ES2582947T3 - Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids - Google Patents

Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids Download PDF

Info

Publication number
ES2582947T3
ES2582947T3 ES10182890.3T ES10182890T ES2582947T3 ES 2582947 T3 ES2582947 T3 ES 2582947T3 ES 10182890 T ES10182890 T ES 10182890T ES 2582947 T3 ES2582947 T3 ES 2582947T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
chimeric protein
immunoglobulin
biologically active
factor
epo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10182890.3T
Other languages
Spanish (es)
Inventor
Robert T. Peters
Adam R Mezo
Daniel S Rivera
Alan J Bitonti
James M Stattel
Susan C Low
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bioverativ Therapeutics Inc
Original Assignee
Biogen Hemophilia Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33458764&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2582947(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Hemophilia Inc filed Critical Biogen Hemophilia Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2582947T3 publication Critical patent/ES2582947T3/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Active legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

Una proteína quimérica para uso en un método de tratamiento con una molécula biológicamente activa y dos regiones constantes de inmunoglobulina o partes de las mismas, en donde la proteína quimérica comprende una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena de polipéptidos, en donde la primera cadena de polipéptidos comprende la molécula biológicamente activa y una región constante de inmunoglobulina o parte de la misma, que es un componente de unión a receptor neonatal (FcRn), y en donde la molécula biológicametne activa es una proteína seleccionada del grupo que consiste en una citocina, una hormona y un factor de coagulación; y en donde la segunda cadena de polipéptidos consiste en una región constante de inmunoglobulina, o una parte de la misma, que es un componente de unión a FcRn y opcionalmente una molécula con un peso molecular no mayor que 2 kD,A chimeric protein for use in a method of treatment with a biologically active molecule and two immunoglobulin constant regions or parts thereof, wherein the chimeric protein comprises a first polypeptide chain and a second polypeptide chain, wherein the first chain Polypeptide comprises the biologically active molecule and a constant region of immunoglobulin or part thereof, which is a neonatal receptor binding component (FcRn), and wherein the biologically active molecule is a protein selected from the group consisting of a cytokine. , a hormone and a clotting factor; and wherein the second polypeptide chain consists of a constant region of immunoglobulin, or a part thereof, which is an FcRn binding component and optionally a molecule with a molecular weight not greater than 2 kD,

Description

imagen1image 1

imagen2image2

imagen3image3

imagen4image4

imagen5image5

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

La Figura 3d es la secuencia de ácidos nucleicos de la proteína quimérica ligante  de IFN-Fc. En la secuencia se incluye el péptido señal (subrayado) que es escindido por la célula después de la traducción produciendo ligante  de IFN-Fc maduro. Figure 3d is the nucleic acid sequence of the  chimeric protein binding of IFN-Fc. The sequence includes the signal peptide (underlined) that is cleaved by the cell after translation producing  binding of mature IFN-Fc.

La Figura 3e es la secuencia de ácidos nucleicos de la proteína quimérica Flag-Fc. En la secuencia se incluye el péptido señal (subrayado), que es escindido por la célula después de la traducción produciendo Flag-Fc madura. Figure 3e is the nucleic acid sequence of the Flag-Fc chimeric protein. The signal peptide (underlined) is included in the sequence, which is cleaved by the cell after translation producing mature Flag-Fc.

La Figura 3f es la secuencia de ácidos nucleicos de la proteína quimérica Epo-CCA-Fc. En la secuencia se incluye el péptido señal (subrayado), que es escindido por la célula después de la traducción produciendo Epo-CCA-Fc madura. También se muestra en negrita el dominio de superenrollamiento ácido. Figure 3f is the nucleic acid sequence of the chimeric protein Epo-CCA-Fc. The signal peptide (underlined) is included in the sequence, which is cleaved by the cell after translation producing mature Epo-CCA-Fc. The acid supercoil domain is also shown in bold.

La Figura 3g es la secuencia de ácidos nucleicos de la proteína quimérica CCB-Fc. En la secuencia se incluye el péptido señal (subrayado), que es escindido por la célula después de la traducción produciendo CCB-Fc madura. También se muestra en negrita el dominio de superenrollamiento básico. Figure 3g is the nucleic acid sequence of the chimeric protein CCB-Fc. The signal peptide (underlined) is included in the sequence, which is cleaved by the cell after translation producing mature CCB-Fc. The basic supercoil domain is also shown in bold.

La Figura 3h es la secuencia de ácidos nucleicos de la proteína quimérica Cys-Fc. En la secuencia se incluye el péptido señal (subrayado), que es escindido por la célula después de la traducción produciendo Cys-Fc madura. Figure 3h is the nucleic acid sequence of the Cys-Fc chimeric protein. The signal peptide (underlined) is included in the sequence, which is cleaved by the cell after translation producing mature Cys-Fc.

La Figura 3i es la secuencia de ácidos nucleicos de la proteína quimérica IFN-GS15-Fc. En la secuencia se incluye el péptido señal (subrayado) que es escindido por la célula después de la traducción produciendo IFN-GS15-Fc madura. Figure 3i is the nucleic acid sequence of the chimeric protein IFN-GS15-Fc. The sequence includes the signal peptide (underlined) that is cleaved by the cell after translation producing mature IFN-GS15-Fc.

La Figura 3j es la secuencia de ácidos nucleicos de la proteína quimérica Epo-Fc. En la secuencia se incluye el péptido señal (subrayado), que es escindido por la célula después de la traducción produciendo Epo-Fc madura. También se muestra en negrita una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el ligante de 8 aminoácidos. Figure 3j is the nucleic acid sequence of the chimeric protein Epo-Fc. The signal peptide (underlined) is included in the sequence, which is cleaved by the cell after translation producing mature Epo-Fc. A nucleic acid sequence encoding the 8 amino acid binder is also shown in bold.

La Figura 4 demuestra rutas para formar híbridos de monómero-dímero mediante ligación nativa. Figure 4 demonstrates routes to form monomer-dimer hybrids by native ligation.

La Figura 5a muestra la secuencia de aminoácidos de Fc-MESNA (SEQ ID Nº: 4). Figure 5a shows the amino acid sequence of Fc-MESNA (SEQ ID NO: 4).

La Figura 5b muestra la secuencia de ADN de Fc-MESNA (SEQ IDSEQ ID Nº: 5). Figure 5b shows the DNA sequence of Fc-MESNA (SEQ IDSEQ ID NO: 5).

La Figura 6 compara actividad antiviral de homo-dímero de IFN (es decir, que comprende 2 moléculas de IFN) con un híbrido de monómero-dímero de IFN (es decir, que comprende 1 molécula de IFN). Figure 6 compares IFN homo-dimer antiviral activity (ie, comprising 2 IFN molecules) with an IFN monomer dimer hybrid (ie, comprising 1 IFN molecule).

La Figura 7 es una comparación de actividad de coagulación de un híbrido quimérico de monómero-dímero factor VIIa-Fc (molécula de un factor VII) y un homodímero quimérico factor VIIa-Fc (moléculas de dos factores VII). Figure 7 is a comparison of coagulation activity of a chimeric hybrid of monomer-dimer factor VIIa-Fc (a factor VII molecule) and a chimeric homodimer factor VIIa-Fc (two factor VII molecules).

La Figura 8 compara la dosificación oral en ratas neonatas de un híbrido quimérico de monómero-dímero factor VIIa-Fc (molécula de un factor VII) y un homodímero quimérico factor VIIa-Fc (moléculas de dos factores VII). Figure 8 compares the oral dosing in neonatal rats of a chimeric hybrid of monomer-dimer factor VIIa-Fc (a factor VII molecule) and a chimeric homodimer factor VIIa-Fc (two factor VII molecules).

La Figura 9 compara la dosificación oral en ratas neonatas de un híbrido quimérico de monómero-dímero factor IX-Fc (molécula de un factor IX) con un homodímero quimérico. Figure 9 compares the oral dosage in neonatal rats of a chimeric hybrid of monomer-dimer factor IX-Fc (molecule of a factor IX) with a chimeric homodimer.

La Figura 10 es un estudio de transcurso del tiempo que compara un híbrido quimérico de monómero-dímero factor IX-Fc (molécula de un factor IX) administrado por vía oral a ratas neonatas con un homodímero quimérico administrado por vía oral. Figure 10 is a time course study comparing a chimeric hybrid of monomer-dimer factor IX-Fc (a factor IX molecule) administered orally to newborn rats with a chimeric homodimer administered orally.

La Figura 11 demuestra la farmacocinética del dímero Epo-Fc en comparación con el híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc en monos cinomolgos después de una única dosis pulmonar. Figure 11 demonstrates the pharmacokinetics of the Epo-Fc dimer compared to the Epo-Fc monomer dimer hybrid in cynomolgus monkeys after a single pulmonary dose.

La Figura 12 compara la concentración en suero en monos de híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc subcutáneamente administrado con Aranesp® subcutáneamente administrado (darbepoyetina alfa). Figure 12 compares the serum concentration in monkeys of Epo-Fc monomer dimer hybrid subcutaneously administered with subcutaneously administered Aranesp® (darbepoietin alfa).

La Figura 13 compara la concentración en suero en monos de híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc intravenosamente administrado con Aranesp® intravenosamente administrado (darbepoyetina alfa) y Epogen® (epoyetina alfa). Figure 13 compares the serum concentration in intravenously administered Epo-Fc monomer dimer hybrid monkeys with intravenously administered Aranesp® (darbepoietin alfa) and Epogen® (epoetin alfa).

La Figura 14 muestra una traza de una columna Mimetic Red 2™ (ProMetic LifeSciences, Inc., Wayne, NJ) y una SDS-PAGE de fracciones de la columna que contienen híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc, dímero de Epo-Fc y Fc. El híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc se encuentra en las fracciones 11, 12, 13 y 14. El dímero de Epo-Fc se encuentra en la fracción 18. Fc se encuentra en las fracciones 1/2. Figure 14 shows a trace of a Mimetic Red 2 ™ column (ProMetic LifeSciences, Inc., Wayne, NJ) and an SDS-PAGE of column fractions containing Epo-Fc monomer-dimer hybrid, Epo- dimer Fc and Fc. The monomer-dimer hybrid of Epo-Fc is found in fractions 11, 12, 13 and 14. The Epo-Fc dimer is found in fraction 18. Fc is found in fractions 1/2.

La Figura 15 muestra la farmacocinética de IFN-Fc con un ligante de 8 aminoácido en monos cinomolgos después de una única dosis pulmonar. Figure 15 shows the pharmacokinetics of IFN-Fc with an 8 amino acid binder in cynomolgus monkeys after a single pulmonary dose.

La Figura 16 muestra la estimulación de neopterina en respuesta al homodímero de IFN-Fc y el híbrido de monómero-dímero de IFN-Fc N297A en monos cinomolgos. Figure 16 shows the stimulation of neopterin in response to the IFN-Fc homodimer and the IFN-Fc N297A monomer dimer hybrid in cynomolgus monkeys.

imagen6image6

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

cascada de reacciones bioquímicas que culmina en la formación de un coágulo de fibrina y/o reduce la gravedad, duración o frecuencia de hemorragia o episodio hemorrágico. cascade of biochemical reactions that culminates in the formation of a fibrin clot and / or reduces the severity, duration or frequency of bleeding or bleeding episode.

Dímero, como se usa en la presente memoria, se refiere a una proteína quimérica que comprende una primera y segunda cadena de polipéptidos, en la que la primera y segunda cadenas comprenden ambas una molécula biológicamente activa, y al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina. Un homodímero se refiere a un dímero en el que ambas moléculas biológicamente activas son las mismas. Dimer, as used herein, refers to a chimeric protein comprising a first and second chain of polypeptides, wherein the first and second chains both comprise a biologically active molecule, and at least a part of a constant region. of immunoglobulin. A homodimer refers to a dimer in which both biologically active molecules are the same.

Híbrido de monómero-dímero diméricamente ligado se refiere a una proteína quimérica que comprende al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, un fragmento Fc de una inmunoglobulina, una molécula biológicamente activa y un ligante que liga las dos juntas de forma que una molécula biológicamente activa esté unida a 2 cadenas de polipéptidos, comprendiendo cada una una parte de una región constante de inmunoglobulina. La Figura 4 muestra un ejemplo de un híbrido de monómero-dímero diméricamente ligado. Dimerically linked monomer-dimer hybrid refers to a chimeric protein comprising at least a part of a constant region of immunoglobulin, for example, an Fc fragment of an immunoglobulin, a biologically active molecule and a binder that binds the two joints together. that a biologically active molecule is bound to 2 chains of polypeptides, each comprising a part of a constant region of immunoglobulin. Figure 4 shows an example of a dimerically linked monomer dimer hybrid.

Construcción de ADN, como se usa en la presente memoria, significa una molécula de ADN, o un clon de una molécula tal, tanto mono como bicatenaria, que ha sido modificada mediante intervención humana para contener segmentos de ADN combinados de un modo que, en conjunto, no existiría de otro modo en la naturaleza. Las construcciones de ADN contienen la información necesaria para dirigir la expresión de polipéptidos de interés. Las construcciones de ADN pueden incluir promotores, potenciadores y terminadores de la transcripción. Las construcciones de ADN que contienen la información necesaria para dirigir la secreción de un polipéptido también contendrán al menos una secuencia señal secretora. DNA construction, as used herein, means a DNA molecule, or a clone of such a molecule, both mono and double stranded, that has been modified by human intervention to contain combined segments of DNA in a way that, in together, it would not exist otherwise in nature. DNA constructs contain the information necessary to direct the expression of polypeptides of interest. DNA constructs may include promoters, enhancers and transcription terminators. DNA constructs that contain the information necessary to direct the secretion of a polypeptide will also contain at least one secretory signal sequence.

Dominio, como se usa en la presente memoria, significa una región de un polipéptido (incluyendo proteínas como se define ese término) que tienen alguna característica o función física distintiva que incluye, por ejemplo, una estructura independientemente plegada que comprende una sección de una cadena de polipéptidos. Un dominio puede contener la secuencia de la característica física distintiva del polipéptido o puede contener un fragmento de la característica física que retiene sus características de unión (es decir, puede unirse a un segundo dominio). Un dominio puede asociarse a otro dominio. En otras palabras, un primer dominio puede unirse naturalmente a un segundo dominio. Domain, as used herein, means a region of a polypeptide (including proteins as that term is defined) that have some distinctive physical feature or function that includes, for example, an independently folded structure comprising a section of a chain. of polypeptides. A domain can contain the sequence of the distinctive physical characteristic of the polypeptide or it can contain a fragment of the physical characteristic that retains its binding characteristics (ie, it can bind to a second domain). A domain can be associated with another domain. In other words, a first domain can naturally join a second domain.

Un fragmento, como se usa en la presente memoria, se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 2 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, o de al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos o cualquier deleción o truncación de una proteína, péptido o polipéptido. A fragment, as used herein, refers to a peptide or polypeptide comprising an amino acid sequence of at least 2 contiguous amino acid residues, of at least 5 contiguous amino acid residues, of at least 10 contiguous amino acid residues , of at least 15 contiguous amino acid residues, of at least 20 contiguous amino acid residues, of at least 25 contiguous amino acid residues, of at least 40 contiguous amino acid residues, of at least 50 contiguous amino acid residues, of at least 100 contiguous amino acid residues, or at least 200 contiguous amino acid residues or any deletion or truncation of a protein, peptide or polypeptide.

La hemostasia, como se usa en la presente memoria, significa la interrupción del sangrado o hemorragia; o la interrupción de la circulación sanguínea a través de un vaso sanguíneo o parte del cuerpo. Hemostasis, as used herein, means the interruption of bleeding or hemorrhage; or the interruption of blood circulation through a blood vessel or body part.

Trastorno hemostático, como se usa en la presente memoria, significa una afección genéticamente heredada o adquirida caracterizada por una tendencia a hemorragia, tanto espontáneamente o como resultado de traumatismo, debido a un capacidad alterada o incapacidad para formar un coágulo de fibrina. Hemostatic disorder, as used herein, means a genetically inherited or acquired condition characterized by a tendency to hemorrhage, either spontaneously or as a result of trauma, due to an impaired ability or inability to form a fibrin clot.

Ligada, como se usa en la presente memoria, se refiere a una primera secuencia de ácidos nucleicos covalentemente unida a una segunda secuencia de ácidos nucleicos. La primera secuencia de ácidos nucleicos puede estar directamente unida o yuxtapuesta a la segunda secuencia de ácidos nucleicos o alternativamente una secuencia interviniente puede unir covalentemente la primera secuencia con la segunda secuencia. Ligada como se usa en la presente memoria también puede referirse a una primera secuencia de aminoácidos covalentemente, o no covalentemente, unida a una segunda secuencia de aminoácidos. La primera secuencia de aminoácidos puede unirse directamente o yuxtaponerse a la segunda secuencia de aminoácidos o alternativamente una secuencia interviniente puede unir covalentemente la primera secuencia de aminoácidos con la segunda secuencia de aminoácidos. Bound, as used herein, refers to a first nucleic acid sequence covalently linked to a second nucleic acid sequence. The first nucleic acid sequence may be directly linked or juxtaposed to the second nucleic acid sequence or alternatively an intervening sequence may covalently link the first sequence with the second sequence. Linked as used herein may also refer to a first amino acid sequence covalently, or not covalently, linked to a second amino acid sequence. The first amino acid sequence can be directly linked or juxtaposed to the second amino acid sequence or alternatively an intervening sequence can covalently link the first amino acid sequence with the second amino acid sequence.

Operativamente ligada, como se usa en la presente memoria, significa una primera secuencia de ácidos nucleicos ligada a una segunda secuencia de ácidos nucleicos de forma que ambas secuencias puedan expresarse como una proteína o péptido biológicamente activo. Operatively linked, as used herein, means a first nucleic acid sequence linked to a second nucleic acid sequence so that both sequences can be expressed as a biologically active protein or peptide.

Polipéptido, como se usa en la presente memoria, se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto; así, péptidos, oligopéptidos y proteínas están incluidos dentro de la definición de polipéptido. Este término no excluye modificaciones post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glucosilación, acetilación, fosforilación, PEGilación, adición de un resto de lípido, o la adición de cualquier molécula orgánica o inorgánica. Incluidos dentro de la definición están, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales) y polipéptidos con enlaces sustituidos, además de otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto que se producen naturalmente como que no se producen naturalmente. Polypeptide, as used herein, refers to an amino acid polymer and does not refer to a specific product length; thus, peptides, oligopeptides and proteins are included within the definition of polypeptide. This term does not exclude post-expression modifications of the polypeptide, for example, glycosylation, acetylation, phosphorylation, PEGylation, addition of a lipid moiety, or the addition of any organic or inorganic molecule. Included within the definition are, for example, polypeptides containing one or more analogs of an amino acid (including, for example, unnatural amino acids) and polypeptides with substituted bonds, in addition to other modifications known in the art, both naturally occurring. as they do not occur naturally.

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

Alta rigurosidad, como se usa en la presente memoria, incluye condiciones fácilmente determinadas por el experto basadas en, por ejemplo, la longitud del ADN. Generalmente, tales condiciones se definen en Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. vol. 1, pág. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), e incluyen uso de una disolución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridación de 50% de formamida, 6X SSC a 42 ºC (u otra disolución de hibridación similar, tal como disolución de Stark, en 50% de formamida a 42 ºC, y con lavado a aproximadamente 68 ºC, 0,2X SSC, 0,1% de SDS). El experto reconocerá que la temperatura y la concentración de sales de la disolución de lavado pueden ajustarse según sea necesario según factores tales como la longitud de la sonda. High stringency, as used herein, includes conditions easily determined by the expert based on, for example, the length of the DNA. Generally, such conditions are defined in Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. vol. 1, p. 1,101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), and include the use of a prewash solution for 5X SSC nitrocellulose filters, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), conditions of 50% formamide hybridization, 6X SSC at 42 ° C (or other similar hybridization solution, such as Stark's solution, in 50% formamide at 42 ° C, and washing at approximately 68 ° C, 0.2X SSC, 0, 1% SDS). The expert will recognize that the temperature and salt concentration of the washing solution can be adjusted as necessary according to factors such as the length of the probe.

Rigurosidad moderada, como se usa en la presente memoria, incluye condiciones que pueden determinarse fácilmente por aquellos expertos habituales en la materia basándose en, por ejemplo, la longitud del ADN. Las condiciones básicas se exponen por Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. vol. 1, pág. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), e incluyen uso de una disolución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridación de 50% de formamida, 6X SSC a 42 ºC (u otra disolución de hibridación similar, tal como disolución de Stark, en 50% de formamida a 42 ºC), y condiciones de lavado de 60 ºC, 0,5X SSC, 0,1% de SDS. Moderate stiffness, as used herein, includes conditions that can be readily determined by those of ordinary skill in the art based on, for example, the length of the DNA. The basic conditions are set forth by Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. vol. 1, p. 1,101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), and include the use of a prewash solution for 5X SSC nitrocellulose filters, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), conditions of 50% formamide hybridization, 6X SSC at 42 ° C (or other similar hybridization solution, such as Stark's solution, in 50% formamide at 42 ° C), and washing conditions of 60 ° C, 0.5X SSC, 0 , 1% SDS.

Una molécula inorgánica pequeña, como se usa en la presente memoria, significa una molécula que no contiene átomos de carbono y que no tiene más de 50 kD. A small inorganic molecule, as used herein, means a molecule that does not contain carbon atoms and that has no more than 50 kD.

Una molécula orgánica pequeña, como se usa en la presente memoria, significa una molécula que contiene al menos un átomo de carbono y que no tiene más de 50 kD. A small organic molecule, as used herein, means a molecule that contains at least one carbon atom and that has no more than 50 kD.

Tratar, tratamiento, tratando, como se usa en la presente memoria, significa cualquiera de lo siguiente: la reducción en la gravedad de una enfermedad o afección; la reducción en la duración de un transcurso de enfermedad; la mejora de uno o más síntomas asociados a una enfermedad o afección; la provisión de efectos beneficiosos a un sujeto con una enfermedad o afección, sin curar necesariamente la enfermedad o afección, la profilaxis de uno o más síntomas asociados a una enfermedad o afección. Treating, treating, treating, as used herein, means any of the following: reduction in the severity of a disease or condition; the reduction in the duration of a disease course; the improvement of one or more symptoms associated with a disease or condition; the provision of beneficial effects to a subject with a disease or condition, without necessarily curing the disease or condition, the prophylaxis of one or more symptoms associated with a disease or condition.

B. Mejoras ofrecidas por ciertas realizaciones de la invención B. Improvements offered by certain embodiments of the invention

La presente descripción proporciona proteínas quiméricas (híbridos de monómero-dímero) que comprenden una primera y una segunda cadena de polipéptidos, en las que dicha primera cadena comprende una molécula biológicamente activa y al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, y dicha segunda cadena comprende al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina sin ninguna molécula biológicamente activa o región variable de una inmunoglobulina. La Figura 1 compara dímeros de proteína de fusión tradicionales con un ejemplo del híbrido de monómero-dímero de la presente descripción (cuyo ejemlo es, además, una realziación de la presente invención). En este ejemplo, la molécula biológicamente activa es EPO y la parte de una inmunoglobulina es la región Fc de IgG. The present description provides chimeric proteins (monomer dimer hybrids) comprising a first and a second polypeptide chain, wherein said first chain comprises a biologically active molecule and at least a part of a constant region of immunoglobulin, and said second The chain comprises at least a part of a constant region of immunoglobulin without any biologically active molecule or variable region of an immunoglobulin. Figure 1 compares traditional fusion protein dimers with an example of the monomer-dimer hybrid of the present disclosure (which is also an embodiment of the present invention). In this example, the biologically active molecule is EPO and the part of an immunoglobulin is the Fc region of IgG.

Al igual que otras proteínas quiméricas que comprenden al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, la presente descripción, que incluye la presente invención, proporciona proteínas quiméricas que proporcionan estabilidad potenciada y elevada biodisponibilidad de la proteína quimérica en comparación con la molécula biológicamente activa sola. Adicionalmente, sin embargo, debido a que solo una de las dos cadenas comprende la molécula biológicamente activa, la proteína quimérica tiene un menor peso molecular que una proteína quimérica en la que todas las cadenas comprenden una molécula biológicamente activa y, aunque no se desee quedar ligado a teoría particular, esto puede hacer que la proteína quimérica sea más fácilmente transcitada a través de la barrera del epitelio, por ejemplo, uniéndose al receptor FcRn, aumentando así la semivida de la proteína quimérica. En un caso, la presente descripción proporciona así un procedimiento no invasivo mejorado (por ejemplo, mediante cualquier superficie de la mucosa tal como por vía oral, bucalmente, sublingualmente, nasalmente, rectalmente, vaginalmente, o mediante vía pulmonar u ocular) de administrar una proteína quimérica terapéutica de la presente descripción, por ejemplo, una proteína quimérica de la presente invención. Así, la presente descripción proporciona procedimientos de obtención de niveles terapéuticos de las proteínas quiméricas de la presente descripción, por ejemplo, de las proteínas quiméricas de la presente invención, usando dosis menos frecuentes y menores en comparación con proteínas quiméricas previamente descritas (por ejemplo, proteínas quiméricas que comprenden al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina y una molécula biológicamente activa, en la que todas las cadenas de la proteína quimérica comprenden una molécula biológicamente activa). Like other chimeric proteins that comprise at least a portion of a constant region of immunoglobulin, the present description, which includes the present invention, provides chimeric proteins that provide enhanced stability and high bioavailability of the chimeric protein compared to the biologically active molecule. alone. Additionally, however, because only one of the two chains comprises the biologically active molecule, the chimeric protein has a lower molecular weight than a chimeric protein in which all chains comprise a biologically active molecule and, although it is not desired to remain linked to particular theory, this can make the chimeric protein more easily transited through the epithelial barrier, for example, by binding to the FcRn receptor, thereby increasing the half-life of the chimeric protein. In one case, the present description thus provides an improved non-invasive procedure (for example, by any mucosal surface such as orally, orally, sublingually, nasally, rectally, vaginally, or by pulmonary or ocular route) of administering a Therapeutic chimeric protein of the present disclosure, for example, a chimeric protein of the present invention. Thus, the present description provides methods of obtaining therapeutic levels of the chimeric proteins of the present description, for example, of the chimeric proteins of the present invention, using less frequent and lower doses compared to previously described chimeric proteins (e.g., chimeric proteins comprising at least a part of a constant region of immunoglobulin and a biologically active molecule, in which all chains of the chimeric protein comprise a biologically active molecule).

En otro caso, la presente descripción proporciona un procedimiento invasivo, por ejemplo, subcutáneamente, intravenosamente, de administración de una proteína quimérica terapéutica de la presente descripción, por ejemplo, una proteína quimérica terapéutica de la presente invención. La administración invasiva de la proteína quimérica terapéutica de la presente descripción, por ejemplo, de la proteína quimérica terapéutica de la presente invención. proporciona una elevada semivida de la proteína quimérica terapéutica que se produce usando dosis menos frecuentes y menores en comparación con proteínas quiméricas previamente descritas (por ejemplo, proteínas quiméricas que comprenden al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina y una molécula biológicamente activa, en la que todas las cadenas de la proteína quimérica comprenden una molécula biológicamente activa). In another case, the present description provides an invasive method, for example, subcutaneously, intravenously, of administration of a therapeutic chimeric protein of the present disclosure, for example, a therapeutic chimeric protein of the present invention. Invasive administration of the therapeutic chimeric protein of the present description, for example, of the therapeutic chimeric protein of the present invention. provides a high half-life of the therapeutic chimeric protein that is produced using less frequent and lower doses compared to previously described chimeric proteins (for example, chimeric proteins comprising at least a part of a constant region of immunoglobulin and a biologically active molecule, in which all chimeric protein chains comprise a biologically active molecule).

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

Todavía otra ventaja de una proteína quimérica en la que solo una de las cadenas comprende una molécula biológicamente activa es la accesibilidad potenciada de la molécula biológicamente activa para su célula diana o molécula resultante de impedimento estérico disminuido, interacciones hidrófobas disminuidas, interacciones iónicas disminuidas o peso molecular disminuido en comparación con una proteína quimérica en la que todas las cadenas comprenden una molécula biológicamente activa. Yet another advantage of a chimeric protein in which only one of the chains comprises a biologically active molecule is the enhanced accessibility of the biologically active molecule to its target cell or molecule resulting from decreased steric hindrance, decreased hydrophobic interactions, decreased ionic interactions or weight. molecular decrease compared to a chimeric protein in which all chains comprise a biologically active molecule.

C. Proteínas quiméricas C. Chimeric proteins

La presente descripción se refiere a proteínas quiméricas que comprenden una molécula biológicamente activa, al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina y opcionalmente al menos un ligante. La parte de una inmunoglobulina tendrá tanto un extremo N, o amino, como un extremo C, o carboxi. La proteína quimérica puede tener la molécula biológicamente activa ligada al extremo N de la parte de una inmunoglobulina. Alternativamente, la molécula biológicamente activa puede ligarse al extremo C de la parte de una inmunoglobulina. En un caso, el enlace es un enlace covalente. En otra realización, el enlace es un enlace no covalente. The present description relates to chimeric proteins comprising a biologically active molecule, at least a part of a constant region of immunoglobulin and optionally at least one binder. The part of an immunoglobulin will have both an N, or amino, and a C, or carboxy end. The chimeric protein may have the biologically active molecule bound to the N-terminus of the part of an immunoglobulin. Alternatively, the biologically active molecule can be linked to the C-terminus of the part of an immunoglobulin. In one case, the link is a covalent link. In another embodiment, the link is a non-covalent link.

La proteína quimérica puede comprender opcionalmente al menos un ligante; así, la molécula biológicamente activa no tiene que estar directamente ligada a la parte de una región constante de inmunoglobulina. El ligante puede intervenir entre la molécula biológicamente activa y la parte de una región constante de inmunoglobulina. El ligante puede ligarse al extremo N de la parte de una región constante de inmunoglobulina, o al extremo C de la parte de una región constante de inmunoglobulina. Si la molécula biológicamente activa comprende al menos un aminoácido, la molécula biológicamente activa tendrá un extremo N y un extremo C y el ligante puede ligarse al extremo N de la molécula biológicamente activa, o al extremo C de la molécula biológicamente activa. The chimeric protein may optionally comprise at least one binder; thus, the biologically active molecule does not have to be directly linked to the part of a constant region of immunoglobulin. The binder can intervene between the biologically active molecule and the part of a constant region of immunoglobulin. The binder may be linked to the N-terminus of the part of a constant region of immunoglobulin, or to the C-terminus of the part of a constant region of immunoglobulin. If the biologically active molecule comprises at least one amino acid, the biologically active molecule will have an N end and a C end and the binder can be linked to the N end of the biologically active molecule, or to the C end of the biologically active molecule.

La presente descripción se refiere a una proteína quimérica de fórmula X-La-F:F o F:F-La-X en las que X es una molécula biológicamente activa, L es un ligante opcional, F es al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina y a es cualquier número entero o cero. La presente descripción también se refiere a una proteína quimérica de fórmula Ta-X-La-F:F o Ta-F:F-La-X en las que X es una molécula biológicamente activa, L es un ligante opcional, F es al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, a es cualquier número entero o cero, T es un segundo ligante o alternativamente una marca que puede usarse para facilitar la purificación de la proteína quimérica, por ejemplo, una marca FLAG, una marca de histidina, una marca GST, una marca de proteína de unión a maltosa y (:) representa una asociación química, por ejemplo, al menos un enlace no peptídico. En ciertos casos, la asociación química, es decir, (:) es un enlace covalente. En otras casos, la asociación química, es decir, (:) es una interacción no covalente, por ejemplo, una interacción iónica, una interacción hidrófoba, una interacción hidrófila, una interacción de Van der Waals, un enlace de hidrógeno. Se entenderá por el experto que cuando a es igual a cero X se ligará directamente a F. Así, por ejemplo, a puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, o superior a 5. The present description refers to a chimeric protein of formula X-La-F: F or F: F-La-X in which X is a biologically active molecule, L is an optional binder, F is at least a part of a Immunoglobulin constant region is already any integer or zero. The present description also refers to a chimeric protein of formula Ta-X-La-F: F or Ta-F: F-La-X in which X is a biologically active molecule, L is an optional binder, F is al minus a part of a constant region of immunoglobulin, a is any integer or zero, T is a second binder or alternatively a brand that can be used to facilitate the purification of the chimeric protein, for example, a FLAG brand, a histidine brand , a GST brand, a maltose binding protein brand and (:) represents a chemical association, for example, at least one non-peptide bond. In certain cases, the chemical association, that is, (:) is a covalent bond. In other cases, the chemical association, that is, (:) is a non-covalent interaction, for example, an ionic interaction, a hydrophobic interaction, a hydrophilic interaction, a Van der Waals interaction, a hydrogen bond. It will be understood by the expert that when a is equal to zero X it will be directly linked to F. Thus, for example, a can be 0, 1, 2, 3, 4, 5, or greater than 5.

En un caso, la proteína quimérica de la presente descripción comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2a (SEQ IDSEQ ID Nº: 6). En un caso, la proteína quimérica de la presente descripción comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2b (SEQ IDSEQ ID Nº: 8). En un caso, la proteína quimérica de la presente descripción comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2c (SEQ IDSEQ ID Nº: 10). En un caso, la proteína quimérica de la presente descripción comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2d (SEQ IDSEQ ID Nº: 12). En un caso, la proteína quimérica de la presente descripción comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2e (SEQ IDSEQ ID Nº: 14). En un caso, la proteína quimérica de la presente descripción comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2f (SEQ IDSEQ ID Nº: 16). En un caso, la proteína quimérica de la presente descripción comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2g (SEQ IDSEQ ID Nº: 18). En un caso, la proteína quimérica de la presente descripción comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2h (SEQ IDSEQ ID Nº: 20). En un caso, la proteína quimérica de la presente descripción comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2i (SEQ IDSEQ ID Nº: 22). En un caso, la proteína quimérica de la presente descripción comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2j (SEQ IDSEQ ID Nº: 24). En un caso, la proteína quimérica de la presente descripción comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 17b (SEQ IDSEQ ID Nº: 27). In one case, the chimeric protein of the present description comprises the amino acid sequence of Figure 2a (SEQ IDSEQ ID NO: 6). In one case, the chimeric protein of the present description comprises the amino acid sequence of Figure 2b (SEQ IDSEQ ID NO: 8). In one case, the chimeric protein of the present description comprises the amino acid sequence of Figure 2c (SEQ IDSEQ ID NO: 10). In one case, the chimeric protein of the present description comprises the amino acid sequence of Figure 2d (SEQ IDSEQ ID NO: 12). In one case, the chimeric protein of the present description comprises the amino acid sequence of Figure 2e (SEQ IDSEQ ID NO: 14). In one case, the chimeric protein of the present disclosure comprises the amino acid sequence of Figure 2f (SEQ IDSEQ ID NO: 16). In one case, the chimeric protein of the present description comprises the amino acid sequence of Figure 2g (SEQ IDSEQ ID NO: 18). In one case, the chimeric protein of the present description comprises the amino acid sequence of Figure 2h (SEQ IDSEQ ID NO: 20). In one case, the chimeric protein of the present disclosure comprises the amino acid sequence of Figure 2i (SEQ IDSEQ ID NO: 22). In one case, the chimeric protein of the present description comprises the amino acid sequence of Figure 2j (SEQ IDSEQ ID NO: 24). In one case, the chimeric protein of the present disclosure comprises the amino acid sequence of Figure 17b (SEQ IDSEQ ID NO: 27).

Basado en la descripción que se ha proporcionado anteriormente, y en la descipción contenida en cualquier otro sitio de la presente memoria, la presente invención proporciona proteínas quiméricas ddentro del alcance de la reivindicación 1 del apéndice. Based on the description provided above, and on the decryption contained in any other site herein, the present invention provides chimeric proteins within the scope of claim 1 of the appendix.

1. Variantes de proteínas quiméricas 1. Chimeric protein variants

Derivados de las proteínas quiméricas de la presente descripción, que incluyen las proteínas quiméricas de la presente invención, anticuerpos contra tales proteínas quiméricas y anticuerpos contra componentes de unión de tales proteínas quiméricas, son todos contemplados, y pueden prepararse alterando sus secuencias de aminoácidos por sustituciones, adiciones y/o deleciones/truncaciones o introduciendo modificación química que produce moléculas funcionalmente equivalentes. Se entenderá por un experto habitual en la materia que ciertos aminoácidos en una secuencia de cualquier proteína pueden estar sustituidos por otros aminoácidos sin afectar adversamente la actividad de la proteína. Derivatives of the chimeric proteins of the present disclosure, which include the chimeric proteins of the present invention, antibodies against such chimeric proteins and antibodies against binding components of such chimeric proteins, are all contemplated, and can be prepared by altering their amino acid sequences by substitutions. , additions and / or deletions / truncations or introducing chemical modification that produces functionally equivalent molecules. It will be understood by a person skilled in the art that certain amino acids in a sequence of any protein may be substituted by other amino acids without adversely affecting the activity of the protein.

Pueden hacerse diversos cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas quiméricas de la presente descripción, por ejemplo, de las proteínas quiméricas de la presente invención, o en secuencias de ADN que las Various changes can be made in the amino acid sequences of the chimeric proteins of the present description, for example, of the chimeric proteins of the present invention, or in DNA sequences that

codifican sin pérdida apreciable de su actividad, función o utilidad biológica. Derivados, análogos o mutantes resultantes de tales cambios y el uso de tales derivados están dentro del alcance de la presente descripción. En un caso específico, el derivado es funcionalmente activo, es decir, puede presentar una o más actividades asociadas a las proteínas quiméricas de la presente descripción, por ejemplo, de las proteínas quiméricas de la invención, por 5 ejemplo, unión a FcRn, inhibición viral, hemostasia, producción de glóbulos rojos. Muchos ensayos que pueden probar la actividad de una proteína quimérica que comprende una molécula biológicamente activa se conocen en la técnica. Si la molécula biológicamente activa es un inhibidor del VIH, la actividad puede probarse midiendo la actividad de transcriptasa inversa usando procedimientos conocidos (véase, por ejemplo, Barre-Sinoussi y col. 1983, Science 220:868; Gallo y col. 1984, Science 224:500). Alternativamente, la actividad puede medirse midiendo la they code without appreciable loss of their activity, function or biological utility. Derivatives, analogs or mutants resulting from such changes and the use of such derivatives are within the scope of the present description. In a specific case, the derivative is functionally active, that is, it may have one or more activities associated with the chimeric proteins of the present description, for example, of the chimeric proteins of the invention, for example, FcRn binding, inhibition. viral, hemostasis, red blood cell production. Many assays that can test the activity of a chimeric protein comprising a biologically active molecule are known in the art. If the biologically active molecule is an HIV inhibitor, the activity can be tested by measuring reverse transcriptase activity using known methods (see, for example, Barre-Sinoussi et al. 1983, Science 220: 868; Gallo et al. 1984, Science 224: 500). Alternatively, activity can be measured by measuring the

10 actividad fusogénica (véase, por ejemplo, Nussbaum y col. 1994, J. Virol. 68(9):5411). Si la actividad biológica es hemostasia, puede realizarse un ensayo de FVlla-rTF StaCLot para evaluar la actividad de derivados del factor VIIa (Johannessen y col. 2000, Blood Coagulation and Fibrinolysis 11:S159). Fusonogenic activity (see, for example, Nussbaum et al. 1994, J. Virol. 68 (9): 5411). If the biological activity is hemostasis, a FVlla-rTF StaCLot assay can be performed to evaluate the activity of factor VIIa derivatives (Johannessen et al. 2000, Blood Coagulation and Fibrinolysis 11: S159).

Sustitutos de un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse de otros miembros de la clase a la que el aminoácido pertenece (véase la Tabla 1). Además, diversos aminoácidos están comúnmente sustituidos con Substitutes for an amino acid within the sequence can be selected from other members of the class to which the amino acid belongs (see Table 1). In addition, various amino acids are commonly substituted with

15 aminoácidos neutros, por ejemplo, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina (véase, por ejemplo, MacLennan y col. 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki y col. 1998, Adv. Biophys. 35:1-24). 15 neutral amino acids, for example, alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine (see, for example, MacLennan et al. 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643: 55-67; Sasaki et al. . 1998, Adv. Biophys. 35: 1-24).

