en la fermentación a gran 15 escala.

En realizaciones preferidas, la producción de la enzima lipolítica se lleva a cabo a escala comercial. A este respecto, la fermentación se lleva a cabo a una escala de más de alrededor de 50.000 litros, preferiblemente a una escala de más de alrededor de 80.000 litros, preferiblemente una fermentación a una escala de más de alrededor de 200.000 litros.

20 En una realización, la proteína total producida mediante el método está muy por encima de alrededor de 20 g/litro.

De la proteína total producida, la mayoría es la enzima lipolítica deseada. En una realización, la proteína secretada total producida comprende al menos 50% de la enzima lipolítica deseada. En una realización, la proteína secretada total producida comprende al menos 60% de la enzima lipolítica deseada. En una realización, la proteína secretada total producida comprende al menos 70% de la enzima lipolítica deseada. En una realización, la proteína secretada

25 total producida comprende al menos 80% de la enzima lipolítica deseada.

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Se ha encontrado sorprendentemente que la enzima lipolítica producida según el método divulgado en la presente memoria es fácil de aislar del medio en el que se ha excretado -es decir el caldo de cultivo (fermentación) -ya que se obtienen altos niveles de expresión.

Así, el método puede implicar una o más de las siguientes etapas para el medio en el que la enzima lipolítica se ha secretado después del cultivo de la célula: diluir el medio (preferiblemente con agua); separar la célula o las células del medio; concentrar el medio (preferiblemente en donde dicho medio está libre de células); granular dicho medio (preferiblemente en donde dicho medio está libre de células).

El método también puede implicar las siguientes etapas para el medio en el que la enzima se ha secretado después del cultivo de la célula: diluir el medio (preferiblemente con agua); separar la célula o las células del medio; concentrar el medio (preferiblemente en donde dicho medio está libre de células); y opcionalmente granular dicho medio (preferiblemente en donde dicho medio está libre de células).

El método también implica opcionalmente someter a las siguientes etapas al medio al que se ha secretado la enzima después del cultivo de la célula: diluir el medio (preferiblemente con agua); separar la célula o las células del medio; concentrar el medio (preferiblemente en donde dicho medio está libre de células); y granular dicho medio (preferiblemente en donde dicho medio está libre de células).

Preferiblemente, el método implica las siguientes etapas para el medio al que se ha secretado la enzima después del cultivo de la célula: diluir el medio con agua; separar la célula o las células del medio; concentrar el medio en donde dicho medio está libre de células; y opcionalmente granular dicho medio en donde dicho medio está libre de células.

En un aspecto preferido, el método implica las siguientes etapas para el medio al que se ha secretado la enzima después del cultivo de la célula: diluir el medio con agua; separar la célula o las células del medio; concentrar el medio en donde dicho medio está libre de células; y granular dicho medio en donde dicho medio está libre de células.

Preferiblemente, la enzima lipolítica precipita de la solución en el caldo de fermentación. Preferiblemente, el precipitado de enzima lipolítica se resolubiliza mediante ajuste del pH. Preferiblemente, el pH se ajusta hasta un pH por encima del pH del caldo de fermentación.

Además de las ventajas mencionadas anteriormente, otra ventaja de la enzima producida mediante el método es que permite la producción a escala comercial de la enzima lipolítica. El método permite que la enzima lipolítica se produzca con un alto rendimiento.

Una ventaja de la enzima lipolítica divulgada en la presente memoria es que se ha encontrado sorprendentemente que es posible ir directamente desde la etapa de transformación y cribado (es decir de la placa de microvaloración) a una fermentación a gran escala (p. ej., una fermentación de al menos 14 litros). Sorprendentemente, esto es posible debido a que la etapa de cribado (particularmente los resultados de la placa de microvaloración) es altamente predictiva de un buen comportamiento en la fermentación a gran escala. Esto contrasta con métodos convencionales en los que a menudo es necesario cultivar la cepa en matraces antes de mover a una fermentación a mayor escala). Esto tiene ventajas significativas para acortar el tiempo de producción y/o simplificar el procedimiento global y/o reducir costes.

Una ventaja adicional es que los métodos descritos en la presente memoria proporcionan una expresión potenciada/incrementada y/o un rendimiento mejorado de la enzima lipolítica en comparación con métodos convencionales para expresar esta enzima lipolítica. Por ejemplo, se proporciona una expresión potenciada/incrementada y/o un rendimiento mejorado de la enzima lipolítica en comparación con la producción de la enzima lipolítica en otro organismo hospedador (es decir un organismo hospedador distinto de T. reesei). En particular, hay una expresión incrementada y/o un rendimiento mejorado de la enzima lipolítica (es decir producida en la célula de Trichoderma reesei) en comparación con la expresión de la misma enzima lipolítica en una célula de Aspergillus tubingensis (por ejemplo según se muestra en el documento WO98/45453).

Una ventaja adicional es que la enzima lipolítica producida según los métodos divulgados en la presente memoria es fácil de producir y aislar y/o purificar y/o concentrar.

Una ventaja adicional es que la enzima lipolítica producida según el método divulgado es fácil de resolubilizar.

Una ventaja adicional es que la enzima lipolítica producida según el método divulgado se puede usar como un granulado o como una solución.

Enzima lipolítica

El término "enzima lipolítica", según se usa en la presente memoria, significa una enzima con actividad hidrolizante de triacilglicerol (clasificada como E.C. 3.1.1.3).

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Adecuadamente, la enzima lipolítica para el uso en la presente invención puede exhibir una o más de las siguientes actividades adicionales: actividad de glicolipasa (E.C. 3.1.1.26), actividad de fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4), actividad de fosfolipasa A1 (E.C. 3.1.1.32) o actividad de fosfolipasa B (E.C. 3.1.1.5). El término "actividad de glicolipasa", según se usa en la presente memoria, abarca "actividad de galactolipasa".

Aislada

En un aspecto, preferiblemente, la enzima lipolítica para el uso en la presente invención es una forma aislada. El término "aislada" significa que la enzima lipolítica está al menos sustancialmente libre de al menos otro componente con el que la enzima lipolítica está asociada naturalmente en la naturaleza y según se encuentra en la naturaleza. El término "aislada" puede significar que la enzima lipolítica está al menos sustancialmente libre de al menos otro componente en el medio de cultivo en el que se produce. La enzima lipolítica de la presente descripción se puede proporcionar en una forma que está sustancialmente libre de uno o más contaminantes con los que la sustancia podría estar asociada de otro modo o con los que la enzima se puede producir.

Así, por ejemplo, puede estar sustancialmente libre de la célula o las células o uno o más polipéptidos y/o moléculas de ácido nucleico potencialmente contaminantes. La enzima lipolítica se puede aislar al separar la célula o las células del caldo durante o después de la fermentación de modo que la enzima lipolítica permanezca en el caldo. La enzima lipolítica se puede aislar al someter el caldo de fermentación a separación de células mediante filtración a vacío.

Purificada

En un aspecto, preferiblemente, la enzima lipolítica para el uso en la presente invención es una forma purificada. El término "purificada" significa que el componente dado está presente a un nivel alto. El componente es deseablemente el componente predominante presente en una composición. Preferiblemente, está presente a un nivel de al menos alrededor de 60%, o al menos alrededor de 65%, o al menos alrededor de 70%, o al menos alrededor de 75%, o al menos alrededor de 80%, determinándose dicho nivel sobre una base peso seco/peso seco con respecto a la composición total que se considera. Para algunas realizaciones, la cantidad es al menos alrededor de 85%, determinándose dicho nivel sobre una base peso seco/peso seco con respecto a la composición total que se considera.

Concentrado

En un aspecto, preferiblemente, la enzima lipolítica para el uso en la presente invención se usa como un concentrado. El concentrado puede ser una forma concentrada del medio al que se ha excretado la enzima. Preferiblemente, el concentrado puede ser una forma concentrada del medio al que se ha secretado la enzima y en el que la célula o las células se han retirado.

Materiales y métodos

1. Ensayo de lipasa a pH 5,5

Según se usa en la presente memoria, 1 LIPU (unidad de lipasa) se define como la cantidad de enzima que libera 1 µmol de H+ por minuto bajo las condiciones descritas posteriormente en la presente memoria.

Se prepara sustrato de tributirina al 5% (v/v) al mezclar 15,00 ml de tributirina, 50,00 ml de agente emulsionante y 235 ml de agua destilada durante 20 s en un homogeneizador. El pH del sustrato se ajusta hasta aprox. 5,4 con NaOH 0,5 M.

El agente emulsionante se prepara al mezclar 17,9 g de NaCl, 0,41 g de KH2PO4, 400 ml de agua destilada y 450 ml de glicerol en un vaso de precipitados de 2.000 ml. Bajo agitación vigorosa, añádanse 6,0 g de goma arábiga y continúese la agitación hasta que la goma arábiga se disuelva completamente. Transfiérase la solución a un matraz volumétrico de 1.000 ml y llénese hasta la marca con agua destilada.

Para muestras secas: en un matraz volumétrico, disuélvase una cantidad de enzima calculada para dar una solución final de aproximadamente 3,5 LIPU/ml en la mitad de la dilución final y sométase a agitación magnética durante 20 min.

Después de remover, ajústese hasta la dilución final con agua destilada. Cualquier dilución adicional se debe hacer con agua destilada. Las muestras en solución se diluyen directamente en agua destilada

25,00 ml de sustrato se ajustan hasta 30,0°C.

Ajústese el pH del sustrato hasta 5,50 con NaOH/HCl

Mientras se remueve, añádanse 2,00 ml de muestra, e iníciese inmediatamente el valorador pH-estático.

Deténgase la valoración después de 6 minutos.

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Calcúlese la pendiente de la curva de valoración. La pendiente de la curva de valoración se calcula a partir de datos entre 3 y 6 min. La pendiente debe estar en el intervalo 0,1-0,2 ml/min.

La actividad (LIPU/g) de la enzima se calcula usando lo siguiente:

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ml/min.:

Pendiente de la curva de valoración

N:

Normalidad de NaOH

F:

Dilución de la muestra

A:

Muestra pesada en gramos

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ml de muestra

2. Actividad de lipasa a pH 3,5

1 LPLU (unidad de lipasa a pH bajo) se define como la cantidad de enzima que produce 1 microequivalente de ácido graso libre por min. bajo las condiciones descritas posteriormente en la presente memoria.

Sustrato de trioctanoato: 0,15% de trioctanoato de glicerol, 13% de Triton X-100, 0,3% de NaCl y glicina-HCl 120 mM, pH 3,5. Los sustratos se prepararon al mezclar todos los componentes seguido por remoción durante una hora.

La solución de muestra de enzima se diluye en HCl de glicina 50 mM, pH 3,5

El ensayo se lleva a cabo usando un robot de análisis Konelab (Thermo, Vantaa, Finlandia). 50 µl de sustrato de trioctanoato se equilibran a 30°C durante 3 min. antes de mezclar con 10 µl de solución de muestra de enzima e incubación durante 6 min. a 30°C. El ácido graso libre en la mezcla de reacción se midió usando el estuche NEFAHR(2) (WAKO Chemicals GmbH). Se añaden a la mezcla de reacción 110 µl de reactivo NEFA R1 y se incuban durante 3 min. a 30 °C antes de que se añadan 55 µl de reactivo NEFA R2. La incubación se continúa durante otros 4,5 min. a 30°C antes de que se mida la OD520 nm. El contenido de ácido libre se calcula a partir de una curva estándar preparada a partir de NEFA Standard (WAKO Chemicals GmbH).

1 LPLU corresponde a 0,24 LIPU para lipasa de Aspergillus tubingensis (Fig. 5, SEQ ID Nº 7).

2. Ensayo de fitasa. Según se usa en la presente memoria 1 FTU (unidad de fitasa) se define como la cantidad de enzima requerida para

liberar 1 µmol de ortofosfato inorgánico a partir de un sustrato en un minuto bajo las condiciones de reacción definidas en la presente memoria Principio: La fitasa se incuba con fitato sódico, lo que da como resultado la liberación de fosfato inorgánico. El fosfato

inorgánico crea complejos coloreados con el reactivo de molibdato-vanadato, que de ese modo se vuelve amarillo. El color amarillo del complejo se mide en el espectrofotómetro a 415 nm. La cuantificación de la actividad se realiza mediante un método absoluto usando una curva estándar de fosfato. Reactivos:

1.1 Tampón de acetato (pH 5,5) 0,25 M 1.000 ml Disuélvanse: 30,02 g de trihidrato de acetato sódico (18,10 g de anhidrato de acetato sódico), 0,147 g de dihidrato de cloruro cálcico, 1,76 g de ácido acético al 100% (=1,677 ml, densidad = 1,0498 g/ml) en ap. 900 ml de agua, Ajústese el pH hasta 5,5 con ácido acético 4 M (22,9 ml de ácido acético concentrado en 100,0 ml de agua

desionizada) y transfiérase la solución a un matraz volumétrico de 1.000 ml. Añádase 1 ml de Tween 20 al 10% y ajústese la solución hasta 1.000 ml mediante la adición de agua desionizada.

5

10

15

20

25

30

1.2 Dihidrogenofosfato potásico 18 mM 1.000 ml Solución madre usada para la curva estándar Séquese KH2PO4 a 60°C durante la noche en un armario calentador. Pésense 2,45 g de KH2PO4 seco y dilúyanse en tampón de acetato (1.1). Ajústese hasta 1.000,0 ml.

