ES2573027T3

ES2573027T3 - Células productoras de polipéptido

Info

Publication number: ES2573027T3
Application number: ES07725230.2T
Authority: ES
Inventors: Josef Endl; Erhard Kopetzki; Oliver Ploettner; Ursula Schwarz; Georg Tiefenthaler
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2006-05-17
Filing date: 2007-05-15
Publication date: 2016-06-03
Anticipated expiration: 2027-05-15
Also published as: BRPI0712073B1; KR101202498B1; EP2208792A3; WO2007131774A1; EP2208792A2; MX2008013514A; AU2007251766B2; AU2007251766A1; CA2651478C; BRPI0712073B8; EP2027273A1; JP2009537124A; ES2543629T3; US20130109058A1; CN101410525A; BRPI0712073A2; IL193721A0; JP4870208B2; EP2027273B1; CN101410525B

Abstract

Ácido nucleico que comprende, en dirección 5' a 3', - el intensificador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano (CMV_h), - un 5'UTR sintético no traducido que incluye una secuencia de consenso de Kozak, - una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina murina que incluye el intrón de secuencia de señal, - un ADNc de cadena pesada variable de un anticuerpo con especificidad contra una proteína, - un intrón 2 híbrido de cadena pesada de ratón/humana que incluye el intensificador de Ig μ de ratón (región interruptor JH3-JH4) unido al gen IGHG1 humano que incluye los exones de CH1 a CH3 con todos los intrones intermedios y la parte 5' contigua del intrón 6, que incluye el sitio de poliadenilación para la forma secretada de la inmunoglobulina, - la parte 3' del intrón 6 y el exón M1 del gen IGHG3 humano, y - el exón M2 y la región 3' no traducida que contiene el sitio de poliadenilación para la forma unida a membrana de la inmunoglobulina del gen IGHG4 humano.

Description

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La expresión “ADN heterólogo” o “ácido nucleico heterólogo” se refiere a una molécula de ADN o un ácido nucleico,

o a una población de moléculas de ADN o a una población de ácidos nucleicos, que no existe naturalmente dentro de una célula huésped dada. Las moléculas de ADN heterólogas respecto a una célula huésped particular pueden contener ADN derivado de la especie de célula huésped (es decir, del ADN endógeno) con la condición de que el ADN del huésped se combine con el ADN no del huésped (es decir, ADN exógeno). Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN no del huésped codificante de un polipéptido operablemente ligado a un segmento de ADN del huésped que comprende un promotor se considera que es una molécula de ADN heterólogo. A la inversa, el ADN heterólogo puede comprender un gen estructural endógeno operablemente ligado a un promotor exógeno.

Un péptido o polipéptido codificado por un ácido nucleico no del huésped, es decir, heterólogo, es un péptido o polipéptido “heterólogo”.

La expresión “polipéptido biológicamente activo” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una molécula orgánica, por ejemplo una macromolécula biológica tal como un péptido, proteína, glucoproteína, nucleoproteína, mucoproteína, lipoproteína, polipéptido o proteína sintético, que provoca un efecto biológico al administrarlo en o a sistemas biológicos artificiales, tales como bioensayos, utilizando líneas celulares y virus, o in vivo en un animal, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, aves y mamíferos, incluyendo seres humanos. Dicho efecto biológico puede ser, aunque sin limitación, inhibición o activación enzimática, unión a un receptor o a un ligando, en el sitio de unión

o contiguo al mismo, inducción de señal o modulación de señal. Dicho polipéptido biológicamente activo se selecciona de entre el grupo de polipéptidos que comprende inmunoglobulinas, fragmentos de inmunoglobulina, conjugados de inmunoglobulina y péptidos antifusogénicos.

Las moléculas biológicamente activas son, aunque sin limitarse a ellas, por ejemplo, hormonas, citoquinas, interleuquinas, inmunoglobulinas, agentes antifusogénicos, factores de crecimiento, ligandos de receptores, agonistas o antagonistas, agentes citotóxicos, agentes antivíricos, agentes de obtención de imágenes, inhibidores enzimáticos, activadores enzimáticos o moduladores de la actividad enzimática tales como sustancias alostéricas, y conjugados de los mismos.

El término “aminoácido” tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a un grupo de carboxi-α-aminoácidos, que directamente o como precursor pueden encontrarse codificados por ácidos nucleicos, comprendiendo alanina (código de tres letras: Ala, código de una letra: A), arginina (Arg, R), asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), cisteína (Cys, C), glutamina (Gln, Q), ácido glutámico (Glu, E), glicina (Gly, G), histidina (His, H), isoleucina (Ile, I), leucina (Leu, L), lisina (Lys, K), metionina (Met, M), fenilalanina (Phe, F), prolina (Pro, P), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), triptófano (Trp, W), tirosina (Tyr, Y) y valina (Val, V).

Un “vector de clonación” es un ácido nucleico, tal como un plásmido, cósmido, fagémido o cromosoma artificial bacteriano (CAB) que presenta la capacidad de replicarse autónomamente en una célula huésped. Los vectores de clonación típicamente contienen uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción que permiten la inserción de un ácido nucleico de una manera determinada sin pérdida de una función biológica esencial del vector, así como secuencias de nucleótidos codificantes de un marcador seleccionable, que resulta adecuado para la utilización en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Entre los marcadores seleccionables típicamente se incluyen genes que proporcionan resistencia a la tetraciclina, a la neomicina, a G418 o a la ampicilina.

Un “vector de expresión” es un ácido nucleico codificante de un polipéptido o proteína heterólogo que debe expresarse en una célula huésped. Típicamente, un vector de expresión comprende una unidad de propagación plasmídica procariótica, por ejemplo E. coli que comprende un origen de replicación y un marcador de selección procariótico, un marcador de selección eucariótico y uno o más casetes de expresión para la expresión de un ácido nucleico de interés, comprendiendo cada uno un promotor, un ácido nucleico y un terminador de transcripción, incluyendo una señal de poliadenilación. La expresión génica habitualmente se sitúa bajo el control de un promotor y este gen estructura se dice que se encuentra “operablemente ligado” al promotor. De manera similar, un elemento regulador y un promotor nuclear se encuentran operablemente ligados en el caso de que el elemento regulador module la actividad del promotor mínimo.

Una “unidad de transcripción policistrónica” es una unidad de transcripción en la que más de un gen estructural se encuentra bajo el control del mismo promotor.

Un “polipéptido aislado” o una “proteína aislada” es un polipéptido o proteína que se encuentra esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidratos, lípidos u otras impurezas proteicas no unidas covalentemente, así como impurezas no proteicas asociadas al polipéptido o proteína en la naturaleza. Típicamente, una preparación de polipéptido/proteína aislado contiene el polipéptido/proteína en una forma altamente purificada, es decir, por lo menos aproximadamente 80% puro, por lo menos aproximadamente 90% puro, por lo menos aproximadamente 95% puro, más de 95% puro o más de 99% puro. Una manera de demostrar que una preparación particular contiene un polipéptido o proteína aislado es a partir de la aparición de una única banda tras la electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico (SDS)-poliacrilamida de la preparación y tinción de azul brillante de

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Coomassie del gel. Sin embargo, el término “aislado” no excluye la presencia del mismo polipéptido o proteína en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas alternativamente glucosiladas o derivatizadas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “inmunoglobulina” se refiere a una proteína que consiste de uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina. Dicha definición incluye variantes tales como formas mutadas, es decir, formas con sustituciones, deleciones e inserciones de uno o más aminoácidos, formas truncadas, así como formas fusionadas. Entre los genes de inmunoglobulina reconocidos se incluyen los diferentes genes de región constante, así como la multitud de genes de región variable de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden existir en una diversidad de formatos, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)2, así como cadenas sencillas (scFv) (por ejemplo Huston J.S. et al., PNAS USA 85:5879-5883, 1988; Bird R.E. et al., Science 242:423-426, 1988; y, en general, Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2ª edición, 1984, y Hunkapiller T. y Hood, L., Nature 323:15-16, 1986).