TABLA 1 TABLE 1

Residuos originales Original waste
Sustituciones a modo de ejemplo Sustituciones típicas Example substitutions Typical substitutions

Ala (A) Wing (A)
Val, Leu, IIe Val Val, Leu, IIe Val

Arg (R) Arg (R)
Lys, Gln, Asn Lys Lys, Gln, Asn Lys

Asn (N) Asn (N)
Gin Gln Gin Gln

Asp (D) Asp (D)
Glu Glu Glu Glu

Cys (C) Cys (C)
Ser, Ala Ser It will be the Be

Gln (Q) Gln (Q)
Asn Asn Asn Asn

Gly (G) Gly (G)
Pro, Ala Ala Pro, wing To

His (H) His (H)
Asn, Gln, Lys, Arg Arg Asn, Gln, Lys, Arg Arg

Ile (I) Ile (I)
Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucine Leu

Leu (L) Leu (L)
Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile Norleucine, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile

Lys (K) Lys (K)
Arg, ácido 1,4-diamino-butírico, Gin, Asn Arg Arg, 1,4-diamino-butyric acid, Gin, Asn Arg

Met (M) Met (M)
Leu, Phe, Ile Leu Leu, Phe, Ile Leu

Phe (F) Phe (F)
Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu

Pro (P) Pro (P)
Ala Gly To Gly

Ser (S) To be
Thr, Ala, Cys Thr Thr, Ala, Cys Thr

Thr (T) Thr (T)
Ser Ser Be Be

Trp (W) Trp (W)
Tyr, Phe Tyr Tyr, Phe Tyr

Tyr (Y) Tyr (Y)
Trp, Phe, Thr, Ser Phe Trp, Phe, Thr, Being Phe

Val (V) Val (V)
Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucine Leu

20 2. Moléculas biológicamente activas 20 2. Biologically active molecules

En las realizaciones de la presente invención, la molécula biológicamente activa es una proteína seleccionada del grupo que consiste en una citosina, una hormona y un factor de coagulación (ejemplos de lis cuales se proporcionan en la siguiente descripción). Sin embargo, la presente descripción contempla más generalmente el uso de cualquier molécula biológicamente activa como la molécula terapéutica de la presente descripción. La molécula In the embodiments of the present invention, the biologically active molecule is a protein selected from the group consisting of a cytosine, a hormone and a coagulation factor (examples of which are provided in the following description). However, the present description more generally contemplates the use of any biologically active molecule as the therapeutic molecule of the present description. Molecule

imagen7image7

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

del mismo, o hélice 5 (Root y col. 2001, Science 291:884) o un análogo del mismo. thereof, or helix 5 (Root et al. 2001, Science 291: 884) or an analog thereof.

Pueden usarse ensayos conocidos en la técnica para probar la actividad inhibidora de la fusión viral de un polipéptido, una molécula orgánica pequeña o una molécula inorgánica pequeña. Estos ensayos incluyen un ensayo con transcriptasa inversa, un ensayo con p24, o ensayo de formación de sincitios (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.464.933). Tests known in the art can be used to test the viral fusion inhibitory activity of a polypeptide, a small organic molecule or a small inorganic molecule. These assays include a reverse transcriptase assay, a p24 assay, or syncytium formation assay (see, for example, U.S. Patent 5,464,933).

Previamente se ha descrito una lista de agentes antivirales que pueden usarse en la proteína quimérica de la presente descripción (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.086.875, 6.485.726, 6.030.613; documentos WO 03/077834; US2003-0235536A1). A list of antiviral agents that can be used in the chimeric protein of the present disclosure has been previously described (see, for example, U.S. Patents 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834 ; US2003-0235536A1).

c. Agentes hemostáticos C. Hemostatic agents

En un caso, la molécula biológicamente activa es un factor de coagulación u otro agente que promueve la hemostasia, que incluye fragmentos y análogos del mismo. El factor de coagulación puede incluir cualquier molécula que tenga actividad de coagulación o active una molécula con actividad de coagulación. El factor de coagulación puede comprender un polipéptido. El factor de coagulación puede ser, como un ejemplo, pero no se limita a, factor VIII, factor IX, factor XI, factor XII, fibrinógeno, protrombina, factor V, factor VII, factor X, factor XIII o factor de von Willebrand. En un caso, el factor de coagulación es factor VII o factor VIIa. El factor de coagulación puede ser un factor que participe en la ruta extrínseca. El factor de coagulación puede ser un factor que participe en la ruta intrínseca. Alternativamente, el factor de coagulación puede ser un factor que participe en tanto la ruta extrínseca como intrínseca. In one case, the biologically active molecule is a coagulation factor or other agent that promotes hemostasis, which includes fragments and analogs thereof. The coagulation factor may include any molecule that has coagulation activity or activates a molecule with coagulation activity. The coagulation factor may comprise a polypeptide. The coagulation factor may be, as an example, but not limited to, factor VIII, factor IX, factor XI, factor XII, fibrinogen, prothrombin, factor V, factor VII, factor X, factor XIII or von Willebrand factor. In one case, the coagulation factor is factor VII or factor VIIa. The coagulation factor may be a factor that participates in the extrinsic path. The coagulation factor may be a factor that participates in the intrinsic path. Alternatively, the coagulation factor may be a factor that participates in both the extrinsic and intrinsic pathways.

El factor de coagulación puede ser un factor de coagulación humano o un factor de coagulación no humano, por ejemplo, derivado de un primate no humano, un cerdo o cualquier mamífero. El factor de coagulación puede ser factor de coagulación quimérico, por ejemplo, el factor de coagulación puede comprender una parte de un factor de coagulación humano y una parte de un factor de coagulación porcino, o una parte de un primer factor de coagulación no humano y una parte de un segundo factor de coagulación no humano. The coagulation factor can be a human coagulation factor or a non-human coagulation factor, for example, derived from a non-human primate, a pig or any mammal. The coagulation factor may be a chimeric coagulation factor, for example, the coagulation factor may comprise a part of a human coagulation factor and a part of a porcine coagulation factor, or a part of a first non-human coagulation factor and a part of a second non-human coagulation factor.

El factor de coagulación puede ser un factor de coagulación activado. Alternativamente, el factor de coagulación puede ser una forma inactiva de un factor de coagulación, por ejemplo, un zimógeno. El factor de coagulación inactivo puede experimentar activación posterior a ser ligado a al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina. El factor de coagulación inactivo puede activarse posterior a la administración a un sujeto. Alternativamente, el factor de coagulación inactivo puede activarse antes de la administración. The coagulation factor may be an activated coagulation factor. Alternatively, the coagulation factor may be an inactive form of a coagulation factor, for example, a zymogen. The inactive coagulation factor may undergo subsequent activation to be linked to at least a part of a constant region of immunoglobulin. The inactive clotting factor can be activated after administration to a subject. Alternatively, the inactive coagulation factor can be activated before administration.

En ciertos casos, una endopeptidasa, por ejemplo, enzima escisora de aminoácidos básicos apareados (PACE), o cualquier miembro de la familia PACE, tal como PCSK1-9, que incluye versiones truncadas de la misma, o su equivalente de levadura Kex2 de S. cerevisiae y versiones truncadas de Kex2 (Kex2 1-675) (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.077.204; 5.162.220; 5.234.830; 5.885.821; 6.329.176) pueden usarse para escindir un propéptido para formar la proteína quimérica madura de la presente descripción (por ejemplo factor VII, factor IX). In certain cases, an endopeptidase, for example, a paired basic amino acid cleavage enzyme (PACE), or any member of the PACE family, such as PCSK1-9, which includes truncated versions thereof, or its equivalent of Kex2 yeast of S cerevisiae and truncated versions of Kex2 (Kex2 1-675) (see, for example, U.S. Patents 5,077,204; 5,162,220; 5,234,830; 5,885,821; 6,329,176) can be used to cleave a propeptide to form the mature chimeric protein of the present disclosure (for example factor VII, factor IX).

d. Otras moléculas biológicamente activas proteináceas d. Other biologically active proteinaceous molecules

En un caso de la presente descripción, la molécula biológicamente activa es un receptor o un fragmento o análogo del mismo. El receptor puede expresarse sobre una superficie celular, o alternativamente el receptor puede expresarse sobre el interior de la célula. El receptor puede ser un receptor viral, por ejemplo, CD4, CCR5, CXCR4, CD21, CD46. La molécula biológicamente activa puede ser un receptor bacteriano. La molécula biológicamente activa puede ser una proteína de la matriz extracelular o fragmento o análogo de la misma, importante en la colonización e infección bacteriana (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.648.240; 5.189.015; 5.175.096) In one case of the present description, the biologically active molecule is a receptor or a fragment or analog thereof. The receptor can be expressed on a cell surface, or alternatively the receptor can be expressed on the inside of the cell. The receptor can be a viral receptor, for example, CD4, CCR5, CXCR4, CD21, CD46. The biologically active molecule can be a bacterial receptor. The biologically active molecule may be an extracellular matrix protein or fragment or analog thereof, important in bacterial colonization and infection (see, for example, U.S. Patents 5,648,240; 5,189,015; 5,175. 096)

o una proteína de la superficie bacteriana importante en adhesión e infección (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.648.240). La molécula biológicamente activa puede ser un factor de crecimiento, hormona o receptor de citocina, o un fragmento o análogo del mismo, por ejemplo, receptor de TNF, el receptor de eritropoyetina, CD25, CD 122 o CD132. or an important bacterial surface protein in adhesion and infection (see, for example, U.S. Patent 5,648,240). The biologically active molecule can be a growth factor, hormone or cytokine receptor, or a fragment or analog thereof, for example, TNF receptor, erythropoietin receptor, CD25, CD 122 or CD132.

Previamente se ha descrito una lista de otras moléculas proteináceas que pueden usarse en la proteína quimérica de la presente descripción (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.086.875; 6.485.726; 6.030.613; documentos WO 03/077834; US2003-0235536A1). A list of other proteinaceous molecules that can be used in the chimeric protein of the present disclosure has been previously described (see, for example, U.S. Patents 6,086,875; 6,485,726; 6,030,613; WO 03 / 077834; US2003-0235536A1).

e. Ácidos nucleicos and. Nucleic acids

En un caso, la molécula biológicamente activa es un ácido nucleico, por ejemplo, ADN, ARN. En un caso específico, la molécula biológicamente activa es un ácido nucleico que puede usarse en ARN interferente (ARNi). La molécula de ácido nucleico puede ser como ejemplo, pero no como limitación, una molécula antisentido o una ribozima o un aptámero. In one case, the biologically active molecule is a nucleic acid, for example, DNA, RNA. In a specific case, the biologically active molecule is a nucleic acid that can be used in interfering RNA (RNAi). The nucleic acid molecule can be as an example, but not as a limitation, an antisense molecule or a ribozyme or an aptamer.

Las moléculas de ARN y ADN antisentido actúan directamente bloqueando la traducción de ARNm hibridándose con ARNm elegido como diana y previniendo la traducción de proteínas. Enfoques antisentido implican el diseño de oligonucleótidos que son complementarios a una ARNm de gen diana. Los oligonucleótidos antisentido se unirán a The antisense RNA and DNA molecules act directly by blocking the translation of mRNA by hybridizing with mRNA chosen as the target and preventing protein translation. Antisense approaches involve the design of oligonucleotides that are complementary to a target gene mRNA. The antisense oligonucleotides will bind to

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

los transcritos de ARNm del gen diana complementario y prevendrán la traducción. No se requiere complementariedad absoluta. the mRNA transcripts of the complementary target gene and will prevent translation. Absolute complementarity is not required.

Una secuencia “complementaria” a una parte de un ARN, como se denomina en la presente memoria, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para poder hibridarse con el ARN, formando un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido bicatenarios, una hebra sencilla del ADN dúplex puede así probarse, o puede ensayarse la formación de tríplex. La capacidad para hibridarse dependerá de tanto el grado de complementaridad como de la longitud del ácido nucleico antisentido. Generalmente, cuanto más largo sea el ácido nucleico de hibridación, más desapareamientos de bases con un ARN puede contener y todavía formar un dúplex estable (o tríplex, según lo requiera el caso). Un experto en la materia puede determinar un grado tolerable de desapareamiento usando procedimientos convencionales para determinar el punto de fusión del complejo hibridado. A sequence "complementary" to a part of an RNA, as it is called herein, means a sequence that has sufficient complementarity to hybridize with the RNA, forming a stable duplex; in the case of double-stranded antisense nucleic acids, a single strand of the duplex DNA can thus be tested, or the triplex formation can be tested. The ability to hybridize will depend on both the degree of complementarity and the length of the antisense nucleic acid. Generally, the longer the hybridization nucleic acid is, the more base mismatches with an RNA can contain and still form a stable duplex (or triplex, as the case requires). One skilled in the art can determine a tolerable degree of disappearance using conventional procedures to determine the melting point of the hybridized complex.

Los ácidos nucleicos antisentido deben tener al menos seis nucleótidos de longitud, y son preferentemente oligonucleótidos que oscilan de 6 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En aspectos específicos, el oligonucleótido tiene al menos 10 nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos o al menos 50 nucleótidos. The antisense nucleic acids should be at least six nucleotides in length, and are preferably oligonucleotides ranging from 6 to about 50 nucleotides in length. In specific aspects, the oligonucleotide has at least 10 nucleotides, at least 17 nucleotides, at least 25 nucleotides or at least 50 nucleotides.

Los oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN, o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, monocatenarios o bicatenarios. El oligonucleótido puede modificarse en el resto de base, el resto de azúcar The oligonucleotides can be DNA or RNA, or chimeric mixtures or derivatives or modified versions thereof, single stranded or double stranded. The oligonucleotide can be modified in the rest of base, the rest of sugar

o esqueleto de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, hibridación, etc. El oligonucleótido puede incluir otros grupos adjuntos tales como polipéptidos (por ejemplo, para elegir como diana receptores de células huésped que eligen diana in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger y col. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553; Lemaitre y col. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648; documento WO 88/09810) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, el documento WO 89/10134), agentes de escisión provocada por la hibridación (véase, por ejemplo, Krol y col. 1988, BioTechniques 6:958) o agentes intercalantes (véase, por ejemplo, Zon 1988, Pharm. Res. 5:539). Para este fin, el oligonucleótido puede conjugarse con otra molécula, por ejemplo, un polipéptido, agente de reticulación provocada por la hibridación, agente de transporte, o agentes de escisión provocada por la hibridación. or phosphate skeleton, for example, to improve the stability of the molecule, hybridization, etc. The oligonucleotide may include other attached groups such as polypeptides (for example, to choose as target receptors for host cells that choose in vivo target), or agents that facilitate transport across the cell membrane (see, for example, Letsinger et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553; Lemaitre et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648; WO 88/09810) or the blood-brain barrier (see, for example WO 89/10134), cleavage agents caused by hybridization (see, for example, Krol et al. 1988, BioTechniques 6: 958) or intercalating agents (see, for example, Zon 1988, Pharm. Res. 5 : 539). For this purpose, the oligonucleotide can be conjugated to another molecule, for example, a polypeptide, crosslinking agent caused by hybridization, transport agent, or cleavage agents caused by hybridization.

También pueden usarse moléculas de ribozima diseñadas para escindir catalíticamente transcritos de ARNm de gen diana para prevenir la traducción de mARN de gen diana y, por tanto, la expresión de producto génico diana (véase, por ejemplo, el documento WO 90/11364; Sarver y col. 1990, Science 247, 1222-1225). Ribozyme molecules designed to catalytically cleave transcripts of target gene mRNAs can also be used to prevent translation of target gene mRNA and, therefore, expression of target gene product (see, for example, WO 90/11364; Sarver et al. 1990, Science 247, 1222-1225).

Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas que pueden catalizar la escisión específica de ARN (véase Rossi 1994, Current Biology 4:469). El mecanismo de acción de las ribozimas implica hibridación específica de secuencias de la molécula de ribozima con ARN diana complementario, seguido de un evento de escisión endonucleolítica. La composición de moléculas de ribozima debe incluir una o más secuencias complementarias al ARNm de gen diana, y debe incluir la muy conocida secuencia catalítica responsable de la escisión de ARNm. Para esta secuencia, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.093.246. Ribozymes are enzymatic RNA molecules that can catalyze specific RNA cleavage (see Rossi 1994, Current Biology 4: 469). The mechanism of action of ribozymes involves specific hybridization of sequences of the ribozyme molecule with complementary target RNA, followed by an endonucleolytic cleavage event. The composition of ribozyme molecules must include one or more sequences complementary to the target gene mRNA, and must include the well-known catalytic sequence responsible for mRNA cleavage. For this sequence, see, for example, US Pat. 5,093,246.

En un caso, las ribozimas que escinden ARNm en secuencias de reconocimiento específicas para sitio pueden usarse para destruir ARNm de gen diana. En otro caso se contempla el uso de ribozimas en cabeza de martillo. La ribozima en cabeza de martillo escinde ARNm en localizaciones dictadas por regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarias con el ARNm diana. El único requisito es que el ARNm tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construcción y producción de ribozimas en cabeza de martillo es muy conocida en la técnica y se describe más completamente en Myers 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VGH Publishers, Nueva York, y en Haseloff y Gerlach 1988, Nature, 334:585. In one case, ribozymes that cleave mRNA into site-specific recognition sequences can be used to destroy target gene mRNAs. In another case, the use of hammerhead ribozymes is contemplated. Hammerhead ribozyme cleaves mRNA at locations dictated by flanking regions that form complementary base pairs with the target mRNA. The only requirement is that the mRNA has the following sequence of two bases: 5'-UG-3 '. The construction and production of hammerhead ribozymes is well known in the art and is more fully described in Myers 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VGH Publishers, New York, and in Haseloff and Gerlach 1988, Nature, 334: 585.

f. Moléculas pequeñas F. Small molecules

La presente descripción también contempla el uso de cualquier molécula pequeña terapéutica o fármaco como molécula biológicamente activa en la proteína quimérica de la presente descripción. Previamente se ha descrito una lista de moléculas pequeñas y fármacos que pueden usarse en la proteína quimérica de la presente descripción (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.086.875; 6.485.726; 6.030.613; documentos WO 03/077834; US2003-0235536A1). The present description also contemplates the use of any small therapeutic molecule or drug as a biologically active molecule in the chimeric protein of the present description. A list of small molecules and drugs that can be used in the chimeric protein of the present disclosure has been previously described (see, for example, U.S. Patents 6,086,875; 6,485,726; 6,030,613; WO 03 / 077834; US2003-0235536A1).

2. Inmunoglobulinas 2. Immunoglobulins

Las proteínas quiméricas de la presente descripción comprenden al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas comprenden cuatro cadenas de proteínas que se asocian covalentemente dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena comprende adicionalmente una región variable y una región constante. Dependiendo del isotipo de inmunoglobulina, la región constante de la cadena pesada comprende 3 ó 4 dominios de la región constante (por ejemplo, CH1, CH2, CH3, CH4). Algunos isotipos comprenden adicionalmente una región bisagra. The chimeric proteins of the present disclosure comprise at least a part of a constant region of immunoglobulin. Immunoglobulins comprise four protein chains that are covalently associated with two heavy chains and two light chains. Each chain additionally comprises a variable region and a constant region. Depending on the immunoglobulin isotype, the heavy chain constant region comprises 3 or 4 domains of the constant region (eg, CH1, CH2, CH3, CH4). Some isotypes further comprise a hinge region.

La parte de una región constante de inmunoglobulina puede obtenerse de cualquier mamífero. La parte de una región constante de inmunoglobulina puede incluir una parte de una región constante de inmunoglobulina humana, una región constante de inmunoglobulina de primate no humano, una región constante de inmunoglobulina bovina, The part of a constant region of immunoglobulin can be obtained from any mammal. The part of a constant region of immunoglobulin may include a part of a constant region of human immunoglobulin, a constant region of immunoglobulin of non-human primate, a constant region of bovine immunoglobulin,

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

una región constante de inmunoglobulina porcina, una región constante de inmunoglobulina murina, una región constante de inmunoglobulina ovina o una región constante de inmunoglobulina de rata. a constant region of porcine immunoglobulin, a constant region of murine immunoglobulin, a constant region of ovine immunoglobulin or a constant region of rat immunoglobulin.

La parte de una región constante de inmunoglobulina puede producirse recombinantemente o sintéticamente. La inmunoglobulina puede aislarse de una biblioteca de ADNc. La parte de una región constante de inmunoglobulina puede aislarse de una biblioteca de fagos (véase, por ejemplo, McCafferty y col. 1990, Nature 348:552, Kang y col. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363; documento EP 0 589 877 B1). La parte de una región constante de inmunoglobulina puede obtenerse por barajado de genes de secuencias conocidas (Mark y col. 1992, Bio/Technol. 10:779). La parte de una región constante de inmunoglobulina puede aislarse por recombinación in vivo (Waterhouse y col. 1993, Nucl. Acid Res. 21:2265). La inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina humanizada (patente de EE.UU. 5.585.089, Jones y col. 1986, Nature 332:323). The part of a constant region of immunoglobulin can be produced recombinantly or synthetically. The immunoglobulin can be isolated from a cDNA library. The part of a constant region of immunoglobulin can be isolated from a phage library (see, for example, McCafferty et al. 1990, Nature 348: 552, Kang et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363 ; EP 0 589 877 B1). The part of a constant region of immunoglobulin can be obtained by shuffling genes of known sequences (Mark et al. 1992, Bio / Technol. 10: 779). The part of a constant region of immunoglobulin can be isolated by recombination in vivo (Waterhouse et al. 1993, Nucl. Acid Res. 21: 2265). The immunoglobulin can be a humanized immunoglobulin (U.S. Patent 5,585,089, Jones et al. 1986, Nature 332: 323).

La parte de una región constante de inmunoglobulina puede incluir una parte de una IgG, una IgA, una IgM, una IgD The part of a constant region of immunoglobulin may include a part of an IgG, an IgA, an IgM, an IgD

o una IgE. En un caso, la inmunoglobulina es una IgG. En otro caso, la inmunoglobulina es IgG1. En otro caso, la inmunoglobulina es IgG2. or an IgE. In one case, the immunoglobulin is an IgG. In another case, the immunoglobulin is IgG1. In another case, the immunoglobulin is IgG2.

La parte de una región constante de inmunoglobulina puede incluir la región constante de la cadena pesada entera, The part of a constant region of immunoglobulin may include the constant region of the entire heavy chain,

o un fragmento o análogo de la misma. En un caso, una región constante de la cadena pesada puede comprender un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3 y/o una región bisagra. En otro caso, una región constante de la cadena pesada puede comprender un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3 y/o un dominio CH4. or a fragment or analogue thereof. In one case, a constant region of the heavy chain may comprise a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain and / or a hinge region. In another case, a constant region of the heavy chain may comprise a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain and / or a CH4 domain.

La parte de una región constante de inmunoglobulina puede incluir un fragmento Fc. Un fragmento Fc puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina y la región bisagra de la inmunoglobulina. El fragmento Fc puede ser el fragmento Fc de una IgG1, una IgG2, una IgG3 o una IgG4. En un caso específico, la parte de una región constante de inmunoglobulina es un fragmento Fc de una IgG1. En otro caso, la parte de una región constante de inmunoglobulina es un fragmento Fc de una IgG2. The part of an immunoglobulin constant region may include an Fc fragment. An Fc fragment may comprise the CH2 and CH3 domains of an immunoglobulin and the hinge region of the immunoglobulin. The Fc fragment can be the Fc fragment of an IgG1, an IgG2, an IgG3 or an IgG4. In a specific case, the part of an immunoglobulin constant region is an Fc fragment of an IgG1. In another case, the part of an immunoglobulin constant region is an Fc fragment of an IgG2.

Como se ha discutido en cualquier parte en la presente memoria, las proteínas quiméricas de la presente invención comprenden al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina que es un componente de unión a receptor neonatal de Fc (FcRn). Esto refleja otro caso de la presente descripción, en el que la parte de una región constante de inmunoglobulina es un componente de unión a FcRn. Un componente de unión a FcRn es cualquier molécula que pueda unirse específicamente por el receptor FcRn con posterior transporte activo por el receptor FcRn del componente de unión a FcRn. Específicamente unido se refiere a dos moléculas que forman un complejo que es relativamente estable bajo condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una alta afinidad y una capacidad de baja a moderada como se distingue de la unión no específica que normalmente tiene una baja afinidad con una capacidad de moderada a alta. Normalmente, la unión se considera específica si la constante de As discussed elsewhere herein, the chimeric proteins of the present invention comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region that is a neonatal Fc receptor binding component (FcRn). This reflects another case of the present description, in which the part of a constant region of immunoglobulin is an FcRn binding component. An FcRn binding component is any molecule that can be specifically bound by the FcRn receptor with subsequent active transport by the FcRn receptor of the FcRn binding component. Specifically bound refers to two molecules that form a complex that is relatively stable under physiological conditions. Specific binding is characterized by high affinity and a low to moderate capacity as distinguished from non-specific binding that normally has a low affinity with a moderate to high capacity. Normally, the union is considered specific if the constant of

M-1 M-1

afinidad KA es superior a 106 M-1, o más preferentemente superior a 108 . Si fuera necesario, la unión no específica puede reducirse sin afectar sustancialmente la unión específica variando las condiciones de unión. Las condiciones de unión apropiadas tales como concentración de las moléculas, fuerza iónica de la disolución, temperatura, tiempo permitido para la unión, concentración de un agente de bloqueo (por ejemplo, albúmina de suero, caseína de la leche), etc., pueden optimizarse por un experto usando técnicas rutinarias. KA affinity is greater than 106 M-1, or more preferably greater than 108. If necessary, the non-specific binding can be reduced without substantially affecting the specific binding by varying the binding conditions. Appropriate binding conditions such as concentration of the molecules, ionic strength of the solution, temperature, time allowed for binding, concentration of a blocking agent (eg, serum albumin, milk casein), etc., may Optimized by an expert using routine techniques.

El receptor FcRn ha sido aislado de varias especies de mamífero que incluyen seres humanos. Se conocen secuencias de FcRn humano, FcRn de mono, FcRn de rata y FcRn de ratón (Story y col. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). El receptor FcRn se une a IgG (pero no a otras clases de inmunoglobulina tales como IgA, IgM, IgD y IgE) a pH relativamente bajo, transporta activamente la IgG transcelularmente en una dirección de luminal a serosal y luego libera la IgG a pH relativamente mayor encontrado en los fluidos intersticiales. Se expresa en tejido epitelial adulto (patentes de EE.UU. 6.485.726, 6.030.613, 6.086.875; documentos WO 03/077834; US2003-0235536A1) que incluye epitelio de pulmón e intestinal (Israel y col. 1997, Immunology 92:69), epitelio tubular proximal renal (Kobayashi y col. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), además de epitelio nasal, superficies vaginales y superficies de las vías biliares. The FcRn receptor has been isolated from several mammalian species that include humans. Sequences of human FcRn, monkey FcRn, rat FcRn and mouse FcRn are known (Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180: 2377). The FcRn receptor binds to IgG (but not to other classes of immunoglobulin such as IgA, IgM, IgD and IgE) at relatively low pH, actively transports the IgG transcellularly in a luminal to serosal direction and then releases the IgG at relatively pH highest found in interstitial fluids. It is expressed in adult epithelial tissue (U.S. Patent 6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536A1) which includes lung and intestinal epithelium (Israel et al. 1997, Immunology 92:69), renal proximal tubular epithelium (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282: F358), in addition to nasal epithelium, vaginal surfaces and bile duct surfaces.

Los componentes de unión a FcRn para su uso según la presente descripción, que incluyen la presente invención, engloban cualquier molécula que pueda unirse específicamente por el receptor FcRn que incluye IgG completa, el fragmento Fc de IgG, y otros fragmentos que incluyen la región de unión completa del receptor FcRn. La región de la parte Fc de IgG que se une al receptor FcRn se ha descrito basándose en cristalografía de rayos X (Burmeister y col. 1994, Nature 372:379). La mayor área de contacto de Fc con el FcRn está cerca de la intersección de los dominios CH2 y CH3. Los contactos Fc-FcRn están todos dentro de una única cadena pesada de Ig. Los componentes de unión a FcRn incluyen IgG completas, el fragmento Fc de IgG y otros fragmentos de IgG que incluyen la región de unión completa de FcRn. Los principales sitios de contacto incluyen los residuos de aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 del dominio CH2 y residuos de aminoácidos 385387, 428 y 433-436 del dominio CH3. Referencias hechas a la numeración de aminoácidos de inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulinas, o regiones, se basan todos en Kabat y col. 1991, Sequences of Proteins of Immunoloical Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, MD. The FcRn binding components for use according to the present disclosure, which include the present invention, encompass any molecule that can be specifically bound by the FcRn receptor that includes complete IgG, the Fc fragment of IgG, and other fragments that include the region of complete binding of the FcRn receptor. The region of the Fc part of IgG that binds to the FcRn receptor has been described based on X-ray crystallography (Burmeister et al. 1994, Nature 372: 379). The largest area of Fc contact with the FcRn is near the intersection of domains CH2 and CH3. The Fc-FcRn contacts are all within a single Ig heavy chain. FcRn binding components include complete IgG, the Fc fragment of IgG and other IgG fragments that include the complete binding region of FcRn. The main contact sites include amino acid residues 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 and 314 of the CH2 domain and amino acid residues 385387, 428 and 433-436 of the CH3 domain. References made to the amino acid numbering of immunoglobulins or immunoglobulin fragments, or regions, are all based on Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunoloical Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, MD.

La región Fc de IgG puede modificarse según procedimientos bien reconocidos tales como mutagénesis dirigida a sitio y similares dando los fragmentos de IgG o Fc modificados o partes de los mismos que se unirán por FcRn. The Fc region of IgG can be modified according to well-recognized procedures such as site-directed mutagenesis and the like giving the modified IgG or Fc fragments or portions thereof that will be joined by FcRn.

imagen8image8

5 5

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

ejemplo, McCafferty y col. 1990, Nature 348:552, Kang y col. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363; documento EP 0 589 877 B1). example, McCafferty et al. 1990, Nature 348: 552, Kang et al. 1991, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88: 4363; EP 0 589 877 B1).

3. Ligantes opcionales 3. Optional binders

La proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, la proteína quimérica de la presente invención, puede comprender opcionalmente al menos una molécula de ligante. El ligante puede comprender cualquier molécula orgánica. En un caso de la presente descripción, por ejemplo, en una realización de la presente invención, el ligante es polietilenglicol (PEG). En otro caso, por ejemplo, en otra realización, el ligante comprende aminoácidos. El ligante puede comprender 1-5 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 10-50 aminoácidos, 50-100 aminoácidos, 100-200 aminoácidos. En un caso, por ejemplo, en una realización, el ligante es el ligante de ocho aminoácidos EFAGAAAV (SEQ ID Nº: 31). Cualquiera de los ligantes descritos en la presente memoria puede usarse en la proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, en las proteínas quiméricas de la presente invención, por ejemplo, un híbrido de monómero-dímero, que incluye EFAGAAAV, independientemente de la molécula biológicamente activa (por ejemplo, EPO, IFN, factor IX). The chimeric protein of the present description, for example, the chimeric protein of the present invention, may optionally comprise at least one binder molecule. The binder can comprise any organic molecule. In one case of the present description, for example, in one embodiment of the present invention, the binder is polyethylene glycol (PEG). In another case, for example, in another embodiment, the binder comprises amino acids. The binder may comprise 1-5 amino acids, 1-10 amino acids, 1-20 amino acids, 10-50 amino acids, 50-100 amino acids, 100-200 amino acids. In one case, for example, in one embodiment, the binder is the eight amino acid binder EFAGAAAV (SEQ ID NO: 31). Any of the binders described herein can be used in the chimeric protein of the present disclosure, for example, in the chimeric proteins of the present invention, for example, a monomer-dimer hybrid, which includes EFAGAAAV, regardless of the molecule. biologically active (for example, EPO, IFN, factor IX).

El ligante puede comprender la secuencia Gn. El ligante puede comprender la secuencia (GA)n (SEQ ID Nº: 32). El ligante puede comprender la secuencia (GGS)n (SEQ ID Nº: 33). El ligante puede comprender la secuencia (GGS)n(GGGGS)n (SEQ ID Nº: 34). En estos casos, n puede ser un número entero de 1-10, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Ejemplos de ligantes incluyen, pero no se limitan a, GGG (SEQ ID Nº: 35), SGGSGGS (SEQ ID Nº: 36), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID Nº: 37), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID Nº: 38), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID Nº: 39). El ligante no elimina o disminuye la actividad biológica de la proteína quimérica. Opcionalmente, el ligante potencia la actividad biológica de la proteína quimérica, por ejemplo, disminuyendo más los efectos de impedimento estérico y haciendo la molécula biológicamente activa más accesible a su sitio de unión diana. The binder may comprise the Gn sequence. The binder may comprise the sequence (GA) n (SEQ ID NO: 32). The binder may comprise the sequence (GGS) n (SEQ ID NO: 33). The binder may comprise the sequence (GGS) n (GGGGS) n (SEQ ID NO: 34). In these cases, n can be an integer from 1-10, that is, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Examples of binders include, but are not limited to, GGG (SEQ ID No.: 35), SGGSGGS (SEQ ID No.: 36), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID No.: 37), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID No.: 38), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID No.:. The binder does not eliminate or decrease the biological activity of the chimeric protein. Optionally, the binder enhances the biological activity of the chimeric protein, for example, further decreasing the effects of steric hindrance and making the biologically active molecule more accessible to its target binding site.

En un caso específico de la presente descripción, por ejemplo en una realización específica de la presente invención, el ligante para interferón  tiene 15-25 aminoácidos de longitud. En otro caso específico / en otra realización específica, el ligante para interferón  tiene 15-20 aminoácidos de longitud. En otro caso específico / en otra realización específica, el ligante para interferón  tiene 10-25 aminoácidos de longitud. En otro caso específico / en otra realización específica, el ligante para interferón  tiene 15 aminoácidos de longitud. En un caso / en una realización, el ligante para interferón  es (GGGGS)n (SEQ ID Nº: 40) en la que G representa glicina, S representa serina y n es un número entero de 1-10. En un caso específico / en una realización específica, n es 3. In a specific case of the present description, for example in a specific embodiment of the present invention, the interferon  binder is 15-25 amino acids in length. In another specific case / in another specific embodiment, the interferon  binder is 15-20 amino acids in length. In another specific case / in another specific embodiment, the interferon binder  is 10-25 amino acids in length. In another specific case / in another specific embodiment, the interferon binder  is 15 amino acids in length. In one case / in one embodiment, the interferon binder  is (GGGGS) n (SEQ ID NO: 40) in which G represents glycine, S represents serine and n is an integer from 1-10. In a specific case / in a specific embodiment, n is 3.

El ligante también puede incorporar un resto que puede escindirse tanto químicamente (por ejemplo, hidrólisis de un éster enlace), enzimáticamente (es decir, incorporación de una secuencia de escisión de proteasa) como fotolíticamente (por ejemplo, un cromóforo tal como ácido 3-amino-3-(2-nitrofenil)propiónico (ANP)) con el fin de liberar la molécula biológicamente activa de la proteína Fc. The binder can also incorporate a moiety that can be cleaved both chemically (for example, hydrolysis of a linker ester), enzymatically (i.e., incorporation of a protease cleavage sequence) and photolytically (for example, a chromophore such as 3- acid amino-3- (2-nitrophenyl) propionic (ANP)) in order to release the biologically active molecule from the Fc protein.

4. Dimerización de proteínas quiméricas usando componentes de unión específicos 4. Chimeric protein dimerization using specific binding components

En un caso, la proteína quimérica de la presente descripción comprende una primera cadena de polipéptidos que comprende al menos un primer dominio, teniendo dicho primer dominio al menos un componente de unión específico, y una segunda cadena de polipéptidos que comprende al menos un segundo dominio, en la que dicho segundo dominio es un componente de unión específico de dicho primer dominio. Así, la proteína quimérica comprende un polipéptido que puede dimerizarse con otro polipéptido debido a la interacción del primer dominio y el segundo dominio. Los procedimientos de dimerización de anticuerpos usando dominios heterólogos se conocen en la técnica (patentes de EE.UU.: 6.807.706 y 5.910.573; Kostelny y col. 1992, J. Immunol. 148(5):1547). In one case, the chimeric protein of the present disclosure comprises a first polypeptide chain comprising at least a first domain, said first domain having at least one specific binding component, and a second polypeptide chain comprising at least a second domain. , wherein said second domain is a specific binding component of said first domain. Thus, the chimeric protein comprises a polypeptide that can be dimerized with another polypeptide due to the interaction of the first domain and the second domain. Methods of antibody dimerization using heterologous domains are known in the art (US Patents: 6,807,706 and 5,910,573; Kostelny et al. 1992, J. Immunol. 148 (5): 1547).

La dimerización puede producirse por formación de un enlace covalente, o alternativamente un enlace no covalente, por ejemplo, interacción hidrófoba, fuerzas de van der Waals, interdigitación de péptidos anfífilos tales como, pero no se limitan a, hélices alfa, interacciones carga-carga de aminoácidos que llevan cargas opuestas tales como, pero no se limitan a, lisina y ácido aspártico, arginina y ácido glutámico. En un caso, el dominio es un haz de hélices que comprende una hélice, un giro y otra hélice. En otro caso, el dominio es una cremallera de leucina que comprende un péptido que tiene varios aminoácidos de repetición en los que cada séptimo aminoácido es un residuo de leucina. En un caso, los componentes de unión específicos son fos/jun (véase Branden y col. 1991, Introduction To Protein Structure, Garland Publishing, Nueva York). Dimerization can occur by formation of a covalent bond, or alternatively a non-covalent bond, for example, hydrophobic interaction, van der Waals forces, interdigitation of amphiphilic peptides such as, but not limited to, alpha helices, charge-loading interactions. of amino acids that carry opposite charges such as, but not limited to, lysine and aspartic acid, arginine and glutamic acid. In one case, the domain is a bundle of propellers comprising a propeller, a turn and another propeller. In another case, the domain is a leucine zipper comprising a peptide that has several repeat amino acids in which each seventh amino acid is a leucine residue. In one case, the specific binding components are fos / jun (see Branden et al. 1991, Introduction To Protein Structure, Garland Publishing, New York).

En otro caso, la unión está mediada por un enlace químico (véase, por ejemplo, Brennan y col. 1985, Science 229:81). En este caso, inmunoglobulinas intactas, o proteínas quiméricas que comprenden al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, se escinden para generar fragmentos de la cadena pesada. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito de sodio para estabilizar ditioles vecinos y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de TNB se reconvierte entonces en el fragmento de la cadena pesada tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y entonces se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de TNB para formar un dímero quimérico. In another case, the binding is mediated by a chemical bond (see, for example, Brennan et al. 1985, Science 229: 81). In this case, intact immunoglobulins, or chimeric proteins that comprise at least a part of a constant region of immunoglobulin, are cleaved to generate heavy chain fragments. These fragments are reduced in the presence of the complexing agent of sodium dithiol arsenite to stabilize neighboring dithiols and prevent the formation of intermolecular disulfide. The fragments generated are then converted to thionitrobenzoate (TNB) derivatives. One of the TNB derivatives is then converted into the thiol heavy chain fragment by reduction with mercaptoethylamine and then mixed with an equimolar amount of the other TNB derivative to form a chimeric dimer.

imagen9image9

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

60 60

comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess 1986, Nucl. Acids Res. 14:6745, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds. 1979, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pág. 353-358; (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y un penalización de 0,10 adicional para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para huecos terminales. También pueden usarse otros programas usados por un experto en la materia de comparación de secuencias. En base a la descripción anterior, y a la descripción contenida en cualquier lugar de la presente memoria, la presente invención proporciona primer y segundo polinucleótidos como se ha establecido en las reivindicaciones anejas. unary comparison (containing a value of 1 for identities and 0 for non-identities) for nucleotides and the weighted comparison matrix of Gribskov and Burgess 1986, Nucl. Acids Res. 14: 6745, as described by Schwartz and Dayhoff, eds. 1979, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, p. 353-358; (2) a penalty of 3.0 for each hole and an additional 0.10 penalty for each symbol in each hole; and (3) without penalty for terminal gaps. Other programs used by an expert in the field of sequence comparison can also be used. Based on the above description, and the description contained herein, the present invention provides first and second polynucleotides as set forth in the appended claims.

E. Síntesis de proteínas quiméricas E. Synthesis of chimeric proteins

Las proteínas quiméricas que comprenden al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina y una molécula biológicamente activa pueden sintetizarse usando técnicas muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, las proteínas quiméricas de la presente descripción, que incluyen las proteínas quiméricas de la presente invención, pueden sintetizarse recombinantemente en células (véase, por ejemplo, Sambrook y col. 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. y Ausubel y col. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.). Alternativamente, las proteínas quiméricas de la presente descripción, que incluyen las proteínas quiméricas de la presente invención, pueden sintetizarse usando procedimientos sintéticos conocidos tales como síntesis en fase sólida. Las técnicas sintéticas son muy conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Merrifield, 1973, Chemical Polypeptides (Katsoyannis y Panayotis eds.) pág. 33561; Merrifield 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Davis y col. 1985, Biochem Intl. 10:394; Finn y col. 1976, The Proteins (3ª ed.) 2:105; Erikson y col. 1976, The Proteins (3ª ed.) 2:257; patente de EE.UU. 3.941.763). Alternativamente, las proteínas quiméricas de la presente descripción, que incluyen las proteínas quiméricas de la presente invención, pueden sintetizarse usando una combinación de procedimientos recombinantes y sintéticos. En ciertas aplicaciones puede ser beneficioso usar tanto un procedimiento recombinante como una combinación de procedimientos recombinantes y sintéticos. Chimeric proteins comprising at least a part of a constant region of immunoglobulin and a biologically active molecule can be synthesized using techniques well known in the art. For example, the chimeric proteins of the present disclosure, which include the chimeric proteins of the present invention, can be synthesized recombinantly in cells (see, for example, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY and Ausubel et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY). Alternatively, the chimeric proteins of the present disclosure, which include the chimeric proteins of the present invention, can be synthesized using known synthetic methods such as solid phase synthesis. Synthetic techniques are well known in the art (see, for example, Merrifield, 1973, Chemical Polypeptides (Katsoyannis and Panayotis eds.) P. 33561; Merrifield 1963, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. 1985, Biochem Intl. 10: 394; Finn et al. 1976, The Proteins (3rd ed.) 2: 105; Erikson et al. 1976, The Proteins (3rd ed.) 2: 257; U.S. Pat. 3,941,763). Alternatively, the chimeric proteins of the present disclosure, which include the chimeric proteins of the present invention, can be synthesized using a combination of recombinant and synthetic methods. In certain applications it may be beneficial to use both a recombinant procedure and a combination of recombinant and synthetic procedures.

Los ácidos nucleicos que codifican una molécula biológicamente activa pueden sintetizarse fácilmente usando técnicas recombinantes muy conocidas en la técnica. Alternativamente, los propios péptidos pueden sintetizarse químicamente. Los ácidos nucleicos de la presente descripción, que incluyen los ácidos nucleicos de la presente invención, pueden sintetizarse mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, por el uso de un sintetizador de ADN automatizado (tal como están comercialmente disponibles de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, oligonucleótidos de fosforotioato pueden sintetizarse mediante el procedimiento de Stein y col. 1988, Nucl. Acids Res. 16:3209, oligonucleótidos de metilfosfonato pueden prepararse por uso de soportes de polímero de vidrio de poro controlado como se describen en Sarin y col. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7448. Se conocen procedimientos adicionales de síntesis de ácidos nucleicos en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.015.881; 6.281.331; 6.469.136). Nucleic acids encoding a biologically active molecule can be easily synthesized using recombinant techniques well known in the art. Alternatively, the peptides themselves can be chemically synthesized. The nucleic acids of the present description, which include the nucleic acids of the present invention, can be synthesized by conventional methods known in the art, for example, by the use of an automated DNA synthesizer (as commercially available from Biosearch, Applied Biosystems, etc.). As examples, phosphorothioate oligonucleotides can be synthesized by the Stein et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209, methylphosphonate oligonucleotides can be prepared by use of controlled pore glass polymer supports as described in Sarin et al. 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85: 7448. Additional methods of nucleic acid synthesis are known in the art (see, for example, U.S. Patent 6,015,881; 6,281,331; 6,469,136).

Las secuencias de ADN que codifican regiones constantes de inmunoglobulina, o fragmentos de las mismas, pueden clonarse a partir de una variedad de bibliotecas de ADN genómico o ADNc conocidas en la técnica. Las técnicas para aislar tales secuencias de ADN usando procedimientos basados en sondas son técnicas convencionales y son muy conocidas para aquellos expertos en la materia. Las sondas para aislar tales secuencias de ADN pueden basarse en secuencias de ADN publicadas (véase, por ejemplo, Hieter y col. 1980, Cell 22:197207). Puede usarse el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) desvelado por Mullis y col. (patente de EE.UU. 4.683.195) y Mullis (patente de EE.UU. 4.683.202). La elección de biblioteca y la selección de sondas para el aislamiento de tales secuencias de ADN está dentro del nivel del experto habitual en la materia. Alternativamente, las secuencias de ADN que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas pueden obtenerse de vectores conocidos en la técnica que contienen inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas. DNA sequences encoding immunoglobulin constant regions, or fragments thereof, can be cloned from a variety of genomic DNA or cDNA libraries known in the art. Techniques for isolating such DNA sequences using probe-based procedures are conventional techniques and are well known to those skilled in the art. Probes for isolating such DNA sequences may be based on published DNA sequences (see, for example, Hieter et al. 1980, Cell 22: 197207). The polymerase chain reaction (PCR) method disclosed by Mullis et al. (U.S. Patent 4,683,195) and Mullis (U.S. Patent 4,683,202). The choice of library and the selection of probes for the isolation of such DNA sequences is within the level of the person skilled in the art. Alternatively, DNA sequences encoding immunoglobulins or fragments thereof can be obtained from vectors known in the art that contain immunoglobulins or fragments thereof.

Para la producción recombinante, una primera secuencia de polinucleótidos que codifica una parte de la proteína quimérica de la presente descripción por ejemplo, de la proteína quimérica de la presente invención, (por ejemplo una parte de una región constante de inmunoglobulina) y una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica una parte de la proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, de la proteína quimérica de la presente invención (por ejemplo, una parte de una región constante de inmunoglobulina y una molécula biológicamente activa, que en el caso de la presente invención es una citocina, una hormona, o un factor de coagulación) se insertan en vehículos de expresión apropiados, es decir, vectores que contienen los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada, o en el caso de un vector viral de ARN, los elementos necesarios para la replicación y traducción. Los ácidos nucleicos que codifican la proteína quimérica se insertan en el vector en la pauta de lectura apropiada. For recombinant production, a first polynucleotide sequence encoding a part of the chimeric protein of the present description, for example, of the chimeric protein of the present invention, (for example a part of a constant region of immunoglobulin) and a second sequence of polynucleotides encoding a part of the chimeric protein of the present description, for example, of the chimeric protein of the present invention (for example, a part of a constant region of immunoglobulin and a biologically active molecule, which in the case of The present invention is a cytokine, a hormone, or a coagulation factor) are inserted into appropriate expression vehicles, that is, vectors containing the elements necessary for the transcription and translation of the inserted coding sequence, or in the case of a vector RNA viral, the elements necessary for replication and translation. Nucleic acids encoding the chimeric protein are inserted into the vector in the appropriate reading pattern.

Los vehículos de expresión se transfectan o co-transfectan entonces en una célula diana adecuada, que expresará los polipéptidos. Técnicas de transfección conocidas en la técnica incluyen, pero no se limitan a, precipitación con fosfato de calcio (Wigler y col. 1978, Cell 14:725) y electroporación (Neumann y col. 1982, EMBO, J. 1:841), y reactivos basados en liposomas. Puede utilizarse una variedad de sistemas de vectores de expresión en huésped para expresar las proteínas quiméricas descritas en la presente memoria que incluyen tanto células procariotas como eucariotas. Éstas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago o ADN de plásmido recombinantes que contienen Expression vehicles are then transfected or co-transfected into a suitable target cell, which will express the polypeptides. Transfection techniques known in the art include, but are not limited to, calcium phosphate precipitation (Wigler et al. 1978, Cell 14: 725) and electroporation (Neumann et al. 1982, EMBO, J. 1: 841), and reagents based on liposomes. A variety of host expression vector systems can be used to express the chimeric proteins described herein that include both prokaryotic and eukaryotic cells. These include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria (eg, E. coli) transformed with bacteriophage DNA or recombinant plasmid DNA expression vectors containing

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

60 60

una secuencia codificante apropiada; levadura u hongos filamentosos transformados con vectores de expresión de levadura u hongos recombinantes que contienen una secuencia codificante apropiada; sistemas de células de insecto infectados por vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen una secuencia codificante apropiada; sistemas de células de planta infectados por vectores de expresión en virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor o virus del mosaico del tabaco) o transformados con vector de expresión en plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contiene una secuencia codificante apropiada; o sistemas de células de animal, que incluyen células de mamífero (por ejemplo, células CHO, Cos, HeLa). an appropriate coding sequence; yeast or filamentous fungi transformed with recombinant yeast expression vectors or fungi containing an appropriate coding sequence; insect cell systems infected by recombinant virus expression vectors (eg, baculovirus) containing an appropriate coding sequence; plant cell systems infected by recombinant virus expression vectors (e.g., cauliflower mosaic virus or tobacco mosaic virus) or transformed with recombinant plasmid expression vector (e.g., Ti plasmid) containing a sequence appropriate coding; or animal cell systems, which include mammalian cells (eg, CHO, Cos, HeLa cells).

Si la proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, la proteína quimérica de la presente invención, se sintetiza recombinantemente en una célula procariota, puede desearse replegar la proteína quimérica. La proteína quimérica producida por este procedimiento puede replegarse a una conformación biológicamente activa usando condiciones conocidas en la técnica, por ejemplo, desnaturalizando bajo condiciones reductoras y luego dializando lentamente en PBS. If the chimeric protein of the present disclosure, for example, the chimeric protein of the present invention, is recombinantly synthesized in a prokaryotic cell, it may be desired to replicate the chimeric protein. The chimeric protein produced by this procedure can be replicated to a biologically active conformation using conditions known in the art, for example, denaturing under reducing conditions and then slowly dialyzing in PBS.

Dependiendo del sistema de expresión usado, la proteína quimérica expresada se aísla entonces mediante procedimientos bien establecidos en la materia (por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico). Depending on the expression system used, the expressed chimeric protein is then isolated by procedures well established in the art (for example, affinity chromatography, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography).

Los vectores de expresión pueden codificar marcas que permiten la fácil purificación de la proteína quimérica recombinantemente producida. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, vector pUR278 (Ruther y col. 1983, EMBO J. 2:1791) en el que la proteína quimérica descrita en la presente memoria que codifica secuencias puede ligarse en el vector en marco con la región codificante de lac z de manera que se produzca una proteína híbrida; pueden usarse vectores pGEX para expresar proteínas quiméricas de la presente descripción, por ejemplo, proteínas quiméricas de la presente invención, con una marca de glutatión S-transferasa (GST). Estas proteínas son normalmente solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células por adsorción a perlas de glutatión-agarosa, seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores incluyen sitios de escisión (trombina o la proteasa factor Xa o PreScission Protease™ (Pharmacia, Peapack, N.J.)) para la fácil eliminación de la marca después de la purificación. Expression vectors can encode tags that allow easy purification of the recombinantly produced chimeric protein. Examples include, but are not limited to, pUR278 vector (Ruther et al. 1983, EMBO J. 2: 1791) in which the chimeric protein described herein encoding sequences can be ligated into the vector in frame with the coding region lac z so that a hybrid protein is produced; pGEX vectors can be used to express chimeric proteins of the present disclosure, for example, chimeric proteins of the present invention, with a glutathione S-transferase (GST) label. These proteins are normally soluble and can be easily purified from cells by adsorption to glutathione-agarose beads, followed by elution in the presence of free glutathione. Vectors include cleavage sites (thrombin or protease factor Xa or PreScission Protease ™ (Pharmacia, Peapack, N.J.)) for easy removal of the label after purification.

Para aumentar la eficiencia de producción, los polinucleótidos pueden diseñarse para codificar múltiples unidades de la proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, de la proteína quimérica de la presente invención, separada por sitios de escisión enzimática. El polipéptido resultante puede escindirse (por ejemplo, mediante tratamiento con la enzima apropiada) con el fin de recuperar las unidades de polipéptido. Esto puede aumentar el rendimiento de polipéptidos accionados por un único promotor. Cuando se usa en sistemas de expresión virales apropiados, la traducción de cada polipéptido codificado por el ARNm se dirige internamente en el transcrito; por ejemplo, por un sitio interno de entrada al ribosoma, IRES. Así, la construcción policistrónica dirige la transcripción de un único ARNm policistrónico grande que, a su vez, dirige la traducción de múltiples polipéptidos individuales. Este enfoque elimina la producción y procesamiento enzimático de poliproteínas y puede aumentar significativamente el rendimiento de polipéptido accionado por un único promotor. To increase production efficiency, polynucleotides can be designed to encode multiple units of the chimeric protein of the present description, for example, of the chimeric protein of the present invention, separated by enzymatic cleavage sites. The resulting polypeptide can be cleaved (for example, by treatment with the appropriate enzyme) in order to recover the polypeptide units. This can increase the performance of polypeptides driven by a single promoter. When used in appropriate viral expression systems, the translation of each polypeptide encoded by the mRNA is directed internally in the transcript; for example, by an internal ribosome entry site, IRES. Thus, the polycistronic construct directs the transcription of a single large polycistronic mRNA which, in turn, directs the translation of multiple individual polypeptides. This approach eliminates the production and enzymatic processing of polyproteins and can significantly increase the performance of polypeptide driven by a single promoter.

Los vectores usados en la transformación contendrán normalmente un marcador de selección usado para identificar transformantes. En sistemas bacterianos, esto puede incluir un gen de resistencia a antibióticos tales como ampicilina o kanamicina. Los marcadores de selección para su uso en células de mamífero cultivadas incluyen genes que confieren resistencia a fármacos, tales como neomicina, higromicina y metrotrexato. El marcador de selección puede ser un marcador de selección amplificable. Un marcador de selección amplificable es el gen DHFR. Otro marcador amplificable es el ADNc de DHFR (Simonsen y Levinson 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2495). Los marcadores de selección se revisan por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA) y la elección de marcadores de selección está perfectamente dentro del nivel del experto habitual en la materia. The vectors used in the transformation will normally contain a selection marker used to identify transformants. In bacterial systems, this may include an antibiotic resistance gene such as ampicillin or kanamycin. Selection markers for use in cultured mammalian cells include genes that confer resistance to drugs, such as neomycin, hygromycin and metrotrexate. The selection marker can be an amplifiable selection marker. An amplifiable selection marker is the DHFR gene. Another amplifiable marker is the DHFR cDNA (Simonsen and Levinson 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495). The selection markers are reviewed by Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA) and the selection of selection markers is perfectly within the level of the person skilled in the art.

Los marcadores de selección pueden introducirse en la célula sobre un plásmido separado al mismo tiempo que el gen de interés, o pueden introducirse sobre el mismo plásmido. Si es sobre el mismo plásmido, el marcador de selección y el gen de interés pueden estar bajo el control de diferentes promotores o el mismo promotor, produciendo la última disposición un mensaje dicistrónico. Las construcciones de este tipo se conocen en la técnica (por ejemplo, la patente de EE.UU. 4.713.339). Selection markers can be introduced into the cell on a separate plasmid at the same time as the gene of interest, or they can be introduced on the same plasmid. If it is on the same plasmid, the selection marker and the gene of interest may be under the control of different promoters or the same promoter, the last arrangement producing a dicistronic message. Constructions of this type are known in the art (for example, US Patent 4,713,339).

Los elementos de expresión de los sistemas de expresión varían en su concentración y especificidades. Dependiendo del sistema huésped/vector utilizado, pueden usarse distintos elementos de transcripción y traducción adecuados, que incluyen promotores constitutivos e inducibles, en el vector de expresión. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos pueden usarse promotores inducibles tales como pL de bacteriófago A, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido de ptrp-lac) y similares; cuando se clona en sistemas de células de insecto, pueden usarse promotores tales como el promotor poliédrico del baculovirus; cuando se clona en sistemas de célula de planta, pueden usarse promotores derivados del genoma de células vegetales (por ejemplo, promotores de choque térmico; el promotor para la subunidad pequeña de RUBISCO; el promotor para la proteína de unión a clorofila a/b) o de virus de plantas (por ejemplo, el promotor de 35S ARN de CaMV; el promotor de la proteína de la envuelta de TMV); cuando se clona en sistemas de células de mamífero, pueden usarse promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus; el promotor de 7,5 K del virus de la variolovacuna); cuando se generan líneas celulares que contienen The expression elements of expression systems vary in their concentration and specificities. Depending on the host / vector system used, different suitable transcription and translation elements, including constitutive and inducible promoters, may be used in the expression vector. For example, when cloning in bacterial systems inducible promoters such as bacteriophage A pL, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac hybrid promoter) and the like can be used; when cloned in insect cell systems, promoters such as the polyhedral baculovirus promoter can be used; when cloned in plant cell systems, promoters derived from the genome of plant cells can be used (for example, heat shock promoters; the promoter for the small subunit of RUBISCO; the promoter for the chlorophyll-binding protein a / b) or from plant viruses (for example, the 35M RNA promoter of CaMV; the promoter of the TMV envelope protein); when cloned into mammalian cell systems, promoters derived from the genome of mammalian cells (eg, metallothionein promoter) or mammalian virus (eg, late adenovirus promoter; 7.5 K promoter can be used of the variolovacuna virus); when cell lines are generated that contain

imagen10image10

15 fifteen

25 25

35 35

45 Four. Five

55 55

de células huésped transformadas o transfectadas apropiadamente cultivadas se separa del material celular, y se demuestra la presencia de proteínas quiméricas. Un procedimiento de detección de las proteínas quiméricas, por ejemplo, es por la unión de las proteínas quiméricas o partes de las proteínas quiméricas a un anticuerpo específico que reconoce la proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, la proteína quimérica de la presente invención. Un anticuerpo anti-proteína quimérica puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal producido contra la proteína quimérica en cuestión. Por ejemplo, la proteína quimérica contiene al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina. Los anticuerpos que reconocen la región constante de muchas inmunoglobulinas se conocen en la técnica y están comercialmente disponibles. Un anticuerpo puede usarse para realizar un ELISA o una transferencia Western para detectar la presencia de la proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, la proteína quimérica de la presente invención. of appropriately cultured transformed or transfected host cells is separated from the cellular material, and the presence of chimeric proteins is demonstrated. A method of detecting the chimeric proteins, for example, is by binding the chimeric proteins or parts of the chimeric proteins to a specific antibody that recognizes the chimeric protein of the present disclosure, for example, the chimeric protein of the present invention. . An anti-chimeric protein antibody may be a monoclonal or polyclonal antibody produced against the chimeric protein in question. For example, the chimeric protein contains at least a part of a constant region of immunoglobulin. Antibodies that recognize the constant region of many immunoglobulins are known in the art and are commercially available. An antibody can be used to perform an ELISA or a Western blot to detect the presence of the chimeric protein of the present disclosure, for example, the chimeric protein of the present invention.

La proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, la proteína quimérica de la presente invención, puede sintetizarse en un animal transgénico, tal como un roedor, vaca, cerdo, oveja o cabra. El término “animales transgénicos” se refiere a animales no humanos que han incorporado un gen extraño en su genoma. Debido a que este gen está presente en tejidos de la línea germinal, se pasa de padres a hijos. Los genes exógenos se introducen en embriones unicelulares (Brinster y col. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438). Los procedimientos de producción de animales transgénicos se conocen en la técnica, que incluyen transgénicos que producen moléculas de inmunoglobulina (Wagner y col. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6376; McKnight y col. 1983, Cell 34:335; Brinster y col. 1983, Nature 306:332; Ritchie y col. 1984, Nature 312:517; Baldassarre y col. 2003, Theriogenology 59:831; Robl y col. 2003, Theriogenology 59:107; Malassagne y col. 2003, Xenotrasplantation 10(3):267). The chimeric protein of the present description, for example, the chimeric protein of the present invention, can be synthesized in a transgenic animal, such as a rodent, cow, pig, sheep or goat. The term "transgenic animals" refers to non-human animals that have incorporated a foreign gene into their genome. Because this gene is present in germline tissues, it is passed from parents to children. Exogenous genes are introduced into single-celled embryos (Brinster et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438). Production methods for transgenic animals are known in the art, including transgenic ones that produce immunoglobulin molecules (Wagner et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight et al. 1983, Cell 34: 335; Brinster et al. 1983, Nature 306: 332; Ritchie et al. 1984, Nature 312: 517; Baldassarre et al. 2003, Theriogenology 59: 831; Robl et al. 2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne et al. 2003, Xenotrasplantation 10 (3): 267).

La proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, la proteína quimérica de la presente invención, también puede producirse por una combinación de técnicas de química sintética y recombinantes. Por ejemplo, la parte de una región constante de inmunoglobulina puede expresarse recombinantemente como se ha descrito anteriormente. La molécula biológicamente activa, que en el caso de la presente invención es una citocina, una hormona, o un factor de coagulación, puede producirse usando técnicas de síntesis química conocidas (por ejemplo, síntesis en fase sólida). The chimeric protein of the present description, for example, the chimeric protein of the present invention, can also be produced by a combination of synthetic and recombinant chemistry techniques. For example, part of an immunoglobulin constant region can be expressed recombinantly as described above. The biologically active molecule, which in the case of the present invention is a cytokine, a hormone, or a coagulation factor, can be produced using known chemical synthesis techniques (eg, solid phase synthesis).

La parte de una región constante de inmunoglobulina puede ligarse a la molécula biológicamente activa usando química de ligación apropiada y luego combinarse con una parte de una región constante de inmunoglobulina que no se ha ligado a una molécula biológicamente activa para formar la proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, la proteína quimérica de la presente invención. En un caso de esta descripción, la parte de una región constante de inmunoglobulina es un fragmento Fc. El fragmento Fc puede producirse recombinantemente para formar Cys-Fc y hacerse reaccionar con una molécula biológicamente activa que expresa un tioéster para hacer un híbrido de monómero-dímero. En otro caso se prepara un Fc-tioéster y se hace reaccionar con una molécula biológicamente activa que expresa una cisteína del extremo N (Figura 4). The part of a constant region of immunoglobulin can be linked to the biologically active molecule using appropriate ligation chemistry and then combined with a part of a constant region of immunoglobulin that has not been linked to a biologically active molecule to form the chimeric protein of the present. description, for example, the chimeric protein of the present invention. In one case of this description, the part of a constant region of immunoglobulin is an Fc fragment. The Fc fragment can be produced recombinantly to form Cys-Fc and reacted with a biologically active molecule that expresses a thioester to make a monomer-dimer hybrid. In another case an Fc-thioester is prepared and reacted with a biologically active molecule that expresses an N-end cysteine (Figure 4).

En un caso, la parte de una región constante de inmunoglobulina ligada a la molécula biológicamente activa formará homodímeros. Los homodímeros pueden alterarse exponiendo los homodímeros a condiciones desnaturalizantes y reductoras (por ejemplo, beta-mercaptoetanol y urea 8 M) y luego combinarse posteriormente con una parte de una región constante de inmunoglobulina no ligada a una molécula biológicamente activa para formar híbridos de monómero-dímero. Los híbridos de monómero-dímero se desnaturalizan entonces y se repliegan dializando en PBS y se aíslan, por ejemplo, por cromatografía de exclusión por tamaño o de afinidad. In one case, the part of a constant region of immunoglobulin bound to the biologically active molecule will form homodimers. The homodimers can be altered by exposing the homodimers to denaturing and reducing conditions (for example, beta-mercaptoethanol and 8 M urea) and then subsequently combined with a part of a constant region of immunoglobulin not bound to a biologically active molecule to form monomer hybrids. dimer The monomer-dimer hybrids are then denatured and replicated by dialysis in PBS and isolated, for example, by size exclusion or affinity chromatography.

En otro caso, la parte de una región constante de inmunoglobulina formará homodímeros antes de ligarse a la molécula biológicamente activa. En este caso, condiciones de reacción para ligar la molécula biológicamente activa al homodímero pueden ajustarse de forma que se favorezca el enlace de la molécula biológicamente activa a solo una cadena del homodímero (por ejemplo, ajustando los equivalentes molares de cada reactante). In another case, the part of a constant region of immunoglobulin will form homodimers before binding to the biologically active molecule. In this case, reaction conditions to bind the biologically active molecule to the homodimer can be adjusted so as to favor the binding of the biologically active molecule to only one chain of the homodimer (for example, by adjusting the molar equivalents of each reactant).

La molécula biológicamente activa puede sintetizarse químicamente con una cisteína del extremo N. La secuencia que codifica una parte de una región constante de inmunoglobulina puede subclonarse en un vector que codifica inteína ligada a un dominio de unión a quitina (New England Biolabs, Beverly, MA). La inteína puede ligarse al extremo C de la parte de una región constante de inmunoglobulina. En un caso, la parte de la inmunoglobulina con la inteína ligada a su extremo C puede expresarse en una célula procariota. En otro caso, la parte de la inmunoglobulina con la inteína ligada a su extremo C puede expresarse en una célula eucariota. La parte de región constante de inmunoglobulina ligada a inteína puede hacerse reaccionar con MESNA. En un caso, la parte de una región constante de inmunoglobulina ligada a inteína está unida a una columna, por ejemplo, una columna de quitina y luego se eluye con MESNA. La molécula biológicamente activa y la parte de una inmunoglobulina pueden hacerse reaccionar juntas de forma que se produzca la transposición nucleófila y la molécula biológicamente activa se ligue covalentemente a la parte de una inmunoglobulina mediante un enlace amida (Dawsen y col. 2000, Annu. Rev. Biochem. 69:923). La proteína quimérica sintetizada de esta forma puede incluir opcionalmente un péptido ligante entre la parte de una inmunoglobulina y la molécula biológicamente activa. El ligante puede, por ejemplo, sintetizarse sobre el extremo N de la molécula biológicamente activa. Los ligantes pueden incluir péptidos y/o moléculas orgánicas (por ejemplo, polietilenglicol y/o secuencias de aminoácidos cortas). Esta síntesis recombinante y química combinada permite el rápido cribado de moléculas biológicamente activas y ligantes para optimizar propiedades deseadas de la proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo de la proteína quimérica de la presente invención, por ejemplo, inhibición viral, hemostasia, producción de glóbulos rojos, semivida biológica, estabilidad, The biologically active molecule can be chemically synthesized with a cysteine of the N-terminus. The sequence encoding a part of a constant region of immunoglobulin can be subcloned into a vector encoding intein linked to a chitin-binding domain (New England Biolabs, Beverly, MA ). Intein can be linked to the C-terminus of the part of a constant region of immunoglobulin. In one case, the part of the immunoglobulin with the intein linked to its C-terminus can be expressed in a prokaryotic cell. In another case, the part of the immunoglobulin with the intein linked to its C-terminus can be expressed in a eukaryotic cell. The intein-linked immunoglobulin constant region portion can be reacted with MESNA. In one case, the part of an intein-linked immunoglobulin constant region is attached to a column, for example, a chitin column and then eluted with MESNA. The biologically active molecule and the part of an immunoglobulin can be reacted together so that the nucleophilic transposition occurs and the biologically active molecule covalently binds to the part of an immunoglobulin via an amide bond (Dawsen et al. 2000, Annu. Rev Biochem. 69: 923). The chimeric protein synthesized in this way may optionally include a binding peptide between the part of an immunoglobulin and the biologically active molecule. The binder can, for example, be synthesized on the N-terminus of the biologically active molecule. The binders may include peptides and / or organic molecules (for example, polyethylene glycol and / or short amino acid sequences). This combined recombinant and chemical synthesis allows rapid screening of biologically active molecules and binders to optimize desired properties of the chimeric protein of the present disclosure, for example of the chimeric protein of the present invention, for example, viral inhibition, hemostasis, production of red blood cells, biological half-life, stability,

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

unión a proteínas del suero o alguna otra propiedad de la proteína quimérica. El procedimiento también permite la incorporación de aminoácidos no naturales en la proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, en la proteína quimérica de la presente invención, que puede ser útil para optimizar una propiedad deseada de la proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, de la proteína quimérica de la presente invención. Si se desea, la proteína quimérica producida por este procedimiento puede replegarse a una conformación biológicamente activa usando condiciones conocidas en la técnica, por ejemplo, condiciones reductoras y luego dializarse lentamente en PBS. binding to whey proteins or some other property of the chimeric protein. The method also allows the incorporation of unnatural amino acids in the chimeric protein of the present disclosure, for example, in the chimeric protein of the present invention, which may be useful for optimizing a desired property of the chimeric protein of the present disclosure, by example, of the chimeric protein of the present invention. If desired, the chimeric protein produced by this procedure can be replicated to a biologically active conformation using conditions known in the art, for example, reducing conditions and then slowly dialyzed into PBS.

Alternativamente, la cisteína del extremo N puede estar sobre la parte de una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, un fragmento Fc. Un fragmento Fc puede generarse con una cisteína del extremo N aprovechando el hecho de que una Fc nativa tiene una cisteína en la posición 226 (véase Kabat y col. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, MD). Alternatively, the N-end cysteine may be on the part of a constant region of immunoglobulin, for example, an Fc fragment. An Fc fragment can be generated with an N-end cysteine taking advantage of the fact that a native Fc has a cysteine at position 226 (see Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Public Health, Bethesda, MD ).

Para exponer una cisteína terminal, un fragmento Fc puede expresarse recombinantemente. En un caso, el fragmento Fc se expresa en una célula procariota, por ejemplo, E. coli. La secuencia que codifica la parte de Fc que empieza con Cys 226 (numeración EU) puede colocarse inmediatamente siguiendo a una secuencia que codifica un péptido señal, por ejemplo, OmpA, PhoA, STII. La célula procariota puede someterse a choque osmótico para liberar el fragmento Fc recombinante. En otro caso, el fragmento Fc se produce en una célula eucariota, por ejemplo, una célula CHO, una célula BHK. La secuencia que codifica el fragmento de la parte Fc puede colocarse directamente siguiendo una secuencia que codifica un péptido señal, por ejemplo, cadena ligera de Igκ de ratón o secuencia señal Kb de MHC de clase I, de forma que cuando la proteína quimérica recombinante se sintetice por una célula eucariota, la secuencia señal se escindirá, dejando una cisteína del extremo N que entonces puede aislarse y hacerse reaccionar químicamente con una molécula que lleva un tioéster (por ejemplo, un tioéster en el extremo C si la molécula comprende aminoácidos). To expose a terminal cysteine, an Fc fragment can be expressed recombinantly. In one case, the Fc fragment is expressed in a prokaryotic cell, for example, E. coli. The sequence encoding the part of Fc that begins with Cys 226 (EU numbering) can be placed immediately following a sequence encoding a signal peptide, for example, OmpA, PhoA, STII. The prokaryotic cell can undergo osmotic shock to release the recombinant Fc fragment. In another case, the Fc fragment is produced in a eukaryotic cell, for example, a CHO cell, a BHK cell. The sequence encoding the fragment of the Fc part can be placed directly following a sequence encoding a signal peptide, for example, mouse Igκ light chain or MHC class I signal sequence KB, so that when the recombinant chimeric protein is synthesized by a eukaryotic cell, the signal sequence will be cleaved, leaving a cysteine of the N-terminus that can then be isolated and chemically reacted with a molecule carrying a thioester (for example, a thioester at the C-terminus if the molecule comprises amino acids).

La cisteína del extremo N sobre un fragmento Fc también puede generarse usando una enzima que escinde su sustrato en su extremo N, por ejemplo, factor Xa, enterocinasa, y el producto se aísla y se hace reaccionar con una molécula con un tioéster. The cysteine of the N-terminus on an Fc fragment can also be generated using an enzyme that cleaves its substrate at its N-terminus, for example, factor Xa, enterokinase, and the product is isolated and reacted with a molecule with a thioester.

El fragmento Fc recombinantemente expresado puede usarse para preparar homodímeros o híbridos de monómerodímero. The recombinantly expressed Fc fragment can be used to prepare homodimers or monomer dimer hybrids.

En un caso específico, un fragmento Fc se expresa con el péptido señal de interferón  humano adyacente a la Cys en la posición 226. Si una construcción que codifica este polipéptido se expresa en células CHO, las células CHO escinden el péptido señal en dos posiciones distintas (en Cys 226 y en Val dentro de 2 aminoácidos del péptido señal en la dirección 5' en la dirección del extremo N). Esto genera una mezcla de dos especies de fragmentos Fc (uno con una Val del extremo N y uno con una Cys del extremo N). Esto produce a su vez una mezcla de especies dímeras (homodímeros con Val del extremo N, homodímeros con Cys terminal y heterodímeros en los que una cadena tiene una Cys terminal y la cadena tiene una Val terminal). Los fragmentos Fc pueden hacerse reaccionar con una molécula biológicamente activa que tiene un tioéster en el extremo C y el híbrido de monómero-dímero resultante puede aislarse de la mezcla (por ejemplo, por cromatografía de exclusión por tamaño). Se contempla que cuando otras secuencias de péptidos señal se usen para la expresión de fragmentos Fc en células CHO se generará una mezcla de especies de fragmentos Fc con al menos dos extremos N diferentes. In a specific case, an Fc fragment is expressed with the human interferon  signal peptide adjacent to the Cys at position 226. If a construct encoding this polypeptide is expressed in CHO cells, the CHO cells cleave the signal peptide in two positions distinct (in Cys 226 and Val within 2 amino acids of the signal peptide in the 5 'direction in the N-end direction). This generates a mixture of two species of Fc fragments (one with a Val from the N end and one with a Cys from the N end). This in turn produces a mixture of dimer species (homodimers with Val N end, homodimers with Cys terminal and heterodimers in which a chain has a terminal Cys and the chain has a terminal Val). Fc fragments can be reacted with a biologically active molecule having a thioester at the C-terminus and the resulting monomer dimer hybrid can be isolated from the mixture (for example, by size exclusion chromatography). It is contemplated that when other signal peptide sequences are used for the expression of Fc fragments in CHO cells, a mixture of Fc fragment species with at least two different N ends will be generated.

En otro caso, una Cys-Fc recombinantemente producida puede formar un homodímero. El homodímero puede hacerse reaccionar con péptido que tiene un ligante ramificado sobre el extremo C, en el que el ligante ramificado tiene dos tioésteres del extremo C que pueden hacerse reaccionar con el Cys-Fc. En otro caso, por ejemplo en otra realización de la presente invención, la molécula biológicamente activa tiene un único tioéster no terminal que puede hacerse reaccionar con Cys-Fc. Alternativamente, el ligante ramificado puede tener dos cisteínas del extremo C que pueden hacerse reaccionar con un Fc-tioéster. En otro caso, el ligante ramificado tiene dos grupos funcionales que pueden hacerse reaccionar con el Fc-tioéster, por ejemplo, 2-mercaptoamina. La molécula biológicamente activa puede comprender aminoácidos. La molécula biológicamente activa puede incluir una molécula orgánica pequeña o una molécula inorgánica pequeña. In another case, a recombinantly produced Cys-Fc can form a homodimer. The homodimer can be reacted with peptide having a branched binder on the C-terminus, in which the branched binder has two thioesters of the C-terminus that can be reacted with the Cys-Fc. In another case, for example in another embodiment of the present invention, the biologically active molecule has a single non-terminal thioester that can be reacted with Cys-Fc. Alternatively, the branched binder may have two C-end cysteines that can be reacted with an Fc-thioester. In another case, the branched binder has two functional groups that can be reacted with the Fc-thioester, for example, 2-mercaptoamine. The biologically active molecule can comprise amino acids. The biologically active molecule may include a small organic molecule or a small inorganic molecule.

F. Procedimientos de uso de proteínas quiméricas F. Procedures for the use of chimeric proteins

Las proteínas quiméricas de la presente descripción tienen muchos usos como se reconocerá por un experto en la materia, que incluyen, pero no se limitan a, procedimientos para tratar un sujeto con una enfermedad o afección. La enfermedad o afección puede incluir, pero no se limita a, una infección viral, un trastorno hemostático, anemia, cáncer, leucemia, una afección inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, artritis, psoriasis, lupus eritematoso, esclerosis múltiple) o una infección bacteriana (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.086.875, 6.030.613, 6.485.726; documentos WO 03/077834; US2003-0235536A1). The chimeric proteins of the present description have many uses as will be recognized by one skilled in the art, which include, but are not limited to, procedures for treating a subject with a disease or condition. The disease or condition may include, but is not limited to, a viral infection, a hemostatic disorder, anemia, cancer, leukemia, an inflammatory condition or an autoimmune disease (for example, arthritis, psoriasis, lupus erythematosus, multiple sclerosis) or a bacterial infection (see, for example, U.S. Patents 6,086,875, 6,030,613, 6,485,726; WO 03/077834; US2003-0235536A1).

1. Procedimientos de tratamiento de un sujeto con una deficiencia de glóbulos rojos 1. Treatment procedures of a subject with a red blood cell deficiency

La presente descripción se refiere a un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene una deficiencia de glóbulos rojos, por ejemplo, anemia, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos una proteína quimérica, en la que la proteína quimérica comprende una primera y una segunda cadena de The present description relates to a method of treating a subject having a red blood cell deficiency, for example, anemia, which comprises administering a therapeutically effective amount of at least one chimeric protein, in which the chimeric protein comprises a first and a second chain of

imagen11image11

5 5

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

Factor XI, Factor XII, Factor V, Factor X o Factor XIII. Factor XI, Factor XII, Factor V, Factor X or Factor XIII.

a. Afecciones que pueden tratarse to. Conditions that can be treated

La proteína quimérica de la presente descripción puede usarse para tratar cualquier trastorno hemostático. Los trastornos hemostáticos que pueden tratarse por administración de la proteína quimérica de la presente incluyen, pero no se limitan a, hemofilia A, hemofilia B, enfermedad de von Willebrand, deficiencia de factor XI (deficiencia de PTA), deficiencia de factor XII, además de deficiencias o anomalías estructurales en fibrinógeno, protrombina, factor V, factor VII, factor X o factor XIII. The chimeric protein of the present disclosure can be used to treat any hemostatic disorder. Hemostatic disorders that can be treated by administration of the chimeric protein herein include, but are not limited to, hemophilia A, hemophilia B, von Willebrand disease, factor XI deficiency (PTA deficiency), factor XII deficiency, in addition of deficiencies or structural abnormalities in fibrinogen, prothrombin, factor V, factor VII, factor X or factor XIII.

En un caso, el trastorno hemostático es un trastorno heredado. En un caso, el sujeto tiene hemofilia A y la proteína quimérica comprende factor VIII o factor VIIIa. En otro caso, el sujeto tiene hemofilia A y la proteína quimérica comprende factor VII o factor VIIa. En otro caso, el sujeto tiene hemofilia B y la proteína quimérica comprende factor IX o factor IXa. En otro caso, el sujeto tiene hemofilia B y la proteína quimérica comprende factor VII o factor VIIa. En otro caso, el sujeto tiene anticuerpos inhibidores para factor VIII o factor VIIIa y la proteína quimérica comprende factor VII o factor VIIa. En otro caso más, el sujeto tiene anticuerpos inhibidores contra factor IX o factor IXa y la proteína quimérica comprende factor VII o factor VIIa. In one case, hemostatic disorder is an inherited disorder. In one case, the subject has hemophilia A and the chimeric protein comprises factor VIII or factor VIIIa. In another case, the subject has hemophilia A and the chimeric protein comprises factor VII or factor VIIa. In another case, the subject has hemophilia B and the chimeric protein comprises factor IX or factor IXa. In another case, the subject has hemophilia B and the chimeric protein comprises factor VII or factor VIIa. In another case, the subject has inhibitory antibodies for factor VIII or factor VIIIa and the chimeric protein comprises factor VII or factor VIIa. In another case, the subject has inhibitory antibodies against factor IX or factor IXa and the chimeric protein comprises factor VII or factor VIIa.

La proteína quimérica de la presente descripción puede usarse para tratar profilácticamente un sujeto con un trastorno hemostático. La proteína quimérica de la presente descripción puede usarse para tratar un episodio hemorrágico agudo en un sujeto con un trastorno hemostático. The chimeric protein of the present disclosure can be used to prophylactically treat a subject with a hemostatic disorder. The chimeric protein of the present description can be used to treat an acute bleeding episode in a subject with a hemostatic disorder.

En un caso, el trastorno hemostático es el resultado de una deficiencia en un factor de coagulación, por ejemplo, factor IX, factor VIII. En otro caso, el trastorno hemostático puede ser el resultado de un factor de coagulación defectivo, por ejemplo, factor de von Willebrand. In one case, hemostatic disorder is the result of a deficiency in a coagulation factor, for example, factor IX, factor VIII. In another case, the hemostatic disorder may be the result of a defective coagulation factor, for example, von Willebrand factor.

En otro caso, el trastorno hemostático puede ser un trastorno adquirido. El trastorno adquirido puede resultar de una enfermedad o afección secundaria subyacente. La afección sin relacionar puede ser, como un ejemplo, pero no como una limitación, cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o embarazo. El trastorno adquirido puede resultar de vejez o de medicación para tratar un trastorno secundario subyacente (por ejemplo, quimioterapia para el cáncer). In another case, the hemostatic disorder may be an acquired disorder. The acquired disorder may result from an underlying secondary disease or condition. The unrelated condition may be, as an example, but not as a limitation, cancer, an autoimmune disease or pregnancy. The acquired disorder may result from old age or medication to treat an underlying secondary disorder (for example, cancer chemotherapy).

4. Procedimientos de tratamiento de un sujeto en necesidad de un agente hemostático general 4. Treatment procedures of a subject in need of a general hemostatic agent

La presente descripción también se refiere a procedimientos de tratamiento de un sujeto que no tiene un trastorno hemostático o una enfermedad o afección secundaria que produzca adquisición de un trastorno hemostático. Así, la presente descripción se refiere a un procedimiento de tratamiento de un sujeto en necesidad de un agente hemostático general que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos una proteína quimérica, en el que la proteína quimérica comprende una primera y una segunda cadena de polipéptidos en la que la primera cadena de polipéptidos comprende al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina y al menos un factor de coagulación y la segunda cadena comprende al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina sin el factor de coagulación de la primera cadena de polipéptidos. The present description also refers to treatment procedures of a subject who does not have a hemostatic disorder or a secondary disease or condition that results in the acquisition of a hemostatic disorder. Thus, the present description refers to a method of treating a subject in need of a general hemostatic agent comprising administering a therapeutically effective amount of at least one chimeric protein, in which the chimeric protein comprises a first and a second chain of polypeptides in which the first polypeptide chain comprises at least a part of a constant region of immunoglobulin and at least one coagulation factor and the second chain comprises at least a part of a constant region of immunoglobulin without the coagulation factor of the first polypeptide chain.

a. Afecciones que pueden tratarse to. Conditions that can be treated

En un caso, el sujeto en necesidad de un agente hemostático general está sometiéndose a, o va a someterse a, cirugía. La proteína quimérica de la presente descripción puede administrarse antes de o después de cirugía como profiláctico. La proteína quimérica de la presente descripción puede administrarse durante o después de cirugía para controlar un episodio hemorrágico agudo. La cirugía puede incluir, pero no se limita a, trasplante de hígado, resección de hígado o trasplante de citoblastos. In one case, the subject in need of a general hemostatic agent is undergoing, or is going to undergo, surgery. The chimeric protein of the present disclosure can be administered before or after surgery as a prophylactic. The chimeric protein of the present disclosure can be administered during or after surgery to control an acute bleeding episode. Surgery may include, but is not limited to, liver transplantation, liver resection or cytoblast transplantation.

