ES2560432T3

ES2560432T3 - Células no símicas para el desarrollo del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS)

Info

Publication number: ES2560432T3
Application number: ES08727607.7T
Authority: ES
Inventors: Federico A. Zuckermann
Original assignee: University of Illinois
Current assignee: University of Illinois
Priority date: 2007-01-12
Filing date: 2008-01-11
Publication date: 2016-02-19
Anticipated expiration: 2028-01-11
Also published as: CA2675139A1; EP2106440A2; US8663984B2; US20140162362A1; US20160115452A1; BRPI0806697B1; DK2106440T3; BRPI0806697B8; WO2008089094A2; US9169465B2; MX2009007457A; AR064888A1; EP2106440B1; US8202717B2; WO2008089094A3; CA2675139C; US20120231540A1; BRPI0806697A2; US20110177118A1; WO2008089094A9

Abstract

Célula macrófaga alveolar porcina fetal aislada capaz de reproducir el virus del PRRS, donde la célula es ZMAC-1, un depósito en la American Type Culture Collection designado como depósito de patente ATCC N.º PTA-8764 o un derivado del mismo, o una variante de célula inmortalizada o un derivado de dicha célula, donde dicha célula derivada de la misma, variante o derivado es capaz de reproducir el virus del PRRS.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

[0042] Cuando se utiliza en el presente documento, el término “célula” se puede referir a una entidad biológica como se entendería en la técnica y que pretende abarcar entidades específicas que se pueden describir como una célula primaria o una línea celular. Cuando se utilizan varios de estos términos en el presente documento, un experto en la materia entenderá que dicha utilización es meramente para fines de enfatizar bien las distinciones

5 entendidas. Por ejemplo, la expresión “una célula o línea celular” puede enfatizar el contraste entre un aislado primario original frente a una versión inmortalizada que podría ser un derivado directo del aislado primario original.

[0043] Cuando se utiliza en el presente documento, el término “aislado” se refiere a un estado manipulado que es diferente al que es el estado natural y/o se modifica en relación con un material inicial, en cuyo caso el término

10 pretende ser coherente con el concepto de ser purificado. Por ejemplo, una célula primaria aislada se extirpa de un tejido natural u otra fuente en un organismo huésped y se mantiene separada de la fuente original. Como ejemplo adicional, un componente celular se puede colocar en cultivo o separarse de manera adicional de una muestra basada en fluido de lavado pulmonar, consiguiendo de esta manera una célula relativamente aislada.

[0044] Cuando se utiliza en el presente documento, el término “purificado” se refiere a una condición en la que

15 ha habido un enriquecimiento, una separación y/o una eliminación relativa de una sustancia en relación con un material inicial. El término puede abarcar las condiciones de una purificación al menos parcial y no implica necesariamente un estado absoluto de pureza. Por ejemplo, el término se puede aplicar a una célula que sea capaz de reproducir un virus del PRRS y que esté presente en un cultivo mixto e independientemente se puede aplicar a lo que normalmente se puede considerar un cultivo puro. El término se puede aplicar a un cultivo celular

20 primario que es opcionalmente un cultivo mixto. El término se puede aplicar a una línea celular.

[0045] En un modo de realización, la invención proporciona una línea celular macrófaga alveolar porcina fetal que es capaz de soportar el desarrollo del PRRSV. Una composición a modo de ejemplo descrita en el presente documento es una línea celular no símica. Las composiciones concretas descritas en el presente documento incluyen una célula o población celular obtenida de muestras de pulmón fetal porcino. Una composición adicional

25 descrita en el presente documento incluye un macrófago alveolar porcino fetal. En un modo de realización, la invención proporciona métodos para desarrollar el PRRSV en una célula o línea celular macrófaga alveolar porcina fetal.

[0046] La invención se puede entender de manera adicional mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLO 1. El aislado de célula no símica UIMAC FBAL-A es capaz de soportar el desarrollo del PRRSV.

30 [0047] La línea celular macrófaga alveolar porcina UIMAC FBAL-A se derivó del pulmón de un feto porcino de 45 días mediante lavado broncoalveolar con medio de cultivo. El cultivo inicial se expandió in vitro desde unos pocos miles de células iniciales hasta varios millones durante un periodo de 6 meses. En ese momento, se llevaron a cabo experimentos para medir el desarrollo del virus del PRRS. Estos experimentos mostraron que las células FBAL-A fueron capaces de soportar la replicación del virus. Este aislado no se transformó deliberadamente y

35 demostró además una capacidad de desarrollarse y propagarse en cultivo y un fenotipo para la capacidad de soportar la infectividad y el desarrollo del virus del PRRS.

[0048] Las condiciones del cultivo celular fueron como sigue. Medio de cultivo: RPMI 1640 complementado con L-glutamina y 25 mM de HEPES. El medio se complementó con aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, gentamicina y suero fetal bovino al 10 %. Las células se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 % a una humedad del 40 100 %. Para la superficie del cultivo se utilizaron placas de 6 pocillos de grado para cultivo de tejidos. Se utilizó un volumen de cultivo de 4-6 ml de medio de cultivo/pocillo. Para los pases, se seleccionaron las células por ser no adherentes o poco adherentes. Cada 3-4 días se retiró una parte de las células del cultivo con la ayuda de una pipeta Pasteur y una pera de succión suspendiendo suavemente las células en el fluido de cultivo y transfiriendo 1/3 del volumen del pocillo a un nuevo pocillo. El nuevo pocillo y el pocillo original se alimentaron

45 con medio nuevo.

[0049] La Figura 1 ilustra el desarrollo de cepas atenuadas del PRRSV PrimePac y Syva en UIMAC FBAL-A. Los resultados demuestran que se pueden utilizar las células porcinas para producir el virus para la vacuna contra el PRRS en cantidades suficientes para la producción de vacunas.

[0050] Las células porcinas aisladas se pueden identificar y/o aislar mediante la expresión de determinadas

50 moléculas de superficie. El patrón de expresión de las moléculas de superficie se puede utilizar para aislar otras células porcinas independientes o para seleccionar líneas celulares como indicadores potenciales para la capacidad de soportar el desarrollo del PRRSV. Por ejemplo, las células se seleccionaron opcionalmente para la expresión de CD163. En un ejemplo concreto, las células o líneas celulares se sometieron a técnicas de tinción y/o separación debido a las moléculas de superficie celular.

55 [0051] La Figura 2 ilustra el fenotipo de las células UIMAC-FBAL-A incluyendo la expresión de los marcadores de superficie de células macrófagas características. Las células FBAL-A expresan CD14, CD163 y CD172. La molécula de proteína CD163 es indicativa del linaje monocito/macrófago y se correlaciona con la tolerancia de

7

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

PRRS natural. También se tomaron muestras en estos momentos para los animales sin tratamiento previo con el virus del PRRS a los que no se les provocó el virus. El nivel de carga viral en el suero se determinó realizando una titulación en las células MARC-145 y después se hizo el promedio. Los datos representan el nivel medio de viremia para cada grupo. La proporción al lado de los símbolos indica el número de cerdos virémicos

5 (numerador) y el número total de cerdos por grupo (denominador).

[0094] Figura 8. Carga viral en el lavado broncoalveolar de cerdos después de la exposición al virus del PRRS natural. Se recogió el lavado broncoalveolar de los pulmones de los cerdos sin tratamiento previo con el virus del PRRS y previamente inmunizados a los 10 días después de la provocación con el aislado NADC-20 del virus del PRRS natural. También se obtuvieron muestras en este momento de animales sin tratamiento previo con el virus

10 del PRRS a los que no se les provocó el virus. El nivel de carga viral en el lavado broncoalveolar de cada animal se determinó realizando una titulación en las células MARC-145.

Análisis

[0095] La observación de que la línea celular utilizada para desarrollar la misma cepa de la vacuna de MLV del PRRS puede mejorar el nivel de inmunidad protectora producida por este producto contra un virus del PRRS 15 virulento genéticamente divergente tiene importantes implicaciones para desarrollar una vacuna altamente efectiva contra este patógeno. A saber, los resultados de este estudio sugieren que la eficacia de una vacuna del virus de MLV del PRRS no se determina solo, como se suele creer, por su similitud genética con respecto al virus de provocación, sino que también influye la manera en que se produce. Una interpretación razonable de las observaciones descritas anteriormente es que las propiedades biológicas del virus de la vacuna se modificaron

20 de manera positiva simplemente desarrollándose en células ZMAC-1. Por consiguiente, se desarrolló una respuesta inmune protectora más efectiva en los animales vacunados. De esta manera, los resultados de este estudio demuestran que se puede crear una vacuna de MLV más efectiva contra el virus del PRRS.

Referencias para el Ejemplo 5

[0096]

25 Harms, P.A., Sorden, S.D., Halbur, P.G., Bolin, S.R., Lager, K.M., Morozov, I., Paul, P.S. 2001. Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected with type 2 porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet Pathol. 38:528-39.

Hill, H., M. JA, K. JJ, H. A, y R. C. 2004. PRRS Control: To Hell and Back. American Assoc Swine Veterinarians, Des Moines, lowa, EE.UU. Marzo 6-9, 2004:369-376.

30 Mengeling, W. L., K. M. Lager, y A. C. Vorwald. 1999. Safety and efficacy of vaccination of pregnant gilts against porcine reproductive and respiratory syndrome. Am J Vet Res 60:796-801.

Mengeling, W. L., A. C. Vorwald, K. M. Lager, y S. L. Brockmeier. 1996. Comparison among strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus for their ability to cause reproductive failure. Am J Vet Res 57:834-9.

35 Osorio, F. A., F. Zuckermann, R. Wills, W. Meier, S. Christian, J. Galeota, y A. Doster. 1998. PRRSV: comparison of commercial vaccines in their ability to induce protection against current PRRSV strains of high virulence. Allen D. Leman Swine Conference 25:176-182.

Kwon, B., Ansari, I.H., Osorio, F.A, Pattnaik, A.K. 2006. Infectious clone-derived viruses from virulent and vaccine strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus mimic biological properties of their

40 parental viruses in a pregnant sow model. Vaccine. 24:7071-80.

Schnitzlein, W.M., Zuckermann, F.A. 1998. Determination of the specificity of CD45 and CD45R monoclonal antibodies through the use of transfected hamster cells producing individual porcine CD45 isoforms. Vet Immunol Immunopathol. 60:389-401.

Zuckermann, F.A., Schnitzlein, W.M., Thacker, E., Sinkora, J., Haverson, K. 2001. Characterization of

45 monoclonal antibodies assigned to the CD45 subgroup of the Third International Swine CD Workshop. Vet Immunol Immunopathol. 80:165-74.

Zuckermann, F.A, Alvarez Garcia, E., Diaz Luque, I., Christopher-Hennings, J., Doster, A., Brito, M., Osorio,

F. 2007. Assessment of the efficacy of commercial porcine reproductive and respiratory syndrome virus

(PRRSV) vaccines based on measurement of serologic response, frequency of gamma-IFN-producing cells 50 and virological parameters of protection upon challenge. Vet Microbiol. 123:69-85.

14

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

Claims

imagen1