ES2575539T3

ES2575539T3 - Brassica plants comprising mutant FAD3 alleles

Info

Publication number: ES2575539T3
Application number: ES10781843.7T
Authority: ES
Inventors: Benjamin Laga; Peter Denolf
Original assignee: Bayer CropScience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 2009-11-20
Filing date: 2010-11-19
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2030-11-19
Also published as: AU2010321249A1; CN102712911B; US20120246755A1; CA2781278C; US9920303B2; SI2501804T1; PL2501804T3; EP2501804A1; CN102712911A; WO2011060946A1; CA2781278A1; DK2501804T3; EP2501804B1; AU2010321249B2; ZA201203654B

Abstract

Una planta de Brassica que comprende al menos dos alelos FAD3 mutantes, totalmente inactivados, en donde i. el primer alelo FAD3 mutante totalmente inactivado es un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado de un gen FAD3, comprendiendo dicho gen FAD3 una secuencia de nucleótidos que a. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 3; o b. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 11 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 12; o c. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 2 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 4; en donde dicho primer alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una secuencia de nucleótidos que a. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 3; o b. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 11 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 12; o c. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 2 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 4; y ii. el segundo alelo FAD3 mutante totalmente inactivado es un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado de un gen FAD3, comprendiendo dicho gen FAD3 una secuencia de nucleótidos que a. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 5, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 7 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 9; o b. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 13, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 14 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 15; o c. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 8 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 10; en donde dicho segundo alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una secuencia de nucleótidos que a. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 5, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 7 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 9; o b. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 13, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 14 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 15; o c. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 8 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 10; y en donde dichos al menos dos alelos FAD3 mutantes totalmente inactivados comprenden una mutación del grupo de: i. una deleción, mutación de desplazamiento de marco o de codón de parada que conduce a una deleción completa de la proteína; ii. una mutación de codón de parada, desplazamiento de marco o sitio de corte y empalme que conduce a un truncamiento de la proteína FAD3 que incluye el motivo de retención ER en una posición correspondiente a la posición 373-377 de SEQ ID NO: 2; iii. una mutación de sentido erróneo, por inserción o deleción en la secuencia que codifica el motivo de retención ER en una posición correspondiente a la posición 373-377 de SEQ ID NO: 2; iv. una mutación de sentido erróneo en el codón que codifica cualquiera de las histidinas conservadas en una posición correspondiente a la posición 92, 96, 128, 131, 132, 295, 298 ó 299 de SEQ ID NO: 2; y v. una mutación sin sentido que resulta del uso de un ATG alternativo como codón de inicio y la síntesis de una proteína truncada en el extremo N que carece de la secuencia señal putativa.A Brassica plant comprising at least two mutant FAD3 alleles, totally inactivated, where i. the first totally inactivated mutant FAD3 allele is a totally inactivated mutant FAD3 allele of an FAD3 gene, said FAD3 gene comprising a nucleotide sequence that a. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO : 3; or b. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 11 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO : 12; or c. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 2 and a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 4; wherein said first fully inactivated mutant FAD3 allele comprises a nucleotide sequence that a. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO : 3; or b. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 11 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO : 12; or c. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 2 and a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 4; and ii. the second totally inactivated mutant FAD3 allele is a totally inactivated mutant FAD3 allele of an FAD3 gene, said FAD3 gene comprising a nucleotide sequence that a. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 5, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO : 7 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 9; or b. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 13, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO : 14 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 15; or c. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 6, a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 8 and a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 10; wherein said second fully inactivated mutant FAD3 allele comprises a nucleotide sequence that a. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 5, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO : 7 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 9; or b. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 13, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO : 14 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 15; or c. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 6, a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 8 and a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 10; and wherein said at least two fully inactivated mutant FAD3 alleles comprise a mutation of the group of: i. a deletion, frame shift or stop codon mutation that leads to a complete deletion of the protein; ii. a stop codon mutation, frame shift or splice site that leads to a truncation of the FAD3 protein that includes the ER retention motif at a position corresponding to position 373-377 of SEQ ID NO: 2; iii. a missense mutation, by insertion or deletion in the sequence encoding the retention reason ER in a position corresponding to position 373-377 of SEQ ID NO: 2; iv. a missense mutation in the codon encoding any of the histidines conserved in a position corresponding to position 92, 96, 128, 131, 132, 295, 298 or 299 of SEQ ID NO: 2; and V. a nonsense mutation that results from the use of an alternative ATG as a start codon and the synthesis of a truncated protein at the N-terminus that lacks the putative signal sequence.

Description

Plantas de Brassica que comprenden alelos FAD3 mutantes Brassica plants comprising mutant FAD3 alleles

CAMPO DE LA INVENCIÓN FIELD OF THE INVENTION

Esta invención se refiere a plantas y partes de cultivo, en particular de la familia Brassicaceae, en particular especies de Brassica, con composición de ácidos grasos mejorada, más específicamente, con contenido reducido en ácido alfa-linolénico en la semilla. Esta invención también se refiere a una ácido graso desaturasa y a ácidos nucleicos que codifican proteínas desaturasa. Más particularmente, esta invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican proteínas delta-15 ácido graso desaturasa, y mutantes de las mismas, que afectan a la composición de ácidos grasos en el aceite de semillas de plantas. También se proporcionan métodos para identificar marcadores moleculares asociados con un contenido reducido de ácido alfa-linolénico en semillas en una población de plantas. This invention relates to plants and crop parts, in particular of the Brassicaceae family, in particular Brassica species, with improved fatty acid composition, more specifically, with reduced content of alpha-linolenic acid in the seed. This invention also relates to a fatty acid desaturase and nucleic acids encoding desaturase proteins. More particularly, this invention relates to nucleic acids encoding delta-15 fatty acid desaturase proteins, and mutants thereof, which affect the composition of fatty acids in plant seed oil. Methods for identifying molecular markers associated with a reduced content of alpha-linolenic acid in seeds in a plant population are also provided.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN BACKGROUND OF THE INVENTION

Los aceites vegetales son cada vez más importantes económicamente porque se utilizan ampliamente en las dietas humanas y animales y en muchas aplicaciones industriales. Sin embargo, las composiciones de ácidos grasos de estos aceites a menudo no son óptimas para muchos de estos usos. Debido a que se necesitan aceites especiales con especial composición de ácidos grasos tanto para fines nutricionales como industriales, existe un interés considerable en la modificación de la composición del aceite mediante el cultivo de plantas y/o mediante nuevas herramientas moleculares de la biotecnología vegetal. Vegetable oils are increasingly important economically because they are widely used in human and animal diets and in many industrial applications. However, the fatty acid compositions of these oils are often not optimal for many of these uses. Because special oils with special fatty acid composition are needed for both nutritional and industrial purposes, there is considerable interest in the modification of the oil composition through plant cultivation and / or through new molecular tools of plant biotechnology.

Los atributos de comportamiento y salud específicos de aceites comestibles se determinan en gran medida por su composición de ácidos grasos. La mayoría de los aceites vegetales derivados de variedades vegetales comerciales se componen principalmente de los ácidos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1), linoleico (C18:2) y linolénico (C18:3). Los ácidos palmítico y esteárico son, respectivamente, ácidos grasos saturados de 16 a 18 carbonos de longitud. Los ácidos oleico, linoleico y linolénico son ácidos grasos insaturados de 18 carbonos de longitud que contienen uno, dos y tres dobles enlaces, respectivamente. Al ácido oleico se le alude como un ácido graso mono-insaturado, mientras que a los ácidos linoleico y linolénico se les alude como ácidos grasos poliinsaturados. The specific behavioral and health attributes of edible oils are largely determined by their fatty acid composition. Most vegetable oils derived from commercial plant varieties are mainly composed of palmitic (C16: 0), stearic (C18: 0), oleic (C18: 1), linoleic (C18: 2) and linolenic (C18: 3 ). Palmitic and stearic acids are, respectively, saturated fatty acids 16 to 18 carbons in length. Oleic, linoleic and linolenic acids are unsaturated fatty acids of 18 carbons in length that contain one, two and three double bonds, respectively. Oleic acid is referred to as a mono-unsaturated fatty acid, while linoleic and linolenic acids are referred to as polyunsaturated fatty acids.

Especies de Brassica tales como Brassica napus (B. napus) y Brassica rapa (B. rapa) constituyen la tercera fuente más importante de aceite vegetal en el mundo. En Canadá, los científicos de plantas centraron sus esfuerzos en la creación de las denominadas variedades "doble bajas", que eran bajas en ácido erúcico en el aceite de semilla y bajas en glucosinolatos en la harina sólida que queda después de la extracción del aceite (es decir, un contenido en ácido erúcico inferior de 2,0 por ciento en peso, basado en el contenido total de ácidos grasos (denominado aquí en lo que sigue % en peso), y un contenido en glucosinolato inferior a 30 micromoles por gramo de la harina libre de aceite). Estas formas de mayor calidad de colza desarrolladas en Canadá se conocen como canola. Brassica species such as Brassica napus (B. napus) and Brassica rapa (B. rapa) constitute the third most important source of vegetable oil in the world. In Canada, plant scientists focused their efforts on the creation of the so-called "double low" varieties, which were low in erucic acid in seed oil and low in glucosinolates in the solid flour that remains after oil extraction ( that is, a content of erucic acid of less than 2.0 percent by weight, based on the total content of fatty acids (hereinafter referred to as% by weight), and a glucosinolate content of less than 30 micromoles per gram of oil free flour). These higher quality rapeseed forms developed in Canada are known as canola.

El aceite extraído de variedades naturales y anteriormente comercialmente útiles de canola contiene un contenido relativamente alto (8% -10%) de ácido alfa-linolénico (C18:3) (solicitud de patente de EE.UU. 20080034457). También se ha informado de valores más altos de, p. ej., 11% (http://www.canolacouncil.org/canola_oil_properties_and_uses.aspx). Este ácido graso trienoico es inestable y se oxida fácilmente durante la cocción lo cual, a su vez, crea malos sabores del aceite (Gailliard, 1980, Vol. 4, págs. 85116 En: Stumpf, P.K., comp. The Biochemistry of Plants, Academic Press, Nueva York). También desarrolla malos olores y sabores rancios durante el almacenamiento (Hawrysh, 1990, Stability of canola oil, Capítulo 7, págs. 99-122 En: F. Shahidi, comp. Canola and Rapeseed: Production, Chemistry, Nutrition, and Processing Technology, Van Nostrand Reinhold, Nueva York). Tanto el sabor como la calidad nutricional del aceite se mejora reduciendo los niveles de C18:3 en favor de C18:2 (Diepenbrock y Wilson, Crop Sci 27:75-77, 1987). Oil extracted from natural and previously commercially useful varieties of canola contains a relatively high content (8% -10%) of alpha-linolenic acid (C18: 3) (US patent application 20080034457). Higher values of, p. eg, 11% (http://www.canolacouncil.org/canola_oil_properties_and_uses.aspx). This trienoic fatty acid is unstable and oxidizes easily during cooking which, in turn, creates bad flavors of the oil (Gailliard, 1980, Vol. 4, pp. 85116 In: Stumpf, PK, comp. The Biochemistry of Plants, Academic Press, New York). It also develops odors and rancid flavors during storage (Hawrysh, 1990, Stability of canola oil, Chapter 7, pp. 99-122 In: F. Shahidi, comp. Canola and Rapeseed: Production, Chemistry, Nutrition, and Processing Technology, Van Nostrand Reinhold, New York). Both the taste and the nutritional quality of the oil are improved by reducing the levels of C18: 3 in favor of C18: 2 (Diepenbrock and Wilson, Crop Sci 27: 75-77, 1987).

Se sabe que la reducción del nivel de contenido en ácido alfa-linolénico mediante hidrogenación aumenta la estabilidad oxidativa del aceite. Desgraciadamente, la hidrogenación química conduce a la formación de ácidos grasos trans, que se han relacionado con niveles elevados de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL o colesterol "malo") en la sangre y, en consecuencia, a un mayor riesgo de enfermedad coronaria. It is known that reducing the level of alpha-linolenic acid content by hydrogenation increases the oxidative stability of the oil. Unfortunately, chemical hydrogenation leads to the formation of trans fatty acids, which have been linked to high levels of low-density lipoprotein cholesterol (LDL or "bad" cholesterol) in the blood and, consequently, to an increased risk of disease. coronary

Otra estrategia para mejorar la calidad del aceite es por el cultivo de variedades bajas en linolénico, que es particularmente desafiante, puesto que el contenido en C18:3 es un rasgo de múltiples genes y es heredado de manera recesiva, con una heredabilidad relativamente baja (documento WO 04072259). Burns et al. (Heredity 90:3948, 2003) identificaron cinco loci de rasgos cualitativos (QTL) asociados con el contenido en C18:3 en B. napus, de Another strategy to improve oil quality is the cultivation of low-linolenic varieties, which is particularly challenging, since the C18: 3 content is a multi-gene trait and is inherited recessively, with a relatively low heritability. WO 04072259). Burns et al. (Heredity 90: 3948, 2003) identified five qualitative trait loci (QTL) associated with the content in C18: 3 in B. napus, of

los cuales tres con efecto positivo se encuentra en N6, N7 y N18, y dos con efecto negativo en N7 y N11. El análisis genético de una población derivada del cruce entre "Stellar" (que tiene un bajo contenido en C18:3 (3%)) y "Drakkar“ (que tiene un nivel “convencional” de C18:3 (9-10%)) indicó que el rasgo C18:3 bajo fue controlado por dos loci principales con efectos aditivos, designados L1 y L2 (Jourdren et al., Euphytica 90:351-357, 1996). Se encontró que which three with positive effect is found in N6, N7 and N18, and two with negative effect in N7 and N11. The genetic analysis of a population derived from the cross between "Stellar" (which has a low content in C18: 3 (3%)) and "Drakkar" (which has a "conventional" level of C18: 3 (9-10%) ) indicated that the C18: 3 low trait was controlled by two main loci with additive effects, designated L1 and L2 (Jourdren et al., Euphytica 90: 351-357, 1996).

5 estos dos loci principales que controlan el contenido de C18:3 corresponden a dos genes FAD3 (ácido graso desaturasa 3); uno situado en un genoma A (procedente de Brassica rapa) en N4 y el otro en el genoma C (procedentes de Brassica oleracea) en N14 (Jourdren et al, Theor Appl Genet 93:512-518, 1996; Barret et al., GCIRC, 1999). 5 these two main loci that control the content of C18: 3 correspond to two FAD3 genes (fatty acid desaturase 3); one located in genome A (from Brassica rapa) in N4 and the other in genome C (from Brassica oleracea) in N14 (Jourdren et al, Theor Appl Genet 93: 512-518, 1996; Barret et al., GCIRC, 1999).

Variedades de canola con mutaciones en el gen FAD3 se han descrito en la técnica. Por ejemplo, el documento Varieties of canola with mutations in the FAD3 gene have been described in the art. For example, the document

10 WO06/034059 describe que se piensa que dos variedades de canola con reducido contenido en ácido linolénico, IMC01 e IMC02 (originalmente descritas en el documento US. 5750827 y la solicitud de patente de EE.UU. 20080034457, respectivamente) tienen mutaciones en los genes FAD3. El documento WO04/072259 describe un alelo FAD3 (del genoma C) con una única sustitución de nucleótidos en un sitio de corte y empalme 5’ de una línea de canola mutante DMS100 con un contenido en ácido linolénico de aproximadamente 3%. El documento WO06 / 034059 describes that two varieties of canola with reduced linolenic acid content, IMC01 and IMC02 (originally described in US 5750827 and US patent application 20080034457, respectively) are thought to have mutations in the FAD3 genes. WO04 / 072259 describes an FAD3 allele (of genome C) with a single nucleotide substitution at a 5 'splice site of a DMS100 mutant canola line with a linolenic acid content of approximately 3%. The document

15 WO01/25453 describe nueva variantes FAD3 con múltiples sustituciones de aminoácidos, una de las cuales está también presente en "Stellar", de la variedad "Apollo" de bajo contenido linolénico. En la solicitud de patente de EE.UU. 20040083503 se describe un mutante FAD3 no funcional con una sustitución de aminoácidos en un dominio conservado. Sin embargo, el fenotipo de ácido linolénico de plantas de canola que comprenden alelos FAD3 mutantes de este tipo puede ser muy variable en función de los antecedentes genéticos. WO01 / 25453 describes new FAD3 variants with multiple amino acid substitutions, one of which is also present in "Stellar", of the "Apollo" variety of low linolenic content. In the US patent application 20040083503 describes a non-functional FAD3 mutant with an amino acid substitution in a conserved domain. However, the linolenic acid phenotype of canola plants comprising mutant FAD3 alleles of this type can vary greatly depending on the genetic background.

20 Por lo tanto, a pesar del hecho de que están disponibles en la técnica secuencias de diversos alelos FAD3, sigue existiendo la necesidad de métodos alternativos (especialmente métodos no transgénicos) para reducir de forma estable la cantidad de ácido alfa-linolénico en semillas, sin tener un efecto negativo en la el crecimiento y desarrollo de las plantas. Las invenciones descritas en lo que sigue en las realizaciones diferentes, los ejemplos y las reivindicaciones proporcionan métodos y medios para desarrollar plantas de cultivo que producen aceite de semilla Therefore, despite the fact that sequences of various FAD3 alleles are available in the art, there is still a need for alternative methods (especially non-transgenic methods) to stably reduce the amount of alpha-linolenic acid in seeds, without having a negative effect on the growth and development of plants. The inventions described in the following in the different embodiments, the examples and the claims provide methods and means for developing crop plants that produce seed oil.

25 que sea de un contenido bajo en C18:3. 25 that is low in C18: 3.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN SUMMARY OF THE INVENTION

Los autores de la invención han encontrado que plantas de Brassica napus comprenden cinco genes FAD3 diferentes y que los niveles de C18:3 en plantas de Brassica, particularmente en el aceite de semilla de dichas plantas de Brassica, se pueden controlar mediante el control del número y/o los tipos de genes/alelos FAD3 que son 30 "funcionalmente expresados" en las semillas, es decir, que dan como resultado proteína FAD3 funcional (biológicamente activa). Mediante la combinación de determinados alelos mutantes de los cinco genes FAD3 ("alelos FAD3"), resultando en una reducción del nivel de proteína FAD3 funcional, el nivel de C18:3 en el aceite de semilla se puede reducir de manera significativa. Se cree que cuantos más alelos mutantes FAD3 se combinen en una planta tanto mayor será la reducción en el contenido de C18:3 en el aceite de semilla, manteniéndose un crecimiento The inventors have found that Brassica napus plants comprise five different FAD3 genes and that C18: 3 levels in Brassica plants, particularly in the seed oil of said Brassica plants, can be controlled by controlling the number and / or the types of FAD3 genes / alleles that are "functionally expressed" in the seeds, that is, that result in functional (biologically active) FAD3 protein. By combining certain mutant alleles of the five FAD3 genes ("FAD3 alleles"), resulting in a reduction in the level of functional FAD3 protein, the level of C18: 3 in the seed oil can be significantly reduced. It is believed that the more FAD3 mutant alleles combined in a plant, the greater the reduction in C18: 3 content in the seed oil, while maintaining growth

35 de la planta y un desarrollo de las semillas normal. 35 of the plant and a normal seed development.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona en una realización una planta de Brassica (y una célula, tejido, órgano, semilla o progenie de la misma) que comprende al menos dos alelos FAD3 mutantes totalmente inactivados en su genoma, en donde Therefore, in a first aspect, the present invention provides in one embodiment a Brassica plant (and a cell, tissue, organ, seed or progeny thereof) comprising at least two mutant FAD3 alleles totally inactivated in its genome, where

i. el primer alelo FAD3 mutante es un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado de un gen FAD3, 40 comprendiendo dicho gen FAD3 una secuencia de nucleótidos que i. the first mutant FAD3 allele is a totally inactivated mutant FAD3 allele of a FAD3 gene, said FAD3 gene comprising a nucleotide sequence that

a. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 3; o to. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO : 3; or

45 b. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 11 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 12; o 45 b. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 11 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO : 12; or

c. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una C. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes a

50 secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 2 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 4; 50 amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 2 and a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 4;

en donde dicho primer alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una secuencia de nucleótidos que 55 a. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 1 y una secuencia de wherein said first fully inactivated mutant FAD3 allele comprises a nucleotide sequence that 55 a. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 1 and a sequence of

nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 3; o nucleotides that have a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 3; or

b. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 11 y una secuencia de b. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 11 and a sequence of

5 nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 12; o 5 nucleotides having a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 12; or

c. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 2 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos C. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 2 and a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence

10 que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 4; y 10 having a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 4; Y

ii. el segundo alelo FAD3 mutante es un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado de un gen FAD3, comprendiendo dicho gen FAD3 una secuencia de nucleótidos que ii. the second mutant FAD3 allele is a totally inactivated mutant FAD3 allele of a FAD3 gene, said FAD3 gene comprising a nucleotide sequence that

a. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 5, una secuencia de to. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 5, a sequence of

15 nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 7 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 9; o 15 nucleotides having a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 7 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 9; or

b. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 13, una secuencia de b. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 13, a sequence of

20 nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 14 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 15; o 20 nucleotides having a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 14 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 15; or

c. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con C. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with

25 SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 8 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 6, a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 8 and a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 10;

en donde dicho segundo alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una secuencia de 30 nucleótidos que wherein said second fully inactivated mutant FAD3 allele comprises a sequence of 30 nucleotides that

a. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 5, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 7 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% to. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 5, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO : 7 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90%

35 con SEQ ID NO: 9; o 35 with SEQ ID NO: 9; or

b. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 13, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 14 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% b. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 13, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO : 14 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95%

40 con SEQ ID NO: 15; o 40 with SEQ ID NO: 15; or

c. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 8 y una C. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 6, a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 8 and a

45 secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una 45 nucleotide sequence encoding an amino acid sequence that has a

identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 10; y en donde dichos al menos dos alelos FAD3 mutantes totalmente inactivados comprenden una mutación seleccionada del grupo que consiste en: sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 10; and wherein said at least two fully inactivated mutant FAD3 alleles comprise a mutation selected from the group consisting of:

i. una deleción, mutación de desplazamiento de marco o de codón de parada que conduce 50 a una deleción completa de la proteína; i. a deletion, frame shift or stop codon mutation that leads to a complete deletion of the protein;

ii. una mutación de codón de parada, desplazamiento de marco o sitio de corte y empalme que conduce a un truncamiento C-terminal de la proteína FAD3 que incluye el motivo de retención ER en una posición correspondiente a la posición 373-377 de SEQ ID NO: 2; ii. a stop codon mutation, frame shift or splice site that leads to a C-terminal truncation of the FAD3 protein that includes the ER retention motif at a position corresponding to position 373-377 of SEQ ID NO: 2;

iii. una mutación de sentido erróneo, por inserción o deleción en la secuencia que codifica el iii. a missense mutation, by insertion or deletion in the sequence encoding the

55 motivo de retención ER en una posición correspondiente a la posición 373-377 de SEQ ID NO: 2; 55 ER retention reason in a position corresponding to position 373-377 of SEQ ID NO: 2;

iv. una mutación de sentido erróneo en el codón que codifica cualquiera de las histidinas conservadas en una posición correspondiente a la posición 92, 96, 128, 131, 132, 295, 298 ó 299 de SEQ ID NO: 2; y iv. a missense mutation in the codon encoding any of the histidines conserved in a position corresponding to position 92, 96, 128, 131, 132, 295, 298 or 299 of SEQ ID NO: 2; Y

60 v. una mutación sin sentido que resulta del uso de un ATG alternativo como codón de inicio y la síntesis de una proteína truncada en el extremo N que carece de la secuencia señal putativa. 60 v. a nonsense mutation that results from the use of an alternative ATG as a start codon and the synthesis of a truncated protein at the N-terminus that lacks the putative signal sequence.

El aceite de semilla de dicha planta puede exhibir una reducción significativa en la cantidad de ácido alfa-linolénico (C18:3) total presente en el aceite de semilla de una planta, no comprendiendo dicho alelos FAD3 mutantes, cuando se compara con el aceite de semillas de plantas similares, dicho alelo o alelos FAD3 mutantes. The seed oil of said plant can exhibit a significant reduction in the amount of total alpha-linolenic acid (C18: 3) present in the seed oil of a plant, said mutant FAD3 alleles not comprising, when compared with the oil of seeds of similar plants, said allele or mutant FAD3 alleles.

La invención también proporciona una planta que comprende, además, un tercer alelo FAD3 mutante totalmente 5 inactivado, en donde dicho tercer alelo FAD3 mutante totalmente inactivado es un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado de un gen FAD3, comprendiendo dicho gen FAD3 una secuencia de nucleótidos que The invention also provides a plant further comprising a third totally inactivated mutant FAD3 allele, wherein said third totally inactivated mutant FAD3 allele is a totally inactivated mutant FAD3 allele of a FAD3 gene, said FAD3 gene comprising a nucleotide sequence that

i. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 3; i. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO : 3;

10 o 10 or

ii. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 11 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 12; o ii. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 11 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO : 12; or

15 iii. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 2 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 4; 15 iii. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 2 and a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 4;

en donde dicho tercer alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una secuencia de 20 nucleótidos que wherein said third totally inactivated mutant FAD3 allele comprises a sequence of 20 nucleotides that

i. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 3; o i. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO : 3; or

25 ii. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 11 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 12; o 25 ii. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 11 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO : 12; or

iii. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una iii. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes a

30 secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 2 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 4; y 30 amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 2 and a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 4; Y

en donde dichos los alelos FAD3 mutantes son alelos mutantes de al menos tres genes FAD3 diferentes. wherein said mutant FAD3 alleles are mutant alleles of at least three different FAD3 genes.

También se proporciona en esta memoria una planta que comprende, además, un cuarto, o un cuarto y un quinto Also provided herein is a plant comprising, in addition, a quarter, or a quarter and a fifth

35 alelo FAD3 mutante totalmente inactivado, en donde dicho cuarto y dicho quinto alelo FAD3 mutante totalmente inactivado es un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado de un gen FAD3, comprendiendo dicho gen FAD3 una secuencia de nucleótidos que 35 totally inactivated mutant FAD3 allele, wherein said fourth and said fifth totally inactivated mutant FAD3 allele is a totally inactivated mutant FAD3 allele of a FAD3 gene, said FAD3 gene comprising a nucleotide sequence that

i. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 5, una secuencia de nucleótidos que tiene una i. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 5, a nucleotide sequence that has a

40 identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 7 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 9; o 40 sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 7 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 9; or

ii. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 13, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 14 y una secuencia de nucleótidos ii. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 13, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO : 14 and a nucleotide sequence

45 que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 15; o 45 having a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 15; or

iii. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 8 y una secuencia de nucleótidos que codifica una iii. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 6, a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 8 and a nucleotide sequence encoding a

50 secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID 50 amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID

NO: 10; en donde dicho cuarto y dicho quinto alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende cada uno una secuencia de nucleótidos que NO: 10; wherein said fourth and said fifth totally inactivated mutant FAD3 allele each comprises a nucleotide sequence that

i. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de i. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has an identity of

55 la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 5, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 7 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 9; o The sequence of at least 90% with SEQ ID NO: 5, a nucleotide sequence having an identity of the sequence of at least 90% with SEQ ID NO: 7 and a nucleotide sequence having an identity of the sequence of at least 90% with SEQ ID NO: 9; or

ii. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 13, una secuencia de nucleótidos que tiene una ii. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 13, a nucleotide sequence that has a

60 identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 14 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 15; o 60 sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 14 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 15; or

5 secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 10; y en donde los alelos FAD3 mutantes son alelos mutantes de al menos cuatro genes FAD3 diferentes. 5 amino acid sequence having a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 10; and wherein the mutant FAD3 alleles are mutant alleles of at least four different FAD3 genes.

También se proporciona una planta de acuerdo con la invención, en donde dichos alelos FAD3 totalmente inactivados se seleccionan del grupo que consiste en una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de 10 nucleótidos de SEQ ID NO: 1, en donde la G en la posición 2405 está sustituida con A; una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, en donde la G en la posición 2702 está sustituida con A; una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, en donde la G en la posición 3934 está sustituida con A; una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, en donde la G en la posición 2847 está sustituida con A; y una molécula de ácido nucleico que tiene la A plant according to the invention is also provided, wherein said fully inactivated FAD3 alleles are selected from the group consisting of a nucleic acid molecule having the 10 nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the G in the position 2405 is substituted with A; a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, wherein the G at position 2702 is substituted with A; a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, wherein the G at position 3934 is substituted with A; a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, wherein the G in position 2847 is substituted with A; and a nucleic acid molecule that has the

15 secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, en donde la G en la posición 3909 está sustituida con A. 15 nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, wherein the G at position 3909 is substituted with A.

También se describen secuencias (aisladas) de ácidos nucleicos que codifican proteínas de tipo salvaje y/o FAD3 mutantes, así como fragmentos de las mismas, y métodos de utilizar estas secuencias de ácidos nucleicos para modificar la composición del aceite de semillas de Brassica. También se describen en esta memoria las proteínas de tipo salvaje y/o FAD3 mutantes propiamente dichas y su uso, así como plantas que comprenden estos alelos FAD3 Also described are (isolated) sequences of nucleic acids encoding wild-type and / or FAD3 mutant proteins, as well as fragments thereof, and methods of using these nucleic acid sequences to modify the composition of Brassica seed oil. Also described herein are wild-type and / or FAD3 mutant proteins themselves and their use, as well as plants comprising these FAD3 alleles

20 mutantes y proteínas FAD3. 20 mutants and FAD3 proteins.

En un aspecto de la invención, un alelo mutante totalmente inactivado de un gen FAD3, comprendiendo dicho gen FAD3 una secuencia de nucleótidos que In one aspect of the invention, a totally inactivated mutant allele of an FAD3 gene, said FAD3 gene comprising a nucleotide sequence that

(a) se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 5, una secuencia de nucleótidos que tiene una (a) is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 5, a nucleotide sequence that has a

25 identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 7 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 9; o 25 sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 7 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 9; or

(b) se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 13, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 14 y una secuencia de nucleótidos (b) is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 13, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 14 and a nucleotide sequence

30 que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 15; o 30 having a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 15; or

(c) se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 8 y una secuencia de nucleótidos que codifica una (c) is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 6, a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that it has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 8 and a nucleotide sequence encoding a

35 secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 10, en donde dicho alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una secuencia de nucleótidos que An amino acid sequence having a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 10, wherein said totally inactivated mutant FAD3 allele comprises a nucleotide sequence that

(c) se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO:8 y una secuencia de nucleótidos que codifica una (c) is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 6, a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that it has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 8 and a nucleotide sequence encoding a

NO:10, y en donde dicho alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en: NO: 10, and wherein said totally inactivated mutant FAD3 allele comprises a mutation selected from the group consisting of:

i. una deleción, mutación de desplazamiento de marco o de codón de parada que conduce 55 a una deleción completa de la proteína; i. a deletion, frame shift or stop codon mutation that leads to a complete deletion of the protein;

ii. una mutación de codón de parada, desplazamiento de marco o sitio de corte y empalme que conduce a un truncamiento de la proteína FAD3 que incluye el motivo de retención ER en una posición correspondiente a la posición 373-377 de SEQ ID NO: 2; ii. a stop codon mutation, frame shift or splice site that leads to a truncation of the FAD3 protein that includes the ER retention motif at a position corresponding to position 373-377 of SEQ ID NO: 2;

iii. una mutación de sentido erróneo, por inserción o deleción en la secuencia que codifica el motivo de retención ER en una posición correspondiente a la posición 373-377 de SEQ ID NO: 2; iii. a missense mutation, by insertion or deletion in the sequence encoding the retention reason ER in a position corresponding to position 373-377 of SEQ ID NO: 2;

iv. una mutación de sentido erróneo en el codón que codifica cualquiera de las histidinas iv. a missense mutation in the codon that encodes any of the histidines

5 conservadas en una posición correspondiente a la posición 92, 96, 128, 131, 132, 295, 298 ó 299 de SEQ ID NO: 2; y 5 kept in a position corresponding to position 92, 96, 128, 131, 132, 295, 298 or 299 of SEQ ID NO: 2; Y

v. una mutación sin sentido que resulta del uso de un ATG alternativo como codón de inicio y la síntesis de una proteína truncada en el extremo N que carece de la secuencia señal putativa. v. a nonsense mutation that results from the use of an alternative ATG as a start codon and the synthesis of a truncated protein at the N-terminus that lacks the putative signal sequence.

10 En otro aspecto de la invención se proporciona un alelo mutante totalmente inactivado de un gen FAD3 , que se selecciona del grupo que consiste en una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, en donde la G en la posición 2405 está sustituida con A; una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, en donde la G en la posición 2702 está sustituida con A; una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, en donde la G en la posición 3934 está In another aspect of the invention there is provided a totally inactivated mutant allele of a FAD3 gene, which is selected from the group consisting of a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the G in position 2405 is substituted with A; a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, wherein the G at position 2702 is substituted with A; a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, wherein the G at position 3934 is

15 sustituida con A; una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, en donde la G en la posición 2847 está sustituida con A; y una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, en donde la G en la posición 3909 está sustituida con A. 15 substituted with A; a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, wherein the G in position 2847 is substituted with A; and a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, wherein the G at position 3909 is substituted with A.

La invención se refiere, además, a una planta, y células, tejidos, órganos, semillas y progenie de la misma, que comprende uno o más alelos FAD3 mutantes totalmente inactivados de acuerdo con la invención. La planta de 20 acuerdo con la invención puede comprender una cantidad reducida de proteínas FAD3 funcionales en comparación con una planta, y células, partes, semillas y progenie de la misma, que comprende un alelo FAD3 que codifica la proteína FAD3 funcional correspondiente. Tales plantas y células, partes, semillas y progenie de las mismas pueden utilizarse para obtener plantas que producen semilla o grano con la composición de aceite de semilla alterada, en particular para obtener plantas de Brassica que producen semillas o granos con un contenido de C18:3 en el aceite The invention further relates to a plant, and cells, tissues, organs, seeds and progeny thereof, comprising one or more mutant FAD3 alleles totally inactivated according to the invention. The plant according to the invention can comprise a reduced amount of functional FAD3 proteins in comparison to a plant, and cells, parts, seeds and progeny thereof, comprising an FAD3 allele encoding the corresponding functional FAD3 protein. Such plants and cells, parts, seeds and progeny thereof can be used to obtain plants that produce seed or grain with the altered seed oil composition, in particular to obtain Brassica plants that produce seeds or grains with a C18 content: 3 in the oil

25 de semilla que mantiene preferiblemente un desarrollo de las plantas agronómicamente adecuado. Tal como se utiliza en esta memoria, "parte de la planta" incluye cualquier cosa derivada de una planta de la invención, incluyendo partes de la planta tales como células, tejidos, órganos, semillas, vainas de semillas, harina de semillas, torta de semillas, grasas o aceites de semillas. 25 of seed that preferably maintains an agronomically adequate plant development. As used herein, "part of the plant" includes anything derived from a plant of the invention, including parts of the plant such as cells, tissues, organs, seeds, seed pods, seed meal, cake seeds, fats or seed oils.

También se proporciona un método para producir un aceite de semillas, que comprende machacar semillas de las A method for producing a seed oil is also provided, which comprises crushing seeds of the seeds.

30 plantas de acuerdo con la invención, comprendiendo dichas semillas al menos dos alelos FAD3 mutantes, totalmente inactivados de acuerdo con la invención. 30 plants according to the invention, said seeds comprising at least two mutant FAD3 alleles, totally inactivated according to the invention.

Todavía en otro aspecto de la invención se proporciona una planta de Brassica de acuerdo con la invención, o una célula, tejido, órgano, semilla o progenie de la misma que comprende al menos dos alelos FAD3 mutantes, totalmente inactivados de acuerdo con la invención, obtenible de una semilla seleccionada del grupo que consiste In still another aspect of the invention there is provided a Brassica plant according to the invention, or a cell, tissue, organ, seed or progeny thereof comprising at least two mutant FAD3 alleles, totally inactivated according to the invention, obtainable from a seed selected from the group consisting

35 en: 35 in:

--: semilla de Brassica que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, en donde la G en la posición 2405 está sustituida con A, y una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, en donde la G en la posición 2702 está sustituida con A, habiendo sido depositada dicha semilla en NCIMB Brassica seed comprising a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the G at position 2405 is substituted with A, and a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, where the G in position 2702 is substituted with A, said seed having been deposited in NCIMB

40 Limited el 9 de octubre de 2009 bajo el número de acceso NCIMB 41655; -semilla de Brassica que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, en donde la G en la posición 3934 está sustituida con A, y una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, en donde la G en la posición 3909 está sustituida con A, habiendo sido depositada dicha semilla en NCIMB 40 Limited on October 9, 2009 under accession number NCIMB 41655; - Brassica seed comprising a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, wherein the G in position 3934 is substituted with A, and a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, where the G in position 3909 is substituted with A, said seed having been deposited in NCIMB

45 Limited el 9 de octubre de 2009 bajo el número de acceso NCIMB 41656; y -semilla de Brassica que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, en donde la G en la posición 2847 está sustituida con A, habiendo sido depositada dicha semilla en NCIMB Limited el 9 de octubre de 2009 bajo el número de acceso 45 Limited on October 9, 2009 under accession number NCIMB 41656; and - Brassica seed comprising a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, wherein the G in position 2847 is substituted with A, said seed having been deposited in NCIMB Limited on October 9 2009 under the access number

50 NCIMB 41657. 50 NCIMB 41657.

También se proporciona una semilla o grano con un contenido reducido de C18:3 en el aceite, que se puede obtener de una planta de acuerdo con la presente invención, y el uso de dicha semilla o grano, por ejemplo para la siembra y el crecimiento de la progenie de las plantas o para la producción de harina de semillas, torta de semillas, grasas o aceites de semillas. A seed or grain with a reduced content of C18: 3 is also provided in the oil, which can be obtained from a plant according to the present invention, and the use of said seed or grain, for example for sowing and growth. from the progeny of plants or for the production of seed meal, cake seeds, fats or seed oils.

Son adecuados para la invención métodos para generar y seleccionar plantas, y células, partes, semillas y progenie de las mismas que contienen uno o más alelos FAD3 totalmente inactivados. En particular, son adecuados métodos para generar y seleccionar plantas de Brassica que comprenden al menos dos genes FAD3, en particular, plantas de Brassica napus, y células, partes, semillas y progenie de las mismas, que contienen al menos dos alelos FAD3 mutantes totalmente inactivados en al menos dos loci diferentes en el genoma (es decir, al menos dos genes FAD3 diferentes) y para distinguir entre la presencia de alelos FAD3 mutantes y alelos FAD3 de tipo salvaje en una planta Methods for generating and selecting plants, and cells, parts, seeds and progeny thereof containing one or more fully inactivated FAD3 alleles are suitable for the invention. In particular, methods for generating and selecting Brassica plants comprising at least two FAD3 genes, in particular Brassica napus plants, and cells, parts, seeds and progeny thereof, containing at least two fully mutant FAD3 alleles are suitable inactivated in at least two different loci in the genome (i.e. at least two different FAD3 genes) and to distinguish between the presence of mutant FAD3 alleles and wild-type FAD3 alleles in a plant

o parte de planta. Por lo tanto, se describen métodos (tales como mutagénesis y/o selección asistida por marcadores) para generar y/o identificar alelos FAD3 mutantes o plantas o partes de plantas que comprenden tales alelos y para combinar un número adecuado de alelos FAD3 mutantes en una sola planta, en los que la planta tiene un contenido significativamente reducido de C18:3 en el aceite de semilla. or part of the plant. Therefore, methods (such as mutagenesis and / or marker-assisted selection) for generating and / or identifying mutant FAD3 alleles or plants or parts of plants comprising such alleles and for combining a suitable number of mutant FAD3 alleles into one are described. single plant, in which the plant has a significantly reduced content of C18: 3 in the seed oil.

Es otro aspecto de la invención proporcionar un método para determinar el estado de zigosidad de un alelo FAD3 mutante de acuerdo con la invención en una planta, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, que comprende determinar la presencia de un mutante y/o una correspondiente región específica para FAD3 de tipo salvaje en el ADN genómico de dicha planta, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma. It is another aspect of the invention to provide a method for determining the zygosity state of a mutant FAD3 allele according to the invention in a plant, or a cell, part, seed or progeny thereof, which comprises determining the presence of a mutant. and / or a corresponding region specific for wild-type FAD3 in the genomic DNA of said plant, or a cell, part, seed or progeny thereof.

También se proporcionan métodos para utilizar una combinación de alelos FAD3 mutantes de la presente invención para reducir el contenido en C18:3 en el aceite de semillas de una planta de Brassica. Methods for using a combination of mutant FAD3 alleles of the present invention to reduce the C18: 3 content in the seed oil of a Brassica plant are also provided.

También se proporcionan métodos para el uso de la planta, y células, tejidos, órganos, semillas y progenie de la misma, de la invención, para producir aceite de semillas de colza o una torta de aceite de semillas de colza. Tal como se utiliza en esta memoria, "producto vegetal" incluye cualquier cosa derivada de una planta de la invención, incluyendo partes de las plantas tales como semillas, harina de semillas, torta de semillas, grasas o aceites de semillas. Methods are also provided for the use of the plant, and cells, tissues, organs, seeds and progeny thereof, of the invention, to produce rapeseed oil or a rapeseed oil cake. As used herein, "plant product" includes anything derived from a plant of the invention, including parts of plants such as seeds, seed meal, cake seeds, fats or seed oils.

DEFINICIONES GENERALES GENERAL DEFINITIONS

La expresión "secuencia de ácido nucleico" (o molécula de ácido nucleico) se refiere a una molécula de ADN o ARN en forma de cadena sencilla o doble, en particular un ADN que codifica una proteína o fragmento de proteína tal como se describe en esta memoria. Una "secuencia de ácido nucleico endógeno" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se encuentra dentro de una célula vegetal, p. ej., un alelo endógeno de un gen FAD3 presente dentro del genoma nuclear de una célula de Brassica. Una "secuencia de ácido nucleico aislado" se utiliza para aludir a una secuencia de ácido nucleico que ya no está en su entorno natural, por ejemplo in vitro o en una célula huésped bacteriana o vegetal recombinante. The term "nucleic acid sequence" (or nucleic acid molecule) refers to a single or double stranded DNA or RNA molecule, in particular a DNA encoding a protein or protein fragment as described herein. memory. An "endogenous nucleic acid sequence" refers to a nucleic acid sequence that is found within a plant cell, e.g. eg, an endogenous allele of an FAD3 gene present within the nuclear genome of a Brassica cell. An "isolated nucleic acid sequence" is used to refer to a nucleic acid sequence that is no longer in its natural environment, for example in vitro or in a recombinant bacterial or plant host cell.

El término "gen" significa una secuencia de ADN que comprende una región (región transcrita) que se transcribe en una molécula de ARN (p. ej., un pre-ARNm, que comprende secuencias de intrones, que luego se corta y empalma para dar un ARNm maduro) en una célula, enlazada operativamente a regiones reguladoras (p. ej., un promotor). Un gen puede comprender, por lo tanto, varias secuencias enlazadas operativamente tales como un promotor, una secuencia conductora 5’ que comprende, p. ej., secuencias implicadas en una iniciación de la traducción, a región codificante (de proteína) (ADNc o ADN genómico) y una secuencia 3’ no traducida, que comprende, p. ej., sitios de terminación de la transcripción. "Gen endógeno" se utiliza para diferenciar de un "gen extraño", "transgén" o "gen quimérico", y se refiere a un gen de una planta de un determinado género, especie o variedad de planta, que no ha sido introducido en la planta mediante transformación (es decir, no es un "transgén"), sino que normalmente está presente en plantas de ese género, especie o variedad, o que se introduce en esa planta de plantas de otro género, especie o variedad de planta, en la que está normalmente presente, por técnicas de cultivo normales o por hibridación somática, p. ej., por fusión de protoplastos. De manera similar, un "alelo endógeno" de un gen no se introduce en una planta o tejido vegetal por transformación de plantas, sino que, por ejemplo, es generado por mutagénesis y/o selección de la planta o se obtiene mediante el rastreo de poblaciones naturales de plantas. The term "gene" means a DNA sequence that comprises a region (transcribed region) that is transcribed into an RNA molecule (eg, a pre-mRNA, comprising intron sequences, which is then cut and spliced to give a mature mRNA) in a cell, operably linked to regulatory regions (e.g., a promoter). A gene can therefore comprise several operably linked sequences such as a promoter, a 5 ′ conducting sequence comprising, e.g. eg, sequences involved in a translation initiation, to a coding (protein) region (cDNA or genomic DNA) and a 3 ’untranslated sequence, comprising, e.g. eg, transcription termination sites. "Endogenous gene" is used to differentiate from a "foreign gene", "transgene" or "chimeric gene", and refers to a plant gene of a particular genus, species or plant variety, which has not been introduced into the plant by transformation (that is, it is not a "transgene"), but is normally present in plants of that genus, species or variety, or that is introduced into that plant of plants of another genus, species or plant variety, in which it is normally present, by normal culture techniques or by somatic hybridization, e.g. eg, by fusion of protoplasts. Similarly, an "endogenous allele" of a gene is not introduced into a plant or plant tissue by plant transformation, but, for example, is generated by mutagenesis and / or plant selection or is obtained by tracing natural populations of plants.

