ES2565634T3 - Dispositivo de poro dual - Google Patents

Abstract

Un dispositivo amplificador dual y de poro dual, para controlar simultáneamente el movimiento de un polímero cargado a través de un primer (111) y un segundo poro (112), que comprende una cámara superior (cámara A), una cámara intermedia (cámara B) y una cámara inferior (cámara C), en el que la cámara superior está en comunicación con la cámara intermedia a través de un primer poro (111), y la cámara intermedia está en comunicación con la cámara inferior a través de un segundo poro (112), en el que el dispositivo comprende un suministro de energía configurado para proporcionar un primer voltaje entre la cámara superior y la cámara intermedia, y proporcionar un segundo voltaje entre la cámara intermedia y la cámara inferior, pudiendo ajustarse cada voltaje independientemente, en el que el dispositivo comprende componentes electrónicos de amplificador dual (131, 132) configurados para el control del voltaje y la medición de la corriente independientes en cada poro (111, 112), en el que los dos voltajes son diferentes en magnitud, en el que el primer y el segundo poro se configuran de modo que el polímero cargado es capaz de moverse simultáneamente a través de ambos poros (111, 112) en cualquier dirección y de una manera controlada, y en el que cada una de las cámaras comprende un electrodo (121, 122, 123) conectado al suministro de energía, que se caracteriza por que el primer poro (111) y el segundo poro (112) tienen un diámetro de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, y están separados entre sí por una distancia de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1000 nm.

Description

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DESCRIPCION

Dispositivo de poro dual

Esta solicitud reivindica el beneficio, bajo 35 U.S.C. § 119(e), de la solicitud provisional de EEUU n.° 61/572.843, presentada el 20 de julio, 2011.

Antecedentes

Un nanoporo es una abertura de escala nanometrica que se forma de modo natural como canal de protemas en una membrana lipfdica (un poro biologico), o se fabrica taladrando o grabando la abertura en un sustrato en estado solido (un poro en estado solido). Cuando dicho nanoporo se incorpora en un nanodispositivo que comprende dos camaras que estan separadas por el nanoporo puede emplearse un amplificador de pinzamiento zonal de membrana sensible para aplicar un voltaje transmembrana y medir la corriente ionica a traves del poro.

Los nanoporos son muy prometedores para la secuenciacion barata del ADN genomico completo. A este respecto, las moleculas de ADN individuales pueden capturarse y hacerse pasar a traves del poro mediante electroforesis, y cada acontecimiento de captura puede detectarse como un desplazamiento temporal en la corriente ionica. Despues puede inferirse la secuencia de una molecula de ADN a partir de los patrones dentro del registro de la corriente ionica desplazada, o partir de otro detector auxiliar en el nanoporo o cerca de este, a medida que el ADN pasa a traves del canal del poro.

En principio, un secuenciador de nanoporos puede eliminar la necesidad de amplificar la muestra, del uso de enzimas y reactivos empleados para la funcion catalttica durante la operacion de secuenciacion, y de instrumentos opticos para la deteccion del avance de la secuenciacion, algunos de los cuales o todos son necesarios en los metodos de secuenciacion por smtesis convencionales.

Los detectores de nanoporos son puramente electricos y pueden detectar ADN en concentraciones/volumenes que no son mayores que los disponibles en una muestra de sangre o saliva. Ademas, los nanoporos prometen aumentar drasticamente la longitud de lectura del ADN secuenciado, de 450 bases a mas de 10.000 bases.

Existen dos principales obstaculos a la secuenciacion con nanoporos: (1) la falta de sensibilidad suficiente para determinar con precision la identidad de cada nucleotido en el acido nucleico para la secuenciacion de novo (la falta de sensibilidad de nucleotidos individuales), y (2) la capacidad para regular la velocidad de transporte de cada unidad de nucleotido a traves del nanoporo durante la deteccion. Aunque muchos grupos de investigacion estan desarrollando y mejorando los nanoporos para intentar solucionar el obstaculo 1, no existe ningun metodo para solucionar el obstaculo 2 que no implique el uso de enzimas o instrumentos opticos, que solo sirven para tecnicas de nanoporos especializadas y provocan un aumento en los costes y la complejidad, comparado con los metodos puramente electricos. El documento EP 1645628 describe un aparato y un metodo para la separacion, la retirada, la concentracion o el aislamiento de un biopolfmero (ADN, ARN) a partir de una muestra mixta translocando un biopolfmero de un tamano seleccionado desde un deposito a otro a traves de un nanoporo. El documento US 2005/227239 describe un metodo y un aparato para separar e identificar un resto qmmico en el que una molecula diana se une a una sonda, se libera de la sonda y se identifica o secuencia mediante un sistema de nanoporos en estado solido. El sistema de nanoporos se disena para recibir la molecula diana y para registrar y cuantificar su naturaleza, numero, perfil de elusion y orden de elucion de la matriz de union. Pedone et al. (29 de octubre, 2010), J. Physics: Condensed Matter, 22(45), p. 454115) describen la fabricacion y la caracterizacion de un dispositivo de poro-cavidad-poro que consiste en una cavidad de dimensiones micrometricas con dos nanoporos que actuan como entrada y salida. El dispositivo puede utilizarse para investigar objetos no cargados en geometnas confinadas.

Resumen

En una realizacion, se proporciona un dispositivo que comprende una camara superior, una camara intermedia y una camara inferior, en el que la camara superior esta en comunicacion con la camara intermedia a traves de un primer poro, y la camara intermedia esta en comunicacion con la camara inferior a traves de un segundo poro, en el que el primer poro y el segundo poro tienen un diametro de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, y estan separados entre sf por una distancia de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1000 nm, y en el que cada una de las camaras comprende un electrodo para conectarse a una fuente de energfa.

En un aspecto, el primer y el segundo poro son sustancialmente coaxiales.

En un aspecto, el dispositivo comprende un material seleccionado del grupo que consiste en silicio, nitruro de silicio, dioxido de silicio, grafeno, nanotubos de carbono, TiO2, HfO2, AhO3, capas metalicas, vidrio, nanoporos biologicos, membranas con poros biologicos insertados y sus combinaciones.

En un aspecto, el primer poro y el segundo poro tienen una profundidad de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 100 nm.

En un aspecto, el suministro de energfa se configura para proporcionar un primer voltaje entre la camara superior y

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la camara intermedia, y un segundo voltaje entre la camara intermedia y la camara inferior, y en el que el primer voltaje y el segundo voltaje son ajustables independientemente.

En un aspecto, el suministro de energfa comprende un sistema pinzamiento de voltaje o de pinzamiento zonal de membrana para generar cada uno del primer y segundo voltaje. En un aspecto, la camara intermedia se ajusta para que este conectada a tierra con relacion a los dos voltajes. En un aspecto, la camara intermedia comprende un medio para proporcionar conductancia entre cada uno de los poros y el electrodo en la camara intermedia.

En algunos aspectos, el suministro de energfa, tal como el sistema de pinzamiento de voltaje o el sistema de pinzamiento zonal de membrana, tambien se configura para medir la corriente ionica entre cada uno de los poros.

Otra realizacion proporciona un dispositivo que comprende una camara superior, una camara intermedia y una camara inferior, en el que la camara superior esta en comunicacion con la camara intermedia a traves de un primer poro, y la camara intermedia esta en comunicacion con la camara inferior a traves de un segundo poro, y en el que el primer poro y el segundo poro tienen un diametro de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, y estan separados entre sf por una distancia de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1000 nm; y un electrodo en cada una de las camaras para conectarse a un sistema de pinzamiento de voltaje o de pinzamiento zonal de membrana para aplicar un voltaje y medir la corriente ionica a traves de cada uno de los poros, en el que el electrodo en la camara intermedia esta conectado a una tierra comun de los dos sistemas de pinzamiento de voltaje o de pinzamiento zonal de membrana.

Tambien se proporciona, en una realizacion, un metodo para controlar el movimiento de un polfmero cargado a traves de un poro, que comprende: (a) cargar una muestra que comprende un polfmero cargado en una de la camara superior, la camara intermedia o la camara inferior del dispositivo de cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que el dispositivo esta conectado a un sistema de pinzamiento de voltaje o un sistema de pinzamiento zonal de membrana para proporcionar un primer voltaje entre la camara superior y la camara intermedia, y un segundo voltaje entre la camara intermedia y la camara inferior; (b) ajustar un primer voltaje inicial y un segundo voltaje inicial, de modo que el polfmero se mueva entre las camaras, situando con ello al polfmero a traves del primer y del segundo poro; y (c) ajustar el primer voltaje y el segundo voltaje de modo que ambos voltajes generen una fuerza para arrastrar al polfmero cargado de la camara intermedia, en el que los dos voltajes son diferentes en magnitud, bajo condiciones controladas, de modo que el polfmero cargado se mueva a traves de ambos poros en una direccion y de una manera controlada.

En un aspecto, la manera controlada de transporte se establece mediante el control activo o el control retroalimentado del primero o el segundo voltaje o ambos, teniendo cualquiera o ambos una funcion de retroalimentacion de la primera o la segunda o ambas mediciones de la corriente ionica. Un ejemplo no limitante incluye mantener el segundo voltaje constante y emplear la segunda corriente ionica como retroalimentacion para el control retroalimentado o activo del primer voltaje, para establecer un transporte controlado de un polfmero cargado en cualquier direccion. Por consiguiente, en un aspecto, el primer voltaje se ajusta basandose en una corriente ionica medida a traves del segundo poro.

En un aspecto, la muestra se carga en la camara superior y el primer voltaje inicial se ajusta para arrastrar al polfmero cargado de la camara superior hacia la camara intermedia, y el segundo voltaje inicial se ajusta para arrastrar al polfmero de la camara intermedia hacia la camara inferior.

En otro aspecto, la muestra se carga en la camara intermedia y el primer voltaje inicial se ajusta para arrastrar al polfmero cargado de la camara intermedia hacia la camara superior, y el segundo voltaje inicial se ajusta para arrastrar al polfmero cargado de la camara intermedia hacia la camara inferior.

En un aspecto, el polfmero cargado es un polinucleotido o un polipeptido. En un aspecto, el polfmero cargado es un polinucleotido tal como, pero sin limitarse a un ADN bicatenario, un ADN monocatenario, un ARN bicatenario, un ARN monocatenario o un tubrido de ADN-ARN.

En un aspecto, el primer voltaje y el segundo voltaje ajustados en la etapa (c) son de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 10.000 veces tan altos, en magnitud, como la diferencia entre los dos voltajes.

