ES2556177B1 - Detection of gluten peptides in human fluids - Google Patents
Detection of gluten peptides in human fluids Download PDFInfo
- Publication number
- ES2556177B1 ES2556177B1 ES201400569A ES201400569A ES2556177B1 ES 2556177 B1 ES2556177 B1 ES 2556177B1 ES 201400569 A ES201400569 A ES 201400569A ES 201400569 A ES201400569 A ES 201400569A ES 2556177 B1 ES2556177 B1 ES 2556177B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gluten
- peptides
- detection
- urine
- gln pro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 title claims abstract description 194
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 title claims abstract description 187
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 130
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 109
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 239000012530 fluid Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 105
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 85
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 claims abstract description 65
- 235000006171 gluten free diet Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 235000020884 gluten-free diet Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims abstract description 16
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 34
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 22
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 20
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 15
- 108010061711 Gliadin Proteins 0.000 claims description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 7
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000209056 Secale Species 0.000 claims description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims description 3
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 238000003487 electrochemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 claims description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 2
- 241000209146 Triticum sp. Species 0.000 claims 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 6
- PBYFVIQRFLNQCO-GUBZILKMSA-N Gln-Pro-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PBYFVIQRFLNQCO-GUBZILKMSA-N 0.000 claims 5
- ZBKUIQNCRIYVGH-SDDRHHMPSA-N Gln-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N ZBKUIQNCRIYVGH-SDDRHHMPSA-N 0.000 claims 4
- ARMNWLJYHCOSHE-KKUMJFAQSA-N Tyr-Pro-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ARMNWLJYHCOSHE-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims 3
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 claims 2
- IVCOYUURLWQDJQ-LPEHRKFASA-N Gln-Gln-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O IVCOYUURLWQDJQ-LPEHRKFASA-N 0.000 claims 2
- 241000490476 Hordeum sp. Species 0.000 claims 2
- CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N1CCCC1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- UCXQIIIFOOGYEM-ULQDDVLXSA-N Leu-Pro-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UCXQIIIFOOGYEM-ULQDDVLXSA-N 0.000 claims 2
- CZQZSMJXFGGBHM-KKUMJFAQSA-N Phe-Pro-Gln Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O CZQZSMJXFGGBHM-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims 2
- WWPAHTZOWURIMR-ULQDDVLXSA-N Phe-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WWPAHTZOWURIMR-ULQDDVLXSA-N 0.000 claims 2
- SKICPQLTOXGWGO-GARJFASQSA-N Pro-Gln-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O SKICPQLTOXGWGO-GARJFASQSA-N 0.000 claims 2
- 108010007278 alpha-gliadin (43-47) Proteins 0.000 claims 2
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 claims 2
- HZWWPUTXBJEENE-YFNVTMOMSA-N (2s)-5-amino-2-[[(2s)-1-[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-1-[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 HZWWPUTXBJEENE-YFNVTMOMSA-N 0.000 claims 1
- MQJDLNRXBOELJW-KKUMJFAQSA-N Gln-Pro-Phe Chemical compound N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O MQJDLNRXBOELJW-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims 1
- DXVOKNVIKORTHQ-GUBZILKMSA-N Glu-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DXVOKNVIKORTHQ-GUBZILKMSA-N 0.000 claims 1
- LOLUPZNNADDTAA-AVGNSLFASA-N Leu-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LOLUPZNNADDTAA-AVGNSLFASA-N 0.000 claims 1
- KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N Leu-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims 1
- XXXXOVFBXRERQL-ULQDDVLXSA-N Leu-Pro-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XXXXOVFBXRERQL-ULQDDVLXSA-N 0.000 claims 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- CPRLKHJUFAXVTD-ULQDDVLXSA-N Pro-Leu-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CPRLKHJUFAXVTD-ULQDDVLXSA-N 0.000 claims 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 claims 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 claims 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims 1
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 claims 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 claims 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract description 11
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 abstract description 9
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract description 7
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 231100000110 immunotoxic Toxicity 0.000 abstract description 7
- 230000002625 immunotoxic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000012795 verification Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 abstract 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 26
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 10
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 9
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 9
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 9
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 7
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 6
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 5
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 5
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 5
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000012552 review Methods 0.000 description 5
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 3
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 3
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108700039882 Protein Glutamine gamma Glutamyltransferase 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100038095 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2 Human genes 0.000 description 3
- 208000021329 Refractory celiac disease Diseases 0.000 description 3
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 3
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 3
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000004094 preconcentration Methods 0.000 description 3
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 3
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 3
- HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-[[1-[5-amino-2-[[1-[2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1CCC(C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O)N1C(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 241000209761 Avena Species 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015463 ALV003 Proteins 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012468 Dermatitis herpetiformis Diseases 0.000 description 1
- 108010010256 Dietary Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000015781 Dietary Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 206010013082 Discomfort Diseases 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000015710 Iron-Deficiency Anemia Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010025476 Malabsorption Diseases 0.000 description 1
- 208000004155 Malabsorption Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 101710183587 Omega-gliadin Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000056251 Prolyl Oligopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 101710178372 Prolyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 206010061481 Renal injury Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000006903 Wheat Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 201000009840 acute diarrhea Diseases 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- PASHVRUKOFIRIK-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate dihydrate Chemical compound O.O.[Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O PASHVRUKOFIRIK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000004464 cereal grain Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 235000014510 cooky Nutrition 0.000 description 1
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000020931 dietary conditions Nutrition 0.000 description 1
- 235000021245 dietary protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 150000002309 glutamines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000002962 histologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 231100000386 immunotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007688 immunotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000031891 intestinal absorption Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000037806 kidney injury Diseases 0.000 description 1
- 238000012125 lateral flow test Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012543 microbiological analysis Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000021590 normal diet Nutrition 0.000 description 1
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- YTJSFYQNRXLOIC-UHFFFAOYSA-N octadecylsilane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[SiH3] YTJSFYQNRXLOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 or preferably Proteins 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 108060006613 prolamin Proteins 0.000 description 1
- 150000003148 prolines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003498 protein array Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000003352 sequestering agent Substances 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000002562 urinalysis Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 230000036325 urinary excretion Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 1
- 201000006520 wheat allergy Diseases 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
- G01N2800/065—Bowel diseases, e.g. Crohn, ulcerative colitis, IBS
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Detección de péptidos del gluten en fluidos humanos.#La presente invención muestra un procedimiento para la detección y cuantificación en fluidos humanos, preferentemente orina, de péptidos del gluten resistentes a la digestión gastrointestinal. La presencia o ausencia de los péptidos del gluten es controlada por ensayos inmunológicos basados en anticuerpos específicos frente a los mismos. Esta metodología es aplicable en el sector médico-clínico, tanto en la verificación del cumplimiento de la dieta sin gluten como en el diagnóstico preciso en intolerancias al gluten, incluido aquellos casos donde persisten los síntomas de enfermedad celíaca a pesar la supuesta ausencia total de ingesta de gluten. También es aplicable en el proceso de investigación y diagnóstico de fármacos para la EC para comprobar la eficacia de las terapias relacionadas con la eliminación o secuestro de péptidos inmunotóxicos del gluten.Detection of gluten peptides in human fluids. # The present invention shows a method for the detection and quantification in human fluids, preferably urine, of gluten peptides resistant to gastrointestinal digestion. The presence or absence of gluten peptides is controlled by immunological assays based on specific antibodies against them. This methodology is applicable in the medical-clinical sector, both in the verification of compliance with the gluten-free diet and in the precise diagnosis in gluten intolerances, including those cases where the symptoms of celiac disease persist despite the supposed total absence of intake of gluten It is also applicable in the process of research and diagnosis of drugs for CD to verify the efficacy of therapies related to the elimination or sequestration of immunotoxic peptides from gluten.
Description
DETECCIÓN DE PÉPTIDOS DEL GLUTEN EN FLUIDOS HUMANOS DETECTION OF GLUTEN PEPTIDES IN HUMAN FLUIDS
La presente invención muestra un procedimiento para la detección y cuantificación en The present invention shows a method for the detection and quantification in
fluidos humanos, preferentemente orina, de péptidos del gluten resistentes a la digestión gastrointestinal mediante ensayos inmunológicos. Dichos ensayos pueden ser técnicas del tipo de las tiras de flujo lateral inmunocromatográficas que pueden cuantificarse con lector, ELISAs, biosensores, detección con partículas magnéticas, etc. Esta metodología es aplicable en el sector médico-clínico, tanto en la verificación Human fluids, preferably urine, of gluten peptides resistant to gastrointestinal digestion by immunological assays. Such tests may be techniques of the type of immunochromatographic lateral flow strips that can be quantified with reader, ELISAs, biosensors, detection with magnetic particles, etc. This methodology is applicable in the medical-clinical sector, both in the verification
del cumplimiento de la dieta libre de gluten de los pacientes celiacos, pacientes con sensibilidad alérgica o en pacientes con cualquier tipo de sensibilidad a las proteínas del gluten, así como en el diagnóstico preciso de la enfermedad celíaca refractaria, es decir, en aquellos casos donde persisten los síntomas a pesar la supuesta ausencia total de ingesta de gluten. También puede aplicarse la invención en investigación of compliance with the gluten-free diet of celiac patients, patients with allergic sensitivity or in patients with any type of sensitivity to gluten proteins, as well as in the precise diagnosis of refractory celiac disease, that is, in those cases where Symptoms persist despite the supposed total absence of gluten intake. The invention can also be applied in research
clínica de la enfermedad celíaca para comprobar la eficacia de futuras estrategias relacionadas con la eliminación o disminución de la toxicidad del gluten. Celiac disease clinic to verify the effectiveness of future strategies related to the elimination or decrease of gluten toxicity.
La enfermedad celíaca (EC), trastorno autoinmune provocado por la ingestión de Celiac disease (CD), an autoimmune disorder caused by the ingestion of
las proteínas del gluten presente en el trigo, la cebada, el centeno y en algunas variedades de avena (Arent-Hansen et al., 2004; Kagnoff, 2007; Comino et al., 2011) afecta aproximadamente al 1% de la población general (Rubio-Tapia et al, 2009; Lionetti and Catassi, 2011; Bernardo and Peña, 2012; Sapone et al., 2012). La ingesta de gluten provoca en estos pacientes una reacción inflamatoria en la parte superior del The gluten proteins present in wheat, barley, rye and some varieties of oats (Arent-Hansen et al., 2004; Kagnoff, 2007; Comino et al., 2011) affect approximately 1% of the general population (Rubio-Tapia et al, 2009; Lionetti and Catassi, 2011; Bernardo and Peña, 2012; Sapone et al., 2012). The intake of gluten causes in these patients an inflammatory reaction in the upper part of the
intestino delgado que conlleva a daño tisular y a atrofia vellositaria (Kunachowicz, 2001; Rujner, 2002). Small intestine leading to tissue damage and villus atrophy (Kunachowicz, 2001; Rujner, 2002).