Los términos "proteína" o "polipéptido" se utilizan indistintamente y se refieren a moléculas que consisten en una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo de acción específico, tamaño, estructura tridimensional u origen. Un "fragmento" o "porción" de una proteína FAD3 puede, por lo tanto, aludirse todavía como una "proteína". Una "proteína aislada" se utiliza para aludir a una proteína que ya no está en su entorno natural, por ejemplo in vitro o en una célula huésped bacteriana o vegetal recombinante. Una "enzima" es una proteína que comprende la actividad enzimática tal como proteínas FAD3 funcionales, que son capaces de desaturar ácido linoleico en ácido linolénico. The terms "protein" or "polypeptide" are used interchangeably and refer to molecules consisting of an amino acid chain, without reference to a specific mode of action, size, three-dimensional structure or origin. A "fragment" or "portion" of an FAD3 protein may, therefore, still be referred to as a "protein." An "isolated protein" is used to refer to a protein that is no longer in its natural environment, for example in vitro or in a recombinant bacterial or plant host cell. An "enzyme" is a protein that comprises enzymatic activity such as functional FAD3 proteins, which are capable of desaturating linoleic acid in linolenic acid.

Tal como se utiliza en esta memoria, "proteína FAD3", también conocida como "ácido graso desaturasa 3", "ácido graso omega-3 desaturasa" o "delta-15 desaturasa", se refiere a una proteína residente ER que introduce el tercer doble enlace en la biosíntesis de ácidos grasos C18:3. Ácidos grasos desaturasas son enzimas que contienen hierro que catalizan la introducción, dependiente de NAD-(P)H y O2, de dobles enlaces en cadenas de acilo graso As used herein, "FAD3 protein", also known as "fatty acid desaturase 3", "omega-3 desaturase fatty acid" or "delta-15 desaturase", refers to an ER resident protein that introduces the third double bond in the biosynthesis of C18: 3 fatty acids. Desaturated fatty acids are iron-containing enzymes that catalyze the introduction, dependent on NAD- (P) H and O2, of double bonds in fatty acyl chains

interrumpidas con metileno. Análisis de hidropatía indican que estas enzimas contienen hasta tres dominios hidrófobos largos que serían lo suficientemente largos como para abarcar dos veces la bicapa de la membrana. Las enzimas contienen tres regiones que contienen His conservadas (cajas His), que tienen un posicionamiento coherente con respecto a estos posibles dominios en expansión de la membrana. Todos los residuos histidina individuales en estas regiones conservadas, que están supuestamente implicados en la unión de hierro, parecieron ser esenciales para la función de la proteína (Shanklin et al., Biochemistry 33:12787-94, 1994). En FAD3-A1 (SEQ ID NO: 2) están presentes ocho histidinas de unión a dihierro putativas conservadas en las posiciones de aminoácidos 92, 96, 128, 131, 132, 295, 298 y 299 (GenBank: ACS26169.1). interrupted with methylene. Hydropathy analyzes indicate that these enzymes contain up to three long hydrophobic domains that would be long enough to encompass twice the membrane bilayer. Enzymes contain three conserved His-containing regions (His boxes), which have a consistent positioning with respect to these possible expanding domains of the membrane. All individual histidine residues in these conserved regions, which are supposedly involved in iron binding, appeared to be essential for protein function (Shanklin et al., Biochemistry 33: 12787-94, 1994). In FAD3-A1 (SEQ ID NO: 2), eight putative dihydrous binding histidines conserved at amino acid positions 92, 96, 128, 131, 132, 295, 298 and 299 are present (GenBank: ACS26169.1).

La expresión "secuencia señal" o "péptido señal" se refiere a una corta cadena peptídica (3-60 aminoácidos de longitud) en el extremo N-terminal de una proteína que dirige la fijación inicial como objetivo de una proteína a orgánulos intracelulares tales como el retículo endoplásmico (ER). Proteínas ER residentes, tales como FAD3, puede comprender una secuencia señal N-terminal escindible para fijación como objetivo inicial, co-traduccional al ER, pero el primer dominio de la transmembrana también puede actuar como una secuencia señal no escindible que dirige la síntesis de proteínas co-traduccional y que actúa en calidad de una secuencia de parada de la transferencia para el anclaje de la proteína en la membrana. Se demostró que FAD3 de Brassica se inserta en la membrana del ER de una manera co-traduccional (McCartney et al., 2004, Plant Journal 37, páginas 156-173). The term "signal sequence" or "signal peptide" refers to a short peptide chain (3-60 amino acids in length) at the N-terminal end of a protein that directs initial targeting of a protein to intracellular organelles such as the endoplasmic reticulum (ER). Resident ER proteins, such as FAD3, may comprise an N-terminal signal sequence cleavable for binding as an initial target, co-translational to ER, but the first domain of the transmembrane can also act as a non-cleavable signal sequence that directs the synthesis of Co-translational proteins and acting as a transfer stop sequence for anchoring the protein in the membrane. Brassica FAD3 was shown to be inserted into the ER membrane in a co-translational manner (McCartney et al., 2004, Plant Journal 37, pages 156-173).

"Motivo de retención de ER", tal como se utiliza en esta memoria, es un motivo tetrapéptido C-terminal -H/K/RDEL que es responsable de la retención estática del ER o la recuperación de otros compartimentos en la vía secretora. Cualquier cambio de aminoácido no conservado al motivo es conocido por resultar en la pérdida de recuperación de ER. FAD3 comprende un motivo dilisina conservado (posiciones de aminoácidos -3 y -5 con respecto al extremo C) que funciona como una señal de retención en el ER. El truncamiento de los cinco aminoácidos C-terminales -KSKIN o una sustitución de las dos lisinas a alaninas resultó en una localización errónea de FAD3 en el aparato de Golgi o en la membrana plasmática, respectivamente, así como un deterioro grave de la actividad enzimática FAD3 (McCartney et al., 2004, Plant Journal 37, páginas 156-173). Correspondiente regiones de aminoácidos o residuos en otras secuencias FAD3 se pueden encontrar por métodos conocidos en la técnica tal como determinando la alineación óptima, tal como se describe a continuación. "Reason for ER retention", as used herein, is a C-terminal tetrapeptide motif -H / K / RDEL that is responsible for the static retention of ER or the recovery of other compartments in the secretory pathway. Any change of amino acid not conserved to the motif is known to result in the loss of ER recovery. FAD3 comprises a conserved dilisin motif (amino acid positions -3 and -5 with respect to the C-terminus) that functions as a retention signal in the ER. Truncation of the five C-terminal amino acids -KSKIN or a substitution of the two lysines to alanines resulted in an erroneous location of FAD3 in the Golgi apparatus or in the plasma membrane, respectively, as well as a serious deterioration of the FAD3 enzyme activity (McCartney et al., 2004, Plant Journal 37, pages 156-173). Corresponding regions of amino acids or residues in other FAD3 sequences can be found by methods known in the art such as determining optimal alignment, as described below.

La expresión "gen FAD3" se refiere en esta memoria a la secuencia de ácido nucleico que codifica una ácido graso desaturasa (es decir, una proteína FAD3). Una "proteína FAD3" funcional tiene actividad acilo graso desaturasa, más específicamente, es capaz de desaturar ácido linoleico (C18:2) en ácido linolénico (C18:3). La funcionalidad de las proteínas FAD3 se puede testar utilizando un ensayo biológico. Para determinar la función y/o la funcionalidad de un gen/proteína FAD3 específico, se puede utilizar, por ejemplo, un sistema de expresión de levadura tal como se describe por Vrinten et al. (2005, Plant Physiol 139:79-87) o por Reed et al. (2000, Plant Physiol 122:715-20) o un sistema de expresión bacteriana tal como se describe, p. ej., por Reddy et al. (Plant Mol Biol 22: 293-300, 1993). Alternativamente, el gen que codifica la proteína FAD3 puede transformarse, p. ej., en Brassica (u otra planta) y los transformantes resultantes pueden rastrearse en cuanto a la sobre-expresión de fenotipos tal como se describe, p. ej., en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20040083503. The term "FAD3 gene" refers herein to the nucleic acid sequence encoding a fatty acid desaturase (ie, an FAD3 protein). A functional "FAD3 protein" has fatty acyl desaturase activity, more specifically, it is capable of desaturating linoleic acid (C18: 2) in linolenic acid (C18: 3). The functionality of FAD3 proteins can be tested using a biological assay. To determine the function and / or functionality of a specific FAD3 gene / protein, for example, a yeast expression system as described by Vrinten et al. (2005, Plant Physiol 139: 79-87) or by Reed et al. (2000, Plant Physiol 122: 715-20) or a bacterial expression system as described, e.g. eg, by Reddy et al. (Plant Mol Biol 22: 293-300, 1993). Alternatively, the gene encoding the FAD3 protein can be transformed, e.g. eg, in Brassica (or another plant) and the resulting transformants can be traced for the overexpression of phenotypes as described, e.g. e.g., in U.S. Patent Application 20040083503.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "alelo(s)" significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus particular. En una célula diploide (o anfidiploide) de un organismo, alelos de un gen dado se encuentran en un lugar específico o locus (plural loci) en un cromosoma. Un alelo está presente en cada uno de los cromosomas del par de cromosomas homólogos. As used herein, the term "allele (s)" means any of one or more alternative forms of a gene in a particular locus. In a diploid (or amphiploid) cell of an organism, alleles of a given gene are found in a specific place or locus (plural loci) on a chromosome. An allele is present in each of the chromosomes of the pair of homologous chromosomes.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "cromosomas homólogos" significa cromosomas que contienen información para las mismas características biológicas y contienen los mismos genes en los mismos loci, pero posiblemente diferentes alelos de esos genes. Cromosomas homólogos son cromosomas que se aparean durante la meiosis. "Cromosomas no homólogos", que representan todas las características biológicas de un organismo, forman un juego, y el número de juegos en una célula se denomina ploidía. Los organismos diploides contienen dos juegos de cromosomas no homólogos, en donde cada uno de los cromosomas homólogos se hereda de un parental diferente. En especies anfidiploides existen esencialmente dos juegos de genomas diploides, por lo que a los cromosomas de los dos genomas se les alude como "cromosomas homeólogos" (y de manera similar, a los loci o genes de los dos genomas se les alude como loci o genes homeólogos). Una especie vegetal diploide, o anfidiploide, puede comprender un gran número de diferentes alelos en un locus particular. As used herein, the term "homologous chromosomes" means chromosomes that contain information for the same biological characteristics and contain the same genes in the same loci, but possibly different alleles of those genes. Homologous chromosomes are chromosomes that mate during meiosis. "Non-homologous chromosomes," which represent all the biological characteristics of an organism, form a game, and the number of games in a cell is called ploidy. Diploid organisms contain two sets of non-homologous chromosomes, where each of the homologous chromosomes is inherited from a different parent. In amphipiploid species there are essentially two sets of diploid genomes, so that the chromosomes of the two genomes are referred to as "homeologist chromosomes" (and similarly, the loci or genes of the two genomes are referred to as loci or homeologist genes). A diploid plant species, or amphipiploid, can comprise a large number of different alleles in a particular locus.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "heterocigoto" significa una condición genética que existe cuando dos alelos diferentes residen en un locus específico, pero están colocados individualmente en los pares de cromosomas homólogos correspondientes en la célula. A la inversa, tal como se utiliza en esta memoria, el término "homocigoto" significa una condición genética que existe cuando dos alelos idénticos residen en un locus específico, pero están colocados individualmente en pares de cromosomas homólogos correspondiente en la célula. As used herein, the term "heterozygous" means a genetic condition that exists when two different alleles reside in a specific locus, but are individually placed in the corresponding homologous pairs of chromosomes in the cell. Conversely, as used herein, the term "homozygous" means a genetic condition that exists when two identical alleles reside in a specific locus, but are individually placed in pairs of corresponding homologous chromosomes in the cell.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "locus" (loci en plural) significa un lugar o lugares específicos o un sitio en un cromosoma en donde se encuentra, por ejemplo, un gen o marcador genético. Por ejemplo, "FAD3-A1" se refiere a la posición en un cromosoma en el que se puede encontrar el gen FAD3-A1 (y dos alelos FAD3-A1), mientras que el "locus FAD3-C1" se refiere a la posición en un cromosoma en el que se puede encontrar el gen FAD3-C1 (y dos alelos FAD3-C1). As used herein, the term "locus" (plural loci) means a specific place or places or a site on a chromosome where, for example, a gene or genetic marker is found. For example, "FAD3-A1" refers to the position on a chromosome in which the FAD3-A1 gene (and two FAD3-A1 alleles) can be found, while the "FAD3-C1 locus" refers to the position on a chromosome in which the FAD3-C1 gene (and two FAD3-C1 alleles) can be found.

"Esencialmente similar", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a secuencias que tienen al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia. A estas secuencias de ácidos nucleicos también se las puede aludir como siendo "sustancialmente idénticas" o "esencialmente idénticas" a las secuencias FAD3 proporcionados en el listado de secuencias. La "identidad de secuencia" de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos relacionadas, expresada como un porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias alineadas óptimamente que tienen residuos idénticos (x 100), dividido por el número de posiciones comparadas. Un hueco, es decir, una posición en una alineación en donde un residuo está presente en una secuencia pero no en la otra, se considera como una posición con residuos no idénticos. El "alineamiento óptimo" de dos secuencias se encuentra alineando las dos secuencias a lo largo de toda la longitud de acuerdo con el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53) en The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6):. 276-277; véase, p. ej., http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) utilizando ajustes por defecto (penalización por apertura del hueco = 10 (para nucleótidos) / 10 (para proteínas) y penalización por extensión del hueco = 0,5 (para nucleótidos) / 0,5 (para proteínas)). Para los nucleótidos, la matriz de puntuación por defecto es EDNAFULL y para las proteínas la matriz de puntuación por defecto es EBLOSUM62. "Essentially similar," as used herein, refers to sequences that have at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity. These nucleic acid sequences can also be referred to as being "substantially identical" or "essentially identical" to the FAD3 sequences provided in the sequence listing. The "sequence identity" of two nucleotide sequences or related amino acids, expressed as a percentage, refers to the number of positions in the two optimally aligned sequences that have identical residues (x 100), divided by the number of positions compared. A gap, that is, a position in an alignment where a residue is present in one sequence but not in the other, is considered as a position with non-identical residues. The "optimal alignment" of two sequences is found by aligning the two sequences along the entire length according to the global alignment algorithm of Needleman and Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol 48 (3): 443- 53) in The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16 (6): 276-277; see, e.g., http://www.ebi.ac. uk / emboss / align / index.html) using default settings (hole opening penalty = 10 (for nucleotides) / 10 (for proteins) and hole extension penalty = 0.5 (for nucleotides) / 0.5 (for proteins)). For nucleotides, the default scoring matrix is EDNAFULL and for proteins the default scoring matrix is EBLOSUM62.

Se pueden utilizar "condiciones de hibridación rigurosas" para identificar secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas a una secuencia de nucleótidos dada. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser aproximadamente 5ºC menores que el punto de fusión térmico (Tm) para las secuencias específicas a una fuerza iónica y pH definidos. Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Típicamente, se elegirán las condiciones restrictivas en las que la concentración de sal es aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura es al menos 60°C. La reducción de la concentración de sal y/o el aumento de la temperatura aumenta la rigurosidad. Condiciones rigurosas para hibridaciones de ARN-ADN (transferencias Northern utilizando una sonda de, p. ej., 100 nt) son, por ejemplo, las que incluyen al menos un lavado en 0,2X SSC a 63°C durante 20 min, o condiciones equivalentes. "Rigorous hybridization conditions" can be used to identify nucleotide sequences that are substantially identical to a given nucleotide sequence. Rigorous conditions are sequence dependent and will be different in different circumstances. Generally, stringent conditions are selected to be approximately 5 ° C lower than the thermal melting point (Tm) for specific sequences at a defined ionic strength and pH. Tm is the temperature (under a defined ionic strength and pH) at which 50% of the target sequence hybridizes with a perfectly matching probe. Typically, restrictive conditions in which the salt concentration is approximately 0.02 molar at pH 7 and the temperature is at least 60 ° C will be chosen. The reduction in salt concentration and / or the increase in temperature increases the rigor. Rigorous conditions for RNA-DNA hybridizations (Northern blots using a probe of, e.g., 100 nt) are, for example, those that include at least one wash in 0.2X SSC at 63 ° C for 20 min, or equivalent conditions.

"Condiciones de alta rigurosidad" se pueden proporcionar, por ejemplo, por hibridación a 65°C en una disolución acuosa que contiene 6x SSC (20x SSC contiene NaCl 3,0 M, citrato de Na 0,3 M, pH 7,0), 5x Denhardt (100X Denhardt contiene Ficoll al 2%, polivinilpirrolidona al 2%, albúmina de suero bovino al 2%), dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,5% y 20 µg/ml de ADN soporte desnaturalizado (ADN de cadena sencilla de esperma de pescado, con una longitud media de 120-3000 nucleótidos) como competidor no específico. Después de la hibridación, el lavado de alta rigurosidad se puede realizar en varias etapas, con un lavado final (aproximadamente 30 min) a la temperatura de hibridación en 0,2-0,1 x SSC, SDS al 0,1%. "High stringency conditions" can be provided, for example, by hybridization at 65 ° C in an aqueous solution containing 6x SSC (20x SSC contains 3.0 M NaCl, 0.3 M Na citrate, pH 7.0) , 5x Denhardt (100X Denhardt contains 2% Ficoll, 2% polyvinylpyrrolidone, 2% bovine serum albumin), 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 20 µg / ml of denatured support DNA (chain DNA simple fish sperm, with an average length of 120-3000 nucleotides) as a non-specific competitor. After hybridization, the high stringency wash can be performed in several stages, with a final wash (approximately 30 min) at the hybridization temperature in 0.2-0.1 x SSC, 0.1% SDS.

"Condiciones de rigurosidad moderada" se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en la disolución descrita anteriormente, pero a aproximadamente 60-62°C. Lavado de rigurosidad moderada se puede realizar a la temperatura de hibridación en 1x SSC, SDS al 0,1%. "Conditions of moderate stringency" refers to conditions equivalent to hybridization in the solution described above, but at approximately 60-62 ° C. Washing of moderate stringency can be performed at the hybridization temperature in 1x SSC, 0.1% SDS.

"Baja rigurosidad" se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en la disolución descrita anteriormente a aproximadamente 50-52°C. El lavado de baja rigurosidad se puede realizar a la temperatura de hibridación en 2x SSC, SDS al 0,1%. Véase también Sambrook et al. (1989) y Sambrook y Russell (2001). "Low stringency" refers to conditions equivalent to hybridization in the solution described above at approximately 50-52 ° C. The low stringency wash can be performed at the hybridization temperature in 2x SSC, 0.1% SDS. See also Sambrook et al. (1989) and Sambrook and Russell (2001).

El término "ortólogo" de un gen o proteína se refiere en esta memoria al gen homólogo o proteína homóloga que se encuentra en otras especies, que tiene la misma función que el gen o proteína, pero (habitualmente) diverge en secuencia desde el instante en que divergió la especie que alberga los genes (es decir, los genes que evolucionaron a partir de un ancestro común por especiación). Ortólogos de los genes FAD3 de Brassica napus pueden, por lo tanto, ser identificados en otras especies vegetales (p. ej., Brassica juncea, etc.) basado tanto en las comparaciones de secuencias (p. ej., sobre la base de porcentajes de identidad de secuencia a lo largo de toda la secuencia o a lo largo de dominios específicos) y/o el análisis funcional. The term "ortholog" of a gene or protein refers herein to the homologous gene or homologous protein found in other species, which has the same function as the gene or protein, but (usually) diverges in sequence from the moment it is which diverged the species that harbors the genes (that is, the genes that evolved from a common ancestor by speciation). Orthologs of the Brassica napus FAD3 genes can, therefore, be identified in other plant species (e.g., Brassica juncea, etc.) based on both sequence comparisons (e.g., based on percentages sequence identity throughout the entire sequence or along specific domains) and / or functional analysis.

El término "mutante" o "mutación" se refiere, p. ej., a una planta o un gen que es diferente de la denominada variante de "tipo salvaje" (también escrito "tipo-salvaje"), que se refiere a una forma típica de, p. ej., una planta o un gen, ya que se produce de forma más frecuente en la naturaleza. Una "planta de tipo salvaje" se refiere a una planta con el fenotipo más común de una planta de este tipo en la población natural. Un "alelo de tipo salvaje" se refiere a un alelo The term "mutant" or "mutation" refers, e.g. eg, to a plant or gene that is different from the so-called "wild type" variant (also written "wild-type"), which refers to a typical form of, e.g. eg, a plant or a gene, since it occurs more frequently in nature. A "wild type plant" refers to a plant with the most common phenotype of such a plant in the natural population. A "wild type allele" refers to an allele

de un gen necesario para producir el fenotipo de tipo salvaje. Una planta mutante o alelo puede producirse en la población natural o puede producirse por la intervención humana, p. ej., mediante mutagénesis, y un "alelo mutante", por lo tanto, se refiere a un alelo de un gen necesario para producir el fenotipo mutante. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "alelo FAD3 mutante" (p. ej., FAD3-A1, FAD3-C1, FAD3-A2, FAD3-A3 o FAD3-C2 mutante) se refiere a un alelo FAD3, que dirige la expresión de una cantidad significativamente reducida de proteína FAD3 funcional que el correspondiente alelo de tipo salvaje. Esto puede ocurrir ya sea por el alelo FAD3 mutante que codifica una proteína FAD3 no funcional que, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una proteína FAD3 que no tiene actividad biológica, una actividad biológica modificada de manera significativa y/o una actividad biológica significativamente reducida en comparación con la correspondiente proteína FAD3 funcional de tipo salvaje, o por el alelo FAD3 mutante que codifica una cantidad significativamente reducida de proteína FAD3 funcional o ninguna proteína FAD3 en absoluto. Un "alelo FAD3 mutante" de este tipo comprende, por lo tanto, una o más mutaciones en su secuencia de ácido nucleico en comparación con el alelo de tipo salvaje, por lo que la o las mutaciones resultan preferiblemente en una cantidad (absoluta o relativa) significativamente reducida de proteína FAD3 funcional en la célula in vivo. of a gene necessary to produce the wild type phenotype. A mutant plant or allele can be produced in the natural population or can be produced by human intervention, e.g. eg, by mutagenesis, and a "mutant allele", therefore, refers to an allele of a gene necessary to produce the mutant phenotype. As used herein, the term "mutant FAD3 allele" (eg, FAD3-A1, FAD3-C1, FAD3-A2, FAD3-A3 or FAD3-C2 mutant) refers to a FAD3 allele, which directs the expression of a significantly reduced amount of functional FAD3 protein than the corresponding wild type allele. This may occur either by the mutant FAD3 allele that encodes a non-functional FAD3 protein which, as used herein, refers to an FAD3 protein that has no biological activity, a significantly modified biological activity and / or a significantly reduced biological activity compared to the corresponding wild-type functional FAD3 protein, or by the mutant FAD3 allele that encodes a significantly reduced amount of functional FAD3 protein or no FAD3 protein at all. A "mutant FAD3 allele" of this type therefore comprises one or more mutations in its nucleic acid sequence as compared to the wild type allele, whereby the mutation (s) preferably results in an amount (absolute or relative) ) significantly reduced functional FAD3 protein in the cell in vivo.

Mutaciones en secuencias de ácido nucleico pueden incluir, por ejemplo: Mutations in nucleic acid sequences may include, for example:

(a) (to): un "mutación de sentido erróneo", que es un cambio en la secuencia de ácido nucleico que resulta en la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido; a "missense mutation", which is a change in the nucleic acid sequence that results in the substitution of one amino acid for another amino acid;

(b) (b): una "mutación sin sentido" o "mutación del codón de parada", que es un cambio en la secuencia de ácido nucleico que resulta en la introducción de un codón DE PARADA prematuro y, por lo tanto, la terminación de la traducción (que resulta en una proteína truncada); genes vegetales contienen los codones de terminación de la traducción "TGA" (UGA en el ARN), "TAA" (UAA en el ARN) y "TAG" (UAG en el ARN); así, cualquier sustitución, inserción, deleción de nucleótidos que resulta en uno de estos codones que esté en el ARNm maduro que esté siendo traducido (en el marco de lectura) terminará la traducción. a "nonsense mutation" or "mutation of the stop codon," which is a change in the nucleic acid sequence that results in the introduction of a premature STOP codon and, therefore, translation termination (resulting in a truncated protein); plant genes contain the translation termination codons "TGA" (UGA in RNA), "TAA" (UAA in RNA) and "TAG" (UAG in RNA); thus, any substitution, insertion, deletion of nucleotides that results in one of these codons that is in the mature mRNA being translated (in the reading frame) will terminate the translation.

(c)(C): una "mutación por inserción" de uno o más aminoácidos, debida a uno o más codones que han sido añadidos en la secuencia codificante del ácido nucleico; an "insertion mutation" of one or more amino acids, due to one or more codons that have been added in the nucleic acid coding sequence;

(d)(d): una "mutación por deleción" de uno o más aminoácidos, debida a haber sido eliminados uno o más codones en la secuencia codificante del ácido nucleico; a "deletion mutation" of one or more amino acids, due to the elimination of one or more codons in the nucleic acid coding sequence;

(e) (and): una "mutación por desplazamiento de marco", que resulta en que la secuencia de ácido nucleico que se está traduciendo esté en un marco diferente aguas abajo de la mutación. Una mutación por desplazamiento de marco puede tener diversas causas tales como la inserción, deleción o duplicación de uno o más nucleótidos, pero también mutaciones que afectan al corte y empalme de pre-ARNm (mutaciones del sitio por corte y empalme) pueden dar lugar a desplazamientos de marco; a "frame shift mutation", which results in the nucleic acid sequence being translated being in a different frame downstream of the mutation. A frame shift mutation can have various causes such as insertion, deletion or duplication of one or more nucleotides, but also mutations that affect the splicing of pre-mRNA (site mutations by splicing) can lead to frame shifts;

(f)(F): una "mutación del sitio por corte y empalme", que altera o suprime el corte y empalme correctos de la secuencia de pre-ARNm, dando como resultado una proteína de diferente secuencia de aminoácidos que el tipo salvaje. Por ejemplo, uno o más exones pueden omitirse durante el corte y empalme de ARN, lo que resulta en una proteína que carece de los aminoácidos codificados por los exones omitidos. Alternativamente, el marco de lectura puede ser alterado a través de un corte y empalme incorrecto, o uno o más intrones puede ser retenido, o se puede generar donantes o aceptores de corte y empalme alternativos, o el corte y empalme puede ser iniciado en una posición alternativa (p. ej., dentro de un intrón), o se pueden generar señales de poliadenilación alternativas. Un corte y empalme de pre-ARNm correcto es un proceso complejo, que puede verse afectado por diversas mutaciones en la secuencia de nucleótidos de los genes que codifican FAD3. En eucariotas superiores, tales como plantas, el espliceosoma principal corta y empalma intrones que contienen GU en el sitio de corte y empalme 5’ (sitio donante) y AG en el sitio donante 3' (sitio aceptor). Esta regla GU-AG (o regla GT-AG; véase Lewin, Genes VI, Oxford University Press 1998, págs. 885-920, ISBN 0198577788) es seguida por aproximadamente el 99% de los sitios de corte y empalme de genes eucariotas nucleares, mientras que los intrones que contienen otros dinucleótidos en el sitio de empalme 5' y 3', tal como GC-AG y AU-AC, representa sólo aproximadamente 1% y 0,1%, respectivamente. a "mutation of the site by splicing", which alters or suppresses the correct splicing of the pre-mRNA sequence, resulting in a protein of different amino acid sequence than the wild type. For example, one or more exons can be omitted during RNA splicing, resulting in a protein that lacks the amino acids encoded by the omitted exons. Alternatively, the reading frame may be altered through an incorrect splice, or one or more introns may be retained, or alternative splicing donors or acceptors may be generated, or the splicing may be initiated at an alternative position (e.g., within an intron), or alternative polyadenylation signals can be generated. A correct pre-mRNA splice is a complex process, which can be affected by various mutations in the nucleotide sequence of the genes encoding FAD3. In higher eukaryotes, such as plants, the main splenic splicer cuts and splices introns that contain GU at the 5 ’splice site (donor site) and AG at the 3 'donor site (acceptor site). This GU-AG rule (or GT-AG rule; see Lewin, Genes VI, Oxford University Press 1998, pp. 885-920, ISBN 0198577788) is followed by approximately 99% of the splicing sites of nuclear eukaryotic genes , while introns containing other dinucleotides at the 5 'and 3' splice site, such as GC-AG and AU-AC, represent only about 1% and 0.1%, respectively.

Se desea que la o las mutaciones en la secuencia de ácido nucleico resulten preferiblemente en una proteína mutante que comprende una actividad enzimática significativamente reducida o ninguna in vivo, es decir, actividad C18:2 a C18:3 desaturasa. Básicamente, cualquier mutación que resulte en una proteína que comprende al menos una inserción, deleción y/o sustitución de aminoácidos con respecto a la proteína de tipo salvaje puede dar lugar a una actividad enzimática significativamente reducida o a ninguna. Sin embargo, ha de entenderse que es más probable que las mutaciones en determinadas partes de la proteína resulten en una función reducida de la proteína FAD3 mutante, tales como mutaciones que conducen a proteínas truncadas, con lo que faltan partes significativas de los dominios funcionales y/o estructurales. It is desired that the mutations in the nucleic acid sequence preferably result in a mutant protein comprising significantly reduced enzymatic activity or none in vivo, that is, C18: 2 to C18: 3 desaturase activity. Basically, any mutation that results in a protein that comprises at least one insertion, deletion and / or substitution of amino acids with respect to the wild-type protein can result in a significantly reduced or no enzyme activity. However, it is to be understood that mutations in certain parts of the protein are more likely to result in a reduced function of the mutant FAD3 protein, such as mutations that lead to truncated proteins, thereby missing significant parts of the functional domains and / or structural.

Tal como se utiliza en esta memoria, un "alelo totalmente inactivado" es un alelo mutante que dirige una expresión de FAD3 funcional significativamente reducida o ninguna, es decir, una significativamente reducida de proteína FAD3 funcional o ninguna proteína FAD3 funcional, en la célula in vivo. Alelos mutantes FAD3 totalmente inactivados incluyen, por ejemplo, mutaciones por deleción de la totalidad o de una parte sustancial de la región codificante, o mutaciones por desplazamiento de marco o de codón de parada que conducen a una eliminación sustancial o completa de la proteína. Por ejemplo, un alelo FAD3 totalmente inactivado comprende una mutación As used herein, a "totally inactivated allele" is a mutant allele that directs a significantly reduced or no functional FAD3 expression, that is, a significantly reduced functional FAD3 protein or no functional FAD3 protein, in the cell. alive. Fully inactivated FAD3 mutant alleles include, for example, deletion mutations of all or a substantial part of the coding region, or frame or stop codon shift mutations that lead to substantial or complete elimination of the protein. For example, a fully inactivated FAD3 allele comprises a mutation.

que interrumpe o elimina el motivo de retención de ER que está presente en los 5 los aminoácidos más C-terminales (-KSKIN). Esto resultará en una pérdida completa de la recuperación del ER y en una subsiguiente acumulación de la proteína en el aparato de Golgi o la membrana plasmática, haciéndola incapaz de realizar su función (McCartney et al., 2004, Plant Journal 37, páginas 156-173). Por lo tanto, por ejemplo, cualquier mutación de codón de parada, por desplazamiento de marco o de sitio de corte y empalme que conduce a un truncamiento C-terminal de la proteína que incluye el motivo de retención de ER resultará en un alelo FAD3 totalmente inactivado, al igual que una mutación de sentido erróneo (p. ej., una sustitución de una o de las dos lisinas), inserción o deleción en la secuencia de nucleótidos que codifica el motivo propiamente dicho, es decir, a partir del nt 1117 de SEQ ID NO: 11 (correspondiente a Lys373 de SEQ ID NO: 2) y aún más aguas abajo con relación al codón de inicio ATG en la secuencia codificante de FAD3-A1 o residuos homólogos con el mismo. which interrupts or eliminates the reason for ER retention that is present in the 5 most C-terminal amino acids (-KSKIN). This will result in a complete loss of ER recovery and a subsequent accumulation of the protein in the Golgi apparatus or plasma membrane, rendering it unable to perform its function (McCartney et al., 2004, Plant Journal 37, pages 156- 173). Therefore, for example, any stop codon mutation, by frame or splice site shifting that leads to a C-terminal truncation of the protein that includes the ER retention motif will result in a fully FAD3 allele inactivated, as well as a missense mutation (eg, a substitution of one or both lysines), insertion or deletion in the nucleotide sequence encoding the motif itself, that is, from nt 1117 SEQ ID NO: 11 (corresponding to Lys373 of SEQ ID NO: 2) and further downstream in relation to the ATG start codon in the FAD3-A1 coding sequence or homologous residues therewith.

Alternativamente, un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una mutación que elimina o altera uno cualquiera de los ocho residuos histidina conservados. Por ejemplo, un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una mutación, p. ej., mutación sin sentido o por desplazamiento de marco, entre los nucleótidos (nt) 274276 y los nt 895-897 con respecto al codón de inicio ATG en la secuencia codificante de FAD3-A1 (número de acceso a GenBank FJ985689.1) que codifica respectivamente la primera y última histidinas conservadas (His92 y His299 de la proteína FAD3-A1; número de acceso a GenBank ACS26169.1), o residuos homólogos con el mismo. En otro ejemplo, las mutaciones de sentido erróneo que conducen a la sustitución de cualquiera de estos ocho residuos histidina resultarán en una proteína FAD3 no funcional. Todavía en otro ejemplo, un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una mutación o mutaciones de inserción, deleción o de sitio de corte y empalme que eliminan o alteran cualquiera de los nucleótidos que codifican las ocho histidinas unión a di-hierro, o alteran el posicionamiento de una o más de las ocho histidinas de unión a di-hierro con respecto a las potenciales dominios que abarcan la membrana o bien entre sí. Alternatively, a fully inactivated mutant FAD3 allele comprises a mutation that removes or alters any one of eight conserved histidine residues. For example, a totally inactivated mutant FAD3 allele comprises a mutation, e.g. e.g., nonsense or frame shift mutation, between nucleotides (nt) 274276 and nt 895-897 with respect to the ATG start codon in the FAD3-A1 coding sequence (GenBank accession number FJ985689.1) which respectively encodes the first and last conserved histidines (His92 and His299 of the FAD3-A1 protein; GenBank accession number ACS26169.1), or homologous residues therewith. In another example, missense mutations that lead to the replacement of any of these eight histidine residues will result in a non-functional FAD3 protein. In yet another example, a totally inactivated mutant FAD3 allele comprises a mutation or insertion, deletion or splice site mutations that eliminate or alter any of the nucleotides encoding the eight di-iron binding histidines, or alter positioning of one or more of the eight di-iron binding histidines with respect to the potential domains that span the membrane or each other.

Otro ejemplo de un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado es un alelo FAD3 que codifica una proteína FAD3 truncada en posición N-terminal. En el caso de una mutación aguas arriba de los nucleótidos que codifican la primera histidina di-hierro, un ATG alterativo, aguas abajo del codón de inicio original, puede ser utilizado para inicios de la traducción, con lo que todavía se puede formar una proteína truncada en posición N-terminal. Sin embargo, un truncamiento de este tipo interrumpirá o eliminará el potencial de la secuencia de señal N-terminal, que normalmente funciona para dirigir la proteína al ER, que conduce a una dislocación de FAD3 al citosol, lo cual lo hace incapaz de realizar su función normal. Another example of a totally inactivated mutant FAD3 allele is an FAD3 allele that encodes an N-terminal truncated FAD3 protein. In the case of a mutation upstream of the nucleotides encoding the first di-iron histidine, an alterative ATG, downstream of the original start codon, can be used for early translation, so that a protein can still be formed truncated in N-terminal position. However, such a truncation will interrupt or eliminate the potential of the N-terminal signal sequence, which normally functions to direct the protein to the ER, which leads to a dislocation of FAD3 to the cytosol, which makes it unable to perform its normal function

Tal como se utiliza en esta memoria, una "cantidad significativamente reducida de proteína FAD3 funcional" (p. ej., proteína FAD3-A1, FAD3-A2, FAD3-A3, FAD3-C1 y/o FAD3-C2 funcional) se refiere a una reducción en la cantidad de una proteína FAD3 funcional producida por la célula que comprende un alelo FAD3 mutante en al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% (es decir, ninguna proteína funcional es producida por la célula) en comparación con la cantidad de la proteína FAD3 funcional producida por la célula que no comprende el alelo mutante FAD3. Esta definición abarca la producción de una proteína FAD3 "no funcional" (p. ej., proteína FAD3 truncada) que no tiene actividad biológica (actividad desaturasa C18:2 a C18:3) in vivo, la reducción en la cantidad absoluta de la proteína FAD3 funcional (p. ej. no se hace proteína FAD3 funcional debido a la mutación en el gen FAD3) y/o la producción de una proteína FAD3 con actividad biológica significativamente reducida en comparación con la actividad de una proteína FAD3 de tipo salvaje funcional (tal como una proteína FAD3 en la que uno o más residuos aminoácidos que son cruciales para la actividad biológica de la proteína FAD3 codificada son sustituidos por otro residuo aminoácido o son eliminados). As used herein, a "significantly reduced amount of functional FAD3 protein" (eg, FAD3-A1, FAD3-A2, FAD3-A3, FAD3-C1 and / or FAD3-C2 functional protein) refers to at a reduction in the amount of a functional FAD3 protein produced by the cell comprising a mutant FAD3 allele by at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or 100 % (that is, no functional protein is produced by the cell) compared to the amount of the functional FAD3 protein produced by the cell that does not comprise the FAD3 mutant allele. This definition encompasses the production of a "non-functional" FAD3 protein (eg, truncated FAD3 protein) that has no biological activity (C18: 2 to C18: 3 desaturase activity) in vivo, reducing the absolute amount of the Functional FAD3 protein (eg functional FAD3 protein is not made due to mutation in the FAD3 gene) and / or the production of a FAD3 protein with significantly reduced biological activity compared to the activity of a functional wild type FAD3 protein (such as an FAD3 protein in which one or more amino acid residues that are crucial for the biological activity of the encoded FAD3 protein are replaced by another amino acid residue or are eliminated).

La expresión "proteína FAD3 mutante", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una proteína FAD3 codificada por una secuencia ácido nucleico FAD3 mutante ("alelo fad3"), por lo que la mutación resulta en una actividad FAD3 biológica significativamente reducida y/o ninguna actividad (actividad desaturasa C18:2 a C18:3) in vivo, en comparación con la actividad de la proteína FAD3 codificada por una secuencia FAD3 no mutante, de tipo salvaje ("alelo FAD3"). The term "mutant FAD3 protein", as used herein, refers to a FAD3 protein encoded by a mutant FAD3 nucleic acid sequence ("fad3 allele"), whereby the mutation results in a significantly reduced biological FAD3 activity. and / or no activity (C18: 2 to C18: 3 desaturase activity) in vivo, compared to the activity of the FAD3 protein encoded by a wild-type non-mutant FAD3 sequence ("FAD3 allele").

Tal como se utiliza en esta memoria, "un contenido significativamente reducido de C18:3" o "bajo ácido alfalinolénico" se refiere a una reducción significativa en la cantidad de ácido alfa-linolénico (C18: 3) total presente en el aceite de semilla de una planta que comprende uno o más alelos FAD3 mutantes en comparación con el aceite de semilla de una planta correspondiente que no comprende dicho alelo o alelos FAD3 mutantes. El contenido de C18:3 del aceite de semillas de dichas plantas que comprenden uno o más alelos FAD3 mutantes se reduce hasta por debajo de 11% en peso, 10% en peso, 9% en peso, 8% en peso, 7,0% en peso, 6,0% en peso, 5,0% en peso, 4,0% en peso, 3,0% en peso, 2,5% en peso, 2,0% en peso, 1,5% en peso, 1,0% en peso, 0,5% en peso del contenido total de aceite de semillas. As used herein, "a significantly reduced content of C18: 3" or "low alfalinolenic acid" refers to a significant reduction in the amount of total alpha-linolenic acid (C18: 3) present in the seed oil of a plant comprising one or more mutant FAD3 alleles compared to the seed oil of a corresponding plant that does not comprise said mutant FAD3 allele or alleles. The C18: 3 content of the seed oil of said plants comprising one or more mutant FAD3 alleles is reduced to below 11% by weight, 10% by weight, 9% by weight, 8% by weight, 7.0 % by weight, 6.0% by weight, 5.0% by weight, 4.0% by weight, 3.0% by weight, 2.5% by weight, 2.0% by weight, 1.5% by weight, 1.0% by weight, 0.5% by weight of the total seed oil content.

Se entiende que contenido de C18:3 del aceite de semillas puede variar dependiendo de los antecedentes genéticos y de las condiciones de crecimiento (p. ej., temperatura). Sin pretender limitar la invención, se espera que los niveles It is understood that the C18: 3 content of the seed oil may vary depending on the genetic background and growth conditions (e.g., temperature). Without intending to limit the invention, levels are expected

de C18:3 del aceite de semillas serán generalmente más altos cuando las plantas se cultivan en el campo que cuando se cultivan en el invernadero. Por lo tanto, con el fin de determinar si una planta de acuerdo con la invención, es decir, una planta que comprende uno o más alelos FAD3 mutantes, tiene un contenido significativamente reducido de C18:3 del aceite de semillas, debería hacerse una comparación con una planta correspondiente (es decir, del misma fondo genético) que no comprende dicho o dichos alelos FAD3 mutantes cultivada en las mismas condiciones, en lugar de evaluar los niveles absolutos de C18:3 del aceite de semillas. of C18: 3 seed oil will generally be higher when plants are grown in the field than when grown in the greenhouse. Therefore, in order to determine whether a plant according to the invention, that is, a plant comprising one or more mutant FAD3 alleles, has a significantly reduced C18: 3 content of the seed oil, a comparison should be made. with a corresponding plant (i.e. from the same genetic background) that does not comprise said or said mutant FAD3 alleles grown under the same conditions, instead of evaluating the absolute C18: 3 levels of the seed oil.

La composición de ácidos grasos de aceite de semilla, incluyendo el contenido en C18:3, se puede determinar utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante la extracción de los acilos grasos de las semillas y el análisis de sus niveles relativos en el aceite de semilla por cromatografía de gas-líquido capilar tal como se describe, p. ej., en el documento WO09/007091. The fatty acid composition of seed oil, including the C18: 3 content, can be determined using methods known in the art, for example by extracting the fatty acyls from the seeds and analyzing their relative levels in the oil of seed by capillary gas-liquid chromatography as described, e.g. eg, in WO09 / 007091.