Cada una de las cadenas polipeptídicas pesada y ligera de una inmunoglobulina, en caso de encontrarse presentes, pueden comprender una región constante (generalmente la parte carboxilo-terminal). La región constante de la cadena pesada media en la unión del anticuerpo i) a células que portan un receptor de Fc, tal como células fagocíticas, o ii) a células que portan el receptor de Fc neonatal (FcRn), también conocido como receptor Brambell. También media en la unión a algunos factores, incluyendo factores del sistema clásico del complemento, tal como el componente C1q. Además, tras el dominio constante C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, puede encontrarse un dominio transmembranal, es decir, el dominio CH3 o CH4 Este dominio transmembranal permite la formación de inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulina o polipéptidos de fusión de inmunoglobulina unidos a la membrana plasmática.

Cada una de las cadenas polipeptídicas pesada y ligera de una inmunoglobulina, en caso de encontrarse presentes, pueden comprender un dominio variable (generalmente la parte amino-terminal). El dominio variable de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina comprende diferentes segmentos, es decir, cuatro regiones marco (FR) y tres regiones hipervariables (RDC).

La expresión “por lo menos un fragmento de” se refiere a una fracción de un ácido nucleico completo o de un polipéptido completo, es decir, por lo menos 20%, por lo menos 40%, por lo menos 60%, o por lo menos 80% del ácido nucleico, polipéptido o dominio completo. Por ejemplo, la expresión "un ácido nucleico codificante de por lo menos un fragmento de un dominio de inmunoglobulina CH3 o CH4" se refiere a una fracción de un ácido nucleico codificante del dominio de inmunoglobulina CH3 o CH4 completo, es decir, por lo menos 20%, por lo menos 40%, por lo menos 60% o por lo menos 80% del ácido nucleico codificante del dominio de inmunoglobulina CH3 o CH4 completo. En una realización, un fragmento de una cadena pesada de inmunoglobulina es un fragmento C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina.

La expresión “un codón de parada traduccional en el mismo marco de lectura” se refiere a un codón de parada traduccional (TAA, TAG o TGA) al que sigue una región codificante de un ácido nucleico sin un desplazamiento de marco del marco de lectura con respecto a la región codificante precedente del ácido nucleico, es decir, que termina la región codificante durante la traducción. Un codón de parada traduccional en el marco de lectura se encuentra operablemente ligado a la región codificante precedente de un ácido nucleico.

La expresión “sin un codón de parada traduccional en el marco de lectura” se refiere a la ausencia de un codón de parada traduccional (TAA, TAG o TGA) en el ácido nucleico designado y/o la presencia de un codón de parada traduccional, que puede encontrarse dentro o en el extremo de una región codificante de un ácido nucleico, pero que se debe a uno o dos desplazamientos de par de bases no reconocidos durante la traducción del ARNm procesado (es decir, fuera de marco, no ligado operablemente) y de esta manera no termina la región codificante durante el proceso de traducción.

La expresión “terminador de transcripción” tal como se utiliza en la presente solicitud es una secuencia de ADN de 50 a 750 pares de bases de longitud que proporciona a la ARN polimerasa la señal para la terminación de la síntesis de ARNm. Son recomendables terminadores muy eficientes (fuertes) en el extremo 3' de un casete de expresión para evitar que la ARN polimerasa siga leyendo, particularmente al utilizar promotores fuertes. Los terminadores de transcripción ineficientes pueden conducir a la formación de un ARNm de tipo operón que puede ser el motivo de una expresión génica no deseada, por ejemplo codificada en un plásmido.

Las expresiones “no eliminado constitutivamente durante el procesamiento del pre-ARNm” y “no extraído constitutivamente del pre-ARNm (correspondiente)” tal como se utilizan en la presente solicitud se refieren a un procedimiento de corte y empalme que no tiene lugar necesariamente durante el procesamiento del pre-ARNm, es decir, el ácido nucleico de un intrón específico sólo se elimina en ocasiones durante el procesamiento del pre-ARNm. Como resultado, se obtienen dos ARNm maduros diferentes, uno con por lo menos una parte del intrón y uno sin el intrón.

La expresión “anclaje GPI” tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a una modificación post-traduccional unida a un extremo C-terminal de un polipéptido o proteína. Un “anclaje GPI” presenta una estructura nuclear que

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Un “ácido nucleico procesable” se caracteriza por como mínimo un sitio 5’ donador de procesamiento, un sitio 3’ aceptor de procesamiento y un sitio denominado de ramificación, que normalmente se encuentra situado 20 a 50 bases antes del sitio aceptor. Esta organización afecta al reconocimiento y extracción del ácido nucleico del sitio 5’ donante de procesamiento al sitio 3’ aceptor de procesamiento del pre-ARNm durante el procesamiento del ARN. Durante la etapa de procesamiento, se genera el ARNm maduro a partir del que se traduce un polipéptido o proteína. En una realización, por lo menos un ácido nucleico, preferentemente el segundo ácido nucleico, es un ácido nucleico procesable que contiene elementos reguladores adicionales, tales como un codón de parada en el marco de lectura y una señal de poliadenilación.

Sin embargo, el procedimiento de procesamiento no es exclusivo. Por ejemplo, resulta posible que un intrón no resulte eliminado del pre-ARNm durante el procesamiento del pre-ARNm y, de esta manera, se encuentre por lo menos parcialmente incluido en el ARNm maduro. En caso de encontrarse presente un codón de parada en el marco de lectura en este intrón “opcionalmente” incluido, se para la traducción en este codón de parada y se produce una variante del polipéptido codificado.

El reconocimiento y extracción de un intrón con frecuencia se encuentran regulados por elementos de acción en cis adicionales en el pre-ARNm. Debido a su función y posición, estos elementos se denominan intensificador de procesamiento exónico (IPE), silenciador de procesamiento exónico (SPE), intensificador de procesamiento intrónico (IPI) o silenciador de procesamiento intrónico (SPI), respectivamente (Black D.L., Annu. Rev. Biochem. 72:291-336, 2003).

El ADN genómico de la mayoría de genes eucarióticos presenta una organización de intrón-exón. Por ejemplo, dentro del exón codificante del dominio C-terminal de la forma secretada de una cadena pesada de inmunoglobulina (es decir, CH3 o CH4, respectivamente) se encuentra un sitio 5’ donante de procesamiento.

En el caso de que dicho sitio donante de procesamiento no resulte eficaz en el procesamiento del pre-ARNm de la cadena pesada, el intrón que sigue a dicho exón, que contiene un codón de parada y una señal de poliadenilación, resulta por lo menos parcialmente retenido en el ARNm maduro. A continuación se traduce el ARNm en una cadena pesada de inmunoglobulina que finaliza con un dominio CH3 o CH4 y representa una inmunoglobulina soluble. Ésta es la ruta de procesamiento principal para los genes de cadena pesada de inmunoglobulina en las células secretoras de inmunoglobulina.

En el caso de que el sitio donante de procesamiento resulte eficaz en el procesamiento del pre-ARNm de cadena pesada de inmunoglobulina, el intrón consecutivo, y de esta manera el codón de parada, resultan eliminados. Por lo tanto, la traducción no se para después del dominio C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. Además, la traducción continúa con los exones siguientes procesados que codifican un dominio transmembranal. Esta ruta de procesamiento menor para los genes de cadena pesada de inmunoglobulina resulta en una forma de inmunoglobulina unida a la membrana plasmática presentada sobre la superficie celular de una célula productora de inmunoglobulinas.

Este procedimiento se denomina “procesamiento alternativo” y el ácido nucleico (es decir, el intrón) opcionalmente eliminado en este procedimiento se denomina “ácido nucleico alternativamente procesable”.

En el caso de que un ácido nucleico codificante de un polipéptido o proteína heterólogo se una a un ácido nucleico codificante de por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal o a un ácido nucleico codificante de un péptido de señal para un anclaje GPI mediante un ácido nucleico alternativamente procesable, es decir, un ácido nucleico alternativamente procesable se encuentra situado entre dichos dos ácidos nucleicos, de manera que estos tres ácidos nucleicos se encuentran operablemente ligados, se expresan dos variantes del polipéptido o proteína heterólogo: una variante soluble, es decir, una variante que sólo comprende el polipéptido o proteína, y una variante unida a la membrana plasmática, es decir, una variante que comprende tanto el polipéptido o proteína como el dominio transmembranal o el anclaje GPI.

En una realización, el ácido nucleico transfectado se encuentra comprendido en un casete de expresión. En una realización, el primer ácido nucleico no presenta un codón de parada traduccional dentro del marco en el extremo 3’. En otra realización, el primer, segndo y tercer ácidos nucleicos se encuentran operablemente ligados. En una realización, el tercer ácido nucleico codifica por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal. En otra realización, el fragmento de un dominio transmembranal es una región transmembranal. En una realización, el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico se selecciona de entre el grupo que comprende cadenas pesadas de inmunoglobulina, cadenas ligeras de inmunoglobulina, polipéptidos biológicamente activos, fragmentos de las mismos y polipéptidos de fusión de los mismos. En una realización, el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico se selecciona de entre el grupo que comprende cadenas pesadas de inmunoglobulina, cadenas ligeras de inmunoglobulina, fragmentos de las mismas y fusiones de las mismas. En una realización, el tercer ácido nucleico codifica por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal de inmunoglobulina.

En mayor detalle, en la presente memoria se informa de un método para seleccionar una célula eucariótica que expresa una cadena pesada de inmunoglobulina, en el que el método comprende:

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a) transfectar una célula eucariótica con un ácido nucleico que comprende, en dirección 5’ a 3’, i) un primer ácido nucleico codificante de una cadena pesada de inmunoglobulina sin codón de parada traduccional en el marco de lectura, ii) un segundo ácido nucleico que se inicia con un sitio donador de procesamiento y que termina en un sitio aceptor de procesamiento que comprende un codón de parada traduccional en el mismo marco de lectura y una señal de poliadenilación, iii) un tercer ácido nucleico codificante de: iiia) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal, o iiib) un péptido de señal para un anclaje GPI,

b) cultivar dicha célula transfectada bajo condiciones adecuadas a la producción de pre-ARNm de dicho ácido nucleico, procesar dicho pre-ARNm y traducir dicho ARNm procesado en una cadena pesada de inmunoglobulina, en la que dicha célula transfectada produce cadena pesada de inmunoglobulina soluble y cadena pesada de inmunoglobulina unida a membrana plasmática mediante procesamiento alternativo de dicho pre-ARNm, y

c) seleccionar una célula con cadena pesada de inmunoglobulina unida a membrana plasmática que será la célula expresante de una cadena pesada de inmunoglobulina.

El método puede servir para seleccionar una célula eucariótica que expresa una inmunoglobulina, en la que el método comprende:

a) transfectar una célula eucariótica con un ácido nucleico que comprende un primer casete de expresión para una cadena ligera de inmunoglobulina y un segundo casete de expresión que comprende, en dirección 5’ a 3’: i) un primer ácido nucleico codificante de una cadena pesada de inmunoglobulina sin codón de parada traduccional en el marco de lectura, ii) un segundo ácido nucleico que se inicia con un sitio donador de procesamiento y que termina en un sitio aceptor de procesamiento que comprende un codón de parada traduccional en el mismo marco de lectura y una señal de poliadenilación, iii) un tercer ácido nucleico codificante de: iiia) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal, o iiib) un péptido de señal para un anclaje GPI,

b) cultivar dicha célula transfectada bajo condiciones adecuadas a la producción de pre-ARNm a partir de dicho ácido nucleico, procesar dicho pre-ARNm y traducir dicho ARNm procesado en una cadena pesada de inmunoglobulina, en la que dicha célula transfectada produce inmunoglobulina soluble e inmunoglobulina unida a membrana plasmática mediante procesamiento alternativo de dicho pre-ARNm, y

c) seleccionar una célula con inmunoglobulina unida a membrana plasmática que será la célula expresante de una inmunoglobulina.

a) transfectar una célula eucariótica con dos ácidos nucleicos simultánea o secuencialmente, en la que un ácido nucleico comprende un casete de expresión para una cadena ligera de inmunoglobulina y el otro ácido nucleico comprende un casete de expresión que comprende, en dirección 5' a 3':

i) un primer ácido nucleico codificante de una cadena pesada de inmunoglobulina sin codón de parada traduccional en el marco de lectura, ii) un segundo ácido nucleico que se inicia con un sitio donador de procesamiento y que termina en un sitio aceptor de procesamiento que comprende un codón de parada traduccional en el mismo marco de lectura y una señal de poliadenilación, iii) un tercer ácido nucleico codificante de: iiia) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal, o iiib) un péptido de señal para un anclaje GPI,

En una realización, el dominio transmembranal codificado por el tercer ácido nucleico es un dominio transmembranal de inmunoglobulina. En una realización de la invención, el segundo ácido nucleico comprende únicamente un sitio 5’

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u organismo diferente ya que dicho segundo ácido nucleico, es decir, dicho tercer ácido nucleico, no se encuentra necesariamente organizado con dicho segundo ácido nucleico en un genoma.

Las secuencias se derivan de genomas o bases de datos disponibles públicamente (por ejemplo el proyecto genoma humano, http://www.gdb.org/; bases de datos del genoma del ratón, http://www.informatics.jax.org/; SwissProt (http://www.expasy.org/sprot/). En caso de no haber anotaciones accesibles, las secuencias se han predicho o se han completado con el software ALOM (ver, por ejemplo, Klein P. et al., Biochim. Biophys. Acta 787:221-226, 1984). En caso de dominios transmembranales completos, la secuencia entre paréntesis se predice con ALOM además de la secuencia de SwissProt proporcionada.

El segundo ácido nucleico puede seleccionarse de entre el grupo de ácidos nucleicos que comprende SEC ID nº 001, 002, 003, 004, 005, 006, 007, 008, 009, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 169, 170, 171, 172, 173. El segundo ácido nucleico del ácido nucleico tal como se informa en la presente memoria puede seleccionarse de entre el grupo de secuencias de ácidos nucleicos de SEC ID nº 001 a SEC ID nº 009. El segundo ácido nucleico puede seleccionarse de entre el grupo de ácidos nucleicos que comprende SEC ID nº 002, 003, 156, 157, 170 y 171. El tercer ácido nucleico del ácido nucleico tal como se informa en la presente memoria puede seleccionarse de entre

o es un fragmento de un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo de secuencias de ácidos nucleicos de SEC ID nº 010 a SEC ID nº 018 y de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de las secuencias de aminoácidos de SEC ID nº 019 a SEC ID nº 069. El tercer ácido nucleico del ácido nucleico tal como se informa en la presente memoria puede seleccionarse de entre o es un fragmento de un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo de secuencias de ácidos nucleicos de SEC ID nº 010, 011, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 160, 161, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 174, 175, 176, y de secuencia de ácidos nucleicos codificantes de las secuencias de aminoácidos de SEC ID nº 019 a SEC ID nº 069 y 162. El tercer ácido nucleico del ácido nucleico tal como se informa en la presente memoria puede seleccionarse de entre o es un fragmento de un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo de secuencias de ácidos nucleicos de SEC ID nº 011, 012, 165, 166, 175 y de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de las secuencias de aminoácidos de SEC ID nº 019 a SEC ID nº 036. El tercer ácido nucleico del ácido nucleico tal como se informa en la presente memoria puede seleccionarse de entre o es un fragmento de un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo de secuencias de ácidos nucleicos de SEC ID nº 011, 012, 165, 166 y

175. El cuarto ácido nucleico del ácido nucleico tal como se informa en la presente memoria puede seleccionarse de entre o comprende un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo de secuencias de ácidos nucleicos de SEC ID nº 070 a SEC ID nº 078 y de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de las secuencias de aminoácidos de SEC ID nº 079 a SEC ID nº 129.

Tabla 1: Ejemplos de segundos ácidos nucleicos.

proteína: sitio 5' donante de procesamien to segundo ácido nucleico (ácido nucleico procesable) sitio 3' donante de procesamien to

cadena pesada δ de inmunoglobuli na humana: imagen12 imagen13 imagen14

cadena pesada γ1 de inmunoglobuli na humana: imagen15 imagen16 imagen17

cadena pesada γ2 de inmunoglobuli na humana: imagen18 imagen19 imagen20

cadena pesada µ de inmunoglobuli na humana: imagen21 imagen22 imagen23

cadena pesada de tipo α de Ig murina: imagen24 imagen25 imagen26

cadena pesada de tipo ε (2) de Ig murina: imagen27 imagen28

cadena pesada de tipo γ1 de Ig murina: imagen29 imagen30 imagen31

cadena pesada de tipo γ2B de Ig murina: imagen32 imagen33 imagen34

cadena pesada de tipo γ3 de Ig murina: imagen35 imagen36 imagen37

cadena pesada de tipo µ de Ig murina: imagen38 imagen39

receptor 1 de factor de crecimiento fibroblástico humano: imagen40 imagen41 imagen42

receptor de factor de crecimiento epitelial murino: imagen43 imagen44 imagen45

receptor 1 del complemento humano (C3b/C4b): imagen46 imagen47

receptor de interleuquina 4 murina: imagen48 imagen49 imagen50

cadena pesada α de inmunoglobuli na humana: imagen51 imagen52

cadena pesada ε (1) de inmunoglobuli na humana: imagen53 imagen54 imagen55

cadena pesada δ de inmunoglobuli na humana: imagen56 imagen57 imagen58

cadena pesada ε (2) de inmunoglobuli na humana: imagen59 imagen60 imagen61

cadena pesada γ3 de inmunoglobuli na humana: imagen62 imagen63 imagen64

cadena pesada γ4 de inmunoglobuli na humana: imagen65 imagen66 imagen67

cadena pesada de tipo ε (1) de Ig murina: imagen68 imagen69 imagen70

cadena pesada de tipo γ2A de Ig murina: imagen71 imagen72 imagen73

receptor 4 de interleuquina humana: imagen74 imagen75 imagen76

Tabla 2: ejemplos de terceros ácidos nucleicos y aminoácidos correspondientes a terceros ácidos nucleicos.

fuente: secuencia de nucleótidos o de aminoácidos SEC ID nº

tramo de cadena pesada/transmembranal de inmunoglobulina δ humana: imagen77 010

tramo de cadena pesada/transmembranal de inmunoglobulina γ1 humana: imagen78 011

tramo de cadena pesada/transmembranal de inmunoglobulina γ2 humana: imagen79 012

tramo de cadena pesada/transmembranal de inmunoglobulina µ humana: imagen80 013

tramo de cadena pesada de tipo α/transmembranal de Ig murina: imagen81 014

tramo de cadena pesada de tipo γ/transmembranal de Ig murina: imagen82 015

tramo de cadena pesada de tipo γ2B/transmembranal de Ig murina: imagen83 016

tramo de cadena pesada de tipo γ3/transmembranal de Ig murina: imagen84 017

tramo de cadena pesada de tipo µ/transmembranal de Ig murina: imagen85 018

acetilcolina esterasa/péptido de señal humano sin péptido conector de anclaje GPI opcional: GEAARRPGLPLPLLLLHQLLLLFLSHLRRL 019

fosfatasa alcalina (intestinal) humana/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: DAAHPVAASLPLLAGTLLLLGASAAP 020

fosfatasa alcalina (hepática) humana/péptido de señal de: SSAGSLAAGPLLVALALYPLSVLF 021

anclaje GPI sin péptido conector opcional

fosfatasa alcalina (placentaria) humana/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: DAAHPGRSWPALLPLLAGTLLLLETATAP 022

antígeno CAMPATH-1 humano/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SASSNISGGIFLFFVANAIIHLFCFS 023

antígeno carcinoembrionario humano/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: ASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI 024

CD55 (factor acelerador de la degradación) humano/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT 025

CD59 humano/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: NGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP 026

antígeno CD90 (Thy-1) humano/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: CEGISLLAQNTSWLLLLLLSLSLLQATDFMSL 027

contactina-1 (CNTN1) humana/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SGAPTLSPSLLGLLLPAFGILV 028

antígeno E48 humano/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: imagen86 029

receptor A de folato humano/ péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS 030

receptor B de folato humano/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: NAGEMLHGTGGLLLSLALMLQLWLLG 031

proteína p137 anclaje a GPI humana/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: imagen87 032

antígeno-3 asociado a la función linfocitaria humana/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SSGHSRHRYALIPIPLAVITTCIVLYMNVL 033

proteína de interacción con mDIA humano (PID)/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SGASSLHRHFGLLLASLAPLVLCLSLL 034

5’-nucleotidasa humana/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: STGSHCHGSFSLIFLSLWAVIFVLYQ 035

factor activador del plasminógeno de tipo uroquinasa humano/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: imagen88 036

antígeno LY-6C proteína de: NAAVPTGASTWTMAGVLLFSLSSVILQTLL 037

superficie celular murina/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional

antígeno Ly-6 humano ThB/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: imagen89 038

5’-nucleotidasa murina/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SAASHYQGSFPLVILSLSAVIFVLYQ 039

antígeno OX45 murino (BCM-1 o Blast-1)/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SSGVCWTATWLVVTTLIIHRILLT 040

antígeno 2 de células madre humanas/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: NFSAAGLGLRASIPLLGLGLLLSLLALLQLSP 041

molécula de adhesión a células vasculares murina/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: AKSFYFICYLCLYLAL 042

proteína brevicán de rata/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: GNSAEGSMPAFLLFLLLQLWDT 043

antígeno CD90 (Thy-1) de rata/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: CGGISLLVQNTSWLLLLLLSLSFLQATDFISL 044

proteína glypicán de rata/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SAATRPEPHYFFLLFLFTLVLAAARPRWR 045

antígeno OX-45 MRC de rata/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SSGVHWIAAWLVVTLSIIPSILLA 046

5’-nucleotidasa de rata/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SAASHYQGSEPLIILSFWAVILVLYQ 047

glucoproteína GP2 mayor membranal de gránulos secretorios pancreáticos de rata/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: RNTGFLLAWPTFELPVFLAWLF 048

proteína RT6.2 de superficie de células T de rata/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SSAGARESCVSLFLVVLPSLLVQLLCLAEP 049

proteína de reparación de ADN de levadura PHR1/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: imagen90 050

proteína 1 de superficie anclada por glucofosfolípido de levadura/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: imagen91 051

proteína precursora del amiloide porcino/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: ARAAPTTSLGSLMTVSALAILGWSV 052

dipeptidasa porcina/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SAAPSLHLPPGSLLASLVPLLLLSLP 053

proteína IL Tat 1.1 de superficie variante de Trypanosoma brucei/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SNSFVIHKAPLFLAFLLF 054

proteína MIT 117a de superficie variante de Trypanosoma brucei/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: DSSILVTKKFALTVVSAAFVALLF 055

proteína MIT 118a de superficie variante de Trypanosoma brucei/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: NGSFLTSKQFAFSVVSAAFVALLF 056

proteína MIT 221 de superficie variante de Trypanosoma brucei/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SNSFVISKTPLWLAVLLF 057

proteína MITat 1,1000 BC de superficie variante de Trypanosoma brucei/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: DGSFLVNKKFALMVYDFVSLLAF 058

proteína MITat 1.5b de superficie variante de Trypanosoma brucei/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: NGSFLTSKQFALMVSAAFVTLLF 059

proteína repetitiva ácida procíclica de Trypanosoma brucei/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: GAATLKSVALPFAIAAAALVAAF 060

proteína TxTat 1 de superficie variante de Trypanosoma brucei/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SNSFVINKAPLLLGFLLF 061

proteína YNat 1.1 de superficie variante de Trypanosoma congolense/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SGSSHGTKAIRSILHVALLM 062

melanotransferrina de pollo/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: AGNKLIQQHLLVITFVPFIILGQLQGLG 063

molécula de adhesión a células neurales de pollo/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: ATLGSPSTSSSFVSLLLSAVTLLLLC 064

acetilcolina esterasa de Torpedo marmorata/péptido de señal humano sin péptido: SSSGTSSSKGIIFYVLFSILYLIFY 065

conector de anclaje GPI opcional

proteína priónica de hámster/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SSAVLFSSPPVILLISFLIFLMVG 066

5’-nucleotidasa bovina/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SAGSHCCGSFSLIFLSVLAVIIILYQ 067

proteína membranal Gp64 de moho mucilaginoso/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: SSATTIAFNAFVVFAIVLSVLLF 068

antígeno específico preespora de moho mucilaginoso/péptido de señal de anclaje GPI sin péptido conector opcional: GSASTVVASLSLIIFSMILSLC 069

receptor 1 de factor de crecimiento fibroblástico humano: imagen92 160

receptor de factor de crecimiento epitelial murino: imagen93 161

receptor 1 del complemento humano (C3b/C4b): THDALIVGTLSGTIFFILLIIFLSWIILK 162

receptor 4 de interleuquina humana: imagen94 174

receptor de interleuquina 4 murina: imagen95 163

tramo de cadena pesada/transmembranal de inmunoglobulina α humana: imagen96 164

tramo de cadena pesada/transmembranal de inmunoglobulina ε humana: imagen97 165

tramo de cadena pesada/transmembranal de inmunoglobulina γ3 humana: imagen98 166

tramo de cadena pesada/transmembranal de inmunoglobulina γ4 humana: imagen99 175

tramo de cadena pesada de tipo ε/transmembranal de Ig murina: imagen100 167

tramo de cadena pesada de tipo δ/transmembranal de Ig murina: imagen101 176

tramo de cadena pesada de tipo γ2A/transmembranal de Ig murina: imagen102 168

Tabla 3: ejemplos de cuartos ácidos nucleicos y aminoácidos correspondientes a cuartos ácidos nucleicos.

fuente: secuencia de nucleótidos o de aminoácidos SEC ID nº

cadena pesada δ de inmunoglobulina humana: ACCTGGCCATGACCCCCCTG ATCCC 070

cadena pesada γ1 de inmunoglobulina humana: AGCTGCAACTGGAGGAGAGC TGTGCGGAG 071

cadena pesada γ2 de inmunoglobulina humana: AGCTGCAACTGGAGGAGAGC TGTGCGGAGGCGC 072

cadena pesada µ de inmunoglobulina humana: AGGGGGAGGTGAGCGCCGA CGAGGA 073

cadena pesada de tipo α de Ig murina: AACGTCAAGAGCCACTTTCC TATGTGCTACT 074

cadena pesada de tipo γ1 de Ig murina: GGCTGCAACTGGACGAGACC TGTGCTGAGGCCCAGGACGG GGAGCTGG 075

cadena pesada de tipo γ2B de Ig murina: GGCTAGACCTGGATGATATC TGTGCTG 076

cadena pesada de tipo γ3 de Ig murina: AGCTGGAACTGAATGAGACC TGT 077

cadena pesada de tipo µ de Ig murina: AGGGGGAGGTGAATGCTGA GGAGGAAGGCTTTG 078

acetilcolina esterasa humana: GFTH 079

fosfatasa alcalina humana (intestinal): ACTT 080

fosfatasa alcalina humana (hepática): CAPA 081

fosfatasa alcalina humana (placentaria): AGTT 082

antígeno CAMPATH-1 humana: TSSP 083

antígeno carcinoembrionario humano: ITVS 084

CD55 humano (factor acelerador de la degradación): SGTT 085

CD59 humano: EQLE 086

antígeno CD90 (Thy-1) humano: KLVK 087

contactina-1 humana (CNTN1): QVKI 088

antígeno E48 humano: CCQE 089

receptor A del folato humano: AAAM 090

receptor B del folato humano: AMHV 091

proteína p137 anclada por GPI humana: GSRG 092

antígeno 3 humano asociado a la función linfocitaria: TCIP 093

proteína de interacción con mDIA humana (PID): YGYS 094

5’-nucleotidasa humana: RIKF 095

factor activador del plasminógeno de tipo uroquinasa humana: QYRS 096

proteína antigénica LY-6C de la superficie de las células murinas: EDLC 097

antígeno Ly-6 ThB murino: TDLC 098

5’-nucleotidasa murina: RIKF 099

antígeno OX45 murino (BCM-1 o Blast-1): DLAR 100

antígeno 2 de células madre murinas: SSFC 101

molécula 1 de adhesión a células vasculares murinas: HLMF 102

proteína brevicán de rata/anclaje GPI: APSS 103

antígeno CD90 (Thy-1) de rata: KLVK 104

proteína glypican de rata: GQKT 105

antígeno OX-45 MRC de rata: TLAR 106

5’-nucleotidasa de rata: RIKF 107

glucoproteína mayor membranal GP2 de gránulos secretorios pancreáticos de rata: NGTP 108

proteína RT6.2 de superficie de las células T de rata: NCLY 109

proteína PHR1 de reparación del ADN de levadura: GSSS 110

proteína 1 de superficie anclada por glucofosfolípido de levadura/anclaje GPI: SSKK 111

proteína precursora del amiloide porcino: EPLS 112

dipeptidasa porcina: NYGY 113

proteína IL Tat 1.1 de superficie variante de Trypanosoma brucei: NTTG 114

proteína MIT 117a de superficie variante de Trypanosoma brucei: NACK 115

proteína MIT 118a de superficie variante de Trypanosoma brucei: EKCR 116

proteína MIT 221 de superficie variante de Trypanosoma brucei: TTGS 117

proteína MITat 1.1000 BC de superficie variante de Trypanosoma brucei: EKCC 118

proteína MITat 1.5b de superficie variante de Trypanosoma brucei: EDCR 119

proteína repetitiva ácida procíclica de Trypanosoma brucei: EPEP 120

proteína TxTat 1 de superficie variante de Trypanosoma brucei: NTTA 121

proteína YNat 1.1 de superficie variante de Trypanosoma congolense: SHLP 122

melanotransferrina de pollo: QCSG 123

molécula de adhesión a células neurales de pollo: TVIP 124

acetilcolina esterasa de Torpedo marmorata: DGEL 125

proteína priónica de hámster: DGRR 126

5’-nucleotidasa bovina: RIQF 127

proteína Gp64 membranal de moho mucilaginoso: NNVC 128

antígeno específico de pre-espora de moho mucilaginoso: STTT 129

En una realización, el polipéptido es una cadena pesada de inmunoglobulina y el dominio transmembranal es de una cadena pesada de inmunoglobulina. Para la expresión de una inmunoglobulina, el ácido nucleico de la presente invención se introduce conjuntamente con un ácido nucleico codificante de una cadena ligera de inmunoglobulina en

5 una célula huésped eucariótica. Estos ácidos nucleicos pueden encontrarse situados en el mismo ácido nucleico o en ácidos nucleicos diferentes.

En la presente memoria se informa de un vector que comprende el ácido nucleico de la invención, además de una célula eucariótica que comprende el vector tal como se informa en la presente memoria.

10 La variante soluble del polipéptido heterólogo codificado por el ácido nucleico según la invención puede producirse mediante transfección de una célula eucariótica con el ácido nucleico de la invención, cultivo de la célula bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido codificado por dicho ácido nucleico y recuperación del polipéptido a partir del citoplasma de las células o del medio de cultivo.

15 Para la preparación de una célula eucariótica tal como se informa en la presente memoria se proporciona un kit. El kit comprende un vector que contiene por lo menos dos sitios de clonación múltiple y un ácido nucleico procesable que se inicia con un sitio 5' donante de procesamiento y se termina con un sitio 3' aceptor de procesamiento, en el que: i) el ácido nucleico comprende un codón de parada traduccional y una señal de poliadenilación, e ii) el ácido

20 nucleico no es eliminado constitutivamente durante el procesamiento del pre-ARNm.

La célula eucariótica puede ser una célula de mamífero. La célula de mamífero puede ser una célula seleccionada de entre el grupo que comprende células CHO, células NS0, células Sp2/0, células COS, células K652, células BHK, células PER.C6® y células HEK.

25 Los ejemplos, listado de secuencias y figuras siguientes se proporcionan con el fin de ayudar a comprender la presente invención, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción de las figuras

30 Figura 1: Tarjetas de plásmidos del vector pmIgG-A de expresión de sIgG/mIgG (A), el vector pmIgGΔ-A de sIgG/mIgG (B) y el vector pIgG-A de expresión de sIgG (C). Los elementos vectores ilustrados se describen en detalle en el texto. Figura 2: Ilustración esquemática de las estructuras de exón-intrón de los casetes de expresión de cadena

gamma.

A: estructura de la región constante de la cadena gamma 1 en el vector de expresión pmIgG-A. El fragmento de ADN de aprox. 7,2 kb se muestra como una línea negra. Los exones están representados por cajas blancas con sus denominaciones indicadas en la parte superior. La posición del sitio de poliadenilación para la forma secretada [p(A)s] y para la forma unida a membrana [p(A)M] de la IgG se muestra mediante columnas negras. La numeración de los intrones y del 3’ UTR se indican en la parte inferior del diagrama. Se muestran las posiciones relativas del sitio de restricción Sph I en el intrón 6 y del sitio Sph I mutado en el 3’ UTR (entre paréntesis).

B: estructura de la región constante de cadena gamma 1-gamma 3-gamma 4 híbrida de aprox. 4,8 kb en el vector de expresión pmIgGΔ-A tal como se ilustra en A. Además, el diagrama indica las regiones derivadas de los tres loci génicos de región constante pesada gamma de inmunoglobulina (IGHG1, IGHG3 e IGHG4).

Figura 3: Correlación entre la secreción de IgG y la señal en superficie celular en clones que expresan mIgG. Seis clones independientes de células Sp2/0-Ag14 transfectadas con el plásmido pmIgG-A (izquierda), pmIgGΔ-A (parte intermedia) o pIgG-A a modo de control (derecha) se cultivaron durante 48 horas bajo condiciones definidas. La mediana de intensidad de fluorescencia en la citometría de flujo como medida de la cantidad de IgG unido a la membrana plasmática se representa mediante columnas grises. La concentración de IgG secretada en los sobrenadantes de cultivo celular correspondientes se representa mediante rombos negros.

Figura 4: Gráfico de puntos de FL1/FSC típico para la separación de células en un citómetro de flujo FACS Vantage (BD). El canal R1 comprendía 5,7% de la población de células vivas ilustrada separada anteriormente con un gráfico de puntos de FSC/SSC. Las células que cayeron dentro de R1 se recogieron durante el procedimiento de separación.

Figura 5: Determinación de las tasas de producción específicas. Los clones 5B11, 9B3 y J5-H3 se cultivaron en matraces de agitación durante 92 horas.

A: división celular. En los puntos temporales indicados tras iniciar los cultivos bajo agitación, se realizó un recuento celular de cada clon con un contador celular CASY.

B: producción de IgG. En los puntos temporales indicados (tal como en A), se determinaron las concentraciones de IgG en los sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad de proteína A.

C: tasas de producción específicas. El gráfico de columnas muestra la tasa de producción específica media para cada clon calculada a partir de los recuentos celulares y las mediciones de IgG dentro de las primeras 69 horas (ver la Tabla 2 y el texto para más detalles). Las desviaciones estándares se indican mediante barras de error.

Figura 6: Microscopía de inmunofluorescencia. El clon 5B11 (imágenes 1 y 4), que expresa la sIgG secretada y la mIgG unida a membrana; el clon J5-H3 (imágenes 2 y 5), que expresa únicamente la sIgG secretada, o las céulas Sp2/0-Ag14 no transfectadas (imágenes 3 y 6) se marcaron para IgG sobre la superficie celular (imágenes 1 a 3) o IgG intracelular (imágenes 4 a 6) y se registraron las imágenes en un microscopio de fluorescencia Axiophot.

Figura 7: Análisis de ARNm mediante transferencia northern.

A: autorradiografía de una transferencia northern hibridada con sonda A (carriles 1 a 3) o sonda B (carriles 4 a 6) marcadas con [α-32P]. En cada carril se separaron 10 mg de ARN total aislado a partir del clon 5B11 (carriles 1 y 4), del clon J5-H3 (carriles 2 y 5) o de células Sp2/0-Ag14 no transfectadas (carriles 3 y 6), mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante y se transfirieron a una membrana de nilón.

B: ilustración esquemática de las dos isoformas de ARNm codificantes de la cadena pesada de mIgG unida a membrana o sIgG secretada. Los exones se representan mediante cajas. Las regiones complementarias a las sondas A y B se marcan mediante barras negras.

Figura 8: Análisis de inmunotransferencia de isoformas de cadena pesada de IgG. Los clones 5B11 (carriles 1 y 4), J5-H3 (carriles 2 y 5) o células Sp2/0-Ag14 no transfectadas (carriles 3 y 6) se extrajeron siguiendo el método de extracción con carbonato alcalino (ver el texto). Las inmunoglobulinas de las fracciones de membrana que contenían proteínas integrales de membrana (carriles 1 a 3) o de las fracciones de SN que predominantemente contenían el contenido soluble de las células (carriles 4 a 6) se purificaron mediante ensayo de interacción (“pull down”) con proteína A y se separaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida desnaturalizante. Tras la transferencia y el marcaje con un anticuerpo secundario acoplado con peroxidasa de rábano picante, las cadenas pesadas se visualizaron mediante una reacción de quimioluminiscencia. Se indican las cadenas pesadas de sIgG secretadas (CP sIgG) y las cadenas pesadas de IgG unida a membrana (CP mIgG). El panel inferior muestra un tiempo de exposición corto de una sección de la membrana de transferencia en el panel superior.

Figura 9 Análisis de ARNm mediante transferencia northern. Autorradiografía de las transferencias northern hibridadas con una sonda A (panel izquierdo) o sonda B (panel derecho) marcada con [α-32P] tal como se muestra en la figura 7B. En cada carril se separaron 10 mg de ARN total aislado a partir de los clones 1A1, 1B6, 1C5 o 1D1 (carriles 1 a 4) y de los clones 1D6, 2D6, KO2 o KO6 (carriles 6 a 9) mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante y se transfirieron a una membrana de nilón. El clon “27” expresaba únicamente sIgG y se añadió a modo de control (carriles 5 y 10). Se

imagen103

imagen104

SEC ID nº 101 SEC ID nº 102: cuarto ácido nucleico derivado del antígeno 2 de células madre murinas cuarto ácido nucleico derivado de la molécula 1 de adhesión a células vasculares murinas

SEC ID nº 103: cuarto ácido nucleico derivado de brevicán de rata

5: SEC ID nº 104 SEC ID nº 105 SEC ID nº 106 SEC ID nº 107 cuarto ácido nucleico derivado del antígeno CD90 de rata cuarto ácido nucleico derivado de glypican de rata cuarto ácido nucleico derivado del antígeno MRC OX45 de rata cuarto ácido nucleico derivado de la 5’-nucleotidasa de rata

SEC ID nº 108: cuarto ácido nucleico derivado de la glucoproteína mayor membranal GP2 de gránulos secretorios

SEC ID nº 109 SEC ID nº 110 SEC ID nº 111: pancreáticos de rata cuarto ácido nucleico derivado de la proteína RT6.2 de superficie de las células T de rata cuarto ácido nucleico derivado de la proteína PHR1 de reparación del ADN de levadura cuarto ácido nucleico derivado de la proteína 1 de superficie anclada por glucofosfolípido de levadura

15: SEC ID nº 112 SEC ID nº 113 SEC ID nº 114 cuarto ácido nucleico derivado de la proteína precusora del amiloide porcino cuarto ácido nucleico derivado de la dipeptidasa porcina cuarto ácido nucleico derivado de la proteína IL Tat 1.1 de superficie variante de Trypanosoma

brucei

SEC ID nº 115: cuarto ácido nucleico derivado de la proteína MIT 117a de superficie variante de Trypanosoma

brucei

SEC ID nº 116: cuarto ácido nucleico derivado de la proteína MIT 118a de superficie variante de Trypanosoma

brucei

SEC ID nº 117: cuarto ácido nucleico derivado de la proteína MIT 221 de superficie variante de Trypanosoma

brucei

25: SEC ID nº 118 cuarto ácido nucleico derivado de la proteína MITat 1,1000 BC de superficie variante de Trypanosoma brucei

SEC ID nº 119: cuarto ácido nucleico derivado de la proteína MITat 1.5b de superficie variante de Trypanosoma

brucei

SEC ID nº 120 SEC ID nº 121: cuarto ácido nucleico derivado de la proteína repetitiva ácida procíclica de Trypanosoma brucei cuarto ácido nucleico derivado de la proteína TxTat 1 de superficie variante de Trypanosoma

brucei

SEC ID nº 122: cuarto ácido nucleico derivado de la proteína YNat1.1 de superficie variante de Trypanosoma

SEC ID nº 123: congolense cuarto ácido nucleico derivado de la melanotransferrina de pollo

35: SEC ID nº 124 SEC ID nº 125 SEC ID nº 126 SEC ID nº 127 cuarto ácido nucleico derivado de la molécula de adhesión a células neurales de pollo cuarto ácido nucleico derivado de AchE de Torpedo marmorata cuarto ácido nucleico derivado de proteína priónica de hámster cuarto ácido nucleico derivado de la 5’-nucleotidasa bovina

SEC ID nº 128 SEC ID nº 129 SEC ID nº 130: cuarto ácido nucleico derivado de la proteína membranal Gp64 de moho mucilaginoso cuarto ácido nucleico derivado del antígeno específico de pre-espora de moho mucilaginoso gen gamma 1 de cadena constante pesada de inmunoglobulina humana (IGHG1) incluyendo los exones entre CH1 y CH3 con todos los intrones intermedios y la región 3' no traducida contigua.

45: SEC ID nº 131 SEC ID nº 132 SEC ID nº 133 SEC ID nº 134 SEC ID nº 135 SEC ID nº 136 SEC ID nº 137 SEC ID nº 138 secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena γ codificada por el plásmido pIgG-A cebador oligonucleótido TM-fw1 cebador oligonucleótido TM-rv1 cebador oligonucleótido M1-rv cebador oligonucleótido M2-fw cebador oligonucleótido TM-fw2 cebador oligonucleótido TM-rv2 cebador oligonucleótido mutSphI-1

55: SEC ID nº 139 SEC ID nº 140 SEC ID nº 141 SEC ID nº 142 cebador oligonucleótido mut SphI-2 gen gamma 1 de cadena constante pesada de inmunoglobulina humana (IGHG1) incluyendo los exones de CH1 a M2 con todos los intrones intermedios, el sitio de poliadenilación para la forma secretada de IgG1 en el intrón 6 y la 3’UTR que contiene el sitio de polidenilación para la forma unida a membrana de IgG1. secuencias de aminoácidos de la isoforma corta (sIgG) codificada por el plásmido pmIgG-A. secuencias de aminoácidos de la isoforma larga (mIgG) de la región constante de cadena γ codificada por el plásmido pmIgG-A.

65: SEC ID nº 143 SEC ID nº 144 SEC ID nº 145 SEC ID nº 146 gen IGHG1 humano, incluyendo los exones de CH1 a CH3 con todos los intrones intermedios, y la parte 5' contigua del intrón 6, incluyendo el sitio de poliadenilación para la forma secretada de la inmunoglobulina. secuencias de aminoácidos de la isoforma corta (sIgG) de la región constante de cadena γ codificada por el plásmido pmIgGΔ-A. secuencias de aminoácidos de la isoforma larga (mIgG) de la región constante de cadena γ codificada por el plásmido pmIgGΔ-A. Secuencia codificada eliminada del plásmido pmIgGΔ-B.

imagen105

-el intensificador y promotor tempranos inmediatos procedentes del citomegalovirus humano (CMV_h), -una región 5’ no traducida sintética que incluye una secuencia de consenso de Kozak, -una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina murina que incluye el intrón de secuencia de

señal, 5 -un ADNc de cadena variable κ de un anticuerpo con especificidad contra una proteína “A”, -el intensificador de Igκ del intrón 2 de ratón unido al gen de la región constante κ de inmunoglobulina humana (IGKC), y -la región 3’ no traducida del gen IGKC humano que contiene el sitio de poliadenilación.

: 10 3. Una unidad de transcripción de neomicina fosfotransferasa como marcador seleccionable para células de mamífero.

4. Un origen de replicación procedente del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli.

: 15 5. Un gen beta-lactamasa que proporciona resistencia a la ampicilina en E. coli.

b) Construcción del vector de expresión de sIgG/mIgG ‘pmIgG-A’

Un fragmento genómico de 5,2 kb del locus de la cadena constante pesada gamma 1 de inmunoglobulina humana

20 (IGHG1) que comprendía la parte principal del intrón después del exón CH3 (intrón 6), el exón M1, el intrón después del exón M1 (intrón 7), el exón M2 y la región 3’ no traducida contigua (3’UTR), incluyendo la señal de poliadenilación para la forma unida a membrana de la cadena gamma 1, se amplificaron a partir del ADN genómico humano (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) mediante PCR utilizando el sistema de PCR de moldes largos Expand (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) y el cebador oligonucleótido especificado en la Tabla 4.

25

Tabla 4: cebador oligonucleótido para la clonación y la mutagénesis.

Utilización para: Nombre Secuencia (en dirección 5’ a 3’) SEC ID nº

Amplificación de fragmento genómico IGHG1 de 5,2 kb: TM-fw1 imagen106 132

TM-rv1: imagen107 133

Amplificación de fragmento genómico IGHG3 de 1,1 kb: TM-fw1 imagen108 132

M1-rv: imagen109 134

Amplificación de fragmento genómico IGHG4 de 1,6 kb: M2-fw imagen110 135

TM-rv1: imagen111 133

Amplificación del fragmento IGHG3-IGHG4 unido: TM-fw2 imagen112 136

TM-rv2: imagen113 137

imagen114

imagen115

5

15

25

35

45

55

65

Ejemplo 2

Transfección y análisis de las células Sp2/0-Ag14

a) Cultivo y electroporación de células Sp2/0-Ag14

Se cultivaron células de hibridoma Sp2/0-Ag14 (ATCC nº CRL-1581, Shulman M. et al., Nature 276:269-270, 1978) en medio RPMI (Invitrogen Corp., USA) complementado con suero de feto bovino (SFB) al 10% de contenido ultrabajo en IgG (Invitrogen Corp., US) y glutamina 2 mM (Invitrogen Corp., US) a 37ºC, 5% de CO2 y 95% de humedad. Para la transfección, las células se electroporaron con 10 μg de ADN plasmídico por cada 106 células en tampón HEPES 20 mM (ácido N-(-hidroxietil)-piperazín-N’-2-etanosulfónico), pH 7,0, que contenía NaCl 137 mM, KCl 5 mM, Na2HPO4 0,7 mM y glucosa 6 mM a 4ºC. La electroporación se llevó a cabo a 220 V y 960 mF con un dispositivo de electroporación Genepulser (Bio-Rad Laboratories Inc., US). Tras la transfección, las células se distribuyeron en placas de 96 pocillos con 5.000 células en 100 µl de medio en cada pocillo. Para la selección de las células trnasfectadas, se añadieron 500 mg/ml de G418 (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) al medio un día después de la electroporación. Se cambió el medio cada dos a tres días para mantener la presión selectiva. Aproximadamente dos semanas después de la transfección, se aislaron clones de transfectoma a partir de placas de 96 pocillos y se propagaron adicionalmente en recipientes de cultivo apropiados. Para el almacenamiento, se almacenaron aproximadamente 106 células de un clon en dimetilsulfóxido al 10% (Sigma-Aldrich Co., Alemania) en FCS bajo en IgG (Invitrogen Corp., US) y se almacenaron en nitrógeno líquido.

Las transfecciones de cada 106 células con los plásmidos pmIgG-A, pmIgGΔ-A y pIgG-A condujeron a 15, 19 y 12 clones independientes, respectivamente. De cada transfección se seleccionaron aleatoriamente 6 clones para análisis adicionales.

b) Cuantificación de IgG y análisis mediante citometría de flujo

Se sembraron 105 células de cada clon del Ejemplo 2a) en 2 ml de medio que contenía G418 (tal como se ha indicado anteriormente) en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 48 horas. A continuación, se recolectaron los sobrenadantes y se cuantificó la cantidad de IgG secretada mediante inmunoensayo de fluorescencia de resolución temporal homogénea (HTRF) utilizando el “kit de detección de Fc humano” (CIS Bio international) siguiendo el protocolo del fabricante. Para analizar los anticuerpos unidos a la membrana plasmática mediante citometría de flujo, se lavaron 105 células de cada clon dos veces con STF (solución salina tamponada con fosfato) a 4ºC, después se resuspendieron en 50 μl de fragmento F(ab’)2 conjugado con FITC de ratón anti-IgG humana (Dianova, Alemania) diluido 1:50 en PBS que contenía SFB al 1% (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) y se incubaron durante una hora a 4ºC en la oscuridad. Tras lavar dos veces con PBS, las células se resuspendieron en PBS y se analizaron con un citómetro de flujo FACSCalibur de BD (BD Biosciences, US). Como medida de la cantidad de IgG unida a la superficie celular, se determinó para cada clon la mediana de la intensidad de fluorescencia.

En la figura 3, la mediana de intensidad de fluorescencia en la citometría de flujo se muestra conjuntamente con la concentración de IgG en el sobrenadante de cultivo celular de cada clon. Se observó que para los clones transfectados con pmIgG-A o pmIgGΔ-A (es decir, plásmidos codificantes de tanto la forma sIgG como mIgG), una cantidad incrementada de IgG secretada correspondía a una señal elevada de la superficie celular. No se observó dicha correlación para los clones transfectados con pIgG-A (es decir, el plásmido codificante de únicamente sIgG, la forma secretada del anticuerpo).

Ejemplo 3

Separación de células establemente transfectadas mediante citometría de flujo

Para la generación de clones que expresan establemente IgG, se transfectaron 3x106 células Sp2/0-Ag14 con el plásmido pmIgGΔ-B mediante electroporación, tal como se ha indicado anteriormente. Un día después de la transfección, las células se transfirieron a medio de selección con 500 mg/ml de G418 y se cultivaron como un grupo durante aproximadamente dos semanas. Tras la selección, la IgG unida a la superficie de las células transfectadas se marcó y las células con las señales más intensas se separaron mediante citometría de flujo. Por lo tanto, se lavaron 4x106 células del grupo dos veces con medio a 4ºC y después se incubaron con fragmento F(ab’)2 conjugado con fluoresceína (FITC) de ratón anti-IgG humana (Dianova, Alemania), diluido 1:50 en medio, durante 20 minutos sobre hielo. Tras dos etapas de lavado con medio, las células se resuspendieron en medio y se transfirieron a un citómetro de flujo FACSVantage de BD (BD Biosciences, US). Se fijó un canal que comprendía células con el 56% superior de intensidad de fluorescencia de la población de muestra (figura 4) y se recogieron las células separadas por dicho canal. Las células recolectadas se expandieron mediante cultivo en medio de selección durante varios días. Con estas células se llevó a cabo un segundo ciclo y, seguidamente, un tercer ciclo de separación, tal como se ha indicado anteriormente. En lugar de recolectar las células separadas en forma de grupo, se llevó a cabo una cuarta y una etapa final de separación para las deposiciones de células individuales en placas de 96 pocillos. La deposición condujo a 141 clones independientes de entre los que se seleccionaron 21 para el análisis de la expresión de IgG mediante inmunoensayo de FRTH, tal como se ha indicado en el Ejemplo 2b). Dos clones de entre

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