En un aspecto, el metodo comprende ademas identificar una unidad monomerica del polfmero midiendo una corriente ionica a traves de uno de los poros cuando la unidad monomerica pasa a traves de ese poro. En un aspecto, la unidad monomerica es un nucleotido. En otro aspecto, la unidad monomerica es una pareja de nucleotidos. Los nucleotidos individuales y las parejas de nucleotidos, en algunos aspectos, pueden detectarse en una molecula. Por ejemplo, esta molecula puede tener un segmento de duplex en un polinucleotido mas largo que, por lo demas, es monocatenario, habiendose formado el duplex parcial o totalmente mediante apareamiento de bases complementarias de Watson-Crick.

En un aspecto, el monomero se une a una molecula, tal como una protema de union al ADN, o una nanopartmula. Los ejemplos no limitantes de protemas de union al ADN incluyen la protema RecA y protemas de union al ADN espedficas de secuencia, tales como el represor del fago lambda, NF-kB y p53. Los ejemplos no limitantes de nanopartmulas incluyen los puntos cuanticos y los marcadores fluorescentes.

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En un aspecto, el poUmero esta unido a un soporte solido, tal como una esfera, en un extremo del poKmero.

Otra realizacion proporciona un metodo para determinar la secuencia de un polinucleotido, que comprende: (a) cargar una muestra que comprende un polinucleotido en la camara superior del dispositivo de cualquiera de las anteriores realizaciones, en el que el dispositivo esta conectado a un sistema de pinzamiento de voltaje o un sistema de pinzamiento zonal de membrana para proporcionar un primer voltaje entre la camara superior y la camara intermedia, y un segundo voltaje entre la camara intermedia y la camara inferior, en el que el polinucleotido esta unido opcionalmente a un soporte solido en un extremo del polinucleotido; (b) ajustar un primer voltaje inicial y un segundo voltaje inicial de modo que el polinucleotido se mueve desde la camara superior hacia la camara intermedia y desde la camara intermedia hacia la camara inferior, situando con ello al polfmero a traves de ambos primer y segundo poro; (c) ajustar el primer voltaje y el segundo voltaje de modo que ambos voltajes generen una fuerza para arrastrar al polinucleotido de la camara intermedia, en el que los dos voltajes son diferentes en magnitud, bajo condiciones controladas, de modo que el polinucleotido se mueve a traves de ambos poros en una direccion y de una manera controlada. y (d) identificar cada nucleotido del polinucleotido que pasa a traves de uno de los poros, mediante la medicion de una corriente ionica a traves del poro cuando el nucleotido pasa a traves de ese poro.

Breve descripcion de los dibujos

Las figuras de los dibujos adjuntos describen las realizaciones proporcionadas solo como ilustracion, en las que:

FIG. 1(I)-(IM) ilustra un dispositivo de dos poros (de poro dual). (I) Esquema de la configuracion del chip de poro dual y de los componentes electronicos del amplificador dual para para el control del voltaje (Vi, V2) y las mediciones de corriente (1, I2) independientes de cada poro. Las camaras (A-C) estan volumetricamente separadas excepto por los poros comunes. Los parametros posibles del chip son una distancia entre poros de 10-500 nm, un espesor de membrana de 0,3-50 nm, y un diametro de los poros de 1-100 nm. (II) Electricamente, Vi y V2 son principalmente a traves de cada resistencia del nanoporo, construyendo un dispositivo que minimiza todas las resistencias de acceso para desacoplar Ii e I2 de forma eficaz. (III) Se emplearan voltajes competidores para el control, y las flechas azules muestra la direccion de cada fuerza de voltaje. Suponiendo la existencia de los poros con identica influencia de voltaje-fuerza y empleado |Vi| = | V2I + 6 V, el valor 6 V > 0 (< 0) se ajusta para un movimiento sintonizable en la direccion Vi (V2). En la practica, aunque la fuerza inducida por el voltaje en cada poro no sera identica a Vi = V2, unos experimentos de calibracion pueden identificar el sesgo de voltaje requerido que produzca fuerzas de igual capacidad de arrastre, para un chip de dos poros concreto, y despues pueden utilizarse las variaciones alrededor de ese sesgo para el control direccional; y

FIG. 2 muestra una vista externa de un dispositivo de alojamiento de dos poros que presenta una camara A, una camara B y una camara C, en las que cada una presenta una abertura para el acceso de fluidos y la carga de muestras. Un chip de poro dual se coloca entre dos juntas, siendo cada junta parte de cada porcion del dispositivo de alojamiento, y las dos porciones rotan alrededor de una bisagra (arriba en el centro) para abrir y cerrar el alojamiento alrededor del chip.

Algunas de las figuras son representaciones esquematicas que se ofrecen como ejemplo; por tanto, no muestran necesariamente los tamanos relativos o las localizaciones reales de los elementos mostrados. Las figuras se presentan con el fin de ilustrar una o mas realizaciones con la comprension explfcita de que no se utilizaran para limitar el alcance o el significado de las reivindicaciones que aparecen a continuacion.

Descripcion detallada

A lo largo de esta solicitud, el texto se refiere a diversas realizaciones de los presentes nutrientes, composiciones y metodos. Las diversas realizaciones descritas pretenden proporcionar una diversidad de ejemplos ilustrativos y no deben considerarse como descripciones de especies alternativas. En su lugar, debe advertirse que las descripciones de las diversas realizaciones proporcionadas en la presente pueden tener un alcance solapante. Las realizaciones analizadas en la presente son simplemente ilustrativas y no pretenden limitar el alcance de la presente invencion.

Tambien a lo largo de esta descripcion se mencionan diversas publicaciones, patentes y memorias descriptivas de patentes publicadas mediante una cita identificativa. Las descripciones de estas publicaciones, patentes y memorias descriptivas de patentes publicadas se incorporan en la presente descripcion como referencia para describir mas a fondo la tecnica actual a la cual pertenece esta invencion.

Tal como se emplea en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la forma singular "un/una" y "el/la" incluye la referencia en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresion "un electrodo" incluye una pluralidad de electrodos e incluye sus mezclas.

Tal como se emplea en la presente, el termino "comprende" significa que los dispositivos y los metodos incluyen los componentes o etapas indicados, pero no se excluyen otros. "Que consiste fundamentalmente en", cuando se emplea para definir dispositivos y metodos, significa que se excluyen otros componentes o etapas de cualquier significado fundamental para la combinacion. "Que consiste en" significa que se excluyen otros componentes o etapas. Las realizaciones definidas por cada uno de estos terminos y expresiones de transicion estan dentro del alcance de esta invencion.

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Todas las denominaciones numericas, por ejemplo, distancia, tamano, temperatura, tiempo, voltaje y concentracion, incluyendo los intervalos, son aproximaciones que pueden variar (+) o (-) en incremented de 0,1. Debe entenderse, aunque no siempre se menciona explteitamente, que todas las denominaciones numericas estan precedidas por el termino "aproximadamente". Tambien debe entenderse, aunque no siempre se menciona explteitamente, que los componentes descritos en la presente son simplemente ejemplos y que en la tecnica se conocen equivalentes de estos.

Dispositivo de dos poros

Una realizacion de la presente descripcion proporciona un dispositivo de dos poros. El dispositivo incluye tres camaras y dos poros que permiten la comunicacion fluida entre las camaras. Ademas, cada una de las camaras contiene un electrodo para conectarse a un suministro de energfa, de modo que puede establecerse un voltaje separado a traves de cada uno de los poros entre las camaras.

Segun una realizacion de la presente descripcion, se proporciona un dispositivo que comprende una camara superior, una camara intermedia y una camara inferior, en el que la camara superior esta en comunicacion con la camara intermedia a traves de un primer poro, y la camara intermedia esta en comunicacion con la camara inferior a traves de un segundo poro, en el que el primer poro y el segundo poro tienen un diametro de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, y estan separados entre sf por una distancia de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1000 nm, y en el que cada una de las camaras comprende un electrodo para conectarse a una fuente de energfa.

Haciendo referencia a la FIG. 1(I), el dispositivo incluye una camara superior (camara A), una camara intermedia (camara B), y una camara inferior (camara C). Las camaras estan separadas por dos capas de separacion o membranas (101 y 102) que poseen cada una un poro distinto (111 y 112). Ademas, cada camara contiene un electrodo (121, 122 y 123) para la conexion a un suministro de energfa. Es evidente que la anotacion de la camara superior, intermedia e inferior es relativa y no indica, por ejemplo, que la camara superior este colocada por encima de la camara intermedia o inferior con relacion al suelo, o viceversa.

Cada uno de los poros (111 y 112) independientemente tiene un tamano que permite que una molecula pequena o grande o un microorganismo pase. En un aspecto, cada poro tiene un diametro de al menos aproximadamente 1 nm. Como alternativa, cada poro tiene un diametro de al menos aproximadamente 2 nm, 3 nm, 4 nm, 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm, 11 nm, 12 nm, 13 nm, 14 nm, 15 nm, 16 nm, 17 nm, 18 nm, 19 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm o 100 nm.

En un aspecto, el poro tiene un diametro no mayor que aproximadamente 100 nm. Como alternativa, el poro tiene un diametro no mayor que aproximadamente 95 nm, 90 nm, 85 nm, 80 nm, 75 nm, 70 nm, 65 nm, 60 nm, 55 nm, 50 nm, 45 nm, 40 nm, 35 nm, 30 nm, 25 nm, 20 nm, 15 o 10 nm.

En un aspecto, el poro tiene un diametro que esta entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 100 nm, o como alternativa entre aproximadamente 2 nm y aproximadamente 80 nm, o entre aproximadamente 3 nm y aproximadamente 70 nm, o entre aproximadamente 4 nm y aproximadamente 60 nm, o entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 50 nm, o entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 40 nm, o entre

aproximadamente 15 nm y aproximadamente 30 nm.

En algunos aspectos, el poro tiene una forma sustancialmente redonda. "Sustancialmente redonda", tal como se emplea en la presente, se refiere a una forma que en al menos aproximadamente 80 o 90% esta en forma de un cilindro. En algunas realizaciones, el poro tiene una forma cuadrada, rectangular, triangular, oval, o hexangular.

Cada uno de los poros (111 y 112) independientemente tiene una profundidad. En un aspecto, cada poro tiene una profundidad de al menos aproximadamente 0,3 nm. Como alternativa, cada poro tiene una profundidad que es de al menos aproximadamente 0,6 nm, 1 nm, 2 nm, 3 nm, 4 nm, 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm, 11 nm, 12 nm, 13 nm, 14 nm, 15 nm, 16 nm, 17 nm, 18 nm, 19 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, o 90 nm.

En un aspecto, cada poro tiene una profundidad que no es mayor que aproximadamente 100 nm. Como alternativa,

la profundidad no es mayor que aproximadamente 95 nm, 90 nm, 85 nm, 80 nm, 75 nm, 70 nm, 65 nm, 60 nm, 55

nm, 50 nm, 45 nm, 40 nm, 35 nm, 30 nm, 25 nm, 20 nm, 15 o 10 nm.

En un aspecto, el poro tiene una profundidad que esta entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 100 nm, o como alternativa, entre aproximadamente 2 nm y aproximadamente 80 nm, o entre aproximadamente 3 nm y aproximadamente 70 nm, o entre aproximadamente 4 nm y aproximadamente 60 nm, o entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 50 nm, o entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 40 nm, o entre

aproximadamente 15 nm y aproximadamente 30 nm.

En un aspecto, los poros estan separados entre sf por una distancia que esta entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 1000 nm. En un aspecto, la distancia es de al menos aproximadamente 10 nm, o como alternativa, de al menos aproximadamente 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150

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nm, 200 nm, 250 nm, o 300 nm. En otro aspecto, la distancia no es mayor que aproximadamente 1000 nm, 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, o 100 nm. En otro aspecto, la distancia esta entre aproximadamente 20 nm y aproximadamente 800 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 700 nm, entre aproximadamente 40 nm y aproximadamente 500 nm, o entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 300 nm.

Los dos poros pueden disponerse en cualquier posicion, con la condicion de que permitan una comunicacion fluida entre las camaras y de que tengan el tamano y la distancia entre ellos prescritos. En un aspecto, los poros se colocan de modo que no exista un bloqueo directamente entre ellos. Ademas, en un aspecto, los poros son sustancialmente coaxiales, tal como se ilustra en FIG. 1(I).

En un aspecto, el dispositivo, a traves de los electrodos en las camaras, esta conectado a uno o mas suministros de energfa. En algunos aspectos, el suministro de energfa esta formado por un pinzamiento de voltaje o un pinzamiento zonal de membrana para suministrar el voltaje a traves de cada poro, que tambien puede medir independientemente la corriente a traves de cada poro. A este respecto, el suministro de energfa puede ajustar la camara intermedia a una tierra comun para ambas fuentes de voltaje. En un aspecto, el suministro de energfa se configura para proporcionar un primer voltaje entre la camara superior (por ejemplo, la camara A en FIG. 1(I)) y la camara intermedia (por ejemplo, la camara B en FIG. 1(I)), y un segundo voltaje entre la camara intermedia y la camara inferior (por ejemplo, la camara C en FIG. 1(I)).

En algunos aspectos, el primer voltaje y el segundo voltaje son ajustables independientemente. En un aspecto, la camara intermedia se ajusta para que se conecte a tierra con relacion a los dos voltajes (ilustrado en FIG. 1(I-III)). En un aspecto, la camara intermedia comprende un medio para proporcionar conductancia entre cada uno de los poros y el electrodo en la camara intermedia. En un aspecto, la camara intermedia comprende un medio para proporcionar una resistencia entre cada uno de los poros y el electrodo en la camara intermedia. Resulta util mantener dicha resistencia lo suficientemente pequena, con relacion a las resistencias de los nanoporos, para desacoplar los dos voltajes y corrientes a traves de los poros, lo cual ayuda al ajuste independiente de los voltajes.

El ajuste de los voltajes puede emplearse para controlar el movimiento de las partfculas cargadas en las camaras. Por ejemplo, cuando ambos voltajes se ajustan en la misma direccion, una partfcula de carga apropiada puede moverse desde la camara superior hacia la camara intermedia y hacia la camara inferior, o al reves, de modo secuencial. De otra forma, una partfcula cargada puede moverse desde la camara superior o inferior hacia la camara intermedia y mantenerse aht

El ajuste de los voltajes en el dispositivo puede ser particularmente util para controlar el movimiento de una molecula grande, tal como un polfmero cargado, que sea lo suficientemente larga como para cruzar ambos poros al mismo tiempo. En este aspecto, el movimiento y la velocidad de movimiento de la molecula puede controlarse mediante la magnitud relativa y la direccion de los voltajes, aspecto que se describira mas a fondo a continuacion.

El dispositivo puede contener materiales adecuados para contener muestras de lfquidos, en particular muestras biologicas y/o materiales adecuados para la nanofabricacion. En un aspecto, estos materiales incluyen materiales dielectricos tales como, pero sin limitarse a silicio, nitruro de silicio, dioxido de silicio, grafeno, nanotubos de carbono, TiO2, HfO2, AhO3, u otras capas metalicas, o cualquier combinacion de estos materiales. Una unica lamina de grafeno forma una membrana con un espesor de aproximadamente 0,3 nm, y puede utilizarse como la membrana que porta el poro, por ejemplo.

Los dispositivos que son microflmdicos y que albergan aplicaciones de chips microflmdicos de dos poros pueden fabricarse mediante una diversidad de medios y metodos. Para un chip microflmdico formado por dos membranas paralelas, ambas membranas pueden ser taladradas simultaneamente por un unico haz para formar dos poros concentricos, aunque tambien es posible utilizar haces diferentes a cada lado de las membranas en concierto con cualquier tecnica de alineamiento adecuada. En terminos generales, el alojamiento asegura la separacion sellada de las camaras A-C. En un aspecto, el alojamiento proporciona una resistencia de acceso minima entre los electrodos de voltaje (dos fuentes y una tierra) y los nanoporos, para asegurar que cada voltaje se aplica principalmente a traves de cada poro.

En un aspecto, FIG. 2 muestra una vista externa de otra realizacion del dispositivo. En FIG. 2, el dispositivo contiene un chip microflmdico (denominado "chip de nucleo dual") formado por dos membranas paralelas conectadas por espaciadores. Cada membrana contiene un poro (no se muestra) que ha sido taladrado por un unico haz a traves del centro de la membrana. Ademas, el dispositivo preferiblemente tiene un alojamiento de Teflon® para el chip. El alojamiento asegura la separacion sellada de las camaras A-C y proporciona una resistencia de acceso minima para el electrolito para asegurar que cada voltaje se aplica principalmente a traves de cada poro.

De modo mas espedfico, las membranas que portan los poros puede fabricarse con rejillas TEM ("transmission electron microscopy", microscopfa de transmision de electrones) con ventanas de silicio de 5-100 nm de espesor, nitruro de silicio o dioxido de silicio. Pueden utilizarse espaciadores para separar la membrana, empleando un aislante (SU-8, fotorresistente, oxido de PECVD, oxido de ALD, alumina ALD) o un material de un metal evaporado (Ag, Au, Pt), y que ocupan un pequeno volumen dentro de la porcion, por lo demas acuosa, de la camara B entre las

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membranas. El dispositivo portador se asienta en un bano acuoso que comprende la fraccion volumetrica mayor de la camara B. Las camaras A y C son accesibles a traves de canales de diametro mayor (para una resistencia de acceso baja) que conducen a los sellos de la membrana.

Puede utilizarse un haz de electrones o de iones enfocado para taladrar los poros a traves de la membrana, alineandolos de modo natural. Los poros tambien puede ser esculpidos (encogidos) hasta un tamano menor aplicando un enfoque correcto del haz a cada capa. Tambien puede utilizarse cualquier metodo de taladrado de nanoporos individuales para taladrar el par de poros en las dos membranas, tomando en cuenta la profundidad de taladrado posible para un metodo concreto y el espesor de las membranas. Tambien es posible pretaladrar un microporo hasta una profundidad prescrita y despues un nanoporo a traves del resto de las membranas, para afinar aun mas los espesores de las membranas.

En otro aspecto, la insercion de nanoporos biologicos en nanoporos en estado solido para formar un poro tnbrido puede utilizarse en cualquiera o ambos nanoporos en el metodo de dos poros (Hall et al., Nat. Nanotech., 5(12):874- 877, 2010). El poro biologico puede aumentar la sensibilidad de las mediciones de la corriente ionica, y es util cuando se van a capturar y controlar solo polinucleotidos monocatenarios en el dispositivo de dos poros, por ejemplo, para la secuenciacion.

Control del movimiento de las moleculas con un dispositivo de dos poros

En virtud de los voltajes presentes en los poros del dispositivo, las moleculas cargadas pueden moverse a traves de los poros entre las camaras. La velocidad y la direccion del movimiento pueden controlarse mediante la magnitud y la direccion de los voltajes. Ademas, debido a cada uno de los dos voltajes puede ajustarse independientemente, el movimiento y la velocidad de una molecula cargada puede controlarse con precision en cada camara.

Por ejemplo, el dispositivo puede utilizarse para mezclar dos moleculas con carga positiva de una manera controlada. Para este fin, la primera molecula primero se carga en la camara superior y la segunda en la camara inferior. Un primer voltaje a traves del primer puerto puede inducir el movimiento de la primera molecula hacia la camara intermedia desde la camara inferior. De forma similar, un segundo voltaje, en la direccion opuesta al primer voltaje, puede inducir el movimiento de la segunda molecula hacia la camara intermedia desde la camara inferior. Debido a las direcciones opuestas de los voltajes, ambas moleculas se mantendran en la camara intermedia de forma que reaccionan entre sf. Ademas, ajustando las magnitudes relativas de los voltajes puede afinarse con precision la velocidad de influjo de cada una de las moleculas, lo cual conduce a una reaccion controlada.

Otro ejemplo se refiere a un polfmero cargado, tal como un polinucleotido, que tenga una longitud que sea mayor que la distancia combinada que incluye la profundidad de ambos poros mas la distancia entre los dos poros. Por ejemplo, un ADNbc de 1000 pb tiene una longitud de aproximadamente 340 nm y sena sustancialmente mas largo que los 40 nm que miden dos poros con una longitud de 10 nm separados por 20 nm. En una primera etapa, el polinucleotido se carga en la camara superior o en la inferior. En virtud de su carga negativa bajo condiciones fisiologicas (aproximadamente pH 7,4), el polinucleotido puede moverse a traves de un poro sobre el cual se aplica un voltaje. Por tanto, en una segunda etapa, se aplican dos voltajes en la misma direccion y con las mismas magnitudes o magnitudes similares, a los poros para inducir el movimiento del polinucleotido a traves de ambos poros secuencialmente.

Cuando el polinucleotido alcanza el segundo poro, uno o ambos voltajes pueden cambiarse. Puesto que el polinucleotido es mas largo que la distancia que cubren ambos poros, cuando el polinucleotido alcanza el segundo poro tambien se encuentra en el primer poro. Por tanto, un cambio rapido en la direccion del voltaje en el primer poro generara una fuerza que arrastre al polinucleotido alejandolo del segundo poro (ilustracion en FIG. 1(III)).

Si, en este punto, la magnitud de la fuerza inducida por el voltaje en el primer poro es menor que la de la fuerza inducida por el voltaje en el segundo poro, entonces el polinucleotido continuara atravesando ambos poros hacia el segundo poro, pero a una velocidad menor. A este respecto, se apreciara con facilidad que la velocidad y la direccion del movimiento del polinucleotido pueden ser contraladas por las direcciones y las magnitudes de ambos voltajes. Tal como se describira mas a fondo a continuacion, este control fino del movimiento tiene amplias aplicaciones.

Por consiguiente, en un aspecto, se proporciona un metodo para controlar el movimiento de un polfmero cargado a traves de un poro. El metodo supone (a) cargar una muestra que comprende un polfmero cargado en una de la camara superior, la camara intermedia o la camara inferior del dispositivo de cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que el dispositivo esta conectado a un suministro de energfa para proporcionar un primer voltaje entre la camara superior y la camara intermedia, y un segundo voltaje entre la camara intermedia y la camara inferior; (b) ajustar un primer voltaje inicial y un segundo voltaje inicial, de modo que el polfmero se mueva entre las camaras, situando con ello al polfmero a traves del primer y del segundo poro; y (c) ajustar el primer voltaje y el segundo voltaje de modo que ambos voltajes generen una fuerza para arrastrar al polfmero cargado de la camara intermedia (modo de competicion de voltaje), en el que los dos voltajes son diferentes en magnitud, bajo condiciones controladas, de modo que el polfmero cargado se mueva a traves de ambos poros en cualquier direccion y de una manera controlada.

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Para establecer el modo de competicion de voltaje en la etapa (c), debe determinate la fuerza relativa ejercida por cada voltaje en cada poro para cada dispositivo de dos poros utilizado, y esto puede realizarse con experimentos de calibracion observando la influencia de diferentes valores de voltaje sobre el movimiento del polinucleotido (el movimiento puede medirse detectando caractensticas de localizacion conocida y detectables en el polinucleotido, detallandose mas adelante en este documento provisional ejemplos de dichas caractensticas). Si las fuerzas son equivalentes en cada voltaje comun, por ejemplo, entonces si se emplea el mismo valor de voltaje en cada poro (con la polaridad comun en las camaras superior e inferior en relacion con la camara intermedia conectada a tierra) se crea un movimiento neto cero en ausencia de agitacion termica (la presencia e influencia del movimiento browniano se analiza a continuacion). Si las fuerzas no son equivalentes en cada voltaje comun, entonces para lograr el equilibrio de las fuerzas es necesario identificar y usar un voltaje mayor en el poro que tenga una fuerza mas debil en el voltaje comun. Es necesaria la calibracion para el modo de competicion de voltaje para cada dispositivo de dos poros, y sena necesaria para moleculas o polfmeros cargados espedficos en los que las caractensticas que pasan a traves de cada poro influyan en la fuerza.

En un aspecto, la muestra se carga en la camara superior y el primer voltaje inicial se ajusta para arrastrar al polfmero cargado de la camara superior hacia la camara intermedia, y el segundo voltaje inicial se ajusta para arrastrar al polfmero de la camara intermedia hacia la camara inferior. De forma similar, la muestra puede cargarse primero en la camara inferior.

En otro aspecto, la muestra se carga en la camara intermedia y el primer voltaje inicial se ajusta para arrastrar al polfmero cargado de la camara intermedia hacia la camara superior, y el segundo voltaje inicial se ajusta para arrastrar al polfmero cargado de la camara intermedia hacia la camara inferior.

En algunos aspectos, el polfmero cargado es un polinucleotido o un polipeptido. En un aspecto particular, el polfmero cargado es un polinucleotido. Los ejemplos no limitantes de polinucleotidos incluyen ADN bicatenario, ADN monocatenario, ARN bicatenario, ARN monocatenario, e tubridos de ADN-ARN.

En un aspecto, el primer voltaje y el segundo voltaje ajustados en la etapa (c) son de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 10.000 veces tan altos, en magnitud, como la diferencia entre los dos voltajes. Por ejemplo, los dos voltajes son de 90 mV y 100 mV, respectivamente. La magnitud de los voltajes (aproximadamente 100 mV) es aproximadamente 10 veces la diferencia entre ellos, 10 mV. En algunos aspectos, la magnitud de los voltajes es al menos aproximadamente 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces, 40 veces, 50 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 250 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 3000 veces, 4000 veces, 5000 veces, 6000 veces, 7000 veces, 8000 veces o 9000 veces tan alta como la diferencia entre ellos. En algunos aspectos, la magnitud de los voltajes no es mayor aproximadamente 10000 veces, 9000 veces, 8000 veces, 7000 veces, 6000 veces, 5000 veces, 4000 veces, 3000 veces, 2000 veces, 1000 veces, 500 veces, 400 veces, 300 veces, 200 veces, o 100 veces tan alta como la diferencia entre ellos.

En un aspecto, los ajustes a tiempo real o en lmea del primer voltaje y el segundo voltaje en la etapa (c) se realizan mediante un control activo o un control retroalimentado utilizando un hardware y un software especializado, a una frecuencia de base de hasta cientos de megahertzios. El control automatico del primer o segundo voltaje o ambos se basa en la retroalimentacion de las mediciones de primera o segunda corriente ionica o de ambas.

Analisis de las moleculas con un dispositivo de dos poros

El dispositivo de dos poros de la presente descripcion puede utilizarse para realizar analisis de moleculas o partfculas que se mueven o que son mantenidas dentro del dispositivo en virtud de los voltajes controlados aplicados en los poros. En un aspecto, el analisis se realiza en cualquiera o ambos poros. Cada sistema de pinzamiento de voltaje o de pinzamiento zonal de membrana mide la corriente ionica a traves de cada poro, y esta corriente medida se emplea para detectar la presencia de las moleculas o partfculas cargadas que estan pasando o cualquier caractenstica asociada con una molecula o partfcula cargada que este pasando.

Tal como se indico anteriormente, un polinucleotido puede cargarse en ambos poros mediante dos voltajes que tengan la misma direccion. En este ejemplo, despues de que la direccion del voltaje aplica en el primer poro se haya invertido y la nueva fuerza inducida por el voltaje sea ligeramente menor, en magnitud, que la fuerza inducida por el voltaje aplicada en el segundo poro, el polinucleotido continuara moviendose en la misma direccion, pero a una velocidad marcadamente inferior. A este respecto, el amplificador que suministra el voltaje a traves del segundo poro tambien mide la corriente que pasa a traves del segundo poro, y la corriente ionica entonces determina la identificacion de un nucleotido que este pasando a traves del poro, puesto que el paso de cada diferente nucleotido genera una senal de corriente diferente (por ejemplo, basada en los desplazamientos en la amplitud de la corriente ionica). Por consiguiente, la identificacion de cada nucleotido en el polinucleotido revela la secuencia del polinucleotido.

En algunos aspectos, el transporte controlado repetido para resecuenciar un polinucleotido mejora aun mas la calidad de la secuenciacion. Cada voltaje se alterna a una magnitud cada vez mayor para el transporte controlado en cada direccion. Tambien se contempla que las dos corrientes a traves de los dos poros puedan correlacionarse para mejorar la precision. Se contempla que el movimiento browniano pueda provocar fluctuaciones en el

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movimiento de una molecula, que afectan al transporte controlado de la molecula. Sin embargo, este efecto puede minimizarse o evitarse, por ejemplo, mediante el transporte controlado repetido durante la secuenciacion del ADN y promediando las mediciones de secuenciacion. Ademas, se contempla que el impacto del movimiento browniano sobre el movimiento controlado de moleculas grandes, tales como polinucleotidos y polipeptidos, sea insignificante, en particular cuando las fuerzas en competencia estan separando las moleculas grandes, lo cual genera tension dentro de la molecula.

Este metodo proporciona una solucion facil a problemas que no han sido resueltos en la tecnica anterior.

Por ejemplo, se sabe que existen dos obstaculos en competencia para lograr el transporte controlado y la deteccion precisa necesarios para la secuenciacion con nanoporos. Uno es que se necesita un voltaje relativamente alto, en el poro, para suministrar la suficiente sensibilidad de secuenciacion. Por otra parte, unos voltajes altos provocan que el polinucleotido atraviese con rapidez el poro, sin que haya tiempo suficiente para la identificacion de cada nucleotido.

De modo mas espedfico, la plataforma de secuenciacion con nanoporos requiere que la velocidad de paso del polinucleotido a traves del poro este controlada a 1 ms/nucleotido (nt) o mas lenta, y que al mismo tiempo se genere una corriente sensible a la secuencia. Esto requiere una senal frente al ruido lo suficientemente alta (es mejor un alto voltaje), pero un movimiento suficientemente lento de la molecula a traves del poro para asegurarse de que las mediciones esten dentro del ancho de banda de medicion (es mejor un voltaje bajo). En las aplicaciones de poros individuales, la velocidad del polinucleotido es proporcional al voltaje, de forma que un voltaje mayor es mejor para detectar, pero peor para reducir la velocidad del polinucleotido: las velocidades son de 1 ps/nt y mas rapidas (>1000 veces demasiado rapidas) en voltajes que estimulan la captura del polinucleotido. Por otra parte, unos voltajes menores reducen la actuacion de deteccion, y tambien aumentan la contribucion relativa de las fluctuaciones en velocidad provocadas por el movimiento browniano que socavan la precision de la lectura.

Ademas de los descritos en la presente, en la actualidad no existen metodos para intentar solucionar estos obstaculos que no impliquen el uso de enzimas o instrumentos opticos, que solo sirven para las tecnicas de nanoporos especializadas.

Se han propuesto varias estrategias para intentar solucionar el problema asociado con la falta de capacidad de deteccion y con voltajes bajos. Una es construir nanoporos biologicos para mejorar su sensibilidad. Otra es emplear membranas de grafeno que, como una lamina individual, son mas delgadas que la distancia entre los nucleotidos en el ADNmc. Otra es el uso de una corriente auxiliar medida muy cerca del nanoporo (por ejemplo, corrientes tuneladoras).

Se han ensayado los nanoporos biologicos en la primera estrategia. El nanoporo de a-hemolisina es el poro biologico que se emplea con mas frecuencia en investigacion. Los estudios han demostrado que la a-hemolisina puede resolver sustituciones de nucleotidos individuales en homopolfmeros y restos abasicos (1',2'-didesoxi) dentro de ADN que, por lo demas, estan formados por nucleobases. Sin embargo, la sensibilidad de nucleotidos individuales no es posible en ADN heterodimericos con a-hemolisina de tipo salvaje ("wild-type", WT), ya que la corriente ionica se ve influida por aproximadamente 10 nucleotidos en el canal. Se ha empleado la modificacion de protemas de a-hemolisina para mejorar su sensibilidad para el analisis y la secuenciacion de ADN. Uno de estos poros mutantes emplea a-hemolisina con un adaptador molecular unido covalentemente (Clarke et al., Nat. Nanotech., 4(4):265-270, 2009) que es capaz de discriminar entre las cuatro moleculas de nucleosido 5'-monofosfato con alta precision. Sin embargo, este poro mutante no parece presentar sensibilidad para la secuenciacion de ADNmc heteromericos intactos que pasan a traves del poro.

Otro ejemplo de poro biologico es MspA, que tiene forma de embudo que enfoca la sensibilidad de la corriente ionica en el fondo del canal. Ademas, se puede conseguir la reduccion de la velocidad del ADN a traves de MspA y a- hemolisina empleando enzimas. Tal como se muestra en la figura 1 de Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:34953, 2012, la reduccion de la velocidad del ADN se logra con la enzima encaramada la nanoporo MspA. Sin embargo, esto provoca una duracion de la deteccion no determinista, lecturas repetidas inducidas por reversion de la trayectoria, e incapacidad para detectar regiones homopolimericas. El mecanismo de la translocacion de ADN mediada por la phi29 polimerasa ha sido desarrollado en Cherf et al., Nat. Biotech., 30(4):344-348, 2012) sobre la a- hemolisina y se ha aplicado en el nanoporo MspA mas sensible (Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-353, 2012). Las velocidades discontinuas de la translocacion catalizada por polimerizacion son de 2,5-40 nt/s, que cumplen con los requisitos para la reduccion de velocidad del ADN. Sin embargo, aunque las enzimas en los bioporos pueden reducir la velocidad de translocacion, no existe control sobre el tiempo de permanencia de cada nucleotido, lo cual dificulta el rastreo ciego de repeticiones y la diferenciacion de pausas largas en una lectura de nucleotidos individuales. En terminos de la sensibilidad, tal como se muestra en la figura 3 de Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-353, 2012, la lectura de un molde de ADN repetitivo puede lograrse con phi29 sobre MspA. La figura (3a) muestra un ejemplo de rastreo para un molde de ADN compuesto por trinucleotidos CAT repetidos, con la excepcion de un triplete CAG en mitad de la secuencia. El * representa "pasadores" detectados (mediante analisis humano) como transiciones repetidas entre dos niveles, que son intrrnsecos al metodo de control basado en enzimas e incurren en errores de lectura. La figura (3b) tambien muestra la idealizacion de (3a), estando los promedios de las corrientes alineados con la secuencia de ADN conocida y eliminando la disparidad de mediciones medidas mostradas en (3a). La idealizacion muestra un patron repetido de tres niveles interrumpido por la unica

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sustitucion dG. Cuatro niveles resultan afectados por la unica dG, estando las desviaciones mayores mas cerca de la sustitucion, lo cual sugiere que la corriente residual se ve principalmente afectada por aproximadamente 4 nucleotidos. El hecho de que la corriente ionica a traves de MspA se vea influenciada por aproximadamente 4 nucleotidos mas proximos a la abertura limitante anade una complejidad considerable a la identificacion de la secuencia. Aunque, de modo ideal, se podna construir un banco de amplitudes de corriente diferenciadas que cartograffe cada una de las 44 = 256 combinaciones, tal como se sugiere en la tecnica, este banco sena diffcil de lograr. La razon es que la identificacion de las transiciones de etapa en los registros de la corriente del canal requiere una proporcion de senal al ruido (SNR) de al menos 2 como lo metodos de semiamplitud (SNR > 1,5 para los metodos basados en Markov). Con un ruido RMS de 0,5 pA en los anchos de banda de registro, los desplazamientos de las amplitudes deben ser al menos 1 pA para conseguir la SNR requerida, lo cual produce niveles detectables de solo aproximadamente 40 dentro del intervalo de amplitud de 40 pA con MspA (o como maximo de 53 niveles a SNR 1,5). Ademas, se observaran menos de 40 niveles, puesto que el intervalo no se utilizara de modo uniforme, y aunque una posterior filtracion podna reducir el ruido para anadir discriminacion de amplitud, esto tambien dana como resultado dejar pasar una mayor cantidad de transiciones de movimiento de ADNmc mas rapidas que estan presentes.

En la actualidad, no existen nanoporos para los cuales una deteccion de la corriente ionica pueda proporcionar la sensibilidad de un nucleotido individual para la secuenciacion de acidos nucleicos. No obstante, las mejoras en la sensibilidad de los poros biologicos y los poros en estado solido (grafeno) son campos de investigacion activos que se estan desarrollando. Una cuestion es que la deteccion de la corriente ionica no permite el rastro directo del avance a traves de regiones homolimericas (repeticiones de bases), puesto que no existe una senal diferenciada por nucleotido del movimiento de ADNmc homopolimericos a traves del poro. Por ejemplo, las repeticiones del rastreo son fundamentales, puesto que se han implicado ciertas deleciones e inserciones de repeticiones de mononucleotidos espedficos (7, 9 nt) dentro del ADN mitocondrial humano en varios tipos de canceres (Sanchez- Cespedes, et al., Cancer Research, 61(19):7015-7019, 2001). Aunque las enzimas en los bioporos pueden reducir la velocidad de translocacion, no se puede controlar el tiempo de permanencia de cada nucleotido. Por otra parte, si se emplea una velocidad de transporte constante en el control de los dos poros se eliminan las pausas no deterministas y puede realizarse un calculo preciso de las longitudes de las repeticiones. Volver a leer la seccion repetida muchas veces tambien puede mejorar los errores de calculo e identificar los lfmites de error, y esto puede realizarse sin tener que invertir la qmmica de polimerizacion provocada por las enzimas.

Un estudio reciente ha demostrado que con un unico nanoporo no pueden lograrse unas velocidades reducidas simplemente reduciendo el voltaje (Lu et al., Biophysical Journal, 101(1):70-79, 2011). Por el contrario, a medida que se reduce el voltaje, las velocidades de un ADN monocatenario (ADNmc) se hacen mas aleatorias (incluyendo la reversion de la trayectoria), puesto que el movimiento browniano contribuye aun mas a las fluctuaciones en la velocidad. Este estudio tambien demuestra que es necesaria una fuerza de voltaje alta para eliminar las fluctuaciones en la velocidad inducidas por el movimiento browniano que podnan confundir las mediciones de secuenciacion, incluso cuando se emplea un detector idealizado de nanoporos sensible a un unico nucleotido.

El metodo de secuenciacion proporcionado en la presente descripcion, basado en un dispositivo de dos poros, proporciona una solucion facil a estos problemas y otras ventajas frente a los metodos existentes. En concierto con uno o dos poros que tengan la sensibilidad suficiente para la secuenciacion, a alto o bajo voltaje, el control de los dos poros resuelve el problema del control de la velocidad de secuenciacion de las aplicaciones de nanoporos individuales. Estos poros pueden incluir poros biologicos alojados en sustratos en estado solido, poros biologicos en membranas formadas a traves de sustratos en estado solido, o poros en estado solido (por ejemplo, en grafeno, silicio u otros sustratos). En un aspecto, puede utilizarse una enzima, tal como phi29, en un poro biologico, tal como MspA, en uno o ambos poros, con altos voltajes utilizados para generar senales grandes para la secuenciacion, y un voltaje diferencial bajo que genera una fuerza sobre cada enzima que es suficiente para mantener a la enzima en una posicion por encima de cada poro y permite el movimiento del ADN catalizado por polimerizacion, pero que no sea tan grande como para detener o disociar las enzimas. Esta configuracion puede mejorar los metodos en Cherf et al., Nat. Biotech., 30(4):344-348, 2012 y Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-353, 2012, intensificando significativamente la senal de medicion y permitiendo que los dos poros lean una hebra de ADN al mismo tiempo.

Ademas, el metodo de la presente descripcion puede generar un voltaje suficientemente alto en el poro para asegurar la sensibilidad de deteccion en el poro utilizando la deteccion de la corriente ionica. Resulta plausible que un voltaje alto suprima el movimiento browniano hasta un punto suficiente para asegurar una velocidad constante a traves de cada poro, y que la configuracion del ADN fuera de cada poro afecte a la energetica del movimiento del ADN en cualquier direccion. Ademas, la competicion de voltaje empleada en el metodo (FIG. 1(III)) puede afinarse con precision, de modo que la molecula permanezca un tiempo suficiente en el poro para permitir el analisis de la molecula. Ademas, el presente metodo no necesita enzimas, instrumentos opticos o uniones al ADN. Por tanto, el metodo proporciona corrientes de deteccion de alta proporcion de senal al ruido a traves del nanoporo, al mismo tiempo que regula la velocidad de transporte de la molecula, una capacidad que no es posible con aplicaciones de un unico nanoporo.

El metodo puede utilizarse para identificar una composicion de monomeros en un polfmero cargado. En un aspecto, la unidad monomerica es un nucleotido cuando el polfmero es un ADN o ARN monocatenario. En otro aspecto, la unidad monomerica puede ser una pareja de nucleotidos, cuando el polfmero es bicatenario.

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En un aspecto, el metodo puede utilizarse para identificar una modificacion en el poUmero, tal como una molecula unida a un monomero, en particular cuando la molecula unida esta cargada. Sin embargo, no es necesario que la molecula unida este cargada, puesto que incluso una molecula neutra puede cambiar la corriente ionica en virtud de su tamano.

En otro aspecto, la modificacion comprende la union de una molecula al polfmero. Por ejemplo, para una molecula de ADN, la molecula unida puede ser una protema de union al ADN, tal como RecA, NF-kB y p53. En otro aspecto, la modificacion es una partfcula que se une a un monomero o fragmento concreto. Por ejemplo, el dispositivo puede detectar puntos cuanticos o marcadores fluorescentes unidos a un sitio del ADN concreto para la genotipificacion o el cartografiado del ADN. Por consiguiente, el dispositivo de la presente descripcion proporciona tambien una forma barata de genotipificacion y cartografiado del ADN, sin limitacion.

En un aspecto, el polfmero esta unido a un soporte solido, tal como una esfera, en un extremo del polfmero.

Tambien se proporciona, en una realizacion, un metodo para determinar la secuencia de un polinucleotido, que comprende: (a) cargar una muestra que comprende un polinucleotido en la camara superior del dispositivo de cualquiera de las anteriores realizaciones, en el que el dispositivo esta conectado a un suministro de energfa para proporcionar un primer voltaje entre la camara superior y la camara intermedia, y un segundo voltaje entre la camara intermedia y la camara inferior, en el que el polinucleotido esta unido opcionalmente a un soporte solido en un extremo del polinucleotido; (b) ajustar un primer voltaje inicial y un segundo voltaje inicial de modo que el polinucleotido se mueve desde la camara superior hacia la camara intermedia y desde la camara intermedia hacia la camara inferior, situando con ello al polfmero a traves de ambos primer y segundo poro; (c) ajustar el primer voltaje y el segundo voltaje de modo que ambos voltajes generen una fuerza para arrastrar al polinucleotido de la camara intermedia, en el que los dos voltajes son diferentes en magnitud, bajo condiciones controladas, de modo que el polinucleotido se mueve a traves de ambos poros en una direccion y de una manera controlada. y (d) identificar cada nucleotido del polinucleotido que pasa a traves de uno de los poros, mediante la medicion de una corriente ionica a traves del poro cuando el nucleotido pasa a traves de ese poro.

Ejemplos

La presente tecnologfa se define con mas detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Para los expertos en la tecnica sera evidente que pueden realizarse muchas modificaciones, en la ejecucion y los metodos, sin apartarse del alcance de la presente invencion.

Ejemplo 1: Captura y control de moleculas de ADNbc individuals en los poros

Este ejemplo demuestra que la captura de ADN hacia el interior de cada poro en un dispositivo de dos poros puede detectarse con facilidad como un desplazamiento en la corriente ionica de cada poro independiente medida.

Este ejemplo demuestra la captura con poro dual empleando ADNbc con y sin una esfera unida a un extremo. Tambien pueden estudiarse experimentos con ADNmc unido a esferas.

Tras la captura y el alojamiento del ADN, el voltaje del poro mas cercano a la esfera (V1, FIG. 1(I) en el caso de la captura en la camara A) puede invertirse y aumentarse hasta que la fuerza competidora sobre el ADN le arrastre de nuevo hacia la camara A. La corriente ionica en cualquiera de los poros puede detectar con facilidad la captura y la salida del ADN durante el experimento.

Cuando se emplea una esfera, la esfera tendra un tamano apropiado que evite que la esfera pase a traves de cualquiera o de ambos poros. En la tecnica se han desarrollado metodos para asegurar una proporcion de esfera- ADN de 1 a 1. Por ejemplo, puntos cuanticos revestidos con estreptavidina monovalentes (QD; QD655, Invitrogen) conjugados con duplex de aDn biotinilado (o ADNmc) pueden proporcionar esferas con un intervalo de diametro de 20-30 nm, y se pueden proporcionar esferas mas grandes (30-100 nm) utilizando partfculas de oro o latex. Puede considerarse la influencia de la esfera sobre la hidrodinamica y la carga, puesto que se relaciona con la velocidad de captura, durante el diseno de los experimentos.

Sin las esferas, el ADNbc pasa a traves de un poro a aproximadamente 0,1 ms/kpb. Pueden utilizarse ADN con longitudes de 500 pb y 4 kpb, y moleculas de ADNbc del fago A (aproximadamente 48 kpb). Las muestras de ADN pueden transportarse desde la camara A hacia el interior de ambos poros utilizando una polaridad de voltaje comun para cada poro para estimular la captura desde la camara A y el paso a traves de la camara B hacia la camara C (FIG. 1(I)). La gran longitud de persistencia del ADNbc (un Kuhn de longitud es 100 nm) asegura que el segmento de ADN dentro de cada poro probablemente este totalmente extendido y con forma de varilla. El voltaje y la concentracion ionica pueden variar para identificar las velocidades de captura adecuadas. Tambien pueden utilizarse diferentes concentraciones ionicas tamponadas en cada camara para potenciar o alterar las velocidades de captura y los valores de desplazamiento de la conductancia que registran la presencia de ADN en cada poro.

Empleando unos diametros de nanoporos de 10 nm y mayores se minimiza la interaccion (por ejemplo, friccion y pegado) entre el ADNbc y las paredes del nanoporo. Para poros mas grandes, aunque el ADNbc puede capturarse en una configuracion no plegada y plegada, la configuracion de una sola fila (desplegada) resulta mas probable a

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voltajes mayores y con ADNbc mas cortos (< 3 kpb). Para una distancia entre poros de 500 nm o menor, se contempla que la probabilidad de una captura de poro dual, despues de la captura en el primer poro (entre las camaras A y B) sea muy alta, para voltajes de al menos 200 mV en KCl 1 M.

Se ha calculado que la distancia radial dentro de la cual la influencia del voltaje domina la difusion termica y conduce a la captura con mayor probabilidad es de al menos 900 nm (mayor que la distancia entre poros) para una gama de tamanos de poro (diametro de 6-15 nm), voltajes (120-500 mV), y con ADNbc con una longitud de al menos 4 kpb (Gershow y Golovchenko, Nature Nanotechnology, 2:775-779, 2007). Estos descubrimientos apoyan la nocion de que la captura con poro dual rapida de ADNbc, despues de la captura en un unico poro (primera) del ADNbc, tenga una alta probabilidad.

La captura y el control del ADN a traves de los dos poros puede mejorar con algoritmos a tiempo real y hardware de control activo. Los inventores han desarrollado un hardware/software de control activo para el control del ADN. Vease, por ejemplo, Gyarfas et al., Biophys. J., 100:1509-1516, 2011); Wilson et al., aCs Nano., 3(4):995-1003, 2009; y Benner et al., Nat. Nanotech., 2(11):718-724, 2007. Un software util es el software LabVIEW (version 8, National Instruments, Austin, TX), aplicado en un sistema FPGA (matriz de lfmite programable por campo) (PCI-7831 R, National Instruments)). El FPGA mencionado puede controlar hasta 4 amplificadores simultaneamente. Ademas, el sistema de adquisicion de datos Axon Digidata 1440A Data Acquisition System empleado para digitalizar y cargar datos a un PC tiene 16 canales de entrada, que son suficientes para registrar el voltaje y la corriente de hasta 8 amplificadores en paralelo. Otros sistemas que funcionen a tiempo real en concierto con un hardware/software para la medicion y el control a tiempo real tambien pueden utilizarse para controlar los amplificadores y para digitalizar y cargar los datos.

Los inventores tambien han desarrollado un amplificador de pinzamiento de voltaje de ruido bajo denominado "Nanoclamp," (Kim et al., IEEE Trans. On Biom. Circ. And Syst., en impresion, mayo de 2012; Kim et al., Elec. Lette., 47(15):844-846, julio de 2011; y Kim et al., Proceedings of the IEEE International SoC Design Conference (ISOCC), noviembre de 2010) para funcionalizar y optimizar el uso de uno o mas nanoporos en dispositivos de huella pequena y multiples canales. Puede utilizarse cualquier otro amplificador de pinzamiento de voltaje o de pinzamiento zonal de membrana de mesa, o un amplificador de pinzamiento de voltaje o de pinzamiento zonal de membrana integrado para el control y la medicion de los dos poros.

Para una diversidad de materiales y diametros de poro en estado solido, 0,1-10 kpb tarda aproximadamente 1 ms en translocar. Con un amplificador controlado con FPGA se puede detectar la captura e iniciar el control del voltaje competidor dentro de 0,020 ms, mucho mas rapido que 1 ms de tiempo de paso total de ADN de 1 kpb; asf, tambien es muy probable que el metodo de control se active antes de que el ADN escape (sin union a una esfera). Como demostracion del control, el tiempo hasta la salida de la molecula de los poros y su direccion puede demostrarse como una funcion de la magnitud y la diferencia entre los voltajes competidores (FIG. 1(III)). En los experimentos con un unico poro, se observan experimentalmente grandes fluctuaciones en la velocidad de ADNbc largos (> 1kpb) a traves del poro, y estas fluctuaciones son demasiado grandes como para ser atribuidas al movimiento browniano. En Lu, et al., Biophysical Journal, 101(1):70-79, 2011, se establecio el modelo de que la fuente dominante de fluctuaciones de la velocidad netas (es decir, la longitud del ADN dividido entre el tiempo de paso total) es debida al arrastre viscoso inducido por las porciones afectadas por el voltaje del ADN que aun no estan en el poro, ademas de la porcion en el poro, en donde se extiende la region de atraccion del voltaje. El modelo se corresponde con los datos experimentales bastante bien. De forma notable, si el centro de la masa del ADNbc es colineal con el poro en la captura, la velocidad neta es mayor, pero si no esta alineado con el poro, la velocidad neta es mas lenta. Cuando se acoplan voltajes competidores en el dispositivo de dos poros, las velocidades del ADNbc no se veran afectadas por la perturbacion inducida por el arrastre viscoso, a menos que la diferencia de voltaje sea suficientemente alta. La razon es que, despues de la captura del ADNbc a traves de ambos poros y de haber acoplado el voltaje competidor, el ADNbc entre los poros estara totalmente extendido y en forma de varilla, y por tanto no puede implicarse en la creacion de estructuras cerca de ninguna de las entradas al interior del poro. Por otra parte, las estructuras de ADNbc en los lados exteriores de los poros estan siendo constantemente empujadas por cada voltaje del poro local alejandolas del canal intermedio, y asf es menos probable que confundan la cinetica de entrada al poro. Esta estructura puede afectar a la cinetica de transporte controlado y pueden utilizarse experimentos de calibracion para cuantificarlo.

Es probable que la incertidumbre de la fuerza inducida por el movimiento del ADN transversal aleatorio sea minima. Ademas, la fuerza del voltaje provoca un flujo electroosmotico (EOF) en la direccion opuesta al movimiento del ADN, lo cual provoca que el ADN se mueva mas lentamente de lo que debena en ausencia del flujo contraionico inducido. Puesto que las diferentes posiciones radiales de la molecula pueden producir diferentes campos EOF en el nanoporo, una cuestion sena si la densidad de carga eficaz y, por tanto, la fuerza conductora neta vana durante las fluctuaciones en la posicion radial del ADN para inducir fluctuaciones en la velocidad. Se cree que la densidad de carga eficaz del ADN en KCl 1 M es estable para una distancia de 1 nm o mas entre la pared del poro y el ADN.

Ademas, los nanoporos de SiN tienen una carga de superficie negativa que intrmsecamente repele al ADN. Asf, aunque la molecula sufra fluctuaciones en la posicion radial, utilizando poros SiN con un diametro mayor que unos pocos nanometros es posible que cada valor de voltaje constante produzca una fuerza eficaz constante en cada uno de los poros y, asf, una velocidad constante en la direccion de la fuerza mayor cuando se emplean dos voltajes

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competidores en el sistema de dos poros. El tratamiento de otras superficies de materiales de poros puede producir unos efectos comparables a los de SiN.

La incertidumbre de la velocidad inducida por el movimiento del ADN traduccional aleatorio que es provocado por el movimiento browniano puede reducirse aumentando los voltajes competidores. Pueden realizarse experimented para determinar si dicha reduccion ocurrira. Un estudio con un unico nanoporo (Lu, et al., Biophysical Journal, 101(1):70-79, 2011) apoya la idea de que si se aumentan las fuerzas competidoras se puede reducir la incertidumbre provocada por el movimiento browniano. El estudio analiza las fluctuaciones en la velocidad provocadas por el movimiento browniano, que aparecen en escales de tiempo rapidas (nanosegundos), y los errores de secuenciacion que surgen de dichas fluctuaciones. Suponiendo la existencia de un detector de nucleotidos individuales hipotetico e ideal (deteccion sin ruido en un ancho de banda > 22 MHz), el movimiento browniano por sf solo produce un error de lectura del 75%. El parametro pertinente para predecir el error es kBT/F*(0,34 nm), que es la proporcion de energfa termica al trabajo realizado para translocar el ADN la distancia a entre nucleotidos (0,34 nm). En esta proporcion, la fuerza F = VA es el voltaje V que conduce al ADN con una densidad de carga (0,2 e"/pb para ADNbc). Para el presente metodo de control, un aumento en el voltaje de 50X produce un error de lectura del 5%, y un voltaje mayor aumenta aun mas los errores. Sin embargo, con un unico poro, puesto que el promedio de la velocidad v es F*d/(kBT) con una constante de difusion d, la velocidad del ADN tambien aumenta con F, exigiendo unas demandas aun menos realistas con respecto al ancho de banda de la secuenciacion.

Para mantener el ancho de banda de 22 MHz, un aumento del 50X en la fuerza con un unico nanoporo debe corresponderse con un aumento en 50X en la viscosidad de la disolucion para mantener la misma v. Sin embargo, en la practica, un ancho de banda de 22 MHz ya es mucho mayor que el mostrado, o que promete mostrarse, en cualquier plataforma de nanoporos experimental para la secuenciacion de nucleotidos individuales. Ademas, si se aumenta la viscosidad se puede frenar al ADN solo hasta 10X (Fologea, et al., Nano Lett., 5(9):1734-1737, 2005) con nanoporos individuales. Con el uso de una plataforma de dos poros, cada voltaje puede mantenerse lo suficientemente alto, y esto puede suprimir las fluctuaciones provocadas por el movimiento browniano, mientras que el voltaje diferencial que determina la velocidad neta del aDn puede ajustarse para asegurar una velocidades de control que esten dentro de los anchos de banda de secuenciacion reales (nominalmente 1 kHz). Un metodo alternativo para suprimir las fluctuaciones en la velocidad inducidas por el movimiento browniano es emplear un control retroalimentado. En un aspecto, con un ancho de banda de 10 kHz de la retroalimentacion de corriente del segundo poro a la actuacion del voltaje del primer poro a un ancho de banda de 10 kHz puede compensarse el movimiento browniano para controlar que las caractensticas detectables del ADN permanezcan dentro y cerca del segundo poro en estos kHz de anchos de banda de bucle cerrado. Esta capacidad es un analogo unidimensional de la trampa electrocinetica antibrowniana (ABEL) que suprime el movimiento browniano en dos dimensiones espaciales y actua mediante un empuje optico de las esferas unidas a moleculas en Hz de anchos de banda de bucle cerrado (Wang y Moerner, AcS Nano, 5:5792-5799, 2011).

Ejemplo 2: Deteccion y localizacion de filamentos de RecA unidos a ADN

Este ejemplo demuestra que el dispositivo de dos poros puede utilizarse para cartografiar la union de un ADNbc a una protema de union al ADN, y para protemas que tienen o que no se unen a secuencias espedficas.

Tal como se demostro en el ejemplo 1, las muestras de ADN pueden capturarse desde la camara A. La protema RecA cataliza un reaccion de intercambio de hebra de ADN dependiente de ATP que aparea el ADN roto con regiones complementarias de ADN intacto. Utilizando un analogo de ATP poco hidrolizable, ATP yS, los filamentos de RecA unidos a ADNbc son muy estables en condiciones de alta salinidad (por ejemplo KCl 1 M) cuando se ensamblan primero en concentracion salina fisiologica. Como alternativa a ATPyS, que se hidroliza lentamente, este ejemplo tambien puede utilizar ADP-AIF4 (tetrafluoruro de aluminio), que no sufre recambio en absoluto y hace que RecA se una con mas fuerza al ADN.

Se ha demostrado la deteccion de filamentos de RecA unidos a ADN-A a traves de nanoporos de 20-30 nm (Kowalczyk et al., Nano Lett., 10(1):324-328, 2010; Smeets et al., Nano Lett., 9(9):3089-3095, 2009; y Hall et al. Nano Lett., 9(12):4441-4445, 2009], pero los filamentos <20 pb (6 o menos protemas RecA) de longitud no pueden resolverse utilizando un unico nanoporo, debido al acoplamiento entre la velocidad de translocacion y la SNR de medicion.

Los experimentos iniciales de este ejemplo emplean un ADN-A unido y no unido a esferas que se ha expuesto a concentraciones variables de RecA, para generar un ADN que esta casi no revestido, esta parcialmente revestido y esta totalmente revestido. Puede utilizarse el control a tiempo real de la corriente de cada poro para calibrar el avance del transporte controlado, y se correlacionara para el cartografiado de localizacion de los filamentos. Unas mediciones repetidas de cada ADN mejoraran la precision del cartografiado de RecA.

La carga y masa anadida, y la estabilidad en alto contenido salido, cuando RecA esta unida al ADN, hace que sea un candidato ideal para intentar la deteccion y el cartografiado de localizacion durante el transporte controlado con el instrumento propuesto.

Tambien puede intentarse el control del ADN unido a RecA sin una esfera unida para detener la translocacion. Al

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igual que en los experimented de ADNbc del ejemplo 1, puede utilizarse el control del voltaje activo para iniciar rapidamente el control del voltaje competidor antes de que el ADN salga de los nanoporos. Puesto que las especies cargadas que se unen al ADN afectan a la movilidad del ADN en un campo electrico, si se altera la carga neta y la rigidez del ADN, unos experimented de afinacion del control del movimiento podnan estudiar la influencia de la union de RecA a ADNbc sobre el equilibrio de fuerzas utilizado para controlar el movimiento del ADNbc.

Este ejemplo puede demostrar que pueden medirse las longitudes mas cortas de filamentos observados, a bajas concentraciones de RecA, a una SNR alta y a unas velocidades controladas y suficientemente lentas, de modo que cualquier protema RecA unida en aislamiento puede detectarse si estuviese presente.

Por tanto, el dispositivo de dos poros proporciona un instrumento de una unica molecula completamente nuevo para la investigacion basica, puesto que se puede estudiar la capacidad de detectar la union de protemas adicionales al filamento de RecA-ADN, lo cual puede aumentar la anchura del filamento y asf puede detectarse mediante una disminucion en la corriente observada. Por ejemplo, las protemas que se unen al filamento de RecA-ADN incluyen represores del bacteriofago lambda y LexA, que emplean RecA para detectar el estado de la celula y activar o desactivar acontecimientos reguladores corriente abajo.

Los experimentos de calibracion implicanan detectar protemas que se unen a secuencias espedficas (localizaciones) sobre el ADN, de modo que los desplazamientos en la corriente inducidos por protemas podnan permitir el calculo de la velocidad y la actuacion del control de la velocidad del ADN a traves de los poros. Los ejemplos de protemas que se unen a sitios espedficos sobre ADNbc incluyen el represor Lac (que se une a un segmento de 21 pb), el represor del fago lambda (que tiene multiples sitios de operador sobre ADN-A), y otras protemas.

Ejemplo 3: Deteccion y localizacion de un segmento bicatenario dentro de un ADN monocatenario

Este ejemplo demuestra la produccion de hasta 10 kb de ADNmc con segmentos bicatenarios de longitud variable.

En una primera etapa, pueden crearse 10 kpb de ADNbc mediante PCR de largo alcance. Un extremo de la hebra se biotinila para la union a esferas, y las hebras se separan mediante desnaturalizacion qmmica. Se emplean 10 kb de ADNmc no unido a esferas como la hebra medida en los experimentos con dos poros. Pueden crearse segmentos monocatenarios complementarios con los tamanos deseados mediante PCR, seguido de la captura por las esferas y la separacion de las hebras.

Pueden utilizarse segmentos de ADNmc de diferentes longitudes y en multiples sitios dentro de los 10 kb de ADNmc medidos, comenzando con un conjunto de segmentos de 100 nt. Se emplea la corriente ionica a traves de un unico poro en estado solido para diferenciar el ADNbc de los homopolfmeros de ADNmc y los homopolfmeros de purina y pirimidina como en Skinner et al., Nano Lett., 9(8):2953-2960, enero de 2009). Asf, la probabilidad de diferenciar segmentos monocatenarios de los segmentos bicatenarios en el ADN es alta a un voltaje suficientemente alto empleando el dispositivo de dos poros. El cartografiado de los segmentos de ADNmc frente a ADNbc permite la secuenciacion con nanoporos empleando el metodo asistido por hibridacion (aunque este metodo, segun esta propuesto, se basa en un proceso asistido por hibridacion caro), y puede utilizarse para revelar la localizacion e identificar las secuencias de ADN diana a lo largo de distancias largas (secuenciacion dirigida). Tambien se puede estudiar el uso de protemas de union al ADN monocatenarias (SSB), como esferas que pueden amplificar aun mas las diferencias entre ADNmc frente a ADNbc en la corriente ionica mediante su union al ADNmc y la creacion de una mayor impedancia que el ADNbc.

Ejemplo 4: Captura y control de ADNmc largo y localizacion de RecA

Este ejemplo demuestra la captura y el control de un ADNmc largo y la deteccion y localizacion de un filamento de RecA unido al ADNmc. Ademas, demuestra que el dispositivo de dos poros puede detectar los segmentos homopolimericos de purina frente a pirimidina dentro del ADNmc.

El desenmaranamiento estocastico de 7 kb de ADNmc a traves un poro de 10 nm en una membrana SiN de 20 nm puede realizarse como se muestra en Stefan et al., Nano Lett., 10:1414-1420, 2010. Aunque el metodo de un unico nanoporo en Stefan et al., 2010, desenreda el ADNmc mediante una fuerza de contacto mecanica entre el ADNmc enmaranado y la superficie de la membrana/poro, se contempla que el sistema de voltaje competidor de poro dual pueda forzar electroforeticamente al ADNmc para que se desenmarane cerca de los poros y entre ellos a unos voltajes competidores suficientemente altos, mediante la accion de cada fuerza de voltaje sobre el esqueleto del ADN mas cercano a cada poro.

El desenmaranamiento y el posterior control de precision de la velocidad del ADNmc a traves del sistema de dos poros es importante para la secuenciacion final de moleculas de ADNmc largas. A un voltaje suficientemente alto (aproximadamente 400 mV), es posible discriminar entre los segmentos homopolimericos de purina y pirimidina dentro de un ADNmc (Skinner et al., Nano Lett., 9(8):2953-2960, enero de 2009), lo cual resulta valioso para aplicaciones de diagnostico y quiza para la investigacion del cancer.

Este ejemplo tambien estudia el uso de RecA, o quiza otras protemas de union a ADN monocatenario (SSB), como

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"bombas de velocidad" detectables que puede diferenciarse de la corriente ionica del ADNmc mediante la union al ADNmc y la creacion de una impedancia mayor. Estas bombas de velocidad permiten la cuantificacion directa de las velocidades del ADNmc controladas que sean posibles, lo cual, a su vez, demuestra que puede lograrse la velocidad de 1 ms/nt requerida. Puesto que no es necesario que RecA se una a sitios de secuencia trinucleotfdica espedficos, sino que se una preferentemente a las secuencias de TGG repetidas, y como tambien tiende a unirse cuando ya se han formado filamentos de RecA, los experimentos de calibracion requeriran el uso de otras moleculas de union al ADNmc que sf se unan a localizaciones de secuencia conocida espedficas. Es necesario contar con sitios de union conocidos que sean detectables a medida que pasan a traves de cada poro para poder determinar la velocidad de la molecula como una funcion de los valores de los voltajes competidores. Un ejemplo no limitante consiste en emplear hebras duplex (o hebras duplex unidas a esferas) que se hibridan con uno o mas sitios conocidos, en donde pueden utilizarse los desplazamientos en la corriente para detectar el paso de cada duplex a traves de cada poro, y despues calcular la velocidad de paso de la hebra para los valores de voltaje escogidos. Despues, los filamentos de RecA pueden formarse y detectarse sobre dichas moleculas, manteniendo la caractenstica o caractensticas del duplex como puntos de deteccion de referencia, con relacion a los cuales pueden detectarse los filamentos de RecA e inferirse su posicion.

Los metodos para determinar los haplotipos y el cartografiado de ADN mediante la incorporacion de marcadores fluorescentes en el ADNbc (Xiao, et al., patente de EEUU n.° 7771944 B2, 2010) tambien pueden utilizar el dispositivo de dos poros, puesto que los marcadores de las esferas (por ejemplo, puntos cuanticos o cualquier marcador fluorescente) son mas voluminosos y produciran desplazamientos en la corriente justo de la forma en que lo hanan las protemas de union sobre el ADNbc. Ademas, el metodo de dos poros es mas sencillo y mucho mas barato que la utilizacion de metodos de formacion de imagenes de alta resolucion (es decir, microscopfa de fluorescencia de reflexion interna total) para detectar y cartografiar las posiciones del marcador. Tambien se advierte que cualquier fluctuacion en la velocidad provocada por el movimiento browniano durante el transporte controlado es mucho menos perjudicial para detectar caractensticas mas grandes (protemas, segmentos de duplex, uniones a esferas) que para detectar caractensticas mas pequenas.

Debe entenderse que, aunque la invencion se ha descrito junto con las anteriores realizaciones, la anterior descripcion y los ejemplos pretenden ilustrar y no limitar el alcance de la invencion. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance de la invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica a la cual pertenece la invencion.

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   REIVINDICACIONES

   1. - Un dispositivo amplificador dual y de poro dual, para controlar simultaneamente el movimiento de un poUmero cargado a traves de un primer (111) y un segundo poro (112), que comprende una camara superior (camara A), una camara intermedia (camara B) y una camara inferior (camara C),

   en el que la camara superior esta en comunicacion con la camara intermedia a traves de un primer poro (111), y la camara intermedia esta en comunicacion con la camara inferior a traves de un segundo poro (112),

   en el que el dispositivo comprende un suministro de energfa configurado para proporcionar un primer voltaje entre la camara superior y la camara intermedia, y proporcionar un segundo voltaje entre la camara intermedia y la camara inferior, pudiendo ajustarse cada voltaje independientemente,

   en el que el dispositivo comprende componentes electronicos de amplificador dual (131, 132) configurados para el control del voltaje y la medicion de la corriente independientes en cada poro (111, 112), en el que los dos voltajes son diferentes en magnitud,

   en el que el primer y el segundo poro se configuran de modo que el polfmero cargado es capaz de moverse simultaneamente a traves de ambos poros (111, 112) en cualquier direccion y de una manera controlada, y

   en el que cada una de las camaras comprende un electrodo (121, 122, 123) conectado al suministro de energfa, que se caracteriza por que el primer poro (111) y el segundo poro (112) tienen un diametro de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, y estan separados entre sf por una distancia de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1000 nm.
2. 2. - El dispositivo de la reivindicacion 1, en el que el primer y el segundo poro (111, 112) son sustancialmente coaxiales.
3. 3. - El dispositivo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el dispositivo comprende un material seleccionado del grupo que consiste en silicio, nitruro de silicio, dioxido de silicio, grafeno, nanotubos de carbono, TiO2, HfO2, Al2O3, capas metalicas, vidrio, nanoporos biologicos, membranas con poros biologicos insertados y sus combinaciones.
4. 4. - El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho primer y dicho segundo voltaje se configura para que pueda ser pinzado independientemente por dichos componentes electronicos de amplificador dual (131, 132).
5. 5. - El dispositivo de la reivindicacion 4, en el que la camara intermedia esta conectada a una tierra comun con relacion a los dos voltajes.
6. 6. - El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la camara intermedia comprende un medio para proporcionar conductancia entre cada uno de los poros (111, 112) y el electrodo (122) en la camara intermedia.
7. 7. - El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polfmero cargado se extiende a traves de ambos primer y segundo poro (111, 112) al mismo tiempo.
8. 8. - El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el movimiento y la velocidad de movimiento del polfmero cargado puede controlarse mediante la magnitud relativa y la direccion de los voltajes.
9. 9. - El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer voltaje y el segundo voltaje son de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 10.000 veces tan altos, en magnitud, como la diferencia entre los dos voltajes.
10. 10. - El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que esta presente un diferencial de voltaje neto entre el primer y el segundo voltaje a traves de las camaras superior e inferior.
11. 11. - El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer poro (111) y el segundo poro (112) tienen una profundidad de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 100 nm.
12. 12. - Un metodo para controlar el movimiento de un polfmero cargado a traves de un poro, que comprende proporcionar el dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y realizar las siguientes etapas:

    (a) cargar una muestra que comprende un polfmero cargado en una de la camara superior, la camara intermedia o la camara inferior del dispositivo, en el que el dispositivo esta conectado a un sistema de pinzamiento de voltaje o un sistema de pinzamiento zonal de membrana para proporcionar un primer voltaje entre la camara superior y la camara intermedia, y un segundo voltaje entre la camara intermedia y la camara inferior;

    (b) ajustar un primer voltaje inicial y un segundo voltaje inicial, de modo que el polfmero se mueva entre las camaras,

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    situando con ello al poKmero a traves del primer y del segundo poro (111, 112); y

    (c) ajustar el primer voltaje y el segundo voltaje de modo que ambos voltajes generen una fuerza para arrastrar al polfmero cargado de la camara intermedia, en el que los dos voltajes son diferentes en magnitud, bajo condiciones controladas, de modo que el polfmero cargado se mueva a traves de ambos poros en una direccion y de una manera controlada.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, en el que la muestra se carga en la camara superior y el primer voltaje inicial se ajusta para arrastrar al polfmero cargado desde la camara superior hacia la camara intermedia, y el segundo voltaje inicial se ajusta para arrastrar al polfmero desde la camara intermedia hacia la camara inferior.
14. 14. El metodo de la reivindicacion 12, en el que la muestra se carga en la camara intermedia y el primer voltaje inicial se ajusta para arrastrar al polfmero cargado desde la camara intermedia hacia la camara superior, y el segundo voltaje inicial se ajusta para arrastrar al polfmero cargado desde la camara intermedia hacia la camara inferior.
15. 15. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el primer voltaje y el segundo voltaje ajustados en la etapa (c) son de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 10.000 veces tan grandes, en magnitud, como la diferencia entre los dos voltajes.
16. 16. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, que comprende ademas identificar una unidad monomerica del polfmero, mediante la medicion de una corriente ionica a traves de uno de los poros (111, 112) cuando la unidad monomerica pasa a traves de ese poro (111, 112).
17. 17. El metodo de la reivindicacion 16, en el que la unidad monomerica es un nucleotido o una pareja de nucleotidos.
18. 18. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que el monomero esta unido a una molecula.
19. 19. El metodo de la reivindicacion 18, en el que la molecula es una protema de union al ADN o una nanopartfcula.
20. 20. Un metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19 para determinar la secuencia de un polinucleotido, en el que la muestra se carga en la camara superior del dispositivo, y la muestra comprende un polinucleotido, y en el que el metodo comprende ademas identificar cada nucleotido del polinucleotido que pasa a traves de uno de los poros (111, 112), mediante la medicion de una corriente ionica a traves del poro (111, 112) cuando el nucleotido pasa a traves de ese poro (111, 112).