Aunque la mayoría de proteínas de la dieta son digeridas por las proteasas gastrointestinales a aminoácidos simples, dipéptidos o tripéptidos, las proteínas del gluten no son completamente digeridas y permanecen en el intestino (Ganapathy et Although most dietary proteins are digested by gastrointestinal proteases to simple amino acids, dipeptides or tripeptides, gluten proteins are not completely digested and remain in the intestine (Ganapathy et
al., 2006; Fasano 2009; Comino et al., 2012). Estos péptidos son capaces de internalizarse en las células intestinales y, como consecuencia, los residuos de glutamina que poseen pueden ser desaminados por la transglutaminasa tisular (tTG). Los péptidos desaminados inducen una reacción inmunológica, produciéndose una al., 2006; Fasano 2009; Comino et al., 2012). These peptides are able to internalize in intestinal cells and, as a consequence, the glutamine residues they possess can be deaminated by tissue transglutaminase (tTG). Deaminated peptides induce an immunological reaction, producing a
disminución de la absorción intestinal que puede dar lugar a síntomas como diarrea, anemia, retraso del crecimiento, pérdida de peso, desórdenes óseos, complicaciones neurológicas, cáncer, etc. (Alaedini and Green, 2005; Catassi and Fasano, 2008; Tack et al., 2010). decreased intestinal absorption that can lead to symptoms such as diarrhea, anemia, growth retardation, weight loss, bone disorders, neurological complications, cancer, etc. (Alaedini and Green, 2005; Catassi and Fasano, 2008; Tack et al., 2010).
Existen claras evidencias que avalan la contribución mayoritaria de los epítopos relacionados o contenidos en el péptido 33-mer de la 2 gliadina del trigo (residuos 57-89) en la inmunotoxicidad del gluten en los pacientes celíacos. Los epítopos del gluten con elevada inmunogenicidad están localizados en regiones de las gliadinas ricas en residuos de prolina y glutamina (Shan et al., 2002; Tye-Din et al., 2010; Comino et al., 2011; Real et al., 2012; Dessi et al., 2013). There is clear evidence to support the majority contribution of related epitopes or contained in the 33-mer peptide of 2 wheat gliadin (residues 57-89) in the immunotoxicity of gluten in celiac patients. Gluten epitopes with high immunogenicity are located in gliadin regions rich in proline and glutamine residues (Shan et al., 2002; Tye-Din et al., 2010; Comino et al., 2011; Real et al., 2012; Dessi et al., 2013).
El estricto cumplimiento de una dieta sin gluten (DSG) es el único tratamiento efectivo a día de hoy para la EC y otros casos de intolerancias al gluten. En la mayoría de los pacientes, el cumplimiento estricto de una DSG conduce, en pocos meses, a la recuperación rápida y completa de la arquitectura normal y la función de la mucosa del intestino delgado, así como la remisión de los síntomas y la normalización de las pruebas serológicas (Bernardo and Peña, 2012; Hall et al., 2013). Por tanto, la monitorización de la adherencia en los pacientes celiacos es de vital importancia para evitar los daños acumulativos directos o indirectos así como también para confirmar que la persistencia de cualquier sintomatología no se debe a una infracción (voluntaria Strict adherence to a gluten-free diet (DSG) is the only effective treatment today for CD and other cases of gluten intolerances. In most patients, strict compliance with a DSG leads, in a few months, to the rapid and complete recovery of the normal architecture and function of the mucosa of the small intestine, as well as the remission of symptoms and the normalization of serological tests (Bernardo and Peña, 2012; Hall et al., 2013). Therefore, monitoring adherence in celiac patients is of vital importance to avoid direct or indirect cumulative damage as well as to confirm that the persistence of any symptoms is not due to a violation (voluntary
o no) de la dieta. or not) of the diet.
El seguimiento de la DSG supone numerosas restricciones debido a sus implicaciones sociales y económicas. Aproximadamente más de la mitad de los alimentos que se comercializan a día de hoy contienen gluten de trigo, cebada, centeno o avena, incluyendo aquellos en los que sólo interviene como espesante o aglutinante (Freeman, 2013). El incumplimiento de la DSG se ha asociado con diarreas, dispepsia, osteoporosis, anemia por deficiencia de hierro, depresión e infertilidad, síntomas que desaparecen o mejoran, en cierta medida mediante la adhesión a la DSG. De hecho, la falta de adherencia a una DSG de manera estricta puede aumentar 4,3 veces las posibilidades de sufrir un linfoma (Lebwohl and Green, 2003). Estas observaciones nos dan una idea de la importancia de la adherencia a una DSG para reducir los síntomas, evitar deficiencias nutricionales y mejorar la calidad de vida del paciente. Sin embargo, varios estudios basados en biopsias intestinales han sugerido que al menos un tercio de los pacientes con EC no se adhieren plenamente a la DSG (Ciacci et al., 2002; Silvester and Rashid, 2007; Barratt et al, 2011; Matoori et al., 2013). Además, entre un 36% y 55% de los pacientes que tienen plena adhesión a The monitoring of the DSG involves numerous restrictions due to its social and economic implications. Approximately more than half of the foods sold today contain wheat, barley, rye or oat gluten, including those that only intervene as a thickener or binder (Freeman, 2013). Non-compliance with the DSG has been associated with diarrhea, dyspepsia, osteoporosis, iron deficiency anemia, depression and infertility, symptoms that disappear or improve, to some extent by adhering to the DSG. In fact, the lack of adherence to a DSG can strictly increase the chances of lymphoma 4.3 times (Lebwohl and Green, 2003). These observations give us an idea of the importance of adherence to a DSG to reduce symptoms, avoid nutritional deficiencies and improve the patient's quality of life. However, several studies based on intestinal biopsies have suggested that at least one third of patients with CD do not fully adhere to DSG (Ciacci et al., 2002; Silvester and Rashid, 2007; Barratt et al, 2011; Matoori et al., 2013). In addition, between 36% and 55% of patients who have full adherence to
la DSG no alcanzan la remisión histológica completa, probablemente debido a ingestas involuntarias de gluten (Tio et al., 2012; Stoven et al, 2012; Hall et al., 2013; Matoori et al., 2013). No obstante, la exposición de estos pacientes al gluten a través del consumo de alimentos etiquetados como seguros pero que contienen trazas de DSG does not reach complete histological remission, probably due to involuntary gluten intakes (Tio et al., 2012; Stoven et al., 2012; Hall et al., 2013; Matoori et al., 2013). However, the exposure of these patients to gluten through of food consumption labeled as safe but containing traces of
gluten, no podría explicar el alto número de pacientes en los que no hay remisión completa de los daños histológicos de la mucosa (Koning et al., 2013). gluten could not explain the high number of patients in whom there is no complete remission of histological mucosal damage (Koning et al., 2013).
Así mismo, existe una parte de la población celíaca que no parece responder de manera positiva a la DSG y sufren síntomas de malabsorción persistente o recurrente y atrofia de las vellosidades intestinales. Esta población podría ser sospechosa de Likewise, there is a part of the celiac population that does not seem to respond positive way to the DSG and suffer symptoms of persistent or recurrent malabsorption and atrophy of the intestinal villi. This population could be suspected of
padecer EC refractaria (ECR), una enfermedad rara (aproximadamente el 5%-10% de los pacientes con EC) que aparece en los pacientes sin aparente respuesta positiva a la DSG (Al-Toma et al., 2007; Freeman, 2009; Rubio-Tapia and Murray, 2010). Aunque la ECR fue descrita en pacientes con supuesta ausencia total de ingesta de gluten, la ingestión involuntaria y la hipersensibilidad a una pequeña cantidad de gluten también suffer from refractory CD (ECR), a rare disease (approximately 5% -10% of patients with CD) that appears in patients with no apparent positive response to DSG (Al-Toma et al., 2007; Freeman, 2009; Rubio-Tapia and Murray, 2010). Although ECR was described in patients with alleged total absence of gluten intake, involuntary ingestion and hypersensitivity to a small amount of gluten also
pueden desencadenar los síntomas propios de la patología. They can trigger the symptoms of the pathology.
Existe un porcentaje elevado de celiacos (aproximadamente un 90%) que declaran que durante la semana tienen algún síntoma de haber ingerido gluten (Lähdeaho et al., 2014). En algunos casos de diarrea aguda por ejemplo, existen dudas entre los clínicos a la hora de identificar si las causas provienen de una There is a high percentage of celiacs (approximately 90%) that declare that during the week they have any symptoms of having ingested gluten (Lähdeaho et al., 2014). In some cases of acute diarrhea for example, there are doubts among clinicians when identifying whether the causes come from a
infección aguda o de haber ingerido gluten. La única herramienta disponible en este último caso es identificar el agente infeccioso, lo cual puede ser complejo dada la cantidad de microorganismos causantes y el precio y tiempo en el desarrollo del análisis microbiológico. acute infection or having ingested gluten. The only tool available in the latter case is to identify the infectious agent, which can be complex given the amount of causative microorganisms and the price and time in the development of the microbiological analysis.
Actualmente para la evaluación del cumplimiento de la DSG de los pacientes Currently for the evaluation of patient DSG compliance
celiacos existen algunos marcadores disponibles entre los que se incluyen la observación de la mejora sintomática, entrevista dietética y reducción o normalización de anticuerpos específicos para la EC tales como anti-transglutaminasa tisular (ATT) o péptidos del gluten anti-desamidados (ADG) (Dipper et al., 2009; Vives- Pi et al., 2013; Vallejo et al., 2013; Sharkey et al., 2013). Sin embargo, no hay consenso en cuanto a There are some markers available among celiacs, including the observation of symptomatic improvement, dietary interview and reduction or normalization of antibodies specific for CD such as tissue anti-transglutaminase (ATT) or anti-deamidated gluten peptides (ADG) (Dipper) et al., 2009; Vives-Pi et al., 2013; Vallejo et al., 2013; Sharkey et al., 2013). However, there is no consensus as to
la periodicidad de realización de los controles ni cuáles son las mejores medidas para evaluar dicho cumplimiento, además de que algunos de estos métodos han demostrado limitaciones significativas (Bai et al., 2012). El control con los anticuerpos ATT o ADG han sido propuestos como marcadores, sin embargo por lo general se vuelven negativos al año de comenzar la DSG además de que no implican la curación the periodicity of carrying out the controls or what are the best measures to evaluate said compliance, in addition to some of these methods have shown significant limitations (Bai et al., 2012). The control with the ATT or ADG antibodies have been proposed as markers, however they usually become negative one year after starting the DSG as well as not involving healing.
completa de la mucosa intestinal (Tursi et al, 2003; Sharkey et al., 2013). Este tipo de complete of the intestinal mucosa (Tursi et al, 2003; Sharkey et al., 2013). This type of
marcadores son útiles en la verificación de la no adherencia más que en la comprobación del estricto cumplimiento de la DSG. Por tanto, los métodos serológicos podrían no ser suficientemente sensibles para detectar transgresiones dietéticas ocasionales y que impiden la recuperación completa (Kaukien et al., 2002; 2007; Tursi et al., 2006). No son, por tanto, una manera directa de demostrar la ingesta de gluten y así evitar secuelas nocivas, de hecho, solo se pueden medir las consecuencias de las transgresiones dietéticas observando la inflamación de las mucosas y/o la atrofia vellositaria para lo cual se tendrían que realizar biopsias intestinales y como consecuencia anestesiar al paciente con los posibles riesgos, molestias y gastos markers are useful in verifying non-adherence rather than in the Verification of strict compliance with the DSG. Therefore, serological methods may not be sensitive enough to detect dietary transgressions occasional and preventing complete recovery (Kaukien et al., 2002; 2007; Tursi et al., 2006). They are not, therefore, a direct way to demonstrate gluten intake and thus avoid harmful sequelae, in fact, only the consequences of dietary transgressions can be measured by observing the inflammation of the mucous membranes and / or villus atrophy for which they would have to perform intestinal biopsies and as a result anesthetize the patient with the possible risks, discomforts and expenses
médicos que conlleva. It entails doctors.
Una medida más directa de la ingestión de gluten podría proporcionar información valiosa en el seguimiento del paciente: la detección del incumplimiento de la DSG antes del daño anatómico, la detección del consumo inadvertido y la evaluación de la exactitud de la adherencia al tratamiento en el periodo inicial (tras el A more direct measure of gluten intake could provide Valuable information in patient follow-up: the detection of non-compliance with the DSG before the anatomical damage, the detection of inadvertent consumption and the evaluation of the accuracy of adherence to treatment in the initial period (after
diagnóstico cuando los pacientes están menos familiarizados con la dieta), proporcionando una confirmación fácil y fiable de los resultados obtenidos. Por tanto, un marcador sensible y fiable para monitorizar y detectar la ingesta de gluten sería una herramienta útil para el correcto cumplimiento de la DSG y, probablemente, para un diagnóstico preciso de la ECR. diagnosis when patients are less familiar with the diet), providing easy and reliable confirmation of the results obtained. Therefore, a sensitive and reliable marker for monitoring and detecting gluten intake would be a useful tool for the correct compliance of the DSG and, probably, for an accurate diagnosis of ECR.
Trabajos previos han puesto de manifiesto que los anticuerpos monoclonales anti-33 mer G12 y A1, obtenidos frente al principal epítopo inmunogénico de la agliadina, son muy útiles en la detección de péptidos tóxicos de gluten tanto en investigación clínica como en la alimentaria (Morón et al., 2008a; 2008b; Ehren y col., 2009; Comino et al., 2012). Recientemente se ha propuesto la determinación de los Previous work has shown that the anti-33 mer G12 and A1 monoclonal antibodies, obtained against the main immunogenic epitope of agliadin, are very useful in the detection of toxic gluten peptides both in clinical and food research (Morón et al., 2008a; 2008b; Ehren et al., 2009; Comino et al., 2012). Recently the determination of the
péptidos del gluten en las heces como una estrategia para la verificación directa del cumplimiento de la DSG. Los ensayos basados en los anticuerpos G12 y A1 han permitido la detección de los péptidos derivados del gluten que son excretados en las heces humanas con cierta correlación con la cantidad del gluten ingerido (Comino et al., 2012). La monitorización del gluten digerido en las heces en un grupo de gluten peptides in feces as a strategy for direct verification of compliance with the DSG. Assays based on G12 and A1 antibodies have allowed the detection of gluten-derived peptides that are excreted in human feces with some correlation with the amount of gluten ingested (Comino et al., 2012). Monitoring of digested gluten in feces in a group of
voluntarios sometidos a una estricta DSG indicó que una única ingesta de gluten puede ser detectada mediante medición de dichos péptidos reactivos en heces, pudiendo determinarse su excreción entre 2-4 días, sin ingesta de gluten adicional. Volunteers undergoing a strict DSG indicated that a single intake of gluten can be detected by measuring these reactive peptides in feces, and their excretion can be determined between 2-4 days, without additional gluten intake.
Algunos síntomas extraintestinales de la EC tales como dermatitis herpetiforme, anemia, osteoporosis, trastorno neurológicos, etc., son difíciles de explicar sin asumir la presencia de péptidos en la sangre después de la ingesta de gluten en los pacientes Some extraintestinal symptoms of CD such as dermatitis herpetiformis, anemia, osteoporosis, neurological disorders, etc., are difficult to explain without assuming the presence of peptides in the blood after gluten intake in patients.
celiacos (Chirdo et al., 1998; Stern et al., 2001; Riestra, 2008; Ludvigsson and Green, 2011). Por tanto, las herramientas más convenientes para saber cuándo se infringe una DSG son por tanto aquellas que detectan directamente la presencia de péptidos inmunogénicos del gluten en muestras humanas, ya que la presencia de estos celiac disease (Chirdo et al., 1998; Stern et al., 2001; Riestra, 2008; Ludvigsson and Green, 2011). Therefore, the most convenient tools to know when it is violated A DSG are therefore those that directly detect the presence of peptides immunogenic gluten in human samples, since the presence of these
péptidos en un enfermo celíaco sería la forma más directa e inequívoca para determinar si el individuo ha ingerido o no gluten. Peptides in a celiac patient would be the most direct and unambiguous way to determine whether or not the individual has ingested gluten.
Hasta la fecha, disponemos de escasos recursos directos para controlar el cumplimiento de la dieta en estos pacientes. La detección en heces de péptidos del gluten tiene el inconveniente de que el manejo de las muestras es incómodo y se To date, we have few direct resources to control the Diet compliance in these patients. Stool detection of peptides from gluten has the disadvantage that the handling of the samples is uncomfortable and
detecta solo a partir de las 24 horas desde la ingestión y requiere un proceso extractivo de los péptidos inicial. Las muestras de orina presentan un gran atractivo por su facilidad de toma de muestra, no invasividad, simple manipulación, fácil homogeneización, bajo costo y fácil transporte y almacenamiento (Esteban and Castaño, 2009; Pinches et al, 2012; Li et al, 2013). Los péptidos y pequeñas proteínas Detects only after 24 hours from ingestion and requires an initial extractive process of the peptides. Urine samples are very attractive due to their ease of sampling, non-invasiveness, simple handling, easy homogenization, low cost and easy transport and storage (Esteban and Castaño, 2009; Pinches et al, 2012; Li et al, 2013 ). Peptides and small proteins
(lt; 10 kDa) se filtran libremente por el glomérulo (Pisitkun et al., 2006). Sin embargo, existen pocos estudios acerca de los péptidos de bajo peso molecular o fragmentos de proteínas contenidas en la orina debido a la dificultad técnica de la medición de péptidos en presencia de proteínas en muestras diluidas y la gran diversidad de péptidos esperada. (<10 kDa) are freely filtered through the glomerulus (Pisitkun et al., 2006). However, there are few studies about low molecular weight peptides or protein fragments contained in the urine due to the technical difficulty of measuring peptides in the presence of proteins in diluted samples and the great diversity of peptides expected.
En la presente invención, se indica cómo pueden detectarse péptidos inmunogénicos de gluten (GIPs) en muestras de fluidos humanos, preferentemente en orina de individuos sanos y celíacos mediante concentración de péptidos de la orina y detección con tiras inmunocromatográficas anti-33-mer, pudiendo ser aplicado en estudios clínicos y de seguimiento de la DSG así como también, en el diagnóstico de In the present invention, it is indicated how gluten immunogenic peptides (GIPs) can be detected in human fluid samples, preferably in urine of healthy and celiac individuals by concentration of urine peptides and detection with anti-33-mer immunochromatographic strips, being able to be applied in clinical and follow-up studies of the DSG as well as in the diagnosis of
la ECR. ECR
Akobeng AK, Thomas AG. 2008. Systematic review: tolerable amount of gluten for people with coeliac disease. Aliment Pharmacol Ther; 27:1044-1052. Akobeng AK, Thomas AG. 2008. Systematic review: tolerable amount of gluten for people with coeliac disease. Aliment Pharmacol Ther; 27: 1044-1052.
Alaedini A, Green P. 2005. Narrative review: celiac disease: understanding a complex autoimmune disorder. Am. College Phys; 142: 289-298. Alaedini A, Green P. 2005. Narrative review: celiac disease: understanding a complex autoimmune disorder Am. College Phys; 142: 289-298.
Al-toma A, Verbeek WH, Mulder CJ.2007. The management of complicated celiac disease. Dig Dis; 25:230-236. Al-take A, Verbeek WH, Mulder CJ. 2007. The management of complicated celiac disease. Dig Dis; 25: 230-236.
Arentz-Hansen H, Fleckenstein B, Molberg Ø, Scott H, Koning F, Jung G, Roepstorff P, Lundin KE, Sollid LM. 2004. The molecular basis for oat intolerance in patients with celiac disease. PLoS Medic; 1:84-92. Arentz-Hansen H, Fleckenstein B, Molberg Ø, Scott H, Koning F, Jung G, Roepstorff P, Lundin KE, Sollid LM. 2004. The molecular basis for oat intolerance in patients with celiac disease PLoS Medic; 1: 84-92.
Bai J, Zeballos E, Fried M, Corazza GR, Schuppan D, Farthing MJG, Catassi C, Greco L, Cohen H, Krabshuis JH. 2012. WGOOMGE Practice Guideline Coeliac Disease. World Gastroenterol News; 2: S1-S8. Bai J, Zeballos E, Fried M, Corazza GR, Schuppan D, Farthing MJG, Catassi C, Greco L, Cohen H, Krabshuis JH. 2012. WGOOMGE Practice Guideline Coeliac Disease. World Gastroenterol News; 2: S1-S8.
Barratt SM, Leeds JS, Sanders DS. 2011. Quality of life in coeliac disease is Barratt SM, Leeds JS, Sanders DS. 2011. Quality of life in coeliac disease is
determined by perceived degree of difficulty adhering to a gluten-free diet, not the level of dietary adherence ultimately achieved. J Gastrointest Liver Dis; 20:241-245. determined by perceived degree of difficulty adhering to a gluten-free diet, not the level of dietary adherence ultimately achieved. J Gastrointest Liver Dis; 20: 241-245.
Bernardo D, Peña AS. 2012. Developing strategies to improve the quality of life of patients with gluten intolerance in patients with and without coeliac disease. Eur J Intern Med; 23:6-8. Bernardo D, Peña AS. 2012. Developing strategies to improve the quality of life of patients with gluten intolerance in patients with and without coeliac disease. Eur J Inter Med; 23: 6-8.
Catassi C, Fabiani E, Iacono G, D’Agate C, Francavilla R, Biagi F, Volta U, Accomando S, Picarelli A, De Vitis I, et al. 2007. A prospective, double blind, placebo-controlled trial to establish a safe gluten threshold for patients with celiac disease. Am J Clin Nutr; 85:160-166. Catassi C, Fabiani E, Iacono G, D’Agate C, Francavilla R, Biagi F, Volta U, Accomando S, Picarelli A, De Vitis I, et al. 2007. A prospective, double blind, placebo-controlled trial to establish a safe gluten threshold for patients with celiac disease. Am J Clin Nutr; 85: 160-166.
Catassi C, Fasano A. 2008. Celiac disease. Curr Opin Gastroenterol; 24:687-691. Catassi C, Fasano A. 2008. Celiac disease. Curr Opin Gastroenterol; 24: 687-691.
Chirdo FG, Rumbo M, Añón MC, Fossati CA.1998. Presence of high levels of nondegraded gliadin in breast milk from healthy mothers. Scand J Gastroenterol; 33:1186 Chirdo FG, Rumbo M, Añón MC, Fossati CA.1998. Presence of high levels of nondegraded gliadin in breast milk from healthy mothers. Scand J Gastroenterol; 33: 1186
92. 92.
Ciacci C, Cirillo, M, Cavallaro R, Mazzacca G. 2002. Long-term follow-up of celiac adults on gluten-free diet: prevalence and correlates of intestinal damage. Digestion; Ciacci C, Cirillo, M, Cavallaro R, Mazzacca G. 2002. Long-term follow-up of celiac adults on gluten-free diet: prevalence and correlates of intestinal damage. Digestion;
66:178-185. 66: 178-185.
Comino I, Real A, de Lorenzo A, Cornell H, López-Casado MA, Barro F, Lorite P, Torres MI, Cebolla A, Sousa C. 2011. Diversity in oat potential immunogenicity: basis for the selection of oat varieties with no toxicity in coeliac disease. Gut; 60: 915-922. Comino I, Real A, by Lorenzo A, Cornell H, López-Casado MA, Barro F, Lorite P, Torres MI, Onion A, Sousa C. 2011. Diversity in oat potential immunogenicity: basis for the selection of oat varieties with no toxicity in coeliac disease. Gut; 60: 915-922.
Comino I, Real A, Vivas S, Síglez MÁ, Caminero A, Nistal E, Casqueiro J, RodríguezComino I, Real A, Vivas S, Síglez MÁ, Caminero A, Nistal E, Casqueiro J, Rodríguez
Herrera A, Cebolla A, Sousa C. 2012. Monitoring of gluten-free diet compliance in celiac patients by assessment of gliadin 33-mer equivalent epitopes in feces. Am J Clin Nutr; 95:670-677. Herrera A, Onion A, Sousa C. 2012. Monitoring of gluten-free diet compliance in celiac patients by assessment of gliadin 33-mer equivalent epitopes in feces. Am J Clin Nutr; 95: 670-677.
Dessì M, Noce A, Vergovich S, Noce G Daniele N. 2013. Safety Food in Celiac Disease Patients: A Systematic Review. Food and Nutrition Sciences; Vol. 4 No. Dessì M, Noce A, Vergovich S, Noce G Daniele N. 2013. Safety Food in Celiac Disease Patients: A Systematic Review. Food and Nutrition Sciences; Vol. 4 No.
7A:55-74. 7A: 55-74.
Dipper CR, Maitra S, Thomas R, Lamb C A, McLean-Tooke A P, Ward R, Smith D, Spickett G, Mansfield JC. 2009. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. Anti-tissue Transglutaminase Antibodies in the Follow-up of Adult Coeliac Disease. Aliment Pharmacol Ther; 30:236-244. Dipper CR, Maitra S, Thomas R, Lamb C A, McLean-Tooke A P, Ward R, Smith D, Spickett G, Mansfield JC. 2009. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. Anti-tissue Transglutaminase Antibodies in the Follow-up of Adult Coeliac Disease. Aliment Pharmacol Ther; 30: 236-244.
5 Ehren J, Morón B, Martin E, Bethune MT, Gray GM, Khosla C. 2009. A food-grade enzyme preparation with modest gluten detoxification properties. PLoS One; 21:e6313. 5 Ehren J, Morón B, Martin E, Bethune MT, Gray GM, Khosla C. 2009. A food-grade enzyme preparation with modest gluten detoxification properties. PLoS One; 21: e6313.
Esteban M, Castaño A. 2009. Non-invasive matrices in human biomonitoring: a review. Environ Int; 35:438-449. Esteban M, Castaño A. 2009. Non-invasive matrices in human biomonitoring: a review. Environ Int; 35: 438-449.
Fasano A. 2009.Surprises from celiac disease. Sci Am; 301:54-61. Fasano A. 2009.Surprises from celiac disease. Sci Am; 301: 54-61.
10 Freeman HJ. 2009. Adult celiac disease and its malignant complications. Gut Liver; 3:237-246. 10 Freeman HJ. 2009. Adult celiac disease and its malignant complications. Gut Liver; 3: 237-246.
Freeman HJ. 2013. Non-dietary forms of treatment for adult celiac disease. World J Gastrointest Pharmacol Ther; 4:108-112. Freeman HJ. 2013. Non-dietary forms of treatment for adult celiac disease. World J Gastrointest Pharmacol Ther; 4: 108-112.
Ganapathy V, Gupta N, Martindale RG. Physiology of the gastrointestinal tract. 4th ed. 15 New York, NY: Johnson LR, 2006. Ganapathy V, Gupta N, Martindale RG. Physiology of the gastrointestinal tract. 4th ed. 15 New York, NY: Johnson LR, 2006.
Gibert A, Kruizinga A G, Neuhold S, Houben G F, Canela M A, Fasano A, Catassi C. 2013. Might gluten traces in wheat substitutes pose a risk in patients with celiac disease? A population-based probabilistic approach to risk estimation. Am J Clin Nutr; 97:109-116. Gibert A, Kruizinga A G, Neuhold S, Houben G F, Cinnamon M A, Fasano A, Catassi C. 2013. Might gluten traces in wheat substitutes pose a risk in patients with celiac disease? A population-based probabilistic approach to risk estimation. Am J Clin Nutr; 97: 109-116.
20 Hall NJ, Rubin GP, Charnock A. 2013. Intentional and inadvertent non-adherence in adult coeliac disease. A cross-sectional survey. Appetite; 68:56-62. 20 Hall NJ, Rubin GP, Charnock A. 2013. Intentional and inadvertent non-adherence in adult coeliac disease. A cross-sectional survey. Appetite; 68: 56-62.
Hischenhuber C, Crevel R, Jarry B, Mäki M, Moneret-Vautrin DA, Romano A, Troncone R, Ward R. 2006. Review article: safe amounts of gluten for patients with wheat allergy or coeliac disease. Aliment Pharmacol Ther; 23:559-575. Hischenhuber C, Crevel R, Jarry B, Mäki M, Moneret-Vautrin DA, Romano A, Troncone R, Ward R. 2006. Review article: safe amounts of gluten for patients with wheat allergy or coeliac disease. Aliment Pharmacol Ther; 23: 559-575.
25 Kagnoff F. 2007. Overview and pathogenesis of celiac disease. Gastroenterology, 128:4, S10-S18. 25 Kagnoff F. 2007. Overview and pathogenesis of celiac disease. Gastroenterology, 128: 4, S10-S18.
Kaukinen K, Peraaho M, Lindfors K, et al. 2007. Persistent small bowel mucosal villous atrophy without symptoms in celiac disease. Aliment Pharmacol Ther; 25:1237-1245. Kaukinen K, Peraaho M, Lindfors K, et al. 2007. Persistent small bowel mucosal villous atrophy without symptoms in celiac disease. Aliment Pharmacol Ther; 25: 1237-1245.
Kaukinen K, Sulkanen S, Maki M, et al. 2002. IgA-class transglutaminase antibodies in evaluating the efficacy of gluten-free diet in coeliac disease. Eur J Gastroenterol Hepatol; 14:311-315. Kaukinen K, Sulkanen S, Maki M, et al. 2002. IgA-class transglutaminase antibodies in evaluating the efficacy of gluten-free diet in coeliac disease. Eur J Gastroenterol Hepatol; 14: 311-315.
Koning F, Mol M, Mearin M L. 2013. The million-dollar question: is “gluten-free” food safe for patients with celiac disease? Am J Clin Nutr; 97:3-4. Koning F, Mol M, Mearin M L. 2013. The million-dollar question: is “gluten-free” food safe for patients with celiac disease? Am J Clin Nutr; 97: 3-4.
Kunachowicz H. 2001. WartoĞü odĪywcza produktów i potraw. In: Kunachowicz H. (ed.): Dieta bezglutenowa co wybraü? Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa: 9Kunachowicz H. 2001. WartoĞü odĪywcza produktów i potraw. In: Kunachowicz H. (ed.): Diet bezglutenowa co wybraü? Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa: 9
25. 25.
Lähdeaho ML, Kaukinen K, Laurila K, Vuotikka P, Koivurova OP, Kärjä-Lahdensuu T, Lähdeaho ML, Kaukinen K, Laurila K, Vuotikka P, Koivurova OP, Kärjä-Lahdensuu T,
Marcantonio A, Adelman DC, Mäki M. 2014. Glutenase ALV003 Attenuates Gluten-Induced Mucosal Injury in Patients With Celiac Disease. Gastroenterology; 146:16491658. Marcantonio A, Adelman DC, Mäki M. 2014. Glutenase ALV003 Attenuates Gluten-Induced Mucosal Injury in Patients With Celiac Disease. Gastroenterology; 146: 16491658.
Lebwohl B, Green PH. 2003. Screening for celiac disease. N Engl J Med; 349:16731674. Lebwohl B, Green PH. 2003. Screening for celiac disease. N Engl J Med; 349: 16731674.
Li PKT, Burdmann EA, Mehta RL. 2013. Acute kidney injury: Global health alert. Transplantation; 5: 653-657. Li PKT, Burdmann EA, Mehta RL. 2013. Acute kidney injury: Global health alert. Transplantation; 5: 653-657.
Lionetti E, Catassi C. 2011. New clues in celiac disease epidemiology, pathogenesis, clinical manifestations, and treatment. Int Rev Immunol; 30:219-31. Lionetti E, Catassi C. 2011. New clues in celiac disease epidemiology, pathogenesis, clinical manifestations, and treatment. Int Rev Immunol; 30: 219-31.
Ludvigsson JF, Green PH. 2011. Clinical management of coeliac disease. J Intern Med; 269: 560-571. Ludvigsson JF, Green PH. 2011. Clinical management of coeliac disease. J Intern Med; 269: 560-571.
Matoori S, Fuhrmann G, Leroux JC. 2013. Celiac disease: a challenging disease for pharmaceutical scientists. Pharm Res; 30:619-626. Matoori S, Fuhrmann G, Leroux JC. 2013. Celiac disease: a challenging disease for pharmaceutical scientists Pharm Res; 30: 619-626.
Morón B, Bethune MT, Comino I, Manyani H, Ferragud M, López MC, Cebolla A, Khosla C, Sousa C. 2008a. Toward the assessment of food toxicity for celiac patients: Morón B, Bethune MT, Comino I, Manyani H, Ferragud M, López MC, Onion A, Khosla C, Sousa C. 2008a. Toward the assessment of food toxicity for celiac patients:
characterization of monoclonal antibodies to a main immunogenic gluten peptide. PLoS One 3:e2294. characterization of monoclonal antibodies to a main immunogenic gluten peptide. PLoS One 3: e2294.
Morón B, Cebolla A, Manyani H, Álvarez-Maqueda M, Megías M, Thomas M del C, López MC, Sousa C. 2008b. Sensitive detection of cereal fractions that are toxic to celiac disease patients by using monoclonal antibodies to a main immunogenic wheat Morón B, Onion A, Manyani H, Álvarez-Maqueda M, Megías M, Thomas M del C, López MC, Sousa C. 2008b. Sensitive detection of cereal fractions that are toxic to celiac disease patients by using monoclonal antibodies to a main immunogenic wheat
peptide. Am J Clin Nutr; 87:405-414. peptide Am J Clin Nutr; 87: 405-414.
Pinches M, Betts C, Bickerton S, Burdett L, Thomas H, Derbyshire N, Jones H B, Moores M. 2012. Evaluation of novel renal biomarkers with a cisplatin model of kidney injury: gender and dosage differences. Toxicol Pathol; 40:522-33. Pinches M, Betts C, Bickerton S, Burdett L, Thomas H, Derbyshire N, Jones H B, Moores M. 2012. Evaluation of novel renal biomarkers with a cisplatin model of kidney injury: gender and dosage differences. Toxicol Pathol; 40: 522-33.
Pisitkun T, Johnstone R, Knepper MA. 2006. Discovery of urinary biomarkers. Mol Cell Proteomics; 5:1760-1771. Pisitkun T, Johnstone R, Knepper MA. 2006. Discovery of urinary biomarkers. Mol Cell Proteomics; 5: 1760-1771.
Real A, Comino I, de Lorenzo L, Merchán F, Gil-Humanes J, Giménez MJ, López- Casado MÁ, Torres MI, Cebolla Á, Sousa C, Barro F, Pistón F. 2012. Molecular and immunological characterization of gluten proteins isolated from oat cultivars that differ in toxicity for celiac disease. PLoS One; 7:e48365. Real A, Comino I, by Lorenzo L, Merchán F, Gil-Humanes J, Giménez MJ, López- Married MÁ, Torres MI, Cebolla Á, Sousa C, Barro F, Piston F. 2012. Molecular and immunological characterization of gluten proteins isolated from oat cultivars that differ in toxicity for celiac disease. PLoS One; 7: e48365.
Real A, Comino I, Moreno ML, LópezǦCasado MA, Lorite P, Torres MI, Cebolla A,Sousa C. 2014. Identification and in Vitro reactivity of Riestra, S. 2008. Enfermedades asociadas. Polanco I. (ed.) en Libro blanco de la Enfermedad Celiaca, Madrid, España, pp. 41-49. Real A, Comino I, Moreno ML, LópezǦCasado MA, Lorite P, Torres MI, Onion A, Sousa C. 2014. Identification and in Vitro reactivity of Riestra, S. 2008. Associated diseases. Polanco I. (ed.) In White Paper on Celiac Disease, Madrid, Spain, pp. 41-49.
Rubio-Tapia A, Kyle RA, Kaplan E L, Johnson DR, Page W, Erdtmann F, Brantner TL, Rubio-Tapia A, Kyle RA, Kaplan E L, Johnson DR, Page W, Erdtmann F, Brantner TL,
Kim WR, Phelps TK, Lahr BD, Zinsmeister AR, Melton LJ, Murray JA. 2009. Increased prevalence and mortality in undiagnosed celiac disease. Gastroenterology; 137:88-93. Kim WR, Phelps TK, Lahr BD, Zinsmeister AR, Melton LJ, Murray JA. 2009. Increased prevalence and mortality in undiagnosed celiac disease. Gastroenterology; 137: 88-93.
Rubio-Tapia A, Murray JA. 2010. Classification and management of refractory coeliac disease. Gut; 59:547-57. Rubio-Tapia A, Murray JA. 2010. Classification and management of refractory coeliac disease Gut; 59: 547-57.
Rujner J. 2002. Celiakia (choroba trzewna). In: Rujner J., CichaĔska B.A. (eds.): Dieta Rujner J. 2002. Celiakia (Choroba Trzewna). In: Rujner J., CichaĔska B.A. (eds.): Diet
bezglutenowa i bezmleczna dla dzieci i dorosáych. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa: 9-22. Bezglutenowa and Bezmleczna Dla Dzieci and Dorosáych. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa: 9-22.
Sapone A, Bai JC, Ciacci C, et al. 2012. Spectrum of gluten-related disorders: consensus on new nomenclature and classi¿cation. BMC Med; 10:13. Sapone A, Bai JC, Ciacci C, et al. 2012. Spectrum of gluten-related disorders: consensus on new nomenclature and classi¿cation. BMC Med; 10:13
Shan L, Molberg Ø, Parrot I, Hausch F, Gray G M, Sollid L M, Khosla C. 2002. Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue. Science; 297: 2275-2279. Shan L, Molberg Ø, Parrot I, Hausch F, Gray G M, Sollid L M, Khosla C. 2002. Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue. Science; 297: 2275-2279.
Sharkey L M, Corbett G, Currie E, Lee J, Sweeney N, Woodward J M. 2013. Optimising delivery of care in coeliac disease-comparison of the benefits of repeat biopsy and serological follow-up. Aliment Pharmacol Ther; 38:1278-1291. Sharkey L M, Corbett G, Currie E, Lee J, Sweeney N, Woodward J M. 2013. Optimizing delivery of care in coeliac disease-comparison of the benefits of repeat biopsy and serological follow-up. Aliment Pharmacol Ther; 38: 1278-1291.
Silvester JA, Rashid M. 2007. Long-term follow-up of individuals with celiac disease: an evaluation of current practice guidelines. Can J Gastroenterol; 21:557-564. Silvester JA, Rashid M. 2007. Long-term follow-up of individuals with celiac disease: an evaluation of current practice guidelines. Can J Gastroenterol; 21: 557-564.
Stern M, Ciclitira PJ, Van Eckert R, Feighery C, Janssen FW, Méndez E, Mothes T, Troncone R, Wieser H. 2001. Analysis and clinical effects of gluten in coeliac disease. Eur J Gastroenterol Hepatol; 13:741-747. Stern M, Ciclitira PJ, Van Eckert R, Feighery C, Janssen FW, Méndez E, Mothes T, Troncone R, Wieser H. 2001. Analysis and clinical effects of gluten in coeliac disease. Eur J Gastroenterol Hepatol; 13: 741-747.
Stoven S, Murray JA, Marietta E. 2012. Celiac disease: advances in treatment via gluten modification. Clin Gastroenterol Hepatol; 10:859-862. Stoven S, Murray JA, Marietta E. 2012. Celiac disease: advances in treatment via gluten modification. Clin Gastroenterol Hepatol; 10: 859-862.
Tack GJ, Verbeek WH, Schreurs MW, Mulder CJ. 2010. The spectrum of celiac disease: epidemiology, clinical aspects and treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol; 7:204-213. Tack GJ, Verbeek WH, Schreurs MW, Mulder CJ. 2010. The spectrum of celiac disease: epidemiology, clinical aspects and treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol; 7: 204-213.
Tio M, Cox MR, Eslick GD. 2012. Meta-analysis: coeliac disease and the risk of allUncle M, Cox MR, Eslick GD. 2012. Meta-analysis: coeliac disease and the risk of all
cause mortality, any malignancy and lymphoid malignancy. Aliment Pharmacol Ther; 35:540-551. cause mortality, any malignancy and lymphoid malignancy. Aliment Pharmacol Ther; 35: 540-551.
Tursi A, Brandimarte G, Giorgetti GM. 2003. Lack of usefulness of antitransglutaminase antibodies in assessing histologic recovery after gluten-free diet in celiac disease. J Clin Gastroenterol; 37:387-391. Tursi A, Brandimarte G, Giorgetti GM. 2003. Lack of usefulness of antitransglutaminase antibodies in assessing histologic recovery after gluten-free diet in celiac disease J Clin Gastroenterol; 37: 387-391.
Tursi A, Brandimarte G, Giorgetti G M et al. 2006. Endoscopic and histological findings in the duodenum of adults with celiac disease before and after changing to a glutenfree diet: a 2-year prospective study. Endoscopy; 38:702-707. Tursi A, Brandimarte G, Giorgetti G M et al. 2006. Endoscopic and histological findings in the duodenum of adults with celiac disease before and after changing to a glutenfree diet: a 2-year prospective study. Endoscopy; 38: 702-707.
Tye-Din JA, Stewart JA, Dromey JA, Beissbarth T, van Heel DA, Tatham A, Henderson K, Mannering SI, Gianfrani C, Jewell DP, et al. 2010. Comprehensive, quantitative Tye-Din JA, Stewart JA, Dromey JA, Beissbarth T, van Heel DA, Tatham A, Henderson K, Mannering SI, Gianfrani C, Jewell DP, et al. 2010. Comprehensive, quantitative
mapping of T cell epitopes in gluten in celiac disease. Sci Transl Med; 2:41ra51. mapping of T cell epitopes in gluten in celiac disease. Sci Transl Med; 2: 41ra51.
Vallejo-Diez S, Bernardo D, Moreno Mde L, Muñoz-Suano A, Fernández-Salazar L, Calvo C, Sousa C, Garrote JA, Cebolla A, Arranz E. 2013. Detection of specific IgA antibodies against a novel deamidated 8-mer gliadin peptide in blood plasma samples from celiac patients. PLoS One; 22:e80982. Vallejo-Diez S, Bernardo D, Moreno Mde L, Muñoz-Suano A, Fernández-Salazar L, Calvo C, Sousa C, Garrote JA, Onion A, Arranz E. 2013. Detection of specific IgA antibodies against a novel deamidated 8-mer gliadin peptide in blood plasma samples from celiac patients. PLoS One; 22: e80982.
Vives-Pi M, Takasawa S, Pujol-Autonell I, Planas R, Cabre E, Ojanguren I, Montraveta M, Santos AL, Ruiz-Ortiz E. 2013. Biomarkers for diagnosis and monitoring of celiac disease. J Clin Gastroenterol; 47:308-313. Vives-Pi M, Takasawa S, Pujol-Autonell I, Planas R, Cabre E, Ojanguren I, Montraveta M, Santos AL, Ruiz-Ortiz E. 2013. Biomarkers for diagnosis and monitoring of celiac disease. J Clin Gastroenterol; 47: 308-313.
- Figura 1. Relación de la concentración de los patrones de gliadina con la intensidad de la señal cuantitativa del lector de tiras IC. El valor medio de la intensidad, - Figure 1. Relationship of the concentration of gliadin patterns with the intensity of the quantitative signal of the IC strip reader. The average intensity value,
desviación estándar (s) y la desviación estándar relativa (RSD) se calculó para cada patrón estándar. La función Rodbard fue calculada mediante la utilización del software del Reader con los parámetros incluidos en la tabla. standard deviation (s) and relative standard deviation (RSD) was calculated for each standard pattern The Rodbard function was calculated by using the software of the Reader with the parameters included in the table.
- --
- Figura 2. Cinética de eliminación y aparición de GIPs en muestras de orina de individuos sanos (n=13) sometidos a una dieta controlada de gluten. Figure 2. Kinetics of elimination and occurrence of GIPs in urine samples of healthy individuals (n = 13) subjected to a controlled gluten diet.
Semicuantificación de péptidos/proteínas de gluten mediante tiras inmunocromatográficas con anticuerpo G12 en las muestras de orina de individuos sanos que tras consumir una DCG se sometieron a DSG hasta que los péptidos reactivos del gluten se volvieron indetectables. Tras esto, se sometieron a una DCG para comprobar la aparición nuevamente de GIPs en las muestras de orina. Se recogieron entre 3 y 6 muestras de orina al día de cada individuo durante cuatro días. A) Ejemplo representativo de la colección de tiras IC reaccionando con muestras de orina de un individuo que intervino en el estudio (aH6). La franja azul es un control interno positivo que indica que el dispositivo ha funcionado correctamente, y la franja Semi-quantification of gluten peptides / proteins by strips immunochromatographic with G12 antibody in the urine samples of individuals healthy that after consuming a DCG underwent DSG until the peptides gluten reagents became undetectable. After this, they underwent a DCG to check the appearance of GIPs again in urine samples. Between 3 and 6 urine samples were collected daily from each individual for four days. A) Representative example of the IC strip collection reacting with urine samples from an individual who participated in the study (aH6). The blue strip is a positive internal control that indicates that the device has worked correctly, and the strip
rosa indica la presencia de péptidos del gluten. B) Cinética de excreción de GIPs de 4 individuos sanos (aH1-aH12). GIPs, péptidos inmunogénicos del gluten; DCG, dieta normal con gluten; DSG, dieta sin gluten. Pink indicates the presence of gluten peptides. B) KIP excretion kinetics of 4 healthy individuals (aH1-aH12). GIPs, gluten immunogenic peptides; DCG, normal gluten diet; DSG, gluten free diet.
- Figura 3. Monitorización in vivo de la excreción urinaria de los péptidos derivados del gluten de individuos sanos tras ingestas controladas de gluten. Se administraron tres - Figure 3. In vivo monitoring of urinary excretion of peptides derived from Gluten from healthy individuals after controlled gluten intakes. Three were administered
dosis de gluten (10, 25 y 50 mg) a individuos sanos que estuvieron consumiendo una DSG durante 1 semana. Se muestran 4 experimentos independientes correspondientes a muestras medidas por triplicado para las ingestas de 25 y 50 mg de gluten de 4 individuos sanos. GIPs, péptidos inmunogénicos del gluten; DSG, dieta sin gluten. doses of gluten (10, 25 and 50 mg) to healthy individuals who were consuming a DSG for 1 week. Four independent experiments are shown corresponding to samples measured in triplicate for the intakes of 25 and 50 mg of gluten from 4 healthy individuals. GIPs, gluten immunogenic peptides; DSG, gluten free diet.
- Figura 4. Monitorización de la adherencia a la DSG de los pacientes celiacos mediante detección y cuantificación de GIPs en muestras de orina. Los pacientes celíacos incluidos en el estudio seguían una DSG gt; 2 años y los individuos sanos que participaron como controles positivos consumieron una DCG. Los participantes fueron divididos en dos grupos según edades: adultos (gt;16 años) y niños (0-15 años). Cada - Figure 4. Monitoring of the adherence to the DSG of celiac patients by detection and quantification of GIPs in urine samples. The celiac patients included in the study followed a gt DSG; 2 years and healthy individuals who participated as positive controls consumed a DCG. The participants were divided into two groups according to age: adults (> 16 years old) and children (0-15 years old). Every
punto representa el valor medio de absorbancia (DO de 450 nm) de la muestra de orina analizada de cada individuo. De acuerdo con el límite de cuantificación de la técnica (LQ=0,8 ng/ml, línea señalada), los individuos con un valor de GIPs superior o igual al LQ se consideraron positivos para la presencia de GIPs, mientras que aquellos con contenido en GIPs menor que el LQ fueron considerados negativos. * p lt;0,0001 dot represents the average absorbance value (OD of 450 nm) of the analyzed urine sample of each individual. According to the quantification limit of the technique (LQ = 0.8 ng / ml, indicated line), individuals with a GIP value greater than or equal to LQ were considered positive for the presence of GIPs, while those with content in GIPs lower than the LQ they were considered negative. * p <0.0001
(test de Student). GIPs, péptidos inmunogénicos del gluten; DSG, dieta sin gluten; DCG, dieta normal con gluten; LQ, límite de cuantificación. (Student test). GIPs, gluten immunogenic peptides; DSG, gluten free diet; DCG, normal gluten diet; LQ, quantification limit.
La presente invención muestra un procedimiento para la monitorización no invasiva de la adherencia a la dieta libre de gluten mediante la detección y cuantificación de los péptidos inmunogénicos del gluten resistentes a la digestión gastrointestinal en fluidos humanos y de forma preferente en orina. La presencia o ausencia de los péptidos 10 inmunogénicos del gluten resistentes a degradación enzimática intestinal es detectada por ensayos inmunológicos basados en anticuerpos reactivos frente a los mismos. La reactividad frente a tales péptidos se puede señalizar mediante técnicas inmunológicas variadas que incluyen la inmunocromatografía, biosensores, ensayos ELISA, detección con partículas magnéticas, etc. Si el fluido humano tiene poca concentración de 15 péptidos del gluten, el procedimiento puede requerir como paso previo al ensayo inmunológico la concentración de los péptidos inmunogénicos mediante paso del fluido a través de unas columnas. Esta metodología es aplicable en el sector médico-clínico, tanto en la verificación del cumplimiento de la dieta libre de gluten de los pacientes celiacos, pacientes con sensibilidad alérgica o en pacientes con cualquier tipo de 20 sensibilidad a las proteínas del gluten, así como en el diagnóstico preciso de la enfermedad celíaca refractaria, es decir, en aquellos casos donde persisten los síntomas a pesar la supuesta ausencia total de ingesta de gluten. También puede aplicarse la invención en investigación clínica de la enfermedad celíaca para comprobar la eficacia de futuras estrategias relacionadas con la eliminación o The present invention shows a method for non-invasive monitoring of adherence to the gluten-free diet by detecting and quantifying the immunogenic gluten peptides resistant to gastrointestinal digestion in human fluids and preferably in urine. The presence or absence of gluten immunogenic peptides 10 resistant to intestinal enzymatic degradation is detected by immunological assays based on antibodies reactive against them. The reactivity against such peptides can be signaled by various immunological techniques that include immunochromatography, biosensors, ELISAs, detection with magnetic particles, etc. If the human fluid has a low concentration of 15 gluten peptides, the procedure may require the concentration of immunogenic peptides as a step prior to the immunological test by passing the fluid through columns. This methodology is applicable in the medical-clinical sector, both in the verification of compliance with the gluten-free diet of celiac patients, patients with allergic sensitivity or in patients with any type of sensitivity to gluten proteins, as well as in the precise diagnosis of refractory celiac disease, that is, in those cases where symptoms persist despite the supposed total absence of gluten intake. The invention can also be applied in clinical investigation of celiac disease to verify the effectiveness of future strategies related to elimination or
25 disminución de la toxicidad del gluten. 25 decrease in gluten toxicity.
La presente invención tiene como objeto la aplicación de técnicas inmunológicas basadas en anticuerpos que reconocen péptidos inmunogénicos derivados del gluten y resistentes a degradación intestinal en muestras de fluidos humanos. En una realización preferente de la invención el uso de la orina como The present invention has as its object the application of immunological techniques based on antibodies that recognize gluten-derived immunogenic peptides and resistant to intestinal degradation in human fluid samples. In a preferred embodiment of the invention the use of urine as
30 muestra al permitir disponer de mayores volúmenes que de saliva, sudor, suero, etc., facilitando por tanto el trabajo de recogida de las muestras. La aplicación preferente de la invención es la detección de la ingestión de gluten en pacientes que son diagnosticados y monitorizados por tener alguna sensibilidad al gluten. Tiene una aplicación preferente en la verificación de la ingesta de gluten durante el diagnóstico 30 shows by allowing to have larger volumes than saliva, sweat, serum, etc., thus facilitating the work of collecting samples. The preferred application of the invention is the detection of gluten intake in patients who are diagnosed and monitored for having some gluten sensitivity. It has a preferential application in the verification of gluten intake during diagnosis
35 de la EC, en la comprobación del cumplimiento de la DSG de los pacientes celiacos ya 35 of the EC, in checking the compliance of the DSG of celiac patients already
diagnosticados, así como en la detección de un caso de potencial intoxicación por gluten en cualquier paciente con sensibilidad al gluten inmunotóxico. La invención se basa en emplear preferentemente técnicas inmunológicas que usan anticuerpos que reconocen los péptidos del gluten inmunotóxicos y resistentes a la digestión diagnosed, as well as in the detection of a case of potential poisoning by gluten in any patient with sensitivity to immunotoxic gluten. The invention is based on preferably using immunological techniques that use antibodies that recognize immunotoxic and digestion resistant gluten peptides
gastrointestinal. gastrointestinal.
El término “anticuerpo” se refiere a moléculas de inmunoglobulinas o a porciones activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, a moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con el péptido de la invención. Ejemplos de porciones de The term "antibody" refers to immunoglobulin molecules or to active portions of immunoglobulin molecules, that is, to molecules that contain an antigen binding site that specifically binds (immunoreacts) with the peptide of the invention. Examples of portions of
moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab’)2, los cuales pueden ser generados, por ejemplo, aunque sin limitación, tratando el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina. Otro ejemplo de seleccionar las porciones activas de inmunoglobulinas conocidas en el estado de la técnica se realizan mediante técnicas de ingeniería genética usando las regiones Immunologically active immunoglobulin molecules include F (ab) and F (ab ’) 2 fragments, which can be generated, for example, but not limited to, treating the antibody with an enzyme such as pepsin. Another example of selecting the active portions of immunoglobulins known in the state of the art are performed by genetic engineering techniques using the regions.
variables de las inmunoglobulinas. immunoglobulin variables.
El anticuerpo de la invención puede ser policlonal (incluye típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epítopos distintos) o monoclonal (dirigido contra un único determinante en el antígeno). La expresión “anticuerpo monoclonal” alude a una población de moléculas de anticuerpos que contienen The antibody of the invention can be polyclonal (typically includes different antibodies directed against different determinants or epitopes) or monoclonal (directed against a single determinant in the antigen). The expression "antibody monoclonal ”refers to a population of antibody molecules that contain
solamente una especie de un sitio de fijación de antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno. El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioquímicamente, mediante manipulación genética, o puede ser sintético, careciendo, posiblemente, el anticuerpo en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento del péptido de la invención, y estando sustituidas only a species of an antigen binding site capable of immunoreacting with a particular epitope of the antigen. The monoclonal antibody may be biochemically altered, by genetic manipulation, or it may be synthetic, possibly lacking the antibody in whole or in part, from portions that are not necessary for recognition of the peptide of the invention, and being substituted
por otras que comunican al anticuerpo propiedades ventajosas adicionales. by others that communicate additional advantageous properties to the antibody.
El anticuerpo de la invención puede ser quimérico. Así, una región de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de una especie determinada o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos determinados, mientras que la(s) cadena(s) restante(s) The antibody of the invention can be chimeric. Thus, a region of the chain heavy and / or light is identical or homologous to the corresponding sequences in antibodies from a specific species or belonging to a class or subclass of certain antibodies, while the remaining chain (s)
es(son) idéntica(s), u homóloga(s), a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de dichos anticuerpos, de manera que exhiban la reactividad deseada. is (are) identical, or homologous (s), to the corresponding sequences in antibodies derived from other species or belonging to another class or subclass of antibodies, as well as to fragments of said antibodies, so as to exhibit the desired reactivity .
Son de uso preferente los anticuerpos monoclonales A1 y G12 obtenidos por reactividad frente al 33-mer de la alfa-gliadina del trigo, aunque otros anticuerpos que The A1 and G12 monoclonal antibodies obtained by reactivity against 33-mer of wheat alpha-gliadin are preferred, although other antibodies that
reconocen péptidos resistentes a digestión del gluten como el R5 o anticuerpos anti 8mer de la omega-gliadina podrían usarse. Una forma preferente de realizarse la detección de los péptidos del gluten podría ser mediante pruebas de flujo lateral (lateral flow test) con inmunocromatografía. El método de la invención debería Recognize gluten digestion resistant peptides such as R5 or anti-8mer antibodies from omega-gliadin could be used. A preferred way of detecting gluten peptides could be through lateral flow tests with immunochromatography. The method of the invention should
idealmente permitir detectar en orina una ingesta de gluten puntual equivalente a 50 mg de gluten de trigo por día, que es una cantidad situada en el rango máximo descrito para una DSG, o en su caso un mínimo de 6.48 ng de péptidos inmunogénicos de gluten (GIPs,) /ml de orina. Ideally, it is possible to detect in urine a punctual gluten intake equivalent to 50 mg of wheat gluten per day, which is an amount within the maximum range described for a DSG, or where appropriate a minimum of 6.48 ng of immunogenic gluten peptides ( GIPs,) / ml of urine.
La detección y/o cuantificación de los péptidos en fluidos humanos se puede The detection and / or quantification of peptides in human fluids can be
llevar a cabo mediante ensayos inmunológicos, por ejemplo, aunque sin limitación, por inmunocromatografía con tiras de flujo lateral, inmunoprecipitación, separación inmunomagnética, arrays de proteína, inmunofluorescencia por detección por partículas fluorescentes en citometría de flujo, biosensores electroquímicos, biosensores de resonancia de plasma (ejemplo: BIACORE®™), termoeléctricos, carried out by immunological tests, for example, but not limited to, by immunochromatography with lateral flow strips, immunoprecipitation, immunomagnetic separation, protein arrays, immunofluorescence by detection by fluorescent particles in flow cytometry, electrochemical biosensors, plasma resonance biosensors (example: BIACORE® ™), thermoelectric,
nanomecánicos, ópticos y en definitiva, cualquier técnica inmunológica conocida que sea suficientemente sensible y específica para garantizar la detección y, preferentemente la cuantificación de los péptidos del gluten. Es objeto preferente de la presente invención kits o dispositivos analíticos inmunológicos basados en anticuerpos reactivos frente a péptidos del gluten presentes en orina los cuales han demostrado nanomechanics, optical and ultimately, any known immunological technique that is sensitive and specific enough to guarantee the detection and, preferably, the quantification of gluten peptides. Preference is given to the present invention kits or immunological analytical devices based on antibodies reactive against gluten peptides present in urine which have demonstrated
ser resistentes a digestión gástrica e inmunogénicos Probablemente estos péptidos podrían pasar al sistema sanguíneo y posteriormente ser excretados, entre ellos estarían los péptidos reconocidos por los anticuerpos A1 y G12 (Morón et al. 2008b). be resistant to gastric and immunogenic digestion Probably these peptides could pass into the blood system and subsequently be excreted, among them would be the peptides recognized by antibodies A1 and G12 (Morón et al. 2008b).
Dichos procedimientos y kits analíticos tienen también su objeto en la invención en su uso para revelar que se ha consumido gluten, ya sea por la contaminación de los alimentos consumidos, por una mala praxis en la manipulación de alimentos, o por una ingesta voluntaria/involuntaria ocasional de alimentos que contienen gluten. Además, es objeto de la presente invención la aplicación de la detección de dichos péptidos inmunotóxicos en muestras de orina con fines en investigación clínica sobre la EC, para comprobar la eficacia de futuras terapias relacionadas con la disminución o Said methods and analytical kits also have their object in the invention in their use to reveal that gluten has been consumed, either by the contamination of the food consumed, by a bad practice in food handling, or by a voluntary / involuntary intake Occasional foods that contain gluten. Furthermore, it is the object of the present invention to apply the detection of said immunotoxic peptides in urine samples for purposes of clinical research on CD, to verify the efficacy of future therapies related to the decrease or
eliminación de la toxicidad del gluten entre las que se encuentran las terapias enzimáticas con prolil-endopeptidasas, la eliminación de las prolaminas del gluten de los granos de cereales, las terapias secuestrantes de péptidos inmunotóxicos, la detoxificación de los péptidos del gluten nocivos en los alimentos elaborados y otras terapias alternativas. elimination of gluten toxicity among which are the enzymatic therapies with prolyl-endopeptidases, the elimination of gluten prolamines from cereal grains, immunotoxic peptide sequestrant therapies, the detoxification of harmful gluten peptides in food elaborated and other alternative therapies.
El objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento para detección The object of the present invention is a method for detection
o monitorización del gluten ingerido mediante detección de péptidos inmunogénicos del gluten en muestras de orina, caracterizado por el uso de métodos inmunológicos con anticuerpos que reconocen, preferentemente a epítopos relacionados con el péptido 33-mer de la -gliadina y otras secuencias peptídicas resistentes a las digestión gastrointestinal. or monitoring of ingested gluten by detection of immunogenic gluten peptides in urine samples, characterized by the use of immunological methods with antibodies that recognize, preferably epitopes related to the 33-mer peptide of -gliadine and other peptide sequences resistant to Gastrointestinal digestion
Es objeto de la presente invención el uso de técnicas inmunológicas para dicha detección de gluten en orina y otros fluidos humanos. Los métodos inmunológicos podrían ser tiras inmunocromatográficas, inmunomicropartículas fluorescentes, Western blots, ELISAs, biosensores basados en reacciones electroquímicas catalizadas por enzimas acoplados a los anticuerpos, por partículas magnéticas tapizadas por anticuerpos, por resonancia de plasmones superficiales, otros biosensores ópticos, termoeléctricos, y demás técnicas en las que se pueda medir la concentración de un analito por un anticuerpo. The use of immunological techniques for the detection of gluten in urine and other human fluids is an object of the present invention. The immunological methods could be immunochromatographic strips, fluorescent immunomicroparticles, Western blots, ELISAs, biosensors based on electrochemical reactions catalyzed by antibodies coupled to antibodies, by magnetic particles upholstered by antibodies, by surface plasmon resonance, other optical biosensors, thermoelectric, and others techniques in which the concentration of an analyte by an antibody can be measured.
En una forma preferente de la invención, estos métodos se caracterizan porque emplean preferentemente al menos un anticuerpo con capacidad para detectar epítopos que contienen en su secuencia al menos un tercio de prolinas y un tercio de glutaminas como son las secuencias siguientes: SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 4, SEQ ID Nº 5, SEQ ID Nº 6, SEQ ID Nº 7, SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 10, SEQ ID Nº 11 así como sustituciones aleatorias de glutamato por glutamina en estos péptidos que podría ocurrir por desaminación mediada por transglutaminasas. En una forma preferente de la invención los anticuerpos usados por las técnicas inmunológicas serían el G12 y por extensión el A1, por su demostrada especificidad y sensibilidad. También contempla la invención el uso de otros anticuerpos como el R5 que se suele utilizar en la medida de gluten en alimentos y que reacciona con epítopos similares a la secuencia SEQ ID Nº 9 que también puede hallarse en péptidos del gluten resistente a digestión gastrointestinal, aunque con menor especificidad y sensibilidad ante péptidos inmunogénicos similares al péptido 33-mer, podrían tener sensibilidad suficiente al reaccionar péptidos resistentes a proteasas típicas de las prolaminas de los cereales tóxicos para celiacos. In a preferred form of the invention, these methods are characterized in that they preferably employ at least one antibody capable of detecting epitopes containing in their sequence at least one third of prolines and one third of glutamines as are the following sequences: SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11 as well as random glutamate substitutions for glutamine in these peptides that could occur due to transglutaminase mediated deamination. In a preferred form of the invention, the antibodies used by immunological techniques would be G12 and by extension A1, due to their demonstrated specificity and sensitivity. The invention also contemplates the use of other antibodies such as R5 which is usually used in the measurement of gluten in foods and that reacts with epitopes similar to the sequence SEQ ID No. 9 which can also be found in gluten peptides resistant to gastrointestinal digestion, although With lower specificity and sensitivity to immunogenic peptides similar to the 33-mer peptide, they may have sufficient sensitivity when reacting protease-resistant peptides typical of prolamines of celiac-toxic cereals.
Una forma preferente de la invención sería el empleo de tiras inmunocromatográficas basadas en los anticuerpos anti-33-mer de la -gliadina, G12 y A1, que permiten una detección semicuantitativa y rápida de los péptidos/proteínas del gluten contenidos en las muestras de orina. A preferred form of the invention would be the use of immunochromatographic strips based on the anti-33-mer antibodies of -gliadine, G12 and A1, which allow a semi-quantitative and rapid detection of gluten peptides / proteins contained in the samples of urine.
Otro objeto de la invención lo constituye el uso particular de métodos inmunológicos basados en el anticuerpo monoclonal G12 y A1 conjugado a un enzima que permita un ensayo cuantitativo usando sustratos cromogénicos, fluorogénicos o luminiscentes. Este procedimiento podría usar un patrón de gliadina, gliadina Another object of the invention is the particular use of immunological methods based on the monoclonal antibody G12 and A1 conjugated to an enzyme that allows a quantitative assay using chromogenic, fluorogenic or luminescent substrates. This procedure could use a pattern of gliadin, gliadin
hidrolizada, el péptido 33-mer completo (SEQ ID Nº 1) o una parte de su secuencia de al menos 8 aminoácidos. hydrolyzed, the complete 33-mer peptide (SEQ ID No. 1) or a part of its sequence of at least 8 amino acids.
La invención propone la detección del gluten ingerido por un individuo mediante la cuantificación de los péptidos inmunogénicos del gluten excretados en la orina y en otros fluidos humanos como la saliva, el sudor o el suero. The invention proposes the detection of gluten ingested by an individual by quantifying the immunogenic gluten peptides excreted in the urine and other human fluids such as saliva, sweat or serum.
La invención propone un método analítico de control para la verificar si se cumple la DSG, así como también para descartar la ingesta no controlada de gluten en los pacientes sospechosos de sufrir la llamada EC refractaria. The invention proposes an analytical control method to verify if the DSG is met, as well as to rule out the uncontrolled intake of gluten in patients suspected of suffering from the so-called refractory EC.
Es parte de la invención aplicar el método en la comprobación de la eficacia de las estrategias terapéuticas que reducen o eliminan la toxicidad del gluten mediante la desintoxicación enzimática del gluten (por ejemplo Alvine Pharmaceuticals Ltd., EEUU; It is part of the invention to apply the method in checking the efficacy of therapeutic strategies that reduce or eliminate gluten toxicity by enzymatic detoxification of gluten (for example Alvine Pharmaceuticals Ltd., USA;
o DSM, Holanda), mediante secuestro de las prolaminas tóxicas por polímeros para evitar su hidrólisis (por ejemplo, BiolineRX, Israel) u otras terapias alternativas. También podrán ser controladas las muestras de orina de los pacientes celíacos sometidos a ensayos clínicos o a una prescripción terapéutica en el futuro, ya que la or DSM, The Netherlands), by sequestering toxic prolamines by polymers to prevent hydrolysis (for example, BiolineRX, Israel) or other alternative therapies. Urine samples from celiac patients undergoing clinical trials or a therapeutic prescription in the future may also be monitored, since the
efectividad de la terapia se podría determinar midiendo la presencia o ausencia de péptidos en orina en las siguientes horas de la ingesta de alguna cantidad controlada de gluten junto con las terapias que eliminen los péptidos inmunotóxicos, o bien tras la ingesta de alimentos tratados con alguna metodología que evite que los péptidos inmunotóxicos se internalicen en el individuo. The effectiveness of the therapy could be determined by measuring the presence or absence of peptides in urine within the following hours of the intake of some controlled amount of gluten along with therapies that eliminate immunotoxic peptides, or after the intake of foods treated with some methodology that prevents immunotoxic peptides from internalizing in the individual.
La falta de consenso actual en la práctica clínica sobre cómo llevar el control de la DSG y la determinación de casos de exposición involuntaria al gluten por contaminación de los alimentos podrían ser resueltos con simples ensayos inmunológicos de las muestras de orina. Los profesionales sanitarios podrían considerar útiles estos métodos para el seguimiento de los pacientes celíacos y en el The lack of current consensus in clinical practice on how to take control of the DSG and the determination of cases of involuntary exposure to gluten by contamination of food could be resolved with simple immunological tests of urine samples. Healthcare professionals may find these methods useful for monitoring celiac patients and in the
diseño de futuros ensayos clínicos con el fin de establecer conclusiones coherentes sobre el estado de la enfermedad del paciente. design of future clinical trials in order to establish consistent conclusions about the patient's disease status.
En una realización preferente de la invención, se realiza una preconcentración de los péptidos en las muestras de orina mediante un sistema de extracción en fase sólida (solid phase extraction, SPE), por unión fisicoquímica de los péptidos a la matriz In a preferred embodiment of the invention, a preconcentration of the peptides in the urine samples is performed by a solid phase extraction system (SPE), by physicochemical binding of the peptides to the matrix
de forma reversible y posterior desunión de los mismos tras elución con una solución de composición adecuada que permite despegar los péptidos de la matriz. También pueden concentrarse por interacción con anticuerpos específicos inmovilizados en las resinas cromatográficas o en partículas magnéticas. reversibly and subsequent disunity thereof after elution with a solution of suitable composition that allows peptides to be removed from the matrix. They can also be concentrated by interaction with specific antibodies immobilized in chromatographic resins or magnetic particles.
Posteriormente los polipéptidos del gluten concentrados se eluyen con un volumen inferior de una solución adecuada compatible con la posterior cuantificación mediante las tiras inmunocromatográficas que usen al menos un anticuerpo antipéptidos de prolaminas, preferentemente aquellos reconocidos por los mencionados A1 y G12, pero no limitados a éstos. Para poder cuantificar la cantidad de péptido, el procedimiento se podría completar usando unos patrones de referencia con proteínas del gluten intactas, o preferentemente, polipéptidos del gluten hidrolizados por pepsina y tripsina o bien sintetizados. La intensidad de señal de cantidades conocidas de péptido patrón serviría para extrapolar la cantidad de péptido en la muestra realizando una recta patrón. Subsequently, the concentrated gluten polypeptides are eluted with a lower volume of a suitable solution compatible with subsequent quantification by immunochromatographic strips using at least one prolamin antiseptic antibody, preferably those recognized by those mentioned A1 and G12, but not limited thereto. . In order to quantify the amount of peptide, the procedure could be completed using reference standards with intact gluten proteins, or preferably, gluten polypeptides hydrolyzed by pepsin and trypsin or synthesized. The signal intensity of known amounts of standard peptide would serve to extrapolate the amount of peptide in the sample by performing a straight pattern.
Ejemplo 1. Concentración, detección y semicuantificación de péptidos inmunogénicos del gluten en orina utilizando tiras inmunocromatográficas. Example 1. Concentration, detection and semiquantification of immunogenic peptides of gluten in urine using immunochromatographic strips.
En el presente ejemplo de realización se muestra cómo pueden detectarse y cuantificarse en orina los péptidos inmunogénicos del gluten, a pesar de la esperada digestión gastrointestinal, tras un proceso de preconcentración. El gluten es una mezcla compleja de proteínas que comprenden las gliadinas y gluteninas en trigo y proteínas equivalentes en la cebada, centeno y en algunas variedades de avena. Las gliadinas y gluteninas tienen una composición única de aminoácidos con un alto contenido de prolina (15%), aminoácidos hidrofóbicos (19%) y glutamina (35%); por lo tanto, forman una estructura resistente para completar la digestión por proteasas pancreáticas. Tras la reciente demostración de que las tiras inmunocromatográficas anti 33-mer de la -gliadina, basadas en los anticuerpos G12 y A1, pueden detectar con gran sensibilidad los péptidos de gluten hidrolizado a partir de muestras de heces y cervezas (Comino et al, 2012; Real et al., 2014 en prensa), se planteó si los péptidos del gluten también se excretan en la orina. In the present exemplary embodiment, it is shown how gluten immunogenic peptides can be detected and quantified in urine, despite the expected gastrointestinal digestion, after a preconcentration process. Gluten is a complex mixture of proteins comprising gliadins and glutenins in wheat and equivalent proteins in barley, rye and in some varieties of oats. Gliadins and glutenins have a unique composition of amino acids with a high proline content (15%), hydrophobic amino acids (19%) and glutamine (35%); therefore, they form a resistant structure to complete digestion by pancreatic proteases. After the recent demonstration that the anti-33-mer immunochromatographic strips of -gliadin, based on the G12 and A1 antibodies, can detect with great sensitivity the hydrolyzed gluten peptides from stool and beer samples (Comino et al, 2012; Real et al., 2014 in press), it was raised whether gluten peