ES2565407T3 - Procedimiento para la preparación de un producto alimenticio para animales de compañía, el cual contiene microorganismos probióticos - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la preparación de una composición alimenticia para animales de compañía, la cual comprende microorganismos probióticos no replicantes, en una cantidad que va desde las 106 ufc, hasta las 1012 ufc, por servicio, comprendiendo, el citado procedimiento, el proceso de tratar los microorganismos probióticos en cuestión, mediante un tratamiento de alta temperatura / un corto transcurso de tiempo (HTST), a un temperatura de 120 °C - 140 °C, durante un transcurso de tiempo de 1 - 30 segundos, o a un tratamiento de una temperatura ultra alta (UHT), a un valor de temperatura, la cual exceda de un valor de 135 °C, durante un transcurso de tiempo de 1 - 10 segundos, y convirtiendo así, de este modo, a un porcentaje de por lo menos un 90 % de los microorganismos, en microorganismos no replicantes.
Description
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Las composiciones (de una forma particular, productos alimenticios), pueden prepararse en una forma enlatada, o en forma húmeda, mediante la utilización de procedimientos convencionales de la elaboración de productos alimenticios para animales de compañía o domésticos. Los tejidos proteináceos de procedencia animal, molidos, (tales como, por ejemplo, procedentes de mamíferos, de animales de aves de corral, de pescado y / o de alimentos marinos – mariscos -), pueden mezclarse con los otros ingredientes, incluyendo a los aceites de pescado, los granos de los cereales, otros ingredientes para el equilibrio nutricional, aditivos para propósitos especiales (tales como, por ejemplo, los consistentes en mezclas de vitaminas y de minerales, sales inorgánicas, celulosa, pulpa de remolacha, agentes o cargas de relleno, y por el estilo). Puede también añadirse, así mismo, agua suficiente para realizar el procesado. Los ingredientes en forma húmeda, de una forma típica, se mezclan en un recipiente apropiado para realizar un proceso de calentamiento, al mismo tiempo que se mezclan los componentes. El calentamiento de la mezcla, puede llevarse a cabo mediante la utilización de cualquier medio apropiado, tal como el consistente en una inyección directa de vapor, o mediante la utilización de un recipiente equipado con un intercambiador de calor. A continuación de la adición del último ingrediente, la mezcla, se calienta a una temperatura correspondiente a un nivel comprendido dentro de unos márgenes que desde los 50 °F hasta los 212 °F. Las temperaturas correspondientes a un nivel el cual se encuentre fuera de estos márgenes, son en principio susceptibles de poderse aceptar, pero éstas podrían ser impracticables, desde el punto de vista comercial, sin el uso de otros auxiliares de procesado. Cuando se calienta a la temperatura apropiada, el material, se encontrará, de una forma típica, en la forma de un líquido espeso. El líquido espeso, se introduce en el interior de latas o tarros. A la lata o tarro, se le aplica una tapa de cobertura, y el recipiente de contención, se sella de una forma hermética. La lata o tarro sellado, se emplaza, a continuación, en un equipo convencional, el cual se encuentra diseñado para esterilizar los contenidos. La esterilización en cuestión, se lleva a cabo mediante el calentamiento a una temperaturas correspondientes a un valor superior a los 230 °F, durante un apropiado transcurso de tiempo, el cual dependerá de la temperatura la cual se haya utilizado y de la composición en cuestión.
Para los productos alimenticios húmedos, los microorganismos probióticos no replicantes, pueden incorporarse en el interior de la composición alimenticia húmeda, conjuntamente con un portador o soporte, tal como el consistente en una composición alcohólica (a saber, propilenglicol ó dipropilenglicol), una ciclodextrina, una maltodextrina, o un almidón. De una forma alternativa, los microorganismos probióticos no replicantes, pueden introducirse y mezclarse en los materiales secos, previamente a formar la composición alimenticia húmeda.
Los obsequios o premios, pueden prepararse mediante un procedimiento de extrusión, o de horneado u cocción, similares a los procedimientos los cuales se han descrito anteriormente, arriba, para los productos alimenticios secos. Pueden también utilizarse, así mismo, otros procedimientos, para bien ya sea aplicar la composición saborizante o aromatizante, a modo de recubrimiento, sobre el exterior de la formas existentes del obsequio o regalo, o bien a inyectarla al interior de la forma existente del obsequio o premio.
Los juguetes para animales, se preparan, de una forma típica, procediendo a recubrir cualquier juguete existente, con una composición saborizante o saborizante, la cual tenga los miroorganismos probióticos no replicantes, mezclados en ésta.
La cantidad de microorganismos probióticos no replicantes, en el procedimiento par la preparación de una composición alimenticia para animales de compañía o domésticos, corresponde a una cantidad comprendida dentro de unos márgenes que van desde 106 ufc hasta 1012 ufc, por servicio.
Obviamente, los microorganismos no replicantes, no forman colonias y, por consiguiente, este término debe entenderse como la cantidad de microorganismos no replicantes, los cuales se obtienen a partir de 104 ufc y 1012 ucf / g de bacterias replicantes. Esto incluye a los microorganismos los cuales se encuentran inactivados, los no viables, o muertos, o los cuales se encuentran presentes como fragmentos, tales como, como DNA, o paredes celulares, o compuestos citoplásmicos. En otras palabras, la cantidad de microorganismos la cual contiene la composición, se expresa en términos de capacidad de formación de colonias (ufc), de aquella cantidad de microorganismos, como si la totalidad de los microorganismos se encontrasen vivos, de una forma independiente en cuanto al hecho de si, éstos son, de hecho, no replicantes, tales como inactivados o muertos, fragmentados, o una mezcla de cualesquier de estos estados.
La composición de productos alimenticios para animales de compañía o domésticos, pueden también, comprender, así mismo, probióticos.
“Prebiótico” significa substancias alimenticias, las cuales fomentan el crecimiento de los probióticos en los intestinos. Éstos no se descomponen en el estómago y / o en el intestino superior ni se absorben en el tracto GI (tracto gastrointestinal) de la persona la cual los ingiere, sino que, éstos se fermentan mediante la microflora gastrointestinal y / mediante los probióticos. Los probióticos, de definen, por ejemplo, por parte de Glenn R. Gibson y Marcel B. Roberfroid, en Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics, -Modulación dietética de la microbiota colónica humana: Introducción del concepto de prebióticos -, J. Nutr. 1995 125: 1401 -1412.
Los prebióticos los cuales pueden utilizarse, de una forma particular, no se encuentran limitados, y éstos incluyen a todas la substancias las cuales fomentan el crecimiento de los probióticos en los intestinos. De una forma preferible, 8
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consistentes en el peso corporal y en el estado general de salud del animal, y del efecto de la matriz del producto alimenticio.
En las aplicaciones profilácticas, las composiciones, se administran, a un consumidor el cual sea susceptible de poder sufrir un trastorno o desorden, o de otro modo, el cual se encuentre en riesgo de sufrirlo, en una cantidad la cual sea suficiente como para por lo menos reducir parcialmente el riesgo de sufrir del desorden o trastorno en cuestión. Tal cantidad, se define como siendo “una dosis profiláctica efectiva”. De un nuevo, otra vez, las cantidades precisa, dependerán del número un gran número de factores, tales como los consistentes en el peso corporal y en el estado general de salud del animal, y del efecto de la matriz del producto alimenticio.
Aquéllas personas expertas en el arte especializado de la técnica, serán capaces de ajustar la dosis terapéuticamente efectiva y / o la dosis profilácticamente efectiva, de una forma apropiada.
De una forma general, la composición, puede contener microorganismos probióticos no replicantes, en una dosis terapéuticamente efectiva, y / o en una dosis profilácticamente efectiva.
Así, por ejemplo, la dosis terapéuticamente efectiva y / o la dosis profilácticamente efectiva, puede ser la correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes los cuales se encuentran situados entre los 0,005 mg – 1000 mg de microorganismos probióticos no replicantes, por dosis diaria.
Se da a conocer el hecho de que, los microorganismos no replicantes, pueden encontrarse presentes en una cantidad equivalente a una tasa comprendida dentro de unos márgenes los cuales van desde 104 ufc hasta las 109 ufc /g de composición en seco, e incluso de una forma más preferible, en una cantidad equivalente a una tasa comprendida dentro de unos márgenes situados entre 105 ufc y 109 ufc / g de composición en seco.
Los probióticos, pueden convertirse en no replicantes, mediante cualquier procedimiento el cual sea conocido en el arte especializado de la técnica.
Las tecnologías las cuales se encuentran hoy en día a disposición, para convertir las cepas probióticas en no replicantes son, de una forma usual, las consistentes en un tratamiento de calor, la irradiación γ, la luz UV, o bien el uso de agentes químicos (formalina, paraformaldehído).
En términos de cantidades numéricas, por ejemplo, los microorganismos no replicantes tratados las consistentes en “una alta temperatura durante un corto transcurso de tiempo”, pueden encontrarse presentes en la composición, en una cantidad correspondiente a una tasa comprendida dentro de unos márgenes situados entre 104 y 1012 equivalentes de ufc / g de composición en seco.
Sería preferible el hecho de utilizar una técnica para convertir los probióticos en no replicantes, el cual sea relativamente sencillo de aplicar, en unas circunstancias industriales, en la industria alimentaria.
La mayoría de los productos los cuales se encuentran hoy en día disponibles en el mercado, y que contienen probióticos, se tratan mediante calor, durante su proceso de producción. Sería así por lo tanto conveniente, el hecho de poder tener la capacidad de tratar los probióticos mediante calor, bien ya sea conjuntamente con el producto producido, o por lo menos, de una forma similar, mientras que, al mismo tiempo, se conserven o se mejoren sus propiedades beneficiosas, o que incluso ganen una nueva propiedad beneficiosa para el consumidor.
Sin embargo, no obstante, la inactivación de los microorganismos probióticos, mediante tratamientos por calor, se encuentra asociada, según la literatura especializada, de una forma general, con por lo menos una pérdida parcial de la actividad probiótica.
Los presentes inventores, han encontrado ahora, de una forma sorprendente, el hecho de que, la conversión de los microorganismos probióticos en no replicantes, tal como, por ejemplo, mediante un tratamiento de calor, no tiene como resultado una pérdida de los beneficios para la salud de lo probióticos en cuestión, sino que, muy al contrario, ello puede mejorar los beneficios existentes para la salud, e incuso generar nuevos beneficios para la salud.
Así, de este modo, se da a conocer una composición alimenticia para animales de compañía o domésticos, en donde los microorganismos probióticos no replicantes, se han convertido en no replicantes, mediante un tratamiento de calor.
Tal tipo de tratamiento por calor, puede llevarse a cabo a una temperatura correspondiente a un valor de por lo menos 71,5 °C, durante un transcurso de tiempo de por lo menos 1 segundo.
Los tratamientos por calor durante un prologado transcurso de tiempo, o los tratamiento por calor durante un corto transcurso de tiempo, son los que pueden utilizarse.
A escalas industriales, se prefieren, hoy en día, de una forma usual, los tratamientos de calor durante un corto transcurso de tiempo, tales como los consistentes en los tratamientos por calor del tipo UHT (de sus iniciales en
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, 14, 1192 -1203). Así, por ejemplo, este ensayo , ha mostrado el poder permitir la predicción de un efecto antiinflamatorio, de los candidatos probióticos, en modelos de ratón de la colitis intestinal (véase, a dicho efecto, el trabajo de Foligne, B., et al., 2007, World J. Gastroenterol., -Diario mundial de la gastroenterología –, 13: 236 -243). De una forma adicional, este ensayo, se utiliza, de una forma regular, como referencias de lectura, en ensayos clínicos, éste ha mostrado conducir a resultados los cuales son coherentes con las conclusiones clínicas (véase, a dicho efecto, el trabajo de Schultz et al., 2003, Journal of Dairy Research, -Diario de investigación de los lácteos -, 70, 165 -173; Taylor et al., 2006, en Clinical and Experimental Allergy, -Alergia clínica y experimental -, 36, 1227 1235).
Las enfermedades alérgicas, se han venido incrementando de una forma ininterrumpida, con respecto a las décadas pasadas, y estas se consideran, en la actualidad, por parte de la WHO (Organización Mundial de la Salud), como siendo enfermedades epidémicas. De una forma general, la alergia, se considera como siendo el resultado de un desequilibrio entre las respuestas de las células Th1 y TH2 del sistema inmune, y que conduce a una fuerte tendencia hacia la producción de los mediadores de la células Th2. Así, por lo tanto, la alergia, puede mitigarse, regularse a la baja, o prevenirse o evitarse, procediendo a restaurar una equilibrio apropiado entre los brazos Th1 y Th2 del sistema inmune. Esto implica la necesidad de reducir las respuestas celulares Th2, o de intensificar, por los menos de una forma transitoria, la respuestas celulares Th1. Éstas últimas, serían características de una respuesta potenciadora inmune, a menudo acompañada de, por ejemplo, unos altos niveles de IFN-γ , TNF-α, IL-12. (véase, a dicho efecto, los trabajos de Kekkonen et al., 2008, World Journal of Gastroenterology, -Diario mundial de la gastroenterología -, 14, 1192 -1203; y de Viljanen M. et al., 2005, Allergy, -Alergia -, 60, 494 -500).
La composición alimenticia para animales de compañía o domésticos, permite así, de este modo, el poder tratar o prevenir los trastornos los cuales se encuentran relacionados con una defensa inmune la cual se encuentre comprometida.
Así, por consiguiente, los trastornos ligados a una defensa inmune comprometida, los cuales pueden tratarse o prevenirse, no se encuentran particularmente limitados. 33
Así, por ejemplo, éstos pueden seleccionarse de entre el grupo consistente en las infecciones, de una forma particular, las infecciones víricas, las infecciones fúngicas y / o las infecciones por parásitos; las deficiencias de fagotitos; unos niveles bajos o graves de inmunodepresión, tales como aquéllos inducidos por estrés o por fármacos inmunodepresivos, la quimioterapia o de radioterapia; los estados naturales o sistemas inmunes menos inumunocompetentes, tales como aquéllos de los neonatos o recién nacidos; las alergias; y las combinaciones de entre éstos.
La composición alimenticia para animales de compañía o domésticos, permite así mismo, también, el mejorar o incrementar la respuesta inmune del animal, a las vacunas, de una forma particular, de las vacunas por vía oral.
Por lo menos un porcentaje del 90 % de los probióticos, son no replicantes, siendo dicho porcentaje de probióticos no replicantes, de una forma preferible, de por lo menos un 95 %, de una forma más preferible, de por lo menos un 98 %, de la forma mayormente preferible, de por lo menos un 99 %, de una forma ideal, de por lo menos un 99,9 % y, de la forma la más ideal, la totalidad de éstos son no replicantes.
Se da a conocer el hecho de que, la totalidad de los microorganismos, son no replicantes.
Así, por consiguiente, en la composición en concordancia con la presente invención, por lo menos un porcentaje del 90 % de los probióticos, pueden ser no replicantes, pudiendo ser dicho porcentaje de probióticos no replicantes, de una forma preferible, de por lo menos un 95 %, de una forma más preferible, de por lo menos un 98 %, de la forma mayormente preferible, de por lo menos un 99 %, de una forma ideal, de por lo menos un 99,9 % y, de la forma la más ideal, la totalidad de éstos podrán ser probióticos no replicantes.
Para los propósitos de la presente invención, pueden utilizarse todos los microorganismos probióticos.
Así, por ejemplo, los microorganismos probióticos, pueden seleccionarse de entre el grupo consistente en las bifidobacterias, los lactobacilos, las propionibacterias, ó las combinaciones de entre éstos, tales como, por ejemplo, los Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Escherichia coli y / o las mezclas de entre éstos.
La composición en concordancia con la presente invención, comprende, por ejemplo, microorganismos probióticos seleccionado de entre el grupo consistente en los Bifidobacterium longum NCC 3001 (ATCC BAA-999), Bifidobacterium longum NCC 2705 (CNCM I-2618), Bifidobacterium breve NCC 2950 (CNCM I-3865), Bifidobacterium lactis NCC 2818 (CNCM I-3446), Lactobacillus johnsonii La 1 (CNCM I-1225), Lactobacillus paracasei NCC 2461 (CNCM I-2116), Lactobacillus rhamnosus NCC 4007 (CGMCC 1.3274), Lactobacillus reuteri
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DSM17983, Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Streptococcus thermophilus NCC 2059 (CNCM I-4153), Lactobacillus casei NCC 1825 (ACA-DC 6002), Escherichia coli Nissle (DSM 6601), Lactobacillus bulgaricus NCC 15 (CNCM I1198), Lactococcus lactis NCC 2287 (CNCM I-4154), o las combinaciones de entre éstos.
La totalidad de estas cepas, o bien se depositaron según el Tratado de Budapest y / o bien éstas se encuentran comercialmente disponibles en el mercado.
Las cepas, se depositaron según el Tratado de Budapest, del siguiente modo:
Bifidobacterium longum NCC 3001: ATCC BAA-999 Bifidobacterium longum NCC 2705: CNCM I-2618 Bifidobacterium breve NCC 2950 CNCM I-3865 Bifidobacterium lactis NCC 2818: CNCM I-3446 Lactobacillus paracasei NCC 2461: CNCM I-2116 Lactobacillus rhamnosus NCC 4007: CGMCC 1.3724 Streptococcus themophilus NCC 2019: CNCM I-1422 Streptococcus themophilus NCC 2059: CNCM I-4153 Lactococcus lactis NCC 2287: CNCM I-4154 Lactobacillus casei NCC 4006: CNCM I-1518 Lactobacillus casei NCC 1825: ACA-DC 6002 Lactobacillus acidophilus NCC 3009: ATCC 700396 Lactobacillus bulgaricus NCC 15: CNCM I-1198 Lactobacillus johnsonii La1 CNCM I-1225 Lactobacillus reuteri DSM17983 DSM17983 Lactobacillus reuteri ATCC55730 ATCC55730 Escherichia coli Nissle 1917: DSM 6601
Las cepas denominadas como ATCC, se depositaron en el Depósito de Patentes de la ATCC, (ATCC Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, USA.
Las cepas denominadas como CNCM, se depositaron en la COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (COLECCIÓN NACIONAL DE CULTIVOS DE MICROORGANISMOS) (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, Francia
Las cepas denominadas como CGMCC, se depositaron en el organismo China General Microbiological Culture Collection Center, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, (Centro de Colección General de Cultivos Microbiológicos, Instituto de Microbiología, Academia China de las Ciencias), Zhongguancun, P.O.Box2714, Beijing 100080, China.
Las cepas denominadas como ACA-DC, se depositaron en el organismo Greek Coordinated Collections of Microorganisms, Dairy Laboratory, Department of Food Science and Technology, Agricultural University of Athens, -Colecciones Griegas Coordinadas Microorganismos, Laboratorio de lácteos, Departamento de la Ciencia y de la Técnica de los Alimentos, Universidad Agrícola de Atenas -, 75, Iera odos, Botanikos, Atenas, 118 55, Grecia.
Las cepas denominadas como DSM, se depositaron en la institución DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, -Colección Alemana de Microorganismos y Estructuras Celulares GmbH (DSMZ)-, Inhoffenstr. 7 B^, 38124 Braunschweig, ALEMANIA.
Aquellas personas expertas en el arte de la técnica especializada, entenderán el hecho consistente en que, éstos pueden combinar libremente todos los aspectos de la presente invención, los cuales se han descrito aquí, en este documento, sin salirse del ámbito de la presente invención, tal y como ésta se da a conocer.
Otras ventajas y características de la presente invención, resultarán evidente, a raíz de los ejemplos y de las figuras los cuales se facilitan abajo, a continuación.
Las figuras 1 A y B, muestran la mejora de los perfiles inmunes antiinflamatorios, tratados mediante procesos de “altas temperaturas durante un corto transcurso de tiempo”.
La figura 2, muestra cepas probióticas las cuales no son antiinflamatorias, las cuales se convierten en antiinflamatorias, a saber, que ésas exhiben unos pronunciados perfiles inmunes antiinflamatorios, in vitro, después de haberse tratado mediante procesos de “altas temperaturas durante un corto transcurso de tiempo”.
Las figuras 3 A y B, muestran cepas probióticas, las cuales se utilizan en productos los cuales se encuentran comercialmente disponibles en el mercado, y las cuales exhiben unos perfiles inmunes antiinflamatorios mejorados o nuevos, in vitro, después de haberse tratado mediante “altas temperaturas durante un corto transcurso de tiempo”.
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Las figuras 4 A y B, muestran cepas iniciadoras lácteas (a saber, cepas iniciadoras Lc1), las cuales exhiben unos perfiles inmunes antiinflamatorios, mejorados o nuevos, in vitro, después del tratamiento por calor a altas temperaturas.
La figura 5, muestra una cepa probiótica, no antiinflamatoria, la cual exhibe perfiles inmunes antiinflamatorios, in vitro, después de haberse tratado mediante tratamientos del tipo HTST.
La figura 6: Muestra el análisis principal de componentes en datos de PBMC (Células Mononucleares de la Sangre Periférica – [PBMC, de sus siglas en inglés correspondientes a Peripheral Blood Mononuclear Cells ] -) (IL-12p40, IFN-γ, TNF-α, IL-10) generados con probióticos y cepas iniciadoras lácteas, en sus formas vivas y tratadas por calor (a una temperatura de 140 °C, durante un transcurso de tiempo de 15 segundos). Cada uno de los puntos, representa una cepa, bien ya sea viva, o bien ya sea tratada mediante calor, identificada mediante su número de NCC, o mediante su nombre.
La figura 7, muestra las ratios o factores de relación correspondientes a los cocientes IL-12p40 / IL-10 de las cepas vivas y de las cepas tratadas por calor (85 °C, 20 minutos). El tratamiento por calor, a una temperatura de 85 °C, durante un transcurso de tiempo de 20 minutos, conduce, globalmente, a un incremento de las ratios o factores de relación correspondientes a los cocientes IL-12p40 / IL-10, de una forma opuesta a lo que ocurre mediante los tratamientos de “alta temperatura, durante un corto transcurso de tiempo” de la presente invención (Figuras 1, 2, 3, 4 y 5).
La figura 8, muestra la mejora de la secreción de citocinas, in vitro, a partir de las PBMCs (células mononucleares de la sangre periférica), estimuladas mediante bacterias tratadas por calor.
La figura 9, muestra el porcentaje de la intensidad de las diarreas, observado en ratones sensibilizados a la OVA (ovalbúmina), estimulados con solución salina (control negativo), en ratones sensibilizados a la OVA, estimulados con OVA (control positivo) y en ratones sensibilizados a la OVA, estimulados con OVA y Bifidobacterium breve NCC2950,tratado con calor, o vivo. Los resultados obtenidos, se muestran como los porcentajes de la intensidad de las diarreas (valor medio ± error estándar de la media (mean ± SEM – [SEM, de las siglas en inglés correspondientes a standard error of the mean] -) de 4 experimentos independientes), con un porcentaje correspondiente a un 100 % de la intensidad de las diarreas, correspondiente a los síntomas desarrollados en el grupo de control positivo (es decir, en el grupo correspondiente a los ratones sensibilizados y estimulados mediante el alérgeno).
Ejemplo 1:
Metodología
Preparaciones bacterianas
Los beneficios para la salud proporcionados por los probióticos vivos, en el sistema inmunitario del huésped, se consideran, de una forma general, como siendo específicos de la cepa. Los probióticos los cuales inducen unos altos niveles de IL-10 y / o los cuales inducen unos altos niveles de citocinas proinflamatorias, in vitro (ensayo de PBMC ), han mostrado ser potentes cepas antiinflamatorias, in vivo, (Foligné, B., et al., 2007, World J.Gastroenterol.
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Se procedió a utilizar diversas cepas de probióticos, para investigar las propiedades antiinflamatorias de los probióticos tratados mediante calor. Estas cepas eran las consistentes en Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), y Escherichia coli Nissle. Se procedió así mismo, también, a someter a test de ensayo, diversas cepas de cultivo iniciadoras, incluyendo a algunas cepas, las cuales se utilizan, comercialmente, para producir productos fermentados de Lc1, de Nestlé, consistentes en las cepas: Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus bulgaricus NCC 15 y Lactococcus lactis NCC 2287.
Se procedió a cultivar células bacterianas, en unas condiciones optimizadas para cada una de las cepas, en los biorreactores de 5 – 15 l. Para ello, son susceptibles de poderse utilizar cualesquiera medios de cultivo los cuales son típicos en el arte especializado de la técnica. Tales medios de cultivos, son conocidos, por parte de las personas expertas en el arte especializado de la técnica. Cuando se procedió a ajustar el valor pH, a un nivel de 5,5, se utilizó, para ello, un solución básica, al 30 % (bien ya sea a base de NaOH, o bien ya sea a base de Ca(OH)2), añadiéndola de una forma continua. Cuando fuere adecuado, se procedió a mantener unas condiciones anaeróbicas, mediante el gaseado del espacio de cabeza, con CO2. El E. coli, se cultivó bajo una condiciones aeróbicas estándar.
Las células bacterianas, se recolectaron mediante centrifugación (5. 000 x g, a una temperatura de 4 °C), y se volvieron a suspender en una solución salina de tampón fosfato (PBS), en unos volúmenes apropiados, con objeto de alcanzar una concentración final de aprox. 109 – 1010 ufc / ml. Una parte de la preparación, se congeló, a una
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Se procedió a aplicar los tratamientos del tipo UHT / HTST ó semejantes, a diversos lactobacilos, bifidobacterias y estreptococos, los cuales exhibían diferentes perfiles inmunológicos in vitro. Todas estas cepas, inducían citocinas menos pro-inflamatorias, después de los tratamientos del tipo UHT / HTST, que las correspondientes a sus homólogos (véanse, a dicho efecto, las figuras 1, 2, 3, 4, 5 ó 6), demostrándose, con ello, el hecho consistente en que, el efecto de los tratamientos del tipo UHT / HTST ó semejantes, sobre las propiedades inmunológicas de las bacterias no replicantes resultantes, pueden generalizarse para todos los probióticos, de una forma particular, para los lactobacilos y para las lactobacterias y para las cepas específicas de E. coli, y para todos los cultivos de iniciadores lácteos, de una forma particular, para los estreptococos, para los lactococos y para los lactobacilos.
Ejemplo 2 (ejemplo comparativo)
Metodología
Preparaciones bacterianas
Se procedió a utilizar cinco cepas de probióticos, con objeto de investigar las propiedades estimulantes inmunológicas de los probióticos no replicantes: 3 bifidobacterias (B. longum NCC3001, B. lactis NCC2818, B. breve NCC2950) y 2 lactobacilos (L. paracasei NCC2461, L. rhamnosus NCC4007).
Las células bacterianas, se hicieron crecer, cultivándolas en medio de cultivo MRS, mediante fermentación en lotes, a una temperatura de 37 °C, durante un transcurso de tiempo de 16 – 18 horas, sin ningún tipo de control del valor pH. Se procedió a centrifugar las células en cuestión (5. 000 x g, a una temperatura de 4 °C), y éstas se resuspendieron en tampón fosfato salino (solución salina tamponada), previamente a diluirse en agua salina, con objeto de alcanzar la concentración final, la cual era la correspondiente a 10 E 10 ufc / mol. Se procedió, a continuación, a someter a las cepas de B. longum NCC3001, B. lactis NCC2818, L. paracasei NCC2461, L. rhamnosus NCC4007) a un tratamiento por calor, correspondiente a una temperatura de 85 °C, durante un transcurso de tiempo de 20 minutos. La cepa de B. breve NCC295, se sometió a un tratamiento por calor, correspondiente a una temperatura de 90 °C, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, en un baño de agua. Se procedió a alicuotar (es decir, a dividir en alícuotos), las suspensiones bacterianas tratadas por calor, y éstas se conservaron, congeladas, a una temperatura de – 80 °C, en un tampón del tipo PBS – glicerina al 15 %, hasta su uso.
Establecimiento de los perfiles inmunológicos de las preparaciones bacterianas, in vitro:
Se procedió a evaluar los perfiles inmunológicos de las preparaciones bacterianas vivas, y tratadas mediante calor (a saber, la capacidad de dichas preparaciones para inducir la secreción de citocinas específicas, a partir de las células de sangre humana, in vitro). Se aislaron las células mononucleares de la sangre periférica, humana (PBMCs), a partir de filtros de sangre. Después de haber procedido a la separación, mediante el gradiente de la densidad de las células, las células mononucleares, se recolectaron y se lavaron dos veces, con solución salina de Hank, equilibrada. A continuación, se procedió a resuspender las células en Medio modificado de Dulbecco de Iscove (IMDM – [de sus siglas en inglés, correspondientes a Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium ] -, de la firma Sigma), suplementado con un 10 % de suero bovino (de ternera) fetal (de procedencia de la firma Bioconcept, París, Francia), un 1 % de L-glutamina (de la firma Sigma), un 1% de penicilina / estreptomicina (de la firma Sigma), y un 0,1 %, de gentamicina (de la firma Sigma). Se procedió, a continuación, a cultivar las células consistentes en las PBMCs (a razón de 7 x 105 células / pozo), con bacterias vivas, y tratadas mediante calor (equivalente a 7 x 106 ufc/ pozo), en placas de cultivo, de 48 pozos, durante un transcurso de tiempo de 36 horas. Se procedió, a continuación, a someter a test de ensayo, las bacterias vivas y tratadas mediante calor, en las PBMCs procedentes de 8 individuos donantes, divididas en dos experimentos por separado. Después de una incubación durante un transcurso de tiempo de 36 horas, se procedió a congelar las placas de cultivo, y éstas se mantuvieron, a una temperatura de – 20°C, hasta proceder a la medición de las citocinas. Se procedió, a continuación, a llevar a cabo, en paralelo, el establecimiento de los perfiles de la citocinas (a saber, en el mismo experimento, en el mismo lote de la PBMCs), para las bacterias vivas, y para sus homólogos tratados por calor.
Se procedió a determinar los niveles de las citocinas (IFN-γ, IL-12p40, TNF-α, e IL10), en los sobrenadantes de los cultivos celulares, después de una incubación de un transcurso de tiempo de 36 horas, mediante ensayos ELISA (kits de ensayo consistentes en los R&D DuoSet para la IL-10 humana, BD OptEIA para la IL12p40 humana, BD OptEIA para la TNF-α, BD OptEIA para la IFN-γ humana), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las IFN-γ, IL12p40, y TNF-α, son citocinas proinflamatorias, mientras que, la IL10, es un potente mediador antiinflamatorio. Los resultados obtenidos, se expresan como valores medios (pg / ml) ± error estándar de la media (mean ± SEM) de 4 donantes individuales, y éstos son representativos de dos experimentos individuales, llevados a cabo, cada uno de ellos, con 4 donantes.
Efecto in vivo del Bifidobacterium breve NCC2950, en la prevención de las diarreas alérgicas
Se procedió a utilizar un modelo de la diarrea alérgica del ratón, con objeto de someter a test de ensayo, el efecto estimulante de la Th1, de la cepa de Bifidobacterium breve NCC2950 (véase a dicho efecto, (Brandt E.B et al. JCI 2003; 112 (11): 1666 -1667). A continuación de haber procedido a la sensibilización (2 inyecciones intraperitoneales
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