"Mutagénesis", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere al proceso en el que las células vegetales (p. ej., una pluralidad de semillas de Brassica u otras partes, tales como el polen, etc.) se someten a una técnica que induce mutaciones en el ADN de las células, tal como el contacto con un agente mutagénico, tal como una sustancia química (tal como etilmetilsulfonato (EMS), etilnitrosourea (ENU), etc.) o la radiación ionizante (neutrones (tal como en la mutagénesis de neutrones rápidos, etc.), rayos alfa, rayos gamma (tal como los suministrados por una fuente de cobalto 60), rayos X, radiación UV, etc.), o una combinación de dos o más de estos. Por lo tanto, la mutagénesis deseada de uno o más alelos FAD3 se puede lograr mediante el uso de medios químicos tales como por contacto de uno o más tejidos vegetales con etilmetilsulfonato (EMS), etilnitrosourea, etc., mediante el uso de medios físicos tales como rayos X, etc., o por radiación gamma tal como la suministrada por una fuente de cobalto 60. Mientras que las mutaciones creadas por irradiación son a menudo grandes deleciones u otras lesiones toscas tales como translocaciones o reordenamientos complejos, las mutaciones creadas por mutágenos químicos son a menudo lesiones más discretas tales como mutaciones puntuales. Por ejemplo, bases de guanina con alquilatos de EMS, que resulta en un apareamiento erróneo de las bases: una guanina alquilada se emparejará con una base de timina, resultando principalmente transiciones G/C a A/T. Después de la mutagénesis, las plantas de Brassica se regeneran a partir de las células tratadas utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, las semillas de Brassica resultantes pueden plantarse de acuerdo con procedimientos convencionales de cultivo y después de la autopolinización se forma semilla en las plantas. Alternativamente, pueden extraerse se plántulas haploides dobles para formar inmediatamente plantas homocigotas, por ejemplo tal como se describe por Coventry et al. (1988, Manual for Microspore Culture for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. Publicación OAC 0489. Univ. de Guelph, Guelph, Ontario, Canadá). Semilla adicional que se forma como resultado de una auto-polinización de este tipo en la presente generación o en una posterior puede ser recolectada y rastreada en cuanto a la presencia de alelos FAD3 mutantes. Se conocen varias técnicas para rastrear alelos mutantes específicos, p. ej., Deleteagene™ (Delet-agene; Li et al., 2001, Plant J. 27: 235-242) utiliza ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para rastrear mutantes por deleción generados por mutagénesis de neutrones rápidos, TILLING (lesiones locales dirigidas inducidas en genomas; McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol. 18:455-457) identifica mutaciones puntuales inducidas por EMS, etc. Técnicas adicionales para el rastreo de la presencia de alelos FAD3 mutantes específicos se describen en los Ejemplos que figuran más adelante. "Mutagenesis", as used herein, refers to the process in which plant cells (eg, a plurality of Brassica seeds or other parts, such as pollen, etc.) are subjected to a technique that induces mutations in the DNA of cells, such as contact with a mutagenic agent, such as a chemical (such as ethylmethylsulfonate (EMS), ethylnitrosourea (ENU), etc.) or ionizing radiation (neutrons (such as in the rapid neutron mutagenesis, etc.), alpha rays, gamma rays (such as those supplied by a source of cobalt 60), X-rays, UV radiation, etc.), or a combination of two or more of these. Therefore, the desired mutagenesis of one or more FAD3 alleles can be achieved by the use of chemical means such as by contact of one or more plant tissues with ethylmethylsulfonate (EMS), ethylnitrosourea, etc., by the use of physical means such such as X-rays, etc., or by gamma radiation such as that supplied by a source of cobalt 60. While mutations created by irradiation are often large deletions or other coarse lesions such as translocations or complex rearrangements, mutations created by mutagens Chemicals are often more discrete lesions such as point mutations. For example, guanine bases with EMS alkylates, which results in a mismatch of the bases: an alkylated guanine will be paired with a thymine base, resulting primarily in G / C to A / T transitions. After mutagenesis, Brassica plants are regenerated from the treated cells using known techniques. For example, the resulting Brassica seeds can be planted according to conventional cultivation procedures and after self-pollination seed is formed in the plants. Alternatively, double haploid seedlings can be extracted to immediately form homozygous plants, for example as described by Coventry et al. (1988, Manual for Microspore Culture for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. University of Guelph, Guelph, Ontario, Canada). Additional seed that is formed as a result of a self-pollination of this type in the present generation or in a subsequent one can be collected and tracked for the presence of mutant FAD3 alleles. Several techniques are known for tracking specific mutant alleles, e.g. e.g., Deleteagene ™ (Delet-agene; Li et al., 2001, Plant J. 27: 235-242) uses polymerase chain reaction (PCR) assays to screen deletion mutants generated by rapid neutron mutagenesis, TILLING (local genome-induced targeted lesions; McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol. 18: 455-457) identifies point mutations induced by EMS, etc. Additional techniques for tracking the presence of specific mutant FAD3 alleles are described in the Examples below.

Siempre que se haga referencia a una "planta" o "plantas", de acuerdo con la invención, se entiende que también quedan abarcadas en esta memoria las partes de plantas (células, tejidos u órganos, vainas de semillas, semillas, partes cortadas tales como raíces, hojas, flores, polen, etc.), la progenie de las plantas que conservan las características distintivas de los parentales (especialmente el contenido en C18:3 de aceite de semillas), tales como las semillas obtenidas por autofecundación o cruce, p. ej., las semillas híbridas (obtenidas mediante el cruce de dos líneas parentales endógamas), plantas híbridas y partes de las plantas derivadas de las mismas, a menos que se indique lo contrario. Whenever reference is made to a "plant" or "plants", in accordance with the invention, it is understood that parts of plants (cells, tissues or organs, seed pods, seeds, cut-off parts such as these are also encompassed herein). such as roots, leaves, flowers, pollen, etc.), the progeny of plants that retain the distinctive characteristics of the parents (especially the C18: 3 content of seed oil), such as the seeds obtained by self-fertilization or crossing, p. eg, hybrid seeds (obtained by crossing two endogenous parental lines), hybrid plants and parts of the plants derived therefrom, unless otherwise indicated.

"Planta de cultivo" se refiere a las especies vegetales cultivadas como un cultivo tales como Brassica napus (AACC, 2n = 38), Brassica juncea (AABB, 2n = 36), Brassica carinata (BBCC, 2n = 34), Brassica rapa (sin. B. campestris ) (AA, 2n = 20), Brassica oleracea (CC, 2n = 18) o Brassica nigra (BB, 2n = 16). La definición no incluye las malas hierbas tales como Arabidopsis thaliana. "Crop plant" refers to plant species grown as a crop such as Brassica napus (AACC, 2n = 38), Brassica juncea (AABB, 2n = 36), Brassica carinata (BBCC, 2n = 34), Brassica rapa ( without B. campestris) (AA, 2n = 20), Brassica oleracea (CC, 2n = 18) or Brassica nigra (BB, 2n = 16). The definition does not include weeds such as Arabidopsis thaliana.

Un "variedad" se utiliza en esta memoria de conformidad con la Convención de la UPOV y se refiere a un conjunto de plantas dentro un solo taxón botánico del rango más bajo conocido, conjunto que puede definirse por la expresión de las características que resultan de un genotipo dado o de una combinación de genotipos, puede distinguirse de cualquier otro conjunto de plantas por la expresión de al menos uno de dichos caracteres y se considera como una unidad, habida cuenta de su aptitud a propagarse sin alteración (estable). A "variety" is used herein in accordance with the UPOV Convention and refers to a set of plants within a single botanical taxon of the lowest known range, which can be defined by the expression of the characteristics that result from a given genotype or a combination of genotypes, can be distinguished from any other set of plants by the expression of at least one of said characters and is considered as a unit, given its ability to spread without alteration (stable).

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "se produce de forma no natural" o "cultivada", cuando se utiliza con referencia a una planta, significa una planta con un genoma que ha sido modificado por el hombre. Una planta transgénica, por ejemplo, es una planta que se produce de forma no natural que contiene una molécula de ácido As used herein, the expression "occurs unnaturally" or "cultivated", when used with reference to a plant, means a plant with a genome that has been modified by man. A transgenic plant, for example, is a plant that is produced unnaturally that contains an acid molecule

nucleico exógeno, p. ej., un gen quimérico que comprende una región transcrita que cuando se transcribe proporciona una molécula de ARN biológicamente activa capaz de reducir la expresión de un gen endógeno tal como un gen FAD3 tal como se describe en esta memoria y, por lo tanto, haya sido modificada genéticamente por el hombre. Además, una planta que contiene una mutación en un gen endógeno, por ejemplo, una mutación en un gen FAD3 endógeno (p. ej., en un elemento regulador o en la secuencia codificante) como resultado de una exposición a un agente mutagénico también se considera una planta que se produce de forma no natural, ya que ha sido modificada genéticamente por el hombre. Además, una planta de una especie particular tal como Brassica napus, que contiene una mutación en un gen endógeno, por ejemplo, en un gen FAD3 endógeno, que en la naturaleza no se produce en esa especie vegetal particular, como resultado de, por ejemplo, los procesos de reproducción dirigida tal como la reproducción asistida por marcadores y la selección o introgresión, con una planta de la misma o de otra especie tal como Brassica juncea o rapa, de esa planta también se considera una planta que se produce de forma no natural. Por el contrario, una planta que contiene sólo mutaciones espontáneas o que se producen de forma natural, es decir, una planta que no haya sido modificada genéticamente por el hombre, no es una "planta que se produce de forma no natural" tal como se define en esta memoria y, por lo tanto, no queda abarcado dentro de la invención. Un experto en la técnica entiende que, mientras que una planta que se produce de forma no natural tiene típicamente una secuencia de nucleótidos que está alterada en comparación con una planta que se produce de forma natural, una planta que se produce de forma no natural también puede ser modificada genéticamente por el hombre, sin alterar su secuencia de nucleótidos, por ejemplo, mediante la modificación de su patrón de metilación. exogenous nucleic, e.g. eg, a chimeric gene that comprises a transcribed region that when transcribed provides a biologically active RNA molecule capable of reducing the expression of an endogenous gene such as an FAD3 gene as described herein and, therefore, has been genetically modified by man. In addition, a plant that contains a mutation in an endogenous gene, for example, a mutation in an endogenous FAD3 gene (e.g., in a regulatory element or in the coding sequence) as a result of exposure to a mutagenic agent is also It considers a plant that is produced unnaturally, since it has been genetically modified by man. In addition, a plant of a particular species such as Brassica napus, which contains a mutation in an endogenous gene, for example, in an endogenous FAD3 gene, which in nature does not occur in that particular plant species, as a result of, for example , the processes of directed reproduction such as the reproduction assisted by markers and the selection or introgression, with a plant of the same or another species such as Brassica juncea or rapa, of that plant is also considered a plant that is produced in a non- natural. On the contrary, a plant that contains only spontaneous mutations or that occur naturally, that is, a plant that has not been genetically modified by man, is not a "plant that is produced unnaturally" as it is defined herein and, therefore, is not encompassed within the invention. One skilled in the art understands that, while a plant that is produced unnaturally typically has a nucleotide sequence that is altered compared to a plant that occurs naturally, a plant that occurs unnaturally also it can be genetically modified by man, without altering its nucleotide sequence, for example, by modifying its methylation pattern.

Tal como se utiliza en esta memoria, "un desarrollo vegetal agronómicamente adecuado" se refiere a un desarrollo de la planta, en particular una planta de semillas de aceite de colza, que no afecta adversamente a su rendimiento bajo prácticas agrícolas normales, más específicamente su establecimiento en el campo, vigor, tiempo de floración, altura, maduración, resistencia al aplanamiento, rendimiento, resistencia a enfermedades, resistencia a la rotura de la vaina, etc. Por lo tanto, las líneas con un contenido significativamente reducido de C18R del aceite de semillas con un desarrollo de las plantas agronómicamente adecuado tienen un contenido de C18:3 de aceite de semillas que ha disminuido en comparación con el contenido de C18:3 de aceite de semillas de una planta que se sabe que tiene un contenido medio de C18:3 de aceite de semillas al tiempo que mantiene un establecimiento similar en el campo, vigor, tiempo de floración, altura, maduración, resistencia al aplanamiento, rendimiento, resistencia a enfermedades, resistencia a la rotura de las vainas, etc. As used herein, "agronomically adequate plant development" refers to a plant development, in particular a rapeseed oil seed plant, which does not adversely affect its performance under normal agricultural practices, more specifically its establishment in the field, vigor, flowering time, height, maturation, resistance to flattening, yield, resistance to diseases, resistance to sheath breakage, etc. Therefore, lines with a significantly reduced C18R content of seed oil with agronomically adequate plant development have a C18: 3 content of seed oil that has decreased compared to the C18: 3 oil content of seeds of a plant that is known to have an average C18: 3 content of seed oil while maintaining a similar establishment in the field, vigor, flowering time, height, maturation, flattening resistance, yield, resistance to diseases, resistance to sheath breakage, etc.

La expresión "que comprende" debe interpretarse como que especifica la presencia de las partes, fases o componentes establecidos, pero no excluye la presencia de una o más partes, fases o componentes adicionales. Una planta que comprende un determinado rasgo puede comprender, por lo tanto, rasgos adicionales. The term "comprising" should be interpreted as specifying the presence of the established parts, phases or components, but does not exclude the presence of one or more additional parts, phases or components. A plant comprising a certain feature can therefore comprise additional features.

Se entiende que cuando se hace referencia a una palabra en singular (p. ej., planta o raíz), también se incluye en esta memoria el plural (p. ej., una pluralidad de plantas, una pluralidad de raíces). Por lo tanto, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y sólo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "una", por lo tanto, significa habitualmente "al menos uno". It is understood that when referring to a singular word (e.g., plant or root), the plural is also included herein (e.g., a plurality of plants, a plurality of roots). Therefore, the reference to an element by the indefinite article "a" or "a" does not exclude the possibility that more than one of the elements is present, unless the context clearly requires that there be one and only one of the elements. The indefinite article "a" or "a", therefore, usually means "at least one".

DESCRIPCIÓN DETALLADA DETAILED DESCRIPTION

Se describe que Brassica napus (genoma AACC, 2n = 4x = 38), que es una especie en alotetraploide (anfidiploide) que contienen esencialmente dos genomas diploides (el genoma A y el genoma C) debido a su origen de ancestros diploides, comprende dos genes FAD3 en su genoma localizados en los genomas A y C, en adelante denominados FAD3-A1 y FAD3-C1, respectivamente. Se encontró por los autores de la invención que el genoma de Brassica napus contiene tres genes FAD3 adicionales, que fueron designados FAD3-A2, FAD3-A3 y FAD3-C2. Se encontró en cruces con una línea de cultivo masculina de élite y una línea de cultivo femenina de élite de Brassica que plantas de Brassica napus, que son homocigóticas para un alelo FAD3-A1 o FAD3-C1 mutante, muestran una disminución significativa en el contenido de C18:3 de aceite de semillas cuando se compara con plantas de Brassica napus que no comprenden alelos FAD3 mutantes, mientras que las plantas homocigóticas para una mutación en cualquiera de los genes FAD3 recientemente identificados no exhibían una reducción en C18:3. Se encontró además que, además de una homocigosidad para los alelos FAD3-A1 o FAD3-C1 mutantes, la presencia de un segundo gen FAD3 mutante en estado homocigótico, sorprendentemente también de la de los nuevos genes FAD3, en Brassica napus podría reducir adicionalmente el contenido de C18:3 de aceite de semillas. Además de ello, además de tanto la mutación FAD3-A1 y FAD3-C1 en estado homocigótico, la homocigosidad para un tercer alelo FAD3 mutante podría reducir el contenido de C18:3 en aceite de las semillas de plantas cultivadas en el invernadero incluso por debajo del 3% del contenido total del aceite de las semillas. Se observó, además, que cuantos más alelos FAD3 mutantes adicionales se apilen en la parte superior de los alelos mutantes de los genes FAD3A1 y FAD3C1, menor será contenido de C18:3 de aceite, tanto en plantas de Brassica cultivadas en invernadero como en plantas cultivadas en el campo. It is described that Brassica napus (AACC genome, 2n = 4x = 38), which is an allotetraploid species (amphiploid) that essentially contain two diploid genomes (genome A and genome C) due to their origin of diploid ancestors, comprises two FAD3 genes in its genome located in genomes A and C, hereinafter referred to as FAD3-A1 and FAD3-C1, respectively. It was found by the authors of the invention that the Brassica napus genome contains three additional FAD3 genes, which were designated FAD3-A2, FAD3-A3 and FAD3-C2. It was found in crosses with an elite male culture line and an elite Brassica female culture line that Brassica napus plants, which are homozygous for a mutant FAD3-A1 or FAD3-C1 allele, show a significant decrease in content of C18: 3 seed oil when compared to Brassica napus plants that do not comprise mutant FAD3 alleles, while homozygous plants for a mutation in any of the newly identified FAD3 genes did not exhibit a reduction in C18: 3. It was also found that, in addition to a homozygosity for the mutant FAD3-A1 or FAD3-C1 alleles, the presence of a second mutant FAD3 gene in homozygous state, surprisingly also that of the new FAD3 genes, in Brassica napus could further reduce the C18: 3 content of seed oil. In addition, in addition to both the FAD3-A1 and FAD3-C1 mutation in the homozygous state, homozygosity for a third mutant FAD3 allele could reduce the C18: 3 oil content of the seeds of plants grown in the greenhouse even below 3% of the total oil content of the seeds. It was also observed that the more additional mutant FAD3 alleles are stacked on top of the mutant alleles of the FAD3A1 and FAD3C1 genes, the lower will be C18: 3 oil content, both in greenhouse grown Brassica plants and in plants cultivated in the field.

Por lo tanto, en una primera realización, la invención proporciona una planta de Brassica que comprende al menos dos alelos FAD3 mutantes totalmente inactivados de dos genes FAD3 diferentes, en donde Therefore, in a first embodiment, the invention provides a Brassica plant comprising at least two fully inactivated mutant FAD3 alleles of two different FAD3 genes, wherein

i. el primer alelo FAD3 mutante se selecciona del grupo que consiste en FAD3-A1 o FAD3-C1;y i. the first mutant FAD3 allele is selected from the group consisting of FAD3-A1 or FAD3-C1; and

ii. el segundo alelo FAD3 mutante se selecciona del grupo que consiste en FAD3-A2, FAD3-A3 o FAD3-C2. ii. The second mutant FAD3 allele is selected from the group consisting of FAD3-A2, FAD3-A3 or FAD3-C2.

En una realización, se proporcionan en esta memoria plantas dobles mutantes que son heterocigóticas u homocigóticas para el primer alelo FAD3 mutante y heterocigóticas u homocigóticas para el segundo alelo FAD3 mutante, en donde el genotipo de la planta se puede describir como (el alelo FAD3 mutante se abrevia como fad3, mientras que el alelo de tipo salvaje se representa como FAD3): In one embodiment, double mutant plants are provided herein that are heterozygous or homozygous for the first mutant FAD3 allele and heterozygous or homozygous for the second mutant FAD3 allele, where the plant genotype can be described as (the mutant FAD3 allele It is abbreviated as fad3, while the wild type allele is represented as FAD3):

--: FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-A2 / fad3-a2 -FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-A3 / fad3-a3 -FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-A2 / fad3-a2 -fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-A3 / fad3-a2 -fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-a2 / fad3-a2 -FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-a3 / fad3-a3 -FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c1 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-c2 / fad3-c2 -fad3-c1 / fad3-c1, fad3-a2 / fad3-a2 -fad3-c1 / fad3-c1, fad3-a3 / fad3-a2 -fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c1 / fad3-c2 en donde la planta es homocigótica para los alelos de tipo salvaje de los genes FAD3 restantes (p. ej., FAD3A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2 corresponde al genotipo FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/FAD3-A3, FAD3-C1/FAD3-C1, FAD3-C2/FAD3-C2) FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3- C1 / fad3-c1, FAD3-A2 / fad3-a2 -FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-A3 / fad3-a3 -FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-c1 / fad3- c1, FAD3-A2 / fad3-a2 -fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-A3 / fad3-a2 -fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-C1 / fad3-c1, fad3- a2 / fad3-a2 -FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-a3 / fad3-a3 -FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c1 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-c2 / fad3-c2 -fad3-c1 / fad3-c1, fad3-a2 / fad3- a2 -fad3-c1 / fad3-c1, fad3-a3 / fad3-a2 -fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c1 / fad3-c2 where the plant is homozygous for wild-type alleles of FAD3 res genes tantes (p. e.g., FAD3A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2 corresponds to the genotype FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-A3 / FAD3-A3, FAD3-C1 / FAD3-C1 , FAD3-C2 / FAD3-C2)

La invención también proporciona una planta que comprende, además, un tercer alelo FAD3 mutante totalmente inactivado, en donde dicho tercer alelo FAD3 mutante totalmente inactivado se selecciona del grupo que consiste en FAD3-A1 o FAD3-C1, con lo que los alelos FAD3 mutantes son alelos mutantes de por lo menos tres genes FAD3 diferentes. The invention also provides a plant comprising, in addition, a third totally inactivated mutant FAD3 allele, wherein said third totally inactivated mutant FAD3 allele is selected from the group consisting of FAD3-A1 or FAD3-C1, whereby mutant FAD3 alleles they are mutant alleles of at least three different FAD3 genes.

Resultará claro para la persona experta que cuando FAD3-A1 se elige como el primer alelo FAD3 mutante totalmente inactivado, el tercer alelo FAD3 mutante totalmente inactivado será FAD3-C1, y viceversa. It will be clear to the skilled person that when FAD3-A1 is chosen as the first fully inactivated mutant FAD3 allele, the third fully inactivated mutant FAD3 allele will be FAD3-C1, and vice versa.

Por lo tanto, en otra realización, se proporcionan en esta memoria plantas triple mutantes que son heterocigóticas u homocigóticas para el primer alelo FAD3 mutante, heterocigóticas u homocigóticas para el segundo alelo FAD3 mutante y heterocigóticas u homocigóticas para el tercer alelo FAD3 mutante, en donde el genotipo de la planta se puede describir como (el alelo FAD3 mutante se abrevia como fad3, mientras que el alelo de tipo salvaje se representa como FAD3): -.FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-C2 / fad3-c2, FAD3-C1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-C2 / fad3-c2, FAD3-C1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-c2 / fad3-c2, FAD3-C1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1 Therefore, in another embodiment, triple mutant plants are provided herein that are heterozygous or homozygous for the first mutant FAD3 allele, heterozygous or homozygous for the second mutant FAD3 allele and heterozygous or homozygous for the third mutant FAD3 allele, wherein The plant genotype can be described as (the mutant FAD3 allele is abbreviated as fad3, while the wild type allele is represented as FAD3): -.FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-C2 / fad3-c2, FAD3- C1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-C2 / fad3-c2, FAD3-C1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3- c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-c2 / fad3-c2, FAD3-C1 / fad3-c1 - FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1

--: FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-C2 / fad3-c2, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-C2 / fad3-c2, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-c2 / fad3-c2, FAD3-c1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-c2 / fad3-c2, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-c2 / fad3-c2, fad3-c1 / fad3-c1 en donde la planta es homocigótica para los alelos de tipo salvaje de los genes FAD3 restantes (p. ej., FAD3A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1 corresponde al genotipo FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-A3/FAD3-A3, FAD3C2/FAD3-C2). FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-C2 / fad3-c2, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3- a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-C2 / fad3-c2, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3- a1, fad3-a3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-c2 / fad3-c2, FAD3-c1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3- c2 / fad3-c2, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-c2 / fad3-c2, fad3-c1 / fad3-c1 where the plant is homozygous for wild-type gene alleles FAD3 remaining (e.g., FAD3A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1 corresponds to genotype FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-A3 / FAD3-A3, FAD3C2 / FAD3-C2).

Se cree que cuantos más alelos FAD3 mutantes se combinen en una planta, mayor será la reducción en el contenido de C18:3 del aceite de semillas. Por lo tanto, la invención también proporciona una planta que comprende, además, un cuarto alelo FAD3 mutante totalmente inactivado, en donde dicho cuarto alelo FAD3 mutante totalmente inactivado se selecciona del grupo que consiste en FAD3-A2, FAD3-A3 o FAD3-C2, en donde los alelos FAD3 mutantes son alelos mutantes de al menos cuatro genes FAD3 diferentes. It is believed that the more mutant FAD3 alleles are combined in a plant, the greater the reduction in the C18: 3 content of the seed oil. Therefore, the invention also provides a plant comprising, in addition, a fourth totally inactivated mutant FAD3 allele, wherein said fourth totally inactivated mutant FAD3 allele is selected from the group consisting of FAD3-A2, FAD3-A3 or FAD3-C2 , wherein the mutant FAD3 alleles are mutant alleles of at least four different FAD3 genes.

Resultará claro para la persona experta que cuando FAD3-A2 se elige como el segundo alelo FAD3 mutante totalmente inactivado, el cuarto alelo FAD3 mutante totalmente inactivado será FAD3-A3 o FAD3-C2. De manera similar, cuando FAD3-A3 se elige como el segundo alelo FAD3 mutante totalmente inactivado, el cuarto alelo FAD3 mutante totalmente inactivado será FAD3-A3 o FAD3-C2 y cuando FAD3-C2 se elige como el segundo alelo FAD3 mutante totalmente inactivado, el cuarto alelo FAD3 mutante totalmente inactivado será FAD3-A2 o FAD3-A3. It will be clear to the skilled person that when FAD3-A2 is chosen as the second fully inactivated mutant FAD3 allele, the fourth fully inactivated mutant FAD3 allele will be FAD3-A3 or FAD3-C2. Similarly, when FAD3-A3 is chosen as the second fully inactivated mutant FAD3 allele, the fourth totally inactivated mutant FAD3 allele will be FAD3-A3 or FAD3-C2 and when FAD3-C2 is chosen as the second fully inactivated mutant FAD3 allele, the fourth fully inactivated mutant FAD3 allele will be FAD3-A2 or FAD3-A3.

Por lo tanto, en otra realización, se proporcionan en esta memoria plantas cuádruple mutantes que son heterocigóticas u homocigóticas para el primer alelo FAD3 mutante, heterocigóticas u homocigóticas para el segundo alelo FAD3 mutante, heterocigóticas u homocigóticas para el tercer alelo FAD3 mutante, y heterocigóticas u homocigóticas para el cuarto alelo FAD3 mutante, en donde el genotipo de la planta se puede describir como (el alelo FAD3 mutante se abrevia como fad3, mientras que el alelo de tipo salvaje se representa como FAD3): Thus, in another embodiment, quadruple mutant plants are provided herein that are heterozygous or homozygous for the first mutant FAD3 allele, heterozygous or homozygous for the second mutant FAD3 allele, heterozygous or homozygous for the third mutant FAD3 allele, and heterozygous. or homozygous for the fourth mutant FAD3 allele, where the plant genotype can be described as (the mutant FAD3 allele is abbreviated as fad3, while the wild type allele is represented as FAD3):

--: FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-A3/fad3-a3 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-a3/fad3-a3 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-A3/fad3-a3 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-A3/fad3-a3 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-A3/fad3-a3 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-A3/fad3-a3 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-A3/fad3-a3 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-a3/fad3-a3 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, fad3-a3/fad3-a3 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-a3/fad3-a3 FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-A3 / fad3-a3 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3- C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-a3 / fad3-a3 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3- c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-A3 / fad3-a3 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3- C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-A3 / fad3-a3 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3- c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-A3 / fad3-a3 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3- a1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c 1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-A3 / fad3-a3 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3- C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-A3 / fad3-a3 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3- c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-a3 / fad3-a3 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3- A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-a3 / fad3-a3 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3- a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-a3 / fad3-a3

--: FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-A3/fad3-a3 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, fad3-a3/fad3-a3 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, fad3-a3/fad3-a3 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-a3/fad3-a3 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-A3/fad3-a3 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, fad3-a3/fad3-a3 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -.fad3-a1/fad3-a1, fad3-a3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, FAD3- C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-A3 / fad3-a3 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3- c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-a3 / fad3-a3 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, fad3- c2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-a3 / fad3-a3 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3- c2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-a3 / fad3-a3 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -fad3- a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c 1, FAD3-A3 / fad3-a3 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, fad3- a3 / fad3-a3 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -.fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2

en donde la planta es homocigótica para los alelos de tipo salvaje de los genes FAD3 restantes (p. ej., FAD3A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-A3/fad3-a3 corresponde al genotipo FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-A3/FAD3-A3, FAD3 C2 / FAD3-C2). where the plant is homozygous for wild-type alleles of the remaining FAD3 genes (e.g., FAD3A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-A3 / fad3 -a3 corresponds to the genotype FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-A3 / FAD3-A3, FAD3 C2 / FAD3-C2).

La invención proporciona, además, una planta que comprende, además, un quinto alelo FAD3 mutante totalmente inactivado, en donde dicho quinto alelo FAD3 mutante totalmente inactivado se selecciona del grupo que consiste en FAD3-A2, FAD3-A3 o FAD3-C2, con lo que los alelos FAD3 mutantes son alelos mutantes de por lo menos cinco genes FAD3 diferentes. The invention further provides a plant comprising, in addition, a fifth fully inactivated mutant FAD3 allele, wherein said fifth totally inactivated mutant FAD3 allele is selected from the group consisting of FAD3-A2, FAD3-A3 or FAD3-C2, with What mutant FAD3 alleles are mutant alleles of at least five different FAD3 genes.

Por lo tanto, en otra realización, se proporcionan en esta memoria plantas quíntuple mutantes que son heterocigóticas u homocigóticas para el primer alelo FAD3 mutante, heterocigóticas u homocigóticas para el segundo alelo FAD3 mutante, heterocigóticas u homocigóticas para el tercer alelo FAD3 mutante, heterocigóticas u homocigóticas para el cuarto alelo FAD3 mutante y heterocigóticas u homocigóticas para el quinto alelo FAD3 mutante, en donde el genotipo de la planta se puede describir como (el alelo FAD3 mutante se abrevia como fad3, mientras que el alelo de tipo salvaje se representa como FAD3): Therefore, in another embodiment, quintuple mutant plants are provided herein which are heterozygous or homozygous for the first mutant FAD3 allele, heterozygous or homozygous for the second mutant FAD3 allele, heterozygous or homozygous for the third mutant FAD3 allele, heterozygous or homozygous for the fourth mutant FAD3 allele and heterozygous or homozygous for the fifth mutant FAD3 allele, where the plant genotype can be described as (the mutant FAD3 allele is abbreviated as fad3, while the wild type allele is represented as FAD3 ):

--: FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -fad3a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, FAD3-C2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, daf3-a3/fad3-a3, FAD3-C1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3- A2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3- c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 - FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -fad3a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3- A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, F AD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3- A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3- a3, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -fad3- a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3- a3, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -FAD3- A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3 , FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, fad3 -c2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, FAD3-A2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, FAD3-C2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3 -a2, daf3-a3 / fad3-a3, FAD3-C1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2

--: fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -FAD3-A1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 -fad3-a1/fad3-a1, fad3-a2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, fad3-c1/fad3-c1, fad3-c2/fad3-c2 fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, FAD3-A3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, FAD3- A2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -FAD3-A1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3-c1, fad3-c2 / fad3-c2 -fad3-a1 / fad3-a1, fad3-a2 / fad3-a2, fad3-a3 / fad3-a3, fad3-c1 / fad3- c1, fad3-c2 / fad3-c2

En otra realización, las plantas de la invención comprenden alelos FAD3 mutantes que comprenden una mutación sin sentido (codón de parada). In another embodiment, the plants of the invention comprise mutant FAD3 alleles comprising a nonsense mutation (stop codon).

En aún otra realización, las plantas de la invención comprenden alelos FAD3 mutantes que se seleccionan del grupo que consiste en LOLI105, LOLI103, LOLI108, LOLI111 o LOLI115. In yet another embodiment, the plants of the invention comprise mutant FAD3 alleles that are selected from the group consisting of LOLI105, LOLI103, LOLI108, LOLI111 or LOLI115.

Tal como se utiliza en esta memoria, LOLI105 o LOLI105 es un alelo mutante de una secuencia genómica FAD3-A1, secuencia codificante o secuencia de aminoácidos de, respectivamente, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 2, que comprende una mutación en SEQ ID NO: 1 en la posición de nucleótido 2405, en SEQ ID NO: 11 en la posición de nucleótido 732 o en la SEQ ID NO: 2 en la posición de aminoácido 244, dando como resultado un cambio de codón en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 11 de TGG a TGA o un cambio de aminoácido en SEQ ID NO: 2 de Trp a parada. As used herein, LOLI105 or LOLI105 is a mutant allele of a FAD3-A1 genomic sequence, coding sequence or amino acid sequence of, respectively, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 2, which comprises a mutation in SEQ ID NO: 1 at nucleotide position 2405, in SEQ ID NO: 11 at nucleotide position 732 or in SEQ ID NO: 2 at amino acid position 244, resulting in a codon change in SEQ ID NO : 1 or SEQ ID NO: 11 from TGG to TGA or an amino acid change in SEQ ID NO: 2 from Trp to stop.

Tal como se utiliza en esta memoria, LOLI103 o LOLI103 es un alelo mutante de una secuencia genómica FAD3-C1, secuencia codificante o secuencia de aminoácidos de, respectivamente, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 4, que comprende una mutación en SEQ ID NO: 3 en la posición de nucleótido 2702, en SEQ ID NO: 12 en la posición de nucleótido 543 o en la SEQ ID NO: 4 en la posición de aminoácido 181, dando como resultado un cambio de codón en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 12 de TGG a TGA o un cambio de aminoácido en SEQ ID NO: 4 de Trp a parada. As used herein, LOLI103 or LOLI103 is a mutant allele of a FAD3-C1 genomic sequence, coding sequence or amino acid sequence of, respectively, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 4, which comprises a mutation in SEQ ID NO: 3 at nucleotide position 2702, in SEQ ID NO: 12 at nucleotide position 543 or in SEQ ID NO: 4 at amino acid position 181, resulting in a codon change in SEQ ID NO : 3 or SEQ ID NO: 12 from TGG to TGA or an amino acid change in SEQ ID NO: 4 from Trp to stop.

Tal como se utiliza en esta memoria, LOLI108 o LOLI108 es un alelo mutante de una secuencia genómica FAD3-A2, secuencia codificante o secuencia de aminoácidos de, respectivamente, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 6, que comprende una mutación en SEQ ID NO: 5 en la posición de nucleótido 3934, en SEQ ID NO: 13 en la posición de nucleótido 749 o en la SEQ ID NO: 6 en la posición de aminoácido 250, dando como resultado un cambio de codón en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 13 de TGG a TAG o un cambio de aminoácido en SEQ ID NO: 6 de Trp a parada. As used herein, LOLI108 or LOLI108 is a mutant allele of a FAD3-A2 genomic sequence, coding sequence or amino acid sequence of, respectively, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 6 , which comprises a mutation in SEQ ID NO: 5 in nucleotide position 3934, in SEQ ID NO: 13 in nucleotide position 749 or in SEQ ID NO: 6 in amino acid position 250, resulting in a change codon in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 13 from TGG to TAG or an amino acid change in SEQ ID NO: 6 from Trp to stop.

Tal como se utiliza en esta memoria, LOLI111 o LOLI111 es un alelo mutante de una secuencia genómica FAD3-A3, secuencia codificante o secuencia de aminoácidos de, respectivamente, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 8, que comprende una mutación en SEQ ID NO: 7 en la posición de nucleótido 2847, en SEQ ID NO: 14 en la posición de nucleótido 552 o en la SEQ ID NO: 8 en la posición de aminoácido 184, dando como resultado un cambio de codón en SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 14 de TGG a TGA o un cambio de aminoácido en SEQ ID NO: 8 de Trp a parada. As used herein, LOLI111 or LOLI111 is a mutant allele of a FAD3-A3 genomic sequence, coding sequence or amino acid sequence of, respectively, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 8 , which comprises a mutation in SEQ ID NO: 7 in nucleotide position 2847, in SEQ ID NO: 14 in nucleotide position 552 or in SEQ ID NO: 8 in amino acid position 184, resulting in a change codon in SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 14 from TGG to TGA or an amino acid change in SEQ ID NO: 8 from Trp to stop.

Tal como se utiliza en esta memoria, LOLI115 o LOLI115 es un alelo mutante de una secuencia genómica FAD3-C2, secuencia codificante o secuencia de aminoácidos de, respectivamente, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 10, que comprende una mutación en SEQ ID NO: 9 en la posición de nucleótido 3909, en SEQ ID NO: 15 en la posición de nucleótido 551 o en la SEQ ID NO: 10 en la posición de aminoácido 184, dando como resultado un cambio de codón en SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 15 de TGG a TAG o un cambio de aminoácido en SEQ ID NO: 10 de Trp a parada. As used herein, LOLI115 or LOLI115 is a mutant allele of a FAD3-C2 genomic sequence, coding sequence or amino acid sequence of, respectively, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 10 , which comprises a mutation in SEQ ID NO: 9 at nucleotide position 3909, in SEQ ID NO: 15 at nucleotide position 551 or in SEQ ID NO: 10 at amino acid position 184, resulting in a change codon in SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 15 from TGG to TAG or an amino acid change in SEQ ID NO: 10 from Trp to stop.

La planta de la invención puede producir una cantidad significativamente reducida de proteína FAD3 funcional en comparación con la cantidad de proteína FAD3 funcional producida por una planta correspondiente que no comprende los alelos FAD3 mutantes de la invención. La semilla de la planta puede tener un contenido de C18:3 significativamente reducido de aceite de semillas en comparación con plantas que no comprenden los alelos mutantes FAD3. The plant of the invention can produce a significantly reduced amount of functional FAD3 protein compared to the amount of functional FAD3 protein produced by a corresponding plant that does not comprise the mutant FAD3 alleles of the invention. The plant seed may have a significantly reduced C18: 3 content of seed oil compared to plants that do not comprise the FAD3 mutant alleles.

Además se describen en esta memoria secuencias de ácido nucleico genes/alelos FAD3 de tipo salvaje y mutantes de especies de Brassica, así como proteínas de tipo salvaje y FAD3 mutantes. También se describen métodos de generar y combinar alelos FAD3 mutantes y de tipo salvaje en las plantas de Brassica, así como plantas de Brassica y partes de plantas que comprenden combinaciones específicas de alelos FAD3 de tipo salvaje y mutantes en su genoma, por lo que disminuye el contenido C18:3 del aceite de semillas. El uso de estas plantas para la transferencia de alelos FAD3 mutantes a otras plantas es también adecuado para la invención, como lo son los productos vegetales de cualquiera de las plantas descritas. Además, se describen kits y métodos para la selección asistida por marcadores (MAS) para combinar o detectar genes y/o alelos FAD3. In addition, nucleic acid sequences of wild-type FAD3 genes / alleles and mutants of Brassica species are described herein, as well as wild-type and FAD3 mutant proteins. Methods of generating and combining mutant and wild-type FAD3 alleles in Brassica plants, as well as Brassica plants and parts of plants comprising specific combinations of wild-type FAD3 alleles and mutants in their genome, are also described. C18: 3 content of seed oil. The use of these plants for the transfer of mutant FAD3 alleles to other plants is also suitable for the invention, as are the plant products of any of the plants described. In addition, kits and methods for marker assisted selection (MAS) for combining or detecting FAD3 genes and / or alleles are described.

Secuencias de ácidos nucleicos Nucleic acid sequences

Se describen tanto secuencias de ácidos nucleicos FAD3 de tipo salvaje que codifican proteínas FAD3 funcionales como secuencias de ácidos nucleicos FAD3 mutantes (que comprenden una o más mutaciones, preferiblemente mutaciones que resultan en ninguna o en una actividad biológica significativamente reducida de la proteína FAD3 codificada o en ninguna proteína FAD3 que está siendo producida) de genes FAD3 de Brassicaceae, en particular de especies de Brassica, especialmente de Brassica napus, pero también de otras especies de cultivo de Brassica. Por ejemplo, especies de Brassica que comprenden un genoma A y/o C pueden comprender diferentes alelos de genes FAD3, que pueden ser identificados y combinados en una sola planta de acuerdo con la invención. Además, se pueden utilizar métodos de mutagénesis para generar mutaciones en los alelos FAD3 de tipo salvaje, generando con ello alelos FAD3 mutantes para uso de acuerdo con la invención. Debido a que alelos FAD3 específicos se combinan preferiblemente en una planta por cruce y selección, las secuencias de ácidos nucleicos FAD3 pueden estar presentes dentro de una planta (es decir, de forma endógena), p. ej., una planta de Brassica, preferiblemente una planta de Brassica que puede ser cruzada con Brassica napus o que puede ser utilizada para hacer "sintética" a una planta de Brassica napus. La hibridación entre diferentes especies de Brassica se describe en la técnica, p. ej., como se indica en Snowdon (2007, Chromosome research 15: 85-95). La hibridación interespecífica puede utilizarse, por ejemplo, para transferir genes, p. ej., del genoma C en B. napus (AACC) al genoma C en B. carinata (BBCC), o incluso de, p. ej., el genoma C en B. napus (AACC) al genoma B en B. juncea (AABB) (por el evento esporádico de una recombinación ilegítima entre sus genomas C y B). Líneas de Brassica napus “resintetizadas" o "sintéticas" se pueden producir cruzando los ancestros originales, B. oleracea (CC) y B. rapa (AA). Barreras de incompatibilidad interespecíficas, y también intergenéricas, pueden ser superadas con éxito en los cruces entre especies de cultivo de Brassica y sus parientes, p. ej., mediante técnicas de rescate de embriones o de fusión de protoplastos (véase, p. ej., Snowdon, arriba). Both wild-type FAD3 nucleic acid sequences encoding functional FAD3 proteins and mutant FAD3 nucleic acid sequences (comprising one or more mutations, preferably mutations resulting in none or a significantly reduced biological activity of the encoded FAD3 protein or described) are described. in any FAD3 protein that is being produced) from FAD3 genes from Brassicaceae, in particular from Brassica species, especially from Brassica napus, but also from other Brassica crop species. For example, Brassica species comprising a genome A and / or C may comprise different alleles of FAD3 genes, which can be identified and combined in a single plant according to the invention. In addition, mutagenesis methods can be used to generate mutations in wild-type FAD3 alleles, thereby generating mutant FAD3 alleles for use according to the invention. Because specific FAD3 alleles are preferably combined in a plant by crossing and selection, FAD3 nucleic acid sequences may be present within a plant (i.e. endogenously), e.g. eg, a Brassica plant, preferably a Brassica plant that can be crossed with Brassica napus or that can be used to make a Brassica napus plant "synthetic". Hybridization between different species of Brassica is described in the art, e.g. eg, as indicated in Snowdon (2007, Chromosome research 15: 85-95). Interspecific hybridization can be used, for example, to transfer genes, e.g. eg, from genome C in B. napus (AACC) to genome C in B. carinata (BBCC), or even from, p. eg, genome C in B. napus (AACC) to genome B in B. juncea (AABB) (due to the sporadic event of illegitimate recombination between its genomes C and B). Brassica napus "resynthesized" or "synthetic" lines can be produced by crossing the original ancestors, B. oleracea (CC) and B. rapa (AA). Interspecific, and also intergeneric, incompatibility barriers can be successfully overcome at crossings between Brassica crop species and their relatives, e.g., by embryo rescue techniques or protoplast fusion (see, e.g., Snowdon, above).

Sin embargo, secuencias FAD3 aisladas y secuencias de ácidos nucleicos FAD3 (p. ej., aisladas de la planta por clonación o hechas sintéticamente mediante síntesis de ADN), así como variantes de las mismas y fragmentos de cualquiera de éstas también se describen en esta memoria, ya que éstas se pueden utilizar para determinar qué secuencia está presente de forma endógena en una planta o parte de planta, si la secuencia codifica una proteína funcional, una no funcional o ninguna proteína (p. ej., por expresión en una célula huésped recombinante tal como se describe en esta memoria) y para la selección y transferencia de alelos específicos de una planta a otra, con el fin de generar una planta que tenga la combinación deseada de alelos funcionales y mutantes. However, isolated FAD3 sequences and FAD3 nucleic acid sequences (e.g., isolated from the plant by cloning or synthetically made by DNA synthesis), as well as variants thereof and fragments of any of these are also described herein. memory, since these can be used to determine which sequence is endogenously present in a plant or part of the plant, if the sequence encodes a functional protein, a non-functional protein or no protein (e.g., by expression in a cell recombinant host as described herein) and for the selection and transfer of specific alleles from one plant to another, in order to generate a plant having the desired combination of functional and mutant alleles.

Secuencias de ácidos nucleicos de alelos FAD3 han sido aisladas de Brassica napus tal como se representa en el Listado de secuencias. Se representan secuencias FAD3 de tipo salvaje, mientras que las secuencias FAD3 mutantes de estas secuencias y de secuencias esencialmente similares a éstas, se describen en esta memoria más adelante y en los Ejemplos, con referencia a secuencias FAD3 de tipo salvaje. El ADN que codifica proteína FAD3 genómica y el correspondiente pre-ARNm, comprende 8 exones (exones numerados 1-8 a partir del extremo 5') interrumpidos por 7 intrones (intrones numerados 1-7 a partir del extremo 5'). En el ADNc y el correspondiente ARNm procesado (es decir, el ARN cortado y empalmado), los intrones se separan y se unen los exones tal como se representa en el Listado de secuencias. Secuencias de exones están más conservadas evolutivamente y, por lo tanto, son menos variables que las secuencias de intrones. Nucleic acid sequences of FAD3 alleles have been isolated from Brassica napus as depicted in the Sequence Listing. Wild-type FAD3 sequences are depicted, while mutant FAD3 sequences of these sequences and of sequences essentially similar to these, are described herein below and in the Examples, with reference to wild-type FAD3 sequences. The DNA encoding genomic FAD3 protein and the corresponding pre-mRNA, comprises 8 exons (exons numbered 1-8 from the 5 'end) interrupted by 7 introns (introns numbered 1-7 from the 5' end). In the cDNA and the corresponding processed mRNA (i.e., the cut and spliced RNA), the introns are separated and exons are joined as depicted in the Sequence Listing. Exon sequences are more evolutionarily conserved and, therefore, are less variable than intron sequences.