1.3 Solución de fitato (sustrato) 7,5 mM 250 ml Disuélvanse: 2,10 g (±0,05 g) de decahidrato de fitato sódico (ácido fítico) en 200 ml de tampón de acetato. Termostatícese la

solución hasta 37°C en un baño de agua.

A 37°C, el pH se ajusta hasta pH 5,5 mediante la adición de ácido acético 4 M (24 g = 22,9 ml de ácido acético concentrado en 100,0 ml de agua desionizada). Ajústese hasta 250,0 ml mediante la adición de tampón de acetato. Puede ser necesario un factor de corrección para el sustrato cuando se cambia por otro lote de ácido fítico. El factor

de corrección para ácido fítico Sigma P0109, partida 057K0049 se define para 1,00

1.4 Solución de ácido nítrico 24,5 % 200 ml (Para solución de vanadato amónico) Se añaden 75 ml de ácido nítrico (65%) a 100 ml de agua bajo agitación continua. La solución se transfiere a un matraz volumétrico de 200 ml y se ajusta con agua desionizada.

1.5 Solución de amonio 25% 50 ml (Para solución de heptamolibdato amónico) 40 ml de una solución de amonio al 32% se ajustan hasta 50 ml con agua.

1.6 Solución de heptamolibdato amónico 10% 250 ml (Para el reactivo de color/parada) Disuélvanse: 25 g de tetrahidrato de heptamolibdato amónico en 225 ml de agua. La solución necesita calentarse para disolver el

heptamolibdato amónico antes de añadir la solución de amonio. Añádanse 2,5 ml de solución de amonio (25%)

(véase 1.5), córtese el calor y déjese en el agitador hasta que se disuelva totalmente. Cuando se enfría, la solución se transfiere a un matraz volumétrico de 250 ml, se ajusta con agua desionizada y se mezcla.

1.7 Solución de vanadato amónico 0,24% 250 ml (Para el reactivo de color/parada) Disuélvanse 0,5875 g de vanadato amónico en 100 ml de agua precalentada hasta 60°C. Añádanse lentamente 5 ml

de solución de ácido nítrico al 24,5% bajo agitación continua. Cuando la solución se enfría, se transfiere a un matraz volumétrico de 250 ml, se ajusta con agua desionizada y se mezcla.

1.8 Reactivo de color/parada 200 ml

Se debe preparar inmediatamente antes del uso.

Descárguense 50 ml de solución de heptamolibdato amónico (10%) en un matraz volumétrico de 200 ml seguido por 50 ml de solución de vanadato amónico (0,24%). Descárguense 33 ml de ácido nítrico al 65% bajo agitación continua. Ajústese hasta 200,0 ml mediante la adición de agua desionizada y mézclese.

Condiciones de reacción

pH = 5,5 Temperatura de incubación = 37°C ± 0,1°C Tiempo de incubación = 60 minutos

Preparación de una curva estándar de fosfato (método absoluto)

Se prepara una curva estándar usando el tampón de KH2PO4 (1.2). El patrón se diluye con tampón de acetato. Cdilución = 0,0 mM, 0,5 mM, 1,0 mM, 1,5 mM, 2,0 mM, 2,5 mM, 3,0 mM, 4,0 mM

Úsese la siguiente ecuación:

Csolución madre * Vsolución madre = Cdilución * Vdilución

Vsolución madre = (Cdilución * Vdilución)/Csolución madre

Donde C = concentración y V = volumen

Concentración de fosfato final en mM

volumen de KH2PO4 (18 mM) en un matraz volumétrico de 50 ml Volumen del tampón de acetato

0

0,0 ml 50,0 ml

0,5

1,4 ml 48,6 ml

1,0

2,8 ml 47,2 ml

1,5

4,2 ml 45,8 ml

2,0

5,6 ml 44,4 ml

2,5

6,9 ml 43,1 ml

3,0

8,3 ml 41,7 ml

4,0

11,1 ml 38,9 ml

1,00 ml de muestra para la curva estándar se mezcla con 2,00 ml de reactivo de color/parada seguido por 2,00 ml de

10 solución de fitato. Las muestras se incuban a temperatura ambiente durante 5-10 minutos, y la OD se midió (como se hace con las muestras después de la incubación).

Preparación de muestras:

1A: Productos líquidos (apr. 5.500 FTU/g): 1 g de muestra se pesa en un matraz volumétrico de 100 ml, el peso se anota y el matraz volumétrico se rellena con tampón de acetato.

15 1B: Productos secos (fitasa formulada solamente sobre portador de trigo / almidón): 1 g de producto se pesa en un vaso de precipitados de vidrio. Se añaden 100 ml de tampón de acetato usando un vaso dispensador o medidor. La muestra se remueve en un agitador magnético durante 20 minutos. El extracto se filtra a través de un filtro de vidrio.

1C: Productos secos (gránulos revestidos con una sobrecapa hidrófoba): Productos secos: 1 g de producto se

20 pesa en un vaso de precipitados de vidrio. Se añaden 100 ml de tampón de acetato usando un vaso dispensador o medidor. La muestra se remueve en un agitador magnético durante 20 minutos. El extracto se deja sedimentar, el producto revestido no se debe filtrar a través de un filtro de vidrio.

2: Prepárese la dilución adicional de la muestra. El intervalo de OD preferido es 0,4 -1,6. Si no se sabe la

concentración de la muestra, niveles de diluciones típicos para llevar la actividad dentro del intervalo para el 25 ensayo se muestran posteriormente.

La actividad en las muestras debe ser aproximadamente 0,0300 U/ml.

Las diluciones se deben preparar inmediatamente antes de la determinación.

Determinación de la actividad:

Todas las muestras se analizan al mismo tiempo -controles, blancos y muestras. La prueba de ensayo debe ser en 30 un flujo continuo.

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Ingrediente

Preiniciador (0-14 d: g/kg) Control negativo (14-21 d: g/kg)

Almidón de maíz/trigo

2,0 2,0

Aceite de soja

40,0 40,0

HCl de lisina

3,8 3,8

DL-metionina

2,7 2,7

L-treonina

1,0 1,0

Marcador inerte

3,0 3,0

Sal

3,6 3,6

Piedra caliza

13,8 3,0

Fosfato dicálcico

16,4 13,5

Premezcla de oligominerales-vitaminas

3,5 3,5

Space (enzima)

0,0 14,9

Análisis calculado

Energía metabolizable, kcal/kg

3,140 3,100

Proteína cruda, g/kg

240 240

Lisina digerible, g/kg

12,6 12,6

Metionina digerible, g/kg

6,4 6,4

Metionina + cisteína digeribles, g/kg

9,0 9,0

Treonina digerible, g/kg

7,9 7,9

Calcio, g/kg

10,5 5,7

Fósforo disponible, g/kg

4,3 3,8

El diseño experimental consistía en 6 tratamientos dietéticos, cada uno asignado aleatoriamente a 6 jaulas reproducidas exactamente (8 pájaros por jaula) como sigue:

1.

Control negativo (CN)

2.

CN + lipasa (1.000 LIP U/kg)

5 3. CN + lipasa (3.000 LIP U/kg)

4.

CN + fitasa (500 FTU / kg)

5.

CN + fitasa (500 FTU / kg) + lipasa (1.000 LIP U/kg)

6.

CN + fitasa (500 FTU / kg)+ lipasa (3.000 LIP U/kg)

Pollos de engorde con días de edad se asignaron aleatoriamente a incubadoras calentadas eléctricamente por pilas

10 en una habitación de ambiente controlado. Los pollos recibían iluminación fluorescente constante y se les dejó acceso libre a las dietas y el agua. Las aves recibieron una dieta preiniciadora hasta el día 14. A esta edad, a las aves se les asignaron tratamientos dietéticos basándose en el peso corporal y se transfirieron a jaulas de cría. Las aves se alimentaron con las dietas experimentales desde el día 14 hasta el día 21. La temperatura se mantuvo a 31°C durante la primera semana y a continuación se redujeron gradualmente hasta 22°C para la tercera semana.

15 La toma de pienso y la producción de excrementos total de cada jaula se midieron desde el día 17 al 20 después de la eclosión. Los excrementos de cada jaula se reunieron, se mezclaron en un mezclador y se submuestrearon. Cada submuestra se liofilizó, se trituró para pasar a través de un tamiz de 0,5 mm y se almacenó en recipientes de plástico herméticos a -4°C esperando el análisis. Las dietas y las muestras de excrementos se analizaron con respecto al contenido de materia seca (DM, por sus siglas en inglés), calcio (Ca) y fósforo (P).

20 El d 21, dos aves de cada jaula reproducida exactamente se seleccionaron y se sacrificaron mediante inyección intracárdica de pentabarbitona sódica. El intestino delgado se expuso inmediatamente y el contenido de la mitad inferior del íleon se recogió al barrer suavemente con agua destilada en bolsas de plástico. El íleon se definió como la porción del intestino delgado que se extiende desde el divertículo vitelino hasta un punto 40 mm proximal a la

Claims (1)

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