ES2562463T3 - Administración no covalente, mediada por péptidos, de agentes activos a través de la barrera hematoencefálica - Google Patents

Administración no covalente, mediada por péptidos, de agentes activos a través de la barrera hematoencefálica Download PDF

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Abstract

Un péptido portador, que comprende la secuencia: Xn - [B]m o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: X es un aminoácido hidrófilo; B es un agente de barrera hematoencefálica; n es un número entero de 4 a 50; y m es un número entero de 1 a 3, en donde el agente de barrera hematoencefálica comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos una identidad de la secuencia de 80% con: L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 13).

Description

DESCRIPCION
Administracion no covalente, mediada por peptidos, de agentes activos a traves de la barrera hematoencefalica CAMPO TECNICO
Esta descripcion se refiere a peptidos portadores, incluyendo composiciones y metodos de uso de los mismos. En 5 particular, la descripcion se refiere a peptidos portadores capaces de suministrar agentes activos a traves de la barrera hematoencefalica y a composiciones y metodos de uso de los mismos.
ANTECEDENTES
La barrera hematoencefalica (BBB) impide que la mayona de las macromoleculas (p. ej., ADN, ARN y polipeptidos) y muchas moleculas pequenas penetren en el cerebro. La BBB se compone principalmente de celulas endoteliales 10 especializadas con uniones estrechas altamente restrictivas, por consiguiente el paso de sustancias, pequeno y grande, de la sangre al sistema nervioso central es controlado por la BBB. Esta estructura hace diffcil el tratamiento y la gestion de pacientes con enfermedades y trastornos neurologicos (p. ej., cancer de cerebro y la enfermedad de Alzheimer), ya que muchos agentes terapeuticos no pueden ser administrados a traves de la BBB con una eficiencia deseable.
15 MOUSAZADEH MOHAMMAD ET AL. JOURNAL OF DRUG TARGETING, vol. 15, n° 3, 2007, paginas 226-230, describe metodos de transportar material genetico a traves de la barrera hematoencefalica utilizando el receptor de LDL.
El documento US 2004/229219 A1 describe el uso de peptidos para inhibir la fusion de membranas y la infeccion por metapneumovirus humano y/o coronavirus humano en la prevencion y el tratamiento del smdrome respiratorio agudo 20 grave (SARS) u otras enfermedades respiratorias.
SUMARIO
Los peptidos descritos en esta memoria pueden funcionar como peptidos portadores. Estos peptidos pueden asociarse (p. ej., unirse de forma no covalente) con moleculas biologicamente activas y agentes formadores de imagenes para transportar las moleculas biologicamente activas y agentes formadores de imagenes a traves de la 25 barrera hematoencefalica. En algunos casos, un transporte de este tipo puede aumentar la eficacia de las moleculas biologicas y agentes formadores de imagenes.
Un peptido portador, tal como se describe en esta memoria, incluye la secuencia:
Xn-[B]m
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde:
30 X es un aminoacido hidrofilo;
B es un agente de barrera hematoencefalica; n es un numero entero de 4 a 50; y m es un numero entero de 1 a 3,
en donde el agente de barrera hematoencefalica incluye una secuencia de polipeptidos que tiene al menos una 35 identidad de la secuencia de 80% con:
L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 13).
Un aminoacido hidrofilo (X) puede elegirse de arginina, asparagina, acido aspartico, acido glutamico, glutamina, histidina, lisina, serina, treonina, tirosina, o una combinacion de los mismos. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, Xn puede comprender diez lisinas y seis argininas; seis lisinas y dieciseis argininas; ocho lisinas, ocho 40 argininas y ocho histidinas. En algunas realizaciones, X es lisina.
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La variable n es un numero entero que oscila entre 4 y 50 (p. ej., 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 26, 28, 32, 36, 40, 42, 44, 48 y 50). En algunas formas de realizacion, n se selecciona de entre 4, 8, 12, 16 y 20. En algunas formas de realizacion, n es 16. En algunas formas de realizacion, m es 1.
Ejemplos de un peptido portador pueden incluir:
K-K-K-K-L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 19);
K-K-K-K-K-K-K-K-L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO:20);
K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-L-R-V R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO:21);
K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO:22); y
K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO:23).
Ademas se proporciona en esta memoria un complejo, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, que tiene una molecula biologicamente activa o un agente formador de imagenes asociado a un peptido portador tal como se describe arriba. En algunas formas de realizacion, la molecula o el agente formador de imagenes biologicamente activo esta unido de forma no covalente al peptido portador.
Un agente formador de imagenes puede ser cualquier producto qmmico o sustancia que se utiliza para proporcionar la senal o el contraste en la formacion de imagenes. Por ejemplo, el agente formador de imagenes puede ser 125I- IgG o magnevist. Una molecula biologicamente activa puede incluir un polipeptido; oligonucleotido; plasmido; molecula pequena; anticuerpo; fragmento de anticuerpo; hidrato de carbono; polisacarido; lfpido; glicolfpido; antfgeno; y peptido antigenico. En algunas formas de realizacion, la molecula biologicamente activa se selecciona de entre un: polipeptido; oligonucleotido; y plasmido. Un oligonucleotido puede incluir una secuencia de ADN codificante; una secuencia de ADN antisentido; ARNm, secuencia de ARN antisentido; ARNi; y ARNsi. En algunas formas de realizacion, la molecula biologicamente activa es una molecula pequena, por ejemplo, un agente terapeutico.
Los peptidos portadores y complejos de peptidos portadores y agentes biologicamente activos o agentes formadores de imagenes tienen diversos usos y se pueden utilizar en diversos metodos. Por ejemplo, se proporciona en esta memoria un metodo de transportar una molecula biologicamente activa o un agente formador de imagenes a traves de la barrera hematoencefalica de un sujeto. El metodo puede incluir la administracion al sujeto de un complejo, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, que tiene la molecula biologicamente activa o el agente formador de imagenes asociado con un peptido portador.
El peptido portador de la invencion es util en un metodo de tratar un trastorno cerebral en un sujeto. El metodo puede incluir la administracion al sujeto de un complejo, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, que tiene un agente biologicamente activo asociado con un peptido portador. El trastorno cerebral puede elegirse de meningitis, epilepsia, esclerosis multiple, neuromielitis optica, tripanosomiasis neurologica de fase tardfa, Parkinson, leucoencefalopatfa multifocal progresiva, enfermedad de De Vivo, enfermedad de Alzheimer, encefalitis por VIH y el cancer.
Esta descripcion proporciona, ademas, un metodo de formacion de imagenes del sistema nervioso central de un sujeto. El metodo puede incluir la administracion al sujeto de un complejo, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, que comprende un agente formador de imagenes asociado con un peptido portador; y la formacion de imagenes del sistema nervioso central del sujeto.
Tambien se describen composiciones farmaceuticas. Una composicion farmaceutica puede incluir un complejo, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, que tiene una molecula o agente formador de imagenes biologicamente activo, un peptido portador y un soporte farmaceuticamente aceptable.
Finalmente, tambien se proporcionan kits. Un kit puede incluir un peptido portador. En algunas formas de realizacion, el kit incluye, ademas, una molecula biologicamente activa o un agente formador de imagenes.
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Los detalles de una o mas formas de realizacion de la invencion se recogen en los dibujos adjuntos y en la descripcion siguiente. Otras caractensticas, objetos y ventajas de la invencion resultaran evidentes a partir de la descripcion y los dibujos, y de las reivindicaciones.
DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es una serie de imagenes que ilustran las diferencias entre la administracion de IgG Alexa complejada con Ki6ApoE (SEQ ID NO: 22) en el cerebro e IgG Alexa no complejada.
La FIG. 2 ilustra la acumulacion de IgG 4.1 radiactiva en cerebro de raton con la ayuda de Ki6ApoE (SEQ ID NO: 22).
La FIG. 3 muestra la administracion de beta-galactosidasa, mediada por Ki6APoE (SEQ ID NO: 22), en el cerebro (parte superior) y en otros organos (parte inferior). En un experimento, beta-galactosidasa se inyecto en ratones mezclada con (Fig. 3A') y sin mezclar con Ki6ApoE (SEQ ID NO: 22) (Fig. 3A), rodajas de cerebro hechas seis horas despues de la inyeccion se tineron para la actividad enzimatica (parte superior). En un experimento relacionado separado, se hicieron laminas de diferentes organos y se tineron para la actividad de beta-galactosidasa despues de la administracion sin (FIG. 3B-G) y con K16ApoE (SEQ ID NO: 22) (FIG. 3B' - G'), B - cerebro, C - corazon, D - rinon, E - pulmon, F - hfgado, G - bazo.
La FIG. 4 muestra la evaluacion de la administracion de IgG (A) e IgM (B), mediada por K16ApoE (SEQ ID NO: 22), en cerebros de ratones por microSPECT. La formacion de imagenes se realizo a intervalos de 1 hora hasta seis horas, despues de lo cual se realizo una perfusion cardiaca, y la formacion de imagenes final se llevo a cabo 30 minutos despues de la perfusion. Barras de la izquierda - con K16ApoE (SEQ ID NO: 22); barras de la derecha - sin K16ApoE (SEQ ID NO: 22).
La FIG. 5 ilustra el marcaje de placas de amiloide con un anticuerpo espedfico para placas administrado a traves de K16ApoE (SEQ ID NO: 22) en cerebros de modelos de ratones de la enfermedad de Alzheimer. Se utilizaron dos ratones con la enfermedad de Alzheimer: uno representado por A, C y E, mientras que el otro esta representado por B, D y F. A, C y E representan secciones de cerebro adyacentes de un raton, mientras que B, D y F representan secciones de cerebro adyacentes de otro raton. A, B - tincion con tioflavina S; C, D - inmunotincion para identificar placas utilizando el 4G8 como anticuerpo primario, y un anticuerpo anti-raton como anticuerpo secundario; E, F - inmunotincion utilizando solo el anticuerpo secundario. La IgG 4G8 se inyecto en el primer raton (panel izquierdo) sin K16ApoE (SEQ ID NO: 22), mientras que el segundo raton (panel derecho) recibio la inyeccion de la IgG mezclada con K16ApoE (SEQ ID NO: 22).
La FIG. 6 muestra la evaluacion de la integridad de la BBB despues de la inyeccion de K16ApoE (SEQ ID NO: 22). Cada uno de los ratones (representados por A a G) recibio una inyeccion de K16ApoE (SEQ ID NO: 22), seguido de la inyeccion de p-galactosidasa en los tiempos indicados. Se hicieron rodajas de cerebro 4 horas despues de la inyeccion de p-galactosidasa y fueron seguidas por tincion para determinar la actividad de la enzima. A - p- galactosidasa se inyecto 1 minuto despues de la inyeccion de K16ApoE (SEQ ID NO: 22). B - p-galactosidasa se inyecto 5 minutos despues de la inyeccion de K16ApoE (SEQ ID NO: 22). C - p-galactosidasa se inyecto 10 minutos despues de la inyeccion de K16ApoE (SEQ ID NO: 22). D - p-galactosidasa se inyecto 30 minutos despues de la inyeccion de K16ApoE (SEQ ID NO: 22). E - p-galactosidasa se inyecto 1 hora despues de la inyeccion de K16ApoE (SEQ ID NO: 22). F - p-galactosidasa se inyecto 2 horas despues de la inyeccion de K16ApoE (SEQ ID NO: 22). G - p-galactosidasa se inyecto 4 horas despues de la inyeccion de K16ApoE (SEQ ID NO: 22). H- se inyecto control positivo (p-galactosidasa mezclada con K16ApoE (SEQ ID NO: 22), se hicieron rodajas de cerebro 4 horas despues de la inyeccion y se procedio a la tincion para determinar la actividad enzimatica).
La FIG. 7 demuestra la necesidad del enlace qmmico del K16 (SEQ ID NO: 4) y los restos de peptidos para la administracion no covalente de ApoE a traves de la BBB. La administracion de p-galactosidasa en el cerebro con el peptido K16 (SEQ ID NO: 4) solo (A), con el peptido ApoE solo (B), con el peptido K16 (SEQ ID NO: 4) + peptido ApoE (C) y con el peptido K16APoE (SEQ ID NO: 22) (D).
La FIG. 8 ilustra el ensayo de peptidos ApoE mutantes por su potencial como transportadores no covalentes de protemas a traves de la BBB. A - sin peptido, sin p-gal; B - K16ApoE (SEQ ID NO: 22) + p-gal; C - K16L3N7 (SEQ ID NO: 126) + p-gal; D - K16L3L20 (SEQ ID NO: 127)+ p-gal; E - K16N7L20 (SEQ ID NO: 128)+ p-gal.
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La FIG. 9 muestra un estudio de evolucion en el tiempo de administracion de p-galactosidasa al cerebro de ratones con K16ApoE (SEQ ID NO: 22). A- p-galactosidasa, sin peptido, 6 h; B- p-galactosidasa + peptido, 1 h; C- p- galactosidasa + peptido, 2 h; D- p-galactosidasa + peptido, 5 h; E- p-galactosidasa + peptido, 10 h
DESCRIPCION DETALLADA
Los peptidos descritos en esta memoria pueden funcionar como peptidos portadores. Estos peptidos pueden asociarse (p. ej., unirse de forma no covalente) con moleculas biologicamente activas y agentes formadores de imagenes para el transporte de moleculas biologicamente activas y agentes formadores de imagenes a traves de la barrera hematoencefalica. En algunos casos, este tipo de transporte puede aumentar la eficacia de las moleculas biologicas y agentes formadores de imagenes.
Peptidos portadores
Se proporcionan en esta memoria peptidos portadores que tienen la siguiente secuencia:
Xn - [B]m
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde:
X es un aminoacido hidrofilo;
B es un agente de barrera hematoencefalica; n es un numero entero de 4 a 50; y m es un numero entero de 1 a 3,
en donde el agente de barrera hematoencefalica incluye una secuencia de polipeptidos que tiene al menos una identidad de la secuencia de 80% (p. ej. al menos 85%; al menos 90%; al menos 92%; al menos 95%; al menos 98%; y al menos 99%) con:
L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 13).
Un aminoacido hidrofilo se puede elegir de: arginina, asparagina, acido aspartico, acido glutamico, glutamina, histidina, lisina, serina, treonina, tirosina, y combinaciones y derivados no naturales de los mismos. En algunas formas de realizacion, un aminoacido hidrofilo se puede elegir de lisina o un derivado de lisina no natural, arginina o un derivado de arginina no natural, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el aminoacido hidrofilo es lisina. Ejemplos no limitativos de Xn pueden incluir KKKK (SEQ ID NO: 1); KKKKKKKK (SEQ ID NO: 2); KKKKKKKKKKKK (SEQ ID NO: 3); KKKKKKKKKKKKKKKK (SEQ ID NO: 4); RRRR (SEQ ID NO: 5); RRRRRRRR (SEQ ID NO: 6); RRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 7); RRRRRRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 8); KRKR (SEQ ID NO: 9); KKKR (SEQ ID NO: 10); KKKRRRKKKRRR (SEQ ID NO: 11); y KKKKRRRRKKKKRRRR (SEQ ID NO: 12).
La variable n es un numero entero que oscila entre 4 y 50 (p. ej., 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 26, 28, 32, 36, 40, 42, 44, 48 y 50). Por ejemplo, n puede oscilar entre 4 y 20. En algunas formas de realizacion, n se selecciona de entre 4, 8, 12, 16 y 20. Por ejemplo, n puede ser 16. En algunas realizaciones, m es 1.
Un agente de barrera hematoencefalica, tal como se utiliza en esta memoria, es cualquier ligando polipeptido o no polipeptido que puede cruzar la barrera hematoencefalica. En algunas formas de realizacion, un agente de barrera hematoencefalica tiene un receptor afrn en las celulas del cerebro, o puede unirse a dichos receptores. En algunas realizaciones, el agente de barrera hematoencefalica comprende un sitio de union del receptor de transferencia de un transferrina.
En algunas formas de realizacion, el agente de barrera hematoencefalica incluye un polipeptido que comprende la siguiente secuencia:
L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 13).
En algunas formas de realizacion, el agente de barrera hematoencefalica es de menos de 100 aminoacidos de longitud (p. ej., menos de 90 aminoacidos de longitud; menos de 80 aminoacidos de longitud; menos de 75 aminoacidos de longitud; menos de 70 aminoacidos de longitud; menos de 65 aminoacidos de longitud; menos de 62 aminoacidos de longitud; menos de 60 aminoacidos de longitud; menos de 55 aminoacidos de longitud; menos de 50 aminoacidos de longitud; y menos de 45 aminoacidos de longitud).
"Porcentaje de identidad de la secuencia" se refiere al grado de identidad de la secuencia entre cualquier secuencia dada de referencia, p. ej., SEQ ID NO: 13, y una secuencia de agente de barrera hematoencefalica candidata. Una secuencia candidata tiene tipicamente una longitud que es de 80 por ciento a 200 por ciento la longitud de la secuencia de referencia (p. ej., 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115 , 120, 130, 140, 150, 160, 170, 5 180, 190 o 200 por ciento de la longitud de la secuencia de referencia). Un porcentaje de identidad de cualquier
acido nucleico o polipeptido candidato con relacion a un acido nucleico o polipeptido de referencia se puede determinar como sigue. Una secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de acido nucleico o una secuencia de aminoacidos) se alinea a una o mas secuencias candidatos utilizando el programa informatico ClustalW (version 1.83, parametros por defecto), que permite alineamientos de acido nucleico o secuencias de polipeptidos que se han 10 de llevar a cabo a traves de toda su longitud (alineacion global). Chenna et al., Nucleic Acids Res, 31(13):3497-500 (2003).
ClustalW calcula la mejor combinacion entre una referencia y una o mas secuencias candidatas, y las alinea de manera que se pueden determinar las identidades, similitudes y diferencias. Los huecos de uno o mas residuos pueden ser insertados en una secuencia de referencia, una secuencia candidata, o ambas, para maximizar las 15 alineaciones de secuencia. Para una rapida alineacion por pares de secuencias de acidos nucleicos se utilizan los siguientes parametros por defecto: tamano de palabra: 2; tamano de la ventana: 4; metodo de puntuacion: porcentaje; numero de las diagonales superiores: 4; y penalizacion por hueco: 5. Para el alineamiento multiple de secuencias de acidos nucleicos, se utilizan los siguientes parametros: penalizacion por apertura de hueco: 10.; penalizacion por extension de hueco: 5,0; y transiciones de peso: sf. Para un rapido alineamiento por pares de 20 secuencias de peptidos se utilizan los siguientes parametros: tamano de la palabra: 1; tamano de la ventana: 5; metodo de puntuacion: porcentaje; numero de las diagonales superiores: 5; penalizacion por hueco: 3. Para el alineamiento multiple de secuencias de peptidos se utilizan los siguientes parametros: peso de la matriz: blosum; penalizacion por apertura de hueco: 10.; penalizacion por extension de hueco: 0,5; huecos hidrofilos: on; residuos hidrofilos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg y Lys; penalizaciones por hueco espedfico para residuos: on. La 25 salida ClustalW es un alineamiento de secuencia que refleja la relacion entre las secuencias. ClustalW se puede ejecutar, por ejemplo, en el sitio Baylor College of Medicine Search Launcher (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi- align/multi-align.html) y en el sitio del Instituto Europeo de Bioinformatica en la World Wide Web (ebi.ac.uk/clustalw).
Para determinar el porcentaje de identidad de un acido nucleico o una secuencia de aminoacidos candidato a una secuencia de referencia, las secuencias se alinean utilizando ClustalW, el numero de coincidencias identicas en la 30 alineacion se divide por la longitud de la secuencia de referencia y el resultado se multiplica por 100. Se observa que el valor de porcentaje de identidad puede ser redondeado a la decima mas cercana. Por ejemplo, 78,11, 78,12, 78,13, 78,14 y se redondean a 78,1, mientras que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 y 78,19 se redondean a 78,2.
La variable m es un numero entero de 1 a 3. En algunas realizaciones, m es 1.
En algunas realizaciones, un peptido portador se puede elegir de:
35 K-K-K-K-L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 19);
K-K-K-K-K-K-K-K-L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 20);
K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-L-R-V R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 21);
K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 22); y
K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 23).
40 Complejos
Tambien se proporcionan en esta memoria complejos que tienen una molecula biologicamente activa o un agente formador de imagenes asociado a un peptido portador tal como se describe en esta memoria. En algunas formas de realizacion, la molecula biologicamente activa o el agente formador de imagenes esta unido de forma no covalente al peptido portador.
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Tal como se utiliza en esta memoria, una "molecula biologicamente activa" incluye cualquier molecula que, si es transportada a traves de la barrera hematoencefalica, puede tener un efecto biologico. Ejemplos de moleculas biologicamente activas incluyen polipeptidos, que incluyen dominios funcionales de moleculas biologicamente activas, ejemplos particulares incluyen factores de crecimiento, enzimas, factores de transcripcion, toxinas, peptidos antigenicos (tales como para vacunas), anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, factor neurotrofico derivado del cerebro, factor de crecimiento de fibroblastos (p. ej., (FGF)-2 o FGFs multiples), factor de crecimiento nervioso, neurotrofina (p. ej., NT-3 y NT-4/5), factor neurotrofico derivado de la glia, factor neurotrofico ciliar, neurturina, neuregulinas, interleucinas, factor de crecimiento transformante (p. ej., TGF-ay TGF-p), peptido intestinal vasoactivo, factor de crecimiento epidermico (EGF), eritropoyetina, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, artemina, persefina, netrinas, cardiotrofina-1, factor de celulas madre, midkina, pleiotrofina, protemas morfogenicas oseas, saposinas, semaporinas, factor inhibidor de leucemia, anti-AU, anti- HER2, anti-EGF, anti-nogo A, anti-TRAIL (ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral), anti-a-sinuclema, anti-htt, anti-priones, anti-virus del Nilo Occidental, aL-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, N-acetil-galactosamina-6-sulfatasa, arilsulfatasa B, a-glucosidasa acida y esfingomielinasa acida (Vease, Pardridge, WM, Bioconjug. Chem. 19 (7): 1327-38 2008). Ejemplos adicionales de moleculas biologicamente activas incluyen oligonucleotidos tales como plasmidos naturales o modificados que codifican secuencias de ADN, secuencias de ADN antisentido, ARNms, secuencias de ARN antisentido, ARNis y ARNsis; hidratos de carbono; lfpidos; y glicolfpidos.
Ejemplos adicionales de moleculas biologicamente activas incluyen moleculas pequenas, incluyendo agentes terapeuticos, en particular aquellos con una baja permeabilidad a la barrera hematoencefalica. Algunos ejemplos de estos agentes terapeuticos incluyen farmacos contra el cancer tales como daunorubicina y productos qmmicos toxicos que, debido a la menor dosis que se puede administrar mediante este metodo, ahora se pueden administrar de forma mas segura. Por ejemplo, un agente terapeutico puede incluir bevacizumab, irinotecan, zoledronato y temozolomida.
En otra realizacion, el agente terapeutico puede incluir un antibiotico de amplio espectro (p. ej., cefotaxima, ceftriaxona, ampicilina y vancomicina); un agente antiviral (p. ej., aciclovir); acetazolamida; carbamazepina; clonazepam; clorazepato dipotasico; diazepam; divalproex sodico; etosuximida; felbamato; fosfenitoma sodica; gabapentina; lamotrigina; levetiracetam; lorazepam; oxcarbazepina; fenobarbital; fenitoma; fenitoma sodica; pregabalina; primidona; hidrocloruro de tiagabina; topiramato; trimetadiona; acido valproico; zonisamida; copaxone; tysabri; novantrona; donezepil HCl; rivastigmina; galantamina; memantina; levodopa; carbidopa; parlodel, permax, requip, mirapex; symmetrel; artane; cogentin; eldepryl; y deprenil.
Numerosos otros ejemplos de moleculas biologicamente activas resultaran evidentes para el experto en la materia.
Todavfa otro ejemplo de una molecula biologicamente activa es un peptido antigenico. Los peptidos antigenicos se pueden administrar para proporcionar proteccion inmunologica cuando son importados por celulas implicadas en la respuesta inmune. Otros ejemplos incluyen peptidos inmunosupresores (p. ej., peptidos que bloquean las celulas T autorreactivas, peptidos que son conocidos en la tecnica).
Se pueden utilizar polipeptidos de unos pocos aminoacidos a aproximadamente mil aminoacidos. En algunas formas de realizacion, el intervalo de tamanos de polipeptidos es de unos pocos aminoacidos a aproximadamente 250 aminoacidos (p. ej., aproximadamente 3 a aproximadamente 250 aminoacidos; aproximadamente 20 a aproximadamente 250 aminoacidos; aproximadamente 50 a aproximadamente 250 aminoacidos; aproximadamente 100 a aproximadamente 250 aminoacidos; aproximadamente 150 a aproximadamente 250 aminoacidos; aproximadamente 3 aminoacidos a aproximadamente 200 aminoacidos; aproximadamente 3 aminoacidos a aproximadamente 150 aminoacidos; aproximadamente 3 aminoacidos a aproximadamente 175 aminoacidos; aproximadamente 3 aminoacidos a aproximadamente 125 aminoacidos; aproximadamente 25 aminoacidos a aproximadamente 200 aminoacidos; aproximadamente 50 aminoacidos a aproximadamente 150 aminoacidos, y aproximadamente 75 aminoacidos a aproximadamente 225 aminoacidos). Para cualquier molecula, los intervalos de tamanos pueden ser de hasta aproximadamente un peso molecular de aproximadamente 1 millon. En algunas formas de realizacion, el tamano oscila entre un peso molecular de aproximadamente 25.000, y en realizaciones particulares, los intervalos de tamanos puede ser de hasta un peso molecular de aproximadamente 3.000.
Por "antisentido" se quiere dar a entender una molecula de acido nucleico no enzimatica que se une a ARN diana por medio de interacciones ARN-ARN o ARN-ADN o ARN-APN (acido nucleico protema; Egholm et al., 1993 Nature 365, 566) y altera la actividad del ARN diana (para una revision, vease Stein y Cheng, 1993 Science 261, 1004; Agrawal et al., patente de EE.UU. N° 5.591.721; Agrawal, patente de EE.uU. N° 5.652.356). Tfpicamente, las
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moleculas antisentido seran complementarias a una secuencia diana a lo largo de una unica secuencia contigua de la molecula antisentido. Sin embargo, en determinadas formas de realizacion, una molecula antisentido puede unirse a un sustrato de tal manera que la molecula de sustrato forma un bucle y/o una molecula antisentido puede unirse de tal manera que la molecula antisentido forma un bucle. Por lo tanto, la molecula antisentido puede ser complementaria a dos (o incluso mas) secuencias de sustrato no contiguas o dos (o incluso mas) porciones de secuencias no contiguas de una molecula antisentido pueden ser complementarias a una secuencia diana o ambos.
Se pueden utilizar secuencias de ARN de interferencia (ARNi) y ARN de interferencia corto (ARNsi) para modular (p. ej., inhibir) la expresion de genes (vease, p. ej., Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494 498; y Bass, 2001, Nature, 411,428 429; Bass, 2001, Nature, 411, 428 429; y Kreutzer et al., Publicacion Internacional PCT N° WO 00/44895; Zernicka-Goetz et al., publicacion Internacional pCt N° WO 01/36646; Fire, Publicacion Internacional PCT N° WO 99/32619; Plaetinck et al., Publicacion Internacional PCT N° WO 00/01846; Mello y Fire, Publicacion Internacional PCT N° WO 01/29058; Deschamps-Depaillette, Publicacion Internacional PCT N° WO 99/07409; y Li et al., Publicacion Internacional PCT N° WO 00/44914). En una realizacion, una molecula de ARNsi comprende un ARN de doble cadena, en el que una cadena del ARN es complementaria al ARN de interes. En otra realizacion, una molecula de ARNsi comprende un ARN de doble cadena, en el que una cadena del ARN comprende una parte de una secuencia de un ARN de interes. En aun otra realizacion, una molecula de ARNsi de la invencion comprende un ARN de doble cadena en el que las dos cadenas de ARN estan conectadas por un enlazador de no nucleotidos. Alternativamente, una molecula de ARNsi de la invencion comprende un ARN de doble cadena, en el que las dos cadenas de ARN estan conectadas por un enlazador de nucleotidos tal como una estructura de bucle o de tallo- bucle.
El termino "anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a moleculas de inmunoglobulina y partes inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina (es decir, moleculas que contienen un sitio de union a antigeno que se une espedficamente a un peptido). Un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo quimerico, o un fragmento de los mismos. La expresion "fragmento de anticuerpo" de un anticuerpo de longitud completa se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que conservan la capacidad de unirse espedficamente a una diana de interes.
Un agente formador de imagenes, tal como se usa en esta memoria, puede ser cualquier producto qmmico o sustancia que se utiliza para proporcionar la senal o el contraste en la formacion de imagenes. El dominio potenciador de senales puede ser una molecula organica, ion, sal o quelato metalico, partfculas (particularmente partfcula de hierro), o peptido marcado, protema, polfmero o liposoma.
En algunas formas de realizacion, el agente formador de imagenes es un compuesto de quelato metalico fisiologicamente compatible que consiste en uno o mas agentes quelantes organicos dclicos o adclicos complejados con uno o mas iones metalicos con numeros atomicos 21-29, 42, 44 o 57-83.
Para la formacion de imagenes por rayos x, el agente formador de imagenes puede consistir en moleculas organicas yodadas o quelatos de iones de metales pesados de numeros atomicos 57 a 83. En algunas formas de realizacion, el agente formador de imagenes es 125I-IgG. Ejemplos de compuestos adecuados se describen en M. Sovak, comp., "Radiocontrast Agents", editorial Springer, pags. 23-125 (1984) y la patente de EE.UU. N° 4.647.447.
Para la formacion de imagenes por ultrasonidos, el agente de formacion de imagenes puede consistir en burbujas llenas de gas tales como Albunex, Echovist o Levovist, o partfculas o quelatos metalicos, en donde los iones de metales tienen numeros atomicos 21-29, 42, 44 o 57-83. Ejemplos de compuestos adecuados se describen en Tyler et al, Ultrasonic Imaging, 3, pags. 323-29 (1981) y D.P. Swanson, "Enhancement Agents for Ultrasound Fundamentals”, Pharmaceuticals in Medical Imaging, pags. 682-87. (1990).
Para la formacion de imagenes radiofarmaceutica nuclear o la radioterapia, el agente formador de imagenes puede consistir en una molecula radiactiva. En algunas formas de realizacion, se pueden utilizar los quelatos de Tc, Re, Co, Cu, Au, Ag, Pb, Bi, In y Ga. En algunas formas de realizacion, se pueden utilizar los quelatos de Tc-99m. Ejemplos de compuestos adecuados se describen en GVS, Radiotracers for Medical Applications, I, pags. 201 y D. P. Swanson et al., comp., Pharmaceuticals in Medical Imaging, pags. 279-644 (1990).
Para la formacion de imagenes de luz ultravioleta/visible/infrarroja, el agente formador de imagenes puede consistir en cualquier tinte organico o inorganico o cualquier quelato metalico.
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Para MRI, el agente formador de imagenes puede consistir en un complejo de metal-ligando de una forma paramagnetica de un ion metalico con numeros atomicos 21-29, 42, 44 o 57-83. En algunas formas de realizacion, el metal paramagnetico se elige entre: Gd(III), Fe(III), Mn(II y III), Cr(III), Cu(II), Dy(MI), Tb(MI), Ho(III), Er(III) y Eu(MI). Se conocen en la tecnica muchos ligandos quelantes adecuados para agentes de MRI. Estos tambien se pueden utilizar para quelatos metalicos para otras formas de formacion de imagenes biologicas. Por ejemplo, un agente formador de imagenes puede incluir:
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"Asociado con", tal como se utiliza en esta memoria, quiere dar a entender que la molecula biologicamente activa o el agente formador de imagenes se conjuga con el peptido portador de tal manera que cuando el peptido portador cruza la barrera hematoencefalica, tambien se importa la molecula o el agente. En determinadas formas de realizacion, la molecula biologicamente activa o el agente formador de imagenes esta unido de forma no covalente al peptido portador. Por ejemplo, la molecula biologicamente activa y el peptido portador pueden estar asociados a traves de interacciones electrostaticas. En otras formas de realizacion, el peptido portador puede estar unido de forma covalente, ya sea directa o indirectamente (p. ej., a traves de un enlazador), a la molecula biologicamente activa o el agente formador de imagenes.
Un enlazador puede ser cualquier resto adecuado para la union de un peptido portador a una molecula biologicamente activa. Un enlazador puede estar unido en el extremo C, el extremo N, o en ambos, de un peptido portador. Adicionalmente, un enlazador puede estar unido a la cadena lateral de un peptido portador. Si un peptido portador esta unido a multiples enlazadores, cada uno de los enlazadores puede ser diferente. Un enlazador puede estar unido de forma covalente a una cadena lateral de un aminoacido, p. ej., lisina, glutamina, cistema, metionina, glutamato, aspartato, asparagina.
En algunas formas de realizacion una cadena lateral de aminoacido puede servir como el enlazador. Por ejemplo, el grupo epsilon amino (£-NH2) se puede utilizar para conjugar a un portador, por ejemplo a traves de un enlace amida o tiourea. De manera similar, el grupo delta amino de ornitina (orn), el grupo gamma amino de acido diaminobutirico (dab) o el grupo beta amino de acido diamino-propionico (dpr) tambien pueden actuar como enlazadores. Estos aminoacidos pueden estar en el extremo C o N del peptido portador o pueden estar situados dentro de la secuencia del peptido portador.
El complejo compuesto de una molecula biologicamente activa o agente formador de imagenes y un peptido portador se puede preparar por cualquier metodo conocido por los expertos ordinarios en la tecnica. En algunas
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formas de realizacion, el peptido portador y la molecula biologicamente activa o agente formador de imagenes se combinan, se incuban a temperatura ambiente y luego se utilizan. Por ejemplo, se pueden preparar disoluciones del peptido de administracion (Kl6ApoE (SEQ ID NO: 22)) e IgG en PBS (solucion salina tamponada con fosfato) u OptiMem (comercialmente disponible) o medios de cultivo celular sin suero en concentraciones deseadas. El peptido de administracion e IgG se pueden mezclar en las relaciones deseadas y despues se incuban a la temperatura ambiente durante 30-60 minutos. Despues de la incubacion, la mezcla esta lista para la inyeccion/administracion.
Combinaciones de la molecula biologicamente activa y peptido portador se pueden preparar en una diversidad de relaciones molares. Por ejemplo, una relacion molar de molecula biologicamente activa a peptido portador puede oscilar entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:200 (p. ej., 1:2; 1:5; 1:8; 1:10; 1:25; 1:30; 1:40; 1:45; 1:50; 1:60; 1:65; 1:70; 1:75; 1:80; 1:90; 1:100; 1:125; 1:135; 1:145, 1:150, 1:175 y 1:190). En algunas formas de realizacion se utiliza un exceso molar de peptido portador a molecula biologicamente activa. Por ejemplo, la relacion molar de molecula biologicamente activa a peptido portador puede oscilar entre aproximadamente 1:20 y aproximadamente 1:100 (p. ej., 1:50 a 1:90). En algunos casos, la relacion puede ser de 1:70.
La expresion "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a sales que poseen perfiles de toxicidad dentro de un intervalo que proporciona utilidad en aplicaciones farmaceuticas. Sales farmaceuticamente inaceptables pueden poseer, no obstante, propiedades tales como alta cristalinidad, lo que puede hacerlas utiles, por ejemplo en procesos de smtesis, purificacion o formulacion de compuestos descritos en esta memoria. En general las propiedades utiles de los compuestos descritos en esta memoria no dependen cnticamente de si el compuesto esta o no esta en una forma de sal, a menos que se indique claramente lo contrario (tal como especificando que el compuesto debena estar en forma de "base libre" o "acido libre"), una referencia en la memoria a un peptido portador o a un complejo que comprende un peptido portador debe entenderse como que abarca formas de sal del compuesto, ya se establezca o no explfcitamente.
Sales por adicion de acidos farmaceuticamente aceptables adecuadas se pueden preparar a partir de un acido inorganico o de un acido organico. Ejemplos de acidos inorganicos incluyen acidos clortudrico, bromtHdrico, yodtudrico, mtrico, carbonico, sulfurico y fosforico. Acidos organicos apropiados pueden seleccionarse de las clases alifatica, cicloalifatica, aromatica, aralifatica, heterodclica, carboxflica y sulfonica de acidos organicos, ejemplos de los cuales incluyen acido formico, acetico, propionico, succmico, glicolico, gluconico, lactico, malico, tartarico, cftrico, ascorbico, glucuronico, maleico, fumarico, piruvico, aspartico, glutamico, benzoico, antramlico, 4-hidroxibenzoico, fenilacetico, mandelico, embonico (pamoico), metanosulfonico, etanosulfonico, bencenosulfonico, pantotenico, trifluorometanosulfonico, 2-hidroxietanosulfonico, p-toluenosulfonico, sulfamlico, ciclohexilaminosulfonico, estearico, algmico, p-hidroxibutmco, salicilico, galactarico y galacturonico. Ejemplos de sales por adicion de acidos farmaceuticamente inaceptables incluyen, por ejemplo, percloratos y tetrafluoroboratos.
Sales por adicion de bases farmaceuticamente aceptables adecuadas incluyen, por ejemplo, sales metalicas, incluyendo sales de metales alcalinos, de metales alcalinoterreos y de metales de transicion tales como, por ejemplo, sales de calcio, magnesio, potasio, sodio y zinc.
Sales por adicion de bases farmaceuticamente aceptables incluyen tambien sales organicas preparadas a partir de aminas basicas tales como, por ejemplo, W,W'-dibenciletilendiamina, cloroprocama, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (N-metilglucamina) y procama. Ejemplos de sales por adicion de bases farmaceuticamente aceptables incluyen sales de litio y sales de cianato.
Todas estas sales pueden prepararse por medios convencionales a partir del correspondiente peptido portador o complejo haciendo reaccionar, por ejemplo, el acido o base apropiado con un peptido portador o complejo como se describe en esta memoria. Preferiblemente, las sales estan en forma cristalina, y preferiblemente se preparan por cristalizacion de la sal en un disolvente adecuado. Una persona experta en la tecnica sabra como preparar y seleccionar formas de sales adecuadas, por ejemplo tal como se describe en el Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use P. H. Stahl y C. G. Wermuth (Wiley-VCH, 2002).
Metodos de Uso
Tambien se consideran en esta memoria metodos de utilizar peptidos portadores para transportar una molecula biologicamente activa o agente formador de imagenes a traves de la barrera hematoencefalica de un sujeto. El metodo puede incluir administrar al sujeto un complejo que tiene una molecula biologicamente activa o agente formador de imagenes asociado con un peptido portador, o una sal farmaceuticamente aceptable, tal como se describe en esta memoria.
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Un sujeto puede incluir tanto mairnferos como no mairnferos. Los mairnferos incluyen, por ejemplo, seres humanos; primates no humanos, p. ej., simios y monos; ganado; caballos; ovejas; ratas; ratones; cerdos; y cabras. No mairnferos incluyen, por ejemplo, peces y aves.
El transporte de una molecula biologicamente activa puede incluir la importacion de la molecula a traves de la barrera hematoencefalica.
Ademas se considera en esta memoria un metodo de tratamiento de un trastorno cerebral en un sujeto. El metodo puede incluir la administracion al sujeto de un complejo que comprende un agente biologicamente activo asociado con un peptido portador tal como se describe en esta memoria. En algunos ejemplos, la molecula biologicamente activa es un agente terapeutico. En algunos ejemplos, el trastorno cerebral se elige entre: meningitis, epilepsia, esclerosis multiple, neuromielitis optica, tripanosomiasis neurologica de fase tardfa, Parkinson, leucoencefalopatfa multifocal progresiva, enfermedad de De Vivo, enfermedad de Alzheimer, encefalitis por VIH, y cancer.
En algunos ejemplos, el trastorno del cerebro es un cancer de cerebro, por ejemplo astrocitoma, meduloblastoma, glioma, ependimoma, germinoma (pinealoma), glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma, retinoblastoma y tumores congenitos; o un cancer de la medula espinal, p. ej., neurofibroma, meningioma, glioma y sarcoma.
Esta descripcion tambien proporciona un metodo de formacion de imagenes del sistema nervioso central de un sujeto. En algunas formas de realizacion, el metodo puede incluir administrar al sujeto un complejo que comprende un agente formador de imagenes asociado con un peptido portador, tal como se describe en esta memoria, y la formacion de imagenes del sistema nervioso central del sujeto.
El complejo se puede administrar por cualquier via, p. ej., IV, intramuscular, SC, oral, intranasal, por inhalacion, transdermica y parenteral.
El complejo se puede formular con un soporte farmaceuticamente aceptable, seleccionado sobre la base de la via de administracion seleccionada y la practica farmaceutica estandar. El complejo se puede formular en formas de dosificacion de acuerdo con las practicas estandar en el campo de las preparaciones farmaceuticas. Vease Alphonso Gennaro, comp., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edicion (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA. Formas de dosificacion adecuados pueden comprender, por ejemplo, comprimidos, capsulas, disoluciones, disoluciones parenterales, trociscos, supositorios o suspensiones.
Para la administracion por via parenteral, el complejo se puede mezclar con un soporte o diluyente adecuado tal como agua, un aceite (en particular un aceite vegetal), etanol, solucion salina, dextrosa acuosa (glucosa) y disoluciones de azucares relacionadas, glicerol, o un glicol tal como propilenglicol o polietilenglicol. Las disoluciones para administracion parenteral contienen preferiblemente una sal soluble en agua del complejo. Se pueden anadir tambien agentes estabilizantes, agentes antioxidantes y conservantes. Agentes antioxidantes adecuados incluyen sulfito, acido ascorbico, acido citrico y sus sales, y EDTA sodico. Conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio, metil- o propil-parabeno, y clorobutanol. La composicion para administracion parenteral puede adoptar la forma de una disolucion, dispersion, suspension o emulsion acuosa o no acuosa.
Para la administracion oral, el complejo se puede combinar con uno o mas ingredientes inactivos solidos para la preparacion de comprimidos, capsulas, pfldoras, polvos, granulos u otras formas de dosificacion oral adecuadas. Por ejemplo, el complejo se puede combinar con al menos un excipiente tal como cargas, aglutinantes, humectantes, agentes disgregrantes, retardantes de solucion, aceleradores de la absorcion, agentes humectantes, absorbentes o agentes lubricantes.
La dosis espedfica de un complejo se determinara, por supuesto, por las circunstancias particulares de cada uno de los pacientes individuales incluyendo el tamano, peso, edad y sexo del paciente, la naturaleza y la fase de la enfermedad que se este tratando, la agresividad del trastorno patologico y la via de administracion del compuesto.
Composiciones farmaceuticas
Se proporcionan en esta memoria composiciones farmaceuticas que comprenden una molecula biologicamente activa o agente formador de imagenes asociado con un peptido portador. En algunas formas de realizacion, la
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molecula biologicamente activa o el agente formador de imagenes esta unido de forma no covalente al peptido portador.
Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en esta memoria contienen una molecula biologicamente activa o agente formador de imagenes asociado con un peptido portador en una cantidad que resulta en el transporte de la molecula biologicamente activa o agente formador de imagenes a traves de la barrera hematoencefalica, y un soporte farmaceuticamente aceptable. Soportes farmaceuticos adecuados para la administracion de los compuestos proporcionados en esta memoria incluyen cualquiera de los soportes conocidos por los expertos en la tecnica por ser adecuados para el modo particular de administracion.
Las composiciones se pueden formular, en una forma de realizacion, en preparaciones farmaceuticas adecuadas tales como disoluciones, suspensiones, comprimidos, comprimidos dispersables, pfldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida o elixires para la administracion oral o en disoluciones o suspensiones esteriles para la administracion parenteral y la inyeccion intraperitoneal, asf como la preparacion de un parche transdermico, inhaladores de polvo seco y unguentos (vease, p. ej., Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Cuarta Edicion 1985, 126).
La concentracion de la molecula biologicamente activa o agente formador de imagenes asociado con un peptido portador en la composicion farmaceutica dependera de las tasas de absorcion, inactivacion y excrecion de los compuestos, de las caractensticas ffsico-qmmicas de los compuestos, de la pauta de dosificacion y de la cantidad administrada, asf como de otros factores conocidos por los expertos en la tecnica.
La composicion farmaceutica puede administrarse de una vez, o puede dividirse en un cierto numero de dosis mas pequenas a ser administradas a intervalos de tiempo. Se entiende que la dosificacion precisa y la duracion del tratamiento es una funcion de la enfermedad que este siendo tratada y estas pueden determinarse empmcamente utilizando protocolos de ensayo conocidos o mediante extrapolacion a partir de datos de ensayo in vivo o in vitro. Es de senalar que las concentraciones y los valores de dosificacion tambien pueden variar con la gravedad de la afeccion a aliviar. Ha de entenderse, ademas, que para cualquier sujeto particular, los regfmenes de dosificacion espedficos debenan ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las composiciones, y que los intervalos de concentracion establecidos en este memoria son a modo de ejemplo solamente y no pretenden limitar el alcance o la practica de las composiciones reivindicadas.
Las composiciones farmaceuticas se proporcionan para la administracion a seres humanos y animales en formas de dosificacion unitarias tales como comprimidos, capsulas, pfldoras, polvos, granulos, disoluciones o suspensiones parenterales esteriles, y disoluciones o suspensiones orales, y emulsiones de aceite en agua que contienen cantidades adecuadas de los compuestos o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los compuestos farmaceuticos terapeuticamente activos y derivados de los mismos, en una forma de realizacion, se formulan y administran en formas de dosificacion unitaria o en formas de dosificacion multiple. Formas de dosis unitaria tal como se utilizan en esta memoria se refieren a unidades ffsicamente discretas adecuadas para sujetos humanos y animales y envasadas individualmente tal como se conoce en la tecnica. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada del compuesto terapeuticamente activo, suficiente para producir el efecto terapeutico deseado, en asociacion con el soporte, vehuculo o diluyente farmaceutico requerido. Ejemplos de formas de dosis unitaria incluyen ampollas y jeringas y comprimidos o capsulas envasados individualmente. Formas de dosis unitarias se pueden administrar en fracciones o multiplos de las mismas. Una forma de dosis multiple es una pluralidad de formas de dosificacion unitaria identicas envasadas en un unico recipiente a administrar en forma de dosis unitaria segregada. Ejemplos de formas de dosis multiples incluyen viales, frascos de comprimidos o capsulas o botellas de pintas o galones. Por lo tanto, la forma de dosis multiple es un multiplo de dosis unitarias que no se segregan en el envasado.
Composiciones lfquidas farmaceuticamente administrables pueden prepararse, por ejemplo, mediante disolucion, dispersion, o mezclando de otra manera un compuesto activo tal como se define arriba y adyuvantes farmaceuticos opcionales en un soporte tal como, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol, y similares, para formar de este modo una disolucion o suspension. Si se desea, la composicion farmaceutica a administrar puede contener tambien cantidades menores de sustancias auxiliares no toxicas tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes solubilizantes, agentes tamponadores del pH y similares, por ejemplo acetato, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitan, acetato sodico de trietanolamina, oleato de trietanolamina, y otros agentes de este tipo.
Metodos reales para preparar formas de dosificacion de este tipo son conocidos, o resultaran evidentes para los expertos en esta tecnica; por ejemplo, vease Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15a Edicion, l975.
Se pueden preparar formas de dosificacion o composiciones que contienen una molecula biologicamente activa o un 5 agente formador de imagenes asociado con un peptido portador en el intervalo de 0,005% a 100%, estando el resto constituido por un soporte no toxico. Metodos para la preparacion de estas composiciones son conocidos para los expertos en la tecnica. Las composiciones contempladas pueden contener 0,001% -100% de ingrediente activo, en una forma de realizacion 0,1-95%, en otra forma de realizacion 75-85%.
Kits
10 Tambien se proporcionan en esta memoria kits. Tfpicamente, un kit incluye un peptido portador tal como se describio previamente. En algunas formas de realizacion, un kit incluye un peptido portador y una molecula biologicamente activa y/o un agente formador de imagenes. En determinadas formas de realizacion, un kit puede incluir uno o mas sistemas de administracion, p. ej., para una molecula biologicamente activa, agente formador de imagenes, peptido portador, o cualquier combinacion de los mismos, y las instrucciones de uso del kit (p. ej., instrucciones para la 15 administracion a un sujeto). En determinadas formas de realizacion, un kit puede incluir una molecula biologicamente activa y/o un agente formador de imagenes, y/o un complejo de una molecula biologicamente activa o agente formador de imagenes y un peptido portador. En algunas formas de realizacion, el kit puede incluir un peptido portador y una etiqueta que indique que el contenido se ha de administrar a un sujeto con una molecula biologicamente activa o un agente formador de imagenes.
20 EJEMPLOS
Generalidades
Materiales:
Todos los ratones utilizados (B6SJLF1) eran hembras y se adquirieron de Jackson Laboratories. Los ratones fueron mantenidos y utilizados siguiendo un protocolo aprobado por IRB. p-galactosidasa bacteriana se adquirio de 25 Calbiochem (N° de catalogo 345788). IgG e IgM humanas se adquirieron de Sigma (Numeros de Producto I 4506 y I8260, respectivamente). El anticuerpo monoclonal 4G8 (N° de cat SIG-39220) se adquirio de Covance (Emeryville, CA). El anticuerpo del receptor de lDl era de abcam (N° de Cat ab30532).
Todos los peptidos se sintetizaron en la Instalacion Mayo Proteomic Core
Preparacion del complejo de peptido-protema para la administracion al cerebro: La cantidad requerida del 30 peptido y la protema se mezclaron en un volumen final de 300 pL de PBS (solucion salina tamponada con fosfato), y se incubo a temperatura ambiente durante 60 minutos. La mezcla se sometio a vortice durante unos pocos segundos, cada quince minutos durante el periodo de incubacion.
La mezcla se inyecto por via intravenosa en forma de un bolo en el lumen de la vena femoral. Esto se logro utilizando un cateter PE50 estirado por calor. A la conclusion del experimento, el raton fue sacrificado con una dosis 35 letal de pentobarbital de sodio. Cada uno de los ratones fue perfundido con 10 mL de PBS. Esta perfusion se logro a traves del metodo transcardial estandar. Se extrajo el cerebro del craneo y se coloco para practicar un corte coronal inicial a -2,0 mm del bregma. Subsiguientemente, se cortaron secciones coronales de 25 pm en un criostato y se colocaron en portaobjetos cargados para la tincion de la actividad p-galactosidasa.
Tincion para la actividad de la enzima beta-galactosidasa: Una evaluacion de la actividad enzimatica de p40 galactosidasa se llevo a cabo mediante una fijacion inicial durante 15 minutos de las secciones de cerebro en glutaraldetndo al 0,25%. Los portaobjetos se lavaron con 3 cambios de PBS durante 5 minutos cada uno y luego se enjuagaron en agua destilada durante 5 minutos. Las secciones de cerebro se incubaron en disolucion de trabajo X- Gal (al 0,2%), pH 7,38, durante 18 horas a 37 C en recipientes tapados. Despues de esta incubacion las secciones se deshidrataron y se aplicaron cubreobjetos.
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Formacion de imagenes por microSPECT: Se llevaron a cabo experimentos micro SPECT/CT en un Sistema Gamma Medica SPECT X (GE Healthcare). IgG (Sigma) e IgM (Sigma) humanas se marcaron a una alta actividad espedfica utilizando el metodo cloramina-T. 80 jg (500 jCi) de cada una de las inmunoglobulinas (corresponde a 0,53 nanomoles de IgG y a 0,13 nanomoles de IgM, asumiendo pesos moleculares de 150 Kd y 600 Kd para IgG e IgM, respectivamente) se mezclaron con un exceso molar de 70 veces de K16ApoE (SEQ ID NO: 22) (segun se requiera para el experimento) durante 1 hora a temperatura ambiente y se administraron a cada uno de los ratones mediante el uso de un cateter en la vena femoral. Inmediatamente despues de la inyeccion en bolo intravenosa, se obtuvieron imagenes de cada uno de los ratones cada hora durante un total de 6 horas. Al completarse el tiempo de 6 horas, cada uno de los ratones fue sacrificado y el suministro de sangre sistemica se perfundio de forma transcardial con 10 mL de solucion salina tamponada con fosfato, y se represento en imagenes despues de 30 minutos.
Ejemplo 1 - Administracion de IgG radiomarcada a traves de la BBB
Se evaluo la administracion de IgG radiomarcada traves de la BBB en diferentes regiones del cerebro en ratones con y sin el peptido K-^ApoE (SEQ ID NO 22). Ademas, se examino la integridad de la BBB despues de la administracion de IgG con K-^ApoE (SEQ ID NO 22). 3 jmol de 125I-IgG se mezclaron con cantidades variables del peptido K-^ApoE (SEQ ID NO 22) (0 - 55 jmol) y la mezcla se inyecto por via intravenosa en los ratones. 131 I-IgG no complejada con el peptido se inyecto en los mismos animales en 59 minutos y se dejo que circulara durante 1 minuto despues de la inyeccion en la vena femoral inicial de 125I-IgG + K-^ApoE (SEQ ID NO 22). La captacion de 125I-IgG e131I-IgG se midieron en diferentes areas del cerebro despues de 60 minutos.
Tabla 1.
PSx106 (ml/g/s)
IgG, 3 pmol +ApoE, 8 pmol +ApoE, 16 pmol +ApoE, 32 pmol +ApoE, 55 pmol
Cortex
0,13+- 0,02 0,30 0,47 9,58 15,30
Caudado
0,09+-0,01 0,35 0,86 16,65 22,60
Hipo
0,17+-0,02 0,58 1,05 12,52 20,90
Talamo
0,13+-0,02 0,29 1,37 19,60 21,00
Bulbo raqrndeo
0,20+-0,02 0,45 1,64 22,90 18,40
Cerebelo
0,15 +-0,02 0,48 0,72 13,43 21,60
Vp (ul/g)
Cortex
13,53+-0,98 21,39 21,22 16,41 25,59
Caudado
8,53+-0,52 14,44 11,67 12,89 20.10
Hipo
15,13+-2,35 17,49 16,95 12,67 21,83
Talamo
13,79+-1,09 19,96 21,00 18,34 26,92
Bulbo raqrndeo
22,32+-1,51 19,02 31,50 20,54 34,60
Cerebelo
20,79+-1,24 21,28 23,74 19,79 24,31
N (n° de ratones)
4 2 2 2 1
Los valores de PS reflejan la cantidad de 125I-IgG que ha atravesado la BBB, mientras que los valores Vp indican la cantidad de 131 I-IgG en la BBB, pero que no ha atravesado la BBB.
Tal como se muestra en la Tabla 1, los valores de PS con IgG sola son muy pequenos para todas las regiones del cerebro, lo que indica muy poco transporte de la IgG a traves de la BBB. Sin embargo, los valores aumentaron significativamente (~ 100 veces en 55 jmol de K-^ApoE (SEQ ID NO: 22)) con cantidades crecientes del peptido de administracion.
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Por otro lado, los valores Vp permanecieron practicamente sin cambios en todas las regiones del cerebro examinadas, lo que indica que 1311-IgG no pudo atravesar la BBB (ya que no estaba complejada con el peptido), y avalando la nocion de que la BBB no fue danada debido a la exposicion previa al peptido (durante la administracion de125I-IgG complejada con Ki6ApoE (SEQ ID NO: 22).
Ejemplo 2 - Administracion de IgG alexa asistida por KisApoE (SEQ ID NO: 22) en el cerebro
En este experimento, IgG488Alexa se inyecto en ratones con o sin mezcladura con el peptido Ki6ApoE (SEQ ID NO: 22). Se realizaron secciones del cerebro 1 hora despues de la administracion. Tal como se muestra en la FIG. 1, el agente complejado muestra un contraste significativamente mas brillante y la mejora de las estructuras del cerebro en comparacion con la IgG488Alexa no complejada.
Ejemplo 3 - Administracion de peptido ApoE (sin resto Kis (SEQ ID NO: 4)) a traves de la BBB y union del peptido a los receptores de LDL
Los experimentos evaluaran el peptido ApoE (sin el resto K16 (SEQ ID NO: 4)) que atraviesa la BBB y si se unira a/localizara en receptores de LDL (LDLR) expresados en el cerebro. Un peptido ApoE marcado con FITC se sintetizara y se inyectara a ratones. Se recogeran muestras de cerebro despues de 1 hora tras la inyeccion, y se prepararan laminas con secciones de cerebro de 10 micras de espesor. Las laminas se tineran con anticuerpo contra LDLR y se evaluaran para determinar si las senales para LDLR y el peptido ApoE estan co-localizadas.
Ejemplo 4 - Ubicacion de KisApoE (SEQ ID NO: 22) despues de la administracion a traves de la BBB
Los experimentos determinaran la ubicacion de la administracion de protemas por parte del peptido portador (K16ApoE (SEQ ID NO: 22)) dentro del cerebro. Conjugado de K^ApoE (p. ej., SeQ ID NO: 22) + IgG Alexa (fluorescencia verde) se preparara mezclando disoluciones de cada uno a las concentraciones deseadas e incubando la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. El complejo se inyectara a ratones y muestras del cerebro se recogeran al cabo de 1 hora. Las laminas se prepararan como antes, y se inmunoteniran para GFAP, calbindina y neuregulina. Si se observa una ubicacion conjunta de IgG y GFAP, este resultado puede indicar que la IgG administrada alcanzo los astrocitos. La ubicacion conjunta de IgG y calbindina o neuregulina, sin embargo, puede indicar que la IgG administrada alcanzo las neuronas.
Ejemplo 5 - Integridad comprometida de la BBB por parte de KisApoE (SEQ ID NO: 22)
Estos experimentos evaluaran si el K^ApoE (p. ej., SEQ ID NO: 22), solo o despues de la formacion de un complejo, compromete la integridad de la BBB. Se preparara n complejo con K^ApoE (SEQ ID NO: 22) + lgGAlexa Rojo y se inyectara a ratones. Despues de 1 hora se inyectara lgG Alexa Verde no complejado. Se recogeran muestras de cerebro 1 hora despues de la segunda inyeccion, y se prepararan laminas utilizando secciones de 10 micras. Las secciones se visualizaran utilizando microscopfa confocal. En otros ratones, se implementara lo contrario el enfoque experimental utilizando lgG Alexa Verde complejado con K^ApoE (SEQ ID NO: 22) e lgG Alexa Rojo no acomplejado. Si el peptido no compromete la BBB, entonces solo se vera una fluorescencia roja en las celulas en el cerebro. Sin embargo, si el peptido compromete la BBB, entonces se veran tanto la fluorescencia roja como la verde, y viceversa.
Ejemplo S - Evaluacion de microSPECT
Una maquina microSPECT puede representar en imagenes y cuantificar la radiactividad en diversos tejidos en los animales vivos bajo anestesia. Si K^ApoE (SEQ ID NO: 22) de hecho porta una protema (radiactiva) a traves de la BBB, entonces debena haber mas radiactividad en el cerebro de ratones a los que se inyecto un complejo peptido- protema de este tipo que en el cerebro de ratones a los que se inyecto la protema radiactiva sola.
IgG 4,1 (un anticuerpo contra la protema precursora de amiloide (APP)) fue radioyodada. IgG4.1 sola o previamente complejada con K^ApoE (SEQ ID NO: 22) se inyecto en un cierto numero de ratones. Los ratones se anestesiaron y el cerebro se represento en imagenes con una maquina microSPECT a intervalos de 1 hora. La perfusion se realizo para algunos ratones despues de seis horas de formacion de imagenes cuantitativa, seguido de formacion de imagenes despues de 30 minutos.
La radiactividad medida en cada instante para cada uno de los ratones se represento graficamente frente al tiempo (FIG. 2). Siete animales se utilizaron en total, que se numeran M3-M9. Los ratones M3 y M4 no fueron perfundidos. Dos ratones (M5 y M7) que recibieron IgG 4.1 fueron perfundidos despues de 6 horas de la formacion de imagenes, y tres ratones (M6, M8 y M9) recibieron la IgG complejada con el peptido de administracion fueron perfundidos 5 despues de 6 horas de la formacion de imagenes, seguido de la formacion de imagenes a las 6,5 horas.
Es claro a partir de los datos presentados en la FIG. 2 que se registro ~ 2 veces mas radiactividad en los cerebros de ratones a los que se administro la IgG complejada con el peptido que la IgG sola. Esta diferencia aumento a casi 5 veces cuando se perfundieron los animales.
La radiactividad en los cerebros de los ratones que recibieron IgG sola indicaba que moleculas de IgG fueron 10 retenidas en los capilares. La acumulacion incrementada de radiactividad en los cerebros de los ratones que recibieron la IgG complejada con el peptido de administracion indicaba que IgG estaba presente en los capilares, asf como que habfa atravesado la BBB y estaba retenida en el cerebro. Si la IgG atraviesa la BBB y es retenida en celulas del cerebro, entonces la perfusion de los cerebros debena eliminar IgGs en los capilares, pero las IgGs que han atravesado la BBB debenan aun quedar retenidas, lo cual es esencial para los ratones M6, M8 y M9, 15 proporcionando un fuerte indicio de que el peptido ayuda a transportar la protema (IgG) a traves de la BBB en el
cerebro.
Ejemplo 7 - Administracion de protema a traves de la BBB
Para evaluar el potencial de K16ApoE (SEQ ID NO: 22) para administrar una protema a traves de la BBB, la enzima p-galactosidasa se inyecto en ratones con o sin mezcladura previa con K16ApoE (SEQ ID NO: 22) (a una relacion 20 molar de protema a peptido de 1:70). El experimento se repitio mas de una docena de veces. En esta serie de experimentos, se observo una intensa actividad de p-galactosidasa en el cerebro de ratones cuando se inyecto la mezcla de enzima-peptido y rodajas de cerebro se prepararon para la tincion de la actividad enzimatica 6 horas despues de la inyeccion, mientras que no se observo actividad alguna cuando la enzima se inyecto sola (FIG. 3A). Exploraciones de alto aumento de las imagenes de las secciones tenidas con p-galactosidasa en el cerebro 25 demostraron que la enzima fue administrada en practicamente todas las zonas del cerebro y tino tanto astrocitos como neuronas, sin embargo, las celulas piramidales en el hipocampo mostraron una tincion mucho mas debil para la actividad de p-galactosidasa en comparacion con celulas en otras zonas del cerebro. La debil tincion de la actividad de p-galactosidasa en las celulas piramidales no parece ser debida a la baja expresion de LDLR en el hipocampo de raton, ya que las celulas en esta region exhiben una fuerte tincion inmunohistoqmmica para el 30 receptor. Se especula que, o bien X-gal o 5-bromo-4-cloroindol, o ambos, se separan de alguna manera por lixiviacion fuera de esta region mas rapidamente que otras regiones del cerebro, resultando una debil senal para la actividad de p-galactosidasa.
Para evaluar si la administracion de p-galactosidasa en el cerebro a traves de K16ApoE (SEQ ID NO: 22) esta mediada por LDLR, tambien se evaluo la tincion de p-galactosidasa en hngado, cerebro, rinon, corazon y pulmon 35 despues de la inyeccion de la enzima con y sin mezcladura con K16ApoE (SEQ ID NO: 22). La tincion mas intensa se observo en el fngado y el cerebro, seguido de la tincion en el pulmon, corazon y rinon (FIG. 3B-G). Este patron de absorcion de beta-galactosidasa por parte de K16ApoE (SEQ ID NO: 22) en diversos organos sigue aproximadamente el modelo de patron de expresion LDLR resenado, sugiriendo que la administracion de p- galactosidasa a traves de K16ApoE (SEQ ID NO: 22) es mediada por LDLR.
40 Ejemplo 8 - Administracion de IgG e IgM utilizando K16ApoE (SEQ ID NO: 22)
Dado que muchas protemas potencialmente terapeuticas contra enfermedades asociadas con el cerebro son inmunoglobulinas, se evaluo la administracion de IgG e IgM a traves K16ApoE (SEQ ID NO: 22) en cerebro de raton mediante formacion de imagenes por microtomograffa computarizada por emision de foton unico (microSPECT). Para ello, IgG humana (Sigma, producto n° I 4506) e IgM humana (Sigma, producto n° I 8260) radioyodadas se 45 mezclaron con K16ApoE (SEQ ID NO: 22) y se inyectaron por via intravenosa. Animales anestesiados se sometieron a continuacion a la formacion de imagenes durante 6 horas a intervalos de 1 hora. A continuacion, se realizo una perfusion cardiaca, despues de lo cual la formacion final de imagenes se hizo a los 30 minutos postperfusion. Los resultados de estos experimentos proporcionan una serie de indicaciones (FIG. 4): En primer lugar, parece que la administracion pico tanto de IgG como de IgM en el cerebro ocurre alrededor de 2 horas post- 50 inyeccion de la mezcla de peptido-protema, despues de lo cual la absorcion de las protemas en el cerebro se mantiene relativamente sin cambios hasta 6 horas (instante maximo sometido a ensayo). En segundo lugar, la perfusion cardiaca parece separar la mayor parte de la protema radiactiva en la vasculatura, aumentando de forma
concomitante la diferencia entre la absorcion aparente en el cerebro de la protema con y sin el peptido portador (~ 5 veces). Finalmente, los resultados sugieren que aproximadamente el 1% de las inmunoglobulinas inyectadas son transportadas al cerebro por parte de K16ApoE (SEQ ID NO: 22) bajo la condicion experimental. Es interesante observar que el grado de administracion de la IgG e IgM radiomarcadas en rinon, tngado/bazo y corazon 5 permanecieron practicamente invariables independientemente de que las protemas fueran administradas con o sin el peptido portador. La perfusion cardfaca tampoco cambio la acumulacion de radiactividad en estos organos, lo que implica que el transporte de las protemas en estos organos no depende de atravesar una barrera biologica.
Ejemplo 9 - Eficacia de producto terapeutico administrado
Por su actividad, la p-galactosidasa no necesita unirse con cualquier entidad molecular en el cerebro. Sin embargo, 10 para todos los propositos terapeuticos, la molecula administrada al cerebro debe ser capaz de reconocer y unirse con su molecula diana cognata. Para someter a ensayo esta premisa, un anticuerpo contra el peptido beta amiloide (4G8 de Cavance) se administro a traves de K16ApoE (SEQ Id NO: 22) en los cerebros de ratones que modelan la enfermedad de Alzheimer. Este anticuerpo se conoce para reconocer placas beta amiloides. Los resultados indican que el anticuerpo administrado de esta manera marco las placas amiloides en el cerebro de estos ratones, asf como 15 identifico las placas con el anticuerpo a traves de inmunohistoqmmica estandar (FIG. 5). Resultados similares tambien se obtuvieron con otro anticuerpo (4.1 IgG, 32) conocido para marcar estas placas.
Ejemplo 10 - Transporte de protemas sin dano a la BBB
Un transportador que transporta de manera eficiente una protema en el cerebro no debena hacerlo alterando la integridad de la BBB. Para evaluar si K16ApoE (SEQ ID NO: 22) altera la integridad de la BBB, el peptido fue 20 inyectado primero por via intravenosa, despues se inyecto la p-galactosidasa a diferentes intervalos de tiempo. Los ratones de control recibieron la enzima mezclada con el peptido. Los ratones fueron perfundidos y sacrificados 6 horas despues de la inyeccion de p-galactosidasa, se hicieron rodajas de cerebro y se prepararon para la tincion con p-galactosidasa. Los resultados presentados en la FIG. 6 muestran una actividad de p-galactosidasa cada vez mas debil en los cerebros de los ratones que recibieron p-galactosidasa a los 1, 5 y 10 minutos despues de la inyeccion 25 de K16ApoE (SEQ ID NO: 22) y ninguna tincion visible a partir de entonces. Estos resultados indican que la mayor parte del K16ApoE (SEQ ID NO: 22) inyectado se une con protemas y celulas en la circulacion, y esta union se completa virtualmente en el espacio de 10 minutos, despues de lo cual no permanece en circulacion K16APoE (SEQ ID NO: 22) alguno. K16ApoE (SEQ ID NO: 22) libre que queda en momentos tempranos se une con beta- galactosidasa y porta a la enzima en el cerebro. El peptido por sf mismo y/o unido con protemas/celulas de la sangre 30 no parece afectar a la BBB, dado que no se observo actividad alguna de la enzima p-galactosidasa en el cerebro durante 10 min a 4 horas.
Ejemplo 11- Necesidad del enlace covalente de la cadena de aminoacidos hidrofilos y el peptido portador
La necesidad de la union covalente de los restos peptfdicos K16 (SEQ ID NO: 4) y ApoE (SEQ ID NO: 13) se evaluo para el transporte no covalente de una protema a traves de la BBB. Para ello, la p-galactosidasa se mezclo, ya sea 35 con el peptido ApoE, el peptido K16 (SEQ ID NO: 4), ApoE mas K16 (SEQ ID NO: 4) o con K16ApoE (SEQ ID NO: 22), y se inyecto a ratones. Las secciones del cerebro de estos ratones muestran una tincion con p-galactosidasa sola en laminas de ratones que recibieron p-galactosidasa mezclada con K16ApoE (SEQ ID NO: 22), lo que indica la union de los restos peptfdicos K16 (SEQ ID NO: 4) y ApoE es fundamental para el transporte de una protema de una manera no covalente (FIG. 7).
40 Ejemplo 12 - Ensayo de peptidos ApoE mutantes para su potencial como transportadores no covalentes de las protemas a traves de la bBb
p-galactosidasa se mezclo con cantidades iguales de diversos transportadores de peptidos y se inyecto a ratones. Se prepararon laminas utilizando secciones de 25 pm de los cerebros de los ratones una hora despues de la inyeccion, seguido por el desarrollo de la tincion de la enzima (FIG. 8). Se evaluaron los siguientes peptidos:
45 A: KKKK KKKK KKKK KKKK LRLR LANH LRKL RKRL LRDA (SEQ ID NO: 126);
B: KKKK KKKK KKKK KKKK LRLR LASH LRKL RKRL LRDL (SEQ ID NO: 127);
C: KKKK KKKK KKKK KKKK LRVR LANH LRKL RKRL LRDL (SEQ ID NO: 128).
5
10
15
20
25
30
35
40
Tal como se muestra en la FIG. 8, el mutante A era peor que el agente de barrera hematoencefalica ApoE de tipo salvaje, mientras que los mutantes B y C eran capaces de transportar la p-galactosidasa al menos tan bien como el tipo salvaje o mejor.
Ejemplo 13 - Curso en el tiempo para la administracion de p-galactosidasa en cerebro de raton con K16ApoE (SEQ ID NO: 22)
En cada uno de los ratones, 1,38 nanomoles de p-galactosidasa se mezclaron con 89 nanomoles de K16ApoE (SEQ ID NO: 22) y se inyectaron por via intravenosa. Rodajas de cerebro de 25 pm se prepararon para la tincion para la actividad de p-galactosidasa en los instantes indicados (FIG. 9). La Figura 8 proporciona los siguientes instantes:
A- Beta-galactosidasa, sin peptido, 6 h.
B- Beta-galactosidasa + peptido, 1 h.
C- Beta-galactosidasa + peptido, 2 h.
D- Beta-galactosidasa + peptido, 5 h.
E- Beta-galactosidasa + peptido, 10 h.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> MAYO FOUNDATION FOR MEDICAL EDUCATION AND RESEARCH
<120> ADMINISTRACION NO COVALENTE, MEDIADA POR PEPTIDOS, DE AGENTES ACTIVOS A TRAVES DE LA BARRERA HEMATOENCEFALICA
<130> 07039-0947W01
<140> PCT/US2010/041924 <141>
<150> 61/225,412 <151>
<160> 143
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211>4 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 1
Lys Lys Lys Lys 1
<210>2 <211>8 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico
5
10
15
20
25
30
<400>2
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5
<210>3 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 3
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10
<210> 4 <211> 16 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 4
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
<210> 5 <211>4 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 5
Arg Arg Arg Arg 1
<210> 6 <211>8 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 6
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
5
10
15
20
25
30
35
<210>7 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400>7
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 15 10
<210>8 <211> 16 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 8
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 15 10 15
<210>9 <211>4 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 9
Lys Arg Lys Arg 1
<210> 10 <211>4 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 10
Lys Lys Lys Arg 1
<210> 11 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 11
Lys Lys Lys Arg Arg Arg Lys Lys Lys Arg Arg Arg 15 10
<210> 12 <211> 16 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 12
Lys Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Lys Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg 15 10 15
<210> 13 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 13
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Ala 20
<210> 14 <211> 40 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 14

Ser Ser Val lie Asp Ala Leu Gin Tyr Lys Leu Glu Gly Thr Thr Arg 15 10 15

Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu Ala Thr Ala Leu Ser Leu Ser 20 25 30

Asn Lys Phe Val Glu Gly Ser His 35 40
<210> 15 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
5 <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<220>
<221> MOD_RES <222> (36)..(36)
10 <223> Tyr o un derivado deTyr
<400> 15
Tyr Pro Ala Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 15 10 15
Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30
Arg Gin Arg Xaa 35
<210> 16 <211> 34 15 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <220>
20 <221> MOD_RES
<222> (34)..(34)
<223> Tyr o un derivado de Tyr
<400> 16
Ala Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Ser 15 10 15
Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gin 20 25 30
Arg Xaa
25 <210> 17
<211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
30 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
5
10
15
20
25
<220>
<221> MOD_RES <222> (36)..(36)
<223> Tyr o un derivado de Tyr
<400> 17
Tyr Pro Ser Asp Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp 15 10 15
Leu Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr lie Asn Leu lie Thr 20 25 30
Arg Gin Arg Xaa 35
<210> 18 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<220>
<221> MOD_RES <222> (36)..(36)
<223> Tyr o un derivado de Tyr
<400> 18
Ala Pro Leu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asp Ala Thr Pro Glu Gin 15 10 15
Met Ala Gin Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr lie Asn Met Leu Thr 20 25 30
Arg Pro Arg Xaa 35
<210> 19 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 19
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20
5
10
15
20
25
<210> 20 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 20
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His 15 10 15
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25
<210> 21 <211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 21
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg 15 10 15
Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala
20 25 30
<210> 22 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 22
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
<210> 23 <211> 40 <212> PRT
5
10
15
20
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 23
Lys Lys Lys Lys Lys lays Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 20 25 30
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 35 40
<210> 24 <211> 44 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<400> 24
Lys Lys Lys Lys Ser Ser Val lie Asp Ala Leu Gin Tyr Lys Leu Glu 15 10 15
Gly Thr Thr Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu Ala Thr Ala 20 25 30
Leu Ser Leu Ser Asn Lys Phe Val Glu Gly Ser His 35 40
<210> 25 <211> 48 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 25
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Ser Val lie Asp Ala Leu Gin 15 10 15
Tyr Lys Leu Glu Gly Thr Thr Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys 20 25 30
Leu Ala Thr Ala Leu Ser Leu Ser Asn Lys Phe Val Glu Gly Ser His 35 40 45
<211> 52 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
5 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<400> 26

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Ser Val lie 15 10 15

Asp Ala Leu Gin Tyr Lys Leu Glu Gly Thr Thr Arg Leu Thr Arg Lys 20 25 30

Arg Gly Leu Lys Leu Ala Thr Ala Leu Ser Leu Ser Asn Lys Phe Val 35 40 45
Glu Gly Ser His 50
<210> 27 <211> 56 10 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 27

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 1 5 10 15

Ser Ser Val lie Asp Ala Leu Gin Tyr Lys Leu Glu Gly Thr Thr Arg 20 25 30

Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu Ala Thr Ala Leu Ser Leu Ser 35 40 45

Asn Lys Phe Val Glu Gly Ser His 50 55
<210> 28 <211> 60 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 28
5
10
15
20
25
30
35

Lys Lys Lys Lys Ser Scr Val lie Asp Ala Leu Gin Tyr Lys Leu Glu 20 25 30

Gly Thr Thr Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu Ala Thr Ala 35 40 45

Leu Ser Leu Ser Asn Lys Phe Val Glu Gly Ser His 50 55 60
<210> 29 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <220>
<221> MOD_RES <222> (3)..(3)
<223> Ala, Leu, Ser o Val
<220>
<221> MOD_RES <222> (5)..(5)
<223> Leu o Met
<220>
<221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ala o Ser
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)..(7)
<223> Asn, Ser o Thr
<220>
<221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Lys o Asn
<220>
<221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Leu, Met o Val
<220>
<221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Arg o Pro
<220>
<221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Leu o Met
5 <220>
<221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Ala o Leu
<400> 29
Leu Arg Xaa Arg Xaa Xaa Xaa His Leu Arg Xaa Xaa Xaa Lys Arg Leu 15 10 15
Xaa Arg Asp Xaa 10 20
<210> 30 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
15 <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 30
Leu Arg Ser Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Ala 20
<210> 31 20 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico 25 <400> 31
Leu Arg Val Arg Met: Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Ala 20
<210> 32 <211> 20 <212> PRT
30 <213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 32
Leu Arg Val Arg Leu Ala Thr His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Ala 20
<210> 33 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 33
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Fro Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Ala 20
<210> 34 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 34
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Met Arg Asp Ala 20
<210> 35 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Leu Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Ala 20
<210> 36 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 36
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Val Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Ala 20
<210> 37 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 37
Leu Arg Val Arg Met: Ser Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Ala 20
<210> 38 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 38
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Val Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Ala 20
<210> 39 <211> 20
5
10
15
20
25
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 39
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Met Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Ala 20
<210> 40 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 40
Leu Arg Ala Arg Met Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Ala 20
<210> 41 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 41
Leu Arg Val Arg Leu Ser Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Met Arg Asp Ala 20
<210> 42 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 42
5
10
15
20
25
Leu Arg Ser Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Met Arg Asp Ala 20
<210> 43 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 43
Leu Arg Val Arg Leu Ser Ser His Leu Pro Lys Leu Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Ala 20
<210> 44 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 44
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Met Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Met Arg Asp Ala 20
<210> 45 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 45
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Leu Pro Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Ala 20
<210> 46
5
10
15
20
25
<211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 46
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Ser Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20
<210> 47 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 47
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Ser Arg Leu Ala Ser His 15 10 15
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25
<210> 48 <211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 48
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Ser Arg 15 10 15
Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25 30
<210> 49 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<400> 49
Leu Arg Ser Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
<210> 50 <211> 40 5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 50

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15

Lys Lys Lys Lys Leu Arg Ser Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 20 25 30

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 10 35 40
<210> 51 <211> 24 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial 15 <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 51

Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Met Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20
<210> 52 20 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico
5
10
15
20
25
<400> 52
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25
<210> 53 <211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 53
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg 15 10 15
Met Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25 30
<210> 54 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 54
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Val Arg Met Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
<210> 55 <211> 40 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Met Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 20 25 30
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 35 40
<210> 56 <211> 24 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 56
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Thr His Leu Arg Lys Leu 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20
10 <210> 57
<211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico
<400> 57
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Thr His 15 10 15
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25
<210> 58 <211> 32 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
Leu Ala Thr His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25 30
<210> 59 <211> 36 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 59
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Val Arg Leu Ala Thr His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
10 <210> 60 <211> 40 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<400> 60

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15

Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Thr His Leu Arg Lys Leu 20 25 30

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 35 40
<210> 61 <211> 24 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 61
5
10
15
20
25
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 15 10 15
Pro Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20
<210> 62 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 62
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His 15 10 15
Leu Arg Lys Leu Pro Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25
<210> 63 <211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 63
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg 15 10 15
Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Pro Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25 30
<210> 64 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 64
5
10
15
20
25
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Pro Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
<210> 65 <211> 40 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 65

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu

20 25 30
Pro Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala

35 40
<210> 66 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 66
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 20
<210> 67 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 67
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 20 25
<210> 68 <211> 32 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 68
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg 15 10 15
Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 20 25 30
10 <210> 69
<211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<400> 69
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Met Arg Asp Ala 35
<210> 70 <211> 40 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
5
10
15
20
25
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 20 25 30
Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 35 40
<210> 71 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 71
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Leu 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20
<210> 72 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 72
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His 15 10 15
Leu Arg Asn Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25
<210> 73 <211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25 30
<210> 74 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 74
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
<210> 75 <211> 40 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 75

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15

Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Leu 20 25 30

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 35 40
<210> 76 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 76
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20
<210> 77 <211> 28 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 77
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His 15 10 15
Leu Arg Lys Val Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25
10 <210> 78
<211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<400> 78
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg 15 10 15
Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Val Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25 30
<210> 79 <211> 36 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Val Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
<210> 80 <211> 40 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 80

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15

Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Val 20 25 30

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 35 40
10 <210> 81 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico
<400> 81
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Met Ser Ser His Leu Arg Lys Leu 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20
<210> 82 <211> 28 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25
<210> 83 <211> 32 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 83
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg 15 10 15
Met Ser Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25 30
10 <210> 84
<211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<400> 84
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Val Arg Met Ser Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
<210> 85 <211> 40 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
5
10
15
20
25
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Met Ser Ser His Leu Arg Lys Leu 20 25 30
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 35 40
<210> 86 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 86
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Val 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20
<210> 87 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 87
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His 15 10 15
Leu Arg Asn Val Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25
<210> 88 <211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 88
imagen2
10
15
20
<210> 89 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 89
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Val Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
<210> 90 <211> 40 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 90
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Val 20 25 30
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 35 40
<210> 91 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 91
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Met 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20
5
10
15
20
25
<210> 92 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 92
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His 15 10 15
Leu Arg Asn Met Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25
<210> 93 <211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 93
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg 15 10 15
Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Met Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25 30
<210> 94 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 94
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Met Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
<210> 95 <211> 40 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 95

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15

Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Met 20 25 30

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 35 40
<210> 96 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 96
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Ala Arg Met Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20
<210> 97 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 97
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Ala Arg Met Ala Ser His 15 10 15
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25
<210> 98 <211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 98
Met Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25 30
<210> 99 <211> 36 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 99
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Ala Arg Met Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
10 <210> 100 <211> 40 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<400> 100

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15

Lys Lys Lys Lys Leu Arg Ala Arg Met Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 20 25 30

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 35 40
<210> 101 <211> 24 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ser Ser His Leu Arg Lys Leu 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 20
<210> 102 <211> 28 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 102
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ser Ser His 15 10 15
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 20 25
10 <210> 103
<211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<400> 103
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg 15 10 15
Leu Ser Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 20 25 30
<210> 104 <211> 36 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
5
10
15
20
25
Leu Arg Val Arg Leu Ser Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Met Arg Asp Ala 35
<210> 105 <211> 40 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 105

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15

Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ser Ser His Leu Arg Lys Leu 20 25 30

Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 35 40
<210> 106 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 106
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Ser Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 20
<210> 107 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 20 25
<210> 108 <211> 32 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 108
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Ser Arg 15 10 15
Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 20 25 30
10 <210> 109
<211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<400> 109
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Ser Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Met Arg Asp Ala 35
<210> 110 <211> 40 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Ser Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 20 25 30
Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 35 40
<210> 111 <211> 24 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 111
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ser Ser His Leu Pro Lys Leu 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20
10 <210> 112 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico
<400> 112
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ser Ser His 15 10 15
Leu Pro Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25
<210> 113 <211> 32 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
5
10
15
20
25
Lys
Lys
Lys
Lys
Lys
Lys
Lys
Lys
Lys
Lys
1
5 10
Leu
Ser Ser His Leu Pro Lys Leu Arg Lys
20
25
Lys Lys Leu Arg Val Arg 15
Arg Leu Leu Arg Asp Ala 30
<210> 114 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 114
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Val Arg Leu Ser Ser His Leu Pro Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
<210> 115 <211> 40 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 115
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ser Ser His Leu Pro Lys Leu
20
25
30
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 35 40
<210> 116 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico
<400> 116
5
10
15
20
25
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Met 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 20
<210> 117 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 117
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His 15 10 15
Leu Arg Lys Met Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 20 25
<210> 118 <211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 118
Lys Lys Lys Lys 1
Leu Ala Ser His 20
Lys 5
Lys Lys >1 h-1 Lys Lys 10
Leu
Arg Lys Met Arg 25 Lys
Lys Lys Leu Arg Val Arg 15
Arg Leu Met Arg Asp Ala 30
<210> 119 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Met Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Met Arg Asp Ala 35
<210> 120 <211> 40 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 120

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15

Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Met 20 25 30

Arg Lys Arg Leu Met Arg Asp Ala 35 40
10 <210> 121 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico
<400> 121
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Leu 15 10 15
Pro Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20
<210> 122 <211> 28 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
Lys 1
Lys Lys Lys Lys 5 Lys Lys Lys Leu Arg 10
Leu
Arg Asn Leu 20 Pro Lys Arg Leu Leu 25 Arg
imagen3
<210> 123 <211> 32 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 123
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg 15 10 15
Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Leu Pro Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 20 25 30
10 <210> 124
<211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<400> 124
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Leu Pro Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
<210> 125 <211> 40 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
5
10
15
20
25
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn Leu 20 25 30
Pro Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala 35 40
<210> 126 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 126
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Leu Arg Leu Ala Asn His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Ala 35
<210> 127 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 127
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Leu Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Leu 35
<210> 128 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
5
10
15
20
25
<400> 128
Leu Arg Val Arg Leu Ala Asn His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Leu 35
<210> 129 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 129
Leu Arg Leu Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Leu 20
<210> 130 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 130
Leu Arg Val Arg Leu Ala Asn His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 15 10 15
Leu Arg Asp Leu 20
<210> 131 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Leu Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Leu 20
<210> 132 <211> 28 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 132
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Leu Arg Leu Ala Ser His 15 10 15
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Leu 20 25
10 <210> 133
<211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<400> 133
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Leu Arg 15 10 15
Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Leu 20 25 30
<210> 134 <211> 36 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
Leu Arg Leu Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Leu 35
<210> 135 <211> 40 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 135

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15

Lys Lys Lys Lys Leu Arg Leu Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 20 25 30

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Leu 35 40
10 <210> 136
<211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico
<400> 136
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Asn His Leu Arg Lys Leu 15 10 15
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Leu 20
<210> 137 <211> 28 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Leu 20 25
<210> 138 <211> 32 <212> PRT
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 138
10
Lys Lys Lys Lys 1
Leu Ala Asn His
Lys Lys Lys Lys Lys Lys 5 10
Leu Arg Lys Leu Arg Lys
Lys Lys Leu Arg Val Arg 15
Arg Leu Leu Arg Asp Leu
imagen4
<210> 139 <211> 36 <212> PRT
15 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <400> 139
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 15 10 15
Leu Arg Val Arg Leu Ala Asn His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 20 25 30
Leu Arg Asp Leu 35
20 <210> 140
<211> 40 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
25 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<400> 140
5
10
15
20
25
30
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Asn His Leu Arg Lys Leu 20 25 30
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Leu 35 40
<210> 141 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Peptido sintetico <400> 141
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Leu Arg Lys Leu Arg Lys 15 10 15
Arg Leu Leu Arg 20
<210> 142 <211> 40 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(20)
<223> El aminoacido hidrofilo y esta region pueden abarcar 4 a 20 residuos
<220>
<221> MOD_RES <222> (23)..(23)
<223> Ala, Leu, Ser o Val
<220>
<221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Leu o Met
<220>
<221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Ala o Ser
<220>
<221> MOD_RES <222> (27)..(27)
5
10
15
20
25
30
35
<223> Asn, Ser o Thr
<220>
<221> MOD_RES <222> (31)..(31)
< 223> Lys o Asn
<220>
<221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Leu, Met o Val
<220>
<221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Arg o Pro
<220>
<221> MOD_RES <222> (37)..(37) <223> Leu o Met
<220>
<221> MOD_RES <222> (40)..(40)
<223> Ala o Leu
<220>
<223> vease la memoria descriptiva tal como se ha presentado para una descripcion detallada de sustituciones y formas de realizacion preferidas
<400> 142

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Arg Xaa Arg Xaa Xaa Xaa His Leu Arg Xaa Xaa 20 25 30

Xaa Lys Arg Leu Xaa Arg Asp Xaa 35 40
<210> 143 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Polipeptido sintetico <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(50)
<223> El aminoacido hidrofilo y esta region pueden abarcar 4 a 50 residuos
5
10
15
20
25
30
35
40
<220>
<221> MOD_RES <222> (53)..(53)
<223> Ala, Leu, Ser o Val
<220>
<221> MOD_RES <222> (55)..(55)
<223> Leu o Met
<220>
<221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> Ala o Ser
<220>
<221> MOD_RES <222> (57)..(57) <223> Asn, Ser o Thr
<220>
<221> MOD_RES <222> (61)..(61)
< 223> Lys o Asn
<220>
<221> MOD_RES <222> (62)..(62) <223> Leu, Met o Val
<220>
<221> MOD_RES <222> (63)..(63) <223> Arg o Pro
<220>
<221> MOD_RES <222> (67)..(67) <223> Leu o Met
<220>
<221> MOD_RES <222> (70)..(70)
<223> Ala o Leu
<220>
<223> vease la memoria descriptiva tal como se ha presentado para una descripcion detallada de sustituciones y formas de realizacion preferidas
400> 143

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    1. Un peptido portador, que comprende la secuencia:
    Xn - [B]m
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde:
    X es un aminoacido hidrofilo;
    B es un agente de barrera hematoencefalica; n es un numero entero de 4 a 50; y m es un numero entero de 1 a 3,
    en donde el agente de barrera hematoencefalica comprende una secuencia de polipeptidos que tiene al menos una identidad de la secuencia de 80% con:
    L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 13).
  2. 2. El peptido portador de la reivindicacion 1, en donde cada uno de los X se elige independientemente de arginina, asparagina, acido aspartico, acido glutamico, glutamina, histidina, lisina, serina, treonina y tirosina, o en donde n se elige de 4, 8, 12, 16 y 20, o en donde m es 1.
  3. 3. El peptido portador de la reivindicacion 1, en donde el polipeptido es de menos de 100 aminoacidos de longitud.
  4. 4. El peptido portador de la reivindicacion 1, en donde el peptido portador se elige de:
    K-K-K-K-L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 19); K-K-K-K-K-K-K-K-L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO:20); K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-L-R-V R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO:21); K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO:22); K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO:23).
  5. 5. Un complejo o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, que comprende una molecula biologicamente activa o un agente formador de imagenes asociado con el peptido portador de una de las reivindicaciones precedentes.
  6. 6. El complejo de la reivindicacion 5, en donde el agente formador de imagenes se elige de: 125I-IgG y magnevist.
  7. 7. El complejo de la reivindicacion 5, en donde la molecula biologicamente activa se elige de un/una: polipeptido; oligonucleotido; plasmido; molecula pequena; anticuerpo; fragmento de anticuerpo; hidrato de carbono; polisacarido; lfpido; glicolipido; antfgeno; y peptido antigenico, en particular en donde el oligonucleotido se elige de un/una: secuencia de ADN codificante; secuencia de ADN antisentido; ARNm, secuencia de ARN antisentido; ARNi; y ARNsi, o en donde la molecula pequena es un agente terapeutico.
  8. 8. El complejo de la reivindicacion 5, en donde la molecula biologicamente activa o el agente formador de imagenes esta unido de forma no covalente al peptido portador.
  9. 9. Un complejo o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, que comprende un agente biologicamente activo asociado con un peptido portador, en donde el peptido portador comprende la secuencia:
    Xn - [B]m
    en donde:
    X es un aminoacido hidrofilo;
    B es un agente de barrera hematoencefalica;
    n es un numero entero de 4 a 50; y m es un numero entero de 1 a 3,
    en donde el agente de barrera hematoencefalica comprende una secuencia de polipeptidos que tiene al menos una identidad de la secuencia de 80% con: L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 13), para uso en el 5 tratamiento de trastorno cerebral, en particular, en donde el trastorno cerebral se elige de: meningitis, epilepsia, esclerosis multiple, neuromielitis optica, tripanosomiasis neurologica de fase tardfa, Parkinson, leucoencefalopatfa multifocal progresiva, enfermedad de De Vivo, enfermedad de Alzheimer, encefalitis por VIH y el cancer.
  10. 10. Un metodo de formar imagenes del sistema nervioso central de un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto un complejo o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, que comprende un agente biologicamente 10 activo asociado con un peptido portador, en donde el peptido portador comprende la secuencia:
    Xn - [B]m
    en donde:
    X es un aminoacido hidrofilo;
    B es un agente de barrera hematoencefalica;
    15 n es un numero entero de 4 a 50; y m es un numero entero de 1 a 3; y formar imagenes del sistema nervioso central del sujeto,
    en donde el agente de barrera hematoencefalica comprende una secuencia de polipeptidos que tiene al menos una identidad de la secuencia de 80% con: L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 13).
    20 11. Una composicion farmaceutica que comprende un complejo o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,
    que comprende una molecula biologicamente activa o un agente formador de imagenes, un peptido portador y un soporte farmaceuticamente aceptable, en donde el peptido portador comprende la secuencia:
    Xn - [B]m
    en donde:
    25 X es un aminoacido hidrofilo;
    B es un agente de barrera hematoencefalica; n es un numero entero de 4 a 50; y m es un numero entero de 1 a 3;
    en donde el agente de barrera hematoencefalica comprende una secuencia de polipeptidos que tiene al menos una 30 identidad de la secuencia de 80% con: L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 13).
  11. 12. Un kit que comprende un peptido portador, en donde el peptido portador comprende la secuencia:
    Xn - [B]m
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde:
    35 X es un aminoacido hidrofilo;
    B es un agente de barrera hematoencefalica; n es un numero entero de 4 a 50; y m es un numero entero de 1 a 3;
    en donde el agente de barrera hematoencefalica comprende una secuencia de polipeptidos que tiene al menos una 40 identidad de la secuencia de 80% con: L-R-V-R-L-A-S-H-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-A (SEQ ID NO: 13),
    en donde el kit comprende, ademas, una molecula biologicamente activa o un agente formador de imagenes.
    imagen1
    imagen2
    Actividacl Regional
    ■'•HGG4.1 MS
    ApoE K16 T
    -IGG4.1 MS
    .......ApoE K16 f.
    -a-IGGd i Mr
    > —ApoE K16 r.
    ApsE K16 n
    3 Horas 4
    FIG. 2
    imagen3
    FIG. 3
    CO
    imagen4
    imagen5
    FIG. 5
    imagen6
    imagen7
    imagen8
    imagen9
ES10800456.5T 2009-07-14 2010-07-14 Administración no covalente, mediada por péptidos, de agentes activos a través de la barrera hematoencefálica Active ES2562463T3 (es)

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