ES2573807T3 - Procedimiento de determinación de susceptibilidad a las infecciones nosocomiales - Google Patents

Procedimiento de determinación de susceptibilidad a las infecciones nosocomiales Download PDF

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Abstract

Procedimiento de determinación de la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales en un paciente, que comprende las etapas siguientes: - medir la expresión de sCD127 en una muestra biológica procedente de dicho paciente o muestra problema, - concluir una susceptibilidad aumentada a las infeccionas nosocomiales después de la comparación de la expresión de CD127 con respecto a un valor de referencia.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento de determinacion de susceptibilidad a las infecciones nosocomiales
La presente invencion se refiere al campo medico en general, y en particular el campo de la reanimacion.
Mas precisamente, la invencion se refiere a un procedimiento de determinacion de la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales en un paciente hospitalizado en reanimacion y/o que haya sufrido una agresion, tal como cirugfa, quemadura, traumatismo..., que genera una respuesta inflamatoria sistemica o SIRS, en particular en un paciente en estado septico, en concreto grave, y preferentemente en un paciente en choque septico.
Las infecciones nosocomiales son un problema de salud publico importante. Los pacientes hospitalizados tienen a menudo, por naturaleza, defensas inmunitarias disminuidas o alteradas, debido a patologfas que afectan directamente sus competencias inmunitarias, o por su estado general. Estos pacientes, y en particular las personas desnutridas o con edades extremas de la vida (personas mayores, recien nacidos) son especialmente sensibles a las infecciones en general, y en particular a la aparicion de infecciones nosocomiales.
El predominio de las infecciones nosocomiales es considerablemente mas elevado en las unidades de reanimacion que el que se observa en otros sectores hospitalarios. La incidencia importante de las infecciones nosocomiales en este sector se explica por la conjuncion deleterea de varios factores de riesgo endogenos: una exposicion del paciente a procedimientos invasivos (ventilacion artificial, drenaje urinario, cateterismo), la gravedad de los pacientes (asf como las comorbilidades asociadas) y los tratamientos (transfusiones multiples, sedacion). Sin embargo a pesar del conjunto de las medidas de higiene y de vigilancia (riesgos exogenos) y la consideracion de estos factores de riesgo endogenos, la incidencia de las infecciones nosocomiales permanece estable o disminuye modestamente.
Determinar la susceptibilidad de un paciente a las infecciones nosocomiales es por tanto esencial para poder proponer una atencion personalizada, e intentar de este modo minimizar los riesgos adicionales de fallecimiento.
Segun los inventores, el unico marcador inmunologico conocido en la actualidad por estar asociado a una susceptibilidad aumentada a las infecciones nosocomiales es el marcador HLA-DR (Human Leukocyte Antigen- DR) cuya expresion en los monocitos (mHLA-DR) disminuye en los pacientes que desarrollan infecciones nosocomiales. Sin embargo, la expresion de este marcador, desarrollada en citometna de flujo necesita un equipo particular (citometro de flujo), que no esta disponible en las plataformas de biologfa (uso reservado a laboratorios especializados de hematologfa o de inmunologfa) y cuya estandarizacion de uso no esta establecida. Por tanto no se puede realizar la medicion de mHLA-DR de manera rutinaria.
Los artfculos cientfficos siguientes describen el marcador HLA-DR como asociado a la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales en un paciente: Cheron A et al., “diminution de l'expression monocytaire de HLA-DR et risque d'infection hospitaliere”, Annales Frangaises d'Anesthesie et de Reanimation 2010, 29(5): 368-376;
Landelle C et al., “Low monocyte human leukocyte antigen-DR is independently associated with nosocomial infections after septic shock”, Intensive Care Medicine 2010, 36(11): 1859-1866.
La susceptibilidad a las infecciones nosocomiales puede determinarse tambien mediante la medicion combinada de CD4, CD25 y CD127 en la superficie de los linfocitos T: Venet F et al., “Clinical review: flow cytometry perspectives in the ICU - from diagnosis of infection to monitoring of injury-induced immune dysfunctions”, Critical care 2011, 15(5):231;
Venet F et al., “Increased circulating regulatory T cells (CD4+CD25+CD127-) contribute to lymphocyte anergy in septic shock patients”, Intensive Care Medicine 2008, 35(4):678-686.
La solicitud de patente europea FR2941240 A1 (publicada el 23.07.2010) describe un procedimiento de determinacion de la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales en un paciente, basado en la expresion de S100A9.
La solicitud internacional W02010/082004 A1 (publicada el 22.07.2010) describe un procedimiento de determinacion de la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales en un paciente, basado en la expresion de S100A9 y/o de S100A8.
De este modo, existe una verdadera necesidad de disponer de otros marcadores inmunologicos que permitan prever, facil y rapidamente, la susceptibilidad de un paciente a las infecciones nosocomiales. En efecto, poder identificar los sujetos que corren mayores riesgos de contraer infecciones nosocomiales permitina reservarles tratamientos preventivos mas adaptados y espedficos.
Es en este contexto donde la presente invencion propone proporcionar un nuevo biomarcador predictivo de un riesgo aumentado de infecciones nosocomiales en un paciente, y en concreto en un paciente hospitalizado en reanimacion
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y/o que haya sufrido una agresion (cio^a, quemadura, traumatismo...) que genera una respuesta inflamatoria sistemica (SIRS), en particular en un paciente en estado septico, en concreto grave, y preferentemente en un paciente en choque septico. El estudio del nivel de expresion de este biomarcador permite de este modo determinar, facil y rapidamente, la susceptibilidad de un paciente a las infecciones nosocomiales y tomar las disposiciones preventivas necesarias.
Segun un primer aspecto, la presente invencion tiene por tanto por objeto un procedimiento de determinacion de la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales en un paciente, que comprende las etapas siguientes:
- medir la expresion de sCD127 en una muestra biologica procedente de dicho paciente o muestra problema,
- concluir una susceptibilidad aumentada a las infeccionas nosocomiales despues de la comparacion de la expresion de las CD127 con respecto a un valor de referencia.
El procedimiento de determinacion de la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales segun la invencion es por tanto un procedimiento implementado in vitro o ex vivo.
La sCD127 es la forma soluble o plasmatica de la CD127, receptor de la IL-7. La CD127 o cadena alfa del receptor de la IL-7 es una glicoprotema de 75 kDa miembro de la superfamilia de los receptores con factores de crecimiento hematopoyeticos. Se expresa a nivel de la membrana en asociacion con la CD132 (cadena Yc comun) para formar el receptor de la IL-7. Este receptor desempena un papel importante en la diferenciacion, el seguimiento y la proliferacion linfocitaria. La CD127 esta constituida por una parte extracelular de 219 acidos aminados (aa), por una parte transmembranal de 25 aa y por una parte intracitoplasmica de 195 aa. La existencia de una forma soluble/plasmatica, nombrada sCDl27, generada por empalme alternativo del ARNm que codifica la CD127 se describio en 1990 por Goodwin RG et al., Cell, 1990, 23, 9941-951, pero su funcion biologica permanece a dfa de hoy mal conocida.
Se entiende por “infeccion nosocomial”, cualquier infeccion, principalmente bacteriana pero igualmente viral y fungica, que se produce en un establecimiento de salud en el curso o en el transcurso de una atencion (diagnostica, terapeutica, paliativa, preventiva o educativa), de un paciente, y que no estaba ni presente ni en incubacion al inicio de la atencion. Cuando no se conoce con precision el estado infeccioso al inicio de la atencion, se acepta habitualmente un plazo de al menos 48 horas o un plazo superior al penodo de incubacion para definir una infeccion nosocomial.
En el sentido de la invencion, se entiende por “respuesta inflamatoria sistemica” o “SIRS”, una respuesta que asocia al menos dos de los criterios siguientes: Temperatura > 38 °C o < 36 °C, Frecuencia cardfaca > 90/minuto, Frecuencia respiratoria > 20 / minuto o paC02 <32 mmHg, Leucocitos > 12.000/mm3 o < 4.000/mm3 (Bone et al., Chest, 1992,1644- 1655.
En el marco de la invencion, se entiende por “sCD127” la forma soluble o forma circulante (tambien nombrada forma plasmatica o serica) del receptor de la iL-7, tambien nombrada cadena alfa del receptor de la IL-7 o IL7R o IL7R- ALFA o IL7RA o CDW127, y en particular tal como se describe por Goodwin y al., Cell, 1990, 23, 941-951 y se determina por Crawley et al., Journal of Immunology, 2010, 184, 4679-4687.
En particular, las secuencias de acidos nucleicos de referencia para sCD127 segun la invencion son preferentemente las siguientes: Conjunto: ENSG00000168685, HPRD-ID: 00893 Secuencia de nucleotidos: NM 002185.2. Vega genes: 0TTHUMG00000090791.
Por otra parte, las secuencias proteicas de referencia para sCD127 segun la invencion son preferentemente las siguientes: NP_002176 XP_942460; version: NP_002176.2 GI:28610151.
La muestra problema en el marco del procedimiento de la invencion es una muestra biologica procedente del paciente del que se quiere determinar la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales. En particular, se elige una muestra biologica de este tipo entre los que son susceptibles de contener el marcador sCD127.
La presente invencion presenta una aplicacion particularmente preferente en los pacientes hospitalizados en reanimacion y/o que hayan sufrido una agresion, tal como cirugfa, quemadura, traumatismo..., que genera una respuesta inflamatoria sistematica o SIRS. Por consiguiente, la muestra biologica implementada en el marco del procedimiento de la invencion procede preferentemente de un paciente hospitalizado en reanimacion y/o que haya sufrido una agresion (cirugfa, quemadura, traumatismo...) que genera una respuesta inflamatoria sistemica (SIRS), en particular procedente de un paciente en estado septico, en concreto grave, y en particular procedente de un paciente en choque septico. De manera particularmente preferente, la muestra biologica implementada en el marco del procedimiento de la invencion procede de un paciente en choque septico.
Segun un primer modo de realizacion preferente, el procedimiento de la invencion permite determinar la susceptibilidad de un paciente a las infecciones nosocomiales, es decir concluir un riesgo aumentado de desarrollar una infeccion nosocomial o una susceptibilidad aumentada a las infecciones nosocomiales, cuando se pone de
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manifiesto una sobreexpresion de sCD127 en la muestra problema con respecto a un primer valor de referencia.
Por “sobreexpresion”, se entiende un incremento estadfsticamente significativo del nivel de expresion.
En este modo de realizacion, el primer valor de referencia puede corresponder al nivel de expresion de sCD127 medido en una muestra biologica procedente de un paciente hospitalizado en reanimacion y/o que haya sufrido una agresion, como cio^a, quemadura, traumatismo..., que genera una respuesta inflamatoria sistemica o SIRS del que se sabe que no ha desarrollado una infeccion nosocomial, en concreto de un paciente en estado septico del que se sabe que no ha desarrollado una infeccion nosocomial, y preferentemente de un paciente en choque septico del que se sabe que no ha desarrollado una infeccion nosocomial. En este caso, esta medicion de la expresion de sCD127 que constituye el primer valor de referencia se efectua preferentemente en paralelo, es decir al mismo tiempo que la medicion de la expresion de sCD127 que se hace en la muestra procedente del paciente del que se pretende determinar la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales, aunque la toma de la muestra de referencia se haya efectuado anteriormente a la de la muestra problema.
Este primer valor de referencia puede corresponder igualmente a un valor medio del nivel de expresion de sCD127 que se mide en un pool de muestras procedente de pacientes hospitalizados en reanimacion y/o que hayan sufrido una agresion, como cirugfa, quemadura, traumatismo..., que genera una respuesta inflamatoria sistemica (SIRS) de los que se sabe que no han desarrollado una infeccion nosocomial, en concreto de pacientes en estado septico de los que se sabe que no han desarrollado una infeccion nosocomial, y preferentemente de pacientes en choque septico de los que se sabe que no han desarrollado una infeccion nosocomial. En este caso, esta medicion de la expresion de sCD127 que constituye el primer valor de referencia se efectua preferentemente previamente a la medicion de la expresion de sCD127 que se hace en la muestra procedente del paciente del que se pretende determinar la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales, aunque la toma de las muestras de referencia destinadas para “juntarse en un pool” se haya efectuado anteriormente a la de la muestra problema.
En este primer modo de realizacion preferente, y en concreto para determinar la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales de un paciente en choque septico, la medicion de la expresion de sCD127 en la muestra problema y en caso necesario en la muestra biologica usada para obtener el primer valor de referencia, es decir cuando se obtiene el primer valor de referencia a partir de una muestra biologica, se realiza dentro de los 10 dfas o a los 10 dfas (D10) despues del choque septico, preferentemente dentro de los 7 dfas o a los 7 dfas (D7) despues del choque septico, de manera aun mas preferente dentro de los 4 dfas o a los 4 dfas (D4) despues del choque septico, y en particular dentro de los 3 dfas o a los 3 dfas (D3) despues del choque septico.
Segun un segundo modo de realizacion preferente, el procedimiento de la invencion permite determinar la susceptibilidad de un paciente a las infecciones nosocomiales, es decir concluir un riesgo aumentado de desarrollar una infeccion nosocomial o una susceptibilidad aumentada a las infecciones nosocomiales, cuando la expresion de sCD127 que se mide en la muestra problema no disminuye de manera significativa con respecto a un segundo valor de referencia. De manera particularmente preferente, se concluye un riesgo aumentado de desarrollar una infeccion nosocomial si la expresion de sCD127 que se mide en la muestra problema no disminuye mas del 25%, y en particular no disminuye mas del 20 %, con respecto a este segundo valor de referencia.
Este segundo valor de referencia puede corresponder al nivel de expresion de sCD127 medido en una muestra biologica procedente del mismo dicho paciente durante una toma anterior, es decir en una muestra biologica que se ha tomado anteriormente con respecto a la muestra problema. Por “anteriormente” o “anterior”, se entiende de manera mas precoz en el tiempo o previamente a la toma de la muestra problema.
En este segundo modo de realizacion preferente, y en concreto para determinar la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales de un paciente en choque septico, la medicion de la expresion de sCD127 en la muestra problema se realiza aproximadamente en o a los 10 dfas (D10) despues del choque septico, de manera preferente aproximadamente en o a los 7 dfas (D7) despues del choque septico, de manera mas preferente aproximadamente en o a los 4 dfas (D4) despues del choque septico.
Se puede efectuar por ejemplo la toma anterior dentro de las o a las 48 h despues del choque septico y al menos 24 h antes de la de la muestra problema, y se efectua preferentemente la toma anterior dentro de las o a las 48 h despues del choque septico y se efectua la de la muestra problema dentro de las 48 h posteriores a la toma anterior o a las 48 h despues de la toma anterior.
De este modo, en todos los casos, antes de la medicion de la expresion de sCD127 propiamente dicha en la muestra problema, el procedimiento de la invencion puede comprender la obtencion previa del valor de referencia, ya sea el primer valor de referencia o bien el segundo valor de referencia, con el que el nivel de expresion que se detectara en la muestra problema podra compararse con el fin de concluir un riesgo aumentado o no de desarrollar infecciones nosocomiales en el paciente del que procede la muestra problema.
Por tanto se compararan estos valores de referencia, ya sea el primer valor de referencia o bien el segundo valor de referencia, obtenidos previamente o al mismo tiempo, con el valor de la expresion de sCD127 que se mide en la
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muestra problema.
La muestra en la que se implementa el procedimiento de la invencion, tambien nombrada aqu muestra problema, puede ser de origen animal o humano, y preferentemente humano.
Por consiguiente, la muestra problema puede ser de diferentes naturalezas. En particular, esta muestra es un fluido biologico, elegido por ejemplo entre la sangre, la sangre total (tal como se colecta en la via venosa, es decir que contiene las celulas blancas y rojas, las plaquetas y el plasma), el suero, el plasma y el lfquido de lavado broncoalveolar.
Preferentemente, la muestra problema procedente de dicho paciente es una muestra de plasma o de suero.
Las muestras a partir de las que se pueden determinar los valores de referencia, ya sea el primer valor de referencia o el segundo valor de referencia, tambien nombradas “muestras de referencia”, pueden ser de diferentes naturalezas y en concreto de naturaleza biologica tal como se ha mencionado anteriormente tratandose de la muestra problema (fluidos biologicos). Ventajosamente, estas muestras biologicas son de la misma naturaleza que la de la muestra biologica problema o al menos de una naturaleza compatible para constituir una referencia en cuanto a la deteccion y/o la cuantificacion de la expresion de sCD127.
Para obtener el primer valor de referencia en particular, estas muestras proceden preferentemente de personas que tienen las mismas caractensticas o una mayona de caractensticas comunes, en concreto del mismo sexo y/o de una edad similar o identica y/o de mismo origen etnico, con las del sujeto o paciente del que se quiere determinar la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales. En este caso la muestra de referencia puede estar constituida igualmente por cualquier muestra, biologica o no biologica, que se ha calibrado previamente para contener un valor medio de sCD127 que corresponde al nivel que se ha medido en un pool de muestras biologicas procedentes de pacientes, hospitalizados en reanimacion y/o que hayan sufrido una agresion, como cirugfa, quemadura, traumatismo..., que genera una respuesta inflamatoria sistemica (SIRS) de los que se sabe que no han desarrollado una infeccion nosocomial, en concreto de pacientes en estado septico de los que se sabe que no han desarrollado una infeccion nosocomial, y preferentemente de pacientes en choque septico de los que se sabe que no han desarrollado una infeccion nosocomial. En este caso, y segun una variante particularmente preferente, la muestra de referencia procede de uno o de pacientes en choque septico del(de los) que se sabe que no ha(n) desarrollado una infeccion nosocomial.
Para obtener el segundo valor de referencia en particular, la muestra de referencia es una muestra biologica procedente del mismo dicho paciente, es decir del paciente del que se quiere determinar la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales y del que procede la muestra problema, pero obtenida a partir de una toma anterior, es decir de una muestra biologica que se ha tomado previamente en el tiempo con respecto a la muestra problema.
En el sentido de la presente invencion, se entiende por el termino “medir la expresion” una medicion in vitro o ex vivo. Por otra parte, este termino se entiende que designa la deteccion y la cuantificacion de sCD127 a nivel proteico. A tal efecto, se puede usar cualquier metodo de deteccion y/o de cuantificacion bien conocido por el experto en la materia para la implementacion de la invencion, ya sea en relacion con la determinacion de la presencia y/o la medicion de la expresion de la protema sCD127. A modo de ejemplo de metodo de medicion de la expresion de la protema sCD127, se puede citar en concreto el que se ha descrito por Crawley et al, Journal of immunology, 2010,184, 4679-4687.
En particular, la medicion del nivel de expresion de sCD127 se realiza con la ayuda de herramientas o de reactivos que son espedficos de sCD127 y que permiten, directa o indirectamente, determinar su presencia y/o cuantificar su nivel de expresion.
Entre las herramientas o reactivos capaz(ces) de detectar y/o cuantificar sCD127, se pueden citar en concreto anticuerpos espedficos, policlonales o monoclonales, preferentemente monoclonales, o fragmentos o derivados de los mismos, por ejemplo anticuerpos “single chain” Sv.
Entre estas herramientas o reactivos, se preferiran en concreto los que son espedficos de la forma soluble del receptor de la IL-7, es decir que no reconocen CD127 que es la forma celular/de membrana no soluble en este receptor. Se pueden usar sin embargo herramientas o reactivos que reconozcan a la vez la forma soluble o sCD127 y la forma celular del receptor de la IL-7 o CD127, siempre que sea posible distinguir estas dos formas mediante otro medio, como por ejemplo la naturaleza de la muestra analizada (por ejemplo, plasma o suero versus muestra biologica que contiene celulas o sangre total).
Cuando se realiza la deteccion y/o la cuantificacion de sCD127 a nivel proteico, se pueden usar las tecnicas estandar tales como el Western-Blot, ELISA, RIA, IRMA, FIA, CLIA, ECL, citometna de flujo o inmunocitologfa.
De manera particularmente ventajosa, se mide la expresion de sCD127 a nivel proteico, y preferentemente con la ayuda de una tecnica ELISA.
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Segun la invencion, y en particular en este modo de realizacion particular, se mide preferentemente el nivel de expresion de sCD127 con la ayuda de anticuerpos anti-sCD127, monoclonales o policlonales, y en concreto de anticuerpos monoclonales anti-sCD127. A modo de ejemplo, se pueden citar en concreto los anticuerpos monoclonales anti-CD127 humano R34.34 comercializados por la comparua Beckman Coulter® o los anticuerpos policlonales anti-CD127 comercializados por la comparMa R&D Systems®.
Todas las indicaciones y preferencias mencionadas anteriormente que se tratan de la medicion de la expresion de sCD127 se aplican de manera indiferente ya sea para la medicion de esta expresion en la muestra problema y en la muestra de referencia.
Segun un segundo aspecto, la presente invencion tiene igualmente por objeto el uso de la medicion, in vitro o ex vivo, de la expresion de sCD127 para determinar la susceptibilidad de un paciente a las infecciones nosocomiales.
De manera preferente, este uso es particularmente ventajoso para determinar la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales de un paciente hospitalizado en reanimacion y/o que haya sufrido una agresion, tal como cirugfa, quemadura, traumatismo..., que genera una respuesta inflamatoria sistemica o SIRS, en particular de un paciente en estado septico, en concreto grave, y preferentemente de un paciente en choque septico. Preferentemente, el uso segun la invencion permite determinar la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales de un paciente en choque septico.
Por otra parte, en el marco del uso segun la invencion, la expresion de sCD127 se mide preferentemente a nivel proteico, y en particular con la ayuda de una tecnica ELISA.
En particular, la expresion de SCD127 puede medirse con la ayuda de anticuerpos anti-sCD127, monoclonales o policlonales, y preferentemente de anticuerpos monoclonales anti-sCD127. Se pueden usar igualmente los anticuerpos citados anteriormente para este segundo aspecto de la invencion.
Mas ampliamente, todos los modos de realizacion preferentes que se han mencionado anteriormente relacionados con el procedimiento y sus combinaciones constituyen igualmente unos modos de realizacion preferentes tratandose del uso.
Segun un tercer aspecto, la presente invencion tiene tambien por objeto un kit para la medicion, in vitro o ex vivo, de la expresion de sCDl27 en una muestra biologica, que comprende:
- unas herramientas o reactivos espedficos que permiten medir la expresion de sCD127 en dicha muestra biologica, y
- una muestra control positiva que es una muestra calibrada para contener la cantidad de sCD127 que corresponde a la cantidad media medida en un pool de muestras de pacientes de los que se sabe que han desarrollado una infeccion nosocomial, y/o una muestra control negativa que es una muestra calibrada para contener la cantidad de sCD127 que corresponde a la cantidad media medida en un pool de muestras de pacientes de los que se sabe que no han desarrollado una infeccion nosocomial.
De este modo, el kit segun la invencion comprende unas herramientas o reactivos espedficos que permiten medir la expresion de sCD127 en dicha muestra biologico, y al menos una muestra control.
El kit segun la invencion permite en particular determinar la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales en un paciente, y en concreto en un paciente en choque septico.
Preferentemente, las herramientas o reactivos espedficos que permiten medir la expresion de sCD127 en una muestra biologica que estan presentes en el kit de la invencion permiten detectar y/o cuantificar la expresion de sCD127, ya sea a nivel proteico o bien a nivel de la actividad de sCD127, y preferentemente a nivel proteico.
Segun un modo de realizacion particularmente preferente, el kit de la invencion contiene anticuerpos anti-sCD127, monoclonales o policlonales, y en particular anticuerpos monoclonales.
Otra muestra control positiva puede ser igualmente una muestra procedente de un paciente del que se sabe que ha desarrollado una infeccion nosocomial. Asimismo, otra muestra control negativa puede ser igualmente una muestra procedente de un paciente del que se sabe que no ha desarrollado una infeccion nosocomial. Ya sea para un control positivo o negativo este tipo de muestra control procede preferentemente de uno o de varios paciente(s) hospitalizado(s) en reanimacion y/o que haya(n) sufrido una agresion, tal como cirugfa, quemadura, traumatismo..., que genera una respuesta inflamatoria sistemica (SIRS) en concreto, de uno o de varios paciente(s) en estado septico, y preferentemente de uno o de varios paciente(s) en choque septico. Por ejemplo, el kit puede contener una muestra control negativa procedente de uno o varios paciente(s) hospitalizado(s) en reanimacion y/o que haya(n) sufrido una agresion, tal como cirugfa, quemadura, traumatismo..., que genera una respuesta inflamatoria sistemica (SIRS), del(de los) se sabe que no ha(n) desarrollado una infeccion nosocomial, en particular procedente de uno o de varios paciente(s) en choque septico del(de los) que se sabe que no ha(n) desarrollado una infeccion nosocomial.
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De manera preferente, el kit comprende a la vez una muestra control positiva y una muestra control negativa, y en particular elegidas cada una entre las muestras calibradas tales como se han definido anteriormente.
La invencion abarca igualmente el uso de un kit segun la invencion para realizar el procedimiento de la invencion, y en particular para determinar la susceptibilidad de un paciente a las infecciones nosocomiales, preferentemente en un paciente hospitalizado en reanimacion y/o que haya sufrido una agresion, tal como cio^a, quemadura, traumatismo..., que genera una respuesta inflamatoria sistemica (SIRS), en particular en un paciente en estado septico, en concreto grave, y preferentemente un paciente en choque septico. Preferentemente, el uso del kit segun la invencion permite determinar la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales en un paciente en choque septico.
Todos los modos de realizacion preferentes que se han mencionado anteriormente relativos al procedimiento y sus combinaciones constituyen igualmente unos modos de realizacion preferentes que se tratan del kit segun la invencion y su uso.
Diversas otras caractensticas se ponen de manifiesto en la descripcion realizada a continuacion con referencia a las figuras adjuntas que muestran, a modo de ejemplos no limitativos, unas formas de realizacion del objeto de la invencion y en las que:
- la figura 1 representa la concentracion de IL-7 plasmatica en 35 pacientes en choque septico a los dfas 1-2 (1-2) y 3-4 (3-4) y 30 sujetos sanos “HV” (A) y la comparacion de estos resultados segun los grupos de pacientes “NS” o “S” (figura 1B) y los grupos de pacientes “NI” o “No NI” (figura 1C).
** p<0,005 vs. “HV” - U-test Mann Whitney;
- la figura 2 representa la expresion de CD127 en las celulas T CD4+ (figura 2A) y en las celulas T CD8+ (figura 2B) en 35 pacientes en choque septico a los dfas 1-2 y 3-5 y 30 sujetos sanos “HV”.
* p<0,05 vs “HV” - U-test Mann Whitney; § p<0,05 - evolucion en el tiempo en un mismo grupo de pacientes - Witcoxon paired t- test.
- la figura 3 representa la concentracion de sCD127 plasmatica en 35 pacientes en choque septico en los dfas 1-2 y 3-4 y 30 sujetos sanos (figura 3A) y la comparacion de estos resultados segun los grupos de pacientes “NS” o “S” (figura 3B) y los grupos de pacientes “NI” o “No NI” (figura 3C).
# p<0,05 ## p<0,005 vs “No Nl” - U-test Mann Whitney; § p<0,05 §§ p<0,005 - evolucion en el tiempo en un mismo grupo de pacientes - Wilcoxon paired t-test.
- la figura 4 representa la expresion del marcador HLA-DR en 35 pacientes en choque septico en los dfas 1-2 y 34 y 30 sujetos sanos segun los grupos de pacientes “NI” o “No NI”.
METODOS
Medicion de la concentracion en IL-7 plasmatica
Se ha medido la concentracion de IL-7 plasmatica gracias a un kit que usa la tecnica LUMINEX™ comercializado por la compama Bio-Rad (Bio- Plex Pro Cytokine, Chemokine and Growth Factor Assays: BioPlex Pro Reagent kit, BioRad #171-304070 y SinglePle IL-7) siguiendo las instrucciones del proveedor.
Medicion de la expresion celular del receptor de la IL-7 (CD127)
Brevemente, se incuban 50 pl de sangre total en presencia de 5 pl de Ac anti- CD4 acoplado a Ficoeritrina- TexasRed (ECD) (BeckmanCoulter #6604727) o de 5 pl de Ac anti-CD8 acoplado a ECD (BeckmanCoulter #737659) asf como 10 pl de Ac anti-CD127 acoplado a la ficoeritrina (PE) (BeckmanCoulter #IM1980U) durante 15 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. A continuacion se lisan los globulos rojos gracias a una lisis hipotonica y se fijan las celulas gracias a una lisis automatica realizada en un automata TQ- Prep (BeckmanCoulter). Por ultimo se mide la expresion de la membrana de la CD127 en la superficie de los linfocitos T CD4+ o CD8+ mediante citometna de flujo.
Dosificacion de la forma soluble del receptor de la IL-7 (sCD127) por ELISA
“Coating”
Se ha preparado un tampon de “coating” para contener 0,8 g Na2CO3, 1,4 g NaHCO3,0,1 g NaN3 en 500 ml de agua (pH 96).
Se han depositado 100 pl de anticuerpos (Ac) de captura (anticuerpo monoclonal de raton anti-CD127 humano R34.34, Beckman Coulter®) diluidos en tampon de “coating” por pozo en una placa ([Ac] = 8 pg/mL). A continuacion se ha cubierto la placa para incubarse a 4°C durante una noche.
A continuacion se ha aspirado el contenido de los pozos y se han lavado los pozos 3 veces con al menos 300 pL de tampon de lavado PBS-Tween20 0,05 %. Se ha retirado minuciosamente todo el lfquido en cada lavado. Despues del ultimo lavado, se ha dado la vuelta a la placa sobre papel absorbente con el fin de eliminar todos los restos de
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tampon.
“Blocking”
Se ha bloqueado la fijacion no espedfica con la ayuda de 150 pl de tampon de bloqueo por pozos (10 % suero de bovino fetal (FBS)/PBS-Tween20 0,05 %), luego se ha incubado la placa durante 1 h a 37°C.
De nuevo, se ha aspirado el contenido de los pozos y se han lavado los pozos 3 veces con al menos 300 pL de tampon de lavado PBS-Tween20 0,05 %. Se ha retirado minuciosamente todo el lfquido en cada lavado. Despues del ultimo lavado, se ha dado la vuelta a la placa sobre papel absorbente con el fin de eliminar todos los restos de tampon.
Muestras y controles
Se ha realizado un rango de calibracion con recombinante humano IL-7Ra / CD127 Fc chimera (R&D Systems - Catalog Number: 306-IR) diluido en tampon de dilucion PBS 5 % FCS, tal como se describe en la tabla 1 a continuacion y conforme a C. Janot-Sardet et al. Journal of Immunological Methods, 2010, 28, 115-123.
Tabla 1
rh IL-7Ra / CD127 Fc chimera
[c] (ng/mL)
500 250 125 62,5 31,25 15,7 7,85 0
Diluyente (pL)
0 100 100 100 100 100 100 100
Solucion a 500 ng/mL (pL)
100 100 Diluciones sucesivas 0
Se han anadido 100 pl de muestra o de control (solucion de CD127 Fc chimera reconstituida extemporaneamente y alicuotada a unas concentraciones de 60 ng/ml y 10ng/ml) en cada pozo, luego se ha incubado la placa durante 1 h a 37°C.
De nuevo, se ha aspirado el contenido de los pozos y los pozos se han lavado 3 veces con al menos 300 pL de tampon de lavado PBS-Tween20 0,05 %. Todo el lfquido se ha retirado minuciosamente en cada lavado. Despues del ultimo lavado, se ha dado la vuelta a la placa sobre papel absorbente con el fin de eliminar todos los restos de tampon.
Anticuerpos de deteccion
Se han anadido 100 pl de anticuerpos de deteccion (anticuerpos de cabra policlonal anti- CD127 biotinilados reconstituidos con 1 mL de TBS-bSa 1 %, R&D Systems®) diluidos en PBS/5 %FBS en cada pozo ([Ac] = 200 ng/mL), luego se ha incubado la placa durante 1 h a 37°C.
De nuevo, se ha aspirado el contenido de los pozos y se han lavado los pozos 3 veces con al menos 300 pL de tampon de lavado PBS-Tween20 0,05 %. Se ha retirado minuciosamente todo el lfquido en cada lavado. Despues del ultimo lavado, se ha dado la vuelta a la placa sobre papel absorbente con el fin de eliminar todos los restos de tampon.
Revelacion
Se han anadido 100 pL de Estreptavidina-HRP en cada pozo ([Estreptavidina-HRP] = 8 pL/mL). A continuacion se ha cubierto la placa para incubarse durante 30 min a temperatura ambiente.
De nuevo, se ha aspirado el contenido de los pozos y se han lavado los pozos 3 veces con al menos 300 pL de tampon de lavado PBS-Tween20 0,05 %. Se ha retirado minuciosamente todo el lfquido en cada lavado. Despues del ultimo lavado, se ha dado la vuelta a la placa sobre papel absorbente con el fin de eliminar todos los restos de tampon. En esta etapa de lavado, se han empapado los pozos con el tampon de lavado de 1 a 2 min antes de la aspiracion.
Se han mezclado los dos frascos de la solucion de substrato colorimetrico TM B (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, bioMerieux #XX7LF1UC) volumen a volumen. Se han depositado 100 pL de esta solucion de substrato en cada pozo. A continuacion se ha cubierto la placa para incubarse durante 30 min a temperatura ambiente.
Por ultimo, se ha efectuado la lectura de la placa mediante medicion de la absorbencia a 450 nm.
Medicion de la expresion monocitaria de HLA-DR
Se ha realizado la medicion mediante la tecnica de citometna de flujo, con la ayuda de un marcado directo en sangre
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total tomada con EDTA.
Se han incubado los dos anticuerpos siguientes con 50 pL de sangre total (30 minutes a temperatura ambiente y en la oscuridad):
- 5 pL de anticuerpos anti-CD14, acoplados a fluorescema (Beckman Coulter Immunotech, - Ref.: IM0645), que permiten identificar los monocitos entre los leucocitos)
- 10 pL de anticuerpos anti-HLA-DR, acoplados a ficoeritrina (Becton Dickinson - Ref.: 347401), que permiten cuantificar la expresion de HLA-DR en la superficie de las celulas.
A continuacion se han eliminado los globulos rojos: lisis mediante adicion de 1 ml de solucion de lisis (comercializada por la comparna Becton Dickinson con la referencia 349202) diluida (1/10) (15 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad).
A continuacion se han analizado las celulas en un citometro de flujo (FC500 - Beckman Coulter).
Los resultados se expresan en % de celulas positivas, definiendose el umbral de positividad gracias a un control isotfpico (Mouse IgG2a PE Becton Dickinson - Ref.: 349053).
RESULTADOS
Se han tomado muestras de plasma en 35 pacientes en choque septico a los dfas 1-2 (D1-2) y 3-4 (D3-4) despues de choque septico, luego se han almacenado (cohorte retrospectiva). Se han medido diferentes parametros o marcadores tales como las concentraciones de IL-7 y de sCD127 plasmaticas, y la expresion de CD127 en las celulas T CD4+, y la expresion de HLA-DR en los monocitos. A los 28 dfas despues de admision en reanimacion por choque septico, 13 pacientes no han sobrevivido (“NS”) es decir el 37 % mientras que 22 pacientes han sobrevivido (“S”) sobre los 35 pacientes. Por otra parte, 6 pacientes han contrafdo una infeccion nosocomial (“NI”) es decir el 17 %, mientras que 29 pacientes han permanecido libres de cualquier episodio nosocomial (“No NI”).
Se han efectuado igualmente las mismas mediciones en 30 sujetos sanos voluntarios (HV).
Se han comparado los resultados obtenidos con la ayuda de un test U Mann Whitney dentro de estas diferentes poblaciones de sujetos o pacientes y se agrupan en las figuras 1 a 4 adjuntos.
Estos resultados muestran que la concentracion de IL-7 plasmatica ha disminuido de manera significativa (a D1-2), pero esto no es significativo a D3-4 en los pacientes que desarrollan una infeccion secundaria con respecto a los pacientes que no han tenido ningun episodio nosocomial (figura 1C), mientras que permanece inalterada entre los pacientes supervivientes “S” o no-supervivientes “NS”.
Ademas, la expresion celular del receptor de la IL-7 (CD127) se conserva despues de choque septico (figura 2A y 2B), y sin ninguna diferencia entre los pacientes supervivientes “S” o no-supervivientes “NS” o los pacientes que han desarrollado una infeccion nosocomial “NI” o no “No NI” (resultados no representados).
El incremento ligero de la concentracion plasmatica de la forma soluble del receptor de la IL-7 o sCD127 observado al inicio del choque septico no es significativo estadfsticamente y vuelve a valores “normales” con el tiempo (figura 3A).
En cambio, mientras que la concentracion plasmatica de sCD127 permanece inalterada entre los pacientes supervivientes “S” o no-supervivientes “NS” (figura 3B), se observa un incremento marcado de la concentracion plasmatica de sCD127 en los pacientes “NI” que han presentado una infeccion nosocomial con respecto a los pacientes “No NI” que no han contrafdo una infeccion nosocomial (figura 3C).
Por otra parte, se observa igualmente que la concentracion plasmatica de la sCD127 no evoluciona en el tiempo (entre D1-2 y D3-4) en los pacientes “NI” que han presentado una infeccion nosocomial, a diferencia de los pacientes “No NI” que no han contrafdo una infeccion nosocomial (figura 3C).
A modo de comparacion, el estudio de la expresion del marcador de la tecnica anterior HLA-DR en la misma cohorte de pacientes no ha permitido poner de manifiesto la disminucion de la expresion de este marcador entre los pacientes “NI” que han presentado una infeccion nosocomial y los pacientes “No NI” que no han contrafdo una infeccion nosocomial (figura 4), a diferencia de lo que se establece claramente en la tecnica anterior.
Esta diferencia, probablemente relacionada con el tamano de la cohorte actualmente estudiada que es menor con respecto al de las cohortes analizadas en los estudios de la tecnica anterior, permite poner de manifiesto la pertinencia del marcador sCD127 con respecto a HLA-DR. En efecto, a pesar del tamano de la cohorte que se ha estudiado aqrn, los resultados muestran que el estudio de la expresion de SCD127 segun la invencion es informativo en cuanto a la susceptibilidad de los pacientes a las infecciones nosocomiales.
En consecuencia, el conjunto de estos resultados demuestran que la medicion de la expresion de SCD127 es un marcador inmunologico util para determinar la susceptibilidad de un paciente a las infecciones nosocomiales, y en particular de los pacientes hospitalizados en reanimacion y/o que hayan sufrido una agresion (cio^a, quemadura, traumatismo...) que genera una respuesta inflamatoria sistemica (SIRS), y en particular de los pacientes en estado 5 septico, en concreto grave, y preferentemente de los pacientes en choque septico.
La invencion no se limita a los ejemplos descritos y representados porque se pueden aportar a ellos diversas modificaciones sin salirse de su marco.

Claims (22)

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    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de determinacion de la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales en un paciente, que comprende las etapas siguientes:
    - medir la expresion de sCD127 en una muestra biologica procedente de dicho paciente o muestra problema,
    - concluir una susceptibilidad aumentada a las infeccionas nosocomiales despues de la comparacion de la expresion de CD127 con respecto a un valor de referencia.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la muestra biologica procede de un paciente hospitalizado en reanimacion y/o que haya sufrido una agresion, como cirugfa, quemadura, traumatismo..., que genera una respuesta inflamatoria sistemica o SIRS, en particular procedente de un paciente en estado septico, en concreto grave.
  3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 2, caracterizado por que la muestra biologica procede de un paciente en choque septico.
  4. 4. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que se concluye una susceptibilidad aumentada a las infecciones nosocomiales cuando se pone de manifiesto una sobreexpresion de sCDl27 en la muestra problema con respecto a un primer valor de referencia y por que el primer valor de referencia corresponde al nivel de expresion de sCD127 medido en una muestra biologica procedente de un paciente hospitalizado en reanimacion y/o que haya sufrido una agresion, tal como cirugfa, quemadura o traumatismo, que genera una respuesta inflamatoria sistemica o SIRS del que se sabe que no ha desarrollado una infeccion nosocomial, en concreto de un paciente en estado septico del que se sabe que no ha desarrollado una infeccion nosocomial, o bien corresponde a un valor medio del nivel de expresion de sCD127 que se mide en un pool de muestras procedente de pacientes de este tipo.
  5. 5. Procedimiento segun la reivindicacion 4, caracterizado por que el primer valor de referencia corresponde al nivel de expresion de sCD127 medido en una muestra biologica procedente de un paciente en choque septico del que se sabe que no ha desarrollado una infeccion nosocomial, o bien corresponde a un valor medio del nivel de expresion de sCDl27 que se mide en un pool de muestras procedente de pacientes de este tipo.
  6. 6. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado por que la medicion de la expresion de sCD127 en la muestra problema y en caso necesario en la muestra biologica usada para obtener el primer valor de referencia dentro de los 10 dfas o a los 10 dfas (D10) despues del choque septico, preferentemente dentro de los 7 dfas o a los 7 dfas (D7) despues del choque septico, de manera aun mas preferente dentro de los 4 dfas o a los 4 dfas (D4) despues del choque septico, y en particular dentro de los 3 dfas o a los 3 dfas (D3) despues del choque septico.
  7. 7. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que se concluye una susceptibilidad aumentada a las infecciones nosocomiales cuando la expresion de sCD127 que se mide en la muestra problema no disminuye de manera significativa con respecto a un segundo valor de referencia, preferentemente cuando la expresion de sCD127 que se mide en la muestra problema no disminuye mas del 25 %, y preferentemente no disminuye mas del 20 %, con respecto a este segundo valor de referencia y por que el segundo valor de referencia corresponde al nivel de expresion de sCD127 medido en una muestra biologica procedente del mismo dicho paciente durante una toma anterior, es decir en una muestra biologica que se ha tomado anteriormente con respecto a la muestra problema.
  8. 8. Procedimiento segun la reivindicacion 3 o 7, caracterizado por que la medicion de la expresion de sCD127 en la muestra problema se realiza aproximadamente en o a los 10 dfas (D10) despues del choque septico, de manera preferente aproximadamente en o a los7 dfas (D7) despues del choque septico, de manera mas preferente aproximadamente en o a los 4 dfas (D4) despues del choque septico.
  9. 9. Procedimiento segun la reivindicacion 8, caracterizado por que es conforme a la reivindicacion 7 y por que la toma anterior se efectua dentro de las o a las 48 h despues del choque septico y al menos 24 h antes de la de la muestra problema.
  10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, caracterizado por que la toma anterior se efectua dentro de las o a las 48 h despues del choque septico y la de la muestra problema se efectua dentro de las 48 h posteriores a la toma anterior o a las 48 h despues de la toma anterior.
  11. 11. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la muestra problema procedente de dicho paciente es una muestra de plasma o de suero.
  12. 12. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la expresion de sCD127 se mide a nivel proteico, preferentemente con la ayuda de una tecnica ELISA.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
  13. 13. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la expresion de sCD127 se mide con la ayuda de anticuerpos anti-sCD127, y en concreto de anticuerpos monoclonales anti-sCD127.
  14. 14. Uso de la medicion, in vitro o ex vivo, de la expresion de sCD127 para determinar la susceptibilidad de un paciente a las infecciones nosocomiales.
  15. 15. Uso segun la reivindicacion 14, caracterizado por que dicho paciente es un paciente hospitalizado en reanimacion y/o que haya sufrido una agresion, como cio^a, quemadura, traumatismo, que genera una respuesta inflamatoria sistemica (SIRS), en particular de un paciente en estado septico, en concreto grave.
  16. 16. Uso segun la reivindicacion 15, caracterizado por que dicho paciente es un paciente en choque septico.
  17. 17. Uso segun la reivindicacion 15 o 16, caracterizado por que la expresion de sCD127 se mide a nivel proteico, preferentemente con la ayuda de una tecnica ELISA.
  18. 18. Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado por que la expresion de sCD127 se mide con la ayuda de anticuerpos anti-sCD127, preferentemente de anticuerpos monoclonales anti-sCD127.
  19. 19. Kit para la medicion, in vitro o ex vivo, de la expresion de sCD127 en una muestra biologica, que comprende:
    - unas herramientas o reactivos espedficos que permiten medir la expresion de sCD127 en dicha muestra biologica, y
    - una muestra control positiva que es una muestra calibrada para contener la cantidad de sCD127 que corresponde a la cantidad media medida en un pool de muestras de pacientes de los que se sabe que han desarrollado una infeccion nosocomial, y/o una muestra control negativa que es una muestra calibrada para contener la cantidad de sCD127 que corresponde a la cantidad media medida en un pool de muestras de pacientes de los que se sabe que no han desarrollado una infeccion nosocomial.
  20. 20. Kit segun la reivindicacion 19, caracterizado por que dichas herramientas o reactivos espedficos permiten detectar y/o cuantificar la expresion de sCD127, y preferentemente a nivel proteico.
  21. 21. Uso de un kit tal como se define en la reivindicacion 19 o 20 para determinar la susceptibilidad de un paciente a las infecciones nosocomiales, siendo dicho paciente un paciente hospitalizado en reanimacion y/o que haya sufrido una agresion, como cirugfa, quemadura, traumatismo, que genera una respuesta inflamatoria sistemica (SIRS).
  22. 22. Uso de un kit segun la reivindicacion 21 para determinar la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales en un paciente en choque septico.
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