"Secuencias de ácido nucleico FAD3-A1" o "secuencias de ácidos nucleicos FAD3-A1 variantes" de acuerdo con la invención son secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 o secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 11. A estas secuencias de ácidos nucleicos también se las puede aludir como siendo "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias FAD3 proporcionadas en el Listado de secuencias. "FAD3-A1 nucleic acid sequences" or "variant FAD3-A1 nucleic acid sequences" according to the invention are nucleic acid sequences encoding an amino acid sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 2 or nucleic acid sequences having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 11. These nucleic acid sequences can also be referred to as being "essentially similar" or "essentially identical" to the FAD3 sequences provided in the Sequence Listing.

"Secuencias de ácido nucleico FAD3-C1" o "secuencias de ácidos nucleicos FAD3-C1 variantes" de acuerdo con la invención son secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4 o secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 12. A estas secuencias de ácidos nucleicos también se las puede aludir como siendo "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias FAD3 proporcionadas en el Listado de secuencias. "FAD3-C1 nucleic acid sequences" or "variant FAD3-C1 nucleic acid sequences" according to the invention are nucleic acid sequences encoding an amino acid sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 4 or nucleic acid sequences having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 12. These nucleic acid sequences can also be referred to as being "essentially similar" or "essentially identical" to the FAD3 sequences provided in the Sequence Listing.

"Secuencias de ácido nucleico FAD3-A2" o "secuencias de ácidos nucleicos FAD3-A2 variantes" de acuerdo con la invención son secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 6 o secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 13. A estas "FAD3-A2 nucleic acid sequences" or "variant FAD3-A2 nucleic acid sequences" according to the invention are nucleic acid sequences encoding an amino acid sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 6 or nucleic acid sequences having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 13. To these

secuencias de ácidos nucleicos también se las puede aludir como siendo "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias FAD3 proporcionadas en el Listado de secuencias. Nucleic acid sequences can also be referred to as being "essentially similar" or "essentially identical" to the FAD3 sequences provided in the Sequence Listing.

"Secuencias de ácido nucleico FAD3-A3" o "secuencias de ácidos nucleicos FAD3-A3 variantes" de acuerdo con la invención son secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 8 o secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 14. A estas secuencias de ácidos nucleicos también se las puede aludir como siendo "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias FAD3 proporcionadas en el Listado de secuencias. "FAD3-A3 nucleic acid sequences" or "variant FAD3-A3 nucleic acid sequences" according to the invention are nucleic acid sequences encoding an amino acid sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 8 or nucleic acid sequences having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 14. These nucleic acid sequences can also be referred to as being "essentially similar" or "essentially identical" to the FAD3 sequences provided in the Sequence Listing.

"Secuencias de ácido nucleico FAD3-C2" o "secuencias de ácidos nucleicos FAD3-C2 variantes" de acuerdo con la invención son secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 10 o secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 15. A estas secuencias de ácidos nucleicos también se las puede aludir como siendo "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias FAD3 proporcionadas en el Listado de secuencias. "FAD3-C2 nucleic acid sequences" or "variant FAD3-C2 nucleic acid sequences" according to the invention are nucleic acid sequences encoding an amino acid sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 10 or nucleic acid sequences having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 15. These nucleic acid sequences can also be referred to as being "essentially similar" or "essentially identical" to the FAD3 sequences provided in the Sequence Listing.

Por lo tanto, se describen secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas FAD3 funcionales de tipo salvaje, incluyendo variantes y fragmentos de las mismas (como se define más adelante), así como secuencias de ácidos nucleicos mutantes de cualquiera de éstas, con lo que la mutación en la secuencia de ácido nucleico preferiblemente resulta en uno o más aminoácidos que se insertan, suprimen o sustituyen en comparación con la proteína FAD3 de tipo salvaje. Como ya se ha mencionado, preferiblemente la o las mutaciones en la secuencia de ácido nucleico resulta en uno o más cambios de aminoácidos (es decir, en relación con la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje se insertan, suprimen y/o sustituyen uno o más aminoácidos), con lo cual la actividad biológica de la proteína FAD3 se reduce significativamente o se suprime por completo o con lo que se expresa una cantidad significativamente reducida de proteína FAD3 funcional o ninguna proteína FAD3 funcional. A una reducción significativa en o una supresión completa de la actividad biológica de la proteína FAD3 se la alude en esta memoria a una deleción o interrupción de residuos o dominios de aminoácidos estructural y/o funcionalmente relevantes, tales como el motivo de retención de ER C-terminal, una deleción, sustitución o reposicionamiento de cualquiera de las ocho histidinas conservadas, y/o una deleción o interrupción de la secuencia señal, de modo que el contenido de C18:3 del aceite de semillas de una planta que expresa el alelo FAD3 mutante disminuye en comparación con una planta que expresa el correspondiente alelo FAD3 de tipo salvaje. Therefore, nucleic acid sequences encoding wild-type functional FAD3 proteins are described, including variants and fragments thereof (as defined below), as well as mutant nucleic acid sequences of any of these, whereby the Mutation in the nucleic acid sequence preferably results in one or more amino acids that are inserted, deleted or substituted compared to the wild-type FAD3 protein. As already mentioned, preferably the one or more mutations in the nucleic acid sequence results in one or more amino acid changes (i.e., in relation to the wild-type amino acid sequence, one or more are inserted, deleted and / or substituted). amino acids), whereby the biological activity of the FAD3 protein is significantly reduced or completely suppressed or with which a significantly reduced amount of functional FAD3 protein or no functional FAD3 protein is expressed. A significant reduction in or a complete suppression of the biological activity of the FAD3 protein is referred to herein as a deletion or interruption of structurally and / or functionally relevant amino acid residues or domains, such as the reason for retention of ER C -terminal, a deletion, replacement or repositioning of any of the eight conserved histidines, and / or a deletion or interruption of the signal sequence, so that the C18: 3 content of the seed oil of a plant expressing the FAD3 allele mutant decreases compared to a plant that expresses the corresponding wild-type FAD3 allele.

Se describen en esta memoria secuencias de ácidos nucleicos tanto endógenas como aisladas. También se describen fragmentos de las secuencias FAD3 y secuencias de ácidos nucleicos FAD3 variantes arriba definidas, para uso como cebadores o sondas y como componentes de kits (véase más adelante). Un "fragmento" de FAD3 o una secuencia de ácido nucleico FAD3 o variante de la misma (tal como se define) puede ser de diversas longitudes, tales como al menos 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 1100 nucleótidos contiguos de la secuencia codificante de FAD3 (o de la secuencia variante) o tal como al menos 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 2900 nucleótidos contiguos de la secuencia del genoma FAD3 (o de la secuencia variante). Sequences of both endogenous and isolated nucleic acids are described herein. Also described are fragments of the FAD3 sequences and FAD3 nucleic acid sequences defined above, for use as primers or probes and as kit components (see below). A "fragment" of FAD3 or an FAD3 nucleic acid sequence or variant thereof (as defined) can be of various lengths, such as at least 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 1100 nucleotides contiguous of the FAD3 coding sequence (or of the variant sequence) or such as at least 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 2900 contiguous nucleotides of the FAD3 genome sequence (or of the variant sequence ).

Secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas FAD3 funcionales Nucleic acid sequences encoding functional FAD3 proteins

Las secuencias de ácidos nucleicos representadas en el Listado de secuencias codifican proteínas FAD3 funcionales, de tipo salvaje, de Brassica napus. Por lo tanto, estas secuencias son endógenas a las plantas de Brassica napus de las que se aislaron. Otras especies de cultivo, variedades, líneas de fecundación o accesos salvajes de Brassica, se pueden rastrear en cuanto a otros alelos FAD3, que codifican las mismas proteínas FAD3 o variantes de las mismas. Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas de hibridación de ácidos nucleicos (p. ej., análisis de transferencia Southern, utilizando, por ejemplo, condiciones de hibridación rigurosas) o técnicas basadas en la PCR para identificar alelos FAD3 endógenos a otras plantas de Brassica tales como diversas variedades, líneas o accesos de Brassica napus, pero también se pueden rastrear plantas, órganos y tejidos de Brassica juncea (especialmente alelos FAD3 en el genoma A), Brassica carinata (especialmente alelos FAD3 en el genoma C) y Brassica rapa (genoma A) y Brassica oleracea (genoma C) en cuanto a otros alelos FAD3 de tipo salvaje. Además, también se pueden rastrear plantas, órganos y tejidos de Brassica nigra (genoma B), Brassica carinata (genomas B y C) y Brassica juncea (genomas A y B) en cuanto a alelos FAD3 en el genoma B. Para rastrear a tales plantas, órganos de plantas o tejidos en cuanto a la presencia de alelos FAD3, se pueden utilizar las secuencias de ácido nucleico FAD3 proporcionadas en el Listado de secuencias, o variantes o fragmentos de cualquiera de éstas. Por ejemplo, se pueden utilizar secuencias enteras o fragmentos como sondas o cebadores. Por ejemplo, se pueden utilizar cebadores específicos o degenerados para amplificar secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas FAD3 del ADN genómico o el ADNc de la planta, órgano o tejido de la planta. Estas secuencias de ácido nucleico The nucleic acid sequences represented in the Sequence Listing encode functional wild-type FAD3 proteins from Brassica napus. Therefore, these sequences are endogenous to the Brassica napus plants from which they were isolated. Other crop species, varieties, fertilization lines or wild accesses of Brassica, can be traced for other FAD3 alleles, which encode the same FAD3 proteins or variants thereof. For example, nucleic acid hybridization techniques (eg, Southern blot analysis, using, for example, rigorous hybridization conditions) or PCR-based techniques can be used to identify endogenous FAD3 alleles to other Brassica plants such such as various varieties, lines or accesses of Brassica napus, but you can also trace plants, organs and tissues of Brassica juncea (especially FAD3 alleles in genome A), Brassica carinata (especially FAD3 alleles in genome C) and Brassica rapa (genome A) and Brassica oleracea (genome C) as for other wild-type FAD3 alleles. In addition, plants, organs and tissues of Brassica nigra (genome B), Brassica carinata (genomes B and C) and Brassica juncea (genomes A and B) can also be traced for FAD3 alleles in genome B. To track such plants, plant organs or tissues as regards the presence of FAD3 alleles, the FAD3 nucleic acid sequences provided in the Sequence Listing, or variants or fragments of any of these may be used. For example, whole sequences or fragments can be used as probes or primers. For example, specific or degenerate primers can be used to amplify nucleic acid sequences encoding FAD3 proteins of the genomic DNA or the cDNA of the plant, organ or plant tissue. These nucleic acid sequences

FAD3 pueden ser aislados y secuenciados utilizando técnicas estándares de biología molecular. El análisis bioinformático puede entonces utilizarse para caracterizar el o los alelos, por ejemplo con el fin de determinar qué alelo FAD3 corresponde a la secuencia, y qué proteína FAD3 o variante de la proteína es codificada por la secuencia. FAD3 can be isolated and sequenced using standard molecular biology techniques. The bioinformatic analysis can then be used to characterize the allele (s), for example in order to determine which FAD3 allele corresponds to the sequence, and which FAD3 protein or variant of the protein is encoded by the sequence.

El que una secuencia de ácido nucleico codifique una proteína FAD3 funcional puede analizarse mediante técnicas de ADN recombinante tal como se conocen en la técnica, p. ej., mediante un ensayo de complementación genética utilizando, p. ej., una planta de Arabidopsis, que es homocigótica para un FAD3 totalmente inactivado, o por métodos tal como se describen antes. The fact that a nucleic acid sequence encodes a functional FAD3 protein can be analyzed by recombinant DNA techniques as are known in the art, e.g. eg, by a genetic complementation test using, e.g. eg, an Arabidopsis plant, which is homozygous for a fully inactivated FAD3, or by methods as described above.

Además, se entiende que las secuencias de ácidos nucleicos FAD3 y variantes de las mismas (o fragmentos de cualquiera de éstas) pueden ser identificados in silico, mediante el rastreo de bases de datos de ácidos nucleicos para secuencias esencialmente similares. Del mismo modo, una secuencia de ácido nucleico puede sintetizarse químicamente. También se describen fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, que se describen más adelante. Furthermore, it is understood that the FAD3 nucleic acid sequences and variants thereof (or fragments of any of these) can be identified in silico, by scanning nucleic acid databases for essentially similar sequences. Similarly, a nucleic acid sequence can be chemically synthesized. Fragments of nucleic acid molecules according to the invention are also described, which are described below.

Secuencias de ácidos nucleicos codifican proteínas FAD3 mutantes Nucleic acid sequences encode mutant FAD3 proteins

Se describen en esta memoria secuencias de ácidos nucleicos que comprende una o más deleciones, inserciones o sustituciones de nucleótidos en relación con las secuencias de ácidos nucleicos de tipo salvaje, al igual que fragmentos de tales moléculas de ácidos nucleicos mutantes. Tales secuencias de ácidos nucleicos mutantes (a las que se alude como secuencias fad3) se pueden generar y/o identificar utilizando diversos métodos conocidos tal como se describe más adelante. De nuevo, moléculas de ácido nucleico de este tipo pueden estar presentes tanto en forma endógena como en forma aislada. La o las mutaciones pueden resultar en uno o más cambios (deleciones, inserciones y/o sustituciones) en la secuencia de aminoácidos de la proteína FAD3 codificada (es decir, no es un "mutación silenciosa"). La o las mutaciones en la secuencia de ácido nucleico pueden resultar en una actividad biológica significativamente reducida o completamente suprimida de la proteína FAD3 codificada en relación con la proteína de tipo salvaje. Nucleic acid sequences comprising one or more nucleotide deletions, insertions or substitutions in relation to wild-type nucleic acid sequences are described herein, as are fragments of such mutant nucleic acid molecules. Such mutant nucleic acid sequences (referred to as fad3 sequences) can be generated and / or identified using various known methods as described below. Again, nucleic acid molecules of this type may be present both endogenously and in isolation. The mutation (s) may result in one or more changes (deletions, insertions and / or substitutions) in the amino acid sequence of the FAD3 encoded protein (ie, it is not a "silent mutation"). Mutation or nucleic acid sequence mutations can result in a significantly reduced or completely suppressed biological activity of the FAD3 protein encoded in relation to the wild type protein.

Las moléculas de ácidos nucleicos pueden, por lo tanto, comprender una o más mutaciones tales como: una mutación de sentido erróneo, mutación sin sentido o mutación del codón de “PARADA”, una mutación por inserción Nucleic acid molecules may, therefore, comprise one or more mutations such as: a missense mutation, nonsense mutation or "STOP" codon mutation, an insert mutation

o deleción, una mutación de desplazamiento del marco y/o una mutación del sitio de corte y empalme, tal como se describe ya en detalle anteriormente. or deletion, a frame shift mutation and / or a splice site mutation, as described in detail above.

Como ya se mencionó, se desea que la o las mutaciones en la secuencia de ácido nucleico resulten preferiblemente en una cantidad significativamente reducida de o ninguna proteína FAD3 funcional en la célula in vivo. Básicamente, cualquier mutación que resulte en una proteína que comprende al menos una inserción, deleción y/o sustitución de aminoácido con respecto a la proteína de tipo salvaje puede conducir a una actividad biológica significativamente reducida o a ninguna. Sin embargo, ha de entenderse que es más probable que mutaciones en determinadas partes de la proteína resulten en una función reducida de la proteína FAD3 mutante, tales como mutaciones que conducen a proteínas truncadas, con lo que se suprimen o sustituyen partes significativas de los residuos o dominios de aminoácidos funcionales, tales como la señal de retención en el ER, los ocho residuos histidina conservados o la secuencia señal. As already mentioned, it is desired that the mutations in the nucleic acid sequence preferably result in a significantly reduced amount of or no functional FAD3 protein in the cell in vivo. Basically, any mutation that results in a protein comprising at least one amino acid insertion, deletion and / or substitution with respect to the wild type protein can lead to significantly reduced or no biological activity. However, it is to be understood that mutations in certain parts of the protein are more likely to result in a reduced function of the mutant FAD3 protein, such as mutations that lead to truncated proteins, thereby suppressing or replacing significant portions of the residues. or functional amino acid domains, such as the retention signal in the ER, the eight conserved histidine residues or the signal sequence.

Por lo tanto, secuencias de ácidos nucleicos pueden comprender uno o más de cualquiera de los tipos de mutaciones arriba descritas. También, secuencias fad3 pueden comprender una o más mutaciones del codón de parada (sin sentido). Cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos mutantes anteriores se describen per se (en forma aislada), así como plantas y partes de plantas que comprenden tales secuencias de forma endógena. En la Tabla 2 de esta memoria se describen los alelos fad3 más preferidos. Therefore, nucleic acid sequences may comprise one or more of any of the types of mutations described above. Also, fad3 sequences may comprise one or more stop codon (nonsense) mutations. Any of the above mutant nucleic acid sequences are described per se (in isolation), as well as plants and plant parts comprising such sequences endogenously. Table 2 of this report describes the most preferred fad3 alleles.

Una mutación sin sentido en un alelo FAD3, tal como se usa en esta memoria, es una mutación en un alelo FAD3, con lo que uno o más codones de parada de la traducción se introducen en el ADN codificante y la secuencia de ARNm correspondiente del correspondiente alelo FAD3 de tipo salvaje. Codones de parada de la traducción son TGA (UGA en el ARNm), TAA (UAA) y TAG (UAG). Por lo tanto, cualquier mutación (deleción, inserción o sustitución) que conduzca a la generación de un codón de parada en marco en la secuencia codificante resultará en la terminación de la traducción y en el truncamiento de la cadena de aminoácidos. Un alelo FAD3 mutante que comprende una mutación sin sentido es un alelo FAD3 en el que un codón de parada en marco se introduce en la secuencia de codón FAD3 mediante una sola sustitución de nucleótidos, tales como LOLI103, LOLI105, LOLI108, LOLI111 y LOLI115. También, un alelo FAD3 mutante que comprende una mutación sin sentido es un alelo FAD3 en el que un codón de parada en marco se introduce en la secuencia codificante de FAD3 mediante sustituciones dobles de nucleótidos. También, un alelo FAD3 mutante que comprende una mutación sin sentido es un alelo FAD3 A nonsense mutation in an FAD3 allele, as used herein, is a mutation in an FAD3 allele, whereby one or more translation stop codons are introduced into the coding DNA and the corresponding mRNA sequence of the corresponding wild type FAD3 allele. Translation stop codons are TGA (UGA in the mRNA), TAA (UAA) and TAG (UAG). Therefore, any mutation (deletion, insertion or substitution) that leads to the generation of a stop codon in frame in the coding sequence will result in termination of translation and truncation of the amino acid chain. A mutant FAD3 allele comprising a nonsense mutation is an FAD3 allele in which a frame stop codon is introduced into the FAD3 codon sequence by a single nucleotide substitution, such as LOLI103, LOLI105, LOLI108, LOLI111 and LOLI115. Also, a mutant FAD3 allele comprising a nonsense mutation is an FAD3 allele in which a frame stop codon is introduced into the FAD3 coding sequence by double nucleotide substitutions. Also, a mutant FAD3 allele comprising a nonsense mutation is an FAD3 allele.

en el que un codón de parada en marco se introduce en la secuencia codificante de FAD3 mediante sustituciones triples de nucleótidos. La proteína truncada carece de los aminoácidos codificados por el ADN codificante aguas abajo (3') de la mutación (es decir, la parte C-terminal de la proteína FAD3) y conserva los aminoácidos codificados por el ADN codificante aguas arriba (5') de la mutación (es decir, la parte N-terminal de la proteína FAD3). Un alelo FAD3 mutante que puede comprender una mutación sin sentido es un alelo FAD3 en el que la mutación sin sentido está presente en cualquier parte aguas arriba de o que incluye los nucleótidos que codifican el motivo de retención de ER (nt 1117-1131 de SEQ ID NO: 11), de modo que faltan al menos lisina 375 y/o lisina 373, o residuos homólogos a las mismas. in which a frame stop codon is introduced into the FAD3 coding sequence by triple nucleotide substitutions. The truncated protein lacks the amino acids encoded by the downstream (3 ') coding DNA of the mutation (i.e., the C-terminal part of the FAD3 protein) and retains the amino acids encoded by the upstream (5') coding DNA of the mutation (that is, the N-terminal part of the FAD3 protein). A mutant FAD3 allele that can comprise a nonsense mutation is an FAD3 allele in which the nonsense mutation is present anywhere upstream of or that includes the nucleotides encoding the ER retention motif (nt 1117-1131 of SEQ ID NO: 11), so that at least lysine 375 and / or lysine 373, or homologous residues thereof are missing.

Cuanto más truncada esté la proteína FAD3 mutante en comparación con la proteína FAD3 de tipo salvaje, más probable será que el truncamiento pueda resultar en una funcionalidad significativamente reducida o ninguna de la proteína FAD3 in vivo. Por lo tanto, se describe un alelo FAD3 mutante que comprende una mutación sin sentido aguas arriba de o que incluye los nt 895-897, nt 892-894 o nt 883-885 de SEQ ID NO: 11, es decir, resultando en una proteína truncada de menos de aproximadamente 299, 298 ó 295 aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (que carecen de las octava, séptima y sexta histidinas conservadas de la tercera caja his). También adecuado para la invención es un alelo FAD3 mutante que comprende una mutación sin sentido aguas arriba de o incluyendo los nt 394-396, nt 391-393 o nt 382-384 de SEQ ID NO: 11, es decir, resultando en una proteína truncada de menos de aproximadamente 131, 130 ó 128 aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (que carecen de las quinta, cuarta y/o tercera histidina de la segunda caja his), o un alelo FAD3 mutante que comprende una mutación sin sentido aguas arriba de The more truncated the mutant FAD3 protein is compared to the wild-type FAD3 protein, the more likely it is that truncation can result in significantly reduced functionality or none of the FAD3 protein in vivo. Therefore, a mutant FAD3 allele is described that comprises a nonsense mutation upstream of or that includes nt 895-897, nt 892-894 or nt 883-885 of SEQ ID NO: 11, that is, resulting in a truncated protein of less than about 299, 298 or 295 amino acids of SEQ ID NO: 2 (lacking the preserved eighth, seventh and sixth histidines of the third his box). Also suitable for the invention is a mutant FAD3 allele comprising a nonsense mutation upstream of or including nt 394-396, nt 391-393 or nt 382-384 of SEQ ID NO: 11, that is, resulting in a protein truncated from less than approximately 131, 130 or 128 amino acids of SEQ ID NO: 2 (lacking the fifth, fourth and / or third histidine of the second his box), or a mutant FAD3 allele comprising a nonsense mutation upstream from

o incluyendo los nt 286-288 o nt 274-276 de SEQ ID NO: 11, es decir, lo que resulta en una proteína truncada de menos de aproximadamente 96 ó 92 amino ácidos de SEQ ID NO: 2 (que carece de la segunda y/o primera sexta histidina conservadas de la primera caja his). Como ya se ha mencionado, las regiones o residuos correspondientes en otras secuencias FAD3 de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos FAD3 se pueden identificar determinando el alineamiento óptimo. or including nt 286-288 or nt 274-276 of SEQ ID NO: 11, that is, resulting in a truncated protein of less than about 96 or 92 amino acids of SEQ ID NO: 2 (which lacks the second and / or first sixth histidine conserved from the first his) box. As already mentioned, the corresponding regions or residues in other FAD3 nucleic acid sequences and FAD3 amino acid sequences can be identified by determining the optimal alignment.

También se describe un alelo FAD3 mutante comprende una mutación sin sentido que resulta en el uso de una ATG alternativo como codón de iniciación y la síntesis de una proteína truncada en el extremo N que carece de la putativa secuencia señal. A mutant FAD3 allele is also described comprising a nonsense mutation that results in the use of an alternative ATG as an initiation codon and the synthesis of a truncated protein at the N-terminus that lacks the putative signal sequence.

Una mutación de sentido erróneo en un alelo FAD3, tal como se utiliza en esta memoria, es cualquier mutación (deleción, inserción o sustitución) en un alelo FAD3 mediante la cual uno o más codones son cambiados en el ADN codificante y la secuencia de ARNm correspondiente del correspondiente alelo FAD3 de tipo salvaje, resultando en la sustitución de uno o más aminoácidos en la proteína FAD3 de tipo salvaje para uno o más de otros aminoácidos en la proteína FAD3 mutante. Un alelo FAD3 mutante que puede comprender una mutación de sentido erróneo es un alelo FAD3, en el que están sustituidos uno o más de los aminoácidos del motivo de retención de ER, es decir, los residuos 373-377, especialmente lisina 373 y/o 375 de FAD3-A1, o residuos homólogos de los mismos. Tales mutaciones conducirán a una pérdida de la localización del ER. También mutaciones de sentido erróneo que resultan en la sustitución de uno o más de los ocho residuos histidina de unión di-hierro conservadas resultarán en una pérdida completa de la función de la proteína. Además, es probable que las mutaciones de sentido erróneo que resultan en la sustitución de aminoácidos en la secuencia señal N-terminal resulten en una enzima no funcional debido a la pérdida de su localización del ER. A missense mutation in an FAD3 allele, as used herein, is any mutation (deletion, insertion or substitution) in an FAD3 allele whereby one or more codons are changed in the coding DNA and the mRNA sequence. corresponding of the corresponding wild-type FAD3 allele, resulting in the substitution of one or more amino acids in the wild-type FAD3 protein for one or more other amino acids in the mutant FAD3 protein. A mutant FAD3 allele that can comprise a missense mutation is an FAD3 allele, in which one or more of the amino acids of the ER retention motif are substituted, i.e. residues 373-377, especially lysine 373 and / or 375 of FAD3-A1, or homologous residues thereof. Such mutations will lead to a loss of ER localization. Also missense mutations that result in the replacement of one or more of the eight di-iron binding histidine residues conserved will result in a complete loss of protein function. In addition, missense mutations that result in amino acid substitution in the N-terminal signal sequence are likely to result in a non-functional enzyme due to the loss of its ER location.

Una mutación de desplazamiento de marco en un alelo FAD3, tal como se utiliza en esta memoria, es una mutación (deleción, inserción, duplicación, y similares) en un alelo FAD3 que resulta en la secuencia de ácido nucleico que se está traduciendo en un marco diferente aguas abajo de la mutación que conduce a una cantidad significativamente reducida de o sin enzima FAD3 funcional in vivo. A frame shift mutation in an FAD3 allele, as used herein, is a mutation (deletion, insertion, duplication, and the like) in an FAD3 allele that results in the nucleic acid sequence that is being translated into a Different framework downstream of the mutation that leads to a significantly reduced amount of or without functional FAD3 enzyme in vivo.

Una mutación en el sitio de corte y empalme en un alelo FAD3 es una mutación que resulta en corte y empalme aberrante del pre-ARNm que resulta en una proteína mutante que tiene una actividad significativamente reducida o ninguna. En esta memoria se describe cualquier mutación (inserción, deleción y/o sustitución de uno o más nucleótidos) que altera el corte y empalme del pre-ARNm y, con ello, conduce a una cantidad significativamente reducida de o sin enzima FAD3 funcional in vivo. Un alelo FAD3 mutante puede comprender una mutación en el sitio de corte y empalme es un alelo FAD3 en el que el corte y empalme alterado es provocado por la introducción en la región de ADN transcrita de FAD3 de una o más sustituciones de nucleótidos de los dinucleótidos consenso del sitio de corte y empalme 5' o del sitio de corte y empalme 3’ tal como se describe anteriormente. Por ejemplo, GU puede, por ejemplo, ser mutado a AU en el sitio de corte y empalme de donantes y/o AG puede ser mutado a AA en la secuencia del sitio de corte y empalme del aceptor. A mutation at the splice site in an FAD3 allele is a mutation that results in aberrant splicing of the pre-mRNA that results in a mutant protein that has significantly reduced or no activity. This report describes any mutation (insertion, deletion and / or substitution of one or more nucleotides) that alters the splicing of the pre-mRNA and, thus, leads to a significantly reduced amount of or without functional FAD3 enzyme in vivo . A mutant FAD3 allele may comprise a mutation at the splice site is an FAD3 allele in which the altered splice is caused by the introduction into the region of FAD3 transcribed DNA of one or more nucleotide substitutions of the dinucleotides consensus of the 5 'splice site or 3' splice site as described above. For example, GU can, for example, be mutated to AU at the donor splice site and / or AG can be mutated to AA in the sequence of the acceptor splice site.

Secuencias de aminoácidos Amino acid sequences

Se describen tanto secuencias de aminoácidos FAD3 de tipo salvaje (funcionales) como secuencias de aminoácidos FAD3 mutantes (que comprende una o más mutaciones, preferiblemente mutaciones que resultan en una cantidad significativamente reducida de enzima FAD3 funcional o sin enzima FAD3 funcional in vivo) de Brassicaceae, particularmente de especies de Brassica, especialmente de Brassica napus, pero también de otras especies de cultivo de Brassica. Por ejemplo, las especies de Brassica que comprende un genoma A y/o un genoma C pueden codificar diferentes aminoácidos FAD3. Además, se pueden utilizar métodos de mutagénesis para generar mutaciones en alelos FAD3 de tipo salvaje, generando de esta manera alelos mutantes que pueden codificar proteínas FAD3 mutantes adicionales. Las secuencias de aminoácidos FAD3 mutantes de tipo salvaje pueden estar presentes dentro de una planta de Brassica (es decir, de forma endógena). Sin embargo, también se describen en esta memoria secuencias de aminoácidos FAD3 aisladas (p. ej., aisladas a partir de la planta o hechas sintéticamente), así como variantes de las mismos y fragmentos de cualquiera de éstas. Both wild-type (functional) FAD3 amino acid sequences are described as well as mutant FAD3 amino acid sequences (comprising one or more mutations, preferably mutations resulting in a significantly reduced amount of functional FAD3 enzyme or no functional in vivo FAD3 enzyme) from Brassicaceae , particularly of Brassica species, especially Brassica napus, but also other Brassica crop species. For example, Brassica species comprising a genome A and / or a genome C can encode different FAD3 amino acids. In addition, mutagenesis methods can be used to generate mutations in wild-type FAD3 alleles, thereby generating mutant alleles that can encode additional mutant FAD3 proteins. The wild-type mutant FAD3 amino acid sequences may be present within a Brassica plant (that is, endogenously). However, isolated FAD3 amino acid sequences (e.g., isolated from the plant or made synthetically), as well as variants thereof and fragments thereof, are also described herein.

Secuencias de aminoácidos de proteínas FAD3 se han deducido a partir de las secuencias FAD3 de ADN genómico que han sido aisladas de Brassica napus tal como se representa en el Listado de secuencias. Se representan las secuencias FAD3 de tipo salvaje, mientras que las secuencias FAD3 mutantes de estas secuencias y de secuencias esencialmente similares a éstas, se describen en esta memoria a continuación, con referencia a las secuencias FAD3 de tipo salvaje. Las proteínas FAD3 de Brassica descritas en esta memoria son de 377 a 388 aminoácidos de longitud y comprenden un cierto número de dominios estructurales y funcionales y residuos aminoácidos, tal como se describe anteriormente. Amino acid sequences of FAD3 proteins have been deduced from the FAD3 sequences of genomic DNA that have been isolated from Brassica napus as depicted in the Sequence Listing. Wild-type FAD3 sequences are depicted, while mutant FAD3 sequences of these sequences and of sequences essentially similar to these, are described herein below, with reference to wild-type FAD3 sequences. The Brassica FAD3 proteins described herein are 377 to 388 amino acids in length and comprise a number of structural and functional domains and amino acid residues, as described above.

"Secuencias de aminoácidos FAD3-A1" o "secuencias de aminoácidos FAD3-A1 variantes", de acuerdo con la invención, son secuencias de aminoácidos que tienen al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2. A estas secuencias de aminoácidos también se las puede aludir como "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias FAD3 proporcionadas en el Listado de secuencias. "FAD3-A1 amino acid sequences" or "variant FAD3-A1 amino acid sequences", according to the invention, are amino acid sequences having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% , at least 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 2. These amino acid sequences can also be referred to as "essentially similar" or "essentially identical" to the FAD3 sequences provided in the Sequence Listing.

"Secuencias de aminoácidos FAD3-C1" o "secuencias de aminoácidos FAD3-C1 variantes", de acuerdo con la invención, son secuencias de aminoácidos que tienen al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4. A estas secuencias de aminoácidos también se las puede aludir como "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias FAD3 proporcionadas en el Listado de secuencias. "FAD3-C1 amino acid sequences" or "variant FAD3-C1 amino acid sequences", according to the invention, are amino acid sequences having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% , at least 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 4. These amino acid sequences can also be referred to as "essentially similar" or "essentially identical" to the FAD3 sequences provided in the Sequence Listing.

"Secuencias de aminoácidos FAD3-A2" o "secuencias de aminoácidos FAD3-A2 variantes", de acuerdo con la invención, son secuencias de aminoácidos que tienen al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 6. A estas secuencias de aminoácidos también se las puede aludir como "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias FAD3 proporcionadas en el Listado de secuencias. "FAD3-A2 amino acid sequences" or "variant FAD3-A2 amino acid sequences", according to the invention, are amino acid sequences having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% , at least 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 6. These amino acid sequences can also be referred to as "essentially similar" or "essentially identical" to the FAD3 sequences provided in the Sequence Listing.

"Secuencias de aminoácidos FAD3-A3" o "secuencias de aminoácidos FAD3-A3 variantes", de acuerdo con la invención, son secuencias de aminoácidos que tienen al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 8. A estas secuencias de aminoácidos también se las puede aludir como "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias FAD3 proporcionadas en el Listado de secuencias. "FAD3-A3 amino acid sequences" or "variant FAD3-A3 amino acid sequences", according to the invention, are amino acid sequences having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% , at least 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 8. These amino acid sequences can also be referred to as "essentially similar" or "essentially identical" to the FAD3 sequences provided in the Sequence Listing.

"Secuencias de aminoácidos FAD3-C2" o "secuencias de aminoácidos FAD3-C2 variantes", de acuerdo con la invención, son secuencias de aminoácidos que tienen al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 10. A estas secuencias de aminoácidos también se las puede aludir como "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias FAD3 proporcionadas en el Listado de secuencias. "FAD3-C2 amino acid sequences" or "variant FAD3-C2 amino acid sequences", according to the invention, are amino acid sequences having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% , at least 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 10. These amino acid sequences can also be referred to as "essentially similar" or "essentially identical" to the FAD3 sequences provided in the Sequence Listing.

Por lo tanto, se describen en esta memoria tanto secuencias de aminoácidos de proteínas FAD3 de tipo salvaje, funcionales, incluyendo variantes y fragmentos de las mismas (tal como se define más adelante) como secuencias de aminoácidos mutantes de cualquiera de éstas, con lo que la mutación en la secuencia de aminoácidos preferiblemente resulta en una reducción significativa en o una supresión completa de la actividad biológica de la proteína FAD3 en comparación con la actividad biológica de la proteína FAD3 de tipo salvaje correspondiente. Una reducción significativa en o la supresión completa de la actividad biológica de la proteína FAD3 se refiere en esta memoria a una reducción significativa en la conversión de C18:2 en C18:3, de manera que el aceite de semillas de una planta que expresa la proteína FAD3 mutante tiene un contenido reducido en C18:3 en comparación con una planta que expresa la proteína FAD3 de tipo salvaje correspondiente. Therefore, both amino acid sequences of wild-type, functional FAD3 proteins, including variants and fragments thereof (as defined below) and mutant amino acid sequences of any of these are described herein, whereby The mutation in the amino acid sequence preferably results in a significant reduction in or a complete suppression of the biological activity of the FAD3 protein compared to the biological activity of the corresponding wild-type FAD3 protein. A significant reduction in or complete suppression of the biological activity of the FAD3 protein refers herein to a significant reduction in the conversion of C18: 2 to C18: 3, so that the seed oil of a plant expressing the Mutant FAD3 protein has a reduced C18: 3 content compared to a plant that expresses the corresponding wild-type FAD3 protein.

Se describen en esta memoria tanto las secuencias de aminoácidos endógenas como las aisladas. También se describen fragmentos de las secuencias de aminoácidos FAD3 y secuencias de aminoácidos FAD3 variantes definidas anteriormente. Un "fragmento" de una secuencia de aminoácidos FAD3 o variante de la misma (tal como se define) puede ser de diversas longitudes tales como al menos 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 ó 370 aminoácidos contiguos a la secuencia de FAD3 (o de la secuencia variante). Both endogenous and isolated amino acid sequences are described herein. Fragments of the FAD3 amino acid sequences and FAD3 amino acid sequences defined above are also described. A "fragment" of an FAD3 amino acid sequence or variant thereof (as defined) may be of various lengths such as at least 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 or 370 amino acids adjacent to the FAD3 sequence (or the variant sequence).

Secuencias de aminoácidos de proteínas FAD3 funcionales Amino acid sequences of functional FAD3 proteins

Las secuencias de aminoácidos representadas en el Listado de secuencias son proteínas FAD3 funcionales de tipo salvaje de Brassica napus. Por lo tanto, estas secuencias son endógenas a las de plantas de Brassica napus de las que se aislaron. Otras especies de cultivo, variedades, líneas de reproducción o accesos salvajes de Brassica pueden ser rastreadas en cuanto a otras proteínas FAD3 funcionales con las mismas secuencias de aminoácidos o variantes de los mismos tal como se describe anteriormente. The amino acid sequences depicted in the Sequence Listing are wild-type functional FAD3 proteins from Brassica napus. Therefore, these sequences are endogenous to those of Brassica napus plants from which they were isolated. Other crop species, varieties, reproduction lines or wild accesses of Brassica can be traced for other functional FAD3 proteins with the same amino acid sequences or variants thereof as described above.

Además, se entiende que las secuencias de aminoácidos FAD3 y variantes de las mismas (o fragmentos de cualquiera de éstas) se puede identificar in silico, mediante el rastreo de bases de datos de aminoácidos en cuanto a secuencias esencialmente similares. También se describen fragmentos de moléculas de aminoácidos de acuerdo con la invención. In addition, it is understood that FAD3 amino acid sequences and variants thereof (or fragments of any of these) can be identified in silico, by scanning amino acid databases for essentially similar sequences. Fragments of amino acid molecules according to the invention are also described.

Secuencias de aminoácidos de proteínas FAD3 mutantes Amino acid sequences of mutant FAD3 proteins

Se describen en esta memoria secuencias de aminoácidos que comprenden una o más deleciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos con relación a las secuencias de aminoácidos de tipo salvaje, al igual que fragmentos de tales moléculas de aminoácidos mutantes. Tales secuencias de aminoácidos mutantes se pueden generar y/o identificar utilizando diversos métodos conocidos, tal como se describe anteriormente. De nuevo, tales moléculas de aminoácidos se describen tanto en forma endógena como en forma aislada. Amino acid sequences comprising one or more amino acid deletions, insertions or substitutions in relation to wild-type amino acid sequences are described herein, as are fragments of such mutant amino acid molecules. Such mutant amino acid sequences can be generated and / or identified using various known methods, as described above. Again, such amino acid molecules are described both endogenously and in isolation.

La o las mutaciones en la secuencia de aminoácidos pueden resultar en una actividad biológica significativamente reducida o completamente suprimida de la proteína FAD3 con relación a la proteína de tipo salvaje. Tal como se describe anteriormente, básicamente, cualquier mutación que resulta en una proteína que comprende al menos una inserción, deleción y/o sustitución de aminoácido con respecto a la proteína de tipo salvaje puede conducir a una actividad biológica significativamente reducida o ninguna. Sin embargo, ha de entenderse que es más probable que mutaciones en determinadas partes de la proteína resulten en una función reducida de la proteína FAD3 mutante, tales como mutaciones que conducen a proteínas truncadas, con lo que se eliminan o sustituyen partes significativas de los residuos o dominios de aminoácidos funcionales y/o estructurales, tales como la señal de retención del ER, los ocho residuos histidina conservados o la secuencia señal, tal como se ha descrito anteriormente. The amino acid sequence or mutations can result in a significantly reduced or completely suppressed biological activity of the FAD3 protein relative to the wild type protein. As described above, basically, any mutation that results in a protein comprising at least one insertion, deletion and / or amino acid substitution with respect to the wild type protein can lead to significantly reduced or no biological activity. However, it is to be understood that mutations in certain parts of the protein are more likely to result in a reduced function of the mutant FAD3 protein, such as mutations that lead to truncated proteins, thereby eliminating or replacing significant portions of the residues. or functional and / or structural amino acid domains, such as the ER retention signal, the eight conserved histidine residues or the signal sequence, as described above.

Por lo tanto, se describen proteínas FAD3 mutantes que comprenden una o más mutaciones de deleción o inserción, con lo que la o las eliminaciones, inserciones o sustituciones resultan en una proteína mutante que tiene una actividad significativamente reducida o ninguna in vivo. Tales proteínas FAD3 mutantes son proteínas FAD3 en las que se suprimen, insertan o sustituyen al menos 1, al menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 370 o más aminoácidos, en comparación con la proteína FAD3 de tipo salvaje, con lo cual la o las deleciones o inserciones resultan en una proteína mutante que tiene una actividad significativamente reducida o ninguna in vivo. Therefore, mutant FAD3 proteins comprising one or more deletion or insertion mutations are described, whereby the deletion, insertion or substitution results in a mutant protein that has significantly reduced activity or none in vivo. Such mutant FAD3 proteins are FAD3 proteins in which at least 1, at least 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, are deleted, inserted or replaced. 370 or more amino acids, compared to wild-type FAD3 protein, whereby the deletion or insertions result in a mutant protein that has significantly reduced activity or none in vivo.

Se describen proteínas FAD3 mutantes que están truncadas, con lo cual el truncamiento resulta en una proteína mutante que tiene una actividad significativamente reducida o ninguna in vivo. La proteína truncada carece de los aminoácidos codificados por el ADN codificante aguas abajo (3') de la mutación (es decir, la parte C-terminal de la proteína FAD3) y conserva los aminoácidos codificados por el ADN codificante aguas arriba (5') de la mutación (es decir, la parte N-terminal de la proteína FAD3). También se describe una proteína FAD3 truncada que comprende la parte N-terminal de la proteína FAD3 de tipo salvaje correspondiente hasta, pero no incluyendo (completamente) el motivo de retención de ER, es decir, correspondiente a cualquier parte aguas arriba del o de los residuos lisina en la posición 375 y/o 373 de SEQ ID NO: 2, de modo que al menos faltan lisina 375 y/o lisina 373 (o residuos lisina correspondientes en otras proteínas FAD3). Cuanto más truncada esté la proteína FAD3 mutante en comparación con la proteína FAD3 de tipo salvaje, más truncamiento puede resultar en una actividad significativamente reducida Mutant FAD3 proteins that are truncated are described, whereby truncation results in a mutant protein that has significantly reduced activity or none in vivo. The truncated protein lacks the amino acids encoded by the downstream (3 ') coding DNA of the mutation (i.e., the C-terminal part of the FAD3 protein) and retains the amino acids encoded by the upstream (5') coding DNA of the mutation (that is, the N-terminal part of the FAD3 protein). A truncated FAD3 protein is also described which comprises the N-terminal part of the corresponding wild-type FAD3 protein up to, but not including (completely) the reason for ER retention, that is, corresponding to any part upstream of the or Lysine residues at position 375 and / or 373 of SEQ ID NO: 2, so that at least 375 and / or lysine 373 (or corresponding lysine residues in other FAD3 proteins) are missing. The more truncated the mutant FAD3 protein is compared to the wild-type FAD3 protein, the more truncation can result in significantly reduced activity

o ninguna in vivo de la proteína FAD3. También se describe una proteína truncada de menos de aproximadamente 299, 298 ó 295 aminoácidos (que carecen de las octava, séptima y o sexta histidinas conservadas de la tercera caja his), menos de aproximadamente 131, 130 ó 128 aminoácidos (que carecen de la quinta, cuarta y/o tercera sextas histidinas conservadas de la segunda caja his), menos de aproximadamente 96 ó 92 aminoácidos (que carecen de la segunda y/o primera sextas histidinas conservadas de la primera caja his) de SEQ ID NO: 2 o residuos homólogos de los mismos. También se describe una proteína truncada en el extremo N que carece de la putativa secuencia señal. or none in vivo of the FAD3 protein. Also described is a truncated protein of less than about 299, 298 or 295 amino acids (lacking the eighth, seventh, and sixth histidines conserved from the third his box), less than about 131, 130 or 128 amino acids (lacking the fifth , fourth and / or third conserved histidines of the second his box), less than approximately 96 or 92 amino acids (lacking the second and / or first conserved histidines of the first his box) of SEQ ID NO: 2 or residues counterparts thereof. A truncated protein is also described at the N-terminus that lacks the putative signal sequence.

Se describen proteínas FAD3 mutantes que comprenden una o más mutaciones de sustitución, con lo que la o las sustituciones resultan en una proteína mutante que tiene una actividad significativamente reducida o ninguna in vivo. Tales proteínas mutantes FAD3 son proteínas FAD3 en las que están sustituidos los residuos de aminoácidos conservados que tienen una función específica tal como la fijación del ER como objetivo o la retención o la unión del hierro. Se describe una proteína FAD3 mutante, en donde están sustituidos uno o más de los aminoácidos del motivo de retención del ER, es decir, los residuos 373-377, especialmente lisina 373 y/o 375 de SEQ ID NO: 2, o los residuos homólogos de los mismos. Tales mutaciones conducirán a una pérdida de la localización del ER. También se describen proteínas FAD3 mutantes con sustitución de uno o más de los ocho residuos histidina conservados, que resultará en una pérdida completa de la función de la proteína. Además, se describen proteínas FAD3 mutantes con una o más sustituciones de aminoácidos en la secuencia señal N-terminal. Es probable que estas sustituciones resulten en una proteína FAD3 no funcional, debido a la pérdida de la fijación inicial como objetivo del ER. Mutant FAD3 proteins comprising one or more substitution mutations are described, whereby the substitution or substitutions result in a mutant protein that has significantly reduced activity or none in vivo. Such FAD3 mutant proteins are FAD3 proteins in which conserved amino acid residues having a specific function such as ER target fixation or iron retention or binding are substituted. A mutant FAD3 protein is described, wherein one or more of the amino acids of the ER retention motif are substituted, that is, residues 373-377, especially lysine 373 and / or 375 of SEQ ID NO: 2, or residues counterparts thereof. Such mutations will lead to a loss of ER localization. Also described are mutant FAD3 proteins with substitution of one or more of the eight conserved histidine residues, which will result in a complete loss of protein function. In addition, mutant FAD3 proteins with one or more amino acid substitutions in the N-terminal signal sequence are described. It is likely that these substitutions result in a non-functional FAD3 protein, due to the loss of the initial fixation as an ER target.

Se describen proteínas FAD3 mutantes que comprenden una o más mutaciones de inserción o deleción, con lo que la o las inserciones y/o deleciones resultan en una proteína mutante que tiene una actividad significativamente reducida o ninguna in vivo. Tales proteínas FAD3 mutantes son proteínas FAD3 en las que se ha alterado el posicionamiento entre residuos aminoácidos conservados que tienen una función específica. Se describe una proteína FAD3 mutante en la que uno o más aminoácidos han sido insertados entre cualquiera de las ocho histidinas conservadas y los putativos dominios de transmembrana. Además, se describe una proteína FAD3 mutante en la que se han suprimido uno o más de los aminoácidos entre cualquiera de las ocho histidinas conservadas y los putativos dominios de transmembrana. Es probable que estas mutaciones resulten en una estructura alterada y posiblemente en una pérdida de la función de la proteína FAD3. Mutant FAD3 proteins comprising one or more insertion or deletion mutations are described, whereby the insertion or deletions and / or deletions result in a mutant protein that has significantly reduced activity or none in vivo. Such mutant FAD3 proteins are FAD3 proteins in which the positioning between conserved amino acid residues that have a specific function has been altered. A mutant FAD3 protein is described in which one or more amino acids have been inserted between any of the eight conserved histidines and the putative transmembrane domains. In addition, a mutant FAD3 protein is described in which one or more of the amino acids between any of the eight conserved histidines and the putative transmembrane domains have been deleted. It is likely that these mutations result in an altered structure and possibly a loss of the function of the FAD3 protein.

Métodos Methods

Alelos FAD3 mutantes se pueden generar (por ejemplo inducidos por mutagénesis) y/o identificar utilizando una gama de métodos, que son convencionales en la técnica, por ejemplo utilizando métodos basados en PCR para amplificar parte o la totalidad de la FAD3 genómica o ADNc. Mutant FAD3 alleles can be generated (eg induced by mutagenesis) and / or identified using a range of methods, which are conventional in the art, for example using PCR-based methods to amplify part or all of the genomic FAD3 or cDNA.

Después de la mutagénesis, las plantas se cultivan a partir de las semillas tratadas o se regeneran a partir de las células tratadas utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, las semillas mutagenizadas pueden plantarse de acuerdo con procesos de cultivo convencionales, y después de la autopolinización se forman las semillas en las plantas. Alternativamente, se pueden extraer plántulas dobles haploides a partir de células de microsporas o polen tratadas para formar inmediatamente plantas homocigóticas, por ejemplo tal como se describe por Coventry et al. (1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. Publicación OAC 0489. Univ. De Guelph, Guelph, Ontario, Canadá). Se puede recolectar semilla adicional que se forma como resultado de una auto-polinización de este tipo en la presente generación o en una posterior y se pueden rastrear en cuanto a la presencia de alelos FAD3 mutantes, utilizando técnicas que son convencionales en la técnica, por ejemplo técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (amplificación de los alelos FAD3) o técnicas basadas en la hibridación, p. ej., análisis de transferencia Southern, rastreo del banco BAC, y similares, y/o mediante secuenciación directa de alelos FAD3. Para rastrear la presencia de mutaciones puntuales (los denominados polimorfismos de nucleótido único o SNPs) en los alelos FAD3 mutantes, se pueden utilizar métodos de detección de SNP convencionales en la técnica, por ejemplo, técnicas basadas en oligoligamiento, técnicas basadas en la extensión de una sola base, tales como pirosecuenciación, o técnicas basadas en las diferencias en los sitios de restricción, tales como TILLING. After mutagenesis, the plants are grown from the treated seeds or regenerated from the treated cells using known techniques. For example, mutagenized seeds can be planted according to conventional culture processes, and after self-pollination the seeds are formed in the plants. Alternatively, double haploid seedlings can be extracted from treated microspores or pollen cells to immediately form homozygous plants, for example as described by Coventry et al. (1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. De Guelph, Guelph, Ontario, Canada). Additional seed that is formed as a result of such self-pollination can be collected in the present or a later generation and can be traced for the presence of mutant FAD3 alleles, using techniques that are conventional in the art, by example techniques based on polymerase chain reaction (PCR) (amplification of FAD3 alleles) or techniques based on hybridization, e.g. eg, Southern blot analysis, BAC bank tracking, and the like, and / or by direct sequencing of FAD3 alleles. To track the presence of point mutations (so-called single nucleotide polymorphisms or SNPs) in mutant FAD3 alleles, conventional SNP detection methods can be used in the art, for example, oligoligation-based techniques, techniques based on the extent of a single base, such as pyrosequencing, or techniques based on differences in restriction sites, such as TILLING.

Tal como se describió anteriormente, la mutagenización (espontánea, así como inducida) de un alelo FAD3 de tipo salvaje específico resulta en la presencia de uno o más nucleótidos eliminados, insertados o sustituidos (en lo que sigue denominada "región de mutación") en el alelo FAD3 mutante resultante. El alelo FAD3 mutante se puede caracterizar, por lo tanto, por la ubicación y la configuración de uno o más nucleótidos eliminados, insertados o sustituidos en el alelo FAD3 de tipo salvaje. Al sitio en el alelo FAD3 de tipo salvaje en el que se han insertado, eliminado o sustituido los uno o más nucleótidos, respectivamente, se alude en esta memoria también como la "región o secuencia de mutación". Una "región o secuencia flanqueante 5’ ó 3’ " tal como se utiliza en esta memoria se refiere a una región o secuencia de ADN en el alelo FAD3 mutante (o el tipo salvaje correspondiente) de al menos 20 pb, preferiblemente al menos 50 pb, al menos 750 pb , al menos 1500 pb, y hasta 5000 pb de ADN diferentes del ADN que contiene el uno o más nucleótidos eliminados, insertados o sustituidos, preferiblemente ADN del alelo FAD3 mutante (o el tipo salvaje correspondiente) que se encuentra inmediatamente aguas arriba de y contiguo con (región o secuencia flanqueante 5' ") o inmediatamente aguas abajo de y contiguo con (región o secuencia flanqueante 3' ") la región de la mutación en el alelo FAD3 mutante (o en el correspondiente alelo FAD3 de tipo salvaje). Una "región de unión", tal como se utiliza en esta memoria se refiere a una región de ADN en el alelo FAD3 mutante (o el tipo salvaje correspondiente), en que la región de la mutación y la región flanqueante 5' ó 3' están enlazadas entre sí. Una "secuencia que abarca la región de unión entre la región de mutación y la región As described above, mutagenization (spontaneous, as well as induced) of a specific wild-type FAD3 allele results in the presence of one or more nucleotides removed, inserted or substituted (hereinafter referred to as "mutation region") in the resulting mutant FAD3 allele. The mutant FAD3 allele can therefore be characterized by the location and configuration of one or more nucleotides removed, inserted or substituted in the wild type FAD3 allele. The site in the wild-type FAD3 allele in which the one or more nucleotides have been inserted, removed or replaced, respectively, is also referred to herein as the "mutation region or sequence". A "5 'or 3' flanking region or sequence" as used herein refers to a region or DNA sequence in the mutant FAD3 allele (or the corresponding wild type) of at least 20 bp, preferably at least 50 bp, at least 750 bp, at least 1500 bp, and up to 5000 bp different DNA from the DNA containing the one or more nucleotides removed, inserted or substituted, preferably DNA from the mutant FAD3 allele (or the corresponding wild type) found immediately upstream of and contiguous with (region or flanking sequence 5 '") or immediately downstream of and contiguous with (region or flanking sequence 3'") the region of the mutation in the mutant FAD3 allele (or in the corresponding FAD3 allele wild type). A "binding region", as used herein refers to a region of DNA in the mutant FAD3 allele (or the corresponding wild type), in which the mutation region and the 5 'or 3' flanking region They are linked together. A "sequence that encompasses the junction region between the mutation region and the region

flanqueante 5' ó 3' comprende, por lo tanto, una secuencia de mutación, así como la secuencia flanqueante contigua con la misma. 5 'or 3' flanking therefore comprises a mutation sequence, as well as the contiguous flanking sequence therewith.

Las herramientas desarrolladas para identificar un alelo FAD3 mutante específico o la planta o el material vegetal que comprende un alelo FAD3 mutante específico, o productos que comprenden material vegetal que comprende un The tools developed to identify a specific mutant FAD3 allele or the plant or plant material comprising a specific mutant FAD3 allele, or products comprising plant material comprising a

5 alelo FAD3 mutante específico se basan en las características genómicas específicas del alelo FAD3 mutante específico en comparación con las características genómicas del correspondiente alelo FAD3 de tipo salvaje tales como un mapa específico de restricción de la región genómica que comprende la región de mutación, marcadores moleculares o la secuencia de las regiones flanqueantes y/o de mutación. 5 specific mutant FAD3 allele are based on the specific genomic characteristics of the specific mutant FAD3 allele compared to the genomic characteristics of the corresponding wild-type FAD3 allele such as a specific restriction map of the genomic region comprising the mutation region, molecular markers or the sequence of flanking and / or mutation regions.

Una vez que un alelo FAD3 mutante específico ha sido secuenciado, se pueden desarrollar cebadores y sondas que Once a specific mutant FAD3 allele has been sequenced, primers and probes can be developed that

10 reconocen específicamente una secuencia dentro de las regiones flanqueante 5’, flanqueante 3' y/o de mutación del alelo FAD3 mutante en el ácido nucleico (ADN o ARN) de una muestra por medio de una técnica de biología molecular. Por ejemplo, se puede desarrollar un método de PCR para identificar el alelo FAD3 mutante en muestras biológicas (tales como muestras de plantas, material vegetal o productos que comprenden material vegetal). Una PCR de este tipo se basa en al menos dos "cebadores" específicos: (1) uno que reconoce una secuencia dentro de 10 specifically recognize a sequence within the 5 'flanking, 3' flanking and / or mutational regions of the mutant FAD3 allele in the nucleic acid (DNA or RNA) of a sample by means of a molecular biology technique. For example, a PCR method can be developed to identify the mutant FAD3 allele in biological samples (such as plant samples, plant material or products comprising plant material). Such a PCR is based on at least two specific "primers": (1) one that recognizes a sequence within

15 la región flanqueante 5' ó 3' del alelo FAD3 mutante y el otro que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 3' ó 5' del alelo FAD3 mutante, respectivamente; o (2) uno que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 5' ó 3' del alelo FAD3 mutante y el otro que reconoce una secuencia dentro de la región de mutación del alelo FAD3 mutante; o (3) uno que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 5' ó 3' del alelo FAD3 mutante y el otro que reconoce una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante 15 the 5 'or 3' flanking region of the mutant FAD3 allele and the other that recognizes a sequence within the 3 'or 5' flanking region of the mutant FAD3 allele, respectively; or (2) one that recognizes a sequence within the 5 'or 3' flanking region of the mutant FAD3 allele and the other that recognizes a sequence within the mutation region of the mutant FAD3 allele; or (3) one that recognizes a sequence within the 5 'or 3' flanking region of the mutant FAD3 allele and the other that recognizes a sequence that encompasses the junction region between the flanking region

20 3' ó 5' y la región de mutación del alelo FAD3 mutante específico (tal como se describe más adelante), respectivamente. 3 'or 5' and the mutation region of the specific mutant FAD3 allele (as described below), respectively.

Los cebadores tienen preferiblemente una secuencia de entre 15 y 35 nucleótidos que, en condiciones de PCR optimizadas, "reconoce específicamente" una secuencia dentro de la región flanqueante 5’ ó 3’, una secuencia dentro de la región de mutación, o una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante 3’ ó 5’ y The primers preferably have a sequence of between 15 and 35 nucleotides that, under optimized PCR conditions, "specifically recognize" a sequence within the 5 'or 3' flanking region, a sequence within the mutation region, or a sequence that covers the junction region between the 3 'or 5' flanking region and

25 las regiones de mutación del alelo FAD3 mutante específico, de modo que un fragmento específico ("fragmento específico para FAD3 mutante" o amplicón discriminante) se amplifica a partir de una muestra de ácido nucleico que comprende el alelo FAD3 mutante específico. Esto significa que sólo el alelo FAD3 mutante específico, y no otra secuencia en el genoma de la planta, se amplifica bajo condiciones PCR optimizadas. The mutation regions of the specific mutant FAD3 allele, so that a specific fragment ("fragment specific for mutant FAD3" or discriminant amplicon) is amplified from a nucleic acid sample comprising the specific mutant FAD3 allele. This means that only the specific mutant FAD3 allele, and not another sequence in the plant genome, is amplified under optimized PCR conditions.

Cebadores de la PCR adecuados para la invención pueden ser los siguientes: PCR primers suitable for the invention may be the following:

30 -oligonucleótidos que oscilan en longitud desde 17 nt hasta aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferiblemente 20 nucleótidos consecutivos seleccionada entre la secuencia flanqueante 5’ ó 3’ de un alelo FAD3 mutante específico o el complemento del mismo (es decir, por ejemplo, la secuencia 5' ó 3' que flanquea el uno o más nucleótidos eliminados, insertados o sustituidos en los alelos FAD3 mutantes de la invención, tal como la secuencia 5' ó 3' 30-oligonucleotides ranging in length from 17 nt to about 200 nt, comprising a nucleotide sequence of at least 17 consecutive nucleotides, preferably 20 consecutive nucleotides selected from the 5 'or 3' flanking sequence of a specific mutant FAD3 allele or the complement thereof (ie, for example, the 5 'or 3' sequence flanking the one or more nucleotides removed, inserted or substituted in the mutant FAD3 alleles of the invention, such as the 5 'or 3' sequence

35 que flanquea mutaciones sin sentido, de sentido erróneo, inserción, deleción, de desplazamiento de marco o del sitio de corte y empalme descritas anteriormente o el complemento de las mismas) (reconociendo los cebadores secuencias flanqueantes 5’); o -oligonucleótidos que oscilan en longitud desde 17 nt hasta aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferiblemente 20 nucleótidos 35 flanking nonsense, missense, insertion, deletion, frame shift or splicing site mutations described above or the complement thereof) (recognizing primers 5 ’flanking sequences); or - oligonucleotides ranging in length from 17 nt to about 200 nt, comprising a nucleotide sequence of at least 17 consecutive nucleotides, preferably 20 nucleotides

40 seleccionados de la secuencia de la región de mutación de un alelo FAD3 mutante específico o el complemento del mismo (es decir, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos insertada o sustituida en los genes FAD3 de la invención o el complemento de la misma) (cebadores que reconocen secuencias de mutación). 40 selected from the sequence of the mutation region of a specific mutant FAD3 allele or the complement thereof (i.e., for example, the nucleotide sequence inserted or substituted in the FAD3 genes of the invention or the complement thereof) ( primers that recognize mutation sequences).

Los cebadores pueden, por supuesto, ser más largos que los mencionados 17 nucleótidos consecutivos, y pueden The primers may, of course, be longer than the mentioned 17 consecutive nucleotides, and may

45 ser, por ejemplo, 18, 19, 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt de largo o incluso más. Los cebadores pueden consistir enteramente en secuencia de nucleótidos seleccionadas entre las secuencias de nucleótidos mencionadas de secuencias flanqueantes y de mutación. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos de los cebadores en su extremo 5' (es decir, fuera de los 17 nucleótidos consecutivos 3’-localizados) es menos crítica. Por lo tanto, la secuencia 5' de los cebadores puede consistir en una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias 45 be, for example, 18, 19, 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt long or even more. The primers may consist entirely of nucleotide sequence selected from the aforementioned nucleotide sequences of flanking and mutation sequences. However, the nucleotide sequence of primers at their 5 'end (that is, outside the 17 consecutive 3'-localized nucleotides) is less critical. Therefore, the 5 'sequence of the primers may consist of a nucleotide sequence selected from the sequences

50 flanqueantes o de mutación, según sea apropiado, pero puede contener varios (p. ej., 1, 2, 5, 10) apareamientos erróneos. La secuencia 5' de los cebadores puede incluso consistir por completo en una secuencia de nucleótidos que no guarda relación con las secuencias flanqueantes o de mutación tales como, p. ej., una secuencia de nucleótidos que representa sitios de reconocimiento de enzimas de restricción. Tales secuencias no relacionadas o que flanquean secuencias de ADN con apareamientos erróneos no deberían ser preferiblemente de más de 100, 50 flanking or mutation, as appropriate, but may contain several (eg, 1, 2, 5, 10) erroneous pairings. The 5 'sequence of the primers may even consist entirely of a nucleotide sequence that is unrelated to flanking or mutation sequences such as, e.g. eg, a nucleotide sequence that represents restriction enzyme recognition sites. Such unrelated sequences or flanking DNA sequences with mismatches should preferably not be more than 100,

55 más preferiblemente de más de 50 o incluso de 25 nucleótidos. More preferably more than 50 or even 25 nucleotides.

Además de ello, cebadores adecuados pueden comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos que abarca la región de unión entre las secuencias flanqueantes y de mutación (es decir, por ejemplo, la región de unión entre una secuencia 5' ó 3' que flanquea uno o más nucleótidos eliminados, insertados o sustituidos en los alelos FAD3 mutantes de la invención y la secuencia del uno o más nucleótidos insertados o sustituidos, o la secuencia 3' ó 5', respectivamente, que flanquea el uno o más nucleótidos eliminados tal como la región de unión entre una secuencia 5' ó 3' que flanquea mutaciones sin sentido, de sentido erróneo, de inserción, de deleción, de desplazamiento del marco de lectura o del sitio de corte y empalme en los genes FAD3 de la invención descritas anteriormente y la secuencia de las mutaciones sin sentido, de sentido erróneo o de desplazamiento del marco de lectura, o la región de unión entre una secuencia 5' ó 3 'que flanquea una potencial mutación del codón de PARADA tal como se indica anteriormente o las mutaciones de sustitución indicadas anteriormente y la secuencia de la potencial mutación del codón de PARADA o las mutaciones de sustitución, respectivamente), siempre que la secuencia de nucleótidos no se derive exclusivamente de la región de mutación o de regiones flanqueantes. In addition, suitable primers may comprise or consist of a nucleotide sequence that encompasses the junction region between flanking and mutational sequences (i.e., for example, the binding region between a 5 'or 3' sequence flanking one or more nucleotides deleted, inserted or substituted in the mutant FAD3 alleles of the invention and the sequence of the one or more inserted or substituted nucleotides, or the sequence 3 'or 5', respectively, flanking the one or more nucleotides removed such as the junction region between a 5 'or 3' sequence flanking nonsense, missense, insertion, deletion, displacement mutations of the reading frame or splice site in the FAD3 genes of the invention described above and the sequence of the nonsense, missense or displacement mutations of the reading frame, or the junction region between a 5 'or 3' sequence flanking a potential mu stop codon status as indicated above or the substitution mutations indicated above and the sequence of the potential mutation of the STOP codon or substitution mutations, respectively), provided that the nucleotide sequence is not derived exclusively from the region of mutation or flanking regions.

También resultará inmediatamente evidente para el experto en la materia que pares de cebadores de PCR seleccionados adecuadamente tampoco deberían comprender secuencias complementarias entre sí. It will also be immediately apparent to the person skilled in the art that pairs of properly selected PCR primers should also not comprise complementary sequences to each other.

Para el fin de la invención, el "complemento de una secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID No: X" es la secuencia de nucleótidos que se puede derivar de la secuencia de nucleótidos representada por el reemplazo de los nucleótidos a través de su nucleótido complementario de acuerdo con las reglas de Chargaff (A↔T; G↔C) y la lectura de la secuencia en la dirección 5' a 3', es decir, en dirección opuesta a la secuencia de nucleótidos representada. For the purpose of the invention, the "complement of a nucleotide sequence represented in SEQ ID No: X" is the nucleotide sequence that can be derived from the nucleotide sequence represented by the replacement of nucleotides through their complementary nucleotide. according to the Chargaff rules (A↔T; G↔C) and the sequence reading in the 5 'to 3' direction, that is, in the opposite direction to the nucleotide sequence represented.

Ejemplos de cebadores adecuados para identificar alelos FAD3 mutantes específicos se describen en los Ejemplos. Examples of suitable primers for identifying specific mutant FAD3 alleles are described in the Examples.

Tal como se utiliza en esta memoria, "la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. Z de la posición X a la posición Y" indica la secuencia de nucleótidos incluyendo los dos puntos extremos de los nucleótidos. As used herein, "the nucleotide sequence of SEQ ID No. Z from position X to position Y" indicates the sequence of nucleotides including the two endpoints of the nucleotides.

Preferiblemente, el fragmento amplificado tiene una longitud de entre 50 y 1000 nucleótidos tal como una longitud entre 50 y 500 nucleótidos, o una longitud entre 100 y 350 nucleótidos. Los cebadores específicos pueden tener una secuencia que es entre 80 y 100% idéntica a una secuencia dentro de la región flanqueante 5’ ó 3’, a una secuencia dentro de la región de mutación, o a una secuencia que abarca las regiones flanqueante 5’ ó 3’ y de mutación del alelo FAD3 mutante específico, siempre que los apareamientos erróneos permitan todavía la identificación específica del alelo FAD3 mutante específico con estos cebadores bajo condiciones de PCR optimizadas. El intervalo de apareamientos erróneos permisibles, sin embargo, se puede determinar fácilmente de modo experimental y son conocidos para una persona experta en la técnica. Preferably, the amplified fragment has a length between 50 and 1000 nucleotides such as a length between 50 and 500 nucleotides, or a length between 100 and 350 nucleotides. Specific primers may have a sequence that is between 80 and 100% identical to a sequence within the 5 'or 3' flanking region, a sequence within the mutation region, or a sequence that encompasses the 5 'or flanking regions 3 'and mutation of the specific mutant FAD3 allele, provided that the mismatches still allow specific identification of the specific mutant FAD3 allele with these primers under optimized PCR conditions. The range of permissible mismatches, however, can be easily determined experimentally and are known to a person skilled in the art.

La detección y / o identificación de un "mutante fragmento específico FAD3" pueden ocurrir de varias maneras, por ejemplo, a través de la estimación del tamaño después de la electroforesis en gel o capilar o por medio de métodos de detección basados en fluorescencia. Los fragmentos específicos mutantes FAD3 también se pueden secuenciar directamente. También se conocen otros métodos específicos de secuencia para la detección de fragmentos de ADN amplificados en la técnica. The detection and / or identification of a "FAD3 specific fragment mutant" can occur in several ways, for example, by estimating the size after gel or capillary electrophoresis or by fluorescence-based detection methods. Specific FAD3 mutant fragments can also be sequenced directly. Other specific sequence methods for the detection of DNA fragments amplified in the art are also known.

Protocolos de la PCR estándar se describen en la técnica, tal como en "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2ª edición, 1999) y otras referencias. Las condiciones óptimas para la PCR, incluyendo la secuencia de los cebadores específicos, se especifican en un "protocolo de identificación de la PCR" para cada uno de los alelos FAD3 mutantes específicos. Sin embargo, se entiende que se puede necesitar ajustar un cierto número de parámetros en el protocolo de identificación de la PCR a las condiciones específicas de laboratorio, y se pueden modificar ligeramente para obtener resultados similares. Por ejemplo, el uso de un método diferente para la preparación de ADN puede requerir el ajuste de, por ejemplo, la cantidad de cebadores, polimerasa, concentración de MgCl2 o condiciones de reasociación utilizadas. De manera similar, la selección de otros cebadores puede dictar otras condiciones óptimas para el protocolo de identificación de la PCR. Sin embargo, estos ajustes resultarán evidentes para una persona experta en la técnica, y están, además, detallados en los actuales manuales de aplicación de la PCR, tales como el antes citado. Standard PCR protocols are described in the art, as in "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2nd edition, 1999) and other references. Optimal conditions for PCR, including the sequence of specific primers, are specified in a "PCR identification protocol" for each of the specific mutant FAD3 alleles. However, it is understood that a certain number of parameters in the PCR identification protocol may need to be adjusted to the specific laboratory conditions, and can be modified slightly to obtain similar results. For example, the use of a different method for the preparation of DNA may require the adjustment of, for example, the amount of primers, polymerase, MgCl2 concentration or re-association conditions used. Similarly, the selection of other primers may dictate other optimal conditions for the PCR identification protocol. However, these adjustments will be evident to a person skilled in the art, and are also detailed in the current PCR application manuals, such as the aforementioned.

Alternativamente, se pueden utilizar cebadores específicos para amplificar un fragmento específico FAD3 mutante que puede utilizarse como una "sonda específica" para identificar un alelo FAD3 mutante específico en muestras biológicas. La puesta en contacto del ácido nucleico de una muestra biológica con la sonda, bajo condiciones que permitan la hibridación de la sonda con su correspondiente fragmento en el ácido nucleico, resulta en la formación de un híbrido ácido nucleico/sonda. La formación de este híbrido puede detectarse (p. ej., marcando el ácido nucleico o la sonda), con lo que la formación de este híbrido indica la presencia del alelo FAD3 mutante específico. Tales métodos de identificación basados en la hibridación con una sonda específica (ya sea en un soporte de fase Alternatively, specific primers can be used to amplify a specific mutant FAD3 fragment that can be used as a "specific probe" to identify a specific mutant FAD3 allele in biological samples. The contacting of the nucleic acid of a biological sample with the probe, under conditions that allow hybridization of the probe with its corresponding fragment in the nucleic acid, results in the formation of a hybrid nucleic acid / probe. The formation of this hybrid can be detected (e.g., by marking the nucleic acid or the probe), whereby the formation of this hybrid indicates the presence of the specific mutant FAD3 allele. Such identification methods based on hybridization with a specific probe (either on a phase support

sólida o en disolución) han sido descritos en la técnica. La sonda específica es preferiblemente una secuencia que, bajo condiciones optimizadas, se hibrida específicamente a una región dentro de la región flanqueante 5’ ó 3’ y/o dentro de la región de mutación del alelo FAD3 mutante específico (a la que se alude en lo sucesivo como "región específica de FAD3 mutante"). Preferiblemente, la sonda específica comprende una secuencia de entre 10 y 1000 solid or in solution) have been described in the art. The specific probe is preferably a sequence that, under optimized conditions, specifically hybridizes to a region within the 5 'or 3' flanking region and / or within the mutation region of the specific mutant FAD3 allele (referred to in hereinafter as "specific region of mutant FAD3"). Preferably, the specific probe comprises a sequence between 10 and 1000

5 pb, 50 y 600 pb, entre 100 y 500 pb, entre 150 y 350 pb, que es al menos 80%, preferiblemente entre 80 y 85%, más preferiblemente entre 85 y 90%, con especial preferencia entre 90 y 95%, lo más preferiblemente entre 95% y 100% idéntica (o complementaria) a la secuencia de nucleótidos de una región específica. Preferiblemente, la sonda específica comprenderá una secuencia de aproximadamente 13 a aproximadamente 100 nucleótidos contiguos idénticos (o complementarios) a una región específica del alelo FAD3 mutante específico. 5 bp, 50 and 600 bp, between 100 and 500 bp, between 150 and 350 bp, which is at least 80%, preferably between 80 and 85%, more preferably between 85 and 90%, especially preferably between 90 and 95% , most preferably between 95% and 100% identical (or complementary) to the nucleotide sequence of a specific region. Preferably, the specific probe will comprise a sequence of about 13 to about 100 contiguous nucleotides identical (or complementary) to a specific region of the specific mutant FAD3 allele.

10 Sondas específicas adecuadas para la invención pueden ser las siguientes: -oligonucleótidos que oscilan en longitud entre 13 nt y aproximadamente 1000 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 13 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia flanqueante 5’ ó 3’ de un alelo FAD3 mutante específico o el complemento del mismo (es decir, por ejemplo, la secuencia 5’ ó 3’ que flanquea el uno o más nucleótidos eliminados, insertados o sustituidos en los alelos Specific probes suitable for the invention may be the following: oligonucleotides ranging in length between 13 nt and about 1000 nt, comprising a nucleotide sequence of at least 13 consecutive nucleotides selected from the 5 'or 3' flanking sequence of a specific mutant FAD3 allele or complement thereof (i.e., for example, the 5 'or 3' sequence flanking the one or more nucleotides removed, inserted or substituted in the alleles

15 FAD3 mutantes de la invención, tal como la secuencia 5' ó 3' que flanquea las mutaciones sin sentido, de sentido erróneo, de inserción, de deleción, de desplazamiento del marco o del sitio de corte y empalme descritas anteriormente, o la secuencia 5' ó 3' que flanquea las mutaciones sin sentido, de sentido erróneo, de inserción, de deleción o de desplazamiento del marco), o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de la secuencia con la misma (sondas que reconocen secuencias flanqueantes 5’ ó 3’); u 15 FAD3 mutants of the invention, such as the 5 'or 3' sequence flanking the nonsense, missense, insertion, deletion, displacement of the frame or splice site described above, or the sequence 5 'or 3' flanking nonsense, missense, insertion, deletion or frame shift mutations), or a sequence that has at least 80% sequence identity with it (probes that recognize sequences 5 'or 3' flanks); or

20 -oligonucleótidos que oscilan en longitud entre 13 nt y aproximadamente 1000 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 13 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de mutación de un alelo FAD3 mutante específico o el complemento del mismo (es decir, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos insertados o sustituidos en los genes FAD3 de la invención, o el complemento de la misma), o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la misma (sondas de 20-oligonucleotides ranging in length between 13 nt and about 1000 nt, comprising a nucleotide sequence of at least 13 consecutive nucleotides selected from the mutation sequence of a specific mutant FAD3 allele or complement thereof (i.e., for example , the nucleotide sequence inserted or substituted in the FAD3 genes of the invention, or the complement thereof), or a sequence that has at least 80% sequence identity thereto (probes of

25 reconocimiento de secuencias de mutación). 25 recognition of mutation sequences).

Las sondas pueden consistir enteramente en una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos mencionadas de secuencias flanqueantes y de mutación. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos de las sondas en sus extremos 5' ó 3' es menos crítica. Por lo tanto, las secuencias 5' ó 3' de las sondas pueden consistir en una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias flanqueantes o de mutación, según sea The probes may consist entirely of a nucleotide sequence selected from the aforementioned nucleotide sequences of flanking and mutation sequences. However, the nucleotide sequence of the probes at their 5 'or 3' ends is less critical. Therefore, the 5 'or 3' sequences of the probes may consist of a nucleotide sequence selected from the flanking or mutation sequences, depending on whether

30 apropiado, pero pueden consistir en una secuencia de nucleótidos no relacionada con las secuencias flanqueantes o de mutación. Tales secuencias no relacionadas deben ser preferiblemente no más de 50, más preferiblemente no más de 25 o incluso no más de 20 ó 15 nucleótidos de largo. 30 may be appropriate, but may consist of a nucleotide sequence unrelated to flanking or mutation sequences. Such unrelated sequences should preferably be no more than 50, more preferably no more than 25 or even no more than 20 or 15 nucleotides long.

Además de ello, sondas adecuadas pueden comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos que abarca la región de unión entre las secuencias flanqueantes y de mutación (es decir, por ejemplo, la región de unión entre una 35 secuencia 5' ó 3' que flanquea uno o más nucleótidos eliminados, insertados o sustituidos en los alelos FAD3 mutantes de la invención y la secuencia del uno o más nucleótidos insertados o sustituidos, o la secuencia 3' ó 5', respectivamente, que flanquea el uno o más nucleótidos eliminados tal como la región de unión entre una secuencia 5' ó 3' que flanquea mutaciones sin sentido, de sentido erróneo, de inserción, de deleción, de desplazamiento del marco o del sitio de corte y empalme en los genes FAD3 de la invención arriba descritos y la secuencia de las In addition, suitable probes may comprise or consist of a nucleotide sequence that encompasses the junction region between flanking and mutational sequences (i.e., for example, the binding region between a flanking 5 'or 3' sequence one or more nucleotides removed, inserted or substituted in the mutant FAD3 alleles of the invention and the sequence of the one or more inserted or substituted nucleotides, or the sequence 3 'or 5', respectively, flanking the one or more nucleotides removed such as the junction region between a 5 'or 3' sequence flanking nonsense, missense, insertion, deletion, frame or splice site shifting mutations in the FAD3 genes of the invention described above and the sequence of

40 mutaciones sin sentido, de sentido erróneo, de inserción, de deleción, de desplazamiento del marco o del sitio de corte y empalme), siempre que la secuencia de nucleótidos mencionada no se derive exclusivamente de cualquiera de la región de mutación o regiones flanqueantes. 40 nonsense, missense, insertion, deletion, frame shift or splice site mutations), provided that the nucleotide sequence mentioned does not derive exclusively from any of the mutation region or flanking regions.

Ejemplos de sondas específicas adecuadas para identificar alelos FAD3 mutantes específicos se describen en los Ejemplos. Examples of specific probes suitable for identifying specific mutant FAD3 alleles are described in the Examples.

45 La detección y/o identificación de una "región específica FAD3 mutante" que se hibrida con una sonda específica puede producirse de varias maneras, p. ej., a través de la estimación del tamaño después de la electroforesis en gel The detection and / or identification of a "mutant FAD3 specific region" that hybridizes with a specific probe can occur in several ways, e.g. e.g., by estimating the size after gel electrophoresis

o a través de métodos de detección basados en fluorescencia. También se conocen en la técnica otros métodos específicos para la secuencia para la detección de una " región específica FAD3 mutante" que se hibrida con una sonda específica. or through fluorescence based detection methods. Other methods specific to the sequence for the detection of a "mutant FAD3 specific region" that hybridize with a specific probe are also known in the art.

50 Alternativamente, las plantas o partes de plantas que comprenden uno o más alelos FAD3 mutantes se pueden generar e identificar utilizando otros métodos, tales como el método "Delete-a-gene™", que utiliza la PCR para el rastreo de mutantes de deleción generados por mutagénesis de neutrones rápidos (revisado por Li y Zhang, 2002 Funct Integr Genomics 2:254-258), por el método TILLING (lesiones locales dirigidas inducidas en genomas) que identifica mutaciones puntuales inducidas por EMS utilizando cromatografía líquida desnaturalizante de alta Alternatively, plants or parts of plants comprising one or more mutant FAD3 alleles can be generated and identified using other methods, such as the "Delete-a-gene ™" method, which uses PCR for the detection of deletion mutants generated by rapid neutron mutagenesis (reviewed by Li and Zhang, 2002 Funct Integr Genomics 2: 254-258), by the TILLING method (directed local lesions induced in genomes) that identifies point mutations induced by EMS using high-performance denaturing liquid chromatography

55 resolución (DHPLC) para detectar cambios de pares de bases por análisis heterodúplex (McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18:455, y McCallum et al. 2000, Plant Physiol 123, 439-442), etc. Como se ha mencionado, TILLING utiliza 55 resolution (DHPLC) to detect base pair changes by heteroduplex analysis (McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18: 455, and McCallum et al. 2000, Plant Physiol 123, 439-442), etc. As mentioned, TILLING uses

un rastreo de mutaciones de alto rendimiento (p. ej., utilizando la escisión el 1 de heterodúplex de ADN mutantes-de tipo salvaje y la detección utilizando un sistema de gel de secuenciación). Por lo tanto, el uso de TILLING para identificar plantas o partes de plantas que comprenden uno o más alelos FAD3 mutantes y métodos para generar e identificar tales plantas, órganos de plantas, tejidos y semillas queda abarcado en esta memoria. Así, el método de acuerdo con la invención puede comprender las etapas de mutagenizar semillas de plantas (p. ej., mutagénesis EMS), agrupar individuos de plantas o ADN, la amplificación por PCR de una región de interés, la formación de heterodúplex y la detección de alto rendimiento, la identificación de la planta mutante y la secuenciación del producto PCR mutante. Se entiende que igualmente se pueden utilizar otros métodos de mutagénesis y selección para generar tales plantas mutantes. a high throughput mutation screening (eg, using 1-cleavage of wild-type mutant DNA heteroduplex and detection using a sequencing gel system). Therefore, the use of TILLING to identify plants or parts of plants comprising one or more mutant FAD3 alleles and methods for generating and identifying such plants, plant organs, tissues and seeds is encompassed herein. Thus, the method according to the invention can comprise the steps of mutagenizing plant seeds (eg, EMS mutagenesis), grouping plant or DNA individuals, PCR amplification of a region of interest, heteroduplex formation and High performance detection, identification of the mutant plant and sequencing of the mutant PCR product. It is understood that other methods of mutagenesis and selection can also be used to generate such mutant plants.

En lugar de inducir mutaciones en alelos FAD3, alelos mutantes naturales (espontáneos) pueden ser identificados por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar ECOTILLING (Henikoff et al. 2004, Plant Physiology 135 (2):630-6) para rastrear una pluralidad de plantas o partes de plantas en cuanto a la presencia de alelos FAD3 mutantes naturales. En cuanto a las técnicas de mutagénesis anteriores, preferiblemente se rastrean especies de Brassica son seleccionados que comprenden un genoma A y/o un genoma C, de modo que el alelo FAD3 identificado se puede introducir subsiguientemente en otras especies de Brassica, tales como Brassica napus, mediante cruce (cruces inter-o intra-específicos) y selección. En ECOTILLING polimorfismos naturales en líneas de fecundación o especies relacionadas son rastreados por la metodología TILLING descrita anteriormente, en la que se utilizan plantas individuales o agrupaciones de plantas para la amplificación por PCR de la diana FAD3, la formación de heterodúplex y el análisis de alto rendimiento. Esto puede ser seguido por la selección de plantas individuales que tienen una mutación requerida que se pueden utilizar subsiguientemente en un programa de fecundación para incorporar el alelo mutante deseado. Instead of inducing mutations in FAD3 alleles, natural (spontaneous) mutant alleles can be identified by methods known in the art. For example, ECOTILLING (Henikoff et al. 2004, Plant Physiology 135 (2): 630-6) can be used to track a plurality of plants or parts of plants for the presence of natural mutant FAD3 alleles. As for the previous mutagenesis techniques, Brassica species are preferably screened and selected that comprise a genome A and / or a C genome, so that the identified FAD3 allele can subsequently be introduced into other Brassica species, such as Brassica napus , by crossing (inter-or intra-specific crossings) and selection. In ECOTILLING natural polymorphisms in fertilization lines or related species are tracked by the TILLING methodology described above, in which individual plants or plant clusters are used for PCR amplification of the FAD3 target, heteroduplex formation and high analysis performance. This can be followed by the selection of individual plants that have a required mutation that can subsequently be used in a fertilization program to incorporate the desired mutant allele.

A continuación, los alelos mutantes identificados se pueden secuenciar y la secuencia se puede comparar con el alelo de tipo salvaje para identificar la o las mutaciones. Opcionalmente, la funcionalidad se puede testar tal como se indicó anteriormente. Utilizando este enfoque se puede identificar una pluralidad de alelos FAD3 mutantes (y plantas de Brassica que comprenden uno o más de éstos). Los alelos mutantes deseados se pueden combinar con los alelos de tipo salvaje deseados por métodos de cruzamiento y selección tal como se describen más adelante. Finalmente se genera una única planta que comprende el número deseado de alelos FAD3 mutantes y el número deseado alelos FAD3 de tipo salvaje. Next, the identified mutant alleles can be sequenced and the sequence can be compared with the wild type allele to identify the mutations (s). Optionally, the functionality can be tested as indicated above. Using this approach, a plurality of mutant FAD3 alleles (and Brassica plants comprising one or more of these) can be identified. The desired mutant alleles can be combined with the desired wild-type alleles by cross-breeding and selection methods as described below. Finally, a single plant is generated comprising the desired number of mutant FAD3 alleles and the desired number of wild-type FAD3 alleles.

También se pueden utilizar oligonucleótidos adecuados como cebadores de PCR o sondas específicas para la detección de un alelo FAD3 mutante específico para el desarrollo de métodos para determinar el estado de zigosidad del alelo FAD3 mutante específico. Suitable oligonucleotides can also be used as PCR primers or specific probes for the detection of a specific mutant FAD3 allele for the development of methods for determining the zygosity state of the specific mutant FAD3 allele.

Para determinar el estado de zigosidad de un alelo FAD3 mutante específico, se puede desarrollar un ensayo basado en PCR para determinar la presencia de un alelo específico FAD3 mutante y/o de tipo salvaje correspondiente: To determine the zygosity status of a specific mutant FAD3 allele, a PCR-based assay can be developed to determine the presence of a specific mutant and / or wild-type FAD3 specific allele:

Para determinar el estado de zigosidad de un alelo FAD3 mutante específico, se pueden diseñar dos cebadores que reconocen específicamente el alelo FAD3 de tipo salvaje de tal manera que estén dirigidos uno hacia el otro y tengan la región de mutación situada entre los cebadores. Estos cebadores pueden ser cebadores que reconocen específicamente las secuencias 5’ y 3’ flanqueantes', respectivamente. Este conjunto de cebadores permite la amplificación por PCR diagnóstica simultánea del alelo mutante, así como del correspondiente alelo FAD3 de tipo salvaje. To determine the zygosity state of a specific mutant FAD3 allele, two primers can be designed that specifically recognize the wild-type FAD3 allele such that they are directed towards each other and have the mutation region located between the primers. These primers can be primers that specifically recognize the 5 ’and 3’ flanking sequences, respectively. This set of primers allows simultaneous diagnostic PCR amplification of the mutant allele, as well as the corresponding wild-type FAD3 allele.

Alternativamente, para determinar el estado de zigosidad de un alelo FAD3 mutante específico, se pueden diseñar dos cebadores que reconocen específicamente el alelo FAD3 de tipo salvaje de tal manera que estén dirigidos uno hacia el otro y que uno de ellos reconozca específicamente la región de mutación. Estos cebadores pueden ser cebadores que reconocen específicamente la secuencia de la región flanqueante 5' ó 3' y la región de mutación del alelo FAD3 de tipo salvaje, respectivamente. Este conjunto de cebadores, junto con un tercer cebador que reconoce específicamente la secuencia de la región de mutación en el alelo FAD3 mutante, permite la amplificación por PCR diagnóstica simultánea del gen FAD3 mutante, así como del gen FAD3 de tipo salvaje. Alternatively, to determine the zygosity state of a specific mutant FAD3 allele, two primers can be designed that specifically recognize the wild-type FAD3 allele such that they are directed toward each other and that one of them specifically recognizes the mutation region . These primers can be primers that specifically recognize the sequence of the 5 'or 3' flanking region and the mutation region of the wild-type FAD3 allele, respectively. This set of primers, together with a third primer that specifically recognizes the sequence of the mutation region in the mutant FAD3 allele, allows simultaneous diagnostic PCR amplification of the mutant FAD3 gene, as well as the wild-type FAD3 gene.