La proteína quimérica de la presente descripción puede usarse para tratar un sujeto que tiene un episodio hemorrágico agudo que no tiene un trastorno hemostático. El episodio hemorrágico agudo puede resultar de traumatismo grave, por ejemplo, cirugía, un accidente de automóvil, herida, laceración, disparo de pistola, o cualquier otro evento traumático que produzca sangrado incontrolado. The chimeric protein of the present disclosure can be used to treat a subject who has an acute bleeding episode that does not have a hemostatic disorder. The acute bleeding episode can result from severe trauma, for example, surgery, a car accident, injury, laceration, gun firing, or any other traumatic event that causes uncontrolled bleeding.

5. Modalidades de tratamiento 5. Modalities of treatment

La proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, una proteína quimérica de la presente invención, puede administrarse intravenosamente, subcutáneamente, intramuscularmente, o mediante cualquier superficie mucosa, por ejemplo, por vía oral, sublingualmente, bucalmente, sublingualmente, nasalmente, rectalmente, vaginalmente o mediante la vía pulmonar. La proteína quimérica puede implantarse dentro de o ligarse a un soporte sólido de biopolímero que permita la lenta liberación de la proteína quimérica al sitio deseado. The chimeric protein of the present disclosure, for example, a chimeric protein of the present invention, can be administered intravenously, subcutaneously, intramuscularly, or by any mucosal surface, for example, orally, sublingually, buccally, sublingually, nasally, rectally, vaginally or through the pulmonary route. The chimeric protein can be implanted into or bound to a solid biopolymer support that allows the slow release of the chimeric protein to the desired site.

La dosis de la proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, de la proteína quimérica de la presente invención, variará dependiendo del sujeto y de la vía de administración particular usada. Las dosificaciones pueden oscilar de 0,1 a 100.000 µg/kg de peso corporal. En un caso, el intervalo de dosificación es 0,1-1.000 µg/kg. La proteína puede administrarse continuamente o en intervalos de tiempo específicos. Pueden emplearse ensayos in vitro para determinar intervalos de dosis y/o programas óptimos para administración. En la técnica se conocen The dose of the chimeric protein of the present description, for example, of the chimeric protein of the present invention, will vary depending on the subject and the particular route of administration used. Dosages can range from 0.1 to 100,000 µg / kg body weight. In one case, the dosage range is 0.1-1,000 µg / kg. The protein can be administered continuously or at specific time intervals. In vitro assays can be used to determine dose ranges and / or optimal programs for administration. In the art they are known

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

muchos ensayos in vitro que miden infectividad viral. Por ejemplo, un ensayo con transcriptasa inversa, o un ensayo de rt-PCR o ensayo de ADN ramificado puede usarse para medir concentraciones de VIH. Puede usarse un ensayo StaClot para medir actividad de coagulación. Adicionalmente, dosis eficaces pueden extrapolarse de curvas de dosis-respuesta obtenidas de modelos animales. Many in vitro assays that measure viral infectivity. For example, a reverse transcriptase assay, or an rt-PCR assay or branched DNA assay can be used to measure HIV concentrations. A StaClot assay can be used to measure coagulation activity. Additionally, effective doses can be extrapolated from dose-response curves obtained from animal models.

La presente descripción también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el inhibidor de la fusión viral, al menos una parte de una inmunoglobulina y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences por E.W. Martin. Ejemplos de excipientes pueden incluir almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición también puede contener reactivos de tamponamiento del pH y agentes humectantes o emulsionantes. The present description also relates to a pharmaceutical composition comprising the viral fusion inhibitor, at least a part of an immunoglobulin and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Examples of suitable pharmaceutical vehicles are described in Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin. Examples of excipients may include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skimmed milk powder, glycerol, propylene, glycol , water, ethanol and the like. The composition may also contain pH buffering reagents and wetting or emulsifying agents.

Para administración por vía oral, la composición farmacéutica puede tomar la forma de comprimidos o cápsulas preparadas mediante medios convencionales. La composición también puede prepararse como un líquido, por ejemplo, un jarabe o una suspensión. El líquido puede incluir agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas), agentes emulsionantes (lecitina o goma arábiga), vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados) y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden incluir aromatizantes, colorantes y edulcorantes. Alternativamente, la composición puede presentarse como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado. For oral administration, the pharmaceutical composition may take the form of tablets or capsules prepared by conventional means. The composition can also be prepared as a liquid, for example, a syrup or a suspension. The liquid may include suspending agents (for example, sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats), emulsifying agents (lecithin or gum arabic), non-aqueous vehicles (for example, almond oil, oily esters, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils) and preservatives (for example, methyl or propyl p-hydroxybenzoates or sorbic acid). The preparations may also include flavorings, colorants and sweeteners. Alternatively, the composition may be presented as a dry product for constitution with water or other suitable vehicle.

Para administración bucal y sublingual, la composición pueden tomar la forma de comprimidos, pastillas para chupar For oral and sublingual administration, the composition may take the form of tablets, lozenges

o películas de rápida disolución según protocolos convencionales. or fast dissolving films according to conventional protocols.

Para administración por inhalación, los compuestos para su uso según la presente descripción se administran convenientemente en forma de un espray en aerosol de un envase presurizado o nebulizador (por ejemplo, en PBS), con un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proveyendo una válvula para administrar una cantidad dosificada. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador que contiene una mezcla en polvo del compuesto y un polvo base adecuado tal como lactosa o almidón. For administration by inhalation, the compounds for use according to the present description are conveniently administered in the form of an aerosol spray of a pressurized container or nebulizer (for example, in PBS), with a suitable propellant, for example, dichlorodifluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoromethane, carbon dioxide or other suitable gas. In the case of a pressurized aerosol, the dosage unit can be determined by providing a valve for administering a dosed amount. Capsules and cartridges of, for example, gelatin can be formulated for use in an inhaler or insufflator containing a powder mixture of the compound and a suitable base powder such as lactose or starch.

La composición farmacéutica puede formularse para administración parenteral (es decir, intravenosa o intramuscular) mediante inyección en bolo. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y contienen agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos. The pharmaceutical composition can be formulated for parenteral administration (ie, intravenous or intramuscular) by bolus injection. Formulations for injection may be presented in unit dosage form, for example, in ampoules or in multi-dose containers with an added preservative. The compositions may take forms such as suspensions, solutions or emulsions in oily or aqueous vehicles, and contain formulating agents such as suspending, stabilizing and / or dispersing agents. Alternatively, the active ingredient may be in powder form for constitution with a suitable vehicle, for example, pyrogen-free water.

La composición farmacéutica también puede formularse para administración rectal como un supositorio o enema de retención, por ejemplo, que contiene bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos. The pharmaceutical composition can also be formulated for rectal administration as a suppository or retention enema, for example, which contains conventional suppository bases such as cocoa butter or other glycerides.

6. Terapia de combinación 6. Combination therapy

La proteína quimérica de la presente descripción, por ejemplo, la proteína quimérica de la presente invención, puede usarse para tratar un sujeto con una enfermedad o afección en combinación con al menos otro agente conocido para tratar dicha enfermedad o afección. The chimeric protein of the present disclosure, for example, the chimeric protein of the present invention, can be used to treat a subject with a disease or condition in combination with at least one other known agent to treat said disease or condition.

En un caso, la presente descripción se refiere a un procedimiento de tratamiento de un sujeto infectado por el VIH que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos una proteína quimérica que comprende una primera y una segunda cadena, en la que la primera cadena comprende un inhibidor de la fusión del VIH y al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina y la segunda cadena comprende al menos una parte de una inmunoglobulina sin un inhibidor de la fusión del VIH de la primera cadena, en combinación con al menos otro agente anti-VIH. Dicho otro agente anti-VIH puede ser cualquier terapéutico con actividad anti-VIH demostrada. Dicho otro agente anti-VIH puede incluir, como un ejemplo, pero no como una limitación, un inhibidor de proteasa (por ejemplo, Amprenavir®, Crixivan®, Ritonivir®), un análogo de nucleósido de transcriptasa inversa (por ejemplo, AZT, DDI, D4T, 3TC, Ziagen®), un inhibidor de análogo de no nucleósido de transcriptasa inversa (por ejemplo, Sustiva®), otro inhibidor de la fusión del VIH, un anticuerpo neutralizante específico para el VIH, un anticuerpo específico para CD4, un mimético de CD4, por ejemplo, proteína de fusión CD4-IgG2 (solicitud de patente de EE.UU. 09/912.824) o un anticuerpo específico para CCR5, o CXCR4, o un componente de unión específico de CCR5, o CXCR4. In one case, the present description refers to a method of treating an HIV-infected subject that comprises administering a therapeutically effective amount of at least one chimeric protein comprising a first and a second chain, in which the first chain comprises an HIV fusion inhibitor and at least a part of an immunoglobulin constant region and the second chain comprises at least a part of an immunoglobulin without a first chain HIV fusion inhibitor, in combination with at least one other agent anti-HIV Said other anti-HIV agent can be any therapeutic with demonstrated anti-HIV activity. Said other anti-HIV agent may include, as an example, but not as a limitation, a protease inhibitor (e.g., Amprenavir®, Crixivan®, Ritonivir®), a nucleoside analogue of reverse transcriptase (e.g., AZT, DDI, D4T, 3TC, Ziagen®), a non-nucleoside reverse transcriptase analogue inhibitor (eg, Sustiva®), another HIV fusion inhibitor, an HIV-specific neutralizing antibody, a CD4 specific antibody, a CD4 mimetic, for example, CD4-IgG2 fusion protein (US patent application 09 / 912,824) or an antibody specific for CCR5, or CXCR4, or a specific binding component of CCR5, or CXCR4.

En otro caso, la presente descripción se refiere a un procedimiento de tratamiento de un sujeto con un trastorno hemostático que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos una proteína quimérica que comprende una primera y una segunda cadena, en la que la primera cadena comprende al menos un factor de In another case, the present description refers to a method of treating a subject with a hemostatic disorder which comprises administering a therapeutically effective amount of at least one chimeric protein comprising a first and a second chain, in which the first chain comprises at least one factor of

imagen12image12

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

el pH en el intervalo apropiado, por ejemplo, tris, HEPES, PIPES, MOPS. Condiciones adecuadas también pueden incluir un tampón de lavado para eluir especies sin unir del ligando colorante. El tampón de lavado puede ser cualquier tampón que no altere la unión de una especie unida. Por ejemplo, el tampón de lavado puede ser el mismo que el tampón usado en la etapa de puesta en contacto. the pH in the appropriate range, for example, tris, HEPES, PIPES, MOPS. Suitable conditions may also include a wash buffer to elute unbound species from the dye ligand. The wash buffer can be any buffer that does not alter the union of a bound species. For example, the wash buffer may be the same as the buffer used in the contacting step.

Una vez la proteína quimérica se une al ligando colorante, la proteína quimérica se aísla alterando las condiciones adecuadas. Alterar las condiciones adecuadas puede incluir la adición de una sal al tampón. Puede usarse cualquier sal, por ejemplo, NaCl, KCl. La sal debe añadirse a una concentración que sea suficientemente alta para alterar la unión entre el ligando colorante y las especies deseadas, por ejemplo, un híbrido de monómero-dímero. Once the chimeric protein binds to the dye ligand, the chimeric protein is isolated by altering the appropriate conditions. Altering the right conditions may include adding a salt to the buffer. Any salt can be used, for example, NaCl, KCl. The salt should be added at a concentration that is high enough to alter the binding between the dye ligand and the desired species, for example, a monomer-dimer hybrid.

En algunos casos en los que la mezcla comprende un Fc, un híbrido de monómero-dímero y un dímero, se ha encontrado que Fc no se une al ligando colorante y así se eluye con el flujo continuo. El dímero se une más estrechamente al ligando colorante que el híbrido de monómero-dímero. Así, se requiere una mayor concentración de sal para alterar el enlace (por ejemplo, eluirlo) entre el dímero y el ligando colorante en comparación con la concentración de sales requerida para alterar el enlace entre el ligando colorante y el híbrido de monómero-dímero. In some cases where the mixture comprises an Fc, a monomer-dimer hybrid and a dimer, it has been found that Fc does not bind to the dye ligand and thus elutes with continuous flow. The dimer binds more closely to the dye ligand than the monomer-dimer hybrid. Thus, a higher concentration of salt is required to alter the bond (for example, elute it) between the dimer and the dye ligand compared to the concentration of salts required to alter the bond between the dye ligand and the monomer-dimer hybrid.

En algunos casos puede usarse NaCl para aislar el híbrido de monómero-dímero de la mezcla. En algunos casos, la concentración de sal apropiada que interrumpe el enlace entre el ligando colorante y el híbrido de monómero-dímero es de 200-700 mM, 300-600 mM, 400-500 mM. En un caso, la concentración de NaCl requerida para alterar la unión entre el ligando colorante y el híbrido de monómero-dímero es 400 mM. In some cases NaCl can be used to isolate the monomer dimer hybrid from the mixture. In some cases, the appropriate salt concentration that disrupts the bond between the dye ligand and the monomer dimer hybrid is 200-700 mM, 300-600 mM, 400-500 mM. In one case, the concentration of NaCl required to alter the binding between the dye ligand and the monomer-dimer hybrid is 400 mM.

El NaCl también puede usarse para aislar el dímero de la mezcla. Normalmente, el híbrido de monómero-dímero se aísla de la mezcla antes del dímero. El dímero se aísla añadiendo una concentración apropiada de sal al tampón, interrumpiendo así la unión entre el ligando colorante y el dímero. En algunos casos, la concentración apropiada de sal que interrumpe el enlace entre el ligando colorante y el dímero es de 800 mM a 2 M, 900 mM a 1,5 M, 950 mM a 1,2 M. En un caso específico se usa NaCl 1 M para interrumpir la unión entre el ligando colorante y el dímero. NaCl can also be used to isolate the dimer from the mixture. Normally, the monomer-dimer hybrid is isolated from the mixture before the dimer. The dimer is isolated by adding an appropriate concentration of salt to the buffer, thereby disrupting the binding between the dye ligand and the dimer. In some cases, the appropriate concentration of salt that disrupts the bond between the dye ligand and the dimer is 800 mM at 2 M, 900 mM at 1.5 M, 950 mM at 1.2 M. In a specific case it is used 1M NaCl to interrupt the binding between the dye ligand and the dimer.

El ligando colorante puede ser un bio-mimético. Un bio-mimético es una sustancia humanizada, dispositivo o sistema que imita a la naturaleza. Así, en algunos casos, el ligando colorante imita el ligando de una molécula que se produce naturalmente. El ligando colorante puede elegirse de Mimetic Red 1™, Mimetic Red 2™, Mimetic Orange 1™, Mimetic Orange 2™, Mimetic Orange 3™, Mimetic Yellow 1™, Mimetic Yellow 2™, Mimetic Green 1™, Mimetic Blue 1™ y Mimetic Blue 2™ (Prometic Biosciences (EE.UU.) Inc., Wayne, NJ). En un caso específico, el ligando colorante es Mimetic Red 2™ (Prometic Biosciences (EE.UU.) Inc., Wayne, NJ). En ciertos casos, el ligando colorante está ligado a un soporte sólido, por ejemplo, de Mimetic Red 1A6XL™, Mimetic Red 2 A6XL™, Mimetic Orange 1 A6XL™, Mimetic Orange 2 A6XL™, Mimetic Orange 3 A6XL™, Mimetic Yellow 1 A6XL™, Mimetic Yellow 2 A6XL™, Mimetic Green 1 A6XL™, Mimetic Blue 1 A6XL™ y Mimetic Blue 2 A6XL™ (Prometic Biosciences (EE.UU.) Inc., Wayne, NJ). The dye ligand can be a bio-mimetic. A bio-mimetic is a humanized substance, device or system that mimics nature. Thus, in some cases, the dye ligand mimics the ligand of a naturally occurring molecule. The dye ligand can be chosen from Mimetic Red 1 ™, Mimetic Red 2 ™, Mimetic Orange 1 ™, Mimetic Orange 2 ™, Mimetic Orange 3 ™, Mimetic Yellow 1 ™, Mimetic Yellow 2 ™, Mimetic Green 1 ™, Mimetic Blue 1 ™ and Mimetic Blue 2 ™ (Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). In a specific case, the dye ligand is Mimetic Red 2 ™ (Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). In certain cases, the dye ligand is bound to a solid support, for example, from Mimetic Red 1A6XL ™, Mimetic Red 2 A6XL ™, Mimetic Orange 1 A6XL ™, Mimetic Orange 2 A6XL ™, Mimetic Orange 3 A6XL ™, Mimetic Yellow 1 A6XL ™, Mimetic Yellow 2 A6XL ™, Mimetic Green 1 A6XL ™, Mimetic Blue 1 A6XL ™ and Mimetic Blue 2 A6XL ™ (Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ).

El ligando colorante puede ligarse a un soporte sólido. El soporte sólido puede ser cualquier soporte sólido conocido en la técnica (véase, por ejemplo, www.seperationsNOW.com). Ejemplos de soportes sólidos pueden incluir una perla, un gel, una membrana, una nanopartícula o una microesfera. El soporte sólido puede comprender cualquier material que pueda ligarse a un ligando colorante (por ejemplo, agarosa, poliestireno, Sepharose, Sephadex). Los soportes sólidos pueden comprender cualquier polímero orgánico sintético tal como polímeros poliacrílicos, vinílicos, acrilato, polimetacrilato y poliacrilamida. Los soportes sólidos también pueden comprender un polímero de hidrato de carbono, por ejemplo, agarosa, celulosa o dextrano. Los soportes sólidos pueden comprender óxidos inorgánicos tales como sílice, circonia, titania, ceria, alúmina, magnesia (es decir, óxido de magnesio) u óxido de calcio. Los soportes sólidos también pueden comprender combinaciones de algunos de los soportes anteriormente mencionadas que incluyen, pero no se limitan a, dextrano-acrilamida. The dye ligand can be bound to a solid support. The solid support can be any solid support known in the art (see, for example, www.seperationsNOW.com). Examples of solid supports can include a bead, a gel, a membrane, a nanoparticle or a microsphere. The solid support may comprise any material that can be bound to a dye ligand (eg, agarose, polystyrene, Sepharose, Sephadex). The solid supports can comprise any synthetic organic polymer such as polyacrylic, vinyl, acrylate, polymethacrylate and polyacrylamide polymers. Solid supports may also comprise a carbohydrate polymer, for example, agarose, cellulose or dextran. Solid supports may comprise inorganic oxides such as silica, zirconia, titania, ceria, alumina, magnesia (i.e., magnesium oxide) or calcium oxide. Solid supports may also comprise combinations of some of the above-mentioned supports that include, but are not limited to, dextran-acrylamide.

Ejemplos Examples

Ejemplo 1: El peso molecular afecta la transcitosis mediada por FcRn Example 1: Molecular weight affects FcRn-mediated transcytosis

Se produjeron recombinantemente proteínas quiméricas que comprenden diversas proteínas de interés y Fc de IgG (Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) o en el caso de contactina-Fc, MAB--gal (un complejo de un anticuerpo monoclonal unido a -gal) (Biodesign International, Saco, ME) y MAB-GH (un complejo de anticuerpo monoclonal y hormona de crecimiento) (Research Diagnostics, Inc. Flanders, NJ) se compraron comercialmente. Brevemente, los genes que codifican la proteína de interés se clonaron por PCR y luego se subclonaron en un plásmido de expresión de fusión de Fc. Los plásmidos se transfectaron en células DG44 CHO y se seleccionaron transfectantes estables y se amplificaron con metrotrexato. Los homodímeros de proteína quimérica se purificaron sobre una columna de proteína A. Las proteínas probadas incluyeron interferón , hormona de crecimiento, eritropoyetina, hormona estimulante del folículo, factor IX, betagalactosidasa, contactina y factor VIII. La unión de las proteínas a partes de inmunoglobulina, que incluye el componente de unión a receptor FcRn, o el uso de complejos de anticuerpo completo (incluyendo la región de unión a FcRn)-antígeno comercialmente disponibles permitió la investigación de transcitosis en función del peso molecular (véase la patente de EE.UU. 6.030.613). Las proteínas quiméricas se administraron a ratas por vía oral y los niveles en suero se midieron 2-4 horas después de la administración usando un ELISA para proteínas quiméricas Chimeric proteins comprising various proteins of interest and IgG Fc (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) or in the case of contactin-Fc were produced, MAB--gal (a complex of a monoclonal antibody bound to -gal) (Biodesign International, Saco, ME) and MAB-GH (a complex of monoclonal antibody and growth hormone) (Research Diagnostics, Inc. Flanders, NJ ) were purchased commercially. Briefly, the genes encoding the protein of interest were cloned by PCR and then subcloned into an Fc fusion expression plasmid. Plasmids were transfected into DG44 CHO cells and stable transfectants were selected and amplified with metrotrexate. The chimeric protein homodimers were purified on a protein A column. The proteins tested included interferon , growth hormone, erythropoietin, follicle stimulating hormone, factor IX, betagalactosidase, contactin and factor VIII. The binding of proteins to immunoglobulin parts, which includes the FcRn receptor binding component, or the use of commercially available antibody complexes (including the FcRn binding region) allowed the investigation of transcytosis based on weight molecular (see US Patent 6,030,613). The chimeric proteins were administered to rats orally and serum levels were measured 2-4 hours after administration using an ELISA for chimeric proteins.

recombinantemente producidas y tanto una transferencia Western como ELISA para complejos de anticuerpo comercialmente obtenidos y proteínas quiméricas. Adicionalmente, todos las proteínas o complejos comercialmente obtenidos, además de controles de factor VIII-Fc, factor IX-Fc y Epo-Fc, se yodaron usando IODO (Pierce, Pittsburgh, PA). Los resultados indicaron que los niveles de Fc en suero y las proteínas quiméricas de anticuerpos monoclonales administradas por vía oral a ratas se relacionan directamente con el tamaño de la proteína. El punto de corte aparente para las proteínas quiméricas de Fc administradas por vía oral es entre 200-285 kD (Tabla 2). recombinantly produced and both a Western blot and ELISA for commercially obtained antibody complexes and chimeric proteins. Additionally, all commercially obtained proteins or complexes, in addition to controls of factor VIII-Fc, factor IX-Fc and Epo-Fc, were iodized using IODO (Pierce, Pittsburgh, PA). The results indicated that serum Fc levels and chimeric monoclonal antibody proteins administered orally to rats are directly related to protein size. The apparent cut-off point for chimeric Fc proteins administered orally is between 200-285 kD (Table 2).

TABLA 2 TABLE 2

Proteína Protein
Tamaño (kD) Transcitosis Size (kD) Transcytosis

IFN-Fc IFN-Fc
92 ++++ 92 ++++

GH-Fc GH-Fc
96 +++ 96 +++

Epo-Fc Epo-Fc
120 +++ 120 +++

FSH-Fc FSH-Fc
170 +++ 170 +++

MAB:GH MAB: GH
172-194 +++ 172-194 +++

FIX-Fc FIX-Fc
200 + 200 +

MAB:Gal MAB: alGal
285-420 - 285-420 -

Contactina-Fc Contactina-Fc
300 - 300 -

FVIII-Fc FVIII-Fc
380 - 380 -

Ejemplo 2: Clonación de pcADN 3.1-Flag-Fc Example 2: Cloning of pcDNA 3.1-Flag-Fc

10 La secuencia para el péptido FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), una marca de afinidad común usada para identificar o purificar proteínas, se clonó en el plásmido pcDNA3.1-Fc, que contiene la secuencia señal de Igκ de ratón, seguido del fragmento Fc de IgG1 humana (aminoácidos 221-447, numeración EU). La construcción se creó por PCR de solapamiento usando los siguientes cebadores: 10 The sequence for the FLAG peptide (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), a common affinity mark used to identify or purify proteins, was cloned into the plasmid pcDNA3.1-Fc, which contains the mouse Igκ signal sequence, followed by the Fc fragment of human IgG1 (amino acids 221-447, EU numbering). The construct was created by overlapping PCR using the following primers:

imagen13image13

15 El molde de pcDNA3.1-Fc se añadió entonces a dos reacciones de PCR separadas que contenían 50 pmoles cada una de los pares de cebadores Flag-Fc-F1/R1 o Flag-Fc-F2/R2 en una reacción de 50 µl usando Pfu Ultra ADN polimerasa (Stratagene, CA) según el protocolo convencional del fabricante en un ciclador térmico MJ usando los siguientes ciclos: 95 ºC 2 minutos; 30 ciclos de (95 ºC 30 segundos, 52 ºC 30 segundos, 72 ºC 45 segundos), seguido de 72 ºC durante 10 minutos. Los productos de estas dos reacciones se mezclaron entonces en otra The pcDNA3.1-Fc template was then added to two separate PCR reactions containing 50 pmoles each of the primer pairs Flag-Fc-F1 / R1 or Flag-Fc-F2 / R2 in a 50 µl reaction using Pfu Ultra DNA polymerase (Stratagene, CA) according to the manufacturer's conventional protocol on an MJ thermal cycler using the following cycles: 95 ° C 2 minutes; 30 cycles of (95 ºC 30 seconds, 52 ºC 30 seconds, 72 ºC 45 seconds), followed by 72 ºC for 10 minutes. The products of these two reactions were then mixed in another

20 reacción de PCR (2 µl cada una) con 50 pmoles de cebadores Flag-Fc-F1 y Flag-Fc-R2 en una reacción de 50 µl usando Pfu Ultra ADN polimerasa (Stratagene, CA) según el protocolo convencional del fabricante en un ciclador térmico MJ usando los siguientes ciclos: 95 ºC 2 minutos; 30 ciclos de (95 ºC 30 segundos, 52 ºC 30 segundos, 72 ºC 45 segundos), seguido de 72 ºC durante 10 minutos. El fragmento resultante se purificó en gel, se digirió y se insertó en el plásmido de pcDNA3.1-Fc Nhel-Bam HI. El plásmido resultante contiene la secuencia señal de Igκ de 20 PCR reaction (2 µl each) with 50 pmoles of Flag-Fc-F1 and Flag-Fc-R2 primers in a 50 µl reaction using Pfu Ultra DNA polymerase (Stratagene, CA) according to the manufacturer's conventional protocol in one MJ thermal cycler using the following cycles: 95 ° C 2 minutes; 30 cycles of (95 ºC 30 seconds, 52 ºC 30 seconds, 72 ºC 45 seconds), followed by 72 ºC for 10 minutes. The resulting fragment was gel purified, digested and inserted into the plasmid of pcDNA3.1-Fc Nhel-Bam HI. The resulting plasmid contains the Igκ signal sequence of

25 ratón que produce la proteína Flag-Fc. 25 mouse that produces the Flag-Fc protein.

Ejemplo 3: Clonación de la construcción de factor VII-Fc Example 3: Cloning of the factor VII-Fc construct

La secuencia codificante para factor VII se obtuvo por RT-PCR a partir de ARN de hígado fetal humano (Clontech, Palo Alto, CA). La región clonada comprende la secuencia de ADNc de pb 36 a pb 1430 que termina justo antes del codón de terminación. Se introdujo un sitio Sbfl en el extremo N. Se introdujo un sitio BspEI en el extremo C. La The coding sequence for factor VII was obtained by RT-PCR from human fetal liver RNA (Clontech, Palo Alto, CA). The cloned region comprises the cDNA sequence from pb 36 to bp 1430 that ends just before the termination codon. An Sbfl site was introduced at the N end. A BspEI site was introduced at the C end.

30 construcción se clonó por PCR usando los cebadores: 30 construction was cloned by PCR using primers:

imagen14image14

5 5

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

imagen15image15

y las siguientes condiciones: 95 ºC durante 5 minutos seguido de 30 ciclos de 95 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 1 minuto y 45 segundos, y un ciclo de extensión final de 72 ºC durante 10 minutos. and the following conditions: 95 ° C for 5 minutes followed by 30 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute and 45 seconds, and a final extension cycle of 72 ° C for 10 minutes.

El fragmento se digirió con Sbfl -BspE I y se insertó en pED.dC-Fc, un plásmido que codifica el fragmento Fc de una IgG1. The fragment was digested with Sbfl -BspE I and inserted into pED.dC-Fc, a plasmid encoding the Fc fragment of an IgG1.

Ejemplo 4: Clonación de la construcción de factor IX-Fc Example 4: Cloning of the factor IX-Fc construct

La secuencia codificante de factor IX humano, que incluye la secuencia de prepropéptidos, se obtuvo por amplificación por RT-PCR de ARN de hígado humano adulto usando los siguientes cebadores: The human factor IX coding sequence, which includes the prepropeptide sequence, was obtained by RT-PCR amplification of adult human liver RNA using the following primers:

natFIX-F: 5'-TTACTGCAGAAGGTTATGCAGCGCGTGAACATG-3' (SEQ ID Nº: 47) natFIX-F: 5'-TTACTGCAGAAGGTTATGCAGCGCGTGAACATG-3 '(SEQ ID NO: 47)

F9-R: 5'-TTTTTCGAATTCAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATCC-3' (SEQ ID Nº: 48) F9-R: 5'-TTTTTCGAATTCAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATCC-3 '(SEQ ID NO: 48)

20 ng de ARN de hígado humano adulto (Clontech, Palo Alto, CA) y 25 pmoles de cada cebador se añadieron a una reacción de RT-PCR usando la RT-PCR de una etapa SuperScript™ con el sistema PLATINUM® Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) según el protocolo del fabricante. La reacción se llevó a cabo en un ciclador térmico MJ usando los siguientes ciclos: 50 ºC 30 minutos; 94 ºC 2 minutos; 35 ciclos de (94 ºC 30 segundos, 58 ºC 30 segundos, 72 ºC 1 minuto) y un final 72 ºC 10 minutos. El fragmento se purificó en gel usando el kit de extracción en gel Qiagen (Qiagen, Valencia, CA) y se digirió con PstI-EcoRI, se purificó en gel y se clonó en el digesto correspondiente del plasmido pED.dC.XFc. 20 ng of adult human liver RNA (Clontech, Palo Alto, CA) and 25 pmoles of each primer were added to an RT-PCR reaction using the SuperScript ™ one-stage RT-PCR with the PLATINUM® Taq system (Invitrogen, Carlsbad, CA) according to the manufacturer's protocol. The reaction was carried out in an MJ thermal cycler using the following cycles: 50 ° C 30 minutes; 94 ° C 2 minutes; 35 cycles of (94 ºC 30 seconds, 58 ºC 30 seconds, 72 ºC 1 minute) and an end 72 ºC 10 minutes. The fragment was gel purified using the Qiagen gel extraction kit (Qiagen, Valencia, CA) and digested with PstI-EcoRI, gel purified and cloned into the corresponding digest of plasmid pED.dC.XFc.

Ejemplo 5: Clonación de la construcción de PACE Example 5: Cloning the construction of PACE

La secuencia codificante para PACE humana (enzima escisora de aminoácidos básicos apareados), una endoproteasa, se obtuvo por RT-PCR. Se usaron los siguientes cebadores: The coding sequence for human PACE (enzyme cleaved from basic paired amino acids), an endoprotease, was obtained by RT-PCR. The following primers were used:

PACE-F1: 5'-GGTAAGCTTGCCATGGAGCTGAGGCCCTGGTTGC -3' (SEQ ID Nº: 49) PACE-F1: 5'-GGTAAGCTTGCCATGGAGCTGAGGCCCTGGTTGC -3 '(SEQ ID NO: 49)

PACE-R1: 5'-GTTTTCAATCTCTAGGACCCACTCGCC -3' (SEQ ID Nº: 50) PACE-R1: 5'-GTTTTCAATCTCTAGGACCCACTCGCC -3 '(SEQ ID NO: 50)

PACE-F2: 5'-GCCAGGCCACATGACTACTCCGC -3' (SEQ ID Nº: 51) PACE-F2: 5'-GCCAGGCCACATGACTACTCCGC -3 '(SEQ ID NO: 51)

PACE-R2: 5'-GGTGAATTCTCACTCAGGCAGGTGTGAGGGCAGC -3' (SEQ ID Nº: 52) PACE-R2: 5'-GGTGAATTCTCACTCAGGCAGGTGTGAGGGCAGC -3 '(SEQ ID NO: 52)

El cebador de PACE-F1 añade un sitio Hindlll al extremo 5' de la secuencia de PACE que empieza con 3 nucleótidos antes del codón de iniciación, mientras que el cebador de PACE-R2 añade un codón de terminación después del aminoácido 715, que se produce en el extremo del dominio extracelular de PACE, además de añadir un sitio EcoRI al extremo 3' del codón de terminación. Los cebadores de PACE-R1 y -F2 se hibridan en los lados 3' y 5' de un sitio BamHI interno, respectivamente. Entonces se establecieron dos reacciones de RT-PCR usando 25 pmoles de cada uno de los pares de cebadores de PACE-F1/R1 o PACE-F2/R2 con 20 ng de ARN de hígado humano adulto (Clontech; Palo Alto, CA) en una reacción de RT-PCR de 50 µl usando la RT-PCR de una etapa SuperScript™ con sistema PLATINUM® Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) según el protocolo del fabricante. La reacción se llevó a cabo en un ciclador térmico MJ usando los siguientes ciclos: 50 ºC 30 minutos; 94 ºC 2 minutos; 30 ciclos de (94 ºC 30 segundos, 58 ºC 30 segundos, 72 ºC 2 minutos), seguido de 72 ºC 10 minutos. Estos fragmentos se ligaron cada uno en el vector pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) y se secuenciaron completamente. El fragmento de F2-R2 se subclonó entonces en pcDNA6 V5/His (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando los sitios BamHI/EcoRl, y entonces el fragmento de F1-R1 se clonó en esta construcción usando los sitios HindIII/BamHI. El plásmido final, pcDNA6-PACE, produce una forma soluble de PACE (aminoácidos 1-715), ya que se ha delecionado la región transmembrana. La secuencia de PACE en pcDNA6-PACE es esencialmente como se describe en Harrison y col. 1998, Seminars in Hematology 35:4. The PACE-F1 primer adds a Hindlll site to the 5 'end of the PACE sequence that begins with 3 nucleotides before the initiation codon, while the PACE-R2 primer adds a termination codon after amino acid 715, which is produces at the end of the PACE extracellular domain, in addition to adding an EcoRI site to the 3 'end of the termination codon. The primers of PACE-R1 and -F2 hybridize on the 3 'and 5' sides of an internal BamHI site, respectively. Two RT-PCR reactions were then established using 25 pmoles of each of the primer pairs of PACE-F1 / R1 or PACE-F2 / R2 with 20 ng of adult human liver RNA (Clontech; Palo Alto, CA) in a 50 µl RT-PCR reaction using the one-stage SuperScript ™ RT-PCR with PLATINUM® Taq system (Invitrogen, Carlsbad, CA) according to the manufacturer's protocol. The reaction was carried out in an MJ thermal cycler using the following cycles: 50 ° C 30 minutes; 94 ° C 2 minutes; 30 cycles of (94 ºC 30 seconds, 58 ºC 30 seconds, 72 ºC 2 minutes), followed by 72 ºC 10 minutes. These fragments were each ligated into the pGEM T-Easy vector (Promega, Madison, WI) and completely sequenced. The F2-R2 fragment was then subcloned into pcDNA6 V5 / His (Invitrogen, Carlsbad, CA) using the BamHI / EcoRl sites, and then the F1-R1 fragment was cloned in this construct using the HindIII / BamHI sites. The final plasmid, pcDNA6-PACE, produces a soluble form of PACE (amino acids 1-715), since the transmembrane region has been deleted. The sequence of PACE in pcDNA6-PACE is essentially as described in Harrison et al. 1998, Seminars in Hematology 35: 4.

Ejemplo 6: Clonación de la construcción del ligante de ocho aminoácidos de IFN-Fc Example 6: Cloning of the eight amino acid binder construction of IFN-Fc

La secuencia codificante de interferón  2b humano (hIFN), que incluye la secuencia señal, se obtuvo por PCR a partir de ADN genómico humano usando los siguientes cebadores: The human interferon  2b coding sequence (hIFN), which includes the signal sequence, was obtained by PCR from human genomic DNA using the following primers:

imagen16image16

Se preparó ADN genómico a partir de la línea celular de astrocitoma humano 373MG según procedimientos Genomic DNA was prepared from the 373MG human astrocytoma cell line according to procedures

imagen17image17

imagen18image18

5 5

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

Ejemplo 10: Clonación de la construcción de eritropoyetina-Fc de péptido ácido Example 10: Cloning of the erythropoietin-Fc acid peptide construct

La región bisagra del fragmento Fc de IgG1 humana en EPO-Fc del aminoácido 221-229 (numeración EU) se sustituyó con un péptido ácido (CCA). Se usaron cuatro oligonucleótidos solapantes (IDT, Coralville, IA): The hinge region of the human IgG1 Fc fragment in EPO-Fc of amino acid 221-229 (EU numbering) was substituted with an acid peptide (CCA). Four overlapping oligonucleotides (IDT, Coralville, IA) were used:

1.one.
Sentido 1 de Epo-CCA-Fc:  Sense 1 of Epo-CCA-Fc:

2.2.
Sentido 2 de Epo-CCA-Fc:  Sense 2 of Epo-CCA-Fc:

3.3.
Antisentido 1 de Epo-CCA-Fc:  Antisense 1 of Epo-CCA-Fc:

4.Four.
Antisentido 2 de Epo-CCA-Fc:  Epo-CCA-Fc Antisense 2:

imagen19image19

imagen20image20

imagen21image21

imagen22image22

Los oligonucleótidos se reconstituyeron a una concentración de 50 µM con dH2O. 5 µl de cada oligonucleótido se hibridaron entre sí combinando en un tubo de PCR de pared delgada con 2,2 µl de tampón de restricción nº 2 (New England Biolabs, Beverly, MA) y se calentaron a 95 ºC durante 30 segundos y luego se dejaron enfriar lentamente durante 2 horas a 25 ºC. 5 pmoles de los oligonucleótidos ahora hibridados se ligaron en un vector pGEM T-Easy como se ha indicado en el manual del kit (Promega, Madison, WI). La mezcla de ligación se añadió a 50 µl de células de E. coli competentes DH5 (Invitrogen, Carlsbad, CA) sobre hielo durante 2 minutos, se incubaron a 37 ºC 5 minutos, se incubaron sobre hielo durante 2 minutos y luego se sembraron en placas de agar de LB+100 µg/l de ampicilina y se pusieron a 37 ºC durante 14 horas. Las colonias bacterianas individuales se recogieron y se pusieron en 5 ml de LB+100 µg/l de ampicilina y se dejaron crecer durante 14 horas. Los tubos se centrifugaron a 2000 x g, 4 ºC durante 15 minutos y el vector ADN se preparó usando el kit Qiagen miniprep (Qiagen, Valencia, CA) como se indica en el manual del kit. Se digirieron 2 µg de ADN con Age I-Rsr-II. El fragmento se purificó en gel por el procedimiento QIAquick como se ha enseñado en el manual del kit (Qiagen, Valencia, CA) y se ligó en pED.Epo Fc.1 Age I-Rsr II. La ligación se transformó en células de E. coli competentes DH5 y se preparó ADN como se ha descrito anteriormente. The oligonucleotides were reconstituted at a concentration of 50 µM with dH2O. 5 µl of each oligonucleotide was hybridized to each other by combining in a thin-walled PCR tube with 2.2 µl of restriction buffer # 2 (New England Biolabs, Beverly, MA) and heated at 95 ° C for 30 seconds and then allowed to cool slowly for 2 hours at 25 ° C. 5 pmoles of the now hybridized oligonucleotides were ligated into a T-Easy pGEM vector as indicated in the kit manual (Promega, Madison, WI). The ligation mixture was added to 50 µl of DH5 competent E. coli cells (Invitrogen, Carlsbad, CA) on ice for 2 minutes, incubated at 37 ° C 5 minutes, incubated on ice for 2 minutes and then seeded in LB agar plates + 100 µg / l ampicillin and placed at 37 ° C for 14 hours. The individual bacterial colonies were collected and placed in 5 ml of LB + 100 µg / l of ampicillin and allowed to grow for 14 hours. The tubes were centrifuged at 2000 x g, 4 ° C for 15 minutes and the DNA vector was prepared using the Qiagen miniprep kit (Qiagen, Valencia, CA) as indicated in the kit manual. 2 µg of DNA was digested with Age I-Rsr-II. The fragment was gel purified by the QIAquick procedure as taught in the kit manual (Qiagen, Valencia, CA) and ligated into pED.Epo Fc.1 Age I-Rsr II. The ligation was transformed into DH5 competent E. coli cells and DNA was prepared as described above.

Ejemplo 11: Clonación de la construcción de Cys-Fc Example 11: Cloning of the Cys-Fc construct

Usando PCR y técnicas de biología molecular convencional (Sambrook y col. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press), una construcción de expresión de mamífero se generó de forma que la secuencia codificante para el péptido señal de IFN humano se apoyara directamente contra la secuencia codificante de Fc que empieza en el primer residuo de cisteína (Cys 226, numeración EU). Tras la escisión y secreción de peptidasa señal de células de mamífero así se generó una proteína Fc con un residuo de cisteína del extremo N. Brevemente, los cebadores Using PCR and conventional molecular biology techniques (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press), a mammalian expression construct was generated so that the coding sequence for the peptide Human IFN signal will be directly supported against the Fc coding sequence that begins at the first cysteine residue (Cys 226, EU numbering). Following cleavage and secretion of mammalian cell signal peptidase thus an Fc protein was generated with a cysteine residue of the N-terminus. Briefly, the primers

IFNa-Sig-F (IFNa-Sig-F: 5'-GCTACTGCAGCCACCATGGCCTTGACCTT TGCTTTAC-3')(SEQ ID NO:71) y Cys-Fc-R (5'-CAGTTCCGGAGCTGGGCACGGCGGAGAGCCCACAGAGCAGCTTG-3') (SEQ ID Nº: 72) se usaron en una reacción de PCR para crear un fragmento que enlazara la secuencia señal de IFNa con el extremo N de Fc, empezando con Cys 226. 500 ng del ligante  de pED.dC.hIFN nativo se añadieron a 25 pmoles de cada cebador en una reacción de PCR con el sistema Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) según el protocolo convencional del fabricante. La reacción se llevó a cabo en un ciclador térmico MJ usando los siguientes ciclos: 94 ºC 2 minutos; 30 ciclos de (94 ºC 30 segundos, 50 ºC 30 segundos, 72 ºC 45 segundos) y finalmente 72 ºC 10 minutos. La banda de tamaño esperado (∼112 pb) se purificó en gel con un kit de extracción en gel (Qiagen, Valencia CA), se digirió con las enzimas de restricción Pstl y BspEI, se purificó en gel y se subclonó en los sitios correspondientes del ligante  de pED.dC.hIFN nativo para generar pED.dC.Cys-Fc (Figura 5). IFNa-Sig-F (IFNa-Sig-F: 5'-GCTACTGCAGCCACCATGGCCTTGACCTT TGCTTTAC-3 ') (SEQ ID NO: 71) and Cys-Fc-R (5'-CAGTTCCGGAGCTGGGCACGGCGGAGAGCCCACAGAGCAGT No. 3: 72) were used in a PCR reaction to create a fragment that linked the IFNa signal sequence to the N-terminus of Fc, starting with Cys 226. 500 ng of the native ED pED.dC.hIFN binder was added to 25 pmoles of each primer in a PCR reaction with the Expand High Fidelity system (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) according to the manufacturer's conventional protocol. The reaction was carried out in an MJ thermal cycler using the following cycles: 94 ° C 2 minutes; 30 cycles of (94 ºC 30 seconds, 50 ºC 30 seconds, 72 ºC 45 seconds) and finally 72 ºC 10 minutes. The expected size band (12112 bp) was gel purified with a gel extraction kit (Qiagen, Valencia CA), digested with the restriction enzymes Pstl and BspEI, gel purified and subcloned into the corresponding sites from the  binder of native pED.dC.hIFN to generate pED.dC.Cys-Fc (Figure 5).

imagen23image23

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

60 60

MES 20 mM, NaCl 20 mM, pH 6,1. El material dializado se cargó entonces sobre una columna de 1,1 x 11 cm (9,9 ml) a 150 cm/hora. Durante el lavado y la elución, la velocidad de flujo aumentó a 500 cm/hora. La columna se lavó secuencialmente con 8 volúmenes de columna de MES 20 mM, NaCl 20 mM, pH 6,1 y 8 volúmenes de columna de MES 20 mM, NaCl 40 mM, pH 6,1. La proteína unida se eluyó con MES 20 mM, NaCl 750 mM, pH 6,1. Las fracciones de elución que contienen el pico de proteína se reunieron y se esterilizaron por filtración a través de un disco de filtro de 0,2 µm antes del almacenamiento a -80 ºC. 20 mM MONTH, 20 mM NaCl, pH 6.1. The dialyzed material was then loaded onto a 1.1 x 11 cm (9.9 ml) column at 150 cm / hour. During washing and elution, the flow rate increased to 500 cm / hour. The column was washed sequentially with 8 column volumes of 20 mM MES, 20 mM NaCl, pH 6.1 and 8 column volumes of 20 mM MES, 40 mM NaCl, pH 6.1. The bound protein was eluted with 20 mM MES, 750 mM NaCl, pH 6.1. Elution fractions containing the protein peak were pooled and sterilized by filtration through a 0.2 µm filter disc before storage at -80 ° C.

Se usó una columna de afinidad de MAB anti-FLAG para separar dímeros quiméricos de Fc con HFVII fusionado a ambas moléculas de Fc de aquellas con un péptido FLAG y una fusión de HFVII. El conjunto Unosphere S Eluate se diluyó 1:1 con Tris 20 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 8, y se cargó sobre una columna de Sepharose de 1,6 x 5 cm M2 anti-FLAG (Sigma Corp., St. Louis, MO) a una velocidad de flujo lineal de 60 cm/hora. La carga se dirigió a < 2,5 mg de híbrido de monómero-dímero /ml de volumen de columna. Después de cargar la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de Tris 20 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 8,0, los híbridos de monómero-dímero se eluyeron entonces con glicina 100 mM, pH 3,0. Las fracciones de elución que contenían el pico de proteína se neutralizaron entonces añadiendo 1 parte de Tris-HCl 1 M, pH 8, a 10 partes de fracción eluida. Los conjuntos se almacenaron a -80 ºC. An anti-FLAG MAB affinity column was used to separate Fc chimeric dimers with HFVII fused to both Fc molecules from those with a FLAG peptide and an HFVII fusion. The Unosphere S Eluate assembly was diluted 1: 1 with 20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 8, and loaded onto a 1.6 x 5 cm M2 anti-FLAG Sepharose column (Sigma Corp., St. Louis, MO) at a linear flow rate of 60 cm / hour. The load was directed at <2.5 mg of monomer-dimer hybrid / ml column volume. After loading the column, it was washed with 5 column volumes of 20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH 8.0, the monomer-dimer hybrids were then eluted with 100 mM glycine, pH 3.0. Elution fractions containing the protein peak were then neutralized by adding 1 part of 1M Tris-HCl, pH 8, to 10 parts of eluted fraction. The sets were stored at -80 ° C.

Ejemplo 14: Expresión y purificación de homodímero e híbrido de monómero-dímero de factor IX-Fc Example 14: Expression and purification of homodimer and hybrid of monomer-dimer factor IX-Fc

Se establecieron células CHO DG-44 que expresan factor IX-Fc. Se sembraron células DG44 en placas de Petri de cultivo de tejido de 100 mm y se cultivaron a una confluencia del 50%-60%. Se usó un total de 10 µg de ADN para transfectar una placa de 100 mm: para la transfección del homodímero se usaron 8 µg de pED.dC.factor IX-Fc + 2 µg de pcDNA6-PACE; para la transfección del híbrido de monómero-dímero se usaron 8 µg de pED.dC.factor IX-Fc CHO DG-44 cells expressing factor IX-Fc were established. DG44 cells were seeded in 100 mm tissue culture Petri dishes and grown at a confluence of 50% -60%. A total of 10 µg of DNA was used to transfect a 100 mm plate: 8 µg of pED.dC.factor IX-Fc + 2 µg of pcDNA6-PACE was used for transfection of the homodimer; 8 µg pED.dC.factor IX-Fc was used for transfection of the monomer-dimer hybrid

+ 1 µg de pcDNA3-Flag-Fc + 1 µg de pcDNA6-PACE. Las células se transfectaron como se describe en el manual del reactivo de transfección Superfect (Qiagen, Valencia, CA). El medio se eliminó de la transfección después de 48 horas y se sustituyó con MEM Alfa sin nucleósidos más 5% de suero bovino fetal dializado y 10 µg/ml de blasticidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) para ambas transfecciones, mientras que la transfección del híbrido de monómero-dímero también se complementó con 0,2 mg/ml de geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 3 días, las células se liberaron de la placa con 0,25% de tripsina y se transfirieron a matraces de cultivo de tejido T25, y la selección continuó durante 10-14 días hasta que las células empezaron a crecer bien a medida que se establecieron líneas celulares estables. La expresión de proteína se amplificó posteriormente mediante la adición de metrotrexato 10 nM + 1 µg of pcDNA3-Flag-Fc + 1 µg of pcDNA6-PACE. The cells were transfected as described in the Superfect transfection reagent manual (Qiagen, Valencia, CA). The medium was removed from the transfection after 48 hours and replaced with MEM alpha without nucleosides plus 5% dialyzed fetal bovine serum and 10 µg / ml blasticidine (Invitrogen, Carlsbad, CA) for both transfections, while transfection of the Monomer-dimer hybrid was also supplemented with 0.2 mg / ml of geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA). After 3 days, the cells were released from the plate with 0.25% trypsin and transferred to T25 tissue culture flasks, and the selection continued for 10-14 days until the cells began to grow well as stable cell lines were established. Protein expression was subsequently amplified by the addition of 10 nM metrotrexate.

o 100 nM para el homodímero o híbrido de monómero-dímero, respectivamente. or 100 nM for the monomer-dimer homodimer or hybrid, respectively.

Para ambas líneas celulares se usaron aproximadamente 2 x 107 células para inocular 300 ml de medio de crecimiento en una botella rotatoria de 1700 cm2 (Coming, Coming, NY) complementado con 5 µg/L de vitamina K3 (menadiona bisulfito de sodio) (Sigma, St. Louis, MO). Las botellas rotatorias se incubaron en 5% de CO2 a 37 ºC durante aproximadamente 72 horas. El medio de crecimiento se intercambió con 300 ml de medio de producción libre de suero (DMEM/F12 con 5 µg/ml de insulina bovina y 10 µg/ml de gentamicina) complementado con 5 µg/L de vitamina K3. El medio de producción (medio acondicionado) se recogió cada día durante 10 días y se guardó a 4 ºC. Se añadió medio de producción fresco a las botellas rotatorias después de cada recogida y las botellas se devolvieron a la estufa de incubación. Antes de la cromatografía, el medio se clarificó usando un filtro SuporCap-100 (0,8/0,2 µm) (Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). Todas las siguientes etapas se realizaron a 4 ºC. El medio clarificado se aplicó a proteína A-Sepharose, se lavó con 5 volúmenes de columna de 1X PBS (fosfato 10 mM, pH 7,4, KCl 2,7 mM y NaCl 137 mM), se eluyó con glicina 0,1 M, pH 2,7, y luego se neutralizó con 1/10 volumen de Tris-HCl 1 M, pH 9,0. La proteína se dializó entonces en PBS. For both cell lines, approximately 2 x 107 cells were used to inoculate 300 ml of growth medium in a 1700 cm2 rotary bottle (Coming, Coming, NY) supplemented with 5 µg / L of vitamin K3 (menadione bisulphite sodium) (Sigma , St. Louis, MO). Rotary bottles were incubated in 5% CO2 at 37 ° C for approximately 72 hours. The growth medium was exchanged with 300 ml of serum-free production medium (DMEM / F12 with 5 µg / ml of bovine insulin and 10 µg / ml of gentamicin) supplemented with 5 µg / L of vitamin K3. The production medium (conditioned medium) was collected every day for 10 days and stored at 4 ° C. Fresh production medium was added to the rotary bottles after each collection and the bottles were returned to the incubation oven. Prior to chromatography, the medium was clarified using a SuporCap-100 filter (0.8 / 0.2 µm) (Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). All the following steps were performed at 4 ° C. The clarified medium was applied to A-Sepharose protein, washed with 5 column volumes of 1X PBS (10 mM phosphate, pH 7.4, 2.7 mM KCl and 137 mM NaCl), eluted with 0.1 M glycine , pH 2.7, and then neutralized with 1/10 volume of 1M Tris-HCl, pH 9.0. The protein was then dialyzed in PBS.

La muestra de proteína de transfección del híbrido de monómero-dímero se sometió a más purificación, ya que contuvo una mezcla de homodímero de FIX-Fc:FIX-Fc, híbrido de monómero-dímero de FIX-Fc:Flag-Fc y homodímero de Flag-Fc:Flag-Fc. El material se concentró y se aplicó a una columna de 2,6 cm x 60 cm (318 ml) Superdex 200 Prep Grade a una velocidad de flujo de 4 ml/minuto (36 cm/hora) y luego se eluyó con 3 volúmenes de columna de 1X PBS. Las fracciones correspondientes a dos picos en el detector de UV se recogieron y se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones del primer pico contuvieron tanto homodímero de FIX-Fc:FIX-Fc como híbrido de monómero-dímero de FIX-Fc:Flag-Fc, mientras que el segundo pico contuvo homodímero de Flag-Fc:Flag-Fc. Todas las fracciones que contenían el híbrido de monómero-dímero, pero no el homodímero de Flag-Fc, se reunieron y se aplicaron directamente a una columna de Sepharose de 1,6 x 5 cm M2 anti-FLAG (Sigma Corp., St. Louis, MO) a una velocidad de flujo lineal de 60 cm/hora. Después de la carga, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de PBS. Los híbridos de monómero-dímero se eluyeron entonces con glicina 100 mM, pH 3,0. Las fracciones de elución que contenían la proteína pico se neutralizaron entonces añadiendo 1/10 volumen de Tris-HCl 1 M y se analizaron por SDS-PAGE reductora y no reductora. Las fracciones se dializaron en PBS, se concentraron a 1-5 mg/ml y se guardaron a -80 ºC. The transfection protein sample of the monomer-dimer hybrid underwent further purification, as it contained a mixture of FIX-Fc homodimer: FIX-Fc, FIX-Fc monomer-dimer hybrid: Flag-Fc and homodimer of Flag-Fc: Flag-Fc. The material was concentrated and applied to a 2.6 cm x 60 cm (318 ml) Superdex 200 Prep Grade column at a flow rate of 4 ml / minute (36 cm / hour) and then eluted with 3 volumes of 1X PBS column. Fractions corresponding to two peaks in the UV detector were collected and analyzed by SDS-PAGE. The fractions of the first peak contained both FIX-Fc: FIX-Fc homodimer and FIX-Fc: Flag-Fc monomer dimer hybrid, while the second peak contained Flag-Fc: Flag-Fc homodimer. All fractions containing the monomer-dimer hybrid, but not the Flag-Fc homodimer, were pooled and applied directly to a 1.6 x 5 cm M2 anti-FLAG Sepharose column (Sigma Corp., St. Louis, MO) at a linear flow rate of 60 cm / hour. After loading, the column was washed with 5 column volumes of PBS. The monomer-dimer hybrids were then eluted with 100 mM glycine, pH 3.0. Elution fractions containing the peak protein were then neutralized by adding 1/10 volume of 1M Tris-HCl and analyzed by reducing and non-reducing SDS-PAGE. The fractions were dialyzed in PBS, concentrated at 1-5 mg / ml and stored at -80 ° C.

Ejemplo 15: Expresión y purificación de homodímero e híbrido de monómero-dímero de IFN Example 15: Expression and purification of IFN monomer-dimer homodimer and hybrid

Se establecieron células CHO DG-44 que expresan hIFN. Células DG44 se sembraron en placas de Petri de cultivo de tejido de 100 mm y se cultivaron a una confluencia del 50%-60%. Se usó un total de 10 µg de ADN para transfectar una placa de 100 mm: para la transfección del homodímero 10 µg de las construcciones de hIFN-Fc; para la transfección del híbrido de monómero-dímero 8 µg de las construcciones de hIFN-Fc + 2 µg de pcDNA3CHO DG-44 cells expressing hIFN were established. DG44 cells were seeded in 100 mm tissue culture Petri dishes and grown at a confluence of 50% -60%. A total of 10 µg of DNA was used to transfect a 100 mm plate: for the transfection of the 10 µg homodimer of the hIFN-Fc constructs; for the transfection of the 8 µg monomer-dimer hybrid of the hIFN-Fc + 2 µg pcDNA3 constructs

imagen24image24

imagen25image25

5 5

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

centrifugación a temperatura ambiente a una velocidad de 1268 x g. Las muestras de plasma se ensayaron tanto frescas como congeladas a 20 ºC. El híbrido de monómero-dímero dosificado por vía oral produjo concentraciones en suero máximas (Cmáx) significativamente mayores en comparación con el factor VII homodimérico (Figura 8). centrifugation at room temperature at a speed of 1268 x g. Plasma samples were tested both fresh and frozen at 20 ° C. The orally dosed monomer-dimer hybrid produced significantly higher serum concentrations (Cmax) compared to homodimeric factor VII (Figure 8).

Ejemplo 22: Dosificación oral de ratas neonatas con factor IX-Fc Example 22: Oral dosing of neonatal rats with factor IX-Fc

Ratas neonatas Sprague-Dawley de diez días de edad se dosificaron p.o. con 200 µl de homodímero de FIX-Fc o híbrido de monómero-dímero de FIX-Fc:Flag-Fc a dosis aproximadamente equimolares de 10 nmol/kg en tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,5 que contiene 5 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja y 0,9% de NaCl. A 1, 2, 4, 8, 24, 48 y 72 horas después de la inyección, los animales se sacrificaron con CO2, se extrajo sangre mediante punción cardíaca y se obtuvo plasma mediante la adición de una disolución al 3,8% de citrato de sodio y centrifugación a temperatura ambiente a una velocidad de 1268 x g. Las muestras se sedimentaron entonces por centrifugación, se recogió el suero y se congeló a -20 ºC hasta el análisis de las proteínas de fusión por ELISA. Ten-day-old Sprague-Dawley newborn rats were dosed p.o. with 200 µl of FIX-Fc homodimer or FIX-Fc monomer dimer hybrid: Flag-Fc at approximately equimolar doses of 10 nmol / kg in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.5 containing 5 mg / ml of soy trypsin inhibitor and 0.9% NaCl. At 1, 2, 4, 8, 24, 48 and 72 hours after injection, the animals were sacrificed with CO2, blood was drawn by cardiac puncture and plasma was obtained by adding a 3.8% citrate solution of sodium and centrifugation at room temperature at a speed of 1268 x g. The samples were then pelleted by centrifugation, the serum was collected and frozen at -20 ° C until analysis of the fusion proteins by ELISA.

Ejemplo 23: ELISA de factor IX-Fc Example 23: Factor IX-Fc ELISA

Una placa de ELISA Immulon 4HBX de 96 pocillos (Thermo LabSystems, Vantaa, Finlandia) se recubrió con 100 µl/pocillo de IgG de cabra anti-factor IX (Affinity Biologicals, Ancaster, Canadá) diluida 1:100 en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas o durante la noche a 4 ºC cerradas con película de plástico. Los pocillos se lavaron 4 veces con PBST, 300 µl/pocillo usando el lavador de placas TECAN. Los pocillos se bloquearon con PBST + 6% de BSA, 200 µl/pocillo, y se incubaron 90 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 4 veces con PBST, 300 µl/pocillo usando el lavador de placas TECAN. Los patrones y muestras de sangre de ratas descritos en el Ejemplo 18 se añadieron a los pocillos (100 µl/pocillo) y se incubaron 90 minutos a temperatura ambiente. Las muestras y patrones se diluyeron en tampón HBET (HBET: 5,95 g de HEPES, 1,46 g de NaCl, 0,93 g de Na2EDTA, 2,5 g de albúmina de suero bovino, 0,25 ml de Tween-20, llevar a 250 ml con dH2O, ajustar a pH 7,2). El intervalo de la curva patrón fue de 200 ng/ml a 0,78 ng/ml con diluciones de 2 veces entre ellas. Los pocillos se lavaron 4 veces con PBST, 300 µl/pocillo usando el lavador de placas TECAN. A cada pocillo se añadieron 100 µl/pocillo de anticuerpo de cabra anti-IgG humana-Fc-HARP conjugado (Pierce, Rockford, IL) diluido en HBET 1:25.000. Las placas se incubaron 90 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 4 veces con PBST, 300 µl/pocillo usando el lavador de placas TECAN. Las placas se revelaron con 100 µl/pocillo de sustrato de peroxidasa de tetrametilbencidina (TMB) (Pierce, Rockford, IL) añadido según las instrucciones del fabricante. Las placas se incubaron 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad o hasta que se reveló el color. La reacción se detuvo con 100 µl/pocillo de ácido sulfúrico 2 M. La absorbancia se leyó a 450 nm en el lector SpectraMax plusplate (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). El análisis de sangre extraído a las 4 horas indicó una diferencia de más de 10 veces en la concentración en suero entre híbridos de monómero-dímero de factor IX-Fc en comparación con homodímeros de factor IX-Fc (Figura 9). Los resultados indicaron que los niveles de híbrido de monómero-dímero de factor IX-Fc fueron coherentemente superiores a los de homodímeros del factor IX-Fc (Figura 10). A 96-well Immulon 4HBX ELISA plate (Thermo LabSystems, Vantaa, Finland) was coated with 100 µl / well of goat anti-factor IX IgG (Affinity Biologicals, Ancaster, Canada) diluted 1: 100 in 50 mM carbonate buffer, pH 9.6. The plates were incubated at room temperature for 2 hours or overnight at 4 ° C closed with plastic film. The wells were washed 4 times with PBST, 300 µl / well using the TECAN plate washer. The wells were blocked with PBST + 6% BSA, 200 µl / well, and incubated 90 minutes at room temperature. The wells were washed 4 times with PBST, 300 µl / well using the TECAN plate washer. The rat blood standards and samples described in Example 18 were added to the wells (100 µl / well) and incubated 90 minutes at room temperature. Samples and standards were diluted in HBET buffer (HBET: 5.95 g of HEPES, 1.46 g of NaCl, 0.93 g of Na2EDTA, 2.5 g of bovine serum albumin, 0.25 ml of Tween- 20, bring to 250 ml with dH2O, adjust to pH 7.2). The range of the standard curve was from 200 ng / ml to 0.78 ng / ml with 2-fold dilutions between them. The wells were washed 4 times with PBST, 300 µl / well using the TECAN plate washer. 100 µl / well of goat anti-human IgG-conjugated Fc-HARP antibody (Pierce, Rockford, IL) diluted in HBET 1: 25,000 was added to each well. The plates were incubated 90 minutes at room temperature. The wells were washed 4 times with PBST, 300 µl / well using the TECAN plate washer. Plates were developed with 100 µl / well of tetramethylbenzidine peroxidase substrate (TMB) (Pierce, Rockford, IL) added according to the manufacturer's instructions. The plates were incubated 5 minutes at room temperature in the dark or until the color was revealed. The reaction was stopped with 100 µl / well of 2 M sulfuric acid. The absorbance was read at 450 nm in the SpectraMax plusplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Analysis of blood taken at 4 hours indicated a difference of more than 10 times in serum concentration between monomer-dimer hybrids of factor IX-Fc compared to homodimers of factor IX-Fc (Figure 9). The results indicated that the levels of factor IX-Fc monomer dimer hybrid were consistently higher than those of factor IX-Fc homodimers (Figure 10).

Ejemplo 24: Clonación de Epo-Fc Example 24: Cloning of Epo-Fc

Se obtuvo la región codificante de Epo madura por amplificación por PCR de un plásmido que codifica la secuencia codificante de eritropoyetina madura, originalmente obtenida por RT-PCR de ARNm de Hep G2, y cebadores hepoxba-F y hepoeco-R, indicados más adelante. El cebador hepoxba-F contiene un sitio Xbal, mientras que el cebador hepoeco-R contiene un sitio EcoRI. La PCR se llevó a cabo en el Idaho Technology RapidCycler usando Vent polimerasa, desnaturalizando a 95 ºC durante 15 segundos, seguido de 28 ciclos con una pendiente de 6,0 de 95 ºC durante 0 segundos, 55 ºC durante 0 segundos y 72 ºC durante 1 minuto 20 segundos, seguido de extensión de 3 minutos a 72 ºC. Un producto de aproximadamente 514 pb se purificó en gel, se digirió con XbaI y EcoRI, se purificó en gel de nuevo y se subclonó direccionalmente en un vector pED.dC.XFc purificado en gel digerido con XbaI/EcoRI, mencionado anteriormente. Esta construcción se llamó pED.dC.Epo-Fc. The mature Epo coding region was obtained by PCR amplification of a plasmid encoding the mature erythropoietin coding sequence, originally obtained by RT-PCR of Hep G2 mRNA, and hepoxba-F and hepoeco-R primers, indicated below. The hepoxba-F primer contains an Xbal site, while the hepoeco-R primer contains an EcoRI site. PCR was carried out in the Idaho Technology RapidCycler using Vent polymerase, denaturing at 95 ° C for 15 seconds, followed by 28 cycles with a slope of 6.0 of 95 ° C for 0 seconds, 55 ° C for 0 seconds and 72 ° C for 1 minute 20 seconds, followed by extension of 3 minutes at 72 ° C. A product of approximately 514 bp was gel purified, digested with XbaI and EcoRI, gel purified again and directionally subcloned into a gel-purified pED.dC.XFc vector digested with XbaI / EcoRI, mentioned above. This construction was called pED.dC.Epo-Fc.

La secuencia de Epo, que contiene tanto el péptido señal endógeno como la secuencia madura, se obtuvo por amplificación por PCR usando una preparación de ADNc del clon QUICK de riñón adulto como molde y cebadores Epo+Pep-Sbf-F y Epo+Pep-Sbf-R, descritos más adelante. El cebador Epo+Pep-Sbf-F contiene un sitio SbfI en la dirección 5' del codón de iniciación, mientras que el cebador Epo+Pep-Sbf-R se hibrida en la dirección 3' del sitio SbfI endógeno en la secuencia Epo. La reacción de PCR se llevó a cabo en el ciclador térmico PTC-200 MJ usando Expand polimerasa, desnaturalizando a 94 ºC durante 2 minutos, seguido de 32 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 57 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 45 segundos, seguido de una extensión de 10 minutos a 72 ºC. Un producto de aproximadamente 603 pb se aisló en gel y se subclonó en el vector pGEM-T Easy. La secuencia codificante correcta se escindió por digestión con SbfI, se purificó en gel y se clonó en el plásmido pED.dC.Epo-Fc digerido con PstI, tratado con fosfatasa alcalina de gamba (SAP) y purificado en gel. El plásmido con el inserto en la orientación correcta se determinó inicialmente por digestión con Kpnl. Una digestión Xmnl y Pvull de esta construcción se comparó con pED.dC.Epo-Fc y se confirmó que estaba en la orientación correcta. La secuencia se determinó y la construcción se llamó pED.dC.natEpo-Fc. Cebadores de PCR: The Epo sequence, which contains both the endogenous signal peptide and the mature sequence, was obtained by PCR amplification using a cDNA preparation of the adult kidney QUICK clone as a template and primers Epo + Pep-Sbf-F and Epo + Pep- Sbf-R, described below. The Epo + Pep-Sbf-F primer contains an SbfI site in the 5 'direction of the initiation codon, while the Epo + Pep-Sbf-R primer hybridizes in the 3' direction of the endogenous SbfI site in the Epo sequence. The PCR reaction was carried out in the PTC-200 MJ thermal cycler using Expand Polymerase, denaturing at 94 ° C for 2 minutes, followed by 32 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 57 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 45 seconds. , followed by a 10 minute extension at 72 ° C. A product of approximately 603 bp was gel isolated and subcloned into the pGEM-T Easy vector. The correct coding sequence was cleaved by digestion with SbfI, gel purified and cloned into the plasmid pED.dC. Epo-Fc digested with PstI, treated with shrimp alkaline phosphatase (SAP) and gel purified. The plasmid with the insert in the correct orientation was initially determined by digestion with Kpnl. An Xmnl and Pvull digestion of this construct was compared with pED.dC.Epo-Fc and it was confirmed that it was in the correct orientation. The sequence was determined and the construction was called pED.dC.natEpo-Fc. PCR primers:

hepoxba-F (EPO-F): 5'-AATCTAGAGCCCCACCACGCCTCATCTGTGAC-3' (SEQ ID Nº: 75) hepoxba-F (EPO-F): 5'-AATCTAGAGCCCCACCACGCCTCATCTGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 75)

imagen26image26

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

Ejemplo 26: Expresión y purificación de homodímero e híbrido de monómero-dímero de EPO-Fc Example 26: Expression and purification of EPO-Fc monomer-dimer homodimer and hybrid

Células DG44 se sembraron en placas de Petri de cultivo de tejido de 100 mm y se cultivaron a una confluencia del 50%-60%. Un total de 10 µg de ADN se usó para transfectar una placa de 100 mm: para la transfección del homodímero 10 µg de pED.dC.EPO-Fc; para la transfección del híbrido de monómero-dímero 8 µg de pED.dC.EPO-Fc + 2 µg de pcDNA3-Flag-Fc. Las construcciones usadas se clonaron como se describe en el Ejemplo 24. El procedimiento de clonación descrito en el Ejemplo 25 también podría usarse para obtener construcciones para su uso en este ejemplo. Las células se transfectaron como se describe en el manual del reactivo de transfección Superfect (Qiagen, Valencia, CA). Alternativamente, pED.dC.EPO-Fc se cotransfectó con pSYN-Fc-016 para preparar un monómero sin marcar. El medio se eliminó de la transfección después de 48 horas y se sustituyó con MEM Alfa sin nucleósidos más 5% de suero bovino fetal dializado para ambas transfecciones, mientras que la transfección del híbrido de monómero-dímero también se complementó con 0,2 mg/ml de geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 3 días, las células se liberaron de la placa con 0,25% de tripsina y se transfirieron a matraces de cultivo de tejido T25, y la selección continuó durante 10-14 días hasta que las células empezaron a crecer bien a medida que se establecieron líneas celulares estables. La expresión de proteína se amplificó posteriormente mediante la adición de metrotrexato. DG44 cells were seeded in 100 mm tissue culture Petri dishes and grown at a confluence of 50% -60%. A total of 10 µg of DNA was used to transfect a 100 mm plate: for the transfection of the 10 µg homodimer of pED.dC.EPO-Fc; for the transfection of the monomer-dimer hybrid 8 µg of pED.dC.EPO-Fc + 2 µg of pcDNA3-Flag-Fc. The constructs used were cloned as described in Example 24. The cloning procedure described in Example 25 could also be used to obtain constructs for use in this example. The cells were transfected as described in the Superfect transfection reagent manual (Qiagen, Valencia, CA). Alternatively, pED.dC.EPO-Fc was co-transfected with pSYN-Fc-016 to prepare an unlabeled monomer. The medium was removed from the transfection after 48 hours and replaced with MEM Alpha without nucleosides plus 5% dialyzed fetal bovine serum for both transfections, while transfection of the monomer-dimer hybrid was also supplemented with 0.2 mg / ml of geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA). After 3 days, the cells were released from the plate with 0.25% trypsin and transferred to T25 tissue culture flasks, and the selection continued for 10-14 days until the cells began to grow well as stable cell lines were established. Protein expression was subsequently amplified by the addition of metrotrexate.

Para ambas líneas celulares, aproximadamente 2 x 107 células se usaron para inocular 300 ml de medio de crecimiento en una botella rotatoria de 1700 cm2 (Corning, Coming, NY). Las botellas rotatorias se incubaron en 5% de CO2 a 37 ºC durante aproximadamente 72 horas. El medio de crecimiento se intercambió con 300 ml de medio de producción libre de suero (DMEM/F12 con 5 µg/ml de insulina bovina y 10 µg/ml de gentamicina). El medio de producción (medio acondicionado) se recogió cada día durante 10 días y se guardó a 4 ºC. Se añadió medio de producción fresco a las botellas rotatorias después de cada recogida y las botellas se devolvieron a la estufa de incubación. Antes de la cromatografía, el medio se clarificó usando un filtro SuporCap-100 (0,8/0,2 µm) de Pall Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). Todas las siguientes etapas se realizaron a 4 ºC. El medio clarificado se aplicó a proteína A-Sepharose, se lavó con 5 volúmenes de columna de 1X PBS (fosfato 10 mM, pH 7,4, KCl 2,7 mM y NaCl 137 mM), se eluyó con glicina 0,1 M, pH 2,7, y luego se neutralizó con 1/10 volumen de Tris-HCl 1 M, pH 9,0. La proteína se dializó entonces en PBS. For both cell lines, approximately 2 x 107 cells were used to inoculate 300 ml of growth medium in a 1700 cm2 rotary bottle (Corning, Coming, NY). Rotary bottles were incubated in 5% CO2 at 37 ° C for approximately 72 hours. The growth medium was exchanged with 300 ml of serum-free production medium (DMEM / F12 with 5 µg / ml of bovine insulin and 10 µg / ml of gentamicin). The production medium (conditioned medium) was collected every day for 10 days and stored at 4 ° C. Fresh production medium was added to the rotary bottles after each collection and the bottles were returned to the incubation oven. Prior to chromatography, the medium was clarified using a SuporCap-100 filter (0.8 / 0.2 µm) from Pall Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). All the following steps were performed at 4 ° C. The clarified medium was applied to A-Sepharose protein, washed with 5 column volumes of 1X PBS (10 mM phosphate, pH 7.4, 2.7 mM KCl and 137 mM NaCl), eluted with 0.1 M glycine , pH 2.7, and then neutralized with 1/10 volume of 1M Tris-HCl, pH 9.0. The protein was then dialyzed in PBS.

La muestra de proteína de transfección del híbrido de monómero-dímero se sometió a más purificación, ya que contuvo una mezcla de homodímero de EPO-Fc:EPO-Fc, híbrido de monómero-dímero EPO-Fc:Flag-Fc y homodímero de Flag-Fc:Flag-Fc. El material se concentró y se aplicó a una columna de 2,6 cm x 60 cm (318 ml) Superdex 200 Prep Grade a una velocidad de flujo de 4 ml/min (36 cm/hora) y luego se eluyó con 3 volúmenes de columna de 1X PBS. Las fracciones correspondientes a dos picos en el detector de UV se recogieron y se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones del primer pico contuvieron tanto homodímero de EPO-Fc:EPO-Fc como híbrido de monómero-dímero de EPO-Fc:Flag-Fc, mientras que el segundo pico contuvo homodímero de Flag-Fc:Flag-Fc. Todas las fracciones que contienen el híbrido de monómero-dímero, pero no el homodímero de Flag-Fc, se reunieron y se aplicaron directamente a una columna de Sepharose 1,6 x 5 cm M2 anti-FLAG (Sigma Corp.) a una velocidad de flujo lineal de 60 cm/hora. Después de la carga la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de PBS. Los híbridos de monómero-dímero se eluyeron entonces con glicina 100 mM, pH 3,0. Las fracciones de elución que contenían el pico de proteína se neutralizaron entonces añadiendo 1/10 volumen de Tris-HCl 1 M, y se analizaron por SDS-PAGE reductora y no reductora. Las fracciones se dializaron en PBS, se concentraron a 1-5 mg/ml y se guardaron a -80 ºC. The transfection protein sample of the monomer-dimer hybrid underwent further purification, as it contained a mixture of EPO-Fc homodimer: EPO-Fc, EPO-Fc: flag-Fc monomer-dimer hybrid and Flag homodimer -Fc: Flag-Fc. The material was concentrated and applied to a 2.6 cm x 60 cm (318 ml) Superdex 200 Prep Grade column at a flow rate of 4 ml / min (36 cm / hour) and then eluted with 3 volumes of 1X PBS column. Fractions corresponding to two peaks in the UV detector were collected and analyzed by SDS-PAGE. The fractions of the first peak contained both EPO-Fc: EPO-Fc homodimer and EPO-Fc: Flag-Fc monomer dimer hybrid, while the second peak contained Flag-Fc: Flag-Fc homodimer. All fractions containing the monomer-dimer hybrid, but not the Flag-Fc homodimer, were pooled and applied directly to a 1.6 x 5 cm M2 anti-FLAG Sepharose column (Sigma Corp.) at a rate of linear flow of 60 cm / hour. After loading the column was washed with 5 column volumes of PBS. The monomer-dimer hybrids were then eluted with 100 mM glycine, pH 3.0. Elution fractions containing the protein peak were then neutralized by adding 1/10 volume of 1M Tris-HCl, and analyzed by reducing and non-reducing SDS-PAGE. The fractions were dialyzed in PBS, concentrated at 1-5 mg / ml and stored at -80 ° C.

Alternativamente, las fracciones del primer pico de Superdex 200 se analizaron por SDS-PAGE, y solo fracciones que contenían una mayoría de híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc, con una minoría de homodímero de Epo-Fc, se reunieron. Este conjunto, enriquecido para el híbrido de monómero-dímero, se volvió a aplicar a una columna Superdex 200 y luego se reunieron las fracciones que contenían solo híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc, se dializaron y se guardaron como proteína purificada. Obsérvese que este procedimiento de purificación alternativo también podría usarse para purificar híbridos de monómero-dímero no marcados. Alternatively, the fractions of the first peak of Superdex 200 were analyzed by SDS-PAGE, and only fractions containing a majority of Epo-Fc monomer dimer hybrid, with a minority of Epo-Fc homodimer, were pooled. This set, enriched for the monomer dimer hybrid, was reapplied to a Superdex 200 column and then fractions containing only Epo-Fc monomer dimer hybrid were pooled, dialyzed and stored as purified protein. Note that this alternative purification procedure could also be used to purify unlabelled monomer-dimer hybrids.

Ejemplo 27: Administración de dímero e híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc con un ligante de ocho aminoácidos a monos cinomolgos Example 27: Administration of dimer and hybrid of Epo-Fc monomer-dimer with an eight amino acid binder to cynomolgus monkeys

Para administración pulmonar, aerosoles de tanto proteínas del dímero de Epo-Fc como del híbrido de monómerodímero de Epo-Fc (ambas con el ligante de 8 aminoácidos) en PBS, pH 7,4 se crearon con el nebulizador Aeroneb Pro™ (AeroGen, Mountain View, CA), en línea con un respirador de Bird Mark 7A, y se administraron a monos cinomolgos sin tratamiento previo anestesiados mediante tubos endotraqueales (que se aproximan a la respiración tidal normal). Ambas proteínas también se administraron a monos cinomolgos sin tratamiento previo mediante inyección intravenosa. Las muestras se tomaron en diversos momentos de tiempo, y la cantidad de proteína que contiene Epo en el plasma resultante se cuantificó usando Quantikine IVD Human Epo Immunoassay (R&D Systems, Mineápolis, MN). Los parámetros farmacocinéticos se calcularon usando el software WinNonLin. La Tabla 4 presenta los resultados de biodisponibilidad de monos cinomolgos tratados con el híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc o el dímero de Epo-Fc. For pulmonary administration, aerosols of both Epo-Fc dimer proteins and Epo-Fc monomer dimer (both with the 8 amino acid binder) in PBS, pH 7.4 were created with the Aeroneb Pro ™ nebulizer (AeroGen, Mountain View, CA), in line with a Bird Mark 7A respirator, and cynomolgus monkeys were administered without prior treatment anesthetized by endotracheal tubes (which approximate normal tidal breathing). Both proteins were also administered to cynomolgus monkeys without prior treatment by intravenous injection. Samples were taken at various times, and the amount of Epo-containing protein in the resulting plasma was quantified using Quantikine IVD Human Epo Immunoassay (R&D Systems, Minneapolis, MN). Pharmacokinetic parameters were calculated using WinNonLin software. Table 4 presents the bioavailability results of cynomolgus monkeys treated with the Epo-Fc monomer-dimer hybrid or the Epo-Fc dimer.

TABLA 4: ADMINISTRACIÓN DEL HÍBRIDO DE MONÓMERO-DÍMERO DE EPO-FC Y DÍMERO DE EPO-FC A TABLE 4: EPO-FC MONÓMERO-DÍMERO HYBRID ADMINISTRATION AND EPO-FC DIMERO A

MONOS MONKEYS

Proteína Protein
Mono nº Vía Dosis depositada aprox.1 (µg/kg) Cmáx (ng/ml) Cmáx (fmol/ml) t1/2 (h) t1/2 prom(h) Monkey No. Via Dose deposited approx. 1 (µg / kg) Cmax (ng / ml) Cmax (fmol / ml) t1 / 2 (h) t1 / 2 avg (h)

Híbrido de monómerodímero de Epo-Fc Epo-Fc monomer dimer hybrid
CO6181 pulm 20 72,3 1014 23,6 25,2 CO6181 pulm twenty 72.3 1014 23.6 25.2

CO6214 CO6214
pulm 20 50,1 703 23,5 pulm twenty 50.1 703 23.5

CO7300 CO7300
pulm 20 120 1684 36,2 pulm twenty 120 1684 36.2

CO7332 CO7332
pulm 20 100 1403 17,5 pulm twenty 100 1403 17.5

CO7285 CO7285
IV 25 749 10508 21,3 22,6 IV 25 749 10508 21.3 22.6

CO7288 CO7288
IV 25 566 7941 23 IV 25 566 7941 2. 3

CO7343 CO7343
IV 25 551 1014 23,5 IV 25 551 1014 23.5

Dímero de Epo-Fc Epo-Fc dimer
DD026 pulm 15 10,7 120 11,5 22,1 DD026 pulm fifteen 10.7 120 11.5 22.1

DD062 DD062
pulm 15 21,8 244 27,3 pulm fifteen 21.8 244 27.3

DD046 DD046
pulm 15 6,4 72 21,8 pulm fifteen 6.4 72 21.8

DD015 DD015
pulm 15 12,8 143 20,9 pulm fifteen 12.8 143 20.9

DD038 DD038
pulm 35 27 302 29 pulm 35 27 302 29

F4921 F4921
IV 150 3701 41454 15,1 14,6 IV 150 3701 41454 15.1 14.6

96Z002 96Z002
IV 150 3680 41219 15,3 IV 150 3680 41219 15.3

1261CQ 1261CQ
IV 150 2726 30533 23,6 IV 150 2726 30533 23.6

127-107 127-107
IV 150 4230 47379 15,0 IV 150 4230 47379 15.0

118-22 118-22
IV 150 4500 50403 8,7 IV 150 4500 50403 8.7

126-60 126-60
IV 150 3531 39550 9,8 IV 150 3531 39550 9.8

1Basado en el 15% de fracción de deposición de dosis nebulizada como se ha determinado por escintigrafía gamma 1Based on 15% nebulized dose deposition fraction as determined by gamma scintigraphy

El porcentaje de biodisponibilidad (F) se calculó para la dosis pulmonar usando la siguiente ecuación: F = (ABC pulmonar / Dosis pulmonar) / (ABC IV / Dosis IV) * 100 The bioavailability percentage (F) was calculated for the pulmonary dose using the following equation: F = (pulmonary ABC / pulmonary dose) / (ABC IV / IV dose) * 100

TABLA 5: CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE BIODISPONIBILIDAD PARA HÍBRIDO DE MONÓMERO-DÍMERO FRENTE A DÍMERO DE EPO-FC DESPUÉS DE LA ADMINISTRACIÓN PULMONAR A MONOS CINOMOLGOS TABLE 5: CALCULATION OF THE PERFORMANCE OF BIODISPONIBILITY FOR MONOMER-DIMMER HYBRID AGAINST THE EPO-FC DIMMER AFTER THE PULMONARY ADMINISTRATION TO MONKEY-MONKEYS

SIN TRATAMIENTO PREVIO WITHOUT PRIOR TREATMENT

Proteína Protein
Mono nº Dosis depositada aprox.1 (µg/kg) ABC ng·h/ml Biodisponibilidad2 (F) Biodisponibilidad promedio Monkey No. Dose deposited approx. 1 (µg / kg) ABC ng · h / ml Bioavailability2 (F) Average bioavailability

Híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc Epo-Fc monomer dimer hybrid
CO6181 20 µg/kg 3810 25,2% 34,9% CO6181 20 µg / kg 3810 25.2% 34.9%

CO6214 CO6214
20 µg/kg 3072 20,3% 20 µg / kg 3072 20.3%

CO7300 CO7300
20 µg/kg 9525 63,0% 20 µg / kg 9525 63.0%

CO7332 CO7332
20 µg/kg 4708 31,1% 20 µg / kg 4708 31.1%

Dímero de Epo-Fc Epo-Fc dimer
DD026 15 µg/kg 361 5,1% 10,0% DD026 15 µg / kg 361 5.1% 10.0%

DD062 DD062
15 µg/kg 1392 19,6% 15 µg / kg 1392 19.6%

DD046 DD046
15 µg/kg 267 3,8% 15 µg / kg 267 3.8%

DD015 DD015
15 µg/kg 647 9,1% 15 µg / kg 647 9.1%

DD038 DD038
35 µg/kg 2062 12,4% 35 µg / kg 2062 12.4%

1 Basado en el 15% de fracción de deposición de dosis nebulizada como se ha determinado por escintigrafía gamma 2 ABC media para híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc IV = 18,913 ng·h/ml (n=3 monos), dosificado a 25 µg/kg. ABC media para dímero de Epo-Fc IV = 70,967 ng·h/ml (n=6 monos), dosificado a 150 µg/kg 1 Based on 15% nebulized dose deposition fraction as determined by gamma scintigraphy 2 ABC average for Epo-Fc IV monomer-dimer hybrid = 18,913 ng · h / ml (n = 3 monkeys), dosed at 25 µg / kg Average ABC for Epo-Fc IV dimer = 70,967 ng · h / ml (n = 6 monkeys), dosed at 150 µg / kg

5 La farmacocinética de Epo-Fc con un ligante de 8 aminoácidos administrada a monos cinomolgos se presenta en la Figura 11. La Figura compara el dímero de Epo-Fc con el híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc en monos después de la administración de una única dosis pulmonar. Basándose en una comparación molar, se obtuvieron niveles en suero significativamente grandes en monos tratados con el híbrido de monómero-dímero en comparación con el dímero. 5 The pharmacokinetics of Epo-Fc with an 8-amino acid binder administered to cynomolgus monkeys is presented in Figure 11. The Figure compares the Epo-Fc dimer with the monomer-dimer hybrid of Epo-Fc in monkeys after administration. of a single pulmonary dose. Based on a molar comparison, significantly large serum levels were obtained in monkeys treated with the monomer-dimer hybrid compared to the dimer.

10 Ejemplo 28: Administración subcutánea de híbrido de monómero-dímero de EPO-Fc 10 Example 28: Subcutaneous administration of EPO-Fc monomer dimer hybrid

Para comparar concentraciones en suero de agentes de eritropoyetina conocidos con híbridos de monómero-dímero de EPO-Fc, tanto el híbrido de monómero-dímero de EPO-Fc como Aranesp® (darbepoyetina alfa), que no es una proteína quimérica de fusión, se administraron subcutáneamente a diferentes monos y la concentración en suero de ambos se midió con el tiempo. To compare serum concentrations of known erythropoietin agents with EPO-Fc monomer dimer hybrids, both the EPO-Fc monomer dimer hybrid and Aranesp® (darbepoietin alpha), which is not a chimeric fusion protein, is administered subcutaneously to different monkeys and the serum concentration of both was measured over time.

15 Se inyectaron subcutáneamente monos cinomolgos (n = 3 por grupo) con 0,025 mg/kg de híbrido de monómerodímero de Epo-Fc. Las muestras de sangre se recogieron antes de la dosis y en momento de hasta 144 horas después de la dosis. Se preparó suero a partir de la sangre y se guardó congelado hasta el análisis por ELISA (Human Epo Quantikine Immunoassay) (R & D Systems, Mineápolis, MN). Los parámetros farmacocinéticos se determinaron usando el software WinNonLinâ® (Pharsight, Mountainview, CA). 15 Cynomolgus monkeys (n = 3 per group) were injected subcutaneously with 0.025 mg / kg of Epo-Fc monomer dimer hybrid. Blood samples were collected before the dose and at the time of up to 144 hours after the dose. Serum was prepared from the blood and kept frozen until analysis by ELISA (Human Epo Quantikine Immunoassay) (R&D Systems, Minneapolis, MN). Pharmacokinetic parameters were determined using WinNonLinâ® software (Pharsight, Mountainview, CA).

20 Los resultados indicaron que las concentraciones en suero de tanto el híbrido de monómero-dímero de EPO-Fc como Aranesp® (darbepoyetina alfa) fueron equivalentes con el tiempo, aun cuando la dosis molar administrada de Aranesp® (darbepoyetina alfa) fuera ligeramente mayor (Tabla 6) (Figura 12). 20 The results indicated that serum concentrations of both the EPO-Fc monomer dimer hybrid and Aranesp® (darbepoietin alfa) were equivalent over time, even if the administered molar dose of Aranesp® (darbepoietin alfa) was slightly higher (Table 6) (Figure 12).

TABLA 6 TABLE 6

Vía Via
Dosis (µg/kg) Dosis (nmol/kg) Cmáx (ng/ml) ABC (ng·h·ml-1) T1/2 (h) % de biodisponibilidad (F) Dose (µg / kg) Dose (nmol / kg) Cmax (ng / ml) ABC (ng · h · ml-1) T1 / 2 (h) % bioavailability (F)

Híbrido de monómerodímero de Epo-Fc Epo-Fc monomer dimer hybrid
Subcutánea 25 0,3 133 ± 34 10,745 ± 3,144 26 ± 5 57 ± 17 Subcutaneous 25 0.3 133 ± 34 10,745 ± 3,144 26 ± 5 57 ± 17

Aranesp® Aranesp®
Subcutánea 20 0,54 83±11 5390 ± 747 22 ± 2 53 ± 8 Subcutaneous twenty 0.54 83 ± 11 5390 ± 747 22 ± 2 53 ± 8

25 Ejemplo 29: Administración intravenosa de híbrido de monómero-dímero de EPO-Fc Para comparar concentraciones en suero de agentes de eritropoyetina conocidos con híbridos de monómero-dímero 43 Example 29: Intravenous administration of EPO-Fc monomer dimer hybrid To compare serum concentrations of known erythropoietin agents with monomer dimer hybrids 43

imagen27image27

5 5

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

50 fifty

55 55

Seq señal de rc-Igk-F: 5’-TTTAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCC TGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACAAAACT CACACATGCCCACCG -3’ (SEQ ID NO: 86) Seq rc-Igk-F signal: 5’-TTTAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCC TGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACAAACT CACACATGCCCACCG -3 ’(SEQ ID NO: 86)

Fc-noXma-GS-R: 5’-GGTCAGCTCATCGCGGGATGGG -3’ (SEQ ID NO: 87) Fc-noXma-GS-R: 5’-GGTCAGCTCATCGCGGGATGGG -3 ’(SEQ ID NO: 87)

Fc-noXma-GS-F: 5’-CCCATCCCGCGATGAGCTGACC -3’ (SEQ ID NO: 88) Fc-noXma-GS-F: 5’-CCCATCCCGCGATGAGCTGACC -3 ’(SEQ ID NO: 88)

El cebador rc-secuencia señal de Igκ-F añade un sitio de restricción HindIII al extremo 5' de la molécula, seguido de una secuencia de Kozak (GCCGCCACC) (SEQ ID Nº: 89), seguido de la secuencia señal de la cadena ligera de Igκ de ratón, directamente contigua al principio de la secuencia de Fc (EU nº 221). Los cebadores Fc-noXma-GS-F y -R eliminan el sitio Xmal interno de la secuencia de Fc codificante, usando la degeneración del código genético para preservar la correcta secuencia de aminoácidos. Se llevaron a cabo dos reacciones de PCR de 25 µl con 25 pmoles de tanto rc-secuencia señal de Igκ-F como Fc-noXma-GS-R o Fc-noXma-GS-F y rcFc-R usando el sistema Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) según el protocolo convencional del fabricante en un ciclador térmico MJ. La primera reacción se llevó a cabo con 500 ng de biblioteca de ADNc de leucocitos (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) como molde usando los siguientes ciclos: 94 ºC 2 minutos; 30 ciclos de (94 ºC 30 segundos, 55 ºC 30 segundos, 72 ºC 45 segundos), 72 ºC 10 minutos. La segunda reacción se llevó a cabo con 500 ng de pSYN-Fc-001 como molde (anteriormente) usando los siguientes ciclos: 94 ºC 2 minutos; 16 ciclos de (94 ºC 30 segundos, 58 ºC 30 segundos, 72 ºC 45 segundos), 72 ºC 10 minutos. Las bandas de tamaño esperado (-495 y 299 pb, respectivamente) se purificaron en gel con un kit de extracción en gel (Qiagen, Valencia CA), luego se combinaron en una reacción de PCR con 25 pmoles de cebadores de secuencia señal de rc-Igκ-F y rcFc-R y se ejecutaron como antes, hibridando a 58 ºC y continuando durante 16 ciclos. La banda de tamaño esperado (∼772 pb) se purificó en gel con un kit de extracción en gel (Qiagen, Valencia CA) y se clonó en pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) para producir un plásmido intermedio pSYN-Fc-007 (pGEM T-Easy/sec señal de Igκ-Fc). El casete de la secuencia señal de Igκ-Fc entero se subclonó entonces usando los sitios Hindlll y EcoRI en tanto el vector de expresión de mamífero pEE6.4 (Lonza, Slough, RU) como pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), dependiendo del sistema que fuera a usarse, para generar pSYN-Fc-009 (pEE6.4/sec señal de Igκ-Fc) y pSYN-Fc-015 (pcDNA3/sec señal de Igκ-Fc). The rk-Igκ-F signal sequence primer adds a HindIII restriction site to the 5 'end of the molecule, followed by a Kozak sequence (GCCGCCACC) (SEQ ID NO: 89), followed by the light chain signal sequence of mouse Igκ, directly adjacent to the beginning of the Fc sequence (EU No. 221). The primers Fc-noXma-GS-F and -R remove the internal Xmal site of the coding Fc sequence, using the degeneracy of the genetic code to preserve the correct amino acid sequence. Two 25 µl PCR reactions were carried out with 25 pmoles of both rk-signal sequence of Igκ-F as Fc-noXma-GS-R or Fc-noXma-GS-F and rcFc-R using the Expand High Fidelity system (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) according to the manufacturer's conventional protocol on an MJ thermal cycler. The first reaction was carried out with 500 ng of leukocyte cDNA library (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) as a template using the following cycles: 94 ° C 2 minutes; 30 cycles of (94 ºC 30 seconds, 55 ºC 30 seconds, 72 ºC 45 seconds), 72 ºC 10 minutes. The second reaction was carried out with 500 ng of pSYN-Fc-001 as a template (above) using the following cycles: 94 ° C 2 minutes; 16 cycles of (94 ºC 30 seconds, 58 ºC 30 seconds, 72 ºC 45 seconds), 72 ºC 10 minutes. The bands of expected size (-495 and 299 bp, respectively) were gel purified with a gel extraction kit (Qiagen, Valencia CA), then combined in a PCR reaction with 25 pmoles of rc signal sequence primers -Igκ-F and rcFc-R and were run as before, hybridizing at 58 ° C and continuing for 16 cycles. The expected size band (∼772 bp) was gel purified with a gel extraction kit (Qiagen, Valencia CA) and cloned into pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) to produce an intermediate plasmid pSYN-Fc -007 (pGEM T-Easy / sec signal of Igκ-Fc). The entire Igκ-Fc signal sequence cassette was then subcloned using the Hindlll and EcoRI sites in both the mammalian expression vector pEE6.4 (Lonza, Slough, RU) and pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), depending on the system to be used, to generate pSYN-Fc-009 (pEE6.4 / sec signal of Igκ-Fc) and pSYN-Fc-015 (pcDNA3 / sec signal of Igκ-Fc).

Ejemplo 32: Clonación de la construcción de secuencia señal de Igκ -Fc N297A para la preparación de Fc N297A sin marcar solo Example 32: Cloning of the Igκ -Fc N297A signal sequence construct for the preparation of unlabeled Fc N297A alone

Con el fin de mutar Asn 297 (numeración EU) de Fc a un residuo de Ala se usaron los siguientes cebadores: In order to mutate Asn 297 (EU numbering) of Fc to an Ala residue, the following primers were used:

N297A-F 5'-GAGCAGTACGCTAGCACGTACCG -3' (SEQ ID Nº: 90) N297A-F 5'-GAGCAGTACGCTAGCACGTACCG -3 '(SEQ ID NO: 90)

N297A-R 5'-GGTACGTGCTAGCGTACTGCTCC -3' (SEQ ID Nº: 91) N297A-R 5'-GGTACGTGCTAGCGTACTGCTCC -3 '(SEQ ID NO: 91)

Se llevaron a cabo dos reacciones de PCR con 25 pmoles de tanto la rc-secuencia señal de Igκ-F y N297A-R o N297A-F y rcFc-R usando el sistema Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) según el protocolo convencional del fabricante en un ciclador térmico MJ. Ambas reacciones se llevaron a cabo usando 500 ng de pSYN-Fc-007 como molde usando los siguientes ciclos: 94 ºC 2 minutos; 16 ciclos de (94 ºC 30 segundos, 48 ºC 30 segundos, 72 ºC 45 segundos), 72 ºC 10 minutos. Las bandas de tamaño esperado (~319 y 475 pb, respectivamente) se purificaron en gel con un kit de extracción en gel (Qiagen, Valencia CA), luego se combinaron en una reacción de PCR con 25 pmoles de cebadores de rc-secuencia señal de Igκ-F y rcFc-R y se ejecutaron como antes, hibridando a 58 ºC y continuando durante 16 ciclos. La banda de tamaño esperado (~772 pb) se purificó en gel con un kit de extracción en gel (Qiagen, Valencia CA) y se clonó en pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) para producir un plásmido intermedio pSYN-Fc-008 (pGEM T-Easy/sec señal de Igκ-Fc N297A). El casete de la secuencia señal de Igκ-Fc entero solo se subclonó entonces usando los sitios HindIII y EcoRI en tanto el vector de expresión de mamífero pEE6.4 (Lonza, Slough, RU) como pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), dependiendo del sistema que fuera a usarse, para generar pSYN-Fc-010 (pEE6.4/sec señal de Igκ-Fc N297A) y pSYN-Fc-016 (pcDNA3/sec señal de Igκ-Fc N297A). Two PCR reactions were carried out with 25 pmoles of both the rk-signal sequence of Igκ-F and N297A-R or N297A-F and rcFc-R using the Expand High Fidelity system (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) according to conventional manufacturer's protocol on an MJ thermal cycler. Both reactions were carried out using 500 ng of pSYN-Fc-007 as a template using the following cycles: 94 ° C 2 minutes; 16 cycles of (94 ºC 30 seconds, 48 ºC 30 seconds, 72 ºC 45 seconds), 72 ºC 10 minutes. The bands of expected size (~ 319 and 475 bp, respectively) were gel purified with a gel extraction kit (Qiagen, Valencia CA), then combined in a PCR reaction with 25 pmoles of signal sequence rc-primer primers of Igκ-F and rcFc-R and were run as before, hybridizing at 58 ° C and continuing for 16 cycles. The expected size band (~ 772 bp) was gel purified with a gel extraction kit (Qiagen, Valencia CA) and cloned into pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) to produce an intermediate plasmid pSYN-Fc -008 (pGEM T-Easy / sec signal of Igκ-Fc N297A). The entire Igκ-Fc signal sequence cassette was then only subcloned using the HindIII and EcoRI sites in both the mammalian expression vector pEE6.4 (Lonza, Slough, RU) and pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) , depending on the system to be used, to generate pSYN-Fc-010 (pEE6.4 / sec signal from Igκ-Fc N297A) and pSYN-Fc-016 (pcDNA3 / sec signal from Igκ-Fc N297A).

Estos mismos cebadores de N297A también se usaron con cebadores de rcFc-F y rcFc-R y pSYN-Fc-001 como molde en una reacción de PCR seguido de subclonación como se indica anteriormente para generar pSYN-Fc-002 (pGEM T Easy/Fc N297A). These same N297A primers were also used with primers of rcFc-F and rcFc-R and pSYN-Fc-001 as a template in a PCR reaction followed by subcloning as indicated above to generate pSYN-Fc-002 (pGEM T Easy / Fc N297A).

Ejemplo 33: Clonación de Epo-Fc y Fc en un único plásmido para vectores de doble gen para la preparación de híbridos de monómero-dímero no mutante de Epo-Fc o N297A, y expresión Example 33: Cloning of Epo-Fc and Fc in a single plasmid for double gene vectors for the preparation of non-mutant monomer-dimer hybrids of Epo-Fc or N297A, and expression

Una alternativa a transfectar las construcciones de Epo-Fc y Fc en plásmidos separados es clonarlas en un único plásmido, también llamado un vector de doble gen, tal como el usado en el sistema de Lonza Biologics (Slough, RU). El fragmento RsrII/EcoRI de pSYN-Fc-002 se subclonó en los sitios correspondientes en pEE12.4 (Lonza Biologics, Slough, RU) según procedimientos convencionales para generar pSYN-Fc-006 (fragmento pEE12.4/Fc N297A). El plásmido pSYN-EPO-004 se usó como molde para una reacción de PCR usando el cebador de Epo-F del Ejemplo 25 y el siguiente cebador: An alternative to transfecting the Epo-Fc and Fc constructs in separate plasmids is to clone them into a single plasmid, also called a double gene vector, such as that used in the Lonza Biologics system (Slough, UK). The RsrII / EcoRI fragment of pSYN-Fc-002 was subcloned into the corresponding sites in pEE12.4 (Lonza Biologics, Slough, RU) according to conventional procedures to generate pSYN-Fc-006 (pEE12.4 / Fc fragment N297A). Plasmid pSYN-EPO-004 was used as a template for a PCR reaction using the Epo-F primer of Example 25 and the following primer:

5 5

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

imagen28image28

Se llevó a cabo una reacción de PCR usando el sistema Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) según el protocolo convencional del fabricante en un ciclador térmico MJ como se indica anteriormente, durante 16 ciclos con 55 ºC de temperatura de hibridación. La banda de tamaño esperado (~689 pb) se purificó en gel con un kit de extracción en gel (Qiagen, Valencia CA) y se clonó en pSYN-Fc-006 usando los sitios de restricción HindIII/RsrII, para generar pSYN-EPO-005 (pEE12.4/Epo-Fc N297A). El gen de doble vector para el híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc N297A se construyó entonces clonando el fragmento NotIBamHI de pSYN-Fc-010 en los sitios correspondientes en pSYN-EPO-005 para generar pSYN-EPO-008 (pEE12.4-6.4/Epo-Fc N297A/Fc N297A). A PCR reaction was carried out using the Expand High Fidelity system (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) according to the manufacturer's conventional protocol on an MJ thermal cycler as indicated above, for 16 cycles with 55 ° C hybridization temperature. The expected size band (~ 689 bp) was gel purified with a gel extraction kit (Qiagen, Valencia CA) and cloned into pSYN-Fc-006 using the HindIII / RsrII restriction sites, to generate pSYN-EPO -005 (pEE12.4 / Epo-Fc N297A). The double vector gene for the Epo-Fc N297A monomer dimer hybrid was then constructed by cloning the NotIBamHI fragment of pSYN-Fc-010 at the corresponding sites in pSYN-EPO-005 to generate pSYN-EPO-008 (pEE12. 4-6.4 / Epo-Fc N297A / Fc N297A).

La construcción no mutante también se hizo subclonando la secuencia de Fc no mutante de pSYN-Fc-001 en pSYNEPO-005 usando los sitios RsrII y EcoRI, para generar pSYN-EPO-006 (pEE12.4/Epo-Fc). El gen de doble vector para el híbrido de monómero-dímero de Epo-Fc se construyó entonces clonando el fragmento Notl/BamHI de pSYNFc-009 en los sitios correspondientes en pSYN-EPO-006 para generar pSYN-EPO-007 (pEE1,2.4-6.4/Epo-Fc /Fc). Non-mutant construction was also done by subcloning the non-mutant Fc sequence of pSYN-Fc-001 into pSYNEPO-005 using the RsrII and EcoRI sites, to generate pSYN-EPO-006 (pEE12.4 / Epo-Fc). The double vector gene for the Epo-Fc monomer dimer hybrid was then constructed by cloning the Notl / BamHI fragment of pSYNFc-009 at the corresponding sites in pSYN-EPO-006 to generate pSYN-EPO-007 (pEE1,2.4 -6.4 / Epo-Fc / Fc).

Cada plásmido se transfectó en células CHOK1SV y clones positivos se identificaron y adaptaron a suspensión libre de suero, como se indica en The Lonza Biologics Manual for Standard Operating procedures (Lonza Biologics, Slough, RU), y se purificó como se indica para las otras construcciones de monómero-dímero. Each plasmid was transfected into CHOK1SV cells and positive clones were identified and adapted to serum free suspension, as indicated in The Lonza Biologics Manual for Standard Operating procedures (Lonza Biologics, Slough, RU), and purified as indicated for the others. monomer-dimer constructs.

Ejemplo 34: Clonación de IFN-Fc humano, IFN-Fc N297A con ligantes de ocho aminoácidos yconstrucciones de Igκ-Fc-6His Example 34: Cloning of human IFN-Fc, IFN-Fc N297A with eight amino acid binders and Igκ-Fc-6His constructs

Se usaron 10 ng de una biblioteca de ADN genómico humano de Clontech (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) como molde para aislar IFN humano con su secuencia señal nativa usando los siguientes cebadores: 10 ng of a Clontech human genomic DNA library (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) was used as a template to isolate human IFN with its native signal sequence using the following primers:

imagen29image29

El cebador inverso también se usó para crear una secuencia de ligante de ocho aminoácidos (EFAGAAAV) (SEQ ID Nº: 94) en el extremo 3' de la secuencia de IFN humano. La reacción de PCR se llevó a cabo usando el sistema Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) según el protocolo convencional del fabricante en un ciclador térmico Rapid Cycler (Idaho Technology, Salt Lake City, UT). Un producto de PCR del tamaño correcto (~607 pb) se purificó en gel usando un kit de extracción en gel (Qiagen; Valencia, CA), se clonó en el vector de clonación TA (Promega, Madison, WI) y se secuenció. Esta construcción se llamó pSYN-IFN-002. pSYN-IFN-002 se digirió con Sbfl y SalI y se clonó en pSP72 (Promega) en los sitios Pstl y SalI dando pSYN-IFN-005. The reverse primer was also used to create an eight amino acid binder sequence (EFAGAAAV) (SEQ ID NO: 94) at the 3 'end of the human IFN sequence. The PCR reaction was carried out using the Expand High Fidelity system (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) according to the manufacturer's conventional protocol on a Rapid Cycler thermal cycler (Idaho Technology, Salt Lake City, UT). A PCR product of the correct size (~ 607 bp) was gel purified using a gel extraction kit (Qiagen; Valencia, CA), cloned into the TA cloning vector (Promega, Madison, WI) and sequenced. This construction was called pSYN-IFN-002. pSYN-IFN-002 was digested with Sbfl and SalI and cloned into pSP72 (Promega) at the Pstl and SalI sites giving pSYN-IFN-005.

pSYN-Fc-001 purificado (0,6 µg) se digirió con SalI y EcoRI y se clonó en los sitios correspondientes de pSYN-IFN005 para crear el plásmido pSYN-IFN-006 que contiene IFN humano ligado a Fc humano mediante una secuencia de ligante de ocho aminoácidos. pSYN-IFN-006 se digirió entonces con Sbfl y EcoRI y la secuencia de IFN-Fc de longitud completa se clonó en los sitios PstI y EcoRI de pEDdC.señal para crear el plásmido pSYN-IFN-008. purified pSYN-Fc-001 (0.6 µg) was digested with SalI and EcoRI and cloned into the corresponding sites of pSYN-IFN005 to create plasmid pSYN-IFN-006 containing human IFN linked to human Fc by an eight amino acid binder sequence. pSYN-IFN-006 was then digested with Sbfl and EcoRI and the full-length IFN-Fc sequence was cloned into the PstI and EcoRI sites of pEDdC signal to create plasmid pSYN-IFN-008.

pSYN-Fc-002 que contenía el ADN de Fc humano con un único cambio de aminoácido de asparagina a alanina en la posición 297 (N297A; numeración EU) se digirió con BspEI y Xmal para aislar un fragmento de ADN de ~365 pb que contenía la mutación N297A. Este fragmento de ADN se clonó en los sitios correspondientes en pSYN-IFN-008 para crear el plásmido pSYN-IFN-009 que contenía la secuencia de IFN-Fc con un ligante de ocho aminoácidos y una mutación N297A en Fc en el vector de expresión, pED.dC. pSYN-Fc-002 containing human Fc DNA with a single amino acid change from asparagine to alanine at position 297 (N297A; EU numbering) was digested with BspEI and Xmal to isolate a ~ 365 bp DNA fragment containing the mutation N297A. This DNA fragment was cloned into the corresponding sites in pSYN-IFN-008 to create plasmid pSYN-IFN-009 containing the IFN-Fc sequence with an eight amino acid binder and an N297A mutation in Fc in the expression vector, pED.dC.

Clonación de la secuencia señal de Igκ-Fc N297A -6His. Se usaron los siguientes cebadores para añadir una marca de 6xHis al extremo C de la secuencia codificante de Fc N297A: Cloning of the signal sequence of Igκ-Fc N297A-6His. The following primers were used to add a 6xHis tag to the C-terminus of the Fc coding sequence N297A:

Fc GS-F: 5'-GGCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCC -3' (SEQ ID Nº: 95) Fc GS-F: 5'-GGCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCC -3 '(SEQ ID NO: 95)

Fc.6His-R: 5'-TCAGTGGTGATGGTGATGATGTTTACCCGGAGACAGGGAG -3' (SEQ ID Nº: 96) Fc. 6His-R: 5'-TCAGTGGTGATGGTGATGATGTTTACCCGGAGACAGGGAG -3 '(SEQ ID NO: 96)

imagen30image30

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

(3000 ufp/pocillo) a cada pocillo con la excepción de los pocillos de control. Las placas se incubaron a 37 ºC, 5% de CO2 durante 28 horas. Las células vivas se fijaron con 10% de ácido tricloroacético (TCA) frío y luego se tiñeron con sulforrodamina B (SRB) según protocolos publicados (Rubinstein y col. 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82, 1113). El colorante SRB se solubilizó con Tris 10 mM a pH 10,5 y se leyó en un espectrofotómetro a 490 nm. Las muestras se analizaron comparando actividades con una curva patrón conocida que oscila de 10 a 0,199 UI/ml. Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 8 y demuestran elevada actividad antiviral de híbridos de monómero-dímero. (3000 pfu / well) to each well with the exception of the control wells. The plates were incubated at 37 ° C, 5% CO2 for 28 hours. The living cells were fixed with 10% cold trichloroacetic acid (TCA) and then stained with sulforrodamine B (SRB) according to published protocols (Rubinstein et al. 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82, 1113). The SRB dye was solubilized with 10 mM Tris at pH 10.5 and read on a spectrophotometer at 490 nm. The samples were analyzed by comparing activities with a known standard curve that ranges from 10 to 0.199 IU / ml. The results are presented in Table 8 below and demonstrate high antiviral activity of monomer-dimer hybrids.

TABLA 8: ENSAYO ANTIVIRAL DE INTERFERÓN BETA TABLE 8: BETA INTERFERON ANTIVIRAL TEST

HOMODÍMERO FRENTE A HÍBRIDO DE MONÓMERO-DÍMERO HOMODIMER AGAINST MONOMER-DIGER HYBRID

Proteína Protein
Actividad antiviral (UI/nmol) Desv est Antiviral activity (IU / nmol) Desv est

Homodímero del ligante de 8 aa de IFN-Fc IFN-Fc 8 aa binder homodimer
4,5 ×105 0,72 × 105 4.5 × 105 0.72 × 105

Homodímero del ligante de 8 aa de IFN-Fc N297A IFN-Fc N297A 8 aa binder homodimer
3,21 × 105 0,48 × 105 3.21 × 105 0.48 × 105

Híbrido de monómero-dímero del ligante de 8 aa de IFN-Fc N297A: Fc-His IFN-Fc N297A 8 aa binder monomer dimer hybrid: Fc-His
12,2 × 105 2 × 105 12.2 × 105 2 × 105


Ejemplo 37: Administración de homodímero e híbrido de monómero-dímero de IFN-Fc con un ligante de ocho aminoácidos a monos cinomolgos
Example 37: Administration of IFN-Fc monomer-dimer homodimer and hybrid with an eight amino acid binder to cynomolgus monkeys

Para administración pulmonar, aerosoles de tanto proteínas de homodímero de IFN-Fc como de híbrido de monómero-dímero de IFN-Fc N297A (ambas con el ligante de 8 aminoácidos) en PBS, pH 7,4, 0,25% de HSA, se crearon con el nebulizador Aeroneb Pro™ (AeroGen, Mountain View, CA), en línea con un respirador Bird Mark 7A, y se administraron a monos cinomolgos sin tratamiento previo anestesiados mediante tubos endotraqueales (que se aproximan a la respiración tidal normal). Se tomaron muestras de sangre en diversos momentos de tiempo, y la cantidad de proteína que contiene IFN en el suero resultante se cuantificó usando un inmunoensayo de IFN humano (Biosource International, Camarillo, CA). Se calcularon los parámetros farmacocinéticos usando el software WinNonLin. La Tabla 9 presenta los resultados de monos cinomolgos tratados con el híbrido de monómero-dímero de IFN-Fc N297A u homodímero de IFN-Fc. For pulmonary administration, aerosols of both IFN-Fc homodimer proteins and IFN-Fc N297A monomer dimer hybrid (both with the 8 amino acid binder) in PBS, pH 7.4, 0.25% of HSA, were created with the Aeroneb Pro ™ nebulizer (AeroGen, Mountain View, CA), in line with a Bird Mark 7A respirator, and were administered to cynomolgus monkeys without prior treatment anesthetized by endotracheal tubes (which approximate normal tidal breathing ). Blood samples were taken at various times, and the amount of IFN-containing protein in the resulting serum was quantified using a human IFN immunoassay (Biosource International, Camarillo, CA). Pharmacokinetic parameters were calculated using WinNonLin software. Table 9 presents the results of cynomolgus monkeys treated with the IFN-Fc N297A monomer-dimer hybrid or IFN-Fc homodimer.

TABLA 9: ADMINISTRACIÓN DE HÍBRIDO DE MONÓMERO-DÍMERO DE IFNFC N297A Y HOMODÍMERO DE TABLE 9: IFNFC N297A MONOMER-DIMERO HYBRID ADMINISTRATION AND HOMODIMER OF

IFNFC A MONOS IFNFC TO MONKEYS

Proteína Protein
Mono nº Vía Dosis depositada aprox.1 (µg/kg) Cmáx (ng/ml) ABC (h*ng/ml) t1/2(h) t1/2 prom (h) Monkey No. Via Dose deposited approx. 1 (µg / kg) Cmax (ng / ml) ABC (h * ng / ml) t1 / 2 (h) t1 / 2 avg (h)

Híbrido de monómerodímero de IFN-Fc N297A IFN-Fc N297A monomer dimer hybrid
CO7308 pulm 20 23,3 987,9 27,6 27,1 CO7308 pulm twenty 23.3 987.9 27.6 27.1

CO7336 CO7336
pulm 20 22,4 970,6 25,6 pulm twenty 22.4 970.6 25.6

CO7312 CO7312
pulm 20 21,2 1002,7 28,0 pulm twenty 21.2 1002.7 28.0

Homodímero de IFN-Fc IFN-Fc homodimer
CO7326 pulm 20 2,6 94,6 11,1 11,4 CO7326 pulm twenty 2.6 94.6 11.1 11.4

CO7338 CO7338
pulm 20 5,0 150,6 11,7 pulm twenty 5.0 150.6 11.7

1 Basado en el 15% de fracción de deposición de dosis nebulizada como se ha determinado por escintigrafía gamma 1 Based on the 15% fraction of nebulized dose deposition as determined by gamma scintigraphy

La farmacocinética de IFN-Fc con un ligante de 8 aminoácidos administrada a monos cinomolgos se presenta en la Figura 15. La figura compara el homodímero de IFN-Fc con el híbrido de monómero-dímero de IFN-Fc N297A en monos después de la administración de una única dosis pulmonar. Se obtuvieron niveles en suero significativamente mayores en monos tratados con el híbrido de monómero-dímero en comparación con el homodímero. The pharmacokinetics of IFN-Fc with an 8 amino acid binder administered to cynomolgus monkeys is presented in Figure 15. The figure compares the IFN-Fc homodimer with the IFN-Fc N297A monomer dimer hybrid in monkeys after of the administration of a single pulmonary dose. Significantly higher serum levels were obtained in monkeys treated with the monomer-dimer hybrid compared to the homodimer.

También se analizaron muestras de suero para niveles de neopterina (un biomarcador de actividad de IFN) usando un inmunoensayo de neopterina (MP Biomedicals, Orangeburg, NY). Los resultados para este análisis se muestran en la Figura 16. La figura compara la estimulación de neopterina en respuesta al homodímero de IFN-Fc y el híbrido de monómero-dímero de IFN-Fc N297A. Puede observarse que se detectaron niveles de neopterina significativamente mayores en monos tratados con híbrido de monómero-dímero de IFN-Fc N297A con respecto al homodímero de IFN-Fc. Serum samples for neopterin levels (a biomarker of IFN activity) were also analyzed using a neopterin immunoassay (MP Biomedicals, Orangeburg, NY). The results for this analysis are shown in Figure 16. The figure compares the stimulation of neopterin in response to the IFN-Fc homodimer and the IFN-Fc N297A monomer dimer hybrid. It can be seen that significantly higher neopterin levels were detected in monkeys treated with IFN-Fc monomer dimer N297A with respect to the IFN-Fc homodimer.

Todos los números que expresan cantidades de componentes, condiciones de reacción, etc., usados en la memoria descriptiva y reivindicaciones deben entenderse como que están modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en All numbers expressing amounts of components, reaction conditions, etc., used in the specification and claims should be understood as being modified in all cases by the term "approximately". Therefore, unless otherwise indicated, the numerical parameters set forth in

imagen31image31

5 5

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

primera cadena comprende una molécula biológicamente activa, y al menos una parte de una región constante de first chain comprises a biologically active molecule, and at least a part of a constant region of

inmunoglobulina y en donde dicha segunda cadena consiste en al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina y opcionalmente una marca de afinidad. immunoglobulin and wherein said second chain consists of at least a part of a constant region of immunoglobulin and optionally an affinity tag.

E29. La proteína quimérica de E28, en donde la marca de afinidad es una marca FLAG. E30. Una proteína quimérica que comprende una primera y segunda cadena de polipéptidos, en donde dicha E29 The chimeric protein of E28, where the affinity mark is a FLAG brand. E30 A chimeric protein comprising a first and second polypeptide chain, wherein said

primera cadena comprende una molécula biológicamente activa, y al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina y en donde dicha segunda cadena consiste esencialmente en al menos una parte de una región constante de first chain comprises a biologically active molecule, and at least a part of a constant region of immunoglobulin and wherein said second chain consists essentially of at least a part of a constant region of

inmunoglobulina y opcionalmente una marca de afinidad. E31. La proteína quimérica de E30, en donde la marca de afinidad es una marca FLAG. E32. Una proteína quimérica que comprende una primera y segunda cadenas de polipéptidos. a) en donde dicha primera cadena comprende una molécula biológicamente activa, al menos una parte de una immunoglobulin and optionally an affinity mark. E31 The chimeric protein of E30, where the affinity mark is a FLAG brand. E32 A chimeric protein comprising a first and second polypeptide chains. a) wherein said first chain comprises a biologically active molecule, at least a part of a

región constante de inmunoglobulina y un primer dominio que tiene al menos un componente de unión específica, y b) en donde dicha segunda cadena comprende al menos una parte de una inmunoglobulina sin una molécula immunoglobulin constant region and a first domain having at least one specific binding component, and b) wherein said second chain comprises at least a part of an immunoglobulin without a molecule

biológicamente activa o región variable de inmunoglobulina y que además comprende un segundo dominio que es un componente de unión específica de dicho primer dominio. E33. La proteína quimérica de E32, en donde dicha segunda cadena además comprende una marca de afinidad. E34. La proteína quimérica de E33, en donde la marca de afinidad es una marca FLAG. E35. La proteína quimérica de E32, en donde la parte de una inmunoglobulina es un Fragmento de Fc. E36. La proteína quimérica de E32 o 35, en donde la inmunoglobulina es IgG. E37. La proteína quimérica de E35, en donde la parte de una inmunoglobulina es un componente de unión de FcRn. E38. La proteína quimérica de E37, en donde el componente de unión de FcRn es un péptido mimético de un biologically active or immunoglobulin variable region and which further comprises a second domain that is a specific binding component of said first domain. E33 The chimeric protein of E32, wherein said second chain also comprises an affinity tag. E34 The chimeric protein of E33, where the affinity mark is a FLAG brand. E35 The chimeric protein of E32, where the part of an immunoglobulin is a Fc Fragment. E36 The chimeric protein of E32 or 35, where the immunoglobulin is IgG. E37 The chimeric protein of E35, where the part of an immunoglobulin is a binding component of FcRn. E38 The chimeric protein of E37, wherein the FcRn binding component is a mimetic peptide of a

fragmento de Fc de una inmunoglobulina. Fc fragment of an immunoglobulin.

E39. La proteína quimérica de E32 o 37, en donde el primer dominio se une con el segundo dominio no covalentemente. E40. La proteína quimérica de E32 o 37, en donde el primer dominio es una mitad de una cremallera de leucina E39 The chimeric protein of E32 or 37, wherein the first domain binds to the second domain not covalently. E40 The chimeric protein of E32 or 37, where the first domain is one half of a leucine zipper

superenrollada y dicho segundo dominio es el componente de unión complementario de dicha cremallera de leucina superenrollada. E41. La proteína quimérica de E32 o 37, en donde la molécula biológicamente activa es un péptido. E42. La proteína quimérica de E32 o 37, en donde la molécula biológicamente activa es interferón. E43. La proteína quimérica de E42, en donde el interferón es interferón α y tiene un ligante de 15-25 aminoácidos. E44. La proteína quimérica de E43, en donde el interferón α tiene un ligante de 15-20 aminoácidos. E45. La proteína quimérica de E41, en donde la molécula biológicamente activa es feuprolida. E46. La proteína quimérica de E32 o 37, en donde la molécula biológicamente activa es un inhibidor de fusión viral. supercoiled and said second domain is the complementary binding component of said supercoiled leucine zipper. E41 The chimeric protein of E32 or 37, wherein the biologically active molecule is a peptide. E42 The chimeric protein of E32 or 37, where the biologically active molecule is interferon. E43 The chimeric protein of E42, where interferon is interferon α and has a 15-25 amino acid binder. E44 The chimeric protein of E43, where interferon α has a 15-20 amino acid binder. E45 The chimeric protein of E41, where the biologically active molecule is feuprolide. E46 The chimeric protein of E32 or 37, wherein the biologically active molecule is a viral fusion inhibitor.

E47. La proteína quimérica de E46, en donde el inhibidor de fusión viral es un inhibidor de fusión HIV. E48. La proteína quimérica de E47, en donde el inhibidor de fusión HIV es T20 (SEQ ID NO:1), o T21 (SEQ ID NO:2), o T1249 (SEQ ID NO:3). E47 The chimeric E46 protein, wherein the viral fusion inhibitor is an HIV fusion inhibitor. E48 The chimeric protein of E47, wherein the HIV fusion inhibitor is T20 (SEQ ID NO: 1), or T21 (SEQ ID NO: 2), or T1249 (SEQ ID NO: 3).

E49. La proteína quimérica de E32 o 37, en donde la molécula biológicamente activa es un factor de coagulación. E50. La proteína quimérica de E49, en donde el factor de coagulación es Factor VII o Factor VIIa. E51. La proteína quimérica de E49, en donde el factor de coagulación es Factor IX. E52. La proteína quimérica de E32 o 37, en donde la molécula biológicamente activa es una molécula pequeña. E49 The chimeric protein of E32 or 37, where the biologically active molecule is a coagulation factor. E50 The chimeric protein of E49, where the coagulation factor is Factor VII or Factor VIIa. E51 The chimeric protein of E49, where the coagulation factor is Factor IX. E52 The chimeric protein of E32 or 37, wherein the biologically active molecule is a small molecule.

imagen32image32

imagen33image33

5 5

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

E105. El método de E90, en donde dicha molécula biológicamente activa es eritropoyetina. E105 The E90 method, wherein said biologically active molecule is erythropoietin.

E106. Una proteína quimérica de la fórmula X-La-F:F o F:F-La-X E106. A chimeric protein of the formula X-La-F: F or F: F-La-X

en donde X es una molécula biológicamente activa, L es un ligante, F es al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina y a es cualquier número entero o cero. E107. La proteína quimérica de E106, en donde F es un componente de unión de FcRn. E108. La proteína quimérica de E106, en donde el FcRn es un péptido mimético de un fragmento de Fc de una wherein X is a biologically active molecule, L is a binder, F is at least a part of a constant region of immunoglobulin and a is any integer or zero. E107. The chimeric protein of E106, where F is a binding component of FcRn. E108. The chimeric protein of E106, wherein the FcRn is a mimetic peptide of an Fc fragment of a

inmunoglobulina. E109. La proteína quimérica de E106 o 107, en donde cada F está químicamente asociado con el otro F. E110. El método de E109, en donde la asociación química es una interacción no covalente. E111. El método de E109, en donde el enlace químico es un enlace covalente. E112. El método de E109, en donde el enlace químico es un enlace disulfuro. E113. La proteína quimérica de E106, o 107, en donde F está unido a F mediante un enlace que no es un enlace immunoglobulin E109. The chimeric protein of E106 or 107, where each F is chemically associated with the other F. E110. The method of E109, where chemical association is a non-covalent interaction. E111. The method of E109, wherein the chemical bond is a covalent bond. E112. The method of E109, wherein the chemical bond is a disulfide bond. E113. The chimeric protein of E106, or 107, where F is linked to F via a bond that is not a bond

disulfuro. E114. La proteína quimérica de E106, en donde F es una región constante de inmunoglobulina IgG. E115. La proteína quimérica de E106, en donde F es una IgG1. E116. La proteína quimérica de E106, en donde F es un Fragmento de Fc. E117. La proteína quimérica de E106, en donde X es un polipéptido E118. La proteína quimérica de E106, en donde X es leuprolida. E119. La proteína quimérica de E106, en donde X es una molécula pequeña. E120. La proteína quimérica de E119, en donde la molécula pequeña es un antagonista de VLA4. E121. La proteína quimérica de E106, en donde X es un inhibidor de fusión viral. E122. La proteína quimérica de E121, en donde el inhibidor de fusión viral es un inhibidor de fusión HIV. E123. La proteína quimérica de E122, en donde el inhibidor de fusión HIV es T20 (SEQ ID NO:1), o T21 (SEQ ID disulfide E114. The chimeric protein of E106, where F is a constant region of IgG immunoglobulin. E115. The chimeric protein of E106, where F is an IgG1. E116. The chimeric protein of E106, where F is a Fc fragment. E117. The chimeric protein of E106, where X is an E118 polypeptide. The chimeric protein of E106, where X is leuprolide. E119. The chimeric protein of E106, where X is a small molecule. E120. The chimeric protein of E119, where the small molecule is a VLA4 antagonist. E121. The chimeric protein of E106, where X is a viral fusion inhibitor. E122. The chimeric protein of E121, wherein the viral fusion inhibitor is an HIV fusion inhibitor. E123. The chimeric protein of E122, wherein the HIV fusion inhibitor is T20 (SEQ ID NO: 1), or T21 (SEQ ID

NO:2), o T1249 (SEQ ID NO:3). E124. La proteína quimérica de E106 o 107, en donde X es un factor de coagulación. E125. La proteína quimérica de E124, en donde el factor de coagulación es Factor VII o VIIa. E126. La proteína quimérica de E124, en donde el factor de coagulación es Factor IX. E127. La proteína quimérica de E106 o 107, en donde X es un ácido nucleico. E128. La proteína quimérica de E127, en donde el ácido nucleico es una molécula de ADN o ARN. E129. La proteína quimérica de E106 o 107, en donde X es un factor de crecimiento. E130. La proteína quimérica de E129, en donde el factor de crecimiento es eritropoyetina. E131. Un método de tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto que comprende administrar la proteína NO: 2), or T1249 (SEQ ID NO: 3). E124. The chimeric protein of E106 or 107, where X is a coagulation factor. E125. The chimeric protein of E124, where the coagulation factor is Factor VII or VIIa. E126. The chimeric protein of E124, where the coagulation factor is Factor IX. E127. The chimeric protein of E106 or 107, wherein X is a nucleic acid. E128. The chimeric protein of E127, where the nucleic acid is a DNA or RNA molecule. E129. The chimeric protein of E106 or 107, where X is a growth factor. E130 The chimeric protein of E129, where the growth factor is erythropoietin. E131. A method of treating a disease or condition in a subject that comprises administering the protein

quimérica de E1, 5, 32, 37, 106, a 107 a dicho sujeto. E132. El método de E131, en donde la enfermedad o afección es una infección vírica. E133. El método de E131, en donde la molécula biológicamente activa es interferón. E134. El método de E133, en donde el interferón es interferón α y tiene un ligante of 15-25 aminoácidos. E135. El método de E134, en donde el interferón α tiene un ligante of 15-20 aminoácidos. E136. El método de E132, en donde la infección vírica es HIV. chimeric of E1, 5, 32, 37, 106, to 107 to said subject. E132. The method of E131, where the disease or condition is a viral infection. E133. The method of E131, where the biologically active molecule is interferon. E134. The E133 method, where interferon is interferon α and has a binder of 15-25 amino acids. E135. The E134 method, where interferon α has a binder of 15-20 amino acids. E136. The method of E132, where the viral infection is HIV.

5 5

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

40 40

45 Four. Five

E137. El método de E131, en donde la enfermedad o afección es un trastorno hemorrágico. E137. The E131 method, where the disease or condition is a bleeding disorder.

E138. El método de E137, en donde el trastorno hemorrágico es hemofilia A. E138. The method of E137, where the bleeding disorder is hemophilia A.

E139. El método de E137, en donde el trastorno hemorrágico es hemofilia B. E139. The E137 method, where the bleeding disorder is hemophilia B.

E140. El método de E131, en donde la enfermedad o afección es anemia. E140. The method of E131, where the disease or condition is anemia.

E141. El método de E131, en donde la proteína quimérica se administra por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, oral, bucal, sublingual, nasal, rectal, vaginal, por vía de un aerosol, o ruta pulmonar. E141. The E131 method, where the chimeric protein is administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously, orally, orally, sublingually, nasally, rectally, vaginally, via an aerosol, or pulmonary route.

E142. El método de E141, en donde la proteína quimérica se administra vía una ruta pulmonar. E142. The E141 method, where the chimeric protein is administered via a pulmonary route.

E143. El método de E141, en donde la proteína quimérica se administra oralmente. E143. The E141 method, where the chimeric protein is administered orally.

E144. El método de E131, en donde la inmunoglobulina es igG. E144. The method of E131, where the immunoglobulin is igG.

E145. El método de E131, en donde la parte de una inmunoglobulina es un fragmento de Fc. E145. The method of E131, wherein the part of an immunoglobulin is an Fc fragment.

E146. Una proteína quimérica que comprende una primera y segunda cadena de polipéptidos unidas entre sí, en donde dicha primera cadena comprende una molécula biológicamente activa y al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, y dicha segunda cadena comprende al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina sin la molécula biológicamente activa de la primera cadena y en donde dicha segunda cadena no está unida covalentemente a ninguna molécula que tenga un peso molecular mayor que 2 kD. E146. A chimeric protein comprising a first and second chain of polypeptides linked together, wherein said first chain comprises a biologically active molecule and at least a part of a constant region of immunoglobulin, and said second chain comprises at least a part of a region immunoglobulin constant without the biologically active molecule of the first chain and wherein said second chain is not covalently bound to any molecule having a molecular weight greater than 2 kD.

E147. La proteína quimérica de E146, en donde la parte de una región constante de inmunoglobulina es un componente de unión de FcRn. E147. The chimeric protein of E146, where the part of a constant region of immunoglobulin is a binding component of FcRn.

E148. Una proteína quimérica que comprende una primera y segunda cadena de polipéptidos unidas entre sí, en donde dicha primera cadena comprende una molécula biológicamente activa y al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, y dicha segunda cadena comprende al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina unida no covalentemente a cualquier otra molécula excepto la parte de una inmunoglobulina de dicha primera cadena de polipéptidos. E148. A chimeric protein comprising a first and second chain of polypeptides linked together, wherein said first chain comprises a biologically active molecule and at least a part of a constant region of immunoglobulin, and said second chain comprises at least a part of a region immunoglobulin constant not covalently bound to any other molecule except the part of an immunoglobulin of said first polypeptide chain.

E149. La proteína quimérica de E148, en donde la parte de una región constante de inmunoglobulina es un componente de unión de FcRn. E149. The chimeric protein of E148, where the part of a constant region of immunoglobulin is a binding component of FcRn.

E150. Una proteína quimérica que comprende una primera y segunda cadena de polipéptidos unidas entre sí, en donde dicha primera cadena comprende una molécula biológicamente activa y al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, y dicha segunda cadena consiste en al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina. E150 A chimeric protein comprising a first and second chain of polypeptides linked together, wherein said first chain comprises a biologically active molecule and at least a part of a constant region of immunoglobulin, and said second chain consists of at least a part of a Immunoglobulin constant region.

E151. La proteína quimérica de E150, en donde la parte de una región constante de inmunoglobulina es un componente de unión de FcRn. E151. The chimeric protein of E150, where the part of a constant region of immunoglobulin is a binding component of FcRn.

E152. Una proteína quimérica que comprende una primera y segunda cadena de polipéptidos unidas entre sí, en donde dicha primera cadena comprende una molécula biológicamente activa y al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, y dicha segunda cadena comprende al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina sin la molécula biológicamente activa de la primera cadena y una molécula con un peso molecular menor de 2 kD unida covalentemente. E152. A chimeric protein comprising a first and second chain of polypeptides linked together, wherein said first chain comprises a biologically active molecule and at least a part of a constant region of immunoglobulin, and said second chain comprises at least a part of a region immunoglobulin constant without the biologically active molecule of the first chain and a molecule with a molecular weight less than 2 kD covalently bound.

E153. La proteína quimérica de E152, en donde la parte de una región constante de inmunoglobulina es un componente de unión de FcRn. E153. The chimeric protein of E152, where the part of a constant region of immunoglobulin is a binding component of FcRn.

E154. Un método de obtención de una proteína quimérica que comprende un fragmento de Fc de una inmunoglobulina unido a una molécula biológicamente activa, comprendiendo dicho método E154. A method of obtaining a chimeric protein comprising an Fc fragment of an immunoglobulin bound to a biologically active molecule, said method comprising

a) transfectar una célula con un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento de Fc de una inmunoglobulina y una segunda secuencia de ADN que codifica inteína; a) transfecting a cell with a DNA construct comprising a DNA sequence encoding an Fc fragment of an immunoglobulin and a second DNA sequence encoding intein;

b) cultivar dicha célula en condiciones tales que se expresan el fragmento de Fc y la inteína; b) culturing said cell under conditions such that the Fc fragment and the intein are expressed;

c) aislar dicho fragmento de Fc e inteína de dicha célula; c) isolating said Fc and intein fragment from said cell;

d) sintetizar químicamente una molécula biológicamente activa que tiene un Cys N terminal; d) chemically synthesize a biologically active molecule that has a Cys N terminal;

e) hacer reaccionar la inteína aislada Fc de c) con MESNA para generar un tio-éster C terminal; e) reacting the isolated intein Fc of c) with MESNA to generate a terminal C thio-ester;

f) hacer reaccionar la molécula biológicamente activa de d) con el Fc de e) para obtener una proteína quimérica que comprende un Fc unido a una molécula biológicamente activa. f) reacting the biologically active molecule of d) with the Fc of e) to obtain a chimeric protein comprising an Fc bound to a biologically active molecule.

imagen34image34

imagen35image35

imagen36image36

Claims (1)

imagen1image 1 imagen2image2
ES10182890.3T 2003-05-06 2004-05-06 Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids Active ES2582947T3 (en)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46960003P 2003-05-06 2003-05-06
US469600P 2003-05-06
US48796403P 2003-07-17 2003-07-17
US487964P 2003-07-17
US53920704P 2004-01-26 2004-01-26
US539207P 2004-01-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2582947T3 true ES2582947T3 (en) 2016-09-16

Family

ID=33458764

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10182890.3T Active ES2582947T3 (en) 2003-05-06 2004-05-06 Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES10182902.6T Active ES2579938T3 (en) 2003-05-06 2004-05-06 Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES04775946T Active ES2431116T3 (en) 2003-05-06 2004-05-06 Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10182902.6T Active ES2579938T3 (en) 2003-05-06 2004-05-06 Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES04775946T Active ES2431116T3 (en) 2003-05-06 2004-05-06 Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids

Country Status (28)

Country Link
US (13) US7404956B2 (en)
EP (7) EP2174946B1 (en)
JP (6) JP5091480B2 (en)
CN (3) CN1852736B (en)
AT (1) ATE446307T1 (en)
AU (1) AU2004252422B2 (en)
BE (1) BE2016C015I2 (en)
BR (2) BRPI0410345A8 (en)
CA (1) CA2522590C (en)
CY (4) CY1114639T1 (en)
DE (1) DE602004023724D1 (en)
DK (4) DK2361932T3 (en)
EA (1) EA012566B1 (en)
ES (3) ES2582947T3 (en)
FR (1) FR16C0011I2 (en)
HK (2) HK1159649A1 (en)
HU (4) HUE031663T2 (en)
IL (2) IL171779A (en)
LT (2) LTC1625209I2 (en)
LU (1) LU92991I2 (en)
NL (1) NL300799I2 (en)
NO (5) NO339539B1 (en)
PL (3) PL2357196T3 (en)
PT (3) PT2361932T (en)
SI (4) SI2361932T1 (en)
TW (1) TWI353991B (en)
UA (1) UA95436C2 (en)
WO (2) WO2004101739A2 (en)

Families Citing this family (376)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5992710A (en) * 1982-11-16 1984-05-29 関西電力株式会社 Method of laying shaft of direct water cooling line
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7662925B2 (en) 2002-03-01 2010-02-16 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20070026485A1 (en) 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
EP1624846A2 (en) * 2003-05-06 2006-02-15 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
SI2298347T1 (en) * 2003-05-06 2016-03-31 Biogen Hemophilia Inc. Clotting factor chimeric proteins for treatment of a hemostatic disorder
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US8007805B2 (en) 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
EP1682584B1 (en) * 2003-11-13 2013-04-17 Hanmi Science Co., Ltd. A pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin fc region as a carrier
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
EP1771066A2 (en) 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1
US20150010550A1 (en) 2004-07-15 2015-01-08 Xencor, Inc. OPTIMIZED Fc VARIANTS
ES2572779T3 (en) 2004-10-29 2016-06-02 Ratiopharm Gmbh Remodeling and glucopegilation of Fibroblast Growth Factor (FGF)
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
CN102746404B (en) 2004-11-12 2016-01-20 赞科股份有限公司 To FcRn in conjunction with reformed Fc variant
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
ES2449195T3 (en) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP2386571B1 (en) 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US7833979B2 (en) * 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
AU2006250068A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Schering Corporation Interferon-IGG fusion
JP5335422B2 (en) 2005-06-17 2013-11-06 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト Selective reduction and derivatization of engineered proteins containing at least one unnatural cysteine
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
LT1917276T (en) 2005-08-26 2018-05-25 Ares Trading S.A. Process for the preparation of glycosylated interferon beta
EP1931709B1 (en) 2005-10-03 2016-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
CA2625998C (en) 2005-10-06 2015-12-01 Xencor, Inc. Optimized anti-cd30 antibodies
US8153598B2 (en) * 2005-10-19 2012-04-10 Intrexon Corporation PKD ligands and polynucleotides encoding PKD ligands
JP2009513708A (en) 2005-10-31 2009-04-02 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Compositions and methods for diagnosis and treatment of cancer
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US8604175B2 (en) 2005-12-09 2013-12-10 Ares Trading S.A. Method for purifying FSH or a FSH mutant
US7625564B2 (en) 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
TW200745163A (en) * 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
SI2004683T1 (en) 2006-03-24 2016-09-30 Biogen Hemophilia Inc. Pc5 as a factor ix propeptide processing enzyme
US20100222554A1 (en) * 2006-04-11 2010-09-02 Thomas Weimer Method of Increasing the In Vivo Recovery of Therapeutic Polypeptides
EP2213733A3 (en) 2006-05-24 2010-12-29 Novo Nordisk Health Care AG Factor IX analogues having prolonged in vivo half life
EP3896090B1 (en) 2006-06-14 2022-01-12 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
AU2013202566C1 (en) * 2006-06-14 2018-07-12 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
EP1867660A1 (en) 2006-06-14 2007-12-19 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
US7939632B2 (en) * 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
WO2008036449A2 (en) * 2006-06-29 2008-03-27 The Regents Of The University Of California Chemical antibodies for immunotherapy and imaging
US9187532B2 (en) 2006-07-21 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Glycosylation of peptides via O-linked glycosylation sequences
GB0614780D0 (en) * 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
DK2383297T5 (en) 2006-08-14 2022-07-04 Xencor Inc Optimized antibodies directed against CD19
BRPI0715794A2 (en) * 2006-08-17 2013-07-23 Hoffmann La Roche ccr5 antibody conjugate and antifusogenic peptide
TW200817438A (en) 2006-08-17 2008-04-16 Hoffmann La Roche A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide
WO2008051326A2 (en) * 2006-08-21 2008-05-02 President And Fellows Of Harvard College Identification of contactins and l1- cams as ligands for the amyloid precursor protein
US8513393B2 (en) * 2006-08-28 2013-08-20 Ares Trading S.A. Process for the purification of Fc-containing proteins
WO2008025747A1 (en) * 2006-08-28 2008-03-06 Ares Trading S.A. Process for the purification of fc-fusion proteins
WO2008036688A2 (en) 2006-09-18 2008-03-27 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target hm1.24
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As Methods for the purification of polypeptide conjugates
PE20081140A1 (en) 2006-10-25 2008-09-22 Amgen Inc THERAPEUTIC AGENTS BASED ON PEPTIDES DERIVED FROM TOXINS
WO2008140477A2 (en) * 2006-11-02 2008-11-20 Capon Daniel J Hybrid immunoglobulins with moving parts
EP3231440A1 (en) 2006-12-22 2017-10-18 CSL Behring GmbH Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
ES2753183T3 (en) 2007-02-12 2020-04-07 Csl Behring Gmbh Therapeutic application of Kazal-type serine protease inhibitors
CA2682897C (en) 2007-04-03 2016-11-22 Biogenerix Ag Methods of treatment using glycopegylated g-csf
MX2009012609A (en) * 2007-05-22 2009-12-07 Amgen Inc Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins.
CN101778859B (en) 2007-06-12 2014-03-26 诺和诺德公司 Improved process for the production of nucleotide sugars
TWI554520B (en) * 2007-07-20 2016-10-21 諾華健控股公司 Recombinant human epo-fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
CL2008002092A1 (en) * 2007-07-20 2009-05-29 Hoffmann La Roche Conjugate containing two or more antifusogenic peptides and an anti-cd-4 antibody; Method of production; pharmaceutical composition comprising it; antifusogenic polypeptides and use of the conjugate to treat viral infections.
BRPI0814465B1 (en) 2007-07-26 2021-11-23 Novagen Holding Corporation FUSION PROTEIN, DIMER, METHOD FOR PRODUCING A FUSION PROTEIN, CELL LINEAGE, USES OF A FUSION PROTEIN AND A PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION
AU2008284047A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
EP2205280B1 (en) 2007-09-27 2019-09-04 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
US20100260751A1 (en) * 2007-09-28 2010-10-14 Raju T Shantha Methods and Structural Conformations of Antibody Preparations with Increased Resistance to Proteases
EP2203474A1 (en) * 2007-10-22 2010-07-07 Merck Serono S.A. Method for purifying fc-fusion proteins
AU2008314697B2 (en) * 2007-10-22 2013-08-29 Merck Serono S.A. Single IFN-beta fused to a mutated lgG Fc fragment
AU2008314689A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying an Fc-containing protein
ES2558155T3 (en) 2007-10-30 2016-02-02 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds showing glucacon antagonist activity and GLP-1 agonist
WO2009064838A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 Amgen, Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
SI2808343T1 (en) 2007-12-26 2019-10-30 Xencor Inc Fc variants with altered binding to FcRn
EP2252627B1 (en) * 2008-01-24 2017-04-19 Esperance Pharmaceuticals Lytic domain fusion constructs and methods of making and using same
AU2009206306B2 (en) 2008-01-25 2013-06-06 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
US20130189239A1 (en) 2008-02-27 2013-07-25 Novo Nordisk A/S Conjugated Factor VIII Molecules
EP2816059A1 (en) 2008-05-01 2014-12-24 Amgen, Inc Anti-hepcidin antibodies and methods of use
SG192405A1 (en) 2008-06-17 2013-08-30 Univ Indiana Res & Tech Corp Gip-based mixed agonists for treatment of metabolic disorders and obesity
WO2009155257A1 (en) 2008-06-17 2009-12-23 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting enhanced solubility and stability physiological ph buffers
PA8830501A1 (en) 2008-06-17 2010-07-27 Univ Indiana Res & Tech Corp GLUCAGON / GLP-1 RECEIVER CO-AGONISTS
ES2531464T3 (en) 2008-06-24 2015-03-16 Csl Behring Gmbh Factor VIII, von Willebrand factor or its complexes with prolonged in vivo half-life
US20100048488A1 (en) * 2008-08-01 2010-02-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
AU2009296246B2 (en) 2008-09-26 2015-07-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Frizzled-binding agents and uses thereof
EP2365979A2 (en) * 2008-10-22 2011-09-21 Biogen Idec MA Inc. Recombinant fcrn and variants thereof for purification of fc-containing fusion proteins
EP3693014A1 (en) 2008-11-13 2020-08-12 The General Hospital Corporation Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation bmp-6
EP2350271B1 (en) 2008-11-20 2016-01-27 Biogen MA Inc. Arginine inactivation of enveloped viruses
AU2009335715B2 (en) 2008-12-19 2016-09-15 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
US9238878B2 (en) 2009-02-17 2016-01-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
WO2010111414A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 Bayer Healthcare Llc Factor viii variants and methods of use
EP2411038B1 (en) 2009-03-27 2016-12-28 Van Andel Research Institute Parathyroid hormone peptides and parathyroid hormone-related protein peptides and methods of use
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
CA2759333A1 (en) * 2009-04-22 2010-10-28 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites
SG176858A1 (en) 2009-06-16 2012-02-28 Univ Indiana Res & Tech Corp Gip receptor-active glucagon compounds
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
CN102741422B (en) 2009-08-24 2016-06-08 阿穆尼克斯运营公司 Factor VII composition and preparation and application thereof
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
RU2015153109A (en) 2009-09-16 2019-01-15 Дженентек, Инк. SUPERSPIRAL AND / OR BINDING PROTEIN COMPLEXES AND THEIR APPLICATIONS
US9662271B2 (en) 2009-10-23 2017-05-30 Amgen Inc. Vial adapter and system
NZ600278A (en) 2009-11-13 2014-04-30 Grifols Therapeutics Inc Von willebrand factor (vwf)-containing preparations, and methods, kits, and uses related thereto
CN102791285A (en) 2009-12-06 2012-11-21 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 Factor VIII-Fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
US8703701B2 (en) 2009-12-18 2014-04-22 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
TWI535445B (en) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Wnt antagonists and methods of treatment and screening
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
EP2528618A4 (en) 2010-01-27 2015-05-27 Univ Indiana Res & Tech Corp Glucagon antagonist - gip agonist conjugates and compositions for the treatment of metabolic disorders and obesity
WO2011116026A2 (en) 2010-03-15 2011-09-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Inhibitors of beta integrin-g protein alpha subunit binding interactions
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
EP2371857A1 (en) 2010-04-01 2011-10-05 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for treating interstitial lung disease
CN102971337B (en) 2010-04-01 2016-09-21 昂考梅德药品有限公司 FZ combines medicament and application thereof
EP2569000B1 (en) 2010-05-13 2017-09-27 Indiana University Research and Technology Corporation Glucagon superfamily peptides exhibiting nuclear hormone receptor activity
EA032537B1 (en) 2010-06-07 2019-06-28 Эмджен Инк. Method of operation of a drug delivery device
CN103068842B (en) 2010-06-16 2016-10-19 印第安纳大学研究及科技有限公司 Insulin receptor INSR is had highly active single-chain insulin agonist
MX2012014576A (en) 2010-06-24 2013-02-21 Univ Indiana Res & Tech Corp Amide based glucagon superfamily peptide prodrugs.
EP2585102B1 (en) 2010-06-24 2015-05-06 Indiana University Research and Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
MX2013000301A (en) 2010-07-09 2013-05-09 Biogen Idec Hemophilia Inc Chimeric clotting factors.
WO2012006623A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
CN103140237A (en) 2010-07-09 2013-06-05 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 Factor ix polypeptides and methods of use thereof
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
WO2012025530A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
US20120237975A1 (en) 2010-10-01 2012-09-20 Jason Schrum Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2655401B1 (en) 2010-12-20 2016-03-09 The Regents of the University of Michigan Inhibitors of the epidermal growth factor receptor-heat shock protein 90 binding interaction
MA34885B1 (en) 2010-12-22 2014-02-01 Indiana Unversity Res And Technology Corp GLUCAGON ANALOGS HAVING A GIP RECEPTOR ACTIVITY
SG191153A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Hoffmann La Roche Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
RU2606016C2 (en) 2011-01-14 2017-01-10 Редвуд Байосайнс, Инк. Aldehyde marked immunoglobulin polypeptides and methods of their application
PE20140303A1 (en) * 2011-02-10 2014-03-22 Roche Glycart Ag MUTANT INTERLEUQUIN-2 POLYPEPTIDES
ES2549638T3 (en) 2011-02-28 2015-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding proteins
CN103403025B (en) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 Monovalent antigen binding protein
CA2829037C (en) 2011-03-09 2022-05-17 Csl Behring Gmbh Factor xii inhibitors for the administration with medical procedures comprising contact with artificial surfaces
EP2497489A1 (en) 2011-03-09 2012-09-12 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for the treatment of silent brain ischemia and ischemia of other organs
WO2012135315A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Amgen Inc. Vial adapter and system
EP2691101A2 (en) 2011-03-31 2014-02-05 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
LT2699293T (en) 2011-04-20 2019-04-25 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
EA201892619A1 (en) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг IMMUNOCONJUGATES CONTAINING INTERLEUKIN-2 MUTANT POLYPETIPS
PE20141454A1 (en) 2011-05-06 2014-10-23 Us Gov Health & Human Serv RECOMBINANT IMMUNOTOXIN TARGETING MESOTHELIN
WO2012170969A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
US9156902B2 (en) 2011-06-22 2015-10-13 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
EP2729161B1 (en) 2011-07-08 2018-12-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
JP6253578B2 (en) 2011-07-22 2017-12-27 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー Inhibitory anti-factor XII / XIIA monoclonal antibodies and their use
EA028914B1 (en) 2011-07-25 2018-01-31 Байоджен Хемофилия Инк. Assays to monitor bleeding disorders
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2850624A1 (en) 2011-10-03 2013-04-11 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US9597378B2 (en) 2011-10-06 2017-03-21 Hanmi Science Co., Ltd. Blood coagulation factor VII and VIIa derivatives, conjugates and complexes comprising the same, and use thereof
EP3335747B1 (en) 2011-10-14 2021-04-07 Amgen Inc. Injector and method of assembly
JP6158090B2 (en) * 2011-10-31 2017-07-05 ダニエル・ジェイ・カポン Flexible antibody-like molecule containing non-peptide hinge
CA2847246A1 (en) 2011-11-17 2013-05-23 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon superfamily peptides exhibiting glucocorticoid receptor activity
KR20140102759A (en) 2011-12-16 2014-08-22 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
CN104114183A (en) 2011-12-20 2014-10-22 印第安纳大学研究及科技有限公司 CTP-based insulin analogs for treatment of diabetes
EP3453402B1 (en) 2012-01-12 2021-07-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Reducing immunogenicity against factor viii in individuals undergoing factor viii therapy
BR112014017165B1 (en) 2012-01-12 2023-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc CHIMERIC PROTEIN COMPRISING A FACTOR VIII PROTEIN, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, AND USES THEREOF
EP2623110A1 (en) 2012-01-31 2013-08-07 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for the treatment of neurological inflammatory disorders
KR20140127854A (en) 2012-02-10 2014-11-04 제넨테크, 인크. Single-chain antibodies and other heteromultimers
JP6256882B2 (en) 2012-02-15 2018-01-10 アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド Factor VIII composition, and method of making and use of the composition
PL2814502T3 (en) 2012-02-15 2018-02-28 Csl Behring Gmbh Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity
JP6383666B2 (en) 2012-02-15 2018-08-29 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド Recombinant factor VIII protein
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
CA2868398A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
CA2870149A1 (en) * 2012-05-03 2013-11-07 Medimmune, Llc Method for analyzing sample components
AU2013270683A1 (en) 2012-06-08 2014-12-11 Biogen Ma Inc. Chimeric clotting factors
JP2015521589A (en) 2012-06-08 2015-07-30 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． Procoagulant compounds
KR20150039748A (en) 2012-06-21 2015-04-13 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 Analogs of glucagon exhibiting gip receptor activity
WO2013192131A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Indiana University Research And Technology Corporation Incretin receptor ligand polypeptide fc-region fusion polypeptides and conjugates with altered fc-effector function
CA2877358A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting gip receptor activity
RU2015100656A (en) 2012-06-27 2016-08-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг METHOD FOR PRODUCING ANTIBODY FC-FRAGMENT CONNECTING, INCLUDING AT LEAST ONE CONNECTING GROUP, WHICH SPECIALLY RELATED TO THE TARGET, AND THEIR APPLICATION
WO2014001324A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Hoffmann-La Roche Ag Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
EP2870250B2 (en) 2012-07-06 2022-06-29 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
SG10201913893XA (en) 2012-07-11 2020-03-30 Bioverativ Therapeutics Inc Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof
JP2015528003A (en) * 2012-07-13 2015-09-24 ザイムワークス，インコーポレイテッド Bispecific asymmetric heterodimer comprising anti-CD3 construct
EP2877202A4 (en) 2012-07-25 2016-06-01 Biogen Ma Inc Blood factor monitoring assay and uses thereof
BR112015002263A2 (en) 2012-08-02 2017-12-12 Hoffmann La Roche fusion polypeptide, dimeric fusion polypeptide, method for producing a soluble fc receptor, use of an immobilized fusion polypeptide and pharmaceutical composition
EP2900328A4 (en) 2012-09-25 2016-05-11 Biogen Ma Inc Methods of using fix polypeptides
WO2014063108A1 (en) 2012-10-18 2014-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
CA2887711A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using wnt pathway-binding agents
US20150266944A1 (en) 2012-10-30 2015-09-24 Biogen Idec Ma Inc. Methods of Using FVIII Polypeptide
ES2780395T3 (en) 2012-11-21 2020-08-25 Amgen Inc Drug delivery device
JP6144355B2 (en) 2012-11-26 2017-06-07 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． Chemically modified mRNA
US10717965B2 (en) 2013-01-10 2020-07-21 Gloriana Therapeutics, Inc. Mammalian cell culture-produced neublastin antibodies
CN105073195A (en) 2013-02-04 2015-11-18 昂科梅德制药有限公司 Methods and monitoring of treatment with a Wnt pathway inhibitor
EP3889173B1 (en) 2013-02-15 2023-07-05 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor viii gene
CA2901225C (en) 2013-03-08 2023-09-19 Csl Behring Gmbh Treatment and prevention of remote ischemia-reperfusion injury
US20160017017A1 (en) 2013-03-11 2016-01-21 Novo Nordisk Healthcare Ag Growth Hormone Compounds
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
PT3666283T (en) 2013-03-15 2022-09-13 Bioverativ Therapeutics Inc Factor viii polypeptide formulations
US10492990B2 (en) 2013-03-15 2019-12-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
MX359794B (en) 2013-03-15 2018-10-10 Intrinsic Lifesciences Llc Anti-hepcidin antibodies and uses thereof.
JP6336564B2 (en) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド Drug cassette, auto-injector, and auto-injector system
CA2899089C (en) 2013-03-15 2021-10-26 Biogen Ma Inc. Factor ix polypeptide formulations
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
PT3611180T (en) * 2013-03-15 2022-03-15 Biomolecular Holdings Llc Hybrid immunoglobulin containing non-peptidyl linkage
CN113559363B (en) 2013-03-22 2023-10-31 美国安进公司 Syringe and method of assembly
EP2796145B1 (en) 2013-04-22 2017-11-01 CSL Ltd. A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge
US20160166660A1 (en) 2013-06-28 2016-06-16 Csl Behring Gmbh Combination therapy using a factor xii inhibitor and a c-1 inhibitor
AR096891A1 (en) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd CONJUGATE OF BIOMOLOGICALLY ACTIVE POLYPEPTIDE MONOMER AND CONJUGATE OF FRAGMENTO FC OF IMMUNOGLOBULINA, THAT SHOWS CLEARING THROUGH REDUCED RECEPTOR, AND THE METHOD FOR PREPARING THE SAME
EP3043813B1 (en) 2013-08-08 2021-01-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Purification of chimeric fviii molecules
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
CN103397009B (en) * 2013-08-16 2015-06-03 安源生物科技(上海)有限公司 Improved-type human coagulation factor FVII-Fc fusion protein as well as preparation method and application thereof
CN103599527A (en) * 2013-08-16 2014-02-26 安源生物科技(上海)有限公司 Pharmaceutical composition containing modified type human coagulation factor FVII-Fc fusion protein
US9322037B2 (en) * 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
EP3048899B1 (en) 2013-09-25 2021-09-08 Bioverativ Therapeutics Inc. On-column viral inactivation methods
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
JP2016538829A (en) 2013-10-03 2016-12-15 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． Polynucleotide encoding low density lipoprotein receptor
MX2016003593A (en) 2013-10-11 2016-06-02 Hoffmann La Roche Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies.
JP7051293B2 (en) 2013-10-24 2022-04-11 アムジエン・インコーポレーテツド Drug delivery system with temperature sensing control
US11097055B2 (en) 2013-10-24 2021-08-24 Amgen Inc. Injector and method of assembly
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
WO2015070210A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Wake Forest University Health Sciences Epha3 and multi-valent targeting of tumors
MX2016006572A (en) 2013-11-27 2016-12-09 Zymeworks Inc Bispecific antigen-binding constructs targeting her2.
EP4332839A2 (en) 2013-12-06 2024-03-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
US10137170B2 (en) 2013-12-20 2018-11-27 Indiana University Research And Technology Corporation Lipidated incretin receptor ligand human immunoglobulin Fc-region fusion polypeptides
JP2017500017A (en) 2013-12-20 2017-01-05 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． Use of perfusion seed cultures to improve biopharmaceutical fed-batch production capacity and product quality
RS63583B1 (en) 2014-01-10 2022-10-31 Bioverativ Therapeutics Inc Factor viii chimeric proteins and uses thereof
EP3102589A1 (en) 2014-02-04 2016-12-14 Biogen MA Inc. Use of cation-exchange chromatography in the flow-through mode to enrich post-translational modifications
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
SI3701971T1 (en) * 2014-03-14 2023-01-31 Biomolecular Holdings LLC, Compounds useful in preparing hybrid immunoglobulin containing non-peptidyl linkage
WO2015157595A1 (en) * 2014-04-11 2015-10-15 Medimmune, Llc Conjugated compounds comprising cysteine-engineered antibodies
SG11201609219QA (en) 2014-05-07 2016-12-29 Amgen Inc Autoinjector with shock reducing elements
KR102506249B1 (en) 2014-06-03 2023-03-03 암겐 인코포레이티드 Drug delivery system and method of use
AU2015276089B2 (en) 2014-06-18 2021-03-18 Csl Behring Gmbh Therapy using a Factor XII inhibitor in a neurotraumatic disorder
US11008561B2 (en) 2014-06-30 2021-05-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor IX gene
CN106659771B (en) 2014-07-02 2021-09-24 康诺贝林伦瑙有限公司 Modified von Willebrand factor
WO2016049036A1 (en) 2014-09-22 2016-03-31 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
AP2017009826A0 (en) 2014-09-26 2017-03-31 Bayer Pharma AG Stabilized adrenomedullin derivatives and use thereof
CA2957960C (en) 2014-10-14 2023-08-22 Amgen, Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
NZ730563A (en) 2014-10-14 2019-05-31 Halozyme Inc Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same
MA40864A (en) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc HYPOTAURINE, GABA, BETA-ALANINE AND CHOLINE FOR THE REGULATION OF THE ACCUMULATION OF RESIDUAL BY-PRODUCTS IN MAMMAL CELL CULTURE PROCESSES
JP6730278B2 (en) * 2014-11-27 2020-07-29 ノヴォ ノルディスク アー／エス GLP-1 derivative and use thereof
EP3227332B1 (en) 2014-12-03 2019-11-06 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
JP6716566B2 (en) 2014-12-19 2020-07-01 アムジエン・インコーポレーテツド Drug delivery device with proximity sensor
EP3233159B1 (en) 2014-12-19 2020-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
JP7264592B2 (en) 2015-01-26 2023-04-25 ザ ユニバーシティー オブ シカゴ IL13Rα2 BINDING AGENTS AND THEIR USE IN CANCER THERAPY
JP6912386B2 (en) 2015-01-26 2021-08-04 ザ ユニバーシティー オブ シカゴ CAR T cells that recognize cancer-specific IL13Rα2
KR20170110129A (en) 2015-02-05 2017-10-10 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Antibodies comprising ionic concentration dependent antigen binding domains, Fc region variants, antibodies that bind to IL-8, and their use
ES2748750T3 (en) 2015-02-17 2020-03-17 Amgen Inc Drug delivery device with vacuum assisted clamping and / or feedback
ES2905870T3 (en) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Drug delivery device having a needle guard mechanism with an adjustable threshold resistance to movement of the needle guard
US9975934B2 (en) 2015-03-26 2018-05-22 Acceleron Pharma Inc. Follistatin-related fusion proteins
ES2774011T3 (en) 2015-05-22 2020-07-16 CSL Behring Lengnau AG Truncated von Willebrand factor polypeptides to treat hemophilia
EP4089109A3 (en) 2015-05-22 2023-03-01 CSL Behring Lengnau AG Methods for preparing modified von willebrand factor
ES2784603T3 (en) 2015-06-02 2020-09-29 Novo Nordisk As Insulins with recombinant polar extensions
BR112018002150A2 (en) 2015-08-03 2018-09-18 Bioverativ Therapeutics Inc factor ix fusion proteins and methods of manufacturing and using them
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
CR20180217A (en) 2015-09-18 2018-05-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTIBODIES THAT JOIN INTERLEUCINE 8 (IL-8) AND ITS USES
MA43348A (en) 2015-10-01 2018-08-08 Novo Nordisk As PROTEIN CONJUGATES
WO2017070167A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for modified factor ix fusion proteins
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
CN105384828B (en) * 2015-12-18 2019-06-21 中国科学技术大学 Long-acting interferon-α and its remodeling method
EP3184149A1 (en) 2015-12-23 2017-06-28 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Soluble glycoprotein v for treating thrombotic diseases
RU2647769C2 (en) * 2015-12-30 2018-03-19 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Chemeric improved recombinant factor viii
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
BR112018013861A2 (en) 2016-01-07 2018-12-18 Csl Behring Recombinant Facility Ag polypeptide, complex, pharmaceutical composition, methods for treating a blood clotting disorder, for producing a polypeptide and dimer of a polypeptide, for increasing factor viii half life and for increasing dimerization of said polypeptide, use of a polypeptide, kit pharmaceutical, plasmid or vector, and host cell
SG11201805494WA (en) 2016-01-07 2018-07-30 Csl Behring Recombinant Facility Ag Mutated von willebrand factor
CN108779176A (en) 2016-01-11 2018-11-09 印希比股份有限公司 Multivalence and polyspecific 41BB combination fusion proteins
DK3411478T3 (en) 2016-02-01 2022-09-12 Bioverativ Therapeutics Inc OPTIMIZED FACTOR VIII GENES
CN106397598B (en) * 2016-02-23 2020-07-14 上海交通大学 Expression and preparation method of multivalent multispecific antibody and immune hybrid protein
CN106397599B (en) 2016-02-23 2020-08-07 上海交通大学 Expression and preparation method of bivalent and bispecific antibody hybrid protein
EP3721922B1 (en) 2016-03-15 2022-05-04 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
JP7456723B2 (en) 2016-04-06 2024-03-27 シーエスエル、リミテッド How to treat atherosclerosis
WO2017181145A1 (en) * 2016-04-14 2017-10-19 Iconic Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating disorders associated with νeοvascularization
CA3019398A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
EP3453758A4 (en) 2016-05-02 2019-12-04 Ajinomoto Co., Inc. Azide group-containing fc protein
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
JP7084878B2 (en) 2016-05-16 2022-06-15 武田薬品工業株式会社 Anti-factor IX Padua antibody
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
CA3038292A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Cohbar, Inc. Therapeutic mots-c related peptides
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
US11249082B2 (en) 2016-10-29 2022-02-15 University Of Miami Zika virus assay systems
DK3538134T3 (en) 2016-11-11 2022-02-07 CSL Behring Lengnau AG TRUNKED VON WILLEBRAND FACTOR POLYPEPTIDES FOR EXTRAVASCULAR ADMINISTRATION FOR THE TREATMENT OR PROPHYLAXATION OF A BLOOD COAGULATION DISORDER
AU2017358861B2 (en) 2016-11-11 2022-02-17 CSL Behring Lengnau AG Truncated von Willebrand Factor polypeptides for treating hemophilia
BR112019011198A2 (en) 2016-12-02 2019-12-17 Bioverativ Therapeutics Inc methods of inducing immune tolerance to coagulation factors
IL266972B2 (en) 2016-12-02 2024-04-01 Bioverativ Therapeutics Inc Methods of treating hemophilic arthropathy using chimeric clotting factors
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
EP3573641A4 (en) * 2017-01-25 2020-11-11 Iconic Therapeutics, Inc. Methods for treating disorders associated with angiogenesis and neovascularization
EP3579870A4 (en) 2017-02-07 2020-12-30 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) Phospholipid ether (ple) car t cell tumor targeting (ctct) agents
JP7064501B2 (en) 2017-02-17 2022-05-10 アムジエン・インコーポレーテツド Drug delivery device with sterile fluid flow path and related assembly methods
AU2018221351B2 (en) 2017-02-17 2023-02-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
US11117930B2 (en) 2017-02-23 2021-09-14 Adrx, Inc. Peptide inhibitors of transcription factor aggregation
US11850262B2 (en) 2017-02-28 2023-12-26 Purdue Research Foundation Compositions and methods for CAR T cell therapy
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
IL268478B2 (en) 2017-03-07 2023-10-01 Amgen Inc Needle insertion by overpressure
JP2020509837A (en) 2017-03-09 2020-04-02 アムジエン・インコーポレーテツド Insertion mechanism for drug delivery device
WO2018170134A1 (en) * 2017-03-14 2018-09-20 Ohio State Innovation Foundation Methods and compositions related to a tissue factor-targeting igg3 immunoconjugates
CN110446499A (en) 2017-03-20 2019-11-12 豪夫迈·罗氏有限公司 A kind of method of external glycosyl engineering erythropoiesis stimulating protein
CN110446512B (en) 2017-03-28 2022-03-18 美国安进公司 Plunger rod and syringe assembly systems and methods
WO2018185131A2 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Novo Nordisk A/S Oligomer extended insulin-fc conjugates
JP7248588B2 (en) * 2017-04-21 2023-03-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド Use of KLK5 antagonists for the treatment of disease
AU2018266847A1 (en) * 2017-05-10 2019-11-28 Albajuna Therapeutics, S.L. Fc-fusion protein derivatives with high dual HIV antiviral and immunomodulatory activity
JP2020523035A (en) 2017-06-07 2020-08-06 エーディーアールエックス， インコーポレイテッド Tau aggregation inhibitor
US11590294B2 (en) 2017-06-08 2023-02-28 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
EP3634546A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
ES2966835T3 (en) 2017-06-22 2024-04-24 CSL Behring Lengnau AG Modulation of FVIII immunogenicity by truncated VWF
MX2019015472A (en) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Device activation impact/shock reduction.
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
MA49626A (en) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc GAS PERMEABLE SEALING ELEMENT FOR DRUG CONTAINER AND ASSEMBLY PROCEDURES
WO2019022951A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
WO2019022950A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
CN111247251A (en) 2017-08-09 2020-06-05 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 Nucleic acid molecules and uses thereof
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
US11453701B2 (en) 2017-08-18 2022-09-27 Adrx, Inc. Tau aggregation peptide inhibitors
MA49897A (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc ON-BODY INJECTOR WITH STERILE ADHESIVE PATCH
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. Flow adapter for drug delivery device
CN111132711B (en) 2017-10-06 2022-07-01 安进公司 Drug delivery device with interlocking components and related assembly methods
EP3694578A1 (en) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
WO2019090079A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
WO2019089178A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
WO2019090303A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
CA3079665A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
MX2020005066A (en) 2017-11-16 2020-08-20 Amgen Inc Autoinjector with stall and end point detection.
WO2019099324A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
JP7002927B2 (en) 2017-11-22 2022-01-20 本田技研工業株式会社 Drive shaft arrangement structure
TW201940182A (en) 2018-01-22 2019-10-16 美商安德賽特公司 Methods of use for CAR T cells
BR112020015228A2 (en) 2018-02-01 2020-12-29 Bioverativ Therapeutics Inc. USE OF LENTIVIRAL VECTORS THAT EXPRESS FACTOR VIII
EA202092316A1 (en) 2018-03-28 2021-05-25 Бристол-Маерс Сквибб Компани FUSION PROTEINS OF INTERLEUKIN-2 / ALPHA-RECEPTOR OF INTERLEUKIN-2 AND METHODS OF APPLICATION
CU24554B1 (en) 2018-05-07 2021-11-04 Ct Inmunologia Molecular FUSION PROTEINS COMPOSED OF INTERLEUKIN 2 MUTEIN AND TYPE 1 INTERFERON
MA52630A (en) 2018-05-18 2021-05-26 Bioverativ Therapeutics Inc HEMOPHILIA A TREATMENT METHODS
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
US11830582B2 (en) 2018-06-14 2023-11-28 University Of Miami Methods of designing novel antibody mimetics for use in detecting antigens and as therapeutic agents
JP2021529763A (en) 2018-07-03 2021-11-04 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ FGF-21 preparation
EP3826701A1 (en) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
CA3103682A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
US20210228815A1 (en) 2018-07-24 2021-07-29 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
EP3829692A1 (en) 2018-07-31 2021-06-09 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
EP3833766A1 (en) 2018-08-09 2021-06-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
MA53724A (en) 2018-09-24 2021-12-29 Amgen Inc INTERVENTIONAL DOSING SYSTEMS AND METHODS
AU2019350660A1 (en) 2018-09-28 2021-03-18 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
AR116679A1 (en) 2018-10-02 2021-06-02 Amgen Inc INJECTION SYSTEMS FOR THE ADMINISTRATION OF DRUGS WITH INTERNAL FORCE TRANSMISSION
EP3860686A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
CN109439679A (en) * 2018-10-09 2019-03-08 上海市儿童医院 A kind of high activity recombinant human plasma thromboplastin component fusion protein and preparation method thereof
SG11202103800RA (en) 2018-10-15 2021-05-28 Amgen Inc Drug delivery device having damping mechanism
CA3109988A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
WO2020086408A1 (en) 2018-10-26 2020-04-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A high-yield perfusion-based transient gene expression bioprocess
MA54057A (en) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc DRUG DELIVERY ELEMENT PARTIAL RETRACTION DRUG DELIVERY DEVICES
WO2020092056A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial needle retraction
EP3873566A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
AU2020216135A1 (en) 2019-01-28 2021-08-05 Cohbar, Inc. Therapeutic peptides
EP3941509A1 (en) 2019-03-19 2022-01-26 CSL Behring Lengnau AG Factor ix variants and uses thereof in therapy
AU2020258483A1 (en) 2019-04-17 2021-11-11 Evox Therapeutics, Ltd. Compositions of exosomes and AAV
US20220160972A1 (en) 2019-04-24 2022-05-26 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
US20220211808A1 (en) 2019-05-17 2022-07-07 Universitaet Zuerich Haptoglobin for use in treating an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke
JP2022537369A (en) 2019-06-18 2022-08-25 バイエル アクチェンゲゼルシャフト Adrenomedullin-analogs and their use for long-term stabilization
KR20220029733A (en) 2019-07-04 2022-03-08 체에스엘 베링 렝나우 아게 truncated von Willebrand factor (VWF) to increase the in vitro stability of coagulation factor VIII
CA3148261A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
US20210113634A1 (en) 2019-09-30 2021-04-22 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
WO2021094344A1 (en) 2019-11-11 2021-05-20 CSL Behring Lengnau AG Polypeptides for inducing tolerance to factor viii
US20220395553A1 (en) 2019-11-14 2022-12-15 Cohbar, Inc. Cxcr4 antagonist peptides
CN115023444A (en) 2019-12-20 2022-09-06 再生元制药公司 Novel IL2 agonists and methods of use thereof
CN114981297A (en) 2019-12-23 2022-08-30 戴纳立制药公司 Proteinogenin variants
CN115362167A (en) 2020-02-06 2022-11-18 百时美施贵宝公司 IL-10 and uses thereof
TWI815194B (en) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 INTERLEUKIN-2-Fc FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE
JP2023551193A (en) 2020-11-20 2023-12-07 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー Methods for treating antibody-related rejection
KR20230142569A (en) 2021-02-01 2023-10-11 체에스엘 베링 아게 Methods for Treating or Preventing Secondary Neurological Adverse Events After Hemorrhagic Stroke
WO2022234070A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Csl Behring Ag Expression system for producing a recombinant haptoglobin (hp) beta chain
WO2022246055A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2024047219A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Csl Behring Ag Haptoglobin for use in treating or preventing exaggerated erectile response or erectile dysfunction

Family Cites Families (312)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US660843A (en) * 1900-05-16 1900-10-30 Rebecca Coyle Nursing-gown.
US786376A (en) 1902-05-15 1905-04-04 Fischer Motor Vehicle Company Electrogasolene-vehicle.
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
US4456591A (en) 1981-06-25 1984-06-26 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Therapeutic method for activating factor VII
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
AU561343B2 (en) 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US4444878A (en) 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5189015A (en) 1984-05-30 1993-02-23 Alfa-Laval Agri International Ab Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability
US5077204A (en) 1984-06-21 1991-12-31 Chiron Corporation Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use
US4849407A (en) 1986-08-13 1989-07-18 Zymogenetics, Inc. Biologically active mosaic proteins
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
DK525384D0 (en) * 1984-11-05 1984-11-05 Nordisk Insulinlab FACTOR PREPARATION VIII FOR THE TREATMENT OF HAEMOFILI A INHIBITOR PATIENTS AND PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF SUCH A PREPARATION
US5157021A (en) 1985-03-15 1992-10-20 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
DE3683980D1 (en) 1985-04-12 1992-04-02 Genetics Inst NEW PROCOAGULATION PROTEINS.
GR860984B (en) * 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4745055A (en) 1985-05-07 1988-05-17 California Biotechnology Inc. Fused protein for enzyme immunoassay system
KR910006424B1 (en) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 Method of manufacturing knitted briefs
US5180583A (en) * 1985-11-26 1993-01-19 Hedner Ulla K E Method for the treatment of bleeding disorders
EP0253870B1 (en) 1986-01-03 1993-03-31 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor viii:c-type proteins
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
IL78444A (en) 1986-04-08 1992-05-25 Yeda Res & Dev Human gamma interferon-specific receptor protein,antibody against said protein,and compositions containing said protein and antibody
US5543502A (en) 1986-06-24 1996-08-06 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
CA1340456C (en) 1986-07-07 1999-03-23 Hubert J.P. Schoemaker Chimeric rodent/human immunoglobulins specific for tumor-associated antigens
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
NO873164L (en) 1986-07-30 1988-02-01 Teijin Ltd MUSEUM-HUMAN CHEMICAL ANTIBODIES.
IL84285A (en) 1986-10-27 1993-03-15 Int Genetic Engineering Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen
GB8626412D0 (en) 1986-11-05 1986-12-03 Clark M R Antibodies
CA1339445C (en) 1986-11-12 1997-09-09 The General Hospital Corporation Recombinant hybrid immunoglobulin molecules and method of use
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5171844A (en) 1987-06-12 1992-12-15 Gist-Brocades N.W. Proteins with factor viii activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (en) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag FACTOR VIII: C-LIKE MOLECULE WITH COAGULATION ACTIVITY
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
FR2619314B1 (en) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa FACTOR VIII ANALOG, PREPARATION METHOD AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THE SAME
US6018026A (en) * 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
ZA89430B (en) * 1988-01-22 1989-10-25 Gen Hospital Corp Cloned genes encoding ig-cd4 fusion proteins and the use thereof
US5234830A (en) 1988-02-03 1993-08-10 Suntory Limited DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region
JP2643968B2 (en) 1988-02-03 1997-08-25 サントリー株式会社 KEX2 endoprotease and method for producing the same
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
KR0184860B1 (en) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 Single domain ligands receptors comprising said ligands methods for their production and use of said ligands
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FR2641468A1 (en) * 1989-01-11 1990-07-13 Merieux Inst Chimeric antibodies to human interleukin-2 receptor, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
SE8901687D0 (en) 1989-05-11 1989-05-11 Alfa Laval Agri Int FIBRONECTIN BINDING PROTEIN AS WELL AS IT'S PREPARATION
EP0474744B1 (en) 1989-05-22 1994-08-03 Zymogenetics, Inc. Pdgf -alpha- receptor
US5061786A (en) 1989-05-25 1991-10-29 Genentech, Inc. Biologically active polypeptides based on transforming growth factor-β
US5194596A (en) 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
DE69005740T2 (en) 1989-08-21 1994-06-01 Ngk Insulators Ltd Recording head consisting of a substrate carrying an electrode with a thin-walled contact end part, and layer for reinforcing the substrate.
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
JPH0396383A (en) 1989-09-08 1991-04-22 Riso Kagaku Corp Image forming device
ATE194384T1 (en) 1989-09-12 2000-07-15 Hoffmann La Roche TNF-BINDING PROTEINS
US5935815A (en) 1989-10-25 1999-08-10 Katholieke Universiteit Leuven Process for micro biological production of proteins
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
SE465222C5 (en) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab A recombinant human factor VIII derivative and process for its preparation
US5648273A (en) 1989-12-27 1997-07-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Hepatic growth factor receptor is the MET proto-oncogene
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (en) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc GENERATION OF XENOGENIC ANTIBODIES
GB9009106D0 (en) 1990-04-23 1990-06-20 3I Res Expl Ltd Processes and intermediates for synthetic antibody derivatives
CA2040099A1 (en) 1990-05-01 1991-11-02 Mariano Barbacid Tyrosine kinase negative trkb
ATE309376T1 (en) 1990-06-28 2005-11-15 Hoechst Ag FUSION PROTEINS WITH IMMUNGLOBULIN COMPONENTS, THEIR PRODUCTION AND USE
US20030064480A1 (en) 1990-06-28 2003-04-03 Leander Lauffer Fusion proteins with immunoglobulin portions, the preparation and use thereof
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5453491A (en) 1990-09-11 1995-09-26 Kiyoshi Takatsu Murine interleukin-5 receptor
ATE158816T1 (en) 1990-11-26 1997-10-15 Genetics Inst EXPRESSION OF PACE IN HOST CELLS AND METHODS OF USE THEREOF
ES2113940T3 (en) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc ENRICHMENT METHOD FOR PROTEIN VARIANTS WITH ALTERED UNION PROPERTIES.
WO1992010209A1 (en) * 1990-12-04 1992-06-25 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
US5374617A (en) 1992-05-13 1994-12-20 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of bleeding with modified tissue factor in combination with FVIIa
WO1992018628A1 (en) 1991-04-19 1992-10-29 Schering Corporation Subunit of the human interleukin-3 receptor
EP0636173B1 (en) * 1991-05-31 1998-09-02 Genentech, Inc. Treatment of hiv-associated immune thrombocytopenic purpura
US5227158A (en) 1991-06-10 1993-07-13 Genentech, Inc. Method of stimulating hepatocyte proliferation by administration of hepatocyte growth factor and gamma-interferon
US5346991A (en) 1991-06-13 1994-09-13 Genentech, Inc. Tissue factor mutants useful for the treatment of myocardial infarction and coagulopathic disorders
US5348856A (en) 1991-07-08 1994-09-20 E. R. Squibb & Sons, Inc. DNA encoding TRKC protein
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
US5116753A (en) * 1991-07-30 1992-05-26 The Salk Institute For Biological Studies Maintenance of pancreatic islets
US5932448A (en) * 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
US5454933A (en) * 1991-12-16 1995-10-03 Exxon Research And Engineering Company Deep desulfurization of distillate fuels
DE69309472T2 (en) * 1992-01-23 1997-10-23 Merck Patent Gmbh FUSION PROTEINS OF MONOMERS AND DIMERS OF ANTIBODY FRAGMENTS
FR2686899B1 (en) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa NOVEL BIOLOGICALLY ACTIVE POLYPEPTIDES, THEIR PREPARATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING THEM.
ATE244763T1 (en) 1992-02-11 2003-07-15 Cell Genesys Inc ACHIEVEMENT OF HOMOZYGOTE THROUGH TARGETED GENETIC EVENTS
WO1993024135A1 (en) 1992-05-26 1993-12-09 Immunex Corporation Novel cytokine that binds cd30
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
WO1994005328A1 (en) 1992-08-28 1994-03-17 The Scripps Research Institute Inhibition of tumor metastasis via neutralization of tissue factor function
GB2270845B (en) 1992-09-24 1996-07-10 Smiths Ind Med Syst Inc Suction catheter assemblies
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
ATE236987T1 (en) 1992-11-13 2003-04-15 Idec Pharma Corp CONSENSUS KOZAK SEQUENCES FOR MAMMAL EXPRESSION
US5648446A (en) * 1993-02-24 1997-07-15 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Diguanamines and preparation process, derivatives and use thereof
WO1994028017A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 The Scripps Research Institute Human mutant tissue factor compositions useful as tissue factor antagonists
US6518013B1 (en) 1993-06-07 2003-02-11 Trimeris, Inc. Methods for the inhibition of epstein-barr virus transmission employing anti-viral peptides capable of abrogating viral fusion and transmission
US6017536A (en) 1993-06-07 2000-01-25 Trimeris, Inc. Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities
US5464933A (en) 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
US6310180B1 (en) * 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
SE504074C2 (en) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Protein preparation for subcutaneous, intramuscular or intradermal administration
KR950003279A (en) 1993-07-29 1995-02-16 고사이 아끼오 Method for preparing fluoroalkane carboxamide derivatives
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6740734B1 (en) 1994-01-14 2004-05-25 Biovitrum Ab Bacterial receptor structures
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5648240A (en) 1994-05-24 1997-07-15 Texas A&M University MHC II analog from Staphylococcus aureus
HU220347B (en) 1994-07-11 2001-12-28 Board Of Regents The University Of Texas System Composition for the specific coagulation of vasculature
US6027726A (en) * 1994-09-30 2000-02-22 Inex Phamaceuticals Corp. Glycosylated protein-liposome conjugates and methods for their preparation
US5596080A (en) * 1994-10-03 1997-01-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Crosslinking processes/agents for zein
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
EP1323346B1 (en) * 1995-01-17 2006-06-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6030613A (en) * 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5591573A (en) * 1995-04-10 1997-01-07 Alpha Therapeutic Corporation Method and system for testing blood samples
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) * 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5579277A (en) * 1995-05-01 1996-11-26 Apple Computer, Inc. System and method for interleaving memory banks
US6184344B1 (en) 1995-05-04 2001-02-06 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
WO1996040191A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Trimeris, Inc. The treatment of hiv and other viral infections using combinatory therapy
US5840529A (en) 1995-08-02 1998-11-24 Clinical Research Institute Of Montreal Mammalian pro-hormone convertase
AU710696C (en) 1995-09-08 2002-10-24 Genentech Inc. VEGF-related protein
SE9503380D0 (en) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
US20030026779A1 (en) 1999-10-15 2003-02-06 Liming Yu Treatment of tumors and viral infections with a hybrid conjugate of interferon and an immunoglobulin Fc
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
CA2198968C (en) * 1996-03-04 2010-02-09 Toyofumi Masuda Process for production of secretory kex2 derivatives
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
JP2000515735A (en) 1996-07-03 2000-11-28 ジェネンテック インコーポレーテッド Hepatocyte growth factor receptor agonist
CA2203745A1 (en) 1996-07-26 1998-01-26 Robert Day Pro-protein converting enzyme
AU3968897A (en) 1996-08-02 1998-02-25 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
US6159462A (en) 1996-08-16 2000-12-12 Genentech, Inc. Uses of Wnt polypeptides
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
EP2003203A1 (en) 1996-12-23 2008-12-17 Immunex Corporation Ligand for receptor activator of nf-kappa b, ligand is member of TNF superfamily
US6271349B1 (en) 1996-12-23 2001-08-07 Immunex Corporation Receptor activator of NF-κB
CA2278106C (en) 1997-01-22 2005-04-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Tissue factor methods and compositions for coagulation and tumor treatment
TW502011B (en) * 1997-02-05 2002-09-11 Ajinomoto Kk Process for producing n-long-chain acyl acidic amino acids or salts thereof
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
RO120148B1 (en) 1997-03-14 2005-09-30 Idec Pharmaceuticals Corporation Vector system and method for integrating a dna fragment in the mammalian cells genome
US6673901B2 (en) 1997-06-12 2004-01-06 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
EP1001968B1 (en) 1997-06-13 2004-12-22 Gryphon Therapeutics, Inc. Solid phase native chemical ligation of unprotected or n-terminal cysteine protected peptides in aqueous solution
ES2205321T3 (en) * 1997-06-21 2004-05-01 Tesa Ag COMPOSED BASED ON ADHESIVE STRIPS AND ITS USE.
US6310183B1 (en) 1997-09-10 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Coagulation factor VIIa composition
DE19742706B4 (en) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag lipocalin muteins
AU737592B2 (en) 1998-01-23 2001-08-23 Immunex Corporation Il-18 receptors
JP2002505086A (en) 1998-02-25 2002-02-19 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション Enhanced circulating half-life of antibody-based fusion proteins
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
US6008321A (en) 1998-03-16 1999-12-28 Pharmacopeia, Inc. Universal linker for combinatorial synthesis
US6281331B1 (en) 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (en) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc ANTIBODIES VARIANTS AND FRAGMENTS THEREOF
EP1082137A4 (en) 1998-05-06 2004-05-19 Univ Temple REVERSAL OF PROINFLAMMATORY RESPONSE BY LIGATING THE MACROPHAGE Fc$g(g)RI RECEPTOR
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
AU4090299A (en) * 1998-05-20 1999-12-06 Sdg, Inc. Liposomal delivery complex
US6355782B1 (en) 1998-07-09 2002-03-12 Baylor College Of Medicine Hypohidrotic ectodermal dyplasia genes and proteins
AU766970B2 (en) 1998-07-15 2003-10-30 Genentech Inc. Tissue factor protein variants with increased affinity for coagulation factor FVII/FVIIa
ATE251181T1 (en) * 1998-07-28 2003-10-15 Micromet Ag HETEROMINI BODY
EP1105427A2 (en) * 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6927044B2 (en) 1998-09-25 2005-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-1 receptor based cytokine traps
JP4749548B2 (en) * 1998-09-30 2011-08-17 ニユー・イングランド・バイオレイブズ・インコーポレイテツド Intein-mediated peptide linkage
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
CN1810832B (en) 1998-10-23 2012-12-12 麒麟-安姆根有限公司 Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to MP1 receptor and having thrombopoietic activity
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
EP1127154B1 (en) 1998-11-06 2008-09-10 Novo Nordisk Health Care AG Method for the production of fvii
US6280994B1 (en) * 1998-11-25 2001-08-28 Zymogenetics, Inc. Zace 1: a human metalloenzyme
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
ES2329220T3 (en) 1999-01-06 2009-11-24 Genentech, Inc. MUTANT VARIANTS OF THE INSULIN SIMILAR GROWTH FACTOR (IGF)
EP1141014B1 (en) 1999-01-06 2004-12-08 Genentech, Inc. Insulin-like growth factor (igf) i mutant variant
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HUP0104865A3 (en) * 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
SE9901379D0 (en) 1999-04-19 1999-04-19 Pharmacia & Upjohn Ab Receptor structures
US6602977B1 (en) 1999-04-19 2003-08-05 Biovitrum Ab Receptor structures
CA2270600A1 (en) * 1999-05-03 2000-11-03 Infectio Recherche Inc. Method and formulations for the treatment of diseases, particularly those caused by human immunodeficiency virus and leishmania
ATE369384T1 (en) * 1999-05-19 2007-08-15 Emd Lexigen Res Ct Corp EXPRESSION AND EXPORT OF INTERFERON-ALPHA PROTEINS AS FC FUSION PROTEINS
CA2377381C (en) * 1999-07-01 2013-06-11 Yale University Neovascular-targeted immunoconjugates
JP2003503426A (en) * 1999-07-02 2003-01-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド FVIIa antagonist
WO2001002440A1 (en) 1999-07-02 2001-01-11 Genentech, Inc. Fusion peptides comprising a peptide ligand domain and a multimerization domain
US6469136B1 (en) 1999-07-07 2002-10-22 Trimeris, Inc. Methods and composition for peptide synthesis
EP1200124B1 (en) * 1999-07-13 2008-09-10 Bolder Biotechnology, Inc. Erythropoietin-immunoglobulin fusion proteins
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
BR0013231A (en) * 1999-08-09 2002-07-23 Lexigen Pharm Corp Multiple cytokine-antibody complexes
CN1407900A (en) * 1999-10-14 2003-04-02 人类基因组科学公司 Methods of treating or preventing cell, tissue, and organ damage using human myeloid progenitor inhibitory factor-1 (MPIF-1)
AU780693B2 (en) 1999-11-05 2005-04-14 Curis, Inc. Hedgehog fusion proteins and uses
EP1228214A2 (en) 1999-11-12 2002-08-07 MERCK PATENT GmbH Erythropoietin forms with improved properties
US6808902B1 (en) * 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
WO2001036637A1 (en) * 1999-11-17 2001-05-25 Immunex Corporation Receptor activator of nf-kappa b
DE19963859A1 (en) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- or oligomer of a di-, tri-, quattro- or pentamer of recombinant fusion proteins
ES2269366T3 (en) 2000-02-11 2007-04-01 Merck Patent Gmbh IMPROVEMENT OF AVERAGE LIFE IN CIRCULATION OF FUSION PROTEINS BASED ON ANTIBODIES.
DE60138364D1 (en) 2000-02-11 2009-05-28 Bayer Healthcare Llc CLEANING FACTOR VII OR VIIA CONJUGATE
AU2001249389A1 (en) 2000-03-22 2001-10-03 The Children's Hospital Of Philadelphia Modified blood clotting factors and methods of use
CA2407083A1 (en) * 2000-04-21 2001-11-01 Amgen Inc. Apo-ai/aii peptide derivatives
DE10020332A1 (en) 2000-04-26 2001-11-15 Henkel Kgaa Detergents and cleaning agents
US6756480B2 (en) 2000-04-27 2004-06-29 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
CA2407956A1 (en) 2000-05-03 2001-11-08 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US20020090646A1 (en) 2000-05-03 2002-07-11 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
BR0111182A (en) 2000-05-26 2004-02-25 Ortho Mcneil Pharm Inc Neuroprotective Peptides
AU2001270609A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
JP2004507557A (en) 2000-09-01 2004-03-11 グリフォン　セラピューティクス，インコーポレーテッド Nucleophilically stable thioester-forming compounds, methods of manufacture and use
EP1332209B1 (en) 2000-09-08 2009-11-11 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
US7208151B2 (en) 2001-09-12 2007-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Tweak receptor agonists as anti-angiogenic agents
US7138119B2 (en) * 2000-09-15 2006-11-21 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of HIV-1 infection
US7615537B2 (en) 2000-10-25 2009-11-10 Genzyme Corporation Methods for treating blood coagulation disorders
AU2002241556B2 (en) * 2000-11-01 2007-07-19 Elusys Therapeutics, Inc. Method of producing bispecific molecules by protein trans-splicing
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
EP2341060B1 (en) 2000-12-12 2019-02-20 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
WO2002060955A2 (en) 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceuticals Corporation Modified antibodies and methods of use
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
US20040132971A1 (en) * 2001-02-09 2004-07-08 Haaning Jesper Mortensen Rank ligand-binding polypeptides
RU2363707C2 (en) * 2001-02-19 2009-08-10 Мерк Патент Гмбх Artificial proteins with lowered adjuvanticity
US7235638B2 (en) 2001-03-22 2007-06-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Coagulation factor VII derivatives
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
CA2444854A1 (en) 2001-04-26 2002-11-07 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
AU2002310922A1 (en) 2001-05-04 2002-11-18 Institute Of Molecular And Cell Biology Interferons in the treatment of ischemia
US7419949B2 (en) 2001-07-16 2008-09-02 Novo Noridsk Healthcare A/G Single-dose administration of factor VIIa
US7144380B2 (en) * 2001-07-23 2006-12-05 Gilliam Larry A Traction method and device
DK1288433T3 (en) 2001-08-31 2006-05-01 Lille Zeger De Drilling rig Interior
ES2288900T3 (en) 2001-10-05 2008-02-01 Affimed Therapeutics Ag ANTIBODY OF HUMAN ORIGIN TO INHIBIT THE AGGREGATION OF THROMBOCYTES.
FR2831170B1 (en) 2001-10-19 2004-03-19 Inst Nat Sante Rech Med MODIFIED PROTEINS C DIRECTLY ACTIVABLE WITH THROMBIN
US20030078180A1 (en) 2001-10-24 2003-04-24 Benchmark Research & Technology, Inc. Contaminant-tolerant foaming additive
EP2277889B1 (en) 2001-12-21 2014-07-09 Human Genome Sciences, Inc. Fusion proteins of albumin and interferon beta
US20040102440A1 (en) 2002-07-01 2004-05-27 Wong Erik Ho Fong Method of promoting smoking cessation
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
JP4583762B2 (en) 2002-02-27 2010-11-17 イミュネックス・コーポレーション Polypeptide preparation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040018557A1 (en) 2002-03-01 2004-01-29 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
AU2002316574B2 (en) 2002-03-15 2008-05-01 Brandeis University Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
CA2491567A1 (en) 2002-07-01 2004-01-08 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Recombinant tissue protective cytokines and encoding nucleic acids thereof for protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues, and organs
AU2003232081B2 (en) 2002-07-03 2009-02-05 Brandeis University Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
US20040110929A1 (en) * 2002-07-12 2004-06-10 Bjorn Soren E. TF binding compound
AU2003242507A1 (en) 2002-07-12 2004-02-02 Novo Nordisk A/S A tissue factor binding immunoconjugate comprising factor viia
EP1534335B9 (en) 2002-08-14 2016-01-13 Macrogenics, Inc. Fcgammariib-specific antibodies and methods of use thereof
BRPI0314814C1 (en) 2002-09-27 2021-07-27 Xencor Inc antibody comprising an fc variant
PT1562972E (en) 2002-10-15 2010-11-10 Facet Biotech Corp Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
EP1624846A2 (en) 2003-05-06 2006-02-15 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
WO2004108885A2 (en) 2003-05-06 2004-12-16 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Fc chimeric proteins with anti-hiv drugs
SI2298347T1 (en) 2003-05-06 2016-03-31 Biogen Hemophilia Inc. Clotting factor chimeric proteins for treatment of a hemostatic disorder
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ATE385806T1 (en) 2003-06-12 2008-03-15 Lilly Co Eli FUSION PROTEINS
AU2003264100A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
EA036531B1 (en) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Type ii anti-cd20 humanized antibody (variants), pharmaceutical composition comprising these antibody variants, and use thereof
CA2545603A1 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
US8263084B2 (en) 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
EP1682584B1 (en) 2003-11-13 2013-04-17 Hanmi Science Co., Ltd. A pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin fc region as a carrier
JP2007511604A (en) 2003-11-18 2007-05-10 アイコニック セラピューティクス インコーポレイティッド Homogeneous preparation of chimeric protein
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
DE602005015542D1 (en) 2004-01-12 2009-09-03 Applied Molecular Evolution VARIANTS OF FC REGION
EP2053062A1 (en) 2004-03-24 2009-04-29 Xencor, Inc. Immunoglobin variants outside the Fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
NZ550772A (en) 2004-05-21 2009-10-30 Uab Research Foundation Variable lymphocyte receptors, related polypeptides and nucleic acids, and uses thereof
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
EP1919950A1 (en) 2004-07-15 2008-05-14 Xencor, Inc. Optimized fc variants
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
AU2005307789A1 (en) 2004-11-16 2006-05-26 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
KR100754667B1 (en) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 Immunoglobulin Fc fragment modified by non-peptide polymer and pharmaceutical composition comprising the same
CA2605024C (en) 2005-04-15 2018-05-22 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US7427787B2 (en) 2005-07-08 2008-09-23 Texas Instruments Incorporated Guardringed SCR ESD protection
US7666622B2 (en) 2005-10-19 2010-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Monomeric self-associating fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
EP1820508A1 (en) 2006-02-21 2007-08-22 CSL Behring GmbH Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties
CA2646508A1 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
SI2004683T1 (en) 2006-03-24 2016-09-30 Biogen Hemophilia Inc. Pc5 as a factor ix propeptide processing enzyme
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
EP3896090B1 (en) 2006-06-14 2022-01-12 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
EP1952822A1 (en) 2007-01-26 2008-08-06 Novo Nordisk A/S Factor VII polypeptides with increased affinity to platelets
WO2008131242A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
NZ581395A (en) 2007-05-14 2012-08-31 Biogen Idec Inc Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
AU2008314697B2 (en) 2007-10-22 2013-08-29 Merck Serono S.A. Single IFN-beta fused to a mutated lgG Fc fragment
TWI465247B (en) 2008-04-11 2014-12-21 Catalyst Biosciences Inc Factor vii polypeptides that are modified and uses thereof
CN104059155A (en) 2008-05-16 2014-09-24 拜耳医药保健有限公司 Targeted Coagulation Factors And Method Of Using The Same
ES2427627T3 (en) 2009-04-06 2013-10-31 Novo Nordisk A/S Targeted delivery of Factor VIII proteins to platelets
RU2563231C2 (en) 2009-06-25 2015-09-20 Дзе Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл Factor vii chimeric molecules
JP2013503140A (en) 2009-08-27 2013-01-31 ノヴォ ノルディスク アー／エス Targeting tissue factor to activated platelets
CN102791285A (en) 2009-12-06 2012-11-21 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 Factor VIII-Fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
AR081066A1 (en) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd INSULIN CONJUGATE WHERE AN IMMUNOGLOBULIN FRAGMENT IS USED
CN103140237A (en) * 2010-07-09 2013-06-05 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 Factor ix polypeptides and methods of use thereof
WO2012006623A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
MX2013000301A (en) 2010-07-09 2013-05-09 Biogen Idec Hemophilia Inc Chimeric clotting factors.
JP6309273B2 (en) 2011-03-02 2018-04-11 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー Targeting clotting factors to TLT-1 on activated platelets

Also Published As

Publication number Publication date
ATE446307T1 (en) 2009-11-15
NO342384B1 (en) 2018-05-14
CN102234334A (en) 2011-11-09
EP2357196A2 (en) 2011-08-17
PL2357196T3 (en) 2016-11-30
US8932830B2 (en) 2015-01-13
SI2361932T1 (en) 2016-08-31
US7862820B2 (en) 2011-01-04
BRPI0410345A8 (en) 2017-10-10
CY1114639T1 (en) 2016-08-31
EP3978508A1 (en) 2022-04-06
CY1117756T1 (en) 2017-05-17
CY1117764T1 (en) 2017-05-17
EP2357196A3 (en) 2011-11-30
EP2174946A1 (en) 2010-04-14
JP2014139244A (en) 2014-07-31
US9725496B1 (en) 2017-08-08
JP2018126153A (en) 2018-08-16
WO2004101739A3 (en) 2005-04-14
HK1161604A1 (en) 2012-07-27
US11401322B2 (en) 2022-08-02
PT2357196T (en) 2016-07-15
ES2431116T3 (en) 2013-11-25
HK1159649A1 (en) 2012-08-03
TWI353991B (en) 2011-12-11
EP1625209A4 (en) 2007-01-03
EP2357196B9 (en) 2016-10-05
US7404956B2 (en) 2008-07-29
EP2361932A1 (en) 2011-08-31
NO20160483A1 (en) 2006-01-04
CN1852736B (en) 2011-06-08
CA2522590C (en) 2016-08-09
EP1625209B1 (en) 2013-07-17
US20070172928A1 (en) 2007-07-26
JP6441432B2 (en) 2018-12-19
CN104448003B (en) 2019-03-26
EP3103809B1 (en) 2021-08-18
HUE030065T2 (en) 2017-04-28
SI1625209T1 (en) 2013-12-31
DK2357196T3 (en) 2016-08-15
BE2016C015I2 (en) 2023-08-09
US20150139947A1 (en) 2015-05-21
WO2005001025A2 (en) 2005-01-06
NO339539B1 (en) 2016-12-27
EP2361932B1 (en) 2016-05-04
CY2016007I1 (en) 2016-08-31
LU92991I2 (en) 2016-05-09
EP2361932B2 (en) 2022-06-22
CY2016007I2 (en) 2016-08-31
DK1625209T3 (en) 2013-10-28
DK2174946T3 (en) 2016-10-24
IL171779A (en) 2010-11-30
NO20055773L (en) 2006-01-04
US8329182B2 (en) 2012-12-11
DE602004023724D1 (en) 2009-12-03
LTPA2016007I1 (en) 2021-07-12
BRPI0410345A (en) 2006-05-30
NO20055773D0 (en) 2005-12-06
HUE031663T2 (en) 2017-07-28
EP3103809A1 (en) 2016-12-14
NO2017027I1 (en) 2017-06-23
US20110182919A1 (en) 2011-07-28
WO2004101739A2 (en) 2004-11-25
EA012566B1 (en) 2009-10-30
JP2012067142A (en) 2012-04-05
UA95436C2 (en) 2011-08-10
DK2361932T3 (en) 2016-08-15
FR16C0011I1 (en) 2016-04-22
PT2361932T (en) 2016-08-02
US20080249288A1 (en) 2008-10-09
HUS1600011I1 (en) 2016-04-28
JP2007500744A (en) 2007-01-18
US20050027109A1 (en) 2005-02-03
PT1625209E (en) 2013-10-24
SI2357196T1 (en) 2016-08-31
US20170226189A1 (en) 2017-08-10
PL1625209T3 (en) 2013-12-31
EP1654378A4 (en) 2006-09-13
NL300799I2 (en) 2016-09-01
EP1654378B1 (en) 2009-10-21
EP1654378A2 (en) 2006-05-10
JP5091480B2 (en) 2012-12-05
US20130171138A1 (en) 2013-07-04
NO2017028I1 (en) 2017-06-23
TW200510457A (en) 2005-03-16
BR122019011535B1 (en) 2021-08-31
US20050032174A1 (en) 2005-02-10
US20200071385A1 (en) 2020-03-05
CN102234334B (en) 2014-10-29
FR16C0011I2 (en) 2017-04-14
PL2361932T3 (en) 2016-11-30
US11168125B2 (en) 2021-11-09
LTPA2016028I1 (en) 2016-11-10
WO2005001025A3 (en) 2006-06-01
JP2016034977A (en) 2016-03-17
AU2004252422B2 (en) 2011-10-27
US7381408B2 (en) 2008-06-03
ES2579938T3 (en) 2016-08-17
SI2174946T1 (en) 2017-01-31
NO2017027I2 (en) 2017-06-23
EP2174946B1 (en) 2016-07-06
LTC1625209I2 (en) 2021-07-26
EP2357196B1 (en) 2016-05-04
AU2004252422A1 (en) 2005-01-06
US20220010000A1 (en) 2022-01-13
CN104448003A (en) 2015-03-25
CN1852736A (en) 2006-10-25
EA200501756A1 (en) 2006-08-25
US7820162B2 (en) 2010-10-26
US20110159540A1 (en) 2011-06-30
NO2017028I2 (en) 2017-06-23
EP1625209A2 (en) 2006-02-15
JP2018002737A (en) 2018-01-11
JP6526281B2 (en) 2019-06-05
US9636416B2 (en) 2017-05-02
US20230023927A1 (en) 2023-01-26
HUE030293T2 (en) 2017-04-28
US20170266309A1 (en) 2017-09-21
NO2020016I1 (en) 2020-06-12
IL205802A (en) 2013-12-31
CA2522590A1 (en) 2005-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2582947T3 (en) Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES2361036T3 (en) CHEMICAL PROTEINS VII-FC OF THE COAGULATION FACTOR FOR THE TREATMENT OF A HEMOSTATIC DISORDER.
US20050281829A1 (en) Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs
AU2012200470B2 (en) Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids
AU2013245463A1 (en) Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids