ES2558953B1

ES2558953B1 - Maíz enriquecido en antioxidantes para mejorar la calidad nutricional del huevo

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Publication number: ES2558953B1
Application number: ES201531699A
Authority: ES
Inventors: José Antonio MORENO MARTÍNEZ; Carmen NOGAREDA BURCH; Eduardo ANGULO ASENSIO; Paul Christou; Changfu Zhu; Teresa CAPELL
Original assignee: CENTRE DE RECERCA EN AGROTECNOLOGIA-AGROTECNIO; Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA; Universitat de Lleida
Current assignee: CENTRE DE RECERCA EN AGROTECNOLOGIA-AGROTECNIO; Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA; Universitat de Lleida
Priority date: 2015-11-23
Filing date: 2015-11-23
Publication date: 2016-11-18
Anticipated expiration: 2035-11-23
Also published as: ES2558953A1

Abstract

Maíz enriquecido en antioxidantes para mejorar la calidad nutricional del huevo.#La presente invención se relaciona con una composición nutritiva o nutracéutico que comprende una parte de una planta de maíz enriquecida en antioxidantes o un derivado de la misma y con los usos de dicha composición para la obtención de huevos enriquecidos en antioxidantes. La invención también se relaciona con el uso de una parte de una planta de maíz enriquecida en antioxidantes o un derivado de la misma para la obtención de huevos enriquecidos en antioxidantes. La invención se relaciona también con un huevo y ovoproductos derivados de dicho huevo obtenidos según los usos de la invención.

Description

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DESCRIPCION

MAIZ ENRIQUECIDO EN ANTIOXIDANTES PARA MEJORAR LA CALIDAD

NUTRICIONAL DEL HUEVO

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se encuadra en el campo de la tecnologia de alimentos y particularmente en el desarrollo de nuevos maices y la mejora de la calidad nutricional del huevo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Los pigmentos carotenoides son compuestos responsables de la coloration de gran numero de alimentos vegetales y animales, como zanahorias, naranjas, tomates, salmon y yema de huevo. Desde hace muchos anos se sabe que algunos de estos compuestos como a y p- caroteno, asi como la p criptoxantina, son provitaminas A. No obstante, estudios recientes han puesto de manifiesto las propiedades antioxidantes de estos pigmentos, asi como su eficacia en la prevention de ciertas enfermedades del ser humano, como la aterosclerosis o incluso el cancer. Por otro lado, las observaciones epidemiologicas parecen indicar que el consumo de alimentos ricos en carotenoides esta relacionado con un menor riesgo de padecer enfermedades cronicas.

Se ha comprobado que los carotenoides potencian tanto las funciones inmunologicas espedficas como las no espedficas. Diversas reacciones de modulation inmunologicas pueden aumentar la actividad tumoricida de las celulas T citotoxicas, los macrofagos y/o las celulas asesinas naturales y fomentar las funciones antimicrobianas inmunologicas. Por ejemplo, el beta-caroteno puede reducir la incidencia de sucesos cardiovasculares, habiendose demostrado en estudios clmicos. Adicionalmente los grupos de poblacion que consumen alimentos ricos en beta-caroteno estan mas protegidos contra los canceres de piel y pulmon, particularmente los fumadores. Se han propuesto varios mecanismos para explicar la actividad fisiologica de los carotenoides. La mas plausible se basa en el fuerte caracter antioxidante y en su capacidad para desactivar sustancias qdmicas perjudiciales como el oxigeno singlete, los radicales libres y los radicales peroxido lipidicos. Tambien

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hay evidencia de que varios carotenoides producen una estimulacion directa del sistema inmunologico y de la respuesta inmunologica.

Todo ello ha hecho que desde un punto de vista nutricional, el interes por estos pigmentos se haya incrementado notoriamente.

El consumo de huevos de ave y muy especialmente de gallina (92% del total mundial, FAO 2012) esta extendido en todo el mundo, siendo un elemento esencial en la dieta de muchas personas representando un aporte de carotenoides importante. Durante el ano 2012, se consumieron en todo el mundo casi 72 MT de huevo, de ellos mas de 66 MT eran de huevo de gallina (FAO, 2012). Los consumidores aprecian un color elevado en la gama amarillo-naranja en la yema del huevo, considerando esta caracteristica como determinante en el momento de la compra y como reflejo de la calidad de los huevos.

La utilization de carotenoides en avicultura va mas alla de sus propiedades pigmentantes de la yema del huevo y la piel y patas de los pollos. A parte del efecto pigmentante estos carotenoides tambien cumplen una serie de funciones importantes en el animal. Asi se conocen sus efectos antioxidantes, estimuladores del sistema inmunitario y sobre la mejora de los parametros productivos de las aves, especialmente en la eficacia reproductiva y la obtencion de pollitos viables, asi como actuando como precursores de la vitamina A.

Las gallinas pueden depositar carotenoides en la yema del huevo y son estos carotenoides los que le daran el color tipico. Puesto que las gallinas no pueden sintetizar estas moleculas, es obligado que sean aportadas por la dieta, fundamentalmente por el maiz, la alfalfa y otros vegetales verdes.

La composition de las diferentes dietas que habitualmente se suministran a las gallinas, aunque incluyan materias primas ricas en carotenoides, no logran una concentration suficiente en la yema para satisfacer las exigencias del consumidor, siendo necesario anadirlos en forma de aditivos, que se obtienen por extraction a partir de los petalos de la flor de marigold (Tagetes erecta), o bien a partir de smtesis quimica.

Sin embargo estas fuentes de carotenoides presentan desventajas, ya que los carotenoides de maiz son mas biodisponibles que los de Tagetes erecta y la smtesis

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qmmica de carotenoides requiere un gran nivel de control y puede producir compuestos con efectos indeseables y que pueden ser alergenos en ciertos consumidores.

Por tanto, como alternativa se tratan de identificar otras fuentes de carotenoides como los pigmentos obtenidos a partir de biomasa de levadura Phaffia rhodozyma, del alga Haematococcus pluvialis, Chrlorococcum sp o de bacteria Dietzia natronolimnacea (Esfahani-mashhopur M. et al., Asian-Aust. J. Anim. Sci. Vol. 22, No. 2: 254 - 259). Sin embargo existen pocos microrganismos capaces de satisfacer las demandas.

El suplemento del alimento de gallinas ponedoras con distintas variedades de zanahorias consigue incrementar el contenido en carotenoides del huevo, sin embargo se reduce la ingesta en las gallinas lo que da lugar a que el peso de los huevos obtenidos y de la yema disminuye al suplementar con cualquiera de las variedades ensayadas e incluso se reduce la tasa de puesta (Hammershoj M. et al., J Sci Food Agric 2010; 90: 1163-1171).

Por tanto, existe la necesidad de encontrar alternativas para la obtencion huevos con una mejor calidad nutricional y particularmente enriquecerlos en antioxidantes.

COMPENDIO DE LA INVENCION

En un primer aspecto la invencion se relaciona con una composicion nutritiva o nutraceutico que comprende una parte de una planta de maiz enriquecida en antioxidantes o un derivado de la misma.

En un segundo aspecto, la invencion se relaciona con el uso de una composicion nutritiva o nutraceutico de la invencion para la obtencion de huevos enriquecidos en antioxidantes.

En un tercer aspecto, la invencion se relaciona con el uso de una parte de una planta de maiz enriquecida en antioxidantes o un derivado de la misma para la obtencion de huevos enriquecidos en antioxidantes.

En un cuarto aspecto, la invencion se relaciona con un huevo y ovoproductos derivados de dicho huevo obtenidos segun los usos de la invencion.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

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Figura 1. Carotenoides en el pienso en ^g/g de pienso (5 determinaciones).

Figura 2. Carotenoides en la yema de los huevos a los 31 d^as del experimento. Los valores son la media ± error estandar de 5 muestras *C427 es B-cryptoxantina-5,8- epoxido.

Figura 3. Carotenoides en higado de gallina al final del experimento. Los valores son la media ± error estandar de 5 muestras. *C450 es B-caroteno-5,6-epoxido or B-carotene- 5,6,5’,6’-diepoxido. M37W-Ph3 es la lmea enriquecida en antioxidantes.

Figura 4. Carotenoides en dgado de gallina al final del experimento sin retinol para poder observar los demas valores en otra escala. *C450 principalmente B-carotene-5,6-epoxido o B-carotene-5,6,5’,6’-diepoxido.

DESCRIPCION DETALLADA

Los autores de la presente invencion han conseguido mejorar la calidad nutricional del huevo alimentando las gallinas con variedades de maiz enriquecidas en antioxidantes (Ejemplo 1).

Definiciones

El termino “composicion nutritiva” de la presente invencion se refiere a aquel alimento que, con independencia de aportar nutrientes al sujeto que lo toma, afecta beneficiosamente a una o varias funciones del organismo, de manera que proporciona un mejor estado de salud y bienestar. Como consecuencia, dicha composicion nutritiva puede ser destinada a la prevention y/o tratamiento de una enfermedad o del factor causante de una enfermedad. Por tanto, el termino “composicion nutritiva” de la presente invencion se puede emplear como sinonimo de alimento funcional o alimento para fines nutricionales espedficos o alimento medicinal. Una composicion nutritiva tiene una apariencia similar a la de un alimento convencional y se consume como parte de una dieta normal.

Por “nutraceutico”, palabra derivada de nutrition y farmaceutico, se entiende un producto elaborado a partir de un alimento, pero que se encuentra a modo de ejemplo ilustrativo no

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limitativo, en forma de pfldora, polvos y otras presentaciones farmaceuticas no asociadas generalmente con los alimentos y que presenta propiedades beneficiosas para el tratamiento y/o prevention de enfermedades.

Por “planta de maiz”, segun se emplea en la presente invention, se refiere a un ser vivo fotosintetico perteneciente a la especie Zea mays. Dicho termino incluye tambien las diversas subespecies.

Una “parte de una planta”, tal y como se usa en la presente invencion, se refiere a una parte espedfica de una planta, tal como tallo, hoja, raiz, flor, semilla, endospermo, grano, fruto o yema.

“Derivado de una parte de la planta” se refiere a un producto obtenido tras el procesamiento de una parte de la planta de la invencion a partir de la modification fisica y/o qdmica, a modo ilustrativo no limitativo, harina, semola, aceite, sirope, almidon o fecula. Dicho termino no incluye un antioxidante aislado.

Segun la invencion, la planta de maiz se encuentra “enriquecida en antioxidantes”, es decir, presenta niveles superiores de moleculas capaces de retardar o prevenir la oxidation de otras moleculas, comparado con un nivel de referencia. Los antioxidantes se encargan de capturar los radicales libres producidos en las reacciones de oxidacion propias del metabolismo. Ejemplos ilustrativos no limitativos de antioxidantes son carotenoides, lutema, licopeno, selenio, vitamina A, vitamina C y vitamina E.

“Semilla” tal y como se usa en la presente invencion, se refiere a cada uno de los cuerpos que forman parte del fruto que da origen a una nueva planta.

El termino “endospermo”, segun se usa en la presente invencion, se refiere al organo principal de almacenamiento en las semillas de maiz, nutriendo el embrion mientras la semilla se desarrolla y proporcionando nutrientes a la planta joven en germination.

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Por “derivado de semilla o endospermo”, tal y como se usa en la presente invencion se refiere a cualquier producto obtenido a partir de la modification fisica y/o qwmica de la semilla o endospermo.

El termino "harina" segun se entiende en la presente invencion, es el producto obtenido de la molturacion de cualquier semilla de plantas del genero Zea que puede estar despojado en mayor o menor grado del salvado o la cascarilla de la semilla.

El termino "semola" hace referencia a harina gruesa (semillas de maiz poco molidas), es decir, fragmentos de endospermo con una cantidad variable de cascarilla de semilla.

“Aceite de maiz”, tal y como se usa en la presente invencion, se refiere al aceite obtenido tras el secado del grano de maiz germinado.

Por “almidon de maiz”. tal y como se emplea, se refiere a un polvo sedoso blanco finalmente molido hecho del endospermo del maiz seco.

“Fecula de maiz” es el polisacarido obtenido a traves de la molienda humeda.

“Sirope de maiz”, tambien conocido como jarabe de maiz, es un edulcorante liquido elaborado a partir del almidon o la fecula de maiz tras un proceso de calentamiento e hidrolizacion.

“Carotenoides”, tal y como se usa en la presente invencion, se refiere a pigmentos organicos que se encuentran de forma natural en plantas y otros organismos fotosmteticos. La mayoria de los carotenoides son tetraterpenoides, compuestos de 40 atomos de carbono formados por ocho unidades isoprenoides y contienen anillos a uno o ambos extremos de la molecula. Pueden funcionar como antioxidantes, protegiendo frente a la auto-oxidacion.

“B-caroteno” tal y como se usa en la presente invencion se refiere al carotenoide mas abundante en la naturaleza, precursor de la vitamina A con numero CAS 12-88-4.

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“v-caroteno”, segun la presente invencion se refiere al carotenoide con numero CAS 47293-5.

“a-caroteno” tal y como se usa en la presente invencion, se refiere al carotenoide precursor de la vitamina A con numero CAS 7488-99-5

“a-criptoxantina”, segun la presente invencion, se refiere al carotenoide con numero CAS 472-70-8

“B-criptoxantina”, tal y como se usa en la presente invencion, se refiere al compuesto con numero CAS 472-70-8.

“licopeno” tal y como se usa en la presente invencion, se refiere al pigmento vegetal liposoluble con numero CAS 502-65-8 de color rojo.

“Luteina” tal y como se usa en la presente invencion se refiere a un derivado dihidroxilado del a-caroteno de color amarillo con numero CAS 127-40-2.

“Zeaxantina”, tal y como se emplea en la presente invencion se refiere al pigmento liposoluble de color amarillo con numero CAS 144-68-3.

Por “planta de maiz transgenica”, segun se usa en la presente invencion, se refiere a aquella planta de maiz cuyo genoma ha sido modificado mediante ingenieria genetica con el objetivo de conseguir caracteristicas biologicas diferentes y/o mejoradas respecto a las de la planta isogenica silvestre.

Por “transgen” tal y como se usa en la presente invencion, se refiere a una secuencia que codifica un gen de un organismo que ha sido incorporado en el genoma de otro organismo de la misma o diferente especie. El organismo resultante se le denomina transgenico.

Por “Fitoeno sintasa” o psyl tal y como se usa en la presente invencion se refiere al gen que codifica para la enzima que cataliza la reaction que convierte dos moleculas de GGDP en fitoeno, el primer paso en la smtesis de la provitamina A. La secuencia que

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codifica para la fitoeno sintasa de Zea mays tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1.

“Caroteno desaturasa” o crtI, tal y como se usa en la presente invencion, se refiere al gen que codifica para la enzima encargada de la production de licopeno a partir de tres substratos, neurosporeno, un aceptor de electrones y oxigeno. La secuencia que codifica para la caroteno desaturasa de E eurodovora tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2.

“Licopeno B-ciclasa” o Lycb, tal y como se usa en la presente invencion, se refiere al gen que codifica para la enzima que transforma el licopeno en provitamina A. La secuencia que codifica para la Licopeno B-ciclasa de G. lutea tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 3.

“B-caroteno hidroxilasa” o bch, tal y como se usa en la presente invencion, se refiere al gen que codifica para la enzima encargada de la conversion del beta-caroteno a xantofilas. La secuencia que codifica para la B-caroteno hidroxilasa de Z. mays tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 4.

“Carotenoide cetolasa” o crtw tal y como se usa en la presente invencion, se refiere al gen que codifica para la enzima encargada de anadir un grupo carbonilo con el carbono 4 y 4 'de la molecula de beta caroteno._La secuencia que codifica para la carotenoide cetolasa de Paracoccus sp. tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:7.

Por “secuencia para el direccionamiento de proteinas al cloroplasto”, tal y como se usa en la presente invencion se refiere a secuencias de importation al cloroplasto, estoma y que generalmente son secuencias ricas en Ser, Thr y residuos hidrofobicos pequenos y de bajo contenido de Glu y Asp. Dicha secuencia se situa en el extremo N-terminal dentro de la protema y es eliminada tras el direccionamiento. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichas secuencias son aquellas presentes en enzimas del ciclo de Calvin y que son codificadas por genes nucleares y transportas al cloroplasto despues de su smtesis en el citosol, por ejemplo todas las demas enzimas del ciclo de Calvin, excepto la subunidad grande de la Rubisco.

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“La subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa”, tal y como se emplea en la presente invention, se refiere a la subunidad reguladora. La secuencia correspondiente a la protema en guisante tiene el numero de acceso P00868 de la base de datos de Uniprot a fecha 14 de octubre de 2015.

“Secuencia terminadora de la transcription” o senal de parada, tal y como se usa en la presente invencion, se refiere a una secuencia en el ADN que cuando es reconocida por la ARN polimerasa, el ARNm se separa y se interrumpe la smtesis de ARNm

“Nopalina sintasa”, tal y como se usa en la presente invencion se refiere a una protema con actividad oxidoreductasa y cuya secuencia de Agrobacterium tumefaciens corresponde con la secuencia con numero de acceso WP_032488658. 1 en la base de datos de Genbank a fecha 8 de octubre de 2014

“ADP-glucosa pirofosforilasa” La secuencia correspondiente a la protema en arroz tiene el numero de acceso BAF80188.1 de la base de datos de Genbank a fecha 29 de diciembre de 2014.

“Promotor espetifico de endospermo”, tal y como se usa en la presente invencion, se refiere a una molecula de acido nucleico que permite dirigir o regular la expresion de un gen en el endospermo. El “endospermo” es una formation caracteristica de las semillas de Angiospermas, es un tejido nutritivo para el embrion. El endospermo de maiz se origina a partir de una serie de divisiones nucleares libres, seguidas de la celularizacion y posterior formacion de un rango de dominios celulares funcionales. El endospermo es el organo de almacenamiento principal de las semillas de maiz; nutre al embrion mientras la semilla se desarrolla y proporciona nutrientes a la plantula en germination.

“D-hordema de cebada”, tal y como se emplea en la presente invencion, se refiere a la protema con el numero de acceso Q40054 de la base de datos Uniprot a fecha 14 de octubre de 2015. En una realization particular, el promotor de D-hordema tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 12.

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“LMW glutenina de trigo”, tal y como se emplea en la presente invencion, se refiere a protema con el numero de acceso Q41603 de la base de datos Uniprot a fecha 14 de o octubre de 2015. En una realization particular, el promotor de LMW de glutenina tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11.

“Gamma zeina”, tal y como se usa en la presente invencion, se refiere a una protema de reserva de maiz y que corresponde a la secuencia con numero de acceso Q548E9 en la base de datos de Uniprot en fecha 14 de octubre de 2015.

“Astaxantina”, segun la presente invencion es un carotenoide perteneciente a la serie fitoquimica de los terpenos con numero CAS 472-61-7.

“Violaxantina”, tal y como se usa en la presente invencion se refiere a un derivado del alfa y beta caroteno con numero CAS 126-29-4.

“Anteraxantina”, se refiere a un pigmento amarillo con numero CAS 640-03-9.

“Cantaxantina”, tal y como se usa en la presente invencion se refiere al compuesto con numero CAS 514-78-3.

“Adonixantina”, corresponde al compuesto con numero CAS 4418-73-9.

“Adonirubina”, segun la presente invencion se refiere al compuesto con numero CAS 4418-72-8.

“3-OH equinenona”, se refiere al compuesto producto de la enzima EC 1.14.13.

“Zeaxantina”, tal y como se usa en la presente invencion se refiere a un carotenoide de color amarillo del grupo de las xantofilas con numero CAS 114-68-3.

“Z-fitoeno”, se refiere al compuesto con numero CAS 540-04-5.

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“Fitoeno”, segun se emplea en la presente invencion, se refiere a un intermedio de 40 atomos de carbono en la biosmtesis de carotenoides.

“Beta caroteno cetolasa”, tal y como se emplea en la presente invencion, se refiere a la enzima codifica por el gen crtW y que cataliza las dos etapas de introduction del grupo oxo en el anillo de beta-yonona del beta-caroteno por ambos extremos. La secuencia que codifica para la beta caroteno cetolasa de C. reinhardtii tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 14.

“Beta caroteno hidroxilasa”, tal y como se emplea en la presente invencion se refiere a la enzima codificada por el gen crtZ y que interviene en las dos etapas de hidroxilacion del anillo de beta-yonona del beta caroteno en ambos extremos. La secuencia que codifica para la beta caroteno hidroxilasa de Brevidomonas sp. tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:15.

“Licopeno epsilon ciclasa”, tal y como se usa aqti, se refiere a una enzima que actua sobre el carotenoide licopeno-todo-trans que posee grupos psi-terminales en ambos extremos, en un primer paso lo convierte en 5-caroteno; y luego en £-caroteno.

“ARNi” o ARN de interferencia”, tal y como se usa en la presente invencion, se refiere a moleculas de ARN capaces de silenciar la expresion de un gen. Para ese fin, ARNi son tipicamente oligonucleotidos de doble cadena que tienen al menos 30 pares de bases de longitud, y mas preferiblemente comprenden aproximadamente 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18 o 17 pares de bases de acidos ribonucleicos. El ARNi de la licopeno epsilon ciclasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 16.

“Cruzamiento”, tal y como se usa en la presente invencion, se refiere a la reproduction sexual de dos plantas, dando como resultado una descendencia que hereda parte del material genetico de cada progenitor. Los organismos parientes deben ser geneticamente compatibles y pueden ser de variedades diferentes o de especies muy cercanas. El cruzamiento originalmente se da bajo polinizacion cruzada natural entre plantas cuya constitution genetica es diferente.

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“Linea de maiz con alto nivel de aceite”, tal y como se usa aqw, se refiere a una planta de maiz que presenta en sus granos mayor cantidad de aceite al compararlo con una variedad de maiz silvestre, preferiblemente al menos mas de 6% al compararlo con una variedad silvestre que generalmente presenta entre un 3,5 y 5% de aceite.

“NSL30876”, tambien conocida como R78, es una linea de maiz transgenica con alto nivel de aceite.

“Codones adecuados para su expresion en plantas”, tal y como se usa se refiere al uso de una secuencia de nucleotidos adecuada para que tras la transcription y traduction no se vea alterada la secuencia de aminoacidos de la protema resultante, como consecuencia de la preferencia de uso de codones.

“region 5'UTR”', segun se emplea en la invention se conoce a la region no traducida en position 5'tambien conocida como region lider, se refiere a la region de ARNm que esta inmediatamente anterior al codon de initiation. Dicha region no es traducida, sino que forma una estructura secundaria para regular la traduccion.

“Alcohol deshidrogenasa”, segun la invencion es un enzima que facilita la interconversion entre alcoholes y aldehidos o cetonas con la reduction de NAD+ a NADH. La protema de alcohol dehidrogenasa clase 3 de arroz tiene la secuencia con numero de acceso Q0DWH1 en la base de datos de Uniprot en fecha 16 de septiembre de 2015.

“Huevos enriquecidos en antioxidantes”, tal y como se usa en la presente invencion se refiere a aquellos huevos cuyo contenido en antioxidantes, es decir de moleculas capaces de retardar o prevenir la oxidation de otras moleculas, esta incrementado comparado con un nivel de referencia en huevos comunes, procedentes de aves que no han sido alimentadas con un maiz enriquecido en antioxidantes, Por incrementado tal y como se usa en la presente invencion se refiere el nivel es al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso mas con respecto al valor de referencia en huevos comunes.

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“Ave” tal y como se usa en la presente invention, se refiere al animal vertebrado que presentan las extremidades anteriores modificadas como alas, con el cuerpo recubierto de plumas y un pico corneo sin dientes.

"Ave de corral", incluye aves domesticas criadas por el hombre para la obtencion de huevos, carne y/o plumas. Los ejemplos de las aves de corral incluyen gallos, gallinas, pavos, patos, gansos, codornices, faisanes, palomas, palomas, emues, avestruces y nandues.

“Gallina”, tal y como se usa en la presente invencion, se refiere al animal hembra procedente del genero Gallus gallus domesticus.

“Huevo” tal y como se emplea en la presente invencion se refiere a un cuerpo redondeado, de diferente tamano y dureza, que producen las hembras de las aves y que contiene el germen del embrion y las sustancias destinadas a su nutrition durante la incubacion.

“Ovoproductos" tal y como se emplea en la presente invencion se refiere a los productos transformados resultantes de la transformation de huevos, de diversos componentes o mezclas de huevos, o de la transformacion subsiguiente de tales productos transformados. Los ovoproductos pueden clasificarse segun distintos criterios, por sus componentes, por su forma fisica y tratamiento, por su modo de empleo o por la duration de su vida comercial.

Composiciones de la invencion.

En un primer aspecto, la invencion se relaciona con una composition nutritiva o nutraceutico que comprende una parte de una planta de maiz enriquecida en antioxidantes o un derivado de la misma.

La expresion “composicion nutritiva o nutraceutico” se usa en el presente documento en un sentido amplio y cubre alimentos para seres humanos asi como alimentos para animales de production (es decir, un pienso). En un aspecto preferido, la composicion

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nutritiva o nutraceutico es para consumo animal. La composition nutritiva o nutraceutico puede estar en forma de una disolucion o como un solido, dependiendo del uso y/o el modo de aplicacion y/o el modo de administracion.

Se entiende que una parte de una planta de maiz o un derivado de la misma se encuentra enriquecida en antioxidantes, cuando presenta niveles de antioxidantes superiores a los niveles de una muestra de referencia o muestra control. En particular, se puede considerar que una parte de una planta o derivado de la misma presenta niveles superiores de antioxidantes cuando los niveles son de al menos 1 vez, 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso mas con respecto a la muestra de referencia o muestra control. El experto en la materia entendera que no es necesario que una planta enriquecida en antioxidantes contenga niveles elevados de dichos antioxidantes en todos los tejidos de dicha planta, sino que es suficiente con que al menos un tejido de la planta contenga niveles elevados de antioxidantes para que la planta pueda ser considerada como “enriquecida en antioxidantes”. En ese caso, la muestra de referencia para determinar el grado de enriquecimiento en antioxidantes se determina mediante comparacion con los niveles de antioxidantes es una muestra del mismo tejido o parte de una planta control. Por nivel de antioxidantes tambien se engloba el nivel de un solo tipo de antioxidante.

Una muestra control o de referencia, tal y como se usa en la presente invention, puede ser el valor que corresponde a los niveles de antioxidantes presentes en una parte de una planta de maiz o derivado de la misma que se encuentra en estado salvaje, es decir no modificada geneticamente.

El experto en la materia conoce diversos metodos para determinar si una planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en antioxidantes, por ejemplo determinando los niveles de antioxidantes, particularmente carotenoides mediante HPLC (cromatografia liquida de alta resolution) o determinando el incremento de la capacidad antioxidante.

La capacidad antioxidante puede determinarse mediante la cuantificacion de la capacidad que tienen los compuestos antioxidantes para reaccionar con un radical libre determinado,

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o determinando el potencial que tales compuestos tendrian para reducir el complejo formado entre iones Fe(III) y el reactivo TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazina).

Entre aquellos ensayos que se basan en la medicion de la capacidad de los antioxidantes para reaccionar con un radical libre, caben destacar los siguientes, ensayo ORAC (del ingles “Oxygen Radical Absorbance Capacity” o capacidad de absorcion de radicales de oxigeno), ensayo TEAC (del ingles Trolox Equivalent Antioxidant Capacity o Capacidad Antioxidante como Equivalentes Trolox) y Ensayo DPPH (2,2-Difenil-1-picrilhidrazil).

Las composiciones nutritivas o nutraceuticos de la invention comprenden al menos un 0,01 % de la parte de una planta enriquecida en antioxidantes o derivado de la misma, mas preferiblemente al menos un 0,10%, 0,50%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15% 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o, al menos un 95%.

En una realization particular, la composition nutritiva o nutraceutico de la invencion comprende al menos entre un 50 y un 80% de una parte de una planta de maiz enriquecida en antioxidantes o un derivado de la misma.

En otra realizacion mas particular la composicion nutritiva o nutraceutico de la invencion comprende al menos entre un 60 y un 70% de una parte de una planta de maiz enriquecida en antioxidantes o un derivado de la misma, mas particularmente al menos 61, al menos 62, al menos 63, al menos 64, al menos 65, al menos 66, al menos 67, al menos 68, al menos 69.

En otra realizacion particular, la parte de la planta de maiz es el endospermo, la semilla o derivados de los mismos. A modo de ejemplo ilustrativo no limitativo, el derivado de la semilla o endospermo puede ser una harina, semola, aceite de maiz, almidon de maiz, fecula de maiz o sirope de maiz entre otros.

La composicion nutritiva o nutraceutico de acuerdo a la presente invencion se puede preparar directamente a partir de la parte de la planta enriquecida en antioxidantes. En una forma preferida de realizacion, la parte de la planta es el endospermo o granos de maiz, en cuyo caso dicha composicion contiene al menos un 40%, preferiblemente mas de un 50% o mas preferiblemente mas de un 60%.

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Alternativamente, la parte de la planta que se usa para preparar la composition nutritiva o el nutraceutico de acuerdo a la presente invention puede someterse a una purification parcial para obtener un derivado enriquecido en el producto antioxidante. As^ en el caso de que los compuestos antioxidantes sean carotenoides y que la parte de la planta que se usa sea el endospermo, la composicion nutritiva o el nutraceutico contienen un extracto de granos de maiz o de endospermo que puede encontrarse parcial- o totalmente purificado de forma que el contenido en carotenoides sea superior al que aparece en la parte de la planta de maiz enriquecida. Derivados de maiz que se pueden usar en la presente invencion incluyen harina de maiz, salvado de maiz, aceite de maiz, almidon de maiz, sirope de maiz, y similares.

Asi, por ejemplo, de acuerdo a la presente invencion, es posible extraer los carotenoides presentes en la parte de las plantas de maiz o derivados de la misma para obtener una composicion nutritiva o nutraceutico.

El experto en la materia conoce diversos metodos para extraer carotenoides de una parte de una planta de maiz, tal y como extraction a partir de endospermos congelados y HPLC, tal y como se describe en Naqvi S. et al., PNAS 2009, vol. 106, no 19.

Como entendera un experto en la materia, la composicion nutritiva o nutraceutico de la invencion deben cumplir las normativas y legislation alimentaria del pais.

Existen diversos metodos conocidos para la elaboration de composiciones nutritivas y nutraceuticos ampliamente conocidas por el experto en la materia y que pueden emplearse en la presente invencion.

Las composiciones de la invencion o nutraceuticos pueden estar en una forma liquida, semisolida o solida. En una realizacion particular las composiciones o nutraceutico de la invencion se encuentran en forma solida y mas particularmente es un pienso.

Las composiciones nutritivas o nutraceuticos de la invencion pueden formularse con los excipientes y adyuvantes usuales para las composiciones orales o suplementos alimentarios, como por ejemplo y sin sentido limitativo, componentes grasos, componentes acuosos, humectantes, conservantes, agentes texturizantes, sabores, aromas, antioxidantes y colorantes comunes en el sector alimentario.

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Las necesidades nutritivas de los animales son bien conocidas en el estado de la tecnica. Por ejemplo, las necesidades nutritivas de las aves de corral son descritas en Gail Damerow The Chicken Encyclopedia: An Illustrated Reference. Storey Publishing. pp. 118-119, 135-136 y en el libro Animal Nutrition handbook, seccion 12 paginas 316-331.

Composiciones nutritivas utiles para la alimentation de aves de corral, y en concreto de engorde para pollos de carne o broilers, de cria de pollitas (semanas 0 a 8), de recria para pollitas (semana 9 -20) o puesta a partir de la semana 21a son conocidas en el estado de la tecnica, por ejemplo en ES2051706T3.

En una forma preferida, los antioxidantes enriquecidos en una planta de maiz son carotenoides.

En otra realization particular de la composicion nutritiva o nutraceutico de la invention, la parte de una planta de maiz o un derivado de la misma esta enriquecida en carotenoides que se seleccionan del grupo formado por p-caroteno, Y-caroteno, a-caroteno, a- criptoxantina, p-criptoxantina, licopeno, lutema, zeaxantina y combinaciones de los mismos (composicion nutritiva A o nutraceutico A).

En una realizacion particular de la composicion nutritiva A o nutraceutico A, la planta de maiz o derivado de la misma enriquecida en carotenoides se encuentra enriquecida en uno solo de los carotenoides seleccionado del grupo formado por p-caroteno, Y-caroteno, a-caroteno, a-criptoxantina, p-criptoxantina, licopeno, lutema y zeaxantina.

En una realizacion particular de la composicion nutritiva A o nutraceutico A de la invencion, la planta de maiz o derivado de la misma enriquecida en carotenoides se encuentra enriquecida en al menos 2 carotenoides, a modo ilustrativo se encuentra enriquecida en p-caroteno y y caroteno; p-caroteno y a-caroteno; p-caroteno y a- criptoxantina; p-caroteno y p-criptoxantina;p-caroteno y licopeno; p-caroteno y lutema; p- caroteno y zeaxantina; Y-caroteno y a-caroteno; Y-caroteno y a-criptoxantina; Y-caroteno y p-criptoxantina; Y-caroteno y licopeno; Y-caroteno y lutema; Y-caroteno y zeaxantina; a- caroteno y a-criptoxantina; a-caroteno y p-criptoxantina; a-caroteno y licopeno; a-caroteno y lutema; a-caroteno y zeaxantina; a-criptoxantina y p-criptoxantina; a-criptoxantina y licopeno; a-criptoxantina y lutema; a-criptoxantina y zeaxantina; p-criptoxantina y licopeno;

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p-criptoxantina y lutema; p-criptoxantina y zeaxantina; licopeno y lutema; licopeno y zeaxantina; o en lutema y zeaxantina.

En otra realization de la composition nutritiva A o nutraceutico A de la invention, la planta de ma^z o derivado de la misma enriquecida en carotenoides se encuentra enriquecida en al menos 3 carotenoides, a modo ilustrativo se encuentra enriquecido en p-caroteno, y- caroteno y a-caroteno; p-caroteno,Y-caroteno y a-criptoxantina; p-caroteno,Y-caroteno y p- criptoxantina; p-caroteno,Y-caroteno y licopeno; p-caroteno,Y-caroteno y lutema; p- caroteno,Y-caroteno y zeaxantina; p-caroteno,a-caroteno y a-criptoxantina; p-caroteno,a- caroteno y p-criptoxantina; p-caroteno,a-caroteno y licopeno; p-caroteno,a-caroteno y lutema; p-caroteno,a-caroteno y zeaxantina; p-caroteno,a-criptoxantina y p-criptoxantina; p-caroteno,a-criptoxantina y licopeno; p-caroteno,a-criptoxantina y lutema; p-caroteno,a- criptoxantina y zeaxantina; p-caroteno,p-criptoxantina y licopeno; p-caroteno,p- criptoxantina y lutema; p-caroteno,p-criptoxantina y zeaxantina; p-caroteno,licopeno y lutema; p-caroteno,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,lutema y zeaxantina; Y-caroteno,a- caroteno y a-criptoxantina; Y-caroteno,a-caroteno y p-criptoxantina; Y-caroteno,a-caroteno y licopeno; Y-caroteno,a-caroteno y lutema; Y-caroteno,a-caroteno y zeaxantina; y- caroteno,a-criptoxantina y p-criptoxantina; Y-caroteno,a-criptoxantina y licopeno; y- caroteno,a-criptoxantina y lutema; Y-caroteno,a-criptoxantina y zeaxantina; Y-caroteno,p- criptoxantina y licopeno; Y-caroteno,p-criptoxantina y lutema; Y-caroteno,p-criptoxantina y zeaxantina; Y-caroteno,licopeno y lutema; Y-caroteno,licopeno y zeaxantina; y- caroteno,lutema y zeaxantina; a-caroteno,a-criptoxantina y p-criptoxantina; a-caroteno,a- criptoxantina y licopeno; a-caroteno,a-criptoxantina y lutema; a-caroteno,a-criptoxantina y zeaxantina; a-caroteno,p-criptoxantina y licopeno; a-caroteno,p-criptoxantina y lutema; a- caroteno,p-criptoxantina y zeaxantina; a-caroteno,licopeno y lutema; a-caroteno,licopeno y zeaxantina; a-caroteno,lutema y zeaxantina; a-criptoxantina,p-criptoxantina y licopeno; a-criptoxantina,p-criptoxantina y lutema; a-criptoxantina,p-criptoxantina y zeaxantina; a- criptoxantina,licopeno y lutema; a-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; a-

criptoxantina,lutema y zeaxantina; p-criptoxantina,licopeno y lutema; p- criptoxantina,licopeno y zeaxantina; p-criptoxantina,lutema y zeaxantina o enriquecido en licopeno,lutema y zeaxantina.

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En otra realization de la composition nutritiva A o nutraceutico A de la invention, la planta de ma^z enriquecida o derivado de la misma en carotenoides se encuentra enriquecida en al menos 4 carotenoides, a modo ilustrativo se encuentra enriquecido en p-caroteno,Y- caroteno,a-caroteno y a-criptoxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno y p-criptoxantina; P-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno y licopeno; p-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno y lutema; P-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a-criptoxantina y p- criptoxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a-criptoxantina y licopeno; p-caroteno,Y-caroteno,a- criptoxantina y lutema; p-caroteno,Y-caroteno,a-criptoxantina y zeaxantina; p-caroteno,Y- caroteno,p-criptoxantina y licopeno; p-caroteno,Y-caroteno,p-criptoxantina y lutema; p- caroteno,Y-caroteno,p-criptoxantina y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,licopeno y lutema; p-caroteno,Y-caroteno,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,lutema y zeaxantina; p-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina y p-criptoxantina; p-caroteno,a- caroteno,a-criptoxantina y licopeno; p-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina y lutema; p- caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina y zeaxantina; p-caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina y licopeno; p-caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina y lutema; p-caroteno,a-caroteno,p- criptoxantina y zeaxantina; p-caroteno,a-caroteno,licopeno y lutema; p-caroteno,a- caroteno,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,a-caroteno,lutema y zeaxantina; p-caroteno,a- criptoxantina,p-criptoxantina y licopeno; p-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina y lutema; p-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina y zeaxantina; p-caroteno,a-

criptoxantina,licopeno y lutema; p-caroteno,a-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; p- caroteno,a-criptoxantina,lutema y zeaxantina; p-caroteno,p-criptoxantina,licopeno y lutema; p-caroteno,p-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,p-

criptoxantina,lutema y zeaxantina; p-caroteno,licopeno,lutema y zeaxantina; Y-caroteno,a- caroteno,a-criptoxantina y p-criptoxantina; Y-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina y licopeno; Y-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina y lutema; Y-caroteno,a-caroteno,a- criptoxantina y zeaxantina; Y-caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina y licopeno; Y-caroteno,a- caroteno,p-criptoxantina y lutema; Y-caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina y zeaxantina; y- caroteno,a-caroteno,licopeno y lutema; Y-caroteno,a-caroteno,licopeno y zeaxantina; y- caroteno,a-caroteno,lutema y zeaxantina; Y-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina y licopeno; Y-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina y lutema; Y-caroteno,a-criptoxantina,p- criptoxantina y zeaxantina; Y-caroteno,a-criptoxantina,licopeno y lutema; Y-caroteno,a- criptoxantina,licopeno y zeaxantina; Y-caroteno,a-criptoxantina,lutema y zeaxantina; y- caroteno,p-criptoxantina,licopeno y lutema; Y-caroteno,p-criptoxantina,licopeno y

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zeaxantina; Y-caroteno,p-criptoxantina,lutema y zeaxantina; Y-caroteno,licopeno,lutema y zeaxantina; a-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina y licopeno; a-caroteno,a-

criptoxantina,p-criptoxantina y lutema; a-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina y zeaxantina; a-caroteno,a-criptoxantina,licopeno y lutema; a-caroteno,a-

criptoxantina,licopeno y zeaxantina; a-caroteno,a-criptoxantina,lutema y zeaxantina; a- caroteno,p-criptoxantina,licopeno y lutema; a-caroteno,p-criptoxantina,licopeno y

zeaxantina; a-caroteno,p-criptoxantina,lutema y zeaxantina; a-caroteno,licopeno,lutema y zeaxantina; a-criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno y lutema; a-criptoxantina,p-

criptoxantina,licopeno y zeaxantina; a-criptoxantina,p-criptoxantina,lutema y zeaxantina; a-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; o enriquecido en

criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina.

En otra realization de la composition nutritiva A o nutraceutico A de la invention, la planta de ma^z o derivado de la misma enriquecida en carotenoides se encuentra enriquecida en al menos 5 carotenoides, a modo ilustrativo se encuentra enriquecido en p-caroteno,Y- caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina y p-criptoxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno,a- criptoxantina y licopeno; p-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina y lutema; p- caroteno,Y-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a- caroteno,p-criptoxantina y licopeno; p-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina y lutema; p-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina y zeaxantina; p-caroteno,Y- caroteno,a-caroteno,licopeno y lutema; p-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno,lutema y zeaxantina; p-caroteno,Y- caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina y licopeno; p-caroteno,Y-caroteno,a- criptoxantina,p-criptoxantina y lutema; p-caroteno,Y-caroteno,a-criptoxantina,p- criptoxantina y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a-criptoxantina,licopeno y lutema; p- caroteno,Y-caroteno,a-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a- criptoxantina,lutema y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,p-criptoxantina,licopeno y lutema; p-caroteno,Y-caroteno,p-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,Y- caroteno,p-criptoxantina,lutema y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,licopeno,lutema y zeaxantina; p-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina y licopeno; p- caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina y lutema; p-caroteno,a-caroteno,a- criptoxantina,p-criptoxantina y zeaxantina; p-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,licopeno y lutema; p-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,a-

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caroteno,a-criptoxantina,lutema y zeaxantina; p-caroteno,a-caroteno,p-

criptoxantina,licopeno y lutema; p-caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina,licopeno y

zeaxantina; p-caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina,lutema y zeaxantina; p-caroteno,a- caroteno,licopeno,lutema y zeaxantina; |3-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno y lutema; p-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,a- criptoxantina,p-criptoxantina,lutema y zeaxantina; p-caroteno,a-

criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; p-caroteno,p-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; Y-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina y licopeno; Y-caroteno,a- caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina y lutema; Y-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,p- criptoxantina y zeaxantina; Y-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,licopeno y lutema; y- caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; Y-caroteno,a-caroteno,a- criptoxantina,lutema y zeaxantina; Y-caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina,licopeno y lutema; Y-caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; Y-caroteno,a- caroteno,p-criptoxantina,lutema y zeaxantina; Y-caroteno,a-caroteno,licopeno,lutema y zeaxantina; Y-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno y lutema; Y-caroteno,a- criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; Y-caroteno,a-criptoxantina,p- criptoxantina,lutema y zeaxantina; Y-caroteno,a-criptoxantina,licopeno,lutema y

zeaxantina; Y-caroteno,p-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; a-caroteno,a- criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno y lutema; a-caroteno,a-criptoxantina,p-

criptoxantina,licopeno y zeaxantina; a-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,lutema y zeaxantina; a-caroteno,a-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; a-caroteno,p- criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina o enriquecido en a-criptoxantina,p- criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina.

En otra realization de la composition nutritiva A o nutraceutico A de la invention, la planta de ma^z o derivado de la misma enriquecida en carotenoides se encuentra enriquecida en al menos 6 carotenoides, a modo ilustrativo se encuentra enriquecido en p-caroteno,Y- caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina y licopeno; p-caroteno,Y-caroteno,a- caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina y lutema; p-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno,a- criptoxantina,p-criptoxantina y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno,a- criptoxantina,licopeno y lutema; p-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,lutema y zeaxantina, p- caroteno,Y-caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina,licopeno y lutema; p-caroteno,Y-

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caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a- caroteno,p-criptoxantina,lutema y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a-

caroteno,licopeno,lutema y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a-criptoxantina,p- criptoxantina,licopeno y lutema; p-caroteno,Y-caroteno,a-criptoxantina,p-

criptoxantina,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a-criptoxantina,p-

criptoxantina,lutema y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,a-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; p-caroteno,Y-caroteno,p-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; p- caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno y lutema; p-caroteno,a- caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,a-caroteno,a- criptoxantina,p-criptoxantina,lutema y zeaxantina; p-caroteno,a-caroteno,a-

criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; p-caroteno,a-caroteno,p-

criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; p-caroteno,a-criptoxantina,p-

criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; Y-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,p- criptoxantina,licopeno y lutema; Y-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,p-

criptoxantina,licopeno y zeaxantina; Y-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,p-

criptoxantina,lutema y zeaxantina; Y-caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; Y-caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; y- caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina o enriquecido en a- caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina.

En otra realization de la composition nutritiva A o nutraceutico A de la invention, la planta de ma^z o derivado de la misma enriquecida en carotenoides se encuentra enriquecida en al menos 7 carotenoides, a modo ilustrativo se encuentra enriquecido en p-caroteno,Y- caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno y lutema; p-caroteno,Y- caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno y zeaxantina; p-caroteno,Y- caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,lutema y zeaxantina; p-caroteno,Y- caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; p-caroteno,Y- caroteno,a-caroteno,p-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; p-caroteno,Y- caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; p-caroteno,a- caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina; o enriquecida en y- caroteno,a-caroteno,a-criptoxantina,p-criptoxantina,licopeno,lutema y zeaxantina.

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En otra realizacion particular de la composicion nutritiva A o nutraceutico A de la invencion, la planta de maiz o derivado de la misma enriquecida en carotenoides se encuentra enriquecida en p-caroteno, Y-caroteno, a-caroteno, a-criptoxantina, p- criptoxantina, licopeno, lutema y zeaxantina.

En otra realizacion de la composicion nutritiva A o nutraceutico A de la invencion, la planta de maiz o derivado de la misma enriquecida en antioxidantes es una planta de maiz transgenica que expresa al menos un transgen que codifica una fitoeno sintasa y un transgen que codifica una caroteno desaturasa. Mas particularmente la planta de maiz expresa adicionalmente un transgen seleccionado del grupo formado por un transgen que codifica una licopeno p-ciclasa, un transgen que codifica una p-caroteno hidroxilasa y un transgen que codifica una carotenoide cetolasa.

En otra realizacion particular, las secuencias de los transgenes tienen adaptados los codones para su expresion en plantas.

Un experto en la materia puede conocer y determinar la secuencia de los transgenes anteriormente citados.

En otra realizacion mas particular el transgen que codifica la fitoeno sintasa procede de Zea mays y tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, el transgen que codifica la caroteno desaturasa procede de Erwinia eurodevora y tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, el transgen que codifica la licopeno p-ciclasa procede de Gentiana lutea y tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:3, el transgen que codifica la p-caroteno hidroxilasa procede de Zea mays y tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:4 o procede de Gentiana lutea y tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:6 y el transgen que codifica la carotenoide cetolasa procede de Paracoccus sp. tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:7.

En una realizacion particular, la planta de maiz es maiz blanco o maiz amarillo. Maiz blanco se refiere a una variedad de maiz en el que el endospermo tiene color blanco, como consecuencia de la ausencia de los pigmentos carotenoides que confieren el color amarillo al endospermo del maiz conocido como maiz amarillo.

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Un experto en la materia conoce las tecnicas adecuadas para la generacion de plantas transgenicas. Para una revision de la transferencia genica a plantas, incluyendo vectores, metodos de transferencia de ADN, etc, vease, por ejemplo, Twyman RM,2004, Handbook of Plant Biotechnology. John Wiley & Sons Inc., NY, pp 263-289, o Komari et al., 2004 Handbook of Plant Biotechnology. John Wiley & Sons Inc., NY, pp 233-262.

Brevemente dichos metodos pueden incluir: 1) empleo de un vector vivo que lleve el material genetico a la celula blanco mediante virus geneticamente modificados o el mecanismo natural de infeccion de la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens, 2) El uso de protoplastos, que son celulas vegetales a las que se les ha liberado de la pared celular, o 3) la biolistica que consiste en bombardear las celulas con particulas metalicas microscopicas recubiertas del ADN que se desea introducir.

En concreto, para la generacion de plantas de maiz transgenico se ha propuesto la introduction de ADN en celulas de maiz incluyendo la electroporation, microinyeccion, bombardeo con microproyectiles, fusion de liposomas, transferencia mediada por Agrobacterium, macroinyeccion y la exposition a ADN desnudo en solution.

Para lograr que el gen contenido en la molecula de ADN recombinante se exprese en los niveles y en los tejidos adecuados, es deseable, pero no necesario para genes de origen vegetal, que este contenido en un casette de expresion que incluya una secuencia promotora de la transcription funcional en plantas, la parte codificante del gen de interes y un terminador de la transcripcion funcional en plantas. Adicionalmente se puede incluir una secuencia que codifique para un peptido de transito que dirija la enzima a un compartimiento espetifico de la celula. El peptido de transito y las senales de procesamiento correspondientes pueden ser derivados de cualquier protema vegetal que se sintetiza en el citoplasma y es translocada al compartimiento subcelular de interes, ya sea el plastido o la mitocondria. Por ejemplo, para localizar en los plastidos pueden ser usadas secuencias derivadas de genes que codifican para la subunidad pequena de la ribulosa bisfosfato carboxilasa o las protemas CAB que son aquellas que se unen a las clorofilas a y b para formal las antenas cosechadoras de luz (Van den Broek et al Nature (London) 313, 358-363 (1985)).

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Para el caso de genes que no son de origen vegetal, en la secuencia iniciadora de la transcription se debe incluir un promotor y se puede emplear tambien una senal de inicio de la traduction optima para plantas o uno de los llamados potenciadores de la traduction.

Segun la presente invention, si el transgen procede de un organismo que no es de origen vegetal, entonces las protemas codificadas por dicho transgen forman parte de una protema de fusion que comprende en position N con respecto a la protema codificada por dicho gen, una secuencia de direccionamiento de protemas al cloroplasto.

Asi, si el transgen que codifica la caroteno desaturasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, entonces la caroteno desaturasa forma parte de una protema de fusion que comprende en posicion N con respecto a la caroteno desaturasa una secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto.

En una realization particular, la secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto es la secuencia de la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa, y mas particularmente tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 8.

En otra realizacion particular, al menos uno de los transgenes presenta adicionalmente en el extremo 3' una secuencia terminadora de la transcripcion. La secuencia terminadora de la transcripcion puede ser derivada del mismo gen de donde se obtuvo la secuencia promotora de la transcripcion o de un gen distinto. La secuencia terminadora puede ser derivada de genes contenidos en el T-DNA del plasmido Ti de Agrobacterium, del virus del mosaico de la coliflor o de genes de origen vegetal. Por ejemplo, la secuencia terminadora del gen de la nopalina sintetasa es frecuentemente usado en la Ingenieria Genetica de plantas. Mas particularmente la secuencia terminadora empleada es la secuencia terminadora del gen que codifica nopalina sintasa o la secuencia terminadora del gen que codifica la ADP-glucosa pirofosforilasa. Aun mas particularmente, la secuencia terminadora de nopalina sintasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 9 y la secuencia terminadora de ADP- glucosa pirofosforilasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 10.

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En una realizacion de la presente invencion cuando la planta de ma^z expresa el transgen correspondiente a la fitoeno sintasa con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, dicha secuencia presenta adicionalmente en el extremo 3'la secuencia terminadora de nopalina sintasa con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 9.

En otra realizacion particular, cuando la planta de maiz expresa el transgen correspondiente a la caroteno desaturasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, dicha secuencia presente adicionalmente en el extremo 3'la secuencia terminadora de ADP- glucosa pirofosforilasa SEQ ID NO: 10. En otra realizacion, la caroteno desaturasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, entonces la caroteno desaturasa forma parte de una protema de fusion que comprende en posicion N con respecto a la caroteno desaturasa una secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto, y adicionalmente en el extremo 3'presenta la secuencia terminadora de ADP- glucosa pirofosforilasa SEQ ID NO: 10.

Los transgenes que pueden emplearse en la presente invencion pueden ponerse bajo el control de elementos reguladores que aseguran la expresion en las celulas de las plantas. En general, tales elementos reguladores comprenden un promotor activo en las celulas de las plantas.

Por tanto, los promotores que pueden ser usados incluyen promotores de la planta que se desea transformar, promotores de otras plantas o de cualquier origen que sean funcionales en la planta blanco y dirijan una expresion constitutiva, inducible o tejido espedfica. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores derivados del plasmido Ti de Agrobactertum tumefaciens como son los promotores de la octopina sintetasa, la nopahna sintetasa o la sgropina Sintetasa. Ademas, se pueden incluir otros promotores como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor o aquellos derivados de geminivirus. Para una revision de promotores utiles puede verse Peremarti A. et al, Plant Mol Biol 73:363378.

La expresion temporal, inducible o tejido espedfica puede ser lograda mediante el uso de promotores o secuencias reguladoras que tienen la especificidad de expresion deseada.

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Con objeto de conseguir la expresion en tejidos espedficos de una planta transgenica es posible utilizar promotores espedficos de tejido (vease Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Se conocen tambien promotores que son espedficamente activos en semillas de diferentes especies de plantas, tales como maiz.

Los elementos reguladores pueden comprender adicionalmente intensificadores de la transcripcion y/o traduccion funcionales en las celulas de las plantas. Adicionalmente, los elementos reguladores pueden incluir senales de terminacion de la transcripcion, tales como una senal poli-A, que conducen a la adicion de una cola poli-A al transcrito que puede mejorar su estabilidad.

En una realizacion particular el transgen o transgenes se encuentra bajo el control de un promotor espedfico de endospermo.

Promotores espedficos de endospermo utiles en la presente invencion, son entre otros los promotores de genes que codifican para protemas de almacenamiento en semillas, Galili y col., 1993, Trends Cell Biol 3:437-442. Las prolaminas, son las protemas de almacenamiento de cereales mas abundantes, en maiz las zemas (zemas a, p, y y 5- zemas, en trigo las gluteninas, en cebada hordema, secalina en centeno y acenina en avena.

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de promotores espedficos de endospermo que pueden emplearse en la presente invencion son entre otros los promotores de glutenina LMW de trigo, hordema de cebada, prolamina de arroz, glutelina 1 de arroz, zema de maiz, de zeina 27 Kda, ADP-glucosa pirofosforilasa de arroz, glutelina I de arroz tal y como se describe en Russel DA. et al., Transgenic research 6, 157-168 (1997). Tambien son utiles, los promotores de MEG-1 tal y como se describe en EP1680506B1.

En una realizacion particular el promotor espedfico de endospermo es el promotor de D- hordema o el promotor de LMW glutenina. Mas particularmente el promotor de D-hordema es de cebada con secuencia mostrada en SEQ ID NO: 12 o del promotor de LMW glutenina de trigo con secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11.

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En una forma preferida de realization, el gen de la fitoeno sintasa se encuentra bajo control del promotor de la LMW glutenina, preferiblemente del promotor de la LMW glutenina de trigo. En otra forma preferida de realizacion, el gen de la carotena desaturasa se encuentra bajo control del promotor de la D-hordeina, preferiblemente del promotor de la D-hordeina de cebada.

La diferentes secuencias de acidos nucleicos que forman parte de la molecula de ADN recombinante pueden ser unidas por metodos convencionales descritos en la literatura. Las secuencias deben ser clonadas y unidas en la orientation y orden correcto para lograr la expresion funcional en celulas vegetales.

De acuerdo con uno de los aspectos de esta invention, las plantas de interes son transformadas con una o varias moleculas de ADN recombinante. En el desarrollo de la molecula recombinante, las diferentes secuencias nucleotidicas que la componen y que comprenden las secuencias regulatorias de la transcription y la secuencia codificante de interes, pueden haber sido sujetas a diferentes tipos de procesamiento, como son ligaciones, digestiones con enzimas de restriction, mutagenesis in vitro, adicion de oligonucleotidos o modificaciones por medio de la reaction de polimerizacion en cadena (PCR). Por lo tanto, los componentes de la molecula recombinante antes de ser unidos pueden estar sujetos a deleciones, inserciones o modificaciones internas. Como la molecula recombinante es derivada de componentes que se originan de diferentes organismos y que han sido aislados, purificados o sintetizados, no es una molecula que existe como tal en la naturaleza.

Dependiendo del metodo de transformation utilizado para introducir la molecula recombinante a la celula vegetal de interes, puede ser necesario la inclusion de otras secuencias de ADN. Por ejemplo, es necesario incluir un vector de donation molecular que permita su replication en E. coli y, para algunos casos, que permita la replication en A. tumefaciens. Para el uso del sistema de transformacion genetica mediada por el plasmido Ti de Agrobacterium para introducir la molecula recombinante en el genoma de la celula vegetal, es necesario incluir las secuencias bordes del T-DNA, de manera tal que esten presentes a ambos extremos del gen que codifica la enzima que sintetiza acidos organicos y en algunos casos el gen de selection dominante. El uso de cepas de

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Agrobacterium desarmadas, es decir aquellas a las que se les han removido los genes responsables de la formation de tumores, pero que mantienen la capacidad de transferir ADN a celulas vegetales, permite la regeneration de plantas transgenicas que contienen la molecula recombinante de interes.

Tambien generalmente se incluye un gen de selection dominante que permita identificar y seleccionar las celulas que incorporaron de manera estable la molecula recombinante en su genoma. A modo de ejemplo ilustrativo no limitativo, los genes marcadores pueden ser la mutation rrn16 (16S rRNA) que confiere resistencia a espectinomicina y estreptinomicina, la mutacion rps12 (ribosoma) que confiere resistencia a

estreptinomicina, gen aadA (E. coli) que codifica la enzima aminoglucosido 3’ adeniltransferasa que confiere resistencia a los antibioticos espectinomicina y estreptinomicina, gen nptll procedente del transposon bacteriano Tn5 codifica la enzima neomicina fosfotransferasa que confiere resistencia al antibiotico kanamicina, el gen aphA-6 de Acinetobacter baumannii que codifica la enzima aminoglucosido fosfotransferasa la cual le confiere resistencia al antibiotico kanamicina, gen cat de E. coli confiere resistencia a cloranfenicol, gen ASA2 responsable de la resistencia a analogos del triptofano, el gen bar de Streptomyces hygroscopicus que codifica para la enzima fosfinotricina acetil transferasa (PAT) que confiere resistencia a fosfinotricina y el gen pat de Streptomyces viridochromogenes convierten el glufosinato de amonio en nacetil glufosinato que es un compuesto no fitotoxico para la planta.

En una realization preferida el gen de seleccion es el gen bar. En una realization mas particular, el gen bar tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5.

Dependiendo del tipo de gen de seleccion que se incluya, puede ser aconsejable que una vez se ha identificado la planta transgenica, se elimine el gen marcador de seleccion de la planta.

En otra realizacion particular de la composition nutritiva o nutraceutico de la invention, la parte de la planta de maiz o un derivado de la misma esta enriquecida en un carotenoide seleccionado del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH

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equinenona, zeaxantina, Z-fitoeno, fitoeno y combinaciones de los mismos (composicion nutritiva B o nutraceutico B).

En una realizacion particular de la composicion nutritiva B o nutraceutico B de la invention, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en uno solo de los carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona, zeaxantina, Z-fitoeno, fitoeno.

En otra realizacion particular de la composicion nutritiva B o nutraceutico B, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 2 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona, zeaxantina, Z-fitoeno y fitoeno, incluyendo cualquier combination de los mismos.

En otra realizacion particular de la composicion nutritiva B o nutraceutico B, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 3 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH

equinenona, zeaxantina, Z-fitoeno y fitoeno, incluyendo cualquier combinacion de los mismos.

En otra realizacion particular de la composicion nutritiva B o nutraceutico B, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 4 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH

equinenona, zeaxantina, Z-fitoeno, fitoeno y combinaciones de los mismos.

En otra realizacion particular de la composicion nutritiva B o nutraceutico B, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 5 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH

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equinenona, zeaxantina, Z-fitoeno y fitoeno , incluyendo cualquier combinacion de los mismos.

En otra realization particular de la composition nutritiva B o nutraceutico B, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 6 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH

En otra realizacion particular de la composicion nutritiva B o nutraceutico B, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 7 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH

En otra realizacion particular de la composicion nutritiva B o nutraceutico B, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 8 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH

En otra realizacion particular de la composicion nutritiva B o nutraceutico B, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 9 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH

En otra realizacion particular de la composicion nutritiva B o nutraceutico B, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 10 carotenoides

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seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona, zeaxantina, Z-fitoeno y fitoeno , incluyendo cualquier combinacion de los mismos.

En otra realizacion particular de la composicion nutritiva B o nutraceutico B, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 11 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH

En otra realizacion particular de la composicion nutritiva B o nutraceutico B, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 12 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH

En otra realizacion particular de la composicion nutritiva B o nutraceutico B, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 13 carotenoides, concretamente astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno,

cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona,

zeaxantina, Z-fitoeno y fitoeno.

En otra realizacion de la composicion B nutritiva o nutraceutico B de la invencion la parte de la planta de maiz o derivado de la misma enriquecida en antioxidantes expresa un transgen que codifica una fitoeno sintasa, un transgen que codifica una beta caroteno cetolasa y un transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa. En otra realizacion de dicha composicion, la planta de maiz enriquecida en antioxidantes, expresa adicionalmente un ARNi espedfico de la licopeno epsilon ciclasa de maiz.

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En otra realizacion de la composicion nutritiva o nutraceutico de la invention la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en un carotenoide seleccionado del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona y combinaciones de los mismos (composicion nutritiva C o nutraceutico C).

En una realizacion particular de la composicion nutritiva C o nutraceutico C, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en uno solo de los carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina y 3-OH equinenona.

En otra realizacion de la composicion nutritiva C o nutraceutico C, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 2 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina y 3-OH equinenona,

incluyendo cualquier combination de los mismos.

En otra realizacion de la composicion nutritiva C o nutraceutico C, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 3 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina y 3-OH equinenona,

incluyendo cualquier combinacion de los mismos.

En otra realizacion de la composicion nutritiva C o nutraceutico C, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 4 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina y 3-OH equinenona,

incluyendo cualquier combinacion de los mismos.

En otra realizacion de la composicion nutritiva C o nutraceutico C, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 5 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno,

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cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina y 3-OH equinenona, incluyendo cualquier combinacion de los mismos.

En otra realization de la composition nutritiva C o nutraceutico C, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 6 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina y 3-OH equinenona,

incluyendo cualquier combinacion de los mismos.

En otra realizacion de la composicion nutritiva C o nutraceutico C, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 7 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina y 3-OH equinenona,

incluyendo cualquier combinacion de los mismos.

En otra realizacion de la composicion nutritiva C o nutraceutico C, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 8 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina y 3-OH equinenona,

incluyendo cualquier combinacion de los mismos.

En otra realizacion de la composicion nutritiva C o nutraceutico C, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma nutraceutico se encuentra enriquecida en 9 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina y 3-OH equinenona, incluyendo cualquier combinacion de los mismos.

En otra realizacion de la composicion nutritiva C o nutraceutico C, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en 10 carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina y 3-OH equinenona, incluyendo cualquier combinacion de los mismos.

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En otra realizacion de la composicion nutritiva C o nutraceutico C de la invencion, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma enriquecida en antioxidantes procede del cruzamiento entre una lmea de maiz con alto nivel de aceite y un maiz que expresa un transgen que codifica una fitoeno sintasa, un transgen que codifica una beta caroteno cetolasa y un transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa. En una realizacion mas particular, el maiz que expresa un transgen que codifica una fitoeno sintasa, un transgen que codifica una beta caroteno cetolasa y un transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa expresa adicionalmente un ARNi espedfico de la licopeno epsilon ciclasa de maiz.

El experto en la materia conoce diversos metodos para identificar una planta de maiz con alto nivel de aceite, a modo de ejemplo ilustrativo no limitativo mediante la determination del contenido de aceite en grano de maiz empleando la metodologia descrita en Galicia, L., E. Nurit, A. Rosales, and N. Palacios-Rojas. 2009. Maize Nutrition Quality and Plant Tissue Analysis Laboratory. Laboratory Protocols 2008. Centro Internacional de Mejoramiento de Maiz y Trigo. Mexico, D.F. 42 p. Se puede considerar que una planta de maiz presenta alto nivel de aceite, cuando el nivel de aceite en los granos de maiz es al menos un 6% mayor que el contenido en granos de un maiz silvestre.

En otra realizacion particular de la composicion nutritiva C o nutraceutico C de la invencion, la lmea de maiz con alto nivel de aceite es la lmea NSL30876.

En una realizacion particular de las composiciones nutritivas B y Co nutraceuticos B y C de la invencion, las secuencias de los trangenes tienen adaptados los codones para su expresion en plantas.

En otra realizacion particular de las composiciones B y C de la invencion el transgen que codifica una fitoeno sintasa procede de Zea mays y tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, el transgen que codifica una beta caroteno cetolasa procede de Chlamydomonas reinhardtii y tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 14, el transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa procede de Brevidomonas sp. y tiene la

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secuencia mostrada en SEQ ID NO: 15 y/o el ARNi espedfico de la licopeno epsilon ciclasa de maiz tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 16.

En otra realization particular de las composiciones B y C de la invention si el transgen que codifica una beta caroteno cetolasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 14 y/o el transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 15, entonces la protema codificada por dichos genes se encuentra formando parte de una protema de fusion que comprende una secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto. Particularmente, la secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto es la secuencia que codifica la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa y mas particularmente la secuencia que codifica la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:8.

En otra realizacion particular de las composiciones B y C de la invencion, al menos un transgen o ARNi se encuentran bajo el control de un promotor espedfico de endospermo, particularmente el promotor espedfico de endospermo se selecciona de entre el promotor de D-hordema, el promotor de LMW glutenina y el promotor de gamma-zeina. Mas particulamente, el promotor de D-hordema tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 12, el promotor de LMW glutenina tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11 y el promotor de gamma-zeina tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 13.

En otra realizacion, el transgen comprende adicionalmente en el extremo 3' la region 5'UTR del gen de la alcohol deshidrogenasa de arroz, mas particularmente dicha region tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 17.

Usos de las composiciones de la invencion.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso de una composition nutritiva o nutraceutico segun cualquiera la invencion (composicion nutritiva A, Bo C, o nutraceutico A, B o C) para la obtencion de huevos enriquecidos en antioxidantes.

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Un experto en la materia conoce diversos metodos para determinar el nivel de antioxidantes tal y como se ha explicado en detalles anteriormente, en relation con una planta enriquecida en antioxidantes.

Las composiciones de la invention pueden emplearse para la obtencion de huevos enriquecidos en antioxidantes de cualquier individuo oviparo hembra que sea alimentada con dichas composiciones.

En una realization preferida los huevos son huevos de un ave de corral, mas particularmente de gallina.

Usos de una parte de una planta de malz enriquecida en antioxidantes o un derivado de la misma

En otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso de una parte de una planta de maiz enriquecida en antioxidantes o un derivado de la misma para la obtencion de huevos enriquecidos en antioxidantes.

En una realizacion particular del uso de la invencion, la parte de la planta de maiz es el endospermo, la semilla o derivados de los mismos.

En otra realizacion particular, los antioxidantes que se encuentran enriquecidos en una parte de una planta de maiz o en un derivado de la misma son carotenoides.

En una realizacion mas particular del uso de la invencion, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en carotenoides seleccionados del grupo formado por p-caroteno, Y-caroteno, a-caroteno, a-criptoxantina, p-criptoxantina, licopeno, lutema, zeaxantina y combinaciones de los mismos (uso A de la invencion)

En una realizacion particular del uso A de la invencion, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en uno solo de los carotenoides, o en 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 seleccionados de p-caroteno, Y-caroteno, a-caroteno, a-criptoxantina, p- criptoxantina, licopeno, lutema, zeaxantina y combinaciones de los mismos.

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Todas las combinaciones mencionadas anteriormente, en relation con la composition nutritiva A o nutraceutico A de la invention, son igualmente aplicables a este aspecto.

En otra realization del uso A de la invencion la parte de la planta de maiz o derivado de la misma enriquecida en antioxidantes es una planta de maiz transgenica que expresa al menos un transgen que codifica una fitoeno sintasa y un transgen que codifica una caroteno desaturasa. En otra realizacion, la planta de maiz expresa adicionalmente un transgen seleccionado del grupo formado por un transgen que codifica una licopeno p- ciclasa, un transgen que codifica una p-caroteno hidroxilasa y un transgen que codifica una carotenoide cetolasa.

En una realizacion particular, las secuencias de los transgenes tienen adaptados los codones para su expresion en plantas.

En una realizacion particular, el transgen que codifica la fitoeno sintasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, el transgen que codifica la caroteno desaturasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, el transgen que codifica la licopeno p-ciclasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:3, el transgen que codifica la p-caroteno hidroxilasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6 y/o el transgen que codifica la carotenoide cetolasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:7.

En otra realizacion mas particular, si el transgen que codifica una caroteno desaturasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2 entonces la protema codificada por dicho gen se encuentra formando parte de una protema de fusion que comprende en el extremo 5' una secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto, mas particularmente la secuencia que codifica la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa, y mas particularmente dicha secuencia, tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 8.

En otra realizacion, si el transgen que codifica una fitoeno sintasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, dicha secuencia presenta adicionalmente en el extremo 3' la secuencia terminadora de nopalina sintasa con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 9.

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Los trangenes pueden presentar adicionalmente en el extremo 3' una secuencia terminadora de la transcription, particularmente es la secuencia terminadora de nopalina sintasa o la secuencia terminadora de ADP-glucosa pirofosforilasa. Mas particularmente la secuencia terminadora de nopalina sintasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 9 y la secuencia terminadora de ADP- glucosa pirofosforilasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 10.

De acuerdo a este aspecto, un al menos un transgen se encuentra bajo el control de un promotor espedfico de endospermo, particularmente el promotor espedfico de endospermo es el promotor de D-hordema o el promotor de LMW glutenina. Mas particularmente, el promotor de D-hordema tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 12 y el promotor de LMW glutenina tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11.

En otra realization, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma esta enriquecida en carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona, zeaxantina, Z-fitoeno, fitoeno y combinaciones de los mismos (uso B de la invention).

En una realizacion particular del uso B de la invencion, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en uno solo de los carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona, zeaxantina, Z-fitoeno y fitoeno.

En una realizacion particular, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en uno solo de los carotenoides, o en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 seleccionados de astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona,

zeaxantina, Z-fitoeno y fitoeno, incluyendo todas las posibles combinaciones.

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En una realization particular del uso B de la invention, la parte de la planta de ma^z o derivado de la misma enriquecida en antioxidantes expresa un transgen que codifica una fitoeno sintasa, un transgen que codifica una beta caroteno cetolasa y un transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa, y mas particularmente expresa adicionalmente un ARNi espetifico de la licopeno epsilon ciclasa de maiz.

Todas las combinaciones mencionadas anteriormente, en relation con la composition nutritiva B o nutraceutico B de la invencion, son igualmente aplicables al uso B de la invencion.

En otra realizacion particular, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona y combinaciones de los mismos (uso C de la invencion).

En una realizacion particular del uso C de la invencion, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en uno solo de los carotenoides seleccionados del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina y 3-OH equinenona.

En una realizacion particular, la parte de la planta de maiz o derivado de la misma se encuentra enriquecida en uno solo de los carotenoides, o en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, seleccionados de astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona incluyendo todas las posibles combinaciones.

Todas las combinaciones mencionadas anteriormente, en relacion con la composicion nutritiva C o nutraceutico C de la invencion, son igualmente aplicables a este aspecto.

En una realizacion particular del uso C de la invencion, la planta de maiz enriquecida en antioxidantes procede del cruzamiento entre una lmea de maiz con alto nivel de aceite,

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particularmente la lmea NSL30876 y un maiz que expresa un transgen que codifica una fitoeno sintasa, un transgen que codifica una beta caroteno cetolasa, un transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa. Mas particularmente, la planta expresa adicionalmente un ARNi espedfico de la licopeno epsilon ciclasa de maiz.

En otra realizacion particular, las secuencias de los trangenes tienen adaptados los codones para su expresion en plantas. Mas particularmente, el transgen que codifica una fitoeno sintasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, el transgen que codifica una beta caroteno cetolasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 14, el transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 15 y/o el ARNi espedfico de la licopeno epsilon ciclasa de maiz con secuencia SEQ ID NO: 16.

Al menos un transgen o ARNi se pueden encontrar bajo el control de un promotor espedfico de endospermo, particularmente el promotor espedfico de endospermo se selecciona de entre el promotor de D-hordema, el promotor de LMW glutenina y el promotor de gamma-zeina y mas particularmente el promotor de D-hordema tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:12 , el promotor de LMW glutenina tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11 y el promotor de gamma-zeina tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 13.

En otra realizacion particular de los usos B y C de la invencion, si el transgen que codifica para una beta caroteno cetolasa tiene la secuencia SEQ ID NO: 14 y/o el transgen que codifica para la beta caroteno hidroxilasa tiene la secuencia SEQ ID NO: 15, entonces el transgen presenta en el extremo 5' una secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto. Mas particularmente, la secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto es la secuencia que codifica la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa, mas particularmente, la secuencia que codifica la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 8.

En otra realizacion particular, el transgen comprende adicionalmente en el extremo 3' la region 5'UTR del gen de la alcohol deshidrogenasa de arroz, mas particularmente la

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region 5'UTR del gen de la alcohol deshidrogenasa de arroz tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 17.

En otra realization particular, los huevos son huevos de un ave de corral, particularmente gallina.

Todas las realizaciones y limitaciones previamente descritas son igualmente aplicables a este aspecto.

Huevo y ovoproductos

En otro aspecto, la invention se relaciona con un huevo y ovoproductos derivados de dicho huevo obtenidos segun cualquier uso de la invencion, concretamente del uso de la composition nutritiva o nutraceutico A, B o C, o usos de la parte de una planta de maiz enriquecida en antioxidantes A, B o C.

Como entendera el experto en la materia, los huevos de la invencion son obtenidos tras alimentar un ave hembra con una composicion nutritiva o nutraceutico A, B o C o con una planta de maiz enriquecida en antioxidantes A, B o C.

MATERIALES Y METODOS

Transformation del Maiz

Ma^z

El maiz (Zea mays) variedad M37W (endospermo blanco) se obtuvo de CSIR, Pretoria, Sudafrica. La lmea de alto aceite NSL 30876 denominada R38 en la presente description fue proporcionado amablemente por el USDA, ARS, NCRPIS, la Universidad Estatal de Iowa, Estacion Regional de Introduction de Plantas, Ames, Iowa, Estados Unidos, 50011-

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1170. Ambas variedades, la lmea transgenica seleccionada y los cruces, fueron cultivadas en el invernadero a 28 / 20°C temperatura d^a/temperatura noche con un fotoperiodo de 10-h y 60-90% de humedad durante los primeros 50 d^as, seguidos de mantenimiento en 21/18°C temperatura d^a/temperatura noche con un fotoperiodo de 16-h a partir de entonces.

La lmea M37-pH3 ha sido descrita anteriormente en ES2501367A2 y en Naqvi S. et al, PNAS, 2009 vol,. 106, no. 19 paginas 7762-7767.

La lmea M37-BKT fue cruzada con M37W y NSL30876 y generaciones homocigotos T2 y T3 fueron derivados por autofecundacion. Se congelaron en nitrogeno liquido y se almacenaron a -80 °C antes de su uso, muestras de endospermo de semillas inmaduras recogidas a los 30 dias despues de la polinizacion (DAP).

Construccion de vectores y transformacion

1) -Construccion P326-Zmpsy1 que comprende el ADNc de fitoeno sintasa 1 de Zea mays dirigidos por el promotor de la glutenina LMW de trigo.

El ADNc PSY1 (fitoeno sintasa 1) de Zea mays (zm) fue clonado a partir de la lmea consangumea B73 por RT-PCR con el cebador directo 5’- AGGATCCATGGCCATCATACTCGTACGAG-3’ (SEQ ID NO: 18) con el sitio BamHI (subrayado) y cebador inverso 5’-AGAATTCTAGGTCTGGCCATTTCTCAATG-3’ (SEQ ID NO:19) con sitio EcoRI (subrayado). El plasmido P326-ZmPSY1 (Zhu et al. 2008 Proc Natl Acad Sci USA 105:18232-18237) esta bajo el control del promotor de la glutenina LMW (Colot et al. 1987 EMBO J 6:3559-3564).

2) - Construccion pHorP-RNAi-Zmlyce que comprende el fragmento largo de 417 pb del ARNm de licopeno epsilon-ciclasa de maiz (SEQ ID NO: 16) elegido para construir la doble cadena de la construccion de ARNi conducida por el promotor de la D-hordema de cebada SEQ ID NO: 12) junto con el gen de selection bar (SEQ ID NO: 5) conducido por el promotor del gen ubiquitina-1 del maiz (SEQ ID NO: 24).

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Un fragmento de ADNc LYCE (licopeno epsilon ciclasa de ma^z) se amplified por RT-PCR con ADNc de ZmLYCE como plantilla utilizando el cebador directo (5’- ggaattctctagacgatctcggcgccgctcggctgct-3’) (SEQ ID NO: 20) con los sitios EcoRI y Xbal (subrayado) y el cebador reverso (5’-gactagtggatcccaatgagacctacagtgagacct-3’) (SEQ ID NO:21) con sitios Spel y BamHI en base a information de la secuencia en GenBank (numeros de acceso EF622043 a fecha 4 septiembre 2009). Este ADN sentido se clono en el vector pHorP (S0rensen et al. 1996 Molec Gen Genetics 250:750 -760) que contiene el promotor de la hordema D de la cebada (SEQ ID NO: 12) con un fragmento de 306 pares de bases del gen gusA (SEQ ID NO: 25) y el terminador de la ADP-glucosa pirofosforilasa a traves de la restriction con XbaI y BamHI y el fragmento de LYCE antisentido en sitios SpeI y EcoRI.

3) - Construction pGZ63-sCrbkt, que comprende sCrbkt truncado y sintetizado qmmicamente (beta-caroteno cetolasa) de Chlamydomonas reinhardtii fusionado con la subunidad pequena de la rubisco de guisante (SSU) y la region 5' no traducible (5'UTR) del gen de la alcohol deshidrogenasa del arroz, conducido por el promotor gamma-zema de maiz (la secuencia util del codon sCrbkt fue modificada para maiz).

El gen truncado p-caroteno cetolasa (sCrBKT) Chlamydomonas reinhardtii sintetizado qmmicamente (Zhong et al. 2011 J Exp Bot 62:3659-3669) se fusiono a la subunidad pequena de guisante Rubisco (SSU) (Schreier et al. 1985 EMBO J 4:25-32) (el CrBKT y codon SSU se modifico a una preferencia de plantas monocotiledoneas, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 22) y la region 5' no traducida (5'UTR) del gen de la alcohol deshidrogenasa de arroz (SEQ ID NO: 17)(Surgio et al. 2008 J Biosci Bioeng 105:300302) se inserto en el vector pGZ63 (Zhu et al. 2008 Proc Natl Acad Sci USA 105:1823218237) entre el promotor de Y-zema y el terminador Nos utilizando los sitios de restriction BamHI y SacI.

4) - Construction pGZ63-sBrcrtZ. El gen beta-caroteno hidroxilasa (sBrcrtZ) sintetizado qmmicamente de Brevundimonas sp. SD212 fusionado con la SSU (subunidad pequena de la Rubisco) de guisante y 5'UTR del gen de la alcohol deshidrogenasa de arroz,

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conducido por el promotor de maiz gamma-zema espedfico del endospermo (los codones utiles del BrcrtZ se modificaron a tipo de planta dicotiledonea - colza).

El gen Crtz que codifica la beta-caroteno hidroxilasa de Brevundimonas sp. SD212 Strain (MBIC 03.018) (Nishida et al. 2005 Appl Environ Microbiol 71:4286-4296) fue sintetizado qmmicamente de acuerdo con el uso de codones de Brassic napus (numero de acceso AB377272 del a base de datos de GenBank 16, junio 2010) y amablemente proporcionados por el Dr. Norihiko Misawa, Universidad de la Prefectura de Ishikawa, Japon). El gen sBrCRTZ fusionado con la subunidad pequena de Rubisco (SSU) de guisante y la region 5'-no traducida (5'UTR) del gen de la alcohol deshidrogenasa de arroz se digirio con BamHI y SacI. La quimera formada por Crtz con codones optimizados y SSU corresponde a la SEQ ID NO: 23 Los fragmentos digeridos fueron clonados en el sitio BamHI y SacI de pGZ63 con el promotor del gen de gamma zema de maiz para generar pGZ63-sBrCRTZ. El gen bar que codifica fosfinotricina N-acetiltransferasa (Thompson et al., 1987 EMBO J 6:2513-2518) se utilizo como un marcador seleccionable.

El procedimiento utilizado para la transformacion de maiz M37W se describe en Zhu et al. 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105:18232-18237. Las plantas M37M-BKT- con mayor acumulacion de astaxantina se cruzaron con una lmea de alta aceite (NSL30876) para generar NSL30876-BKT.

Seleccion de la linea elite de produccion de astaxantina y otros cetocarotenoides

La mejor linea BKT con alta produccion de astaxantina y otros cetocarotenoides en el endospermo fue elegida para los cruzamientos con la linea de maiz con alto nivel de aceite NSL30876, tambien denominada R78 (Jugenheimer RW Euphytica 10 (1961): 152156, y el libro Specialty corns, Hallauer Arnel R. Caprtulo 5 "High-oil corn hybrids” Robert J. Lambert)

La linea hibrida NSL30876 x M37W BKT (F3) sobreexpresante produjo niveles de astaxantina de hasta 18.83^g/g peso seco. La cantidad de cetocarotenoides totales alcanzo aproximadamente 35^g/g peso seco (mas del 73% del total de carotenoides - 48.63^g/g peso seco). Fue confirmada la expresion espedficamente en el endospermo

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del maiz mediante analisis de ARNm de transferencia de todos los transgenes introducidos involucrados en la ruta metabolica diana.

Analisis de la calidad de huevo

Para determinar la calidad del huevo se midio el grosor de la cascara mediante un micrometro espedfico 4001-DIG (Baxlo Precision, Polinya, Espana), con una sensibilidad de 1j y provisto de contactos para superficies curvas. El peso del huevo, el color segun la ESCALA DSM (del ingles DSM yolk color fan (DYCF), la altura del albumen y las Unidades Haugh (UH = 100 x Log [Altura de la clara densa -1.7 x (peso huevo) 0,37 + 7,57] se midieron con el Egg Analyzer™ (ORKA Technology Ltd., Ramat Hasharon, Israel).

Analisis de carotenoides

Las muestras para el analisis de carotenoides se recogieron el dia 0 del experimento para comprobar el nivel de carotenos de la yema de huevo que teman los animales en granja, a dia 13 para poder comprobar si el periodo de deplecion habia conseguido disminuir los carotenos en la yema, y a dia 20 y 30 para ver la evolucion y diferencias en las cantidades de carotenos de los distintos tratamientos experimentados. Las muestras se congelaron a -80°C, posteriormente se liofilizaron y se enviaron a analizar. La tecnica de analisis fue la siguiente:

Los carotenoides totales, fueros extractados en 20 ml de metanol conteniendo un 6% de KOH a 60°C y durante 15-20 minutos. Los compuestos lipofflicos, se separaron en una solucion con 30% de eter en petroleo y la fase superior fue recogida. Los carotenoides totales fueron determinados midiendo la absorbancia a 450 nm. Para la separacion por HPLC, el solvente fue evaporado en vapor de nitrogeno a 37°C, disuelto en 100 jL de metanol/diclorometano (50:50) y una alicuota de 20 jl fue inyectada inmediatamente. Los compuestos fueron separados en una columna de 15 cm Nucleosil C18 3-|j con acetonitril/metanol/2-propanol (85:15:5) v/v/v en fase movil a 20°C. Las muestras fueron monitorizadas con un Kontron DAD 440 fotodiodo detector, con registro online del espectro. Todos los carotenoides fueron identificados por cromatografia con compuestos autenticos de refencia, los cuales fueron biosintetizados en E.coli como describe

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Sandmann (Sandmann, G. (2002) Combinatorial biosynthesis of carotenoids in a heterologous host: a powerful approach for the biosynthesis of novel structures. ChemBioChem. 3: 629-635) y sus espectros fueron comparados. Esos estandares tambien fueron usados para la cuantificacion, en combination con los coeficientes de extincion de Davies (Davies, B.H. (1976) Carotenoids. In: Chemistry of Plant Pigments (Goodwin, T.W., ed), pp. 149-155. London, UK: Academic Press). El retinol fue comprado a Sigma Chemicals. El acido retinoico conjugado (RAC), derivado del retinol, fue identificado por el espectro tipico del acido retinoico con picos maximos a 328, 350 y 368 nm. Fue cuantificado usando retinol como estandar con correction por el coeficiente de extincion mM para el retinol (45,0 para 325 nm) y acido retinoico (53,5 para 350 nm)

EJEMPLO 1

Como se demuestra a continuation es posible el aporte de Vitamina A, carotenos y cetocarotenoides a las gallinas ponedoras de forma exclusiva y completa a traves del maiz incorporado en la dieta, mediante el uso de dos variedades obtenidas por ingenieria genetica y que expresan elevadas cantidades de carotenos y cetocarotenoides. La suficiencia en el aporte de carotenos desde el punto de vista del consumidor viene marcada cuando se alcanzan los valores comerciales habituales de color amarillo-naranja en la yema de huevo fresco y que se miden generalmente de acuerdo con la escala la escala DSM (en ingles DSM yolk color fan (DYCF)) de color.

Las dos variedades de maiz estudiadas son las siguientes: M37W-Ph-3 y NSL30876 x BKT.

Los carotenoides mayores en la lmea silvestre NSL30876 son lutema y zeaxantina y de la lmea silvestre M37W lutema y zeaxantina

La lmeas transgenicas desarrolladas presentan los siguientes carotenoides:

- BKT: violaxantina, anteraxantina, lutema, zeaxantina, p-caroteno, astaxantina, cantaxanthin, p-cryptoxantina, Z-fitoeno, Adonixantina, adonirubina, 3-OH- equinenona, p-zeacaroteno, fitoeno

- M37W-Ph-3: lutema, zeaxantina, p-carotenos, licopeno y alfa y beta criptoxantina

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- NSL30876 x BKT: astaxantina violaxantina, antheraxantina , lutema, zeaxantina,

P-caroteno, p-cryptoxantina, 3-OH-equinenona y otros cetocarotenoides como cantaxantina, adonixantina, adonirubina

El ensayo se realizo con gallinas ponedoras de tipo comercial en las instalaciones de la Universidad de Lleida (Espana). En las dietas experimentales se uso un 62% de maiz. Los diferentes tipos de maiz empleados fueron los siguientes: maiz isogenico control blanco, maiz M37W-Ph-3, ma^z NSL30876 x BKT y maiz estandar comercial. Se recogieron muestras de pienso, de yemas de los huevos y de higados que se liofilizaron para su posterior analisis de carotenos

Se determino el contenido en carotenos en muestras de pienso (Figura 1) yema de huevos (Figura 2) y en higados liofilizados (Figura 3).

El uso en la dieta de las gallinas ponedoras de maiz rico en pigmentos antioxidantes, (M37W-Ph-3) producen huevos con una mayor calidad nutricional derivada del aporte de carotenoides (57,5 ^g/g de materia seca de yema).

El uso en la dieta de las gallinas ponedoras de maiz rico en antioxidantes, NSL30876 x BKT produce huevos con una mayor calidad nutricional derivada del aporte de carotenoides (24,49 ^g/g de materia seca de yema).

En cambio la variedad salvaje de maiz blanco M37W produce huevos de yema decolorada, (Valor DSM <1) y concentration total de carotenoides en la yema 1,81 ^g/g de materia seca de yema).

El uso en la dieta de las gallinas ponedoras de maiz rico en antioxidantes, M37W-Ph-3 produce yemas de huevos con alto contenido en zeaxantina (29,89 ^g/g de materia seca de yema).

El uso en la dieta de las gallinas ponedoras de maiz rico en antioxidantes, NSL30876 *BKT produce yemas de huevos con alto contenido en carotenos, zeaxantina (10,77±1,33

^g/g de materia seca de yema) y cetocarotenos, astaxantina (6,56±0,56 ^g/g de materia seca de yema)

En la tabla 1 se pueden observar los datos de calidad del huevo al Inicio (a la entrada del 5 experimento, ya que las gallinas proveman de una granja con pienso estandar de ponedoras), Deplecion (a los 13 dias del ensayo despues de la ingestion del pienso con maiz blanco maiz control blanco, M37W y Tratamiento (despues del final del ensayo y de 20 dias de consumo de los piensos elaborados con los diferentes tipos de maiz.

10 En el experimento no se observaron diferencias en los distintas medidas de calidad del huevo excepto en el color segun ESCALA DSM, en el que se observa que se llegan a conseguir los valores comerciales previos e incluso superarlos en el color de la yema en ambos casos con solo el maiz (M37W-Ph-3 y NSL30876xBKT).


: M37W M37W-Ph3 NSL30876xBKT Malz comercial

Peso huevo (g): Inicio 63,81±1,124 61,76±1,531 64,75±1,478 65,17±1,350

Deplecion: 60,90±1,682 61,35±1,578 64,05±1,281 64,91±1,523

: Tratamiento 68,06±1,352 63,71±1,168 66,85±1,274 68,92±1,479

Resistencia rotura (Kg): Inicio 3,35±0,245 3,23±0,405 3,53±0,314 3,68±0,190

Deplecion: 3,01±0,157 3,86±0,215 3,81±0,227 3,56±0,280

: Tratamiento 3,71±0,258 3,87±0,195 3,81±0,146 3,25±0,185

Altura: Inicio 5,88±0,340 6,59±0,636 6,16±0,632 6,98±0,296

albumen (Hmm): Deplecion 5,12±0,322 5,72±0,275 5,58±0,367 5,62±0,256

Tratamiento: 6,08±0,417 5,70±0,229 5,01±0,511 5,56±0,214

: Inicio 9,83±0,207 9,86±0,143 10,13±0,227 10,11±0,000

Color DSM: Deplecion 1,08±0,077 1,33±0,256 1,64±0,308 1,00±0,261

: Tratamiento 1,25±0,250 10,08±0,313 11,38±0,241 4,22±0,222

Inicio 73,97±2,608 74,61±4,728 74,80±4,943 81,10±2,472

Deplecion 69,02±3,073 75,28±1,578 70,76±2,983 71,97±1,794

Tratamiento 73,08±3,328 69,73±3,335 66,22±3,601 69,69±1,787

Inicio 320,33±10,227 315,29±22,561 343,25±11,965 319,67±13,317

Grosor

cascara Deplecion 347,36±7,443 339,12±11,078 356,68±11,242 332,60±7,294

(mm) ___________________________________________________________________

Tratamiento 359,58±19,434 357,46±10,377 364,08±10,117 359,25±10,547

Tabla 1.

Unidades

Haugh

Durante el ensayo, el color de la yema se determino obteniendo las coordenadas L*, a*, b* en el espacio CIELAB mediante un colorimetro Konica Minolta CM-700d (Konica 5 Minolta Sensing Inc., Osaka, Japan) con un area de medida de 8 mm, iluminante D65 y angulo de observation de 10°. Como contenedor de la yema se utilizo una capsula de cristal optico cilmdrica de 34 mm de diametro (Hellma, Mullheim, Germany).

En la tabla 2 se muestran los valores de L*, a* y b* medios para cada tratamiento al final 10 del experimento (dias 32 y 33 del experimento). Se puede apreciar que la L* se mantiene constante en todos los tratamientos, en cambio los valores de a* y b* fluctuan segun el tratamiento y el contenido de carotenos presentes en los maices de las dietas.

: L* a* b*

M37W: 57,96±0,598 -1,16±0,073 9,72±0,951

M37W-Ph3: 51,69±0,554 10,82±0,435 22,67±1,407

NSL30876 x

BKT: 49,37±0,938 13,63±0,620 17,45±0,895

Malz comercial: 56,78±0,696 3,58±0,176 25,43±2,382

Tabla 2.

15 El uso de las variedades de maiz M37W-Ph-3 y NSL30876 x BKT a concentraciones del 62% en la dieta hace innecesario el uso de los pigmentos exogenos para conseguir

huevos con yemas dentro de la gama de color aceptada por el consumidor. Este efecto no es conseguido por el maiz estandar convencional empleado en la misma proporcion en la dieta.

5 El empleo de las variedades de ma^z desarrolladas, permite reducir el coste de pienso fabricado al eliminar el coste que supone anadir los carotenos exogenamente y simplifica el proceso de fabrication de pienso.

El termino "Sequence listing” en la lista de secuencias se refiere a "Lista de secuencias”, "Artificial Sequence” a "Secuencia artificial” y el termino "DNA” se refiere a "ADN”.

Claims

5

10

15

20

25

30

REIVINDICACIONES

1- Composition nutritiva o nutraceutico que comprende una parte de una planta de ma^z enriquecida en antioxidantes o un derivado de la misma.

2- Composicion segun la reivindicacion 1 que comprende al menos entre un 50 y un 80% de una parte de una planta de maiz enriquecida en antioxidantes o un derivado de la misma

3- Composicion segun la reivindicacion 2 que comprende al menos entre un 60 y un 70% de una parte de una planta de maiz enriquecida en antioxidantes o un derivado de la misma.

4- Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde la parte de la planta de maiz es el endospermo, la semilla o derivados de los mismos.

5- Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde los antioxidantes parte de una planta de maiz son carotenoides.

6- Composicion segun la reivindicacion 5 en donde los carotenoides se seleccionan del grupo formado por p-caroteno, Y-caroteno, a-caroteno, a-criptoxantina, p- criptoxantina, licopeno, lutema, zeaxantina y combinaciones de los mismos.

7- Composicion segun la reivindicacion 6 en donde la planta de maiz enriquecida en antioxidantes es una planta de maiz transgenica que expresa al menos un transgen que codifica una fitoeno sintasa y un transgen que codifica una caroteno desaturasa.

8- Composicion segun la reivindicacion 7 en donde la planta de maiz expresa adicionalmente un transgen seleccionado del grupo formado por un transgen que codifica una licopeno p-ciclasa, un transgen que codifica una p-caroteno hidroxilasa y un transgen que codifica una carotenoide cetolasa.

5

10

15

20

25

30

9- Composition segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 en donde las secuencias de los transgenes tienen adaptados los codones para su expresion en plantas.

10- Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 en donde el transgen que codifica la fitoeno sintasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, el transgen que codifica la caroteno desaturasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, el transgen que codifica la licopeno p-ciclasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:3, el transgen que codifica la p-caroteno hidroxilasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:15 y el transgen que codifica la carotenoide cetolasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:7.

11- Composicion segun la reivindicacion 10, en donde si el transgen que codifica la caroteno desaturasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, entonces la caroteno desaturasa forma parte de una protema de fusion que comprende en position N con respecto a la caroteno desaturasa una secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto.

12- Composicion segun la reivindicacion 11 en donde la secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto es la secuencia de la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa.

13- Composicion segun la reivindicacion 12 en donde la secuencia que codifica la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 8.

14- Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13 en donde al menos uno de los transgenes presenta adicionalmente en el extremo 3' una secuencia terminadora de la transcription.

5

10

15

20

25

30

15- Composicion segun la reivindicacion 14 en donde la secuencia terminadora de la transcripcion es la secuencia terminadora del gen que codifica nopalina sintasa o la secuencia terminadora del gen que codifica la ADP-glucosa pirofosforilasa.

16- Composicion segun la reivindicacion 15 en donde la secuencia terminadora de nopalina sintasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 9 y la secuencia terminadora de ADP- glucosa pirofosforilasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 10.

17- Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 16 en donde al menos uno de los transgenes se encuentra bajo el control de un promotor espedfico de endospermo.

18- Composicion segun la reivindicacion 17 en donde el promotor espedfico de endospermo es el promotor de D-hordema o el promotor de LMW glutenina.

19- Composicion segun la reivindicacion 18 en donde el promotor de D-hordema tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 12 y el promotor de LMW glutenina tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11.

20- Composicion segun la reivindicacion 5 en donde los carotenoides se seleccionan del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta- caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona, zeaxantina, Z-fitoeno, fitoeno y combinaciones de los mismos.

21- Composicion segun la reivindicacion 20 en donde la planta de maiz enriquecida en antioxidantes expresa un transgen que codifica una fitoeno sintasa, un transgen que codifica una beta caroteno cetolasa y un transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa

22- Composicion segun la reivindicacion 21 en donde la planta de maiz enriquecida en antioxidantes expresa adicionalmente un ARNi espedfico de la licopeno epsilon ciclasa de maiz.

5

10

15

20

25

30

23- Composicion segun la reivindicacion 5 en donde los carotenoides se seleccionan del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta- caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona y combinaciones de los mismos.

24- Composicion segun la reivindicacion 23 en donde la planta de maiz enriquecida en antioxidantes procede del cruzamiento entre una lmea de ma^z con alto nivel de aceite y un maiz que expresa un transgen que codifica una fitoeno sintasa, un transgen que codifica una beta caroteno cetolasa y un transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa.

25- Composicion segun la reivindicacion 24 en donde la planta de maiz que expresa un transgen que codifica una fitoeno sintasa, un transgen que codifica una beta caroteno cetolasa y un transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa expresa adicionalmente un ARNi espedfico de la licopeno epsilon ciclasa de maiz.

26- Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 24 o 25 en donde la lmea de maiz con alto nivel de aceite es la lmea NSL30876.

27- Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 21, 22, 24-26 en donde las secuencias de los trangenes tienen adaptados los codones para su expresion en plantas.

28- Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 21, 22-27 en donde el transgen que codifica una fitoeno sintasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, el transgen que codifica una beta caroteno cetolasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 14, el transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 15 y el ARNi espedfico de la licopeno epsilon ciclasa de maiz con secuencia SEQ ID NO: 16.

5

10

15

20

25

30

29- Composition segun la revindication 28, en donde si el transgen que codifica una beta caroteno cetolasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 14 y/o el transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 15, entonces la protema codificada por dichos genes se encuentra formando parte de una protema de fusion que comprende una secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto.

30- Composition segun la reivindicacion 29 en donde la secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto es la secuencia que codifica la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa.

31- Composicion segun la reivindicacion 30 en donde la secuencia que codifica la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:8.

32- Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 21,22,24-31 en donde al menos un transgen o ARNi se encuentran bajo el control de un promotor espetifico de endospermo.

33- Composicion segun la reivindicacion 32 en donde el promotor espetifico de endospermo se selecciona de entre el promotor de D-hordema, el promotor de LMW glutenina y el promotor de gamma-zeina.

34- Composicion segun la reivindicacion 33 en donde el promotor de D-hordema tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 12, el promotor de LMW glutenina tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11 y el promotor de gamma-zeina tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 13.

35- Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 21, 22, 24-34 en donde el transgen comprende adicionalmente en el extremo 3' la region 5'UTR del gen de la alcohol deshidrogenasa de arroz.

5

10

15

20

25

30

36- Composition segun la reivindicacion 35 en donde la region 5'UTR del gen de la alcohol deshidrogenasa de arroz tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 17.

37- Uso de una composition nutritiva o nutraceutico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-36 para la obtencion de huevos enriquecidos en antioxidantes.

38- Uso segun la reivindicacion 37 en donde los huevos son huevos de un ave de corral.

39- Uso segun la reivindicacion 38 en donde el ave de corral es gallina.

40- Uso de una parte de una planta de maiz enriquecida en antioxidantes o un derivado de la misma para la obtencion de huevos enriquecidos en antioxidantes.

41- Uso segun la reivindicacion 40 en donde la parte de la planta de maiz es el endospermo, la semilla o derivados de los mismos.

42- Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 40-41 en donde los antioxidantes en una parte de una planta de maiz son carotenoides.

43- Uso segun la reivindicacion 42 en donde los carotenoides se seleccionan del grupo formado por p-caroteno, Y-caroteno, a-caroteno, a-criptoxantina, p- criptoxantina, licopeno, lutema, zeaxantina y combinaciones de los mismos.

44- Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 40-43 en donde en donde la planta de maiz enriquecida en antioxidantes es una planta de maiz transgenica que expresa al menos un transgen que codifica una fitoeno sintasa y un transgen que codifica una caroteno desaturasa.

45- Uso segun la reivindicacion 44 en donde la planta de maiz expresa adicionalmente un transgen seleccionado del grupo formado por un transgen que codifica una licopeno p-ciclasa, un transgen que codifica una p-caroteno hidroxilasa y un transgen que codifica una carotenoide cetolasa.

5

10

15

20

25

30

46- Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 44 a 45 en donde las secuencias de los transgenes tienen adaptados los codones para su expresion en plantas.

47- Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 44-46 en donde el transgen que codifica la fitoeno sintasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, el transgen que codifica la caroteno desaturasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, el transgen que codifica la licopeno p-ciclasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:3, el transgen que codifica la p-caroteno hidroxilasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6 y/o el transgen que codifica la carotenoide cetolasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:7.

48- Uso segun la reivindicacion 47 en donde si el transgen que codifica una caroteno desaturasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2 entonces la protema codificada por dicho gen se encuentra formando parte de una protema de fusion que comprende en el extremo 5' una secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto.

49- Uso segun la reivindicacion 48 en donde la secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto es la secuencia que codifica la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa.

50- Uso segun la reivindicacion 49 en donde la secuencia que codifica la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 8.

51- Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 44-50 en donde el transgen presenta adicionalmente en el extremo 3'una secuencia terminadora de la transcripcion.

52- Uso segun la reivindicacion 51 en donde la secuencia terminadora de la transcripcion es la secuencia terminadora de nopalina sintasa o la secuencia terminadora de ADP-glucosa pirofosforilasa.

5

10

15

20

25

30

53- Uso segun la reivindicacion 52 en donde la secuencia terminadora de nopalina sintasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 9 y la secuencia terminadora de ADP- glucosa pirofosforilasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 10.

54- Uso segun cualquiera de las reivindicadores 44-53 en donde al menos un transgen se encuentra bajo el control de un promotor espedfico de endospermo.

55- Uso segun la reivindicacion 54 en donde el promotor espedfico de endospermo es el promotor de D-hordema o el promotor de LMW glutenina.

56- Uso segun la reivindicacion 55 en donde el promotor de D-hordema tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 12 y el promotor de LMW glutenina tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11.

57- Uso segun la reivindicacion 42 en donde los carotenoides se seleccionan del grupo formado por astaxantina, violaxantina, anteraxantina, lutema, beta-caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona, zeaxantina, Z-fitoeno, fitoeno y combinaciones de los mismos.

58- Uso segun la reivindicacion 57 en donde la planta de maiz enriquecida en antioxidantes expresa un transgen que codifica una fitoeno sintasa, un transgen que codifica una beta caroteno cetolasa y un transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa

59- Uso segun la reivindicacion 58, en donde planta de maiz enriquecida en antioxidantes expresa adicionalmente un ARNi espedfico de la licopeno epsilon ciclasa de maiz.

60- Uso segun la reivindicacion 42 en donde los carotenoides se seleccionan del grupo formado por astaxantina, violaxantina, antheraxantina, lutema, beta- caroteno, cantaxantina, beta-criptoxantina, adonixantina, adonirubina, 3-OH equinenona y combinaciones de los mismos.

5

10

15

20

25

30

61- Uso segun la reivindicacion 60 en donde la planta de maiz enriquecida en antioxidantes procede del cruzamiento entre una lmea de maiz con alto nivel de aceite y un maiz que expresa un transgen que codifica una fitoeno sintasa, un transgen que codifica una beta caroteno cetolasa, un transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa.

62- Uso segun la reivindicacion 61, en donde la planta de maiz enriquecida en antioxidantes expresa adicionalmente un ARNi espedfico de la licopeno epsilon ciclasa de maiz.

63- Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 61 o 62 en donde la lmea de maiz con alto nivel de aceite es la lmea NSL30876.

64- Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 58, 59, 61-63 en donde las secuencias de los trangenes tienen adaptados los codones para su expresion en plantas.

65- Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 58,59,61-64 en donde el transgen que codifica una fitoeno sintasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 13, el trasgen que codifica una beta caroteno cetolasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 14, el transgen que codifica una beta caroteno hidroxilasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 15 y/o el ARNi espedfico de la licopeno epsilon ciclasa de maiz con secuencia SEQ ID NO: 16.

66- Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 58, 59,61-66 en donde al menos un transgen o ARNi se encuentran bajo el control de un promotor espedfico de endospermo.

67- Uso segun la reivindicacion 66 en donde el promotor espedfico de endospermo se selecciona de entre el promotor de D-hordema, el promotor de LMW glutenina y el promotor de gamma-zeina.

5

10

15

20

25

30

68- Uso segun la reivindicacion 67 en donde el promotor de D-hordema tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:12 , el promotor de LMW glutenina tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11 y el promotor de gamma-zeina tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 13.

69- Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 58, 59, 61-68 en donde si el transgen que codifica para una beta caroteno cetolasa tiene la secuencia SEQ ID NO: 14 y/o el transgen que codifica para la beta caroteno hidroxilasa tiene la secuencia SEQ ID NO: 15, entonces el transgen presenta en el extremo 5' una secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto.

70- Uso segun la reivindicacion 69 en donde la secuencia para el direccionamiento de protemas al cloroplasto es la secuencia que codifica la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa.

71- Uso segun la reivindicacion 70 en donde la secuencia que codifica la subunidad pequena de la Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 8.

72- Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 58, 59, 61-71 en donde el transgen comprende adicionalmente en el extremo 3' la region 5'UTR del gen de la alcohol deshidrogenasa de arroz.

73- Uso segun la reivindicacion 72 en donde la region 5'UTR del gen de la alcohol deshidrogenasa de arroz tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 17.

74- Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 40-73 donde los huevos son huevos de un ave de corral.

75- Uso segun la reivindicacion 74 en donde el ave de corral es gallina.

76- Huevo y ovoproductos derivados de dicho huevo obtenidos segun cualquiera de las reivindicaciones 37-75.