ES2560253T3 - Métodos y aparatos para análisis de sistemas acuáticos químicos y/o biológicos - Google Patents

Abstract

Un método de analizar el comportamiento de un sistema que comprende una muestra química y/o biológica en un medio líquido, comprendiendo el método: un primer ciclo que comprende: - una primera etapa de reacción que comprende permitir que la muestra química y/o biológica reaccione en un reactor durante un tiempo de la etapa de la primera reacción (t1) en un sistema cerrado en un medio líquido; y - una primera etapa de toma de muestras que comprende las etapas secuenciales de: (i) combinar y homogeneizar sustancialmente un primer líquido de compensación de peso y composición predeterminados conocidos con el medio líquido; y (ii) separar una porción del medio líquido homogeneizado para su análisis; y un segundo ciclo que comprende: - una segunda etapa de reacción que comprende permitir que la muestra química y/o biológica reaccione en el reactor durante un tiempo de la etapa de la segunda reacción (t2) en un sistema cerrado en el medio líquido resultante del primer ciclo; y - una segunda etapa de toma de muestras que comprende las etapas secuenciales de: (i) combinar y homogeneizar sustancialmente un segundo líquido de compensación de peso y composición predeterminados conocidos con el medio líquido procedente del segundo ciclo; y (ii) separar una porción del medio líquido homogeneizado para su análisis.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y aparatos para analisis de sistemas acuaticos qulmicos y/o biologicos

La presente invencion se refiere a metodos y aparatos para analisis de sistemas llquidos, particularmente sistemas acuaticos qulmicos y/o biologicos.

La mayorla de los quimiostatos “tradicionales” son biorreactores que funcionan como un reactor continuo tipo tanque agitado (CSTR). Un volumen dado de llquido esta contenido en una unidad de reactor bien agitado. En este medio de cultivo (bacterias, algas, celulas en cultivo, etc.) se produce biomasa. El sistema se estabiliza a lo largo del tiempo: (1) eliminando el exceso de la biomasa producida y subproductos, y (2) anadiendo productos qulmicos (nutrientes, oxlgeno, alimento, etc.) que son consumidos por los organismos vivos. Hay una entrada continua de aditivos y una salida correspondiente de productos (como el volumen del reactor es constante, los caudales de entrada y salida son iguales). Tanto el caudal de entrada/salida como la composition del agua de entrada se ajustan de modo que la composicion qulmica del agua en el interior del reactor agitado se mantiene estable. Esto se hace automaticamente midiendo la calidad del agua a la salida y ajustando la cantidad de aditivos como corresponda. Usualmente, la biomasa tambien se mantiene constante. Esto se regula midiendo la densidad de celulas en el reactor y cambiando el caudal de entrada/salida para diluir mas o menos el medio de cultivo hasta estabilizar la biomasa al nivel deseado en el interior del reactor (denominado estado de regimen del biorreactor).

Dicho sistema es conveniente y eficiente para producir biomasa viva y permite el calculo del balance de biomasa para productos qulmicos dados que, a su vez, pueden estimular procesos biologicos, como el crecimiento, respiration, fotoslntesis, etc. El balance de materia para un producto qulmico dado, por ejemplo O2, representado como C en un reactor continuo tipo tanque agitado idealmente es:

imagen1

formula en la que Fin y Fout son respectivamente caudales de entrada y salida, [C]in y [C]out son concentraciones del producto qulmico considerado a la entrada y salida*, Vreactor es el volumen de la unidad del reactor, v, es el coeficiente estequiometrico de C en la reaction i que se produce en el quimioestato y r, es la velocidad de la reaction i. En el caso de un reactor de volumen constante, Fin = Fout y como se trata de un quimiostato, se supone que el producto qulmico no varla significativamente con el tiempo, esto es:

dC

it

(suponiendo, por supuesto, que el sistema automatico de regulacion es eficiente). La ecuacion se simplifica resultando:

r /T^l F/™*1 \ . \."* % 7 ...

1ln ' \ iVJoaf v reactor * yi *1 i

i

En esta ultima ecuacion, el miembro de la izquierda es un balance de entrada y salida de C en el sistema y el miembro de la derecha es un balance de todas las reacciones que se producen en el interior del quimiostato, esto es, una cuantificacion del flujo neto de C entre los organismos vivos que crecen en el quimiostato y el agua circundante. Por ejemplo, para organismos que solo respiran (no realizan fotoslntesis), el balance de entrada y salida de oxlgeno es una buena estimation de la velocidad de respiracion de los organismos vivos en el interior del quimiostato. As! es posible estimar la respiracion usando tres mediciones hechas en las aguas de entrada y salida: Fin, [C]in y [C]out. La concentration de productos qulmicos puede ser determinada de diversos modos (electroqulmica, colorimetrla, etc.). En el caso de oxlgeno, se puede hacer usando electrodos de oxlgeno Clark, u optodos, colocados en las aguas de entrada y salida, y conectados a oxlmetros. Medir el caudal es un poco mas delicado. Hay diversos sistemas y todos son costosos o relativamente inexactos. Otra option podrla ser usar una bomba de flujo constante muy precisa (muy costosa y tambien no conveniente para regular el flujo y, por lo tanto, la biomasa en el interior del reactor). Asl, en la practica, se observa que probablemente se podrla estudiar una fuente de error que es comun a todos los quimiostatos y a todos los productos qulmicos: el error hecho en la estimacion del caudal de entrada/salida.

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(*) Hay que indicar que para un gas no es la concentracion sino la presion parcial lo que se considera en las reacciones. En este caso particular se debe leer Po2 en lugar de [O2], lo cual no cambia significativamente la explicacion.

Las ecuaciones antes desarrolladas son solo validas para reactores continuos tipo tanque agitados idealmente, esto es, reactores en los que hay un mezclado perfecto e instantaneo del agua de entrada y del llquido presente en el interior del reactor. Los sistemas reales no son ideales porque el mezclado se produce durante una cantidad medible de tiempo. Como la salida es slncrona con la entrada, resulta diflcil decir exactamente que cantidad de las adiciones a traves de la entrada se elimina a traves de la salida incluso antes de tener la posibilidad de contactar con los organismos vivos. Tambien, [C]0ut no es una buena aproximacion de [C]inside (en el interior del reactor). La integration a lo largo del tiempo de las ecuaciones que describen un sistema real que no esta mezclado de modo idealmente perfecto es diflcil y se deben considerar muchos parametros adicionales relacionados con la dinamica del fluido y el modo de mezclado en el interior del reactor. Asl, en la practica, solo se pueden usar las ecuaciones para un reactor ideal pero entonces se introducen errores que tienden a una desviacion en la cuantificacion del proceso biologico en el reactor. La importancia de la desviacion depende del tiempo de residencia del producto qulmico en el interior del reactor en funcion del tiempo de mezclado. Si el primero es 5-10 veces mayor que el segundo, la aproximacion se considera valida para ingenierla (esto es, para la production industrial de biomasa). Para investigation, en la que el objetivo es la estimation sin desviacion de los procesos, esto puede ser un problema.

El documento WO 2010/110773 A1 se refiere a un “Reactor metanogenico”, el documento US 2004/0024493 A1 describe un metodo, sistema y subsistema para procesar una reaction qulmica y el documento CN 101 709 263 A se refiere a “Dispositivo de cultivo continuo en un quimiostato”.

Un objetivo de la presente invention es proporcionar un modo practico y economicamente viable de conseguir analisis de sistemas llquidos, particularmente sistemas llquidos qulmicos y/o biologicos, con un nivel deseable de precision analltica.

De acuerdo con uno de sus aspectos, la presente invencion proporciona un metodo de analizar el comportamiento de una muestra qulmica y/o biologica en un medio llquido, por ejemplo, un medio llquido de ensayo, de acuerdo con la reivindicacion 1. De acuerdo con otro de sus aspectos, la presente invencion proporciona aparatos, por ejemplo, un aparato de ensayo, para analizar el comportamiento de un sistema, por ejemplo, un sistema de ensayo, que comprende una muestra qulmica y/o biologica en un medio llquido, de acuerdo con la reivindicacion 7. En las reivindicaciones dependientes se definen realizaciones alternativas y preferidas de la invencion.

En base a las consideraciones de que: (1) el caudal es una causa principal de error en quimiostatos y (2) se produce una desviacion en quimiostatos reales debido a la ausencia de un mezclado instantaneo perfecto, se ha disenado un reactor qulmicamente estabilizado que funciona diferentemente. En lugar de entrada y salida constantes, estas son intermitentes. El volumen del reactor es variable, por lo que es posible anadir un suplemento (denominado en lo sucesivo llquido de compensation) sin que se permita que salga llquido del reactor en una primera etapa. Despues, todo (el fluido presente en el reactor y la adicion) se mezcla durante tiempo suficiente para homogeneizar el contenido del interior del reactor. Solo entonces, se elimina del reactor un volumen similar de la mezcla por lo que se recupera el volumen inicial y se eliminan subproductos. Este modo o sistema se comporta como un reactor ideal tipo tanque agitado, pero intermitente.

Tanto la cantidad de adicion como la cantidad de llquido que se elimina se pesan. Las balanzas de laboratorio estan muy difundidas y permiten una determination muy precisa del peso de llquido anadido y eliminado despues del reactor. Otro beneficio es que la concentracion expresada en terminos ponderales, esto es, la molalidad o molinidad no varla con la temperatura. La concentracion del mismo producto qulmico expresada en terminos volumetricos (que naturalmente se obtiene por mediciones del caudal en volumen por unidad de tiempo), esto es, la molaridad, varla con la temperatura. La causa de error es baja pero puede ser significativa cuando se requieran determinaciones muy precisas.

Se puede conseguir un volumen variable usando un compartimento de gas encima del compartimento de llquido en el reactor cuyo volumen puede fluctuar. La funcion del compartimento de gas no esta limitada a este fin. Tambien es un compartimento que puede simular la atmosfera encima del sistema acuatico presente en el quimiostato y, asl, tambien se pueden simular en la unidad intercambios de gases aire-agua. Ademas, se puede usar un compartimento de gas para regular la presion parcial de oxlgeno en el interior del reactor y/o la presion parcial de uno o mas de otros gases. Como la unidad funciona intermitentemente, es una unidad cerrada durante un perlodo significativo de tiempo. Durante esta etapa, se modifica la composition qulmica del agua presente en el interior del reactor asl como cambios entre los compartimentos de gas y llquido. Al ser considerado como quimiostato, las fluctuaciones deben ser razonablemente pequenas (es decir, no mayores que el 5% de la concentracion de los productos qulmicos) y ser facilmente equilibradas una vez se hayan realizado las adiciones de llquido. Esto se puede conseguir eligiendo cuidadosamente la biomasa por unidad de reactor y el tiempo entre dos adiciones. A veces, efectos tampon ayudan

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a estabilizar el medio. Por ejemplo, el pH esta bien tamponado en agua del mar y cambia menos rapidamente debido a acumulacion de CO2 procedente de la respiracion que el oxlgeno que se consume. En un litro de agua del mar, hay 5 a 7 mg de oxlgeno disuelto; este puede ser eliminado rapidamente cuando organismos vivos respiran en una unidad cerrada. En el sistema de acuerdo con la invencion, un compartimento de gas que contiene aire permite almacenar mucho mas oxlgeno en todo el sistema: a 1 atmosfera y 20°C, hay aproximadamente 240 mg de oxlgeno en un litro de aire. Asl, un sistema compuesto de 1 litro de agua del mar y 1 litro de aire encima contiene aproximadamente 246 mg de oxlgeno en total. El mismo reactor lleno completamente de agua del mar contiene solo 12 mg de oxlgeno, esto es, mas de 20 veces menos. Si los intercambios de gases aire-agua son suficientemente rapidos (por ejemplo, cuando el llquido y el gas estan bien agitados), la concentracion de oxlgeno sera mucho mas estable en el reactor con 1 litro de agua del mar y 1 litro de aire, para la misma biomasa de organismos vivos.

El sistema preferido de acuerdo con la invencion contiene un llquido y una fase gaseosa que simula intercambios de gases aire-agua y permite una concentracion mas estable de oxlgeno (o de otros componentes gaseosos) en el agua. La estabilizacion del oxlgeno en el quimiostato tambien puede ser mediada por sustitucion intermitente de la fase gaseosa, simultanea a la sustitucion parcial de la fase llquida. Esto ultimo funciona intermitentemente, estando desacopladas en el tiempo las adiciones y eliminaciones de llquidos para asegurar que el medio esta bien mezclado antes de eliminar llquido. Asl no hay desviacion en las ecuaciones usadas para cuantificar flujos de los productos qulmicos. Finalmente, la unidad no requiere bombas de flujo fijo costosas ni caudallmetros de precision porque no es necesario medir caudales. Los llquidos que se anaden o eliminan son muestras discretas y estas muestras pueden ser pesadas con precision, originando errores mucho menores en la determinacion de entradas y salidas que en quimiostatos tradicionales. Este diseno origina un sistema que se optimiza para cuantificar flujos, incluidos los que usualmente son diflciles de medir con mucha exactitud, como el flujo neto de CO2 en un medio tamponado, por ejemplo, agua del mar, en presencia de organismos vivos y, asl, con muchos procesos diferentes que impactan sobre estos flujos (respiracion, fotoslntesis, calcificacion, nitrificacion, desnitrificacion, etc.) combinados con un sistema qulmico complejo (especies inorganicas de carbono en el agua de mar).

A continuacion se describe un ejemplo no limitativo de la invencion con referencia a las figuras siguientes:

La figura 1 que es una representacion esquematica de un aparato de acuerdo con la presente invencion,

la figura 2 que es una representacion esquematica que muestra un ciclo preferido de funcionamiento, y

la figura 3 que es una representacion esquematica de una posible disposition de un ciclo de 24 horas.

El aparato de la realization descrita puede ser considerado como un tipo especial de biorreactor que contiene un sistema acuatico qulmico o biologico en una unidad que tiene su propia atmosfera contenida. Las caracterlsticas fisicoqulmicas del compartimento acuoso estan estabilizadas y normalizadas. Cualquier intercambio entre el compartimento acuoso y el sistema qulmico o biologico en estudio puede ser monitorizado, asl como todos los intercambios de gases con la atmosfera interna en la unidad. En el ejemplo, el sistema estudia principalmente cambios objetivos en las especies qulmicas de carbono, pero tambien se puede usar para cuantificar intercambios, por ejemplo, de nitrogeno, fosforo, sllice, calcio, etc.

La figura 1 muestra un proceso general y el diagrama de instrumentation de una realizacion de un aparato conglomerado de ensayo que comprende una pluralidad de reactores individuales 11 (de los que solo se muestra uno), cada uno de los cuales contiene un sistema qulmico o biologico en estudio 50 en agua 111 y aire 112 en un recipiente transparente provisto de un agitador magnetico 14. Un soporte de reactor 12, en forma de un bano a temperatura constante 12, contiene cada reactor 11 bajo una luz artificial controlable 13 de modo que cada reactor esta sometido a condiciones externas controladas sustancialmente identicas. Cada aparato de ensayo comprende un sistema de circulation de gas 21 (en este ejemplo el gas es aire de composition conocida) que comprende una bomba de diafragma 22 que hace circular el aire en el interior del reactor 11 y aumenta los intercambios de gases en la superficie aire-agua 23 y valvulas de solenoide de estrangulamiento controlado (V1, V2, V3 y V4). Tambien, una bomba peristaltica con tuberlas autobloqueables puede sustituir a la bomba de diafragma 22 cuando se requieran condiciones esteriles.

Diversa instrumentacion opcional (en este ejemplo, una sonda de pH 24 y un sonda de oxlgeno 25) monitorizan en continuo el agua que constituye el medio llquido de ensayo. Igualmente, hay conectados analizadores de gases para analizar la fase gaseosa. En este ejemplo, un analizador infrarrojo de gases (IRGA) 41 mide la presion parcial de CO2 en una tuberla de entrada de gas 61 que se puede seleccionar a partir del aire de referencia y el gas de la atmosfera interna del reactor. Un filtro mecanico 42 protege al analizador de gases contra contamination procedente de gotitas de agua, bacterias, etc.

Cada aparato de ensayo comprende tambien una serie de bombas peristalticas de adicion/toma de muestras (P1- P4) que estan configuradas y controladas para anadir automaticamente soluciones de compensation al medio

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llquido de ensayo 111 y recoger muestras de este en el reactor 11 (con lavado correspondiente de los recipientes de las muestras).

La unidad conglomerada comprende una pluralidad (tlpicamente mas de 2 y/o menos de 12) de aparatos de ensayo que funcionan en paralelo, cada uno de los cuales se puede conectar selectivamente con los analizadores de gases, por ejemplo el IRGA 41, mediante una valvula apropiada V4.

La figura 2 muestra una representacion esquematica de un ciclo preferido de funcionamiento:

- Durante una etapa de reaccion, que se produce durante la mayor parte de este ciclo de funcionamiento, el sistema funciona como una unidad cerrada (figura 2a) en la que las valvulas V2 y V3 estan configuradas para que la bomba de diafragma 22 haga circular por un circuito cerrado al gas de referencia introducido previamente para incrementar el contacto con el medio llquido de ensayo 111 en el reactor 11. Durante esta etapa se alimenta al IRGA 41 (no se muestra) gas de referencia procedente de una fuente externa 61 para registrar una llnea de referencia con el analizador de gases.

- En un modo de adicion (figura 2b) la valvula V3 evita alimentar al IRGA 41 gas de referencia procedente de una fuente externa 61 y se para la bomba de diafragma 22 por lo que no hay circulacion forzada de gas en el interior de la unidad, pero gas procedente del interior de la unidad puede fluir libremente al IRGA 61, desplazado por la adicion de solucion de compensacion 71 procedente del recipiente 72 al reactor usando una de las cuatro bombas peristalticas (Px) en la unidad. Durante esta etapa puede fluir libremente gas de referencia 61 al recipiente 72 para evitar vaclo durante el funcionamiento. La solucion de compensacion 71 se pesa antes de su uso.

- En un modo de lavado (figura 2c) la bomba peristaltica (Px) lava el recipiente de llquido combinado de compensacion y el recipiente 72 receptor de la muestra llquida con agua llquida homogeneizada de la reaccion 111 procedente del reactor 11 gracias al funcionamiento alternante de la bomba Px en una y otra direccion. Durante esta etapa, se alimenta gas de referencia 61 al reactor 11 a un caudal suficientemente grande para obtener al termino del modo de lavado la misma o sustancialmente la misma composicion qulmica de la fase gaseosa en el reactor 11 que el gas de referencia. El gas de referencia 61 tambien puede fluir libremente al recipiente 72 para evitar una diferencia de presion encima del llquido. Opcionalmente, la bomba de diafragma 22 puede funcionar tambien para mezclar mejor la fase gaseosa en el interior del reactor 11.

- En un modo de toma de muestras (figura 2d) se recoge una muestra homogeneizada del agua llquida de la reaccion 111 mientras el gas de referencia es lavado todavla en el interior del reactor 11. Una vez completado esto, se hace retornar la unidad desde este ciclo que constituye una etapa de toma de muestras a su configuration de unidad cerrada para una etapa posterior de reaccion. El nivel de llquido en el reactor 11 vuelve a aproximadamente el mismo valor que en la figura 2a. La muestra llquida 73 recien recogida puede ser pesada para un balance exacto de materia y analizada despues con un metodo adecuado para determinar niveles de compuestos qulmicos o biologicos en el reactor 11 al termino del ciclo (por ejemplo, nutrientes, alcalinidad, carbono organico disuelto, nitrogeno o fosforo, bacterias, algas, etc.).

- El funcionamiento de la unidad es controlado por un controlador 80, preferiblemente un ordenador configurado apropiadamente.

En una disposition prototipo en la que la muestra biologica a ensayar en el medio llquido de ensayo fue un trocito del coral Seriatopora hystrix, la duration preferida de las etapas es: etapa de reaccion en la unidad cerrada (figura 2a) 3 horas y 50 minutos; etapa de adicion (figura 2b) 4 minutos; etapa de lavado (figura 2c) 2 minutos; etapa de extraction de muestras (figura 2d) 4 minutos.

La siguiente es una description mas detallada del funcionamiento de la realization ilustrada.

El aparato de ensayo es una unidad cerrada en la que durante la mayor parte del tiempo se realiza la etapa de reaccion, con las valvulas V2 y V3 desviando gas de referencia al analizador de gases, por ejemplo, al analizador IRGA de CO2 41. Todas las bombas peristalticas (P1, P2, P3, P4) estan paradas. El agitador magnetico 14 homogeneiza el agua en el interior de la unidad y la bomba de diafragma 22 mezcla aire en el interior de la unidad y aumenta los intercambios de gases agua-aire. La calidad del agua se monitoriza usando la instrumentation 24, 25 instalada en el interior del reactor 11.

Despues de permitir que un sistema qulmico y/o biologico 50 que esta en contacto con el medio llquido de ensayo reaccione durante un tiempo de reaccion predeterminado [que se calcula para permitir un cambio suficiente del gas (por ejemplo, presion parcial de O2 y CO2) para cuantificar flujos, pero no excesivo para evitar cambios fisicoqulmicos (esto es, aproximadamente 5-10% por encima o por debajo del valor de consigna podrla ser

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aceptable para la mayorla de sistemas biologicos, aunque depende del experimento particular a ensayar), se inicia una etapa de toma de muestras que comprende un ciclo de adicion/toma de muestras usando una o las cuatro bombas peristalticas P1-P4. La toma de muestras se realiza del modo siguiente.

La unidad se conmuta a su modo de adicion. La bomba de diafragma 22 se desconecta para limitar intercambios de gases agua-aire en esta etapa. Se conmuta la valvula V3 para abrir la fase gaseosa de la unidad al analizador IRGA 41 de CO2 y bloquear el suministro del aire de referencia 61. La bomba peristaltica seleccionada se activa a modo de adicion: la solucion de compensacion 71 presente en el recipiente correspondiente de llquido de compensacion se inyecta al interior del reactor 11. Esa solucion 71 se formula para compensar exactamente cambios qulmicos que se producen en la unidad entre las etapas de toma de muestras. Como se incrementa el volumen de agua en el reactor 11, el agua empuja aire desde la fase gaseosa de la unidad al analizador IRGA 41 de CO2 (efecto piston), que medira la presion parcial de CO2 de la fase gaseosa en la unidad despues de que las tuberlas y la celula de medida de infrarrojos hayan sido lavadas completamente (en una realizacion prototipo se inyectan 70-80 ml de solucion de compensacion). Las bombas peristalticas se configuran para tener un caudal que permita la inyeccion de toda la solucion de compensacion durante un tiempo que representa la mitad a dos tercios del tiempo en que la bomba esta funcionando en modo de adicion (dos a tres minutos en la realizacion prototipo mientras que el modo de adicion dura cuatro minutos). De este modo, no son necesarias bombas peristalticas de flujo exacto y todo el llquido de compensacion se inyecta con un margen durante el cual se inyecta al reactor 11 aire de referencia procedente del recipiente de llquido de compensacion. Asl, no es el caudal de la bomba lo que se usa para determinar que cantidad de la solucion de compensacion se inyecta sino la pesada de esa solucion antes de su uso (asl, una medicion que es por lo menos de un orden de magnitud mas exacto que una estimacion del caudal y tiempo).

La unidad se conmuta despues a un modo de lavado durante un tiempo de 2 minutos. La bomba peristaltica funciona tres veces durante 20 segundos en una direccion y durante 20 segundos en la otra direccion. El fondo del recipiente de llquido de compensacion se lava asl tres veces con el agua del medio llquido de ensayo procedente del reactor 11. Entretanto, el agua del medio llquido de ensayo y la solucion de compensacion se homogeneizan progresivamente en la unidad del reactor gracias al agitador magnetico 14.

En esta etapa se inicia tambien el reequilibrio de la atmosfera interna: se pone en marcha de nuevo la bomba de diafragma y se conmuta la valvula V2 para alimentar aire de referencia a la unidad.

La unidad se configura despues en modo de extraccion de muestras, que dura otros cuatro minutos. Se activa la bomba peristaltica y el recipiente de llquido combinado de compensacion y el recipiente receptor de muestras 72 se llenan completamente con una muestra 73 cuyo volumen es aproximadamente igual que el volumen de la solucion de compensacion que se habla anadido. Esto se asegura por la tuberla colectora del interior del reactor que esta sumergida en la unidad justo lo suficiente para corregir el volumen de solucion pero que se lava con aire una vez el agua llega justo por debajo del nivel requerido. De nuevo tambien, la bomba peristaltica funciona durante un tiempo un poco mayor que el tiempo requerido para recoger la muestra y expulsara del reactor justo una pequena cantidad de aire de lavado durante el tiempo restante (la atmosfera interna se lava todavla con aire de referencia a un caudal mayor que el caudal de la bomba peristaltica en este modo).

La muestra 73 es asl un homogeneizado perfecto (no un homogeneizado aproximado teorico) de (i) el agua del medio llquido de ensayo cuya composicion ha sido modificada ligeramente durante la etapa previa de la reaccion y que ha estado en contacto con el sistema qulmico y/o biologico en estudio y (ii) la solucion de compensacion que se ha anadido. Una vez mas, su cantidad no se estima por medicion del caudal sino que se mide muy exactamente pesando despues la muestra. Se puede usar para un analisis qulmico adicional (alcalinidad, calcio, amonio, nitrito, nitrato, ortofosfato, silicato, etc.).

Si la solucion de compensacion ha sido formulada correctamente, la composicion qulmica de esta muestra debe ser identica o muy proxima a valores objetivos en un quimiostato equilibrado idealmente. Como la composicion de la solucion de compensacion se anticipo usando un modelo matematico dinamico y cualquier desviacion observada en la composicion qulmica de la muestra denota una sobre- o subestimacion de esa composicion qulmica por el modelo, se tiene una validacion a tiempo real del modelo como parte constituyente del aparato y/o del propio modelo.

La etapa (y el ciclo) de toma de muestras se termina cuando la unidad se configura de nuevo como una unidad cerrada en su configuracion de etapa de reaccion parando la bomba peristaltica e invirtiendo las valvulas V2 y V3. Puede empezar entonces un nuevo ciclo, que usara otra de las cuatro bombas peristalticas y recipientes de solucion de compensacion, con otra solucion de compensacion lista para ser inyectada.

Todo el sistema ilustrado en esta realizacion tiene asl una autonomla de cuatro ciclos. En este prototipo, se dispone el sistema qulmico y/o biologico para que cada ciclo dure cuatro horas sin un cambio demasiado grande en la composicion qulmica del llquido y del medio gaseoso de ensayo en el interior del reactor. De este modo, la unidad

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tiene una autonomla de 16 horas fuera de la jornada laboral y todavla se aproxima satisfactoriamente a un entorno ideal estatico qulmicamente, a pesar de las correcciones hechas a intervalos de tiempo discretos. Durante la jornada laboral, se realizan dos ciclos adicionales con las bombas P1 y P2 despues de recoger todas las muestras y formular otras soluciones de compensacion (vease la figura 3). Esto completa un perlodo de tiempo de 24 horas. Deja tambien suficiente tiempo de trabajo para que un tecnico analice todas las muestras recogidas. Antes del termino de la jornada laboral se recogen las dos muestras y se formulan todas las soluciones de compensacion para completar un estudio de 24 horas. Esto significa que se tienen seis muestras en 24 horas y, con un perlodo de luz de 12 horas, se tienen dos muestras recogidas exactamente cuando se apaga o enciende la luz: dos muestras adicionales recogidas con luz natural y dos muestras adicionales recogidas en la oscuridad. Se puede usar esta configuracion para evaluar como se comporta el sistema bajo un ciclo circadiano, que incluye quizas cambios durante el dla y/o la noche (una caracterlstica clave del dispositivo para sistemas biologicos con grandes variaciones que se podrlan esperar en un ciclo de 24 horas).

La figura 3 ilustra intervalos de toma de muestras de 4 horas (configuracion usada en el prototipo) que puede proporcionar tiempo de resolucion suficiente en un ciclo circadiano para cuantificar como varlan ciertos procesos, por ejemplo, fotoslntesis, respiracion, calcificacion, etc., durante el dla, incluidas las fases de luz y de oscuridad. Usando 4 bombas distintas (cada una para completar un ciclo individual), se puede programar un ciclo corto con 2 bombas P1 y P2 durante la jornada laboral y otro ciclo largo con las cuatro bombas P1-P4 hasta el dla siguiente. En la figura 3 las flechas muestran que muestras se recogen, y usando que bomba, al termino de cada ciclo completo. Tambien se pueden calcular diferentemente las soluciones de llquido de compensacion, dependiendo de la hora del dla en que se anadiran.

Hay que indicar que el error en los flujos netos durante varios ciclos no es mayor que la suma de errores de cada ciclo, que se mantienen al mlnimo por diseno. Para un tiempo de resolucion menor, pero con una precision mayor durante un perlodo largo, se pueden reunir y analizar juntas varias muestras sucesivas. Por otro lado, durante ciclos sucesivos se acumulan errores ligeros en el calculo por el modelo de las diversas soluciones de compensacion, originando una deteccion mejor de discrepancias todavla ligeras entre el modelo y el sistema real qulmico y/o biologico en estudio. Este diseno se optimiza tambien para medir con mayor precision flujos netos y balances netos que actualmente se miden por otros medios o balanceando ecuaciones que contienen varias mediciones, y en las que los errores tienden a acumularse en una extension mucho mayor en la estimacion final. Por ejemplo, aqul no se calcula el flujo neto crucial de CO2 entre el agua de la reaccion del medio llquido de ensayo y el aire de la fase gaseosa en el contexto de investigaciones sobre la acidificacion de los oceanos, sino que se mide directamente con la mayor precision en nuestro sistema artificial con el analizador IRGA de CO2 una vez por ciclo cuando se realiza la etapa de toma de muestras. Los cambios observados en la Pco2 del aire son las acumulaciones de intercambios de aire-agua que se producen a lo largo de un ciclo (menos el tiempo requerido para la adicion - lavado - toma de muestras, que es justo 10 minutos en el prototipo) cuando la unidad funciona como unidad cerrada. Ademas, se usa el mismo IRGA para medir selectivamente el aire del gas de referencia y el gas de referencia alternativamente, minimizando mas el error en la cuantificacion de cambios de Pco2 entre los dos gases.

El sistema se destina particularmente al estudio de sistemas acuaticos qulmicos y/biologicos. Las aplicaciones posibles incluyen pero sin caracter limitativo:

- Procedimiento experimental para estudiar propiedades qulmicas de cristales de carbonato calcico en agua del mar. La qulmica de la disolucion y precipitacion de carbonato calcico en agua del mar es muy compleja y muy distinta de un sistema ideal. Hay varias formas diferentes de cristales de carbonato calcico (aragonito, calcita, calcita magnesica, carbonato calcico precipitado qulmica o biologicamente) y muchos iones que pueden interferir en la precipitacion o disolucion de dichos cristales en agua del mar, incluidos, pero sin caracter limitativo, estroncio y ortofosfato. El carbonato calcico esta muy sobresaturado (entre 3 y 5 veces) en el agua superficial del mar, pero la acidificacion del agua podrla originar un cambio notable en el estado de sobresaturacion del agua del mar, o incluso una subsaturacion en aguas del Antartico cerca del 2100. El sistema permite un estudio comodo y exacto de la qulmica del carbonato calcico en agua del mar

- El sistema se puede usar como tipo de respirometro sofisticado y muy exacto. Un respirometro es una camara en la que se cuantifica la respiracion (y, por lo tanto, el metabolismo) de organismos vivos. Los respirometros simples son completamente cerrados y permiten mediciones de la respiracion solo durante un perlodo de tiempo corto (no es posible un estudio completo de 24 horas). Los respirometros mas complejos funcionan en sistemas abiertos, pero son mucho menos precisos porque adolecen de las mismas causas de errores de medicion que los quimiostatos tradicionales (por ejemplo, la estimacion del oxlgeno consumido depende de la precision en la estimacion de caudales y en la falsa suposicion de que la solucion es instantaneamente una mezcla perfecta en el respirometro). En comparacion, la invencion se puede usar para una medicion precisa del consumo de oxlgeno (o de la produccion de dioxido de carbono) en la respiracion y para mediciones repetidas a lo largo de un perlodo de tiempo de 24 horas o incluso mayor.

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- El sistema se puede usar como dispositivo experimental para investigar el impacto de la acidificacion de los oceanos sobre organismos vivos, para lo que fue disenada en principio la aplicacion. Todos los parametros, como volumen y tamano de la unidad, volumen de la fase gaseosa de la atmosfera atrapada, tiempo entre dos ciclos sucesivos y volumen de cada adicion y de la muestra, se someten a una seleccion apropiada de acuerdo con el sistema biologico en estudio.

- El sistema se puede usar para cultivar bacterias, protistas, hongos, fitoplancton, zooplancton, etc., en condiciones fisicoqulmicas especificadas y para monitorizar su crecimiento y cambios fenotlpicos en estas condiciones. Se pueden concebir dos aplicaciones objetivos principales: (1) como en aplicaciones anteriores, el dispositivo se puede usar como unidad experimental para investigaciones en estudios ecofisiologicos y (2) el dispositivo se puede usar para medir con precision el modo en que funciona el sistema biologico para disenar mejor quimiostatos industriales, gracias a la caracterizacion completa y precisa de flujos entre el sistema biologico y los medios llquido y gaseoso.

- El sistema se puede usar tambien para cultivar celulas suspendidas en un medio llquido cuando se requiera una cuantificacion precisa de los intercambios entre las celulas y el medio llquido y/o la fase gaseosa. Esto es util en situaciones experimentales en los campos de la fisiologla, medicina, veterinaria o ecologla.

- El sistema biologico tambien puede comprender sedimentos y, en este caso, se pueden estudiar los intercambios entre los sedimentos, los organismos vivos y el medio llquido. Por ejemplo, se pueden caracterizar flujos entre sedimentos procedentes del fondo del mar o del fondo de un rlo o lago y el agua. Esto puede incluir estudios ecotoxicologicos en los que, usando dicho dispositivo, se pueden evaluar con precision el secuestro o liberation de sustancias toxicas, como metales pesados, PCB, hidrocarburos, etc., en los sedimentos y/o en los organismos vivos.

- Tambien se pueden usar radioisotopos estables en las soluciones de compensation y/o en el gas de referencia para seguir mejor flujos especlficos en el sistema. Por ejemplo, el gas de referencia puede estar compuesto de aire en el que N2 (mas de 99% en aire) ha sido sustituido por N2. Los flujos de N2 dentro de los organismos biologicos cuantifican la fijacion de nitrogeno. Por otro lado, los flujos de 14N2 en el aire cuantifican procesos de desnitrificacion. Estos dos flujos se pueden medir con el presente dispositivo, permitiendo una medicion directa de la fijacion de nitrogeno o de la desnitrificacion, una tarea apenas posible actualmente con otro sistema.

Mas ejemplos de aplicabilidad industrial del sistema seran evidentes inmediatamente a los expertos.

Por ejemplo, una de las consecuencias del incremento de CO2 en la atmosfera es un desplazamiento del equilibrio del carbono inorganico en los oceanos, que origina la denominada acidificacion de los oceanos (neutralization parcial del pH alcalino del agua del mar). Desde el inicio de la era industrial, el pH del agua del mar ha descendido aproximadamente 0,1 unidades y se espera un descenso adicional de 0,2-0,3 unidades el siglo proximo, y as! sucesivamente. Actualmente es cierto que este descenso del pH tiene un impacto sobre la vida acuatica. Este descenso impacta sobre la velocidad de la calcification y la velocidad de la fotoslntesis, as! como tambien sobre otras reacciones bioqulmicas que son sensibles al pH extracelular. El horizonte de la saturation del carbonato calcico (tanto aragonito como calcita) es la profundidad en la que la correspondiente forma de carbonato calcico esta en equilibrio en el agua del mar. Por encima, el agua esta sobresaturada y favorece la precipitation (principalmente por acrecion por organismos vivos). Por debajo, el carbonato calcico se disuelve por erosion qulmica en las profundidades de los oceanos. Estos horizontes de saturacion se producen a profundidades mayores y menores cuando disminuye el pH del agua del mar. Debido al gran numero de efectos potenciales sobre la fisiologla de plantas, animales y microbios marinos, a sus efectos indirectos sobre los ecosistemas globales y a cambios en el estado qulmico global relativos a la precipitacion y disolucion del carbonato calcico, todavla no esta claro cuantos entornos acuaticos quedaran impactados a gran escala por este descenso del pH. Esto es actualmente el campo de investigaciones intensivas por parte de la comunidad cientlfica.

En este contexto, es importante saber que sistema actua como sumidero (consume mas carbono inorganico que el que produce) o como fuente (lo contrario). En realidad, las acciones posibles para limitar el incremento de CO2 en la atmosfera incluyen la gestion de recursos que favorezcan sumideros contra fuentes de carbono inorganico en el planeta Tierra. Esto requiere la cuantificacion y el conocimiento agudo del ciclo del carbono en nuestro planeta. Si un sistema qulmico y/o biologico actua como sumidero o como fuente de carbono inorganico no es facil de cuantificar porque esto es el resultado de varios flujos de carbono en direcciones opuestas (los sistemas biologicos, en particular, son muy dinamicos). El balance neto se cuantifica frecuentemente con un gran grado de incertidumbre, como el resultado neto de muchos flujos que se cuantifican individualmente con un error significativo (fotoslntesis, respiration, calcificacion, nitrification, desnitrificacion, precipitacion o disolucion qulmica, etc.). Estos errores se acumulan en las ecuaciones.

La cuantificacion mas precisa de los flujos netos de carbono es por medicion directa. En sistemas acuaticos, el sistema de la presente invention se puede usar para poner el sistema qulmico o biologico en estudio en condiciones

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tales que se puedan medir directamente y con precision los intercambios netos resultantes en la interfaz de aire- agua.

Otro objetivo del sistema es permitir el funcionamiento como quimiostato (el entorno quimico es estatico), con un control de la composicion inorganica del agua, su pH y su carga de nutrientes (para sistemas biologicos).

Un tercer objetivo es permitir la determinacion concurrente de los mecanismos mas importantes que alteran la quimica del carbono inorganico del agua y su pH en sistemas naturales, esto es, la precipitacion o disolucion de carbonato calcico, fotosintesis y respiracion, nitrificacion y desnitrificacion, intercambios en la interfaz de aire-agua, etc. El sistema de la presente invencion se puede usar para la medicion objetivo de estos mecanismos simultaneamente, con la mayor precision posible, no destructivamente y sin usar isotopos radiactivos (por ejemplo, mediciones por incorporacion de 14C). Tambien es crucial una resolution temporal: el sistema se debe mantener suficientemente estable durante unos pocos dias y varias mediciones al dia deben permitir cambios circadianos en los procesos.

Un cuarto objetivo es conseguir un buen conocimiento mecanicista de los procesos que se producen en la unidad. La investigation que se hace posible de acuerdo con la invencion se puede usar para invertir el modo usual de funcionamiento entre un sistema experimental y un modelo matematico (dinamico). Usualmente, primero se estudia un sistema experimental. Al ser un quimiostato, se requiere estabilizar la composicion quimica del medio. Esto se hace por mediciones en el agua de salida y ajuste del agua de entrada para estabilizar la concentration de los productos quimicos presentes en la unidad, independientemente del modelo matematico. Finalmente el modelo se ajusta con los datos experimentales pero nunca interacciona directamente con el modo en que esta funcionando la unidad experimental (el quimiostato). El modelo es asi un tipo de representation matematica pasiva de los cambios que se producen independientemente en la unidad experimental. Al contrario que una unidad experimental, el sistema de la presente invencion puede ser (y en algunas configuraciones debe ser) gestionado directamente por el modelo matematico. Este ultimo se usa para anticipar cambios que se pueden producir en el sistema unas pocas horas antes y para formular suplementos para obtener las correcciones requeridas. La compatibilidad del modelo con el sistema real en estudio se cuantifica por las variaciones observadas con el tiempo que se deben a una prediction incorrecta por el modelo. En tal caso, primero se debe corregir el modelo y se realiza de nuevo el experimento en el sistema hasta que se estabilice todo el sistema. En ese momento, se obtiene una validation experimental directa del modelo matematico puesto que este demuestra que se han previsto y anticipado correctamente los cambios en el sistema.

Claims (14)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de analizar el comportamiento de un sistema que comprende una muestra qulmica y/o biologica en un medio llquido, comprendiendo el metodo:

   un primer ciclo que comprende:

   - una primera etapa de reaccion que comprende permitir que la muestra qulmica y/o biologica reaccione en un reactor durante un tiempo de la etapa de la primera reaccion (t1) en un sistema cerrado en un medio llquido; y

   - una primera etapa de toma de muestras que comprende las etapas secuenciales de: (i) combinar y homogeneizar sustancialmente un primer llquido de compensation de peso y composition predeterminados conocidos con el medio llquido; y (ii) separar una portion del medio llquido homogeneizado para su analisis; y

   un segundo ciclo que comprende:

   - una segunda etapa de reaccion que comprende permitir que la muestra qulmica y/o biologica reaccione en el reactor durante un tiempo de la etapa de la segunda reaccion (t2) en un sistema cerrado en el medio llquido resultante del primer ciclo; y

   - una segunda etapa de toma de muestras que comprende las etapas secuenciales de: (i) combinar y homogeneizar sustancialmente un segundo llquido de compensacion de peso y composicion predeterminados conocidos con el medio llquido procedente del segundo ciclo; y (ii) separar una porcion del medio llquido homogeneizado para su analisis.
2. 2. Un metodo de analizar el comportamiento de un sistema de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la composicion de por lo menos uno de los llquidos de compensacion se selecciona de modo que se iguale a una composicion anticipada del medio llquido en el tiempo en el que se combinan el llquido de compensacion y el medio llquido, determinandose la citada composicion del llquido de compensacion por modelacion.
3. 3. Un metodo d analizar el comportamiento de un sistema de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que la modelacion de la composicion del llquido de compensacion incluye usar datos obtenidos de analisis del medio llquido procedente de una etapa previa de toma de muestras.
4. 4. Un metodo de analizar el comportamiento de un sistema de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el medio llquido contacta con un gas de referencia durante la etapa de reaccion.
5. 5. Un metodo de analizar el comportamiento de un sistema de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que (i) durante la etapa de reaccion se proporciona el gas de referencia en un sistema cerrado y en el que (ii) el metodo comprende analizar por lo menos una propiedad del gas de referencia de un modo destinado a determinar posibles cambios en esa propiedad inducidos durante la etapa de reaccion.
6. 6. Un metodo de analizar el comportamiento de un sistema de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el comportamiento del sistema se analiza pesando cada llquido que se anade al reactor y se separa de este.
7. 7. Un aparato para analizar el comportamiento de un sistema que comprende una muestra qulmica y/o biologica en un medio llquido, destinandose el aparato a ser conmutado entre el funcionamiento en un ciclo de reaccion en circuito cerrado y el funcionamiento en un ciclo de toma de muestras, comprendiendo el aparato:

   un reactor destinado a ser mantenido en un entorno controlado y destinado a contener la muestra qulmica y/o biologica en el medio llquido;

   un sistema de gas de circulation destinado a admitir en el sistema un gas de referencia antes de un ciclo de reaccion, para hacer circular en el sistema el gas en un circuito cerrado durante el ciclo de reaccion para que el gas contacte con el medio llquido, y para suministrar una porcion del gas circulado para su analisis durante el ciclo de toma de muestras.

   por lo menos un recipiente de llquido de compensacion destinado a contener un llquido de compensacion para combinarlo con el medio llquido durante el ciclo de toma de muestras, destinandose el recipiente del llquido de compensacion a ser suministrado con el gas de referencia;

   un sistema de combinar llquidos, destinado a combinar y homogeneizar sustancialmente el llquido de compensacion y el medio llquido como parte del ciclo de toma de muestras;

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   un sistema de toma de muestras llquidas, destinado a separar del medio llquido una porcion de muestra como parte del ciclo de toma de muestras;

   por lo menos un recipiente receptor de llquido, destinado a recibir la porcion de muestra del medio llquido como parte del ciclo de toma de muestras; y

   un controlador destinado a conmutar el sistema entre el ciclo de reaccion y su ciclo de toma de muestras.
8. 8. Un aparato de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que el mismo recipiente se destina a servir como recipiente de llquido combinado de compensacion y como recipiente receptor de muestras llquidas.
9. 9. Un aparato de acuerdo con la reivindicacion 7 o la reivindicacion 8, en el que el aparto comprende una pluralidad de recipientes de llquido de compensacion y de recipientes receptores de muestras llquidas o una pluralidad de recipientes de llquido combinado de compensacion, y en el que el aparato esta configurado de modo que cada recipiente receptor de muestras llquidas se destina a recibir una muestra llquida procedente de un ciclo diferente de reaccion del aparato.
10. 10. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que un sistema de toma de muestras llquidas comprende una o mas bombas que tienen asociadas tuberlas de suministro, estando configuradas cada bomba y sus tuberlas asociadas de suministro para transferir llquido entre el reactor y un recipiente receptor de muestras llquidas.
11. 11. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el aparato comprende ademas por lo menos una sonda, especialmente una sonda de pH y/o una sonda de oxlgeno, destinadas a medir una caracterlstica del medio llquido.
12. 12. Un aparato conglomerado que comprende una pluralidad de aparatos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que el aparato conglomerado comprende un soporte del reactor destinado a contener los reactores de cada aparato en una configuracion tal que dada reactor esta sometido a condiciones externas sustancialmente identicas.
13. 13. Un aparato de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que el gas de circulacion se destina a suministrar selectivamente una porcion del gas circulado procedente de cada aparato individual a un analizador simple de gases durante el ciclo de toma de muestras de cada aparato individual.
14. 14. Uso de un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o de un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13 para analizar un sistema seleccionado del grupo que consiste en un sistema configurado para analizar el impacto de la acidification de los oceanos sobre organismos vivos, un sistema configurado para cuantificar el consumo de oxlgeno y/o la production de dioxido de carbono de organismos vivos, y un sistema para estudiar propiedades qulmicas de cristales de carbonato calcico en agua del mar.