Alternativamente, para determinar el estado de zigosidad de un alelo FAD3 mutante específico, se pueden diseñar dos cebadores que reconocen específicamente el alelo FAD3 de tipo salvaje de tal manera que estén dirigidos uno hacia el otro y que uno de ellos reconozca específicamente la región de unión entre la región flanqueante 5' ó 3' y la región de mutación. Estos cebadores pueden ser cebadores que reconocen específicamente la secuencia flanqueante 5' ó 3' y la región de unión entre la región de mutación y la región flanqueante 3' ó 5' del alelo FAD3 de tipo salvaje, respectivamente. Este conjunto de cebadores, junto con un tercer cebador que reconoce específicamente la región de unión entre la región de mutación y la región flanqueante 3' ó 5' del alelo FAD3 Alternatively, to determine the zygosity state of a specific mutant FAD3 allele, two primers that specifically recognize the wild-type FAD3 allele can be designed such that they are directed toward each other and that one of them specifically recognizes the binding region between the 5 'or 3' flanking region and the mutation region. These primers can be primers that specifically recognize the 5 'or 3' flanking sequence and the junction region between the mutation region and the 3 'or 5' flanking region of the wild-type FAD3 allele, respectively. This set of primers, together with a third primer that specifically recognizes the junction region between the mutation region and the 3 'or 5' flanking region of the FAD3 allele

mutante, respectivamente, permite la amplificación por PCR diagnóstica simultánea del gen FAD3 mutante, así como del gen FAD3 de tipo salvaje. The mutant, respectively, allows simultaneous diagnostic PCR amplification of the mutant FAD3 gene, as well as the wild-type FAD3 gene.

Alternativamente, el estado de zigosidad de un alelo FAD3 mutante específico se puede determinar utilizando conjuntos de cebadores alternativos que reconocen específicamente alelos FAD3 mutantes y de tipo salvaje. Alternatively, the zygosity state of a specific mutant FAD3 allele can be determined using alternative primer sets that specifically recognize mutant and wild-type FAD3 alleles.

Si la planta es homocigótica para el alelo FAD3 mutante o el correspondiente alelo FAD3 de tipo salvaje, los ensayos de PCR diagnóstica descritos anteriormente darán lugar a un único producto de PCR típico, preferiblemente típico en longitud, ya sea para el alelo FAD3 mutante o de tipo salvaje. Si la planta es heterocigótica para el alelo FAD3 mutante, aparecerán dos productos de PCR específicos, reflejando tanto la amplificación del alelo FAD3 mutante como del de tipo salvaje. If the plant is homozygous for the mutant FAD3 allele or the corresponding wild-type FAD3 allele, the diagnostic PCR assays described above will result in a single typical PCR product, preferably typical in length, either for the mutant FAD3 allele or wild guy If the plant is heterozygous for the mutant FAD3 allele, two specific PCR products will appear, reflecting both the amplification of the mutant FAD3 and the wild-type allele.

La identificación de los productos de PCR específicos para FAD3 de tipo salvaje y mutantes se puede producir, p. ej., mediante la estimación del tamaño después electroforesis en gel o capilar (p. ej., para alelos FAD3 mutantes que comprenden un cierto número de nucleótidos insertados o eliminados que resulta en una diferencia de tamaño entre los fragmentos amplificados a partir del alelo FAD3 de tipo salvaje y el mutante, de manera que dichos fragmentos se pueden separar de forma visible en un gel); mediante la evaluación de la presencia o ausencia de los dos fragmentos diferentes después de electroforesis en gel o capilar, con lo que la amplificación por PCR diagnóstica del alelo FAD3 mutante puede, opcionalmente, llevarse a cabo por separado de la amplificación por PCR diagnóstica del alelo FAD3 de tipo salvaje; por secuenciación directa de los fragmentos amplificados; o por métodos de detección basados en fluorescencia. Identification of the specific PCR products for wild-type and mutant FAD3 can occur, e.g. e.g., by estimating the size after gel or capillary electrophoresis (e.g., for mutant FAD3 alleles comprising a certain number of inserted or deleted nucleotides resulting in a difference in size between the fragments amplified from the FAD3 allele wild-type and the mutant, so that said fragments can be visibly separated on a gel); by evaluating the presence or absence of the two different fragments after gel or capillary electrophoresis, whereby the diagnostic PCR amplification of the mutant FAD3 allele can, optionally, be carried out separately from the diagnostic PCR amplification of the allele FAD3 wild type; by direct sequencing of the amplified fragments; or by fluorescence based detection methods.

Ejemplos de cebadores adecuados para determinar la zigosidad de alelos FAD3 mutantes específicos se describen en los Ejemplos. Examples of suitable primers for determining the zygosity of specific mutant FAD3 alleles are described in the Examples.

Alternativamente, para determinar el estado de zigosidad de un alelo FAD3 mutante específico, se puede desarrollar un ensayo basado en la hibridación para determinar la presencia de un de un alelo FAD3 específico mutante y/o de tipo salvaje correspondiente: Alternatively, to determine the zygosity status of a specific mutant FAD3 allele, a hybridization-based assay can be developed to determine the presence of a corresponding mutant and / or wild-type FAD3 specific allele:

Para determinar el estado de zigosidad de un alelo FAD3 mutante específico, se pueden diseñar dos sondas específicas que reconozcan el alelo FAD3 de tipo salvaje de tal manera que cada una de las sondas reconozca específicamente una secuencia dentro del alelo de tipo salvaje FAD3 y que la región de mutación esté situada entre las secuencias reconocidas por las sondas. Estas sondas pueden ser sondas que reconocen específicamente las secuencias flanqueantes 5' y 3', respectivamente. El uso de una o, preferiblemente, de ambas de estas sondas permite la hibridación diagnóstica simultánea del alelo mutante, así como del correspondiente alelo FAD3 de tipo salvaje. To determine the zygosity state of a specific mutant FAD3 allele, two specific probes can be designed that recognize the wild-type FAD3 allele so that each of the probes specifically recognizes a sequence within the FAD3 wild-type allele and that the mutation region is located between the sequences recognized by the probes. These probes can be probes that specifically recognize the 5 'and 3' flanking sequences, respectively. The use of one or, preferably, of both of these probes allows simultaneous diagnostic hybridization of the mutant allele, as well as the corresponding wild-type FAD3 allele.

Alternativamente, para determinar el estado de zigosidad de un alelo FAD3 mutante específico, se pueden diseñar dos sondas específicas que reconozcan el alelo FAD3 de tipo salvaje de tal manera que cada una de ellas reconozca específicamente una secuencia dentro del alelo de tipo salvaje FAD3 aguas arriba o aguas abajo de la región de mutación, preferiblemente aguas arriba de la región de mutación, y que una de ellas reconozca específicamente la región de mutación. Estas sondas pueden ser sondas que reconocen específicamente la secuencia de la región flanqueante 5' ó 3', preferiblemente la región flanqueante 5’ y la región de mutación del alelo FAD3 de tipo salvaje, respectivamente. El uso de una o, preferiblemente, de ambas de estas sondas, opcionalmente junto con una tercera sonda que específicamente reconoce la secuencia de la región de mutación en el alelo FAD3 mutante, permite la hibridación diagnóstica del alelo mutante y del gen FAD3 de tipo salvaje. Alternatively, to determine the zygosity state of a specific mutant FAD3 allele, two specific probes can be designed that recognize the wild-type FAD3 allele so that each of them specifically recognizes a sequence within the upstream wild-type FAD3 allele. or downstream of the mutation region, preferably upstream of the mutation region, and that one of them specifically recognizes the mutation region. These probes may be probes that specifically recognize the sequence of the 5 'or 3' flanking region, preferably the 5 'flanking region and the wild-type FAD3 allele mutation region, respectively. The use of one or, preferably, of both of these probes, optionally together with a third probe that specifically recognizes the sequence of the mutation region in the mutant FAD3 allele, allows diagnostic hybridization of the mutant allele and the wild-type FAD3 gene .

Alternativamente, para determinar el estado de zigosidad de un alelo FAD3 mutante específico, se puede diseñar una sonda específica que reconozca el alelo FAD3 de tipo salvaje de tal manera que la sonda reconozca específicamente la región de unión flanqueante 5' ó 3', preferiblemente la región flanqueante 5’ y la región de mutación del alelo FAD3 de tipo salvaje. La sonda, opcionalmente junto con una segunda sonda que específicamente reconoce la región de unión entre la región flanqueante 5' ó 3', preferiblemente la región flanqueante 5’, y la región de mutación del alelo FAD3 mutante, permite la hibridación diagnóstica del alelo mutante y del gen FAD3 mutante y de tipo salvaje. Alternatively, to determine the zygosity state of a specific mutant FAD3 allele, a specific probe can be designed that recognizes the wild-type FAD3 allele such that the probe specifically recognizes the 5 'or 3' flanking junction region, preferably the 5 'flanking region and the wild-type FAD3 allele mutation region. The probe, optionally together with a second probe that specifically recognizes the junction region between the 5 'or 3' flanking region, preferably the 5 'flanking region, and the mutation region of the mutant FAD3 allele, allows diagnostic hybridization of the mutant allele and of the mutant and wild-type FAD3 gene.

Alternativamente, el estado de zigosidad de un alelo FAD3 mutante específico se puede determinar utilizando conjuntos alternativos de sondas que reconocen específicamente alelos FAD3 mutantes y de tipo salvaje. Alternatively, the zygosity state of a specific mutant FAD3 allele can be determined using alternative sets of probes that specifically recognize mutant and wild-type FAD3 alleles.

Si la planta es homocigótica para el gen FAD3 mutante o el correspondiente gen FAD3 de tipo salvaje, los ensayos de hibridación diagnóstica descritos anteriormente darán lugar a un único producto de hibridación específico tales If the plant is homozygous for the mutant FAD3 gene or the corresponding wild-type FAD3 gene, the diagnostic hybridization assays described above will result in a single specific hybridization product such

como uno o más fragmentos de ADN de hibridación (restricción), típicos, preferiblemente típicos en longitud, ya sea para el alelo FAD3 mutante o de tipo salvaje. Si la planta es heterocigótica para el alelo FAD3 mutante, aparecerán dos productos de hibridación específicos, que reflejan tanto la hibridación del alelo FAD3 mutante y de tipo salvaje. as one or more hybridization (restriction) DNA fragments, typical, preferably typical in length, either for the mutant or wild-type FAD3 allele. If the plant is heterozygous for the mutant FAD3 allele, two specific hybridization products will appear, reflecting both the hybridization of the mutant and wild-type FAD3 allele.

La identificación de los productos de hibridación específicos para FAD3 de tipo salvaje y mutante se puede producir, Identification of hybridization products specific for wild-type and mutant FAD3 can occur,

p. ej., mediante la estimación del tamaño después de electroforesis en gel o capilar (p. ej., para alelos FAD3 mutantes que comprenden un cierto número de nucleótidos insertados o eliminados que resulta en una diferencia de tamaño entre los fragmentos de ADN hibridante (de restricción) del alelo FAD3 de tipo salvaje y mutante, de manera que dichos fragmentos se pueden separar de forma visible en un gel); evaluando la presencia o ausencia de los dos productos de hibridación específicos diferentes después de electroforesis en gel o capilar, con lo que la hibridación diagnóstica del alelo FAD3 mutante puede llevarse a cabo, opcionalmente, por separado de la hibridación diagnóstica del alelo FAD3 de tipo salvaje; por secuenciación directa de los fragmentos de ADN hibridante (de restricción); o por métodos de detección basados en fluorescencia. p. e.g., by estimating the size after gel or capillary electrophoresis (e.g., for mutant FAD3 alleles comprising a certain number of inserted or deleted nucleotides resulting in a difference in size between the hybridizing DNA fragments (from restriction) of the wild-type and mutant FAD3 allele, so that said fragments can be visibly separated on a gel); evaluating the presence or absence of the two different specific hybridization products after gel or capillary electrophoresis, whereby the diagnostic hybridization of the mutant FAD3 allele can optionally be carried out separately from the diagnostic hybridization of the wild type FAD3 allele ; by direct sequencing of the hybridizing (restriction) DNA fragments; or by fluorescence based detection methods.

Ejemplos de sondas adecuadas para determinar la zigosidad de alelos FAD3 mutantes específicos se describen en los Ejemplos. Examples of suitable probes for determining the zygosity of specific mutant FAD3 alleles are described in the Examples.

Además de ello, también se pueden desarrollar métodos de detección específicos para un alelo FAD3 mutante específico que difieren de métodos de amplificación basados en PCR o en la hibridación utilizando la información específica de la secuencia específica de alelo FAD3 mutante proporcionada en esta memoria. Tales métodos de detección alternativos incluyen métodos lineales de detección de la amplificación de la señal basados en la escisión invasiva de estructuras particulares de ácidos nucleicos, también conocida como tecnología Invader™, (tal como se describe, p. ej., en las patentes US. Nºs. 5.985.557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6.001.567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage), los métodos de detección basados en RT-PCR, tal como Taqman, u otros métodos de detección, tal como SNPlex. Brevemente, en la tecnología Invader™, la secuencia de mutación diana puede ser, p. ej., hibridada con un primer oligonucleótido de ácido nucleico marcado que comprende la secuencia de nucleótidos de la secuencia de mutación o una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante 5' y la región de mutación y con un segundo oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia flanqueante 3' inmediatamente aguas abajo y adyacente a la secuencia de mutación, en donde el primer y segundo oligonucleótidos se solapan por al menos un nucleótido. La estructura dúplex o triplex que se produce por esta hibridación permite una escisión selectiva de la sonda con una enzima (Cleavase®), dejando intacta la secuencia diana. La sonda marcada escindida se detecta posteriormente, posiblemente a través de una etapa intermedia que resulta en una amplificación adicional de la señal. In addition, specific detection methods for a specific mutant FAD3 allele that differ from amplification methods based on PCR or hybridization can also be developed using the specific sequence information of mutant FAD3 allele provided herein. Such alternative detection methods include linear methods of signal amplification detection based on invasive cleavage of particular nucleic acid structures, also known as Invader ™ technology, (as described, e.g., in US Pat. No. 5,985,557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6,001,567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage), RT-PCR based detection methods, such as Taqman, or other detection methods, such as SNPlex Briefly, in Invader ™ technology, the target mutation sequence may be, eg, hybridized with a first labeled nucleic acid oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of the mutation sequence or a sequence that encompasses the binding region between the 5 'flanking region and the mutation region and with a second nucleic acid oligonucleotide comprising the 3' flanking sequence immediately downstream jo and adjacent to the mutation sequence, wherein the first and second oligonucleotides overlap by at least one nucleotide. The duplex or triplex structure produced by this hybridization allows selective excision of the probe with an enzyme (Cleavase®), leaving the target sequence intact. The cleaved labeled probe is subsequently detected, possibly through an intermediate stage that results in further amplification of the signal.

Un "kit", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un conjunto de reactivos con el fin de realizar el método de la invención, más particularmente, la identificación de un alelo FAD3 mutante específico en muestras biológicas o la determinación del estado de zigosidad de material vegetal que comprende un alelo FAD3 mutante específico. Más particularmente, el kit puede comprender al menos dos cebadores específicos, tal como se describe anteriormente, para la identificación de un alelo FAD3 mutante específico, o al menos dos o tres cebadores específicos para la determinación del estado de zigosidad. Opcionalmente, el kit puede comprender, además, cualquier otro reactivo descrito en esta memoria en el protocolo de identificación por PCR. Alternativamente, el kit puede comprender al menos una sonda específica que se hibrida específicamente con ácido nucleico de muestras biológicas para identificar la presencia de un alelo FAD3 mutante específico en el mismo, tal como se describe anteriormente, para la identificación de un alelo FAD3 mutante específico, o al menos dos o tres sondas específicas para la determinación del estado de zigosidad. Opcionalmente, el kit puede comprender, además, cualquier otro reactivo (tal como, pero no limitado a tampón de hibridación, marcador) para la identificación de un alelo FAD3 mutante específico en muestras biológicas, utilizando la sonda específica. A "kit", as used herein, refers to a set of reagents in order to perform the method of the invention, more particularly, the identification of a specific mutant FAD3 allele in biological samples or the determination of the state of zygosity of plant material comprising a specific mutant FAD3 allele. More particularly, the kit may comprise at least two specific primers, as described above, for the identification of a specific mutant FAD3 allele, or at least two or three specific primers for the determination of the zygosity state. Optionally, the kit may further comprise any other reagent described herein in the PCR identification protocol. Alternatively, the kit may comprise at least one specific probe that specifically hybridizes with biological sample nucleic acid to identify the presence of a specific mutant FAD3 allele therein, as described above, for the identification of a specific mutant FAD3 allele. , or at least two or three specific probes for the determination of the state of zigosity. Optionally, the kit may further comprise any other reagent (such as, but not limited to hybridization buffer, label) for the identification of a specific mutant FAD3 allele in biological samples, using the specific probe.

El kit de la invención puede utilizarse, y sus componentes se pueden ajustar específicamente, para fines de control de calidad (p. ej., pureza de lotes de semillas), detección de la presencia o ausencia de un alelo FAD3 mutante específico en material vegetal o material que comprende o se deriva de material vegetal tal como, pero no limitado a productos alimenticios o piensos. The kit of the invention can be used, and its components can be specifically adjusted, for quality control purposes (e.g., seed batch purity), detection of the presence or absence of a specific mutant FAD3 allele in plant material or material comprising or derived from plant material such as, but not limited to food products or feed.

El término "cebador", tal como se utiliza en esta memoria, abarca cualquier ácido nucleico que es capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente del molde, tal como PCR. Típicamente, los cebadores son oligonucleótidos de 10 a 30 nucleótidos, pero se pueden emplear secuencias más largas. Los cebadores se pueden proporcionar en forma de doble cadena, aunque se prefiere la forma de cadena sencilla. Las sondas se pueden utilizar como cebadores, pero están diseñados para unirse al ADN o ARN diana y no necesitan ser utilizados en un proceso de amplificación. The term "primer," as used herein, encompasses any nucleic acid that is capable of priming the synthesis of a nascent nucleic acid in a template-dependent process, such as PCR. Typically, the primers are 10 to 30 nucleotide oligonucleotides, but longer sequences can be employed. The primers can be provided in a double chain form, although the single chain form is preferred. The probes can be used as primers, but are designed to bind to the target DNA or RNA and do not need to be used in an amplification process.

El término "reconocer", tal como se utiliza en esta memoria cuando se refiere a cebadores específicos, se refiere al hecho de que los cebadores específicos se hibridan específicamente a una secuencia de ácido nucleico en un alelo FAD3 mutante específico bajo las condiciones establecidas en el método (tales como las condiciones del protocolo de identificación por PCR), con lo que la especificidad es determinada por la presencia de controles positivos y The term "recognize", as used herein when referring to specific primers, refers to the fact that specific primers specifically hybridize to a nucleic acid sequence in a specific mutant FAD3 allele under the conditions set forth in the method (such as the conditions of the PCR identification protocol), whereby the specificity is determined by the presence of positive controls and

5 negativos. 5 negatives

El término "hibridar", tal como se utiliza en esta memoria cuando se hace referencia a sondas específicas, se refiere al hecho de que la sonda se une a una región específica en la secuencia de ácido nucleico de un alelo FAD3 específico (mutante o de tipo salvaje) bajo condiciones de rigurosidad estándares. Condiciones de rigurosidad estándares, tal como se utiliza en esta memoria, se refieren a las condiciones de hibridación descritas en esta 10 memoria o a las condiciones de hibridación convencionales tal como se describe por Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que, por ejemplo, puede comprender las etapas siguientes: 1) inmovilizar fragmentos de ADN genómico de plantas o ADN de bancos BAC en un filtro, 2) prehibridar el filtro durante 1 a 2 horas a 65°C en 6 X SSC, reactivo de 5 X Denhardt, SDS al 0,5% y 20 µg/ml de ADN de soporte desnaturalizado, 3) añadir la sonda de hibridación que ha sido marcada, The term "hybridize," as used herein when referring to specific probes, refers to the fact that the probe binds to a specific region in the nucleic acid sequence of a specific FAD3 allele (mutant or wild type) under standard stringency conditions. Standard stringency conditions, as used herein, refer to the hybridization conditions described herein or to conventional hybridization conditions as described by Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) which, for example, may comprise the following steps: 1) immobilize plant genomic DNA fragments or BAC bank DNA in a filter, 2) pre-inhibit the filter for 1 to 2 hours at 65 ° C in 6 X SSC, 5 X Denhardt reagent, 0.5% SDS and 20 µg / ml denatured support DNA, 3) add the hybridization probe that has been labeled,

15 4) incubar durante 16 a 24 horas, 5) lavar el filtro una vez durante 30 min. a 68°C en 6X SSC, SDS al 0,1%, 6) lavar el filtro tres veces (dos veces durante 30 min en 30 ml y una vez durante 10 min en 500 ml) a 68°C en 2 X SSC, SDS al 0,1% y 7) exponer el filtro durante 4 a 48 horas a una película de rayos X a -70°C. 15 4) incubate for 16 to 24 hours, 5) wash the filter once for 30 min. at 68 ° C in 6X SSC, 0.1% SDS, 6) wash the filter three times (twice for 30 min in 30 ml and once for 10 min in 500 ml) at 68 ° C in 2 X SSC, 0.1% SDS and 7) expose the filter for 4 to 48 hours to an X-ray film at -70 ° C.

Tal como se utiliza en esta memoria, una "muestra biológica" es una muestra de una planta, material vegetal o producto que comprende material vegetal. El término "planta" pretende abarcar tejidos vegetales, en cualquier etapa 20 de madurez, así como cualesquiera células, tejidos u órganos tomados de o derivados de cualquier planta, incluyendo, sin limitación, cualesquiera semillas, hojas, tallos, flores, raíces, células individuales, gametos, cultivos celulares, cultivos de tejidos o protoplastos. "Material vegetal", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a material que se obtiene o se deriva de una planta. Productos que comprenden material vegetal se refieren a alimentos, piensos u otros productos que son producidos utilizando material vegetal o que pueden estar As used herein, a "biological sample" is a sample of a plant, plant material or product comprising plant material. The term "plant" is intended to cover plant tissues, at any stage 20 of maturity, as well as any cells, tissues or organs taken from or derived from any plant, including, without limitation, any seeds, leaves, stems, flowers, roots, cells individual, gametes, cell cultures, tissue cultures or protoplasts. "Plant material", as used herein, refers to material that is obtained or derived from a plant. Products comprising plant material refer to food, feed or other products that are produced using plant material or that may be

25 contaminados por material vegetal. Se entiende que, en el contexto de la presente invención, muestras biológicas de este tipo se testan para determinar la presencia de ácidos nucleicos específicos para un alelo FAD3 mutante específico, implicando la presencia de ácidos nucleicos en las muestras. Así, los métodos a los que se alude en esta memoria para identificar un alelo FAD3 mutante específico en muestras biológicas se refieren a la identificación en muestras biológicas de ácidos nucleicos que comprenden el alelo FAD3 mutante específico. 25 contaminated by plant material. It is understood that, in the context of the present invention, biological samples of this type are tested to determine the presence of specific nucleic acids for a specific mutant FAD3 allele, involving the presence of nucleic acids in the samples. Thus, the methods referred to herein to identify a specific mutant FAD3 allele in biological samples refer to the identification in biological samples of nucleic acids comprising the specific mutant FAD3 allele.

30 La presente invención describe también la combinación de alelos FAD3 específicos en una planta, a la transferencia de uno o mutante alelos FAD3 mutantes específicos de una planta a otra planta, a las plantas que comprenden uno The present invention also describes the combination of specific FAD3 alleles in a plant, to the transfer of one or mutant FAD3 mutant alleles specific from one plant to another plant, to plants comprising one

o más alelos FAD3 mutantes específicos, a la progenie obtenida a partir de estas plantas y a células vegetales, partes de plantas y semillas de plantas derivadas de estas plantas. or more specific mutant FAD3 alleles, to the progeny obtained from these plants and to plant cells, parts of plants and plant seeds derived from these plants.

Así, se describe un método para combinar dos o más alelos FAD3 mutantes seleccionados en una planta, que 35 comprende las etapas de: Thus, a method for combining two or more selected FAD3 mutant alleles in a plant is described, which comprises the steps of:

a. to.: generar y/o identificar dos o más plantas que comprenden cada una uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados, tal como se describe anteriormente, generate and / or identify two or more plants each comprising one or more selected FAD3 mutant alleles, as described above,

b. b.: cruzar una primera planta que comprende uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados con una segunda planta que comprende uno o más de otros alelos FAD3 mutantes seleccionados, recoger semillas F1 del cruce cross a first plant comprising one or more selected FAD3 mutant alleles with a second plant comprising one or more other selected mutant FAD3 alleles, collect F1 seeds from the cross

40 y, opcionalmente, identificar una planta F1 que comprende uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados de la primera planta con uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados de la segunda planta, tal como se describió anteriormente, 40 and, optionally, identify an F1 plant comprising one or more mutant FAD3 alleles selected from the first plant with one or more mutant FAD3 alleles selected from the second plant, as described above,

c. opcionalmente, repetir la etapa (b) hasta obtener una planta F1 que comprenda todos los alelos FAD3 mutantes seleccionados, 45 d. opcionalmente, -identificar una planta F1, que es homocigótica o heterocigótica para un alelo FAD3 mutante seleccionado determinando el estado de zigosidad de los alelos FAD3 mutantes, tal como se describió anteriormente, o -generar plantas que sean homocigóticas para uno o más de los alelos FAD3 mutantes seleccionados realizando una de las siguientes etapas: 50 -extraer plantas doble haploides a partir de células de microsporas o polen tratadas de plantas F1 que comprenden el uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados, tal como se describió anteriormente, C. optionally, repeat step (b) until obtaining an F1 plant comprising all the selected mutant FAD3 alleles, 45 d. optionally, -identify an F1 plant, which is homozygous or heterozygous for a mutant FAD3 allele selected by determining the zygosity status of the mutant FAD3 alleles, as described above, or -generate plants that are homozygous for one or more of the alleles FAD3 mutants selected by performing one of the following steps: - extracting double haploid plants from microspore or pollen cells treated from F1 plants comprising the one or more selected mutant FAD3 alleles, as described above,

--: autofecundar las plantas F1 que comprende el uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados durante una o más generaciones (y), recoger semillas Sy de F1 de las autofecundaciones e identificar plantas Sy de F1, que son homocigóticas para el uno o más alelos FAD3 mutantes, tal como se self-fertilize the F1 plants comprising the one or more mutant FAD3 alleles selected for one or more generations (and), collect F1 Sy seeds from the self-fertilization and identify F1 F1 plants, which are homozygous for the one or more mutant FAD3 alleles, as it

55 describió anteriormente. 55 described above.

También se describe un método para transferir uno o más alelos FAD3 mutantes de una planta a otra planta, que comprende las etapas de: A method for transferring one or more mutant FAD3 alleles from one plant to another plant, comprising the steps of:

a. generar y/o identificar una primera planta que comprende uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados, tal como se describió anteriormente, o generar la primera planta combinando el uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados en una planta, tal como se describió anteriormente (en donde la primera planta es homocigótica o heterocigótica para el uno o más alelos FAD3 mutantes) to. generate and / or identify a first plant comprising one or more selected mutant FAD3 alleles, as described above, or generate the first plant by combining the one or more selected FAD3 mutant alleles in a plant, as described above (where described above) the first plant is homozygous or heterozygous for the one or more mutant FAD3 alleles)

5 b. cruzar la primera planta que comprende el uno o más alelos FAD3 mutantes con una segunda planta que no comprende el uno o más alelos FAD3 mutantes, recoger semillas F1 del cruce (en donde las semillas son heterocigóticas para un alelo FAD3 mutante si la primera planta era homocigótica para ese alelo FAD3 mutante, y en el que la mitad de las semillas son heterocigóticas y la mitad de las semillas son azigóticas para, es decir, no comprenden un alelo FAD3 mutante, si la primera planta era heterocigótica para ese alelo 5 b. cross the first plant comprising the one or more mutant FAD3 alleles with a second plant that does not comprise the one or more mutant FAD3 alleles, collect F1 seeds from the crossing (where the seeds are heterozygous for a mutant FAD3 allele if the first plant was homozygous for that mutant FAD3 allele, and in which half of the seeds are heterozygous and half of the seeds are azigotic for, that is, they do not comprise a mutant FAD3 allele, if the first plant was heterozygous for that allele

10 FAD3 mutante) y, opcionalmente, identificar plantas F1 que comprenden uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados, tal como se describió anteriormente, 10 mutant FAD3) and, optionally, identify F1 plants comprising one or more selected mutant FAD3 alleles, as described above,

c. retrocruzar plantas F1 que comprenden uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados con la segunda planta que no comprende el uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados durante una o más generaciones (x), recoger semillas BCx de los cruces, e identificar en cada generación plantas BCx que C. backcross F1 plants comprising one or more mutant FAD3 alleles selected with the second plant that does not comprise the one or more mutant FAD3 alleles selected for one or more generations (x), collect BCx seeds from the crosses, and identify in each generation BCx plants that

15 comprenden el uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados, tal como se describió anteriormente, 15 comprise the one or more selected mutant FAD3 alleles, as described above,

d. opcionalmente, generar plantas BCx que sean homocigóticas para el uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados realizando una de las siguientes etapas: -extraer plantas doble haploides a partir de células de microsporas o polen tratadas de plantas BCx que d. optionally, generating BCx plants that are homozygous for the one or more FAD3 mutant alleles selected by performing one of the following steps: - extracting double haploid plants from microspore or pollen cells treated from BCx plants that

comprenden el uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados, tal como se describió anteriormente, comprise the one or more selected mutant FAD3 alleles, as described above,

20 -autofecundar las plantas BCx que comprende el uno o más alelos FAD3 mutantes seleccionados durante una o más generaciones (y), recoger semillas Sy de BCx de las autofecundaciones e identificar plantas Sy de BCx, que son homocigóticas para el uno o más alelos FAD3 mutantes deseados, tal como se describió anteriormente. 20-self-fertilize the BCx plants comprising the one or more mutant FAD3 alleles selected for one or more generations (and), collect Sy seeds of BCx from the self-fertilization and identify Sy plants of BCx, which are homozygous for the one or more FAD3 alleles desired mutants, as described above.

La primera y la segunda planta son plantas Brassicaceae, particularmente plantas de Brassica, especialmente The first and second plants are Brassicaceae plants, particularly Brassica plants, especially

25 plantas de Brassica napus o plantas de otra especie de cultivo de Brassica. La primera planta es una planta Brassicaceae, particularmente una planta de Brassica, especialmente una plantas de Brassica napus o una planta de otra especie de cultivo de Brassica, y la segunda planta puede ser una planta de una línea de cultivo de Brassicaceae, en particular de una línea de cultivo de Brassica, especialmente de una línea de cultivo de Brassica napus o de una línea de cultivo de especies de cultivo de Brassica. "Línea de cultivo", tal como se utiliza en esta 25 plants of Brassica napus or plants of another Brassica crop species. The first plant is a Brassicaceae plant, particularly a Brassica plant, especially a Brassica napus plant or a plant from another Brassica crop species, and the second plant can be a plant from a Brassicaceae cultivation line, in particular from a Brassica crop line, especially a Brassica napus crop line or a Brassica crop species crop line. "Cultivation line", as used in this

30 memoria, es una línea de plantas preferiblemente homocigóticas distinguible de otras líneas de plantas por un genotipo y/o fenotipo preferido que se utiliza para producir descendencia híbrida. 30 memory, is a preferably homozygous plant line distinguishable from other plant lines by a preferred genotype and / or phenotype that is used to produce hybrid offspring.

También se describe un método para producir una planta, en particular una planta de cultivo de Brassica, tal como una planta de Brassica napus, de la cual el aceite de semillas tiene un contenido de C18:3 significativamente reducido, pero que mantiene preferiblemente un desarrollo agronómicamente adecuado, que comprende combinar A method for producing a plant, in particular a Brassica crop plant, such as a Brassica napus plant, of which the seed oil has a significantly reduced C18: 3 content, but preferably maintaining a development is also described agronomically suitable, which comprises combining

35 y/o transferir alelos FAD3 mutantes de acuerdo con la invención en o a una planta de Brassica, tal como se describió anteriormente. 35 and / or transferring mutant FAD3 alleles according to the invention in or to a Brassica plant, as described above.

La planta puede ser una planta de Brassica que comprende al menos dos genes FAD3 mutantes, en donde el aceite de semillas tiene un contenido de C18:3 significativamente reducido, pero que mantiene preferiblemente un desarrollo agronómicamente adecuado, combinando y/o transfiriendo al menos dos alelos FAD3 mutantes de The plant can be a Brassica plant that comprises at least two mutant FAD3 genes, where the seed oil has a significantly reduced C18: 3 content, but preferably maintains an agronomically adequate development, combining and / or transferring at least two mutant FAD3 alleles of

40 acuerdo con la invención en o a la planta de Brassica, tal como se describió anteriormente. In accordance with the invention at or at the Brassica plant, as described above.

También se describe el uso de una planta, en particular una planta de cultivo de Brassica, tal como una planta de Brassica napus, que comprende uno o más de los alelos FAD3 mutantes de la invención para combinar y/o transferir alelos FAD3 mutantes de acuerdo con la invención en o a una planta de Brassica, tal como se describió anteriormente. The use of a plant, in particular a Brassica crop plant, such as a Brassica napus plant, comprising one or more of the mutant FAD3 alleles of the invention to combine and / or transfer mutant FAD3 alleles according to the invention is also described. with the invention in or to a Brassica plant, as described above.

45 En aún otra realización, la invención se refiere al uso de una combinación de alelos FAD3 mutantes de la invención para reducir el contenido de C18:3 en el aceite de semillas de una planta de Brassica. In yet another embodiment, the invention relates to the use of a combination of mutant FAD3 alleles of the invention to reduce the content of C18: 3 in the seed oil of a Brassica plant.

También se describe el uso de las plantas y semillas de la invención para producir aceite de semillas de colza. The use of the plants and seeds of the invention to produce rapeseed oil is also described.

En una realización adicional, la invención proporciona el uso de las plantas de la invención para producir semillas que comprenden alelos FAD3 mutantes o para producir una cosecha de semillas de colza que comprende proteínas In a further embodiment, the invention provides the use of the plants of the invention to produce seeds comprising mutant FAD3 alleles or to produce a crop of rapeseed seeds comprising proteins

50 FAD3 mutantes. 50 FAD3 mutants.

SECUENCIAS SEQUENCES

SEQ ID NO: 1 ADN genómico del gen FAD3-A1 de Brassica napus. SEQ ID NO: 1 genomic DNA of the FAD3-A1 gene of Brassica napus.

SEQ ID NO: 2: Secuencia de aminoácidos de la proteína FAD3-A1 de Brassica napus SEQ ID NO: 3: ADN genómico del gen FAD3-C1 de Brassica napus SEQ ID NO: 4: Secuencia de aminoácidos de la proteína FAD3-A2 de Brassica napus SEQ ID NO: 5: ADN genómico del gen FAD3-A2 de Brassica napus SEQ ID NO: 6: Secuencia de aminoácidos de la proteína FAD3-A2 de Brassica napus SEQ ID NO: 7: ADN genómico del gen FAD3-A3 de Brassica napus SEQ ID NO: 8: Secuencia de aminoácidos de la proteína FAD3-A3 de Brassica napus SEQ ID NO: 9: ADN genómico del gen FAD3-C2 de Brassica napus SEQ ID NO: 10: Secuencia de aminoácidos de la proteína FAD3-C2 de Brassica napus SEQ ID NO: 11: Región codificante del gen FAD3-A1 de Brassica napus SEQ ID NO: 12: Región codificante del gen FAD3-C1 de Brassica napus SEQ ID NO: 13: Región codificante del gen FAD3-A2 de Brassica napus SEQ ID NO: 14: Región codificante del gen FAD3-A3 de Brassica napus SEQ ID NO: 15: Región codificante del gen FAD3-C2 de Brassica napus SEQ ID NO: 16: Cebador de PCR directo de FAD3 de Arabidopsis SEQ ID NO: 17: Cebador de PCR inverso de FAD3 de Arabidopsis SEQ ID NO: 18: Sonda FAM de LOLI105 SEQ ID NO: 19: Sonda VIC de LOLI105 SEQ ID NO: 20: Cebador directo de LOLI105 SEQ ID NO: 21: Cebador inverso de LOLI105 SEQ ID NO: 22: Sonda FAM de LOLI103 SEQ ID NO: 23: Sonda VIC de LOLI103 SEQ ID NO: 24: Cebador directo de LOLI103 SEQ ID NO: 25: Cebador inverso de LOLI103 SEQ ID NO: 26: Sonda FAM de LOLI108 SEQ ID NO: 27: Sonda VIC de LOLI108 SEQ ID NO: 28: Cebador directo de LOLI108 SEQ ID NO: 29: Cebador inverso de LOLI108 SEQ ID NO: 30: Sonda FAM de LOLI111 SEQ ID NO: 31: Sonda VIC de LOLI111 SEQ ID NO: 32: Cebador directo de LOLI111 SEQ ID NO: 33: Cebador inverso de LOLI111 SEQ ID NO: 34: Sonda FAM de LOLI115 SEQ ID NO: 35: Sonda VIC de LOLI115 SEQ ID NO: 36: Cebador directo de LOLI115 SEQ ID NO: 37: Cebador inverso de LOLI115 SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of Brassica napus FAD3-A1 protein SEQ ID NO: 3: Brassica napus FAD3-C1 gene genomic DNA SEQ ID NO: 4: FAD3-A2 protein amino acid sequence Brassica napus SEQ ID NO: 5: Genomic DNA of the Brassica napus FAD3-A2 gene SEQ ID NO: 6: Amino acid sequence of the Brassica napus FAD3-A2 protein SEQ ID NO: 7: Genomic DNA of the FAD3-A3 gene of Brassica napus SEQ ID NO: 8: Amino acid sequence of the Brassica napus FAD3-A3 protein SEQ ID NO: 9: Genomic DNA of the Brassica napus FAD3-C2 gene SEQ ID NO: 10: Amino acid sequence of the FAD3- protein Brassica napus C2 SEQ ID NO: 11: Brassica napus FAD3-A1 gene coding region SEQ ID NO: 12: Brassica napus FAD3-C1 gene coding region SEQ ID NO: 13: FAD3-A2 gene coding region of Brassica napus SEQ ID NO: 14: Coding region of the FAD3-A3 gene of Brassica napus SEQ ID NO: 15: Coding region of the FAD3-C2 gene of Brassica na pus SEQ ID NO: 16: Arabidopsis FAD3 direct PCR primer SEQ ID NO: 17: Arabidopsis FAD3 reverse PCR primer SEQ ID NO: 18: LOLI105 FAM probe SEQ ID NO: 19: LOLI105 SEQ VIC probe ID NO: 20: Direct primer of LOLI105 SEQ ID NO: 21: Inverse primer of LOLI105 SEQ ID NO: 22: FAM probe of LOLI103 SEQ ID NO: 23: VIC probe of LOLI103 SEQ ID NO: 24: Direct primer of LOLI103 SEQ ID NO: 25: Inverse primer of LOLI103 SEQ ID NO: 26: FAM probe of LOLI108 SEQ ID NO: 27: VIC probe of LOLI108 SEQ ID NO: 28: Direct primer of LOLI108 SEQ ID NO: 29: Inverse primer of LOLI108 SEQ ID NO: 30: FAM probe of LOLI111 SEQ ID NO: 31: VIC probe of LOLI111 SEQ ID NO: 32: Direct primer of LOLI111 SEQ ID NO: 33: Inverse primer of LOLI111 SEQ ID NO: 34: FAM probe of LOLI115 SEQ ID NO: 35: VIC probe of LOLI115 SEQ ID NO: 36: Direct primer of LOLI115 SEQ ID NO: 37: Inverse primer of LOLI115

EJEMPLOS EXAMPLES

Todos los ejemplos se llevaron a cabo esencialmente como se describe en el documento WO09/007091. All examples were carried out essentially as described in WO09 / 007091.

Ejemplo 1 -Determinación del número de genes FAD3 en Brassica napus y aislamiento de las secuencias deADN de los genes FAD3 Example 1 - Determination of the number of FAD3 genes in Brassica napus and isolation of the DNA sequences of the FAD3 genes

Un banco de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) de una línea de investigación de primavera OSR se rastreó utilizando una sonda que fue amplificada a partir de ADN genómico de Arabidopsis con cebadores con SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17 de acuerdo con técnicas estándares de biología molecular y se aislaron clones de BAC que se hibridan a la sonda (en adelante denominadas "colonias positivas"). A bacterial artificial chromosome (BAC) bank of an OSR spring research line was screened using a probe that was amplified from Arabidopsis genomic DNA with primers with SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 according to techniques molecular biology standards and BAC clones that hybridize to the probe (hereinafter referred to as "positive colonies") were isolated.

El análisis de transferencia Southern se realizó utilizando la misma sonda que antes de acuerdo con técnicas estándares de biología molecular en ADN del clon BAC aislado de las colonias positivas y en ADN genómico aislado de B. napus (AC), Brassica rapa (AA) y Brassica oleracea (CC). Sobre la base de una comparación entre los patrones de hibridación obtenidos después de la digestión de ADN del clon BAC de las colonias positivas identificadas y de ADN genómico aislado de B. napus, B. rapa y B. oleracea, los clones de BAC se agruparon en 5 grupos, de los cuales tres pudieron ser mapeados al genoma A y dos al genoma C. Para cada uno de los 5 grupos se seleccionó un clon de BAC. Southern blot analysis was performed using the same probe as before according to standard molecular biology techniques in BAC clone DNA isolated from positive colonies and in genomic DNA isolated from B. napus (AC), Brassica rapa (AA) and Brassica oleracea (CC). Based on a comparison between hybridization patterns obtained after DNA digestion of the BAC clone of the identified positive colonies and genomic DNA isolated from B. napus, B. rapa and B. oleracea, the BAC clones were grouped in 5 groups, of which three could be mapped to genome A and two to genome C. For each of the 5 groups a BAC clone was selected.

Ejemplo 2 -Caracterización de secuencias de genes FAD3 de Brassica napus Example 2 - Characterization of FAD3 gene sequences from Brassica napus

Las secuencias de ADN completas de los clones de BAC de las colonias positivas seleccionadas se determinaron por secuenciación 454, después de lo cual las secuencias FAD3 se identificaron por análisis blast (Blast2seq) The complete DNA sequences of the BAC clones of the selected positive colonies were determined by sequencing 454, after which the FAD3 sequences were identified by blast analysis (Blast2seq)

utilizando el gen FAD3 de Arabidopsis thaliana (número de acceso a GenBank D26508) como secuencia de consulta. using the Arabidopsis thaliana FAD3 gene (GenBank accession number D26508) as a query sequence.

Las estructuras intrón-exón de las secuencias FAD3 se determinaron con FgeneSH (Softberry, Inc. Mount Kisco, NY, EE.UU.) y mediante el alineamiento óptimo de la secuencia del gen con la secuencia codificante de de A. thaliana (número de acceso a GenBank NM_128552). Las regiones codificantes de proteínas de los genes FAD3, así como las secuencias de aminoácidos FAD3 codificadas por estas secuencias de ácidos nucleicos están representadas en el Listado de secuencias. De los genes FAD3 mapeados al genoma A, se encontró que la secuencia del gen FAD3 de mapeo a N04 corresponde al gen FAD3-A (número de acceso a GenBank L22962) y se designó FAD3-A1, mientras que las secuencias de mapeo a N05 y N03 fueron designados FAD3-A2 y FAD3-A3, respectivamente. De los genes FAD3 de mapeo al genoma C, se encontró que una de las secuencias corresponde a un gen FAD3-C (descrito en el documento WO04/072259) y se designó FAD3-C1, mientras que el otro se encontró que era homólogo a FAD3-A2 y se designó FAD3-C2. Estas designaciones se utilizan a lo largo de toda la memoria descriptiva. Las secuencias genómicas de los genes FAD3 se representan en el Listado de secuencias. The intron-exon structures of the FAD3 sequences were determined with FgeneSH (Softberry, Inc. Mount Kisco, NY, USA) and by optimal alignment of the gene sequence with the coding sequence of A. thaliana (number of access to GenBank NM_128552). The protein coding regions of the FAD3 genes, as well as the FAD3 amino acid sequences encoded by these nucleic acid sequences are represented in the Sequence Listing. From the FAD3 genes mapped to genome A, the sequence of the FAD3 gene mapping to N04 was found to correspond to the FAD3-A gene (GenBank accession number L22962) and FAD3-A1 was designated, while the mapping sequences to N05 and N03 were designated FAD3-A2 and FAD3-A3, respectively. From the FAD3 mapping genes to genome C, one of the sequences was found to correspond to an FAD3-C gene (described in WO04 / 072259) and FAD3-C1 was designated, while the other was found to be homologous to FAD3-A2 and FAD3-C2 was designated. These designations are used throughout the entire specification. The genomic sequences of the FAD3 genes are represented in the Sequence Listing.

Ejemplo 3 -Expresión de genes FAD3 de Brassica Example 3 - Expression of Brassica FAD3 genes

Los niveles de expresión relativos y absolutos de los diversos genes FAD3 en el desarrollo de embriones de B. napus se determinaron mediante secuenciación del transcriptoma completo de ADNcs utilizando la tecnología Roche 454 GS FLX Titanium (http://www.454.com/products-solutions/how-it-works/index.asp). Para la producción de ADNc, ARN total se extrajo utilizando el reactivo TRIZOL (Invitrogen). Esto se realizó por triplicado para cada una de las etapas de desarrollo embrionario. Posteriormente, se agruparon las muestras de ARN total derivadas de embriones de la misma fase de desarrollo y el ARNm se purificó a partir de las muestras de ARN total con el kit de purificación de ARNm GE Healthcare. En la siguiente etapa, se preparó ADNc usando el kit de síntesis de ADNc de Doble Cadena SuperScript (Invitrogen). A continuación, el ADNc se fraccionó por tamaño utilizando columnas CHROMA Spin-400 de acuerdo con el protocolo descrito en el Kit de Construcción de Bancos de ADNc SMART (Clontech). Después del análisis de la secuencia de ADNc se realizó una cuantificación del transcrito mediante recuento de lectura de las secuencias diana. La expresión de cada uno de los genes FAD3 se normalizó para el número de secuencias en el conjunto de datos de cada momento. The relative and absolute expression levels of the various FAD3 genes in the development of B. napus embryos were determined by sequencing the complete cDNA transcriptome using Roche 454 GS FLX Titanium technology (http://www.454.com/products -solutions / how-it-works / index.asp). For the production of cDNA, total RNA was extracted using the TRIZOL reagent (Invitrogen). This was done in triplicate for each of the stages of embryonic development. Subsequently, the total RNA samples derived from embryos of the same development phase were pooled and the mRNA was purified from the total RNA samples with the GE Healthcare mRNA purification kit. In the next step, cDNA was prepared using the SuperScript Double Chain cDNA synthesis kit (Invitrogen). Next, the cDNA was fractionated by size using CHROMA Spin-400 columns according to the protocol described in the SMART cDNA Bank Building Kit (Clontech). After analysis of the cDNA sequence, a quantification of the transcript was performed by reading the target sequences. The expression of each of the FAD3 genes was normalized for the number of sequences in the data set of each moment.

Tabla 1: Expresión de FAD3 normalizada (norm) y porcentaje (%) de la expresión total de FAD3 en embriones de Brassica napus a los 14-35 días post-floración (DAF) Table 1: Expression of normalized FAD3 (norm) and percentage (%) of total FAD3 expression in embryos of Brassica napus at 14-35 days post-flowering (DAF)

De la tabla 1 es evidente que la expresión total de FAD3 disminuye con el tiempo. FAD3-A1 y FAD3-C1 constituyen la mayor parte de la expresión del ARNm total de FAD3, ambas en torno al 40%. Esto es seguido por FAD3-A3, FAD-A2 y FAD-C2, que comprende a lo sumo 11,1%, 7,4% y 6,7% de la expresión total de FAD3, respectivamente. From table 1 it is evident that the total expression of FAD3 decreases over time. FAD3-A1 and FAD3-C1 make up the bulk of the total mRNA expression of FAD3, both around 40%. This is followed by FAD3-A3, FAD-A2 and FAD-C2, which comprises at most 11.1%, 7.4% and 6.7% of the total FAD3 expression, respectively.

Ejemplo 4 -Generación y aislamiento de alelos FAD3 mutantes de Brassica Example 4 - Generation and isolation of mutant FAD3 alleles from Brassica

Se generaron mutaciones en los genes FAD3 identificados en el Ejemplo 1 y se identificaron como sigue: -30.000 semillas de una línea de cultivo de semillas de colza de primavera de élite (semillas M0) fueron preembebidas durante dos horas en un papel de filtro húmedo en agua desionizada o destilada. La mitad de las semillas se expuso a EMS al 0,8% y la mitad a EMS al 1% (Sigma: M0880) y se incubó durante 4 horas. -Las semillas mutagenizadas (semillas M1) se aclararon 3 veces y se secaron en una campana de humos durante la noche. 30.000 plantas M1 se cultivaron en el suelo y se autofecundaron para generar semillas M2. Semillas M2 fueron recolectadas para cada planta M1 individual. Mutations in the FAD3 genes identified in Example 1 were generated and identified as follows: -30,000 seeds from an elite spring rapeseed culture line (M0 seeds) were pre-packed for two hours in a wet filter paper in deionized or distilled water. Half of the seeds were exposed to 0.8% EMS and half to 1% EMS (Sigma: M0880) and incubated for 4 hours. -The mutagenized seeds (M1 seeds) were clarified 3 times and dried in a fume hood overnight. 30,000 M1 plants were grown in the soil and self-fertilized to generate M2 seeds. M2 seeds were collected for each individual M1 plant.

--: Plantas M2 dos veces 4800, derivadas de diferentes plantas M1, fueron cultivadas y se prepararon muestras de ADN a partir de muestras de hojas de cada planta M2 individual de acuerdo con el método CTAB (Doyle y Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15). -Las muestras de ADN fueron rastreadas en cuanto a la presencia de mutaciones puntuales en los genes M2 plants twice 4800, derived from different M1 plants, were cultured and DNA samples were prepared from leaf samples of each individual M2 plant according to the CTAB method (Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19: 11- fifteen). -DNA samples were tracked for the presence of point mutations in the genes

5 FAD3 que provocan la introducción de codones de PARADA en las regiones que codifican proteínas de los genes FAD3 o la interrupción de los sitios de corte y empalme en el ARNm de FAD3, mediante secuenciación directa por técnicas de secuenciación estándares (Agowa) y análisis de las secuencias en cuanto a la presencia de las mutaciones puntuales utilizando el software NovoSNP (VIB Amberes) -Los siguientes alelos FAD3 mutantes fueron así identificados: 5 FAD3 that cause the introduction of STOP codons in the regions encoding proteins of the FAD3 genes or the disruption of the splice sites in the FAD3 mRNA, by direct sequencing by standard sequencing techniques (Agowa) and analysis of Sequences regarding the presence of point mutations using NovoSNP software (VIB Antwerp) -The following mutant FAD3 alleles were thus identified:

10 Tabla 2: Mutaciones en genes FAD3 10 Table 2: Mutations in FAD3 genes

(1) Semillas que comprenden FAD3-A1-LOLI105 y FAD3-C1-LOLI103 (designadas 09MBBN001740) se han depositado en NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Escocia, AB21 9YA, Reino Unido) el 9 de octubre de 2009, bajo el número de acceso NCIMB 41655. (1) Seeds comprising FAD3-A1-LOLI105 and FAD3-C1-LOLI103 (designated 09MBBN001740) have been deposited in NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, United Kingdom) on October 9 of 2009, under the accession number NCIMB 41655.

15 (2) Semillas que comprenden FAD3-A2-LOLI108 y FAD3-C2-LOLI115 (designadas 09MBBN001742) se han depositado en NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Escocia, AB21 9YA, Reino Unido) el 9 de octubre de 2009, bajo el número de acceso NCIMB 41656. 15 (2) Seeds comprising FAD3-A2-LOLI108 and FAD3-C2-LOLI115 (designated 09MBBN001742) have been deposited in NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, United Kingdom) on 9 October 2009, under accession number NCIMB 41656.

(3) Semillas que comprenden FAD3-A3-LOLI111 (designadas 09MBBN000519) se han depositado en (3) Seeds comprising FAD3-A3-LOLI111 (designated 09MBBN000519) have been deposited in

NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Escocia, AB21 9YA, 20 Reino Unido) el 9 de octubre de 2009, con el número de acceso NCIMB 41657. NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, 20 United Kingdom) on October 9, 2009, with accession number NCIMB 41657.

En conclusión, los ejemplos anteriores muestran cómo se pueden generar y aislar alelos FAD3 mutantes. Además, material vegetal que comprende este tipo de alelos mutantes se puede utilizar para combinar un mutante seleccionado y/o alelos de tipo salvaje en una planta, tal como se describe en los siguientes ejemplos. In conclusion, the previous examples show how mutant FAD3 alleles can be generated and isolated. In addition, plant material comprising this type of mutant alleles can be used to combine a selected mutant and / or wild type alleles in a plant, as described in the following examples.

Ejemplo 5 -Identificación de una planta de Brassica que comprende un alelo FAD3 mutante de Brassica Example 5 - Identification of a Brassica plant comprising a mutant FAD3 allele of Brassica

25 Plantas de Brassica que comprenden las mutaciones en los genes FAD3 identificados en el Ejemplo 4 se identificaron como sigue: -Para cada uno de los alelos FAD3 mutantes identificado en la muestra de ADN de una planta M2, se cultivaron al menos 48 plantas M2 derivadas de la misma planta M1 que la planta M2 que comprende la mutación FAD3 y muestras de ADN se prepararon a partir de muestras de hojas de cada una de las plantas M2 individuales. 25 Brassica plants comprising mutations in the FAD3 genes identified in Example 4 were identified as follows: -For each of the mutant FAD3 alleles identified in the DNA sample of an M2 plant, at least 48 derived M2 plants were grown from the same M1 plant as the M2 plant comprising the FAD3 mutation and DNA samples were prepared from leaf samples of each of the individual M2 plants.

30 -Las muestras de ADN fueron rastreadas en cuanto a la presencia de la mutación puntual de FAD3 tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4. -Plantas M2 heterocigóticas y homocigóticas (como se determina en base a los electroferogramas) que comprendían la misma mutación fueron autofecundadas y se recogieron las semillas M3. 30 -DNA samples were screened for the presence of the point mutation of FAD3 as described above in Example 4. -Homozygous and homozygous M2 plants (as determined based on electropherograms) that comprised the same mutation they were self-fertilized and the M3 seeds were collected.

Ejemplo 6 -Análisis de la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de plantas de Brassica que35 comprenden uno a tres genes FAD3 mutantes de Brassica en líneas de élite de Brassica Example 6 - Analysis of the fatty acid composition of the Brassica plant seed oil which35 comprises one to three Brassica mutant FAD3 genes in Brassica elite lines

 La correlación entre la presencia de alelos FAD3 mutantes múltiples en una planta de Brassica que se cultiva en invernadero y la composición de ácidos grasos del aceite de las semillas de la planta de Brassica se  The correlation between the presence of multiple mutant FAD3 alleles in a Brassica plant that is grown in a greenhouse and the fatty acid composition of the Brassica plant's seed oil is

determinaron como sigue. De las plantas de Brassica identificadas en el Ejemplo 5 (F1S2), plantas que comprenden un alelo mutante de cada uno de los genes FAD3 (LOLI105, LOLI103, LOLI108, LOLI115 y LOLI111) se cruzaron primero con una línea de cultivo masculina de élite y una femenina de élite de Brassica, y las plantas de la progenie que comprenden la mutación se autofecundaron posteriormente para obtener plantas 5 homocigóticas. Para la comparación, se realizaron los mismos cruces con plantas que comprenden alelos FAD-A1 y FAD-C1 mutantes tal como se describe en los documento WO01/25453 y WO04/072259, respectivamente. Posteriormente, se determinó la composición de ácidos grasos del aceite de semilla de plantas de la progenie de Brassica individuales homocigóticas para el o los alelos FAD3 mutantes extrayendo los acilos grasos de las semillas y analizando sus niveles relativos en el aceite de semilla por cromatografía capilar de gas-líquido tal como They determined as follows. Of the Brassica plants identified in Example 5 (F1S2), plants comprising a mutant allele of each of the FAD3 genes (LOLI105, LOLI103, LOLI108, LOLI115 and LOLI111) were first crossed with an elite male culture line and an elite female from Brassica, and the progeny plants that comprise the mutation subsequently self-fertilized to obtain homozygous 5 plants. For comparison, the same crosses were made with plants comprising mutant FAD-A1 and FAD-C1 alleles as described in WO01 / 25453 and WO04 / 072259, respectively. Subsequently, the fatty acid composition of the seed oil of individual Brassica progeny plants homozygous for the mutant FAD3 alleles was determined by extracting the fatty acyls from the seeds and analyzing their relative levels in the seed oil by capillary chromatography of gas-liquid such as

10 se describe en el documento WO09/007091. La Tabla 3 muestra el porcentaje de C18:3 del contenido de aceite total de al menos 0,2 g de semilla madura de los cruces F1S2 x élite d 10 is described in WO09 / 007091. Table 3 shows the C18: 3 percentage of the total oil content of at least 0.2 g of mature seed from F1S2 x elite d crosses

Tabla 3: Desviación media (Av) y estándar (SD) de porcentaje (%) de contenido de C18:3 de aceite de semillas en cruces masculinos y femeninos. ND = no pudo ser determinado Table 3: Average deviation (Av) and standard (SD) of percentage (%) of C18: 3 content of seed oil in male and female crosses. ND = could not be determined

Femenino Female: Masculino Male

Alelo FAD3A1/FAD3C1/FAD3A2/FAD3A3/FAD3C2 Allele FAD3A1 / FAD3C1 / FAD3A2 / FAD3A3 / FAD3C2: Av SD C18:3 C18:3 Av SD C18:3 C18:3 Av SD C18: 3 C18: 3 Av SD C18: 3 C18: 3

LOLI103 LOLI103

FAD3A1/FAD3C1/TIPO W/TIPO W/TIPO W FAD3A1 / FAD3C1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 3,59 0,32 3,97 0,38 3.59 0.32 3.97 0.38

FAD3A1/LOLI103/TIPO W/TIPO W/TIPO W FAD3A1 / LOLI103 / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 3,90 0,30 3,97 0,63 3.90 0.30 3.97 0.63

TIPO W/FAD3C1/TIPO W/TIPO W/TIPO W TYPE W / FAD3C1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 5,89 0,51 5,99 0,53 5.89 0.51 5.99 0.53

TIPO W/LOLI103/TIPO W/TIPO W/TIPO W TYPE W / LOLI103 / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 6,37 0,74 6,15 0,67 6.37 0.74 6.15 0.67

LOLI105 LOLI105

FAD3A1/FAD3C1/TIPO W/TIPO W/TIPO W FAD3A1 / FAD3C1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 3,82 0,74 3,69 0,88 3.82 0.74 3.69 0.88

LOLI105/FAD3C1/TIPO W/TIPO W/TIPO W LOLI105 / FAD3C1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 3,68 0,42 4,35 1,54 3.68 0.42 4.35 1.54

FAD3A1/TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W FAD3A1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 5,81 0,46 5,78 0,85 5.81 0.46 5.78 0.85

LOLI105/TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W LOLI105 / TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 6,24 0,50 5,98 0,87 6.24 0.50 5.98 0.87

LOLI108 LOLI108

FAD3A1/FAD3C1/TIPO W/TIPO W/TIPO W FAD3A1 / FAD3C1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 3,42 0,11 2,84 0,12 3.42 0.11 2.84 0.12

FAD3A1/FAD3C1/LOLI108/TIPO W/TIPO W FAD3A1 / FAD3C1 / LOLI108 / TYPE W / TYPE W: 2,62 0,08 2,96 0,31 2.62 0.08 2.96 0.31

FAD3A1/TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W FAD3A1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 5,89 0,83 5,55 0,67 5.89 0.83 5.55 0.67

FAD3A1/TIPO W/LOLI108/TIPO W/TIPO W FAD3A1 / TYPE W / LOLI108 / TYPE W / TYPE W: 4,83 0,32 4,93 0,26 4.83 0.32 4.93 0.26

TIPO W/FAD3C1/TIPO W/TIPO W/TIPO W TYPE W / FAD3C1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 5,48 0,32 5,04 0,23 5.48 0.32 5.04 0.23

TIPO W/FAD3C1/LOLI108/TIPO W/TIPO W TYPE W / FAD3C1 / LOLI108 / TYPE W / TYPE W: 4,31 0,37 4,36 1,06 4.31 0.37 4.36 1.06

TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 6,54 0,55 7,20 0,92 6.54 0.55 7.20 0.92

TIPO W/TIPO W/LOLI108/TIPO W/TIPO W TYPE W / TYPE W / LOLI108 / TYPE W / TYPE W: 6,51 0,19 5,92 0,63 6.51 0.19 5.92 0.63

LOLI111 LOLI111

FAD3A1/FAD3C1/TIPO W/TIPO W/TIPO W FAD3A1 / FAD3C1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 3,77 0,23 3,42 0,78 3.77 0.23 3.42 0.78

FAD3A1/FAD3C1/TIPO W/LOLI111/TIPO W FAD3A1 / FAD3C1 / TYPE W / LOLI111 / TYPE W: 2,58 0,17 2,43 0,55 2.58 0.17 2.43 0.55

FAD3A1/TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W FAD3A1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 6,12 0,24 4,71 0,83 6.12 0.24 4.71 0.83

FAD3A1/TIPO W/TIPO W/LOLI111/TIPO W FAD3A1 / TYPE W / TYPE W / LOLI111 / TYPE W: 4,43 0,18 3,53 0,62 4.43 0.18 3.53 0.62

TIPO W/FAD3C1/TIPO WlTIPO W/TIPO W TYPE W / FAD3C1 / TYPE WlTIPO W / TYPE W: 5,60 0,85 5,01 0,96 5.60 0.85 5.01 0.96

TIPO W/FAD3C1/TIPO W/LOLI111/TIPO W TYPE W / FAD3C1 / TYPE W / LOLI111 / TYPE W: 4,59 0,24 4,17 0,16 4.59 0.24 4.17 0.16

TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 6,90 2,02 7,43 0,63 6.90 2.02 7.43 0.63

TIPO W/TIPO W/TIPO W/LOLI111/TIPO W TYPE W / TYPE W / TYPE W / LOLI111 / TYPE W: 6,68 0,40 7,06 1,02 6.68 0.40 7.06 1.02

LOLI115 LOLI115

FAD3A1/FAD3C1/TIPO W/TIPO W/TIPO W FAD3A1 / FAD3C1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 4.02 0.24 3.44 0.49 4.02 0.24 3.44 0.49

FAD3A1/FAD3C1/TIPO W/TIPO W/LOLI115 FAD3A1 / FAD3C1 / TYPE W / TYPE W / LOLI115: - - 3.20 0.13 - - 3.20 0.13

FAD3A1/TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W FAD3A1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 5.17 ND - - 5.17 ND - -

FAD3A1/TIPO W/TIPO W/TIPO W/LOLI115 FAD3A1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W / LOLI115: 6.06 0.55 4.33 0.08 6.06 0.55 4.33 0.08

TIPO W/FAD3C1/TIPO W/TIPO W/TIPO W TYPE W / FAD3C1 / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 4.35 0.58 4.71 1.22 4.35 0.58 4.71 1.22

TIPO W/FAD3C1/TIPO W/TIPO W/LOLI115 TYPE W / FAD3C1 / TYPE W / TYPE W / LOLI115: 3.29 ND - - 3.29 ND - -

TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 5.93 0.69 5.86 0.79 5.93 0.69 5.86 0.79

TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W/LOLI115 TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W / LOLI115: 6.49 0.99 - - 6.49 0.99 - -

En primer lugar, las plantas que comprenden los alelos FAD3-A1 y FAD3-C1 mutantes tal como se describe en los documentos WO01/25453 y WO04/072259 se compararon con plantas que comprenden los alelos mutantes LOLI105 (FAD3-A1) y LOLI103 (FAD3-C1), respectivamente, en cuanto a su composición de aceite de semillas. Plantas homocigóticas para el alelo LOLI103 exhibían una reducción similar en el contenido de C18:3 del aceite de semillas en comparación con plantas de tipo salvaje (es decir, que no comprenden ningún alelo FAD3 mutante) como las plantas homocigóticas para el alelo FAD3-A1. Del mismo modo, las plantas homocigóticas para el alelo LOLI105 exhibían una reducción similar en el contenido de C18:3 del aceite de semillas en comparación con plantas de tipo salvaje como las plantas homocigóticas para el alelo FAD3-C1. First, the plants comprising the mutant FAD3-A1 and FAD3-C1 alleles as described in WO01 / 25453 and WO04 / 072259 were compared with plants comprising the mutant alleles LOLI105 (FAD3-A1) and LOLI103 ( FAD3-C1), respectively, in terms of its seed oil composition. Homozygous plants for the LOLI103 allele exhibited a similar reduction in the C18: 3 content of seed oil compared to wild-type plants (i.e., which do not comprise any mutant FAD3 allele) such as homozygous plants for the FAD3-A1 allele . Similarly, homozygous plants for the LOLI105 allele exhibited a similar reduction in the C18: 3 content of seed oil compared to wild-type plants such as homozygous plants for the FAD3-C1 allele.

A continuación, la composición de aceite de semillas de plantas que comprenden los alelos FAD3 mutantes LOLI108 (FAD3-A2), LOLI111 (FAD3-A3) o LOLI115 (FAD3-C2) se comparó con la de las plantas de tipo salvaje y plantas que comprenden los alelos mutantes FAD3-A1 y/o FAD3-C1 de los documentos WO01/25453 y WO04/072259. Las plantas de tipo salvaje (es decir, no comprenden alelo FAD3 mutante alguno) exhibían un contenido de C18:3 de aceite de semillas de aproximadamente 7%. En el aceite de semillas de plantas que comprenden los alelos mutantes FAD3-A1 o FAD3-C1 en estado homocigótico, se observó una reducción del contenido de C18:3 de aceite de semilla de aproximadamente 1-2%. Las plantas que comprenden los alelos mutantes tanto FAD3-A1 como FAD3-C1 de los documentos WO01/25453 y WO04/072259 en estado homocigótico exhibían una reducción del contenido de C18:3 de semillas de aceite de a lo sumo 4%. Plantas que comprenden alelos mutantes LOLI108, LOLI111 o LOLI115 en estado homocigoto no mostraron una reducción significativa en C18:3 en el aceite de semillas cuando se compara con el aceite de semillas de plantas de tipo salvaje. Sorprendentemente sin embargo, los alelos LOLI108 y LOLI111 tenían un efecto adicional sobre la reducción de C18:3 en el aceite de semilla por parte de los alelos mutantes FAD3-A1 y/o FAD3-C1. En particular, en plantas de la progenie de cruces con la línea de élite, se encontró que la homocigosidad para el alelo LOLI108 reducía adicionalmente el contenido de C18:3 de aceite de semillas de plantas homocigóticas para el alelo mutante FAD3-C1 solo o de plantas homocigóticas para los alelos mutantes tanto FAD3-A1 como FAD3-C1, conduciendo a un contenido total de C18:3 de aceite de semillas en el mutante triple homocigótico de menos de 3%. Se observó un efecto similar para el alelo LOLI111 en combinación con el alelo mutante FAD3-A1 solo o en combinación con los alelos mutantes tanto FAD3-A1 como FAD3-C1, resultando de nuevo en una reducción del contenido de C18:3 de aceite de semillas en el mutante triple homocigótico de menos de 3%. En la línea de élite masculina se observó una tendencia similar. Al igual que en LOLI108 y LOLI111, la homocigosidad para el alelo LOLI115 solo no tenía un efecto de C18:3 del contenido de aceite de semillas en comparación con las plantas de tipo salvaje, pero a veces podría reducir aún más el contenido de C18:3 de aceite de semillas de plantas que ya comprenden los alelos mutantes FAD3-A1 y/o FAD3-C1. Next, the seed oil composition of plants comprising the mutant FAD3 alleles LOLI108 (FAD3-A2), LOLI111 (FAD3-A3) or LOLI115 (FAD3-C2) was compared with that of wild-type plants and plants that they comprise the FAD3-A1 and / or FAD3-C1 mutant alleles of WO01 / 25453 and WO04 / 072259. Wild-type plants (i.e., do not comprise any mutant FAD3 allele) exhibited a C18: 3 content of seed oil of approximately 7%. In the seed oil of plants comprising the mutant alleles FAD3-A1 or FAD3-C1 in a homozygous state, a reduction in the C18: 3 content of seed oil of approximately 1-2% was observed. Plants comprising both FAD3-A1 and FAD3-C1 mutant alleles of WO01 / 25453 and WO04 / 072259 in homozygous state exhibited a reduction in the C18: 3 content of oil seeds of at most 4%. Plants comprising mutant alleles LOLI108, LOLI111 or LOLI115 in homozygous state did not show a significant reduction in C18: 3 in seed oil when compared to seed oil from wild-type plants. Surprisingly, however, the LOLI108 and LOLI111 alleles had an additional effect on the reduction of C18: 3 in seed oil by the mutant alleles FAD3-A1 and / or FAD3-C1. In particular, in plants of the progeny of crosses with the elite line, it was found that homozygosity for the LOLI108 allele further reduced the C18: 3 content of seed oil from homozygous plants for the mutant allele FAD3-C1 alone or of homozygous plants for both FAD3-A1 and FAD3-C1 mutant alleles, leading to a total C18: 3 content of seed oil in the homozygous triple mutant of less than 3%. A similar effect was observed for the LOLI111 allele in combination with the FAD3-A1 mutant allele alone or in combination with both the FAD3-A1 and FAD3-C1 mutant alleles, again resulting in a reduction of the C18: 3 oil content. seeds in the homozygous triple mutant of less than 3%. A similar trend was observed in the male elite line. As in LOLI108 and LOLI111, the homozygosity for the LOLI115 allele alone did not have a C18: 3 effect of seed oil content compared to wild-type plants, but sometimes it could further reduce the C18 content: 3 of seed oil from plants that already comprise the FAD3-A1 and / or FAD3-C1 mutant alleles.

En conclusión, estos datos demuestran que, aunque los genes FAD3-A2, FAD3-A3 y FAD3-C2 sólo contribuyen a una pequeña fracción de la expresión total de FAD3 en la semilla en desarrollo y las mutaciones en estos genes por sí solas no alteraban el contenido de C18:3 en el aceite de semillas en cruces de élite, en combinación con mutaciones en los genes FAD3-A1 y FAD3-C1 se podría lograr una reducción de C18:3 a aproximadamente menos de 3% cuando las plantas se cultivaron en invernadero. In conclusion, these data demonstrate that, although the FAD3-A2, FAD3-A3 and FAD3-C2 genes only contribute to a small fraction of the total FAD3 expression in the developing seed and mutations in these genes alone did not alter the content of C18: 3 in seed oil at elite crossings, in combination with mutations in the FAD3-A1 and FAD3-C1 genes, a reduction of C18: 3 to approximately less than 3% could be achieved when the plants were grown under glass.

En un experimento similar, la composición de aceite de las plantas que comprenden los alelos FAD3 mutantes LOLI108 (FAD3-A2), LOLI111 (FAD3-A3) o LOLI115 (FAD3-C2) en un fondo que comprende los alelos mutantes FAD3-A1 y/o FAD3-C1 de los documentos WO01/25453 y WO04/072259 se determinó después de dos retrocruzamientos con líneas de cultivo masculinas o femeninas de élite. Las plantas de la progenie que comprenden la mutación se autofecundaron subsiguientemente para obtener plantas homocigóticas, y la composición de aceite en las semillas de estas plantas tras una segunda autofecundación (BC2S2) se analizaron como se ha descrito anteriormente. La Tabla 4 muestra el porcentaje de C18:3 del contenido total de aceite. In a similar experiment, the oil composition of the plants comprising the mutant FAD3 alleles LOLI108 (FAD3-A2), LOLI111 (FAD3-A3) or LOLI115 (FAD3-C2) in a background comprising the mutant alleles FAD3-A1 and / or FAD3-C1 of documents WO01 / 25453 and WO04 / 072259 was determined after two backcrossing with elite male or female culture lines. The progeny plants comprising the mutation were subsequently self-fertilized to obtain homozygous plants, and the oil composition in the seeds of these plants after a second self-fertilization (BC2S2) was analyzed as described above. Table 4 shows the percentage of C18: 3 of the total oil content.

Tabla 4: Desviación media (Av) y estándar (SD) de porcentaje (%) de contenido de C18:3 de aceite de semillas en cruces masculinos y femeninos de élite Table 4: Average deviation (Av) and standard (SD) of percentage (%) of C18: 3 content of seed oil in elite male and female crosses

Estos datos confirman que, aunque los genes FAD3-A2, FAD3-A3 y FAD3-C2 sólo contribuyen a una pequeña fracción de la expresión total de FAD3 en la semilla en desarrollo y las mutaciones en estos genes por sí solas no alteraban no alteraban el contenido de C18:3 en el aceite de semillas en cruces de élite, en combinación con These data confirm that, although the FAD3-A2, FAD3-A3 and FAD3-C2 genes only contribute to a small fraction of the total FAD3 expression in the developing seed and the mutations in these genes alone did not alter did not alter the C18: 3 content in seed oil at elite crossings, in combination with

5 mutaciones en los genes FAD3-A1 y FAD3-C1 se podría lograr una reducción de C18:3 a aproximadamente menos de 3% cuando las plantas se cultivaron en invernadero. 5 mutations in the FAD3-A1 and FAD3-C1 genes could reduce C18: 3 to approximately less than 3% when the plants were grown in the greenhouse.

Ejemplo 7 -Análisis de la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de plantas de Brassica quecomprenden de uno a cuatro genes FAD3 mutantes de Brassica en líneas de élite de Brassica cultivadas en invernadero Example 7 - Analysis of the fatty acid composition of Brassica plant oil seeds comprising one to four Brassica mutant FAD3 genes in greenhouse-grown Brassica elite lines

10 El efecto de más de tres alelos FAD3 mutantes sobre la composición de ácidos grasos del aceite de semilla de plantas de Brassica se determinó en el invernadero. De las plantas de Brassica identificadas en el Ejemplo 5 (F1S2), plantas que comprenden un alelo mutante de cada uno de los genes FAD3 (LOLI105, LOLI103, LOLI108, LOLI115 y LOLI111) fueron autofecundadas para obtener plantas homocigóticas. Se hicieron cruces adicionales entre las líneas que contienen los alelos FAD3 mutantes para obtener plantas con más de un gen FAD3 mutante. Posteriormente, se 10 The effect of more than three mutant FAD3 alleles on the fatty acid composition of Brassica plant seed oil was determined in the greenhouse. Of the Brassica plants identified in Example 5 (F1S2), plants comprising a mutant allele of each of the FAD3 genes (LOLI105, LOLI103, LOLI108, LOLI115 and LOLI111) were self-fertilized to obtain homozygous plants. Additional crosses were made between the lines containing the mutant FAD3 alleles to obtain plants with more than one mutant FAD3 gene. Subsequently

15 determinó la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de plantas de la progenie de Brassica individuales (noBC) homocigóticas para el o los alelos FAD3 mutantes tal como se describió anteriormente. La Tabla 5 muestra el porcentaje de C18:3 del aceite total de las plantas de Brassica en el invernadero. 15 determined the fatty acid composition of the seed oil of individual Brassica progeny (noBC) plants homozygous for the mutant FAD3 allele or alleles as described above. Table 5 shows the percentage of C18: 3 of the total oil of Brassica plants in the greenhouse.

Tabla 5: Desviación media (Av) y estándar (SD) de porcentaje (%) de contenido de C18:3 de aceite de semillas de plantas de Brassica cultivadas en el invernadero Table 5: Average deviation (Av) and standard (SD) of percentage (%) of C18: 3 content of seeds from Brassica plants grown in the greenhouse

Alelo Allele

Av SD Av SD

FAD3A1/FAD3A2/FAD3A3/FAD3C1/FAD3C2 FAD3A1 / FAD3A2 / FAD3A3 / FAD3C1 / FAD3C2

C18:3 C18:3 C18: 3 C18: 3

TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W

9,08 0,11 9.08 0.11

Mutantes sencillos Simple mutants

LOLI105/TIPOW/TIPO W/TIPO W/TIPO W LOLI105 / TIPOW / TYPE W / TYPE W / TYPE W

7,33 0,20 TIPO W/LOLI108/TIPO W/TIPO W/TIPO W 7.33 0.20 TYPE W / LOLI108 / TYPE W / TYPE W / TYPE W

9,10 0,09 TIPO W/TIPO W/TIPO W/LOLI103/TIPO W 9.10 0.09 TYPE W / TYPE W / TYPE W / LOLI103 / TYPE W

7,67 0,15 7.67 0.15

TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W/LOLI115 TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W / LOLI115

9,25 0,30 9.25 0.30

Mutantes dobles Double mutants

LOLI105/LOLI108/TIPO W/TIPO W/TIPO W LOLI105 / LOLI108 / TYPE W / TYPE W / TYPE W

6,45 0,09 LOLI105/TIPO W/TIPO W/LOLI103/TIPO W 6.45 0.09 LOLI105 / TYPE W / TYPE W / LOLI103 / TYPE W

4,57 0,05 LOLI105/TIPO W/TIPO W/TIPO W/LOLI115 4.57 0.05 LOLI105 / TYPE W / TYPE W / TYPE W / LOLI115

6,17 0,06 TIPO W/LOLI108/TIPO W/LOLI103/TIPO W 6.17 0.06 TYPE W / LOLI108 / TYPE W / LOLI103 / TYPE W

6,92 0,08 TIPO W/LOLI108/TIPO W/TIPO W/LOLI115 6.92 0.08 TYPE W / LOLI108 / TYPE W / TYPE W / LOLI115

8,26 0,10 8.26 0.10

Mutantes triples LOLI105/LOLI108/TIPO W/LOLI103/TIPO W LOLI105/LOLI108/TIPO W/TIPO W/LOLI115 TIPO W/LOLI108/TIPO W/LOLI103/LOLI115 Triple mutants LOLI105 / LOLI108 / TYPE W / LOLI103 / TYPE W LOLI105 / LOLI108 / TYPE W / TYPE W / LOLI115 TYPE W / LOLI108 / TYPE W / LOLI103 / LOLI115: 3,39 5,52 5,27 0,05 0,09 0,03 3.39 5.52 5.27 0.05 0.09 0.03

Mutante cuádruple LOLI105/LOLI108/TIPO W/LOLI103/LOLI115 Quadruple mutant LOLI105 / LOLI108 / TYPE W / LOLI103 / LOLI115: 2,36 0,07 2.36 0.07

A partir del experimento con los mutantes sencillos se puede concluir que sólo los alelos mutantes FAD3A1 y FAD3C1 provocan una reducción significativa del contenido de C18:3 del aceite de semillas. Como también se observa en el experimento anterior, los mutantes FAD3A2, FAD3A3 y FAD3C2 reducen adicionalmente el contenido 5 de C18:3 del aceite de semillas en un fondo genético que ya contiene FAD3A1 mutante, o FAD3C1 mutante, o ambos. Además, se observó consistentemente que, en los mutantes dobles y triples, las líneas que comprenden los alelos mutantes tanto FAD3A1 como FAD3C1 contienen un contenido de C18:3 significativamente menor de aceite de semillas que las otras líneas que contienen el mismo número de genes FAD3 mutantes. Además de ello, parece que hay una tendencia hacia los alelos FAD3 más mutantes presentes cuanto menor sea el contenido de C18:3 en From the experiment with the simple mutants it can be concluded that only the mutant alleles FAD3A1 and FAD3C1 cause a significant reduction in the C18: 3 content of the seed oil. As also observed in the previous experiment, the FAD3A2, FAD3A3 and FAD3C2 mutants further reduce the 5 C18: 3 content of the seed oil in a genetic background that already contains mutant FAD3A1, or mutant FAD3C1, or both. In addition, it was consistently observed that, in double and triple mutants, the lines comprising both FAD3A1 and FAD3C1 mutant alleles contain a significantly lower C18: 3 content of seed oil than the other lines that contain the same number of FAD3 genes mutants In addition to this, there seems to be a tendency towards the more mutant FAD3 alleles present the lower the C18: 3 content in

10 el aceite de semillas. 10 seed oil.

Ejemplo 8 -Análisis del efecto de apilar múltiples genes FAD3 mutantes en composiciones de ácidos grasos en plantas de Brassica cultivadas en el invernadero Example 8 - Analysis of the effect of stacking multiple mutant FAD3 genes in fatty acid compositions in Brassica plants grown in the greenhouse

A continuación, se investigó en qué medida el apilamiento de alelos mutantes de genes FAD3 diferentes, en la parte superior de los alelos mutantes FAD3A1 y FAD3C1, tenía un efecto sobre la composición de ácidos grasos en 15 Brassica cultivada en el invernadero. Con este fin, las líneas que contienen las mutaciones LOLI108, LOLI111 y LOLI115 se retrocruzaron dos veces o tres veces con líneas masculinas y femeninas de élite que comprenden los alelos mutantes FAD3-A1 y/o FAD3-C1 de los documentos WO01/25453 y WO04/072259. Las plantas de la progenie que comprenden los alelos mutantes se autofecundaron subsiguientemente para obtener plantas homocigóticas. Se hicieron cruces adicionales entre las líneas que contenían los alelos mutantes de genes FAD3 Next, it was investigated to what extent the stacking of mutant alleles of different FAD3 genes, at the top of the FAD3A1 and FAD3C1 mutant alleles, had an effect on the composition of fatty acids in Brassica grown in the greenhouse. To this end, the lines containing the mutations LOLI108, LOLI111 and LOLI115 were backcrossed twice or three times with elite male and female lines comprising the mutant alleles FAD3-A1 and / or FAD3-C1 of documents WO01 / 25453 and WO04 / 072259. The progeny plants comprising the mutant alleles subsequently self-fertilized to obtain homozygous plants. Additional crossings were made between the lines containing the mutant alleles of FAD3 genes

20 que habían sido retrocruzadas dos veces para obtener plantas con alelos mutantes de múltiples genes FAD3. Se analizó la composición de aceite en semillas de estas plantas tras una segunda autofecundación (BC2S2 para los mutantes cuádruples y BC3S2 para los triples mutantes) tal como se describe anteriormente. La Tabla 6 muestra el porcentaje de C18:3 del contenido total de aceite. 20 that had been backcrossed twice to obtain plants with mutant alleles of multiple FAD3 genes. The seed oil composition of these plants was analyzed after a second self-fertilization (BC2S2 for quadruple mutants and BC3S2 for triple mutants) as described above. Table 6 shows the percentage of C18: 3 of the total oil content.

Tabla 6: Desviación media (Av) y estándar (SD) de porcentaje (%) de contenido de C18:3 de aceite de semillas en Table 6: Average deviation (Av) and standard (SD) of percentage (%) of C18: 3 content of seed oil in

25 cruces masculinos y femeninos de élite tras apilamiento de los diferentes alelos mutantes FAD3 en la parte superior de los alelos mutantes FAD3A1 y/o FAD3C1. 25 elite male and female crosses after stacking the different FAD3 mutant alleles on top of the FAD3A1 and / or FAD3C1 mutant alleles.

Estos resultados demuestran que, en consonancia con los resultados anteriores, los alelos mutantes FAD3A2, FAD3A3 y FAD3C2 reducen adicionalmente el contenido de C18:3 en líneas que contienen alelos mutantes FAD3A1 y FAD3C1. Además de ello, especialmente en la línea femenina, el apilamiento de los mutantes FAD3A2 y FAD3A3 en un fondo con mutantes FAD3A1 y FAD3C1 incluso reduce adicionalmente el contenido de C18:3 a niveles claramente por debajo del 2%. These results demonstrate that, in line with the previous results, the mutant alleles FAD3A2, FAD3A3 and FAD3C2 further reduce the content of C18: 3 in lines containing mutant alleles FAD3A1 and FAD3C1. In addition, especially in the female line, the stacking of the FAD3A2 and FAD3A3 mutants in a background with FAD3A1 and FAD3C1 mutants even further reduces the content of C18: 3 to levels clearly below 2%.

Para investigar con mayor detalle el efecto de mutantes de apilamiento de genes FAD3 diferentes en la parte superior de los mutantes FAD3A1 y FAD3C1 LOLI105 y LOLI108, la composición de ácidos grasos se determinó en líneas que contenían dos, tres, cuatro o cinco genes FAD3 mutantes. Con este fin, las líneas que contenían los alelos LOLI105, LOLI103, LOLI108, LOLI111 y LOLI115 se retrocruzaron tres veces en líneas de élite de Brassica. Las plantas de la progenie que comprenden la mutación se autofecundaron posteriormente para obtener plantas homocigóticas y se cruzaron adicionalmente con líneas que contenían otros alelos FAD3 mutantes con el fin de obtener combinaciones de diferentes mutantes. Se analizó la composición de aceite en las semillas de estas plantas tras una segunda autofecundación (BC3S2) tal como se describe anteriormente. La Tabla 7 muestra el porcentaje de C18:3 del contenido total de aceite. To investigate in more detail the effect of stacking mutants of different FAD3 genes on top of the FAD3A1 and FAD3C1 LOLI105 and LOLI108 mutants, the fatty acid composition was determined in lines containing two, three, four or five mutant FAD3 genes . To this end, the lines containing the alleles LOLI105, LOLI103, LOLI108, LOLI111 and LOLI115 were backcrossed three times in elite Brassica lines. Progeny plants that comprise the mutation were subsequently self-fertilized to obtain homozygous plants and were additionally crossed with lines containing other mutant FAD3 alleles in order to obtain combinations of different mutants. The oil composition in the seeds of these plants was analyzed after a second self-fertilization (BC3S2) as described above. Table 7 shows the percentage of C18: 3 of the total oil content.

Tabla 7: Desviación media (Av) y estándar (SD) de porcentaje (%) de contenido de C18:3 de aceite de semillas en cruces masculinos y femeninos de élite tras apilamiento de los diferentes alelos mutantes FAD3 en la parte superior de los alelos mutantes FAD3A1 y/o FAD3C1. Table 7: Mean (Av) and standard deviation (SD) of percentage (%) of C18: 3 content of seed oil in elite male and female crosses after stacking of the different FAD3 mutant alleles on top of the alleles FAD3A1 and / or FAD3C1 mutants.

De la Tabla 7 se puede observar que cuantos más alelos mutantes de otros genes FAD en la parte superior de los alelos mutantes de FAD3A1 y FAD3C1, menor será el contenido de C18:3. En los mutantes cuádruples que comprenden alelos mutantes tanto FAD3A1 como FAD3C1, así como alelos mutantes de otros dos genes FAD3, el contenido de C18:3 se puede reducir hacia aproximadamente 1,5%, y en los mutantes quíntuples que comprenden alelos mutantes de FAD3A1, FAD3C1, FAD3A2, FAD3A2 y FAD3C2, el contenido de C18:3 en el aceite pueden reducirse adicionalmente hasta el 0,8%. From Table 7 it can be seen that the more mutant alleles of other FAD genes in the upper part of the mutant alleles of FAD3A1 and FAD3C1, the lower the content of C18: 3. In quadruple mutants comprising both FAD3A1 and FAD3C1 mutant alleles, as well as mutant alleles of two other FAD3 genes, the content of C18: 3 can be reduced to approximately 1.5%, and in quintuple mutants comprising FAD3A1 mutant alleles , FAD3C1, FAD3A2, FAD3A2 and FAD3C2, the C18: 3 content in the oil can be further reduced to 0.8%.

Se cree que en un fondo con un contenido de C18:3 en el aceite de semillas superior a estas líneas de élite masculina y femeninas, la introducción del alelo LOLI103 también tendrá un efecto adicional sobre la reducción de C18:3 en el aceite de semilla por los alelos mutantes FAD3-A1 y/o FAD3-C1. Se cree, además, que cuantos más alelos FAD3 mutantes se combinen en una planta, mayor será la reducción en el contenido de C18:3 del aceite de semillas. It is believed that in a fund with a C18: 3 content in the seed oil superior to these male and female elite lines, the introduction of the LOLI103 allele will also have an additional effect on the reduction of C18: 3 in the seed oil for the mutant alleles FAD3-A1 and / or FAD3-C1. It is also believed that the more mutant FAD3 alleles are combined in a plant, the greater the reduction in the C18: 3 content of the seed oil.

Ejemplo 9 -Análisis del efecto de genes FAD3 mutantes sobre la composición de ácidos grasos en plantas de Brassica cultivadas en el campo Example 9 - Analysis of the effect of mutant FAD3 genes on the composition of fatty acids in Brassica plants grown in the field

Se establecieron y se llevaron a cabo ensayos para analizar adicionalmente la correlación entre la presencia de genes FAD3 mutantes en plantas de Brassica y el contenido de C18:3 de aceite de semillas de plantas de Brassica en el campo. De las plantas de Brassica identificadas en el Ejemplo 5 (F1S2), plantas que comprenden un alelo mutante de cada uno de los genes FAD3 (LOLI105, LOLI103, LOLI108, LOLI115 y LOLI111) fue autofecundado para Trials were established and carried out to further analyze the correlation between the presence of mutant FAD3 genes in Brassica plants and the C18: 3 content of Brassica plant seed oil in the field. Of the Brassica plants identified in Example 5 (F1S2), plants comprising a mutant allele of each of the FAD3 genes (LOLI105, LOLI103, LOLI108, LOLI115 and LOLI111) were self-fertilized to

obtener plantas homocigóticas. Se hicieron cruces adicionales entre las líneas que contenían los genes FAD3 mutantes para obtener plantas con más de un gen FAD3 mutante. Las plantas fueron cultivadas en el campo en Bélgica (un lugar) y en Canadá (dos lugares). Se determinó la composición de ácidos grasos de la semilla de aceite de estas plantas (noBC) tal como se describe arriba. La Tabla 8 muestra el porcentaje de C18:3 del aceite total de las plantas de Brassica cultivadas en el campo en Bélgica, y la Tabla 9 muestra el porcentaje de C18:3 del aceite total de las plantas de Brassica cultivadas en dos lugares en el campo en Canadá. Obtain homozygous plants. Additional crossings were made between the lines containing the mutant FAD3 genes to obtain plants with more than one mutant FAD3 gene. The plants were grown in the field in Belgium (one place) and in Canada (two places). The fatty acid composition of the oil seed of these plants (noBC) was determined as described above. Table 8 shows the percentage of C18: 3 of the total oil of Brassica plants grown in the field in Belgium, and Table 9 shows the percentage of C18: 3 of the total oil of Brassica plants grown in two places in the field in Canada.

Tabla 8: Desviación media (Av) y estándar (SD) de porcentaje (%) de contenido de C18:3 de aceite de semillas en plantas de Brassica con diferentes genes FAD3 mutantes cultivados en el campo en Bélgica. Table 8: Average deviation (Av) and standard (SD) of percentage (%) of C18: 3 content of seed oil in Brassica plants with different mutant FAD3 genes grown in the field in Belgium.

alelo FAD3A1/FAD3A2/FAD3A3/FAD3C1/FAD3C2 FAD3A1 / FAD3A2 / FAD3A3 / FAD3C1 / FAD3C2 allele: Av C18:3 SD C18:3 Av C18: 3 SD C18: 3

TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 10,0 0,38 10.0 0.38

Mutantes sencillos LOLI105/TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W TIPO W/LOLI108/TIPO W/TIPO W/TIPO W TIPO W/TIPO W/LOLI111/TIPO W/TIPO W TIPO W/TIPO W/TIPO W/LOLI103/TIPO W TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W/LOLI115 Simple mutants LOLI105 / TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W TYPE W / LOLI108 / TYPE W / TYPE W / TYPE W TYPE W / TYPE W / LOLI111 / TYPE W / TYPE W TYPE W / TYPE W / TYPE W / LOLI103 / TYPE W TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W / LOLI115: 7,05 9,33 8,76 7,69 9,71 0,28 0,22 0,43 0,15 0,25 7.05 9.33 8.76 7.69 9.71 0.28 0.22 0.43 0.15 0.25

Mutantes dobles LOLI105/TIPO W/TIPO W/LOLI103/TIPO W TIPO W/LOLI108/TIPO W/LOLI103/TIPO W TIPO W/LOLI108/TIPO W/TIPO W/LOLI115 TIPOW/TIPOW/LOLI111/LOLI103/TIPO W Double mutants LOLI105 / TYPE W / TYPE W / LOLI103 / TYPE W TYPE W / LOLI108 / TYPE W / LOLI103 / TYPE W TYPE W / LOLI108 / TYPE W / TYPE W / LOLI115 TIPOW / TIPOW / LOLI111 / LOLI103 / TYPE W: 4,10 6,95 9,20 6,76 0,10 0,29 0,28 0,41 4.10 6.95 9.20 6.76 0.10 0.29 0.28 0.41

10 Tabla 9: Porcentaje (%) medio de contenido de C18:3 de aceite de semillas en plantas de Brassica con diferentes genes FAD3 mutantes cultivados en dos lugares el campo en Canadá. 10 Table 9: Average percentage (%) of C18: 3 content of seed oil in Brassica plants with different mutant FAD3 genes grown in two locations in the field in Canada.

alelo FAD3A1/FAD3A2/FAD3A3/FAD3C1/FAD3C2 FAD3A1 / FAD3A2 / FAD3A3 / FAD3C1 / FAD3C2 allele: C18 : 3 C18: 3

TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W: 12,26 12.26

Mutantes sencillos LOLI105/TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W TIPO W/LOLI108/TIPO W/TIPO W/TIPO W TIPO W/TIPO W/TIPO W/LOLI103/TIPO W TIPO W/TIPO W/TIPO W/TIPO W/LOLI115 Simple mutants LOLI105 / TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W TYPE W / LOLI108 / TYPE W / TYPE W / TYPE W TYPE W / TYPE W / TYPE W / LOLI103 / TYPE W TYPE W / TYPE W / TYPE W / TYPE W / LOLI115: 9,58 11,84 9,00 11,98 9.58 11.84 9.00 11.98

Mutantes dobles LOLI105/LOLI108/TIPO W/TIPO W/TIPO W LOLI105/TIPO W/TIPO W/LOLI103/TIPO W LOLI105/TIPO W/TIPO W/TIPO W/LOLI115 TIPO W/LOLI108/TIPO W/LOLI103/TIPO W TIPO W/LOLI108/TIPO W/TIPO W/LOLI115 Double mutants LOLI105 / LOLI108 / TYPE W / TYPE W / TYPE W LOLI105 / TYPE W / TYPE W / LOLI103 / TYPE W LOLI105 / TYPE W / TYPE W / TYPE W / LOLI115 TYPE W / LOLI108 / TYPE W / LOLI103 / TYPE W TYPE W / LOLI108 / TYPE W / TYPE W / LOLI115: 8,07 5,73 7,68 8,23 10,62 8.07 5.73 7.68 8.23 10.62

Mutantes triples LOLI105/LOLI108/TIPO W/LOLI103/TIPO W LOLI105/LOLI108/TIPO W/TIPO W/LOLI115 TIPO W/LOLI108/TIPO W/LOLI103/LOLI115 Mutante cuádruple Triple mutants LOLI105 / LOLI108 / TYPE W / LOLI103 / TYPE W LOLI105 / LOLI108 / TYPE W / TYPE W / LOLI115 TYPE W / LOLI108 / TYPE W / LOLI103 / LOLI115 Quadruple mutant: 4,49 7,08 8,12 4.49 7.08 8.12

LOLI105/LOLI108/TIPO W/LOLI103/LOLI115 LOLI105 / LOLI108 / TYPE W / LOLI103 / LOLI115: 3,54 3.54

LSD LSD: 0,62 0.62

Las Tablas 8 y 9 demuestran que, también en el campo, el aceite de semillas de plantas que comprenden los alelos mutantes FAD3-A1 o FAD3-C1 en estado homocigótico, el contenido de C18:3 del aceite de semillas se redujo en comparación con las plantas de tipo salvaje. Las plantas que comprenden alelos mutantes LOLI108, LOLI111 o LOLI115 en estado homocigótico muestran solamente una pequeña reducción en C18:3 en el aceite de semillas cuando se compara con aceite de semillas de plantas de tipo salvaje. Sin embargo, similar a en el invernadero, los alelos LOLI108, LOLI111 y LOLI115 tienen un efecto adicional sobre la reducción de C18:3 en el aceite de semillas por los alelos mutantes FAD3-A1 y/o FAD3-C1. Además, se observa de forma consistente que, para los mutantes dobles y triples, líneas que comprenden tanto el mutante FAD3A1 como el FAD3C1 contienen un contenido de C18:3 del aceite de semillas significativamente menor que otras líneas que contienen el mismo número de alelos FAD3 mutantes. Para los mutantes triples y cuádruples, se puede observar también, en particular cuando están presentes los alelos mutantes tanto de FAD3A1 como de FAD3C1, que cuantos más alelos FAD3 mutantes se apilen en el genoma, mayor será la reducción en el contenido de C18:3. Tables 8 and 9 demonstrate that, also in the field, the seed oil of plants comprising the FAD3-A1 or FAD3-C1 mutant alleles in the homozygous state, the C18: 3 content of the seed oil was reduced compared to Wild type plants. Plants comprising mutant alleles LOLI108, LOLI111 or LOLI115 in homozygous state show only a small reduction in C18: 3 in seed oil when compared with seed oil from wild-type plants. However, similar to in the greenhouse, the LOLI108, LOLI111 and LOLI115 alleles have an additional effect on the reduction of C18: 3 in seed oil by the mutant alleles FAD3-A1 and / or FAD3-C1. In addition, it is consistently observed that, for double and triple mutants, lines comprising both the FAD3A1 and FAD3C1 mutants contain a significantly lower C18: 3 content of seed oil than other lines that contain the same number of FAD3 alleles mutants For triple and quadruple mutants, it can also be observed, in particular when both the FAD3A1 and FAD3C1 mutant alleles are present, that the more mutant FAD3 alleles are stacked in the genome, the greater the reduction in the content of C18: 3 .

Se establecen ensayos adicionales para analizar la correlación entre la presencia de genes FAD3 mutantes en plantas de Brassica y el contenido de C18:3 de aceite de semillas de plantas de Brassica en el campo tras retrocruzamiento adicional con líneas de élite de Brassica. Additional tests are established to analyze the correlation between the presence of mutant FAD3 genes in Brassica plants and the C18: 3 content of Brassica plant seed oil in the field after further backcrossing with elite Brassica lines.

Ejemplo 10 -Detección y/o transferencia de alelos FAD3 mutantes líneas (de élite) de Brassica Example 10 - Detection and / or transfer of FAD3 alleles mutant (elite) lines from Brassica

Los genes FAD3 mutantes son transferidos a líneas de cultivo (de élite) de Brassica mediante el siguiente método: una planta que contiene un gen FAD3 mutante (planta donante) se cruza con una línea de cultivo (de élite) (parental de élite/parental recurrente) o la variedad que carece del gen FAD3 mutante. Se utiliza el esquema de introgresión siguiente (el alelo FAD3 mutante se abrevia como fad3, mientras que el tipo salvaje se representa como FAD3): Cruce inicial: fad3 / fad3 (planta donante) X FAD3 / FAD3 (parental de élite) Planta F1: FAD3 / fad3 Cruce BC1: FAD3 / fad3 X FAD3 / FAD3 (parental recurrente) Plantas BC1: 50% de FAD3 / fad3 y 50% de FAD3 / FAD3 El 50% de FAD3 / fad3 se seleccionan utilizando marcadores moleculares (p. ej., AFLP, PCR, Invader™, TaqMan® y similares; véase también más adelante) para el alelo FAD3 mutante (fad3). Cruce BC2: FAD3 / fad3 (planta BC1) X FAD3 / FAD3 (parental recurrente) Plantas BC2: 50% de FAD3 / fad3 y 50% de FAD3 / FAD3 El 50% FAD3 / fad3 se seleccionan utilizando marcadores moleculares para el alelo FAD3 (fad3) mutante. El retrocruzamiento se repite hasta BC3 a BC6 Plantas BC3-6: 50% de FAD3 / fad3 y 50% de FAD3 / FAD3 El 50% de FAD3 / fad3 se seleccionan utilizando marcadores moleculares para el alelo FAD3 (fad3) mutante. Para reducir el número de retrocruzamientos (p. ej., hasta BC3 en lugar de BC6), se pueden utilizar marcadores moleculares específicos para el fondo genético del parental de élite. Cruce BC3-6 S1: FAD3 / fad3 X FAD3 / fad3 Plantas BC3-6 S1: 25% de FAD3 / FAD3 y 50% de FAD3 / fad3 y 25% de fad3 / fad3 Se seleccionan plantas que contienen fad3 utilizando marcadores moleculares para el alelo FAD3 (fad3) mutante. Plantas BC3-6 S1 o BC3-6 S2 individuales que son homocigóticas para el alelo FAD3 mutante (fad3 / fad3) se seleccionan utilizando marcadores moleculares para los alelos FAD3 mutantes y de tipo salvaje. Estas plantas se utilizan entonces para la producción de semillas. The mutant FAD3 genes are transferred to Brassica (elite) culture lines by the following method: a plant that contains a mutant FAD3 gene (donor plant) is crossed with an (elite) parental (elite / parental parental) recurrent) or the variety lacking the mutant FAD3 gene. The following introgression scheme is used (the mutant FAD3 allele is abbreviated as fad3, while the wild type is represented as FAD3): Initial crossing: fad3 / fad3 (donor plant) X FAD3 / FAD3 (elite parent) Plant F1: FAD3 / fad3 Crossing BC1: FAD3 / fad3 X FAD3 / FAD3 (recurring parental) Plants BC1: 50% of FAD3 / fad3 and 50% of FAD3 / FAD3 50% of FAD3 / fad3 are selected using molecular markers (e.g. , AFLP, PCR, Invader ™, TaqMan® and the like; see also below) for the mutant FAD3 allele (fad3). BC2 crossing: FAD3 / fad3 (BC1 plant) X FAD3 / FAD3 (recurring parental) BC2 plants: 50% of FAD3 / fad3 and 50% of FAD3 / FAD3 50% FAD3 / fad3 are selected using molecular markers for the FAD3 allele ( fad3) mutant. The backcrossing is repeated up to BC3 to BC6 BC3-6 Plants: 50% of FAD3 / fad3 and 50% of FAD3 / FAD3 50% of FAD3 / fad3 are selected using molecular markers for the mutant FAD3 (fad3) allele. To reduce the number of backcrosses (eg, up to BC3 instead of BC6), specific molecular markers can be used for the genetic background of the elite parent. Crossing BC3-6 S1: FAD3 / fad3 X FAD3 / fad3 Plants BC3-6 S1: 25% of FAD3 / FAD3 and 50% of FAD3 / fad3 and 25% of fad3 / fad3 Plants containing fad3 are selected using molecular markers for FAD3 (fad3) mutant allele. Individual BC3-6 S1 or BC3-6 S2 plants that are homozygous for the mutant FAD3 allele (fad3 / fad3) are selected using molecular markers for the mutant and wild-type FAD3 alleles. These plants are then used for seed production.

Para seleccionar plantas que comprendan una mutación puntual en un alelo FAD3, se puede utilizar una secuenciación directa por técnicas de secuenciación estándares conocidos en la técnica, tales como las descritas en el Ejemplo 4. To select plants comprising a point mutation in an FAD3 allele, direct sequencing can be used by standard sequencing techniques known in the art, such as those described in Example 4.

Alternativamente, se puede utilizar la tecnología Invader™ (Third Wave Agbio) para discriminar plantas que comprenden una mutación puntual específica en un alelo FAD3 de plantas que no comprenden esa mutación puntual específica. La discriminación de sondas mediante Invader™ fue por lo tanto desarrollada para detectar la presencia o ausencia y el estado de zigosidad de alelos mutantes identificados en el Ejemplo 4, en particular LOLI103, LOLI105, LOLI108, LOLI111 y LOLI115, basado en la diferencia de un solo nucleótido entre el alelo mutante y el de tipo salvaje . Brevemente, se desarrollaron sondas específicas para el gen FAD3 diana mutante o de tipo salvaje correspondiente (indicado en lo sucesivo como "5' flap1-x1" y "5' flap2-x2", respectivamente, en donde x1 y x2 representan secuencias específicas para el alelo de tipo salvaje y mutante) y sondas "invasoras" que se pueden utilizar en combinación con ellos. Generalmente, cada una de las sondas consiste en una sonda específica para el mutante o el gen diana de tipo salvaje del cual el primer nucleótido después de la secuencia 5' flap coincide con la diferencia de nucleótido (la denominada "sonda primaria") y una sonda específica para los nucleótidos aguas arriba de la diferencia de nucleótidos (el denominado "oligo invader®"). El último nucleótido de este último cebador puede coincidir con la diferencia de nucleótidos en el mutante, pero también se pueden utilizar otros nucleótidos para este último nucleótido, siempre y cuando la sonda primaria y el oligo Invader® sean todavía capaces de formar Alternatively, Invader ™ (Third Wave Agbio) technology can be used to discriminate plants that comprise a specific point mutation in an FAD3 allele of plants that do not comprise that specific point mutation. Probe discrimination by Invader ™ was therefore developed to detect the presence or absence and zygosity status of mutant alleles identified in Example 4, in particular LOLI103, LOLI105, LOLI108, LOLI111 and LOLI115, based on the difference of a single nucleotide between the mutant and wild-type allele. Briefly, specific probes for the corresponding mutant or wild-type target FAD3 gene were developed (hereinafter referred to as "5 'flap1-x1" and "5' flap2-x2", respectively, where x1 and x2 represent specific sequences for the wild-type and mutant allele) and "invasive" probes that can be used in combination with them. Generally, each of the probes consists of a specific probe for the wild-type mutant or target gene of which the first nucleotide after the 5 'flap sequence coincides with the nucleotide difference (the so-called "primary probe") and a specific probe for nucleotides upstream of the nucleotide difference (the so-called "oligo invader®"). The last nucleotide of this last primer may coincide with the difference of nucleotides in the mutant, but other nucleotides can also be used for this last nucleotide, as long as the primary probe and the Invader® oligo are still capable of forming

un solapamiento de una sola base cuando se hibrida con el ADN diana para generar la estructura invasiva específica reconocida por las enzimas Cleavase® (Third Wave Agbio). El proceso de ensayo Invader™ y la interpretación de los datos se realizan según las indicaciones del fabricante (Third Wave Agbio).Brevemente, las secuencias de nucleótidos indicadas como "flap 1" y "flap2" representan las secuencias de las 5' "flaps", que se escinden de las 5 sondas primarias en la fase primaria del ensayo Invader™ y que son complementarias a secuencias en las casetes FRET™ 1 y 2, respectivamente, y que no son complementarias a las secuencias mutante diana o de tipo salvaje. Si las sondas primarias se escinden en la fase primaria y el la sonda flap1 y/o la sonda flap2 se hibridan a las casetes FRET™ 1 y 2, respectivamente, en la fase secundaria, se genera una señal indicativa de la presencia en la muestra del gen FAD3 diana mutante o de tipo salvaje correspondiente, respectivamente. Los siguientes ensayos Invader™ a single base overlap when hybridized with the target DNA to generate the specific invasive structure recognized by the Cleavase® (Third Wave Agbio) enzymes. The Invader ™ test process and the interpretation of the data are performed according to the manufacturer's instructions (Third Wave Agbio). Briefly, the nucleotide sequences indicated as "flap 1" and "flap2" represent the sequences of the 5 '"flaps ", which are cleaved from the 5 primary probes in the primary phase of the Invader ™ assay and which are complementary to sequences in the FRET ™ 1 and 2 cassettes, respectively, and which are not complementary to the wild-type or target mutant sequences. If the primary probes are cleaved in the primary phase and the flap1 and / or the flap2 probe are hybridized to FRET ™ 1 and 2 cassettes, respectively, in the secondary phase, a signal indicative of the presence in the sample is generated. of the corresponding mutant or wild-type FAD3 target gene, respectively. The following Invader ™ tests

10 discriminatorios fueron por lo tanto desarrollados para detectar la presencia o ausencia y el estado de la zigosidad de los alelos mutantes identificados en el Ejemplo 4 (véase la Tabla 2): 10 discriminatory ones were therefore developed to detect the presence or absence and the zygosity status of the mutant alleles identified in Example 4 (see Table 2):

Tabla 10: Sondas Invader, cebadores directos (Fw) e inversos (Rv). La posición de la mutación está subrayada, sonda FAM: alelo mutante, sonda VIC: alelo de tipo salvaje.
Table 10: Invader probes, direct primers (Fw) and inverse (Rv). The position of the mutation is underlined, FAM probe: mutant allele, VIC probe: wild type allele.

alelo allele: sonda cebador probe primer

colorante Colorant: secuencia (5'-3') Fw/Rv secuencia (5'-3') sequence (5'-3 ') Fw / Rv sequence (5'-3 ')

LOLI 105 LOLI 105: FAM TCTTTGTAATGTGATTGGA SEQ ID NO: 18 Fw CAGTCACAGTTCTCAAAGTCTATGGAG SEQ ID NO: 20 FAM TCTTTGTAATGTGATTGGA SEQ ID NO: 18 Fw CAGTCACAGTTCTCAAAGTCTATGGAG SEQ ID NO: 20

VIC VIC: CTTTGTAATGTGGTTGGAC SEQ ID NO: 19 Rv TGCCTCTGTACCAAGGCAACTTAT SEQ ID NO: 21 CTTTGTAATGTGGTTGGAC SEQ ID NO: 19 Rv TGCCTCTGTACCAAGGCAACTTAT SEQ ID NO: 21

LOLI 103 LOLI 103: FAM GGATGACTACAGTGATACA SEQ ID NO: 22 Fw CCTCTCTATCTGGTAAATCCTAATTCCTAA SEQ ID NO: 24 FAM GGATGACTACAGTGATACA SEQ ID NO: 22 Fw CCTCTCTATCTGGTAAATCCTAATTCCTAA SEQ ID NO: 24

VIC VIC: GATGACTACAGTGGTACAGA SEQ ID NO: 23 Rv GTATGGGTTATAATGTGACCCTTCTTTAC SEQ ID NO: 25 GATGACTACAGTGGTACAGA SEQ ID NO: 23 Rv GTATGGGTTATAATGTGACCCTTCTTTAC SEQ ID NO: 25

LOLI 108 LOLI 108: FAM ATCTTTGTAATGTAGTTGGA SEQ ID NO: 26 Fw GGTGTTCCTTACATTGTAAGTTTCACA SEQ ID NO: 28 FAM ATCTTTGTAATGTAGTTGGA SEQ ID NO: 26 Fw GGTGTTCCTTACATTGTAAGTTTCACA SEQ ID NO: 28

VIC VIC: ATCTTTGTAATGTGGTTGGA SEQ ID NO: 27 Rv GCCTCTGTACCAAGGCAACTTCT SEQ ID NO: 29 ATCTTTGTAATGTGGTTGGA SEQ ID NO: 27 Rv GCCTCTGTACCAAGGCAACTTCT SEQ ID NO: 29

LOLI 111 LOLI 111: FAM TTACTGCAGTGATACAGAA SEQ ID NO: 30 Fw CGCTTACCCGATCTATCTGGTATTT SEQ ID NO: 32 FAM TTACTGCAGTGATACAGAA SEQ ID NO: 30 Fw CGCTTACCCGATCTATCTGGTATTT SEQ ID NO: 32

VIC VIC: TTACTGCAGTGGTACAGA SEQ ID NO: 31 Rv GGGTTAAAATGTGACCCTTCTTTTC SEQ ID NO: 33 TTACTGCAGTGGTACAGA SEQ ID NO: 31 Rv GGGTTAAAATGTGACCCTTCTTTTC SEQ ID NO: 33

LOLI 115 LOLI 115: FAM GACCTTAACTACAGTAGTAC SEQ ID NO: 34 Fw ATGCTCGCTTACCCGATCTATTT SEQ ID NO: 36 FAM GACCTTAACTACAGTAGTAC SEQ ID NO: 34 Fw ATGCTCGCTTACCCGATCTATTT SEQ ID NO: 36

VIC VIC: ACCTTAACTACAGTGGTACA SEQ ID NO: 35 Rv CTCTCGCTTGGAGCAAATAAACTA SEQ ID NO: 37 ACCTTAACTACAGTGGTACA SEQ ID NO: 35 Rv CTCTCGCTTGGAGCAAATAAACTA SEQ ID NO: 37

LISTADO DE SECUENCIAS SEQUENCE LIST

<110> Bayer Bioscience N.v. Laga, Benjamin Denolf, Peter <110> Bayer Bioscience N.v. Laga, Benjamin Denolf, Peter

<120> Plantas de Brassica que comprenden alelos FAD3 mutantes <120> Brassica plants comprising mutant FAD3 alleles

<130> BCS09-2011 <130> BCS09-2011

10 <150> EP09075513.3 10 <150> EP09075513.3

<151> <151>

<150> US 61/263,042 <150> US 61 / 263,042

<151> 15 <151> 15

<160> 37 <160> 37

<170> PatentIn version 3.3 <170> PatentIn version 3.3

20 <210> 1 20 <210> 1

<211> 2985 <211> 2985

<212> ADN <212> DNA

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

25 <220> 25 <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (1)..(281) <222> (1) .. (281)

<220> 30 <221> CDS <220> 30 <221> CDS

<222> (838)..(927) <222> (838) .. (927)

<220> <220>

<221> CDS 35 <222> (1463)..(1529) <221> CDS 35 <222> (1463) .. (1529)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (1931)..(2023) 40 <222> (1931) .. (2023) 40

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (2128)..(2313) <222> (2128) .. (2313)

45 <220> 45 <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (2391)..(2471) <222> (2391) .. (2471)

<220> 50 <221> CDS <220> 50 <221> CDS

<222> (2559)..(2696) <222> (2559) .. (2696)

<220> <220>

<221> CDS 55 <222> (2791)..(2985) <221> CDS 55 <222> (2791) .. (2985)

<400> 1 <400> 1

<210> 2 <210> 2

<211> 377 <211> 377

<212> PRT <212> PRT

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

<400> 2 <400> 2

<210> 3 <210> 3

<211> 3555 <211> 3555

<212> ADN <212> DNA

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (1)..(290) <222> (1) .. (290)

<220> <220>

<221> CDS 5 <222> (882)..(971) <221> CDS 5 <222> (882) .. (971)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (2032)..(2098) 10 <222> (2032) .. (2098) 10

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (2499)..(2591) <222> (2499) .. (2591)

15 <220> 15 <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (2700)..(2885) <222> (2700) .. (2885)

<220> 20 <221> CDS <220> 20 <221> CDS

<222> (2964)..(3044) <222> (2964) .. (3044)

<220> <220>

<221> CDS 25 <222> (3130)..(3267) <221> CDS 25 <222> (3130) .. (3267)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (3361)..(3555) 30 <222> (3361) .. (3555) 30

<400> 3 <400> 3

<210> 5 <210> 5

<211> 4512 5 <212> ADN <211> 4512 5 <212> DNA

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

<220> <220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(299) <221> CDS 10 <222> (1) .. (299)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (923)..(1012) <222> (923) .. (1012)

<220> <220>

<221> CDS 5 <222> (1683)..(1749) <221> CDS 5 <222> (1683) .. (1749)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (3451)..(3543) 10 <222> (3451) .. (3543) 10

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (3650)..(3835) <222> (3650) .. (3835)

15 <220> 15 <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (3921)..(4001) <222> (3921) .. (4001)

<220> 20 <221> CDS <220> 20 <221> CDS

<222> (4096)..(4233) <222> (4096) .. (4233)

<220> <220>

<221> CDS 25 <222> (4318)..(4512) <221> CDS 25 <222> (4318) .. (4512)

<400> 5 <400> 5

<210> 6 <210> 6

<211> 383 5 <212> PRT <211> 383 5 <212> PRT

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

<400> 6 <400> 6

<210> 7 <210> 7

<211> 3729 <211> 3729

<212> ADN <212> DNA

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (1)..(299) <222> (1) .. (299)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (782)..(871) <222> (782) .. (871)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (1687)..(1753) <222> (1687) .. (1753)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (2665)..(2757) <222> (2665) .. (2757)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (2845)..(3030) <222> (2845) .. (3030)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (3125)..(3205) <222> (3125) .. (3205)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (3300)..(3437) <222> (3300) .. (3437)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (3535)..(3729) <222> (3535) .. (3729)

<400> 7 5 <400> 7 5

<210> 8 <210> 8

<211> 383 <211> 383

<212> PRT <212> PRT

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

<400> 8 <400> 8

<210> 9 <210> 9

<211> 4770 <211> 4770

<212> ADN <212> DNA

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (1)..(299) <222> (1) .. (299)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (913)..(1002) <222> (913) .. (1002)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (1665)..(1731) <222> (1665) .. (1731)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (3709)..(3801) <222> (3709) .. (3801)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (3908)..(4093) <222> (3908) .. (4093)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (4179)..(4259) <222> (4179) .. (4259)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (4354)..(4491) <222> (4354) .. (4491)

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (4576)..(4770) <222> (4576) .. (4770)

<400> 9 <400> 9

<210> 10 <210> 10

<211> 383 <211> 383

<212> PRT <212> PRT

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

<400> 10 <400> 10

<210> 11 <210> 11

<211> 1131 <211> 1131

<212> ADN <212> DNA

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

<400> 11 <400> 11

<210> 12 <210> 12

<211> 1140 <211> 1140

<212> ADN <212> DNA

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

<400> 12 <400> 12

<210> 13 15 <211> 1149 <210> 13 15 <211> 1149

<212> ADN <212> DNA

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

<400> 13 <400> 13

<210> 14 <210> 14

<211> 1149 10 <212> ADN <211> 1149 10 <212> DNA

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

<400> 14 <400> 14

<210> 15 5 <211> 1149 <210> 15 5 <211> 1149

<212> ADN <212> DNA

<213> Brassica napus <213> Brassica napus

<400> 15 10 <400> 15 10

<210> 16 <210> 16

<211> 20 <211> 20

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> cebador de PCR <223> PCR primer

<400> 16 tggagttatc tacgtggagg 20 <400> 16 tggagttatc tacgtggagg 20

<210> 17 <210> 17

<211> 20 <211> 20

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> cebador de PCR <223> PCR primer

<400> 17 gcgtaaacgt agagatctgg 20 <400> 17 gcgtaaacgt agagatctgg 20

<210> 18 <210> 18

<211> 19 <211> 19

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> sonda <223> probe

<400> 18 tctttgtaat gtgattgga 19 <400> 18 tctttgtaat gtgattgga 19

<210> 19 <210> 19

<211> 19 <211> 19

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> sonda <223> probe

<400> 19 ctttgtaatg tggttggac 19 <400> 19 ctttgtaatg tggttggac 19

<210> 20 <210> 20

<211> 27 <211> 27

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> cebador <223> primer

<400> 20 cagtcacagt tctcaaagtc tatggag 27 <400> 20 cagtcacagt tctcaaagtc tatggag 27

<210> 21 <210> 21

<211> 24 <211> 24

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> cebador <223> primer

<400> 21 tgcctctgta ccaaggcaac ttat 24 <400> 21 tgcctctgta ccaaggcaac ttat 24

<210> 22 <210> 22

<211> 19 <211> 19

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> sonda <223> probe

<400> 22 ggatgactac agtgataca 19 <400> 22 ggatgactac agtgataca 19

<210> 23 <210> 23

<211> 20 <211> 20

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> sonda <223> probe

<400> 23 gatgactaca gtggtacaga 20 <400> 23 gatgactaca gtggtacaga 20

<210> 24 <210> 24

<211> 30 <211> 30

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> cebador <223> primer

<400> 24 cctctctatc tggtaaatcc taattcctaa 30 <400> 24 cctctctatc tggtaaatcc taattcctaa 30

<210> 25 <210> 25

<211> 29 <211> 29

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> cebador <223> primer

<400> 25 gtatgggtta taatgtgacc cttctttac 29 <400> 25 gtatgggtta taatgtgacc cttctttac 29

<210> 26 <210> 26

<211> 20 <211> 20

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> sonda <223> probe

<400> 26 atctttgtaa tgtagttgga 20 <400> 26 atctttgtaa tgtagttgga 20

<210> 27 <210> 27

<211> 20 <211> 20

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> sonda <223> probe

<400> 27 atctttgtaa tgtggttgga 20 <400> 27 atctttgtaa tgtggttgga 20

<210> 28 <210> 28

<211> 27 <211> 27

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> cebador <223> primer

<400> 28 ggtgttcctt acattgtaag tttcaca 27 <400> 28 ggtgttcctt acattgtaag tttcaca 27

<210> 29 <210> 29

<211> 23 <211> 23

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> cebador <223> primer

<400> 29 gcctctgtac caaggcaact tct 23 <400> 29 gcctctgtac caaggcaact tct 23

<210> 30 <210> 30

<211> 19 <211> 19

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> sonda <223> probe

<400> 30 ttactgcagt gatacagaa 19 <400> 30 ttactgcagt gatacagaa 19

<210> 31 <210> 31

<211> 18 <211> 18

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> sonda <223> probe

<400> 31 ttactgcagt ggtacaga 18 <400> 31 ttactgcagt ggtacaga 18

<210> 32 <210> 32

<211> 25 <211> 25

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> cebador <223> primer

<400> 32 cgcttacccg atctatctgg tattt 25 <400> 32 cgcttacccg atctatctgg tattt 25

<210> 33 <210> 33

<211> 25 <211> 25

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> cebador <223> primer

<400> 33 gggttaaaat gtgacccttc ttttc 25 <400> 33 gggttaaaat gtgacccttc ttttc 25

<210> 34 <210> 34

<211> 20 <211> 20

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> sonda <223> probe

<400> 34 gaccttaact acagtagtac 20 <400> 34 gaccttaact acagtagtac 20

<210> 35 <210> 35

<211> 20 <211> 20

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> sonda <223> probe

<400> 35 accttaacta cagtggtaca 20 <400> 35 accttaacta cagtggtaca 20

<210> 36 <210> 36

<211> 23 <211> 23

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> cebador <223> primer

<400> 36 atgctcgctt acccgatcta ttt 23 <400> 36 atgctcgctt acccgatcta ttt 23

<210> 37 <210> 37

<211> 24 <211> 24

<212> ADN <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> cebador <223> primer

<400> 37 ctctcgcttg gagcaaataa acta 24 <400> 37 ctctcgcttg gagcaaataa act 24

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una planta de Brassica que comprende al menos dos alelos FAD3 mutantes, totalmente inactivados, en donde 1. A Brassica plant comprising at least two mutant FAD3 alleles, totally inactivated, where

i. el primer alelo FAD3 mutante totalmente inactivado es un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado de un gen FAD3, comprendiendo dicho gen FAD3 una secuencia de nucleótidos que i. the first totally inactivated mutant FAD3 allele is a totally inactivated mutant FAD3 allele of an FAD3 gene, said FAD3 gene comprising a nucleotide sequence that

a. to.: se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 3; o is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO : 3; or

b. b.: se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 11 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 12; o is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 11 and a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO : 12; or

c. C.: se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 2 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 4; is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 2 and a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 4;

en donde dicho primer alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una secuencia de nucleótidos que wherein said first fully inactivated mutant FAD3 allele comprises a nucleotide sequence that

c. C.: se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 2 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 4; y is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 2 and a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 4; Y

ii. el segundo alelo FAD3 mutante totalmente inactivado es un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado de un gen FAD3, comprendiendo dicho gen FAD3 una secuencia de nucleótidos que ii. the second totally inactivated mutant FAD3 allele is a totally inactivated mutant FAD3 allele of an FAD3 gene, said FAD3 gene comprising a nucleotide sequence that

a. to.: se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 5, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 7 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 9; o is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 5, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO : 7 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 9; or

b. b.: se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 13, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 14 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 15; o is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 13, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO : 14 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 15; or

c. C.: se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 8 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 10; is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 6, a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 8 and a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 10;

en donde dicho segundo alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una secuencia de nucleótidos que wherein said second fully inactivated mutant FAD3 allele comprises a nucleotide sequence that

c. C.: se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 8 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 10; y is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 6, a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 8 and a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 10; Y

en donde dichos al menos dos alelos FAD3 mutantes totalmente inactivados comprenden una mutación del grupo de: wherein said at least two fully inactivated mutant FAD3 alleles comprise a mutation of the group of:

i. una deleción, mutación de desplazamiento de marco o de codón de parada que conduce a una deleción completa de la proteína; i. a deletion, frame shift or stop codon mutation that leads to a complete deletion of the protein;

iv. iv.: una mutación de sentido erróneo en el codón que codifica cualquiera de las histidinas conservadas en una posición correspondiente a la posición 92, 96, 128, 131, 132, 295, 298 ó 299 de SEQ ID NO: 2; y a missense mutation in the codon encoding any of the histidines conserved in a position corresponding to position 92, 96, 128, 131, 132, 295, 298 or 299 of SEQ ID NO: 2; Y

v. v.: una mutación sin sentido que resulta del uso de un ATG alternativo como codón de inicio y la síntesis de una proteína truncada en el extremo N que carece de la secuencia señal putativa. a nonsense mutation that results from the use of an alternative ATG as a start codon and the synthesis of a truncated protein at the N-terminus that lacks the putative signal sequence.

2. La planta de la reivindicación 1, que comprende, además, un tercer, o un tercer y un cuarto, o un tercer, un cuarto y un quinto alelo FAD3 mutante totalmente inactivado, en donde 2. The plant of claim 1, further comprising a third, or a third and a fourth, or a third, a fourth and fifth mutant FAD3 allele totally inactivated, wherein

a. dicho tercer alelo FAD3 mutante totalmente inactivado es un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado de un gen FAD3, comprendiendo dicho gen FAD3 una secuencia de nucleótidos que to. said third totally inactivated mutant FAD3 allele is a totally inactivated mutant FAD3 allele of a FAD3 gene, said FAD3 gene comprising a nucleotide sequence that

iii. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 2 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 4; iii. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 2 and a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 4;

en donde dicho tercer alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una secuencia de nucleótidos que wherein said third totally inactivated mutant FAD3 allele comprises a nucleotide sequence that

iii. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 2 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 4; y iii. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 2 and a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 4; Y

b. dicho cuarto y dicho quinto alelo FAD3 mutante totalmente inactivado es en cada caso un alelo FAD3 mutante totalmente inactivado de un gen FAD3, comprendiendo dicho gen FAD3 una secuencia de nucleótidos que b. said fourth and said fifth totally inactivated mutant FAD3 allele is in each case a totally inactivated mutant FAD3 allele of a FAD3 gene, said FAD3 gene comprising a nucleotide sequence that

i. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 5, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 7 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 9; o i. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 5, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO : 7 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 9; or

ii. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 13, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 14 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 15; o ii. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 13, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO : 14 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 15; or

iii. se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 8 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 10; iii. is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 6, a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 8 and a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 10;

en donde dicho cuarto y dicho quinto alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende cada uno una secuencia de nucleótidos que wherein said fourth and said fifth totally inactivated mutant FAD3 allele each comprises a nucleotide sequence that

y en donde dichos alelos FAD3 mutantes totalmente inactivados son alelos mutantes de diferentes genes FAD3. and wherein said totally inactivated mutant FAD3 alleles are mutant alleles of different FAD3 genes.

3.3.: La planta de la reivindicación 1 ó 2, en donde dichos alelos FAD3 totalmente inactivados se seleccionan del grupo que consiste en una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, en donde la G en la posición 2405 está sustituida con A; una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, en donde la G en la posición 2702 está sustituida con A; una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, en donde la G en la posición 3934 está sustituida con A; una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, en donde la G en la posición 2847 está sustituida con A; y una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, en donde la G en la posición 3909 está sustituida con A. The plant of claim 1 or 2, wherein said fully inactivated FAD3 alleles are selected from the group consisting of a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the G at position 2405 is substituted with A; a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, wherein the G at position 2702 is substituted with A; a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, wherein the G at position 3934 is substituted with A; a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, wherein the G in position 2847 is substituted with A; and a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, wherein the G at position 3909 is substituted with A.

4.Four.: Un alelo mutante totalmente inactivado de un gen FAD3, comprendiendo dicho gen FAD3 una secuencia de nucleótidos que A totally inactivated mutant allele of an FAD3 gene, said FAD3 gene comprising a nucleotide sequence that

(a) (to): se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 5, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 7 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 9; o is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 5, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO : 7 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 90% with SEQ ID NO: 9; or

(b) (b): se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 13, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 14 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 15; o is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 13, a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO : 14 and a nucleotide sequence having a sequence identity of at least 95% with SEQ ID NO: 15; or

(c) (C): se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 8 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 10, is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 6, a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 8 and a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 10,

en donde dicho alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una secuencia de nucleótidos que wherein said totally inactivated mutant FAD3 allele comprises a nucleotide sequence that

(c) (C): se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO:8 y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 98% con SEQ ID NO:10, is selected from the group consisting of a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 6, a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that has an identity of the sequence of at least 98% with SEQ ID NO: 8 and a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having a sequence identity of at least 98% with SEQ ID NO: 10,

y en donde dicho alelo FAD3 mutante totalmente inactivado comprende una mutación del grupo que consiste en: and wherein said totally inactivated mutant FAD3 allele comprises a mutation of the group consisting of:

ii. una mutación de codón de parada, desplazamiento de marco o sitio de corte y empalme que conduce a una truncación de la proteína FAD3 que incluye el motivo de retención ER en una posición correspondiente a la posición 373-377 de SEQ ID NO: 2; ii. a stop codon mutation, frame shift or splice site that leads to a truncation of the FAD3 protein that includes the ER retention motif at a position corresponding to position 373-377 of SEQ ID NO: 2;

5. 5.: Un alelo mutante totalmente inactivado de un gen FAD3 , que se selecciona del grupo que consiste en una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, en donde la G en la posición 2405 está sustituida con A; una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, en donde la G en la posición 2702 está sustituida con A; una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, en donde la G en la posición 3934 está sustituida con A; una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, en donde la G en la posición 2847 está sustituida con A; y una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, en donde la G en la posición 3909 está sustituida con A. A fully inactivated mutant allele of an FAD3 gene, which is selected from the group consisting of a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the G at position 2405 is substituted with A; a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, wherein the G at position 2702 is substituted with A; a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, wherein the G at position 3934 is substituted with A; a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, wherein the G in position 2847 is substituted with A; and a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, wherein the G at position 3909 is substituted with A.

6.6.: Una célula vegetal, semilla o progenie de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha célula vegetal, semilla o progenie comprende al menos dos alelos FAD3 mutantes, totalmente inactivados según se describe en la reivindicación 1. A plant cell, seed or plant progeny of any one of claims 1 to 3, wherein said plant cell, seed or progeny comprises at least two mutant FAD3 alleles, totally inactivated as described in claim 1.

7. 7.: Un método para producir un aceite de semillas, que comprende machacar las semillas de las plantas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dichas semillas al menos dos alelos FAD3 mutantes, totalmente inactivados según se describe en la reivindicación 1. A method for producing a seed oil, comprising crushing the seeds of the plants of any one of claims 1 to 3, said seeds comprising at least two mutant FAD3 alleles, totally inactivated as described in claim 1.

8.8.: Una planta de Brassica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una célula, tejido, órgano, semilla o progenie de la misma que comprende al menos dos alelos FAD3 mutantes, totalmente inactivados según se describe en la reivindicación 1, obtenible de una semilla seleccionada del grupo que consiste en: A Brassica plant according to any one of claims 1 to 3, or a cell, tissue, organ, seed or progeny thereof comprising at least two mutant FAD3 alleles, totally inactivated as described in claim 1, obtainable of a seed selected from the group consisting of:

--: semilla de Brassica que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, en donde la G en la posición 2405 está sustituida con A, y una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, en donde la G en la posición 2702 está sustituida con A, habiendo sido depositada dicha semilla en NCIMB Limited el 9 de octubre de 2009 bajo el número de acceso NCIMB 41655; Brassica seed comprising a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the G at position 2405 is substituted with A, and a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, where the G in position 2702 is substituted with A, said seed having been deposited in NCIMB Limited on October 9, 2009 under the accession number NCIMB 41655;

--: semilla de Brassica que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, en donde la G en la posición 3934 está sustituida con A, y una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, en donde la G en la posición 3909 está sustituida con A, habiendo sido depositada dicha semilla en NCIMB Limited el 9 de octubre de 2009 bajo el número de acceso NCIMB 41656; Brassica seed comprising a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, wherein the G in position 3934 is substituted with A, and a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, where the G in position 3909 is replaced with A, said seed having been deposited in NCIMB Limited on October 9, 2009 under the accession number NCIMB 41656;

y Y

--: semilla de Brassica que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, en donde la G en la posición 2847 está sustituida con A, habiendo sido depositada dicha semilla en NCIMB Limited el 9 de octubre de 2009 bajo el número de acceso NCIMB 41657. Brassica seed comprising a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, wherein the G in position 2847 is substituted with A, said seed having been deposited with NCIMB Limited on October 9, 2009 under accession number NCIMB 41657.

9. 9.: Un método para determinar el estado de zigosidad de un alelo FAD3 mutante de una cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5 en una planta, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, que comprende determinar la presencia de un mutante y/o una correspondiente región específica para FAD3 de tipo salvaje en el ADN genómico de dicha planta, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma. A method for determining the zygosity state of a mutant FAD3 allele of any one of claims 4 or 5 in a plant, or a cell, part, seed or progeny thereof, which comprises determining the presence of a mutant and / or a corresponding region specific for wild-type FAD3 in the genomic DNA of said plant, or a cell, part, seed or progeny thereof.

10. 10.: Uso de una combinación de alelos FAD3 mutantes según se describe en la reivindicación 1 ó 2, para reducir el contenido en C18:3 en el aceite de semillas de una planta de Brassica. Use of a combination of mutant FAD3 alleles as described in claim 1 or 2, to reduce the C18: 3 content in the seed oil of a Brassica plant.

11. eleven.: Uso de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la semilla de la reivindicación 6 u 8, para producir aceite de semilla de colza o una torta de aceite de semilla de colza. Use of the plant of any one of claims 1 to 3 or the seed of claim 6 or 8, to produce rapeseed oil or a rapeseed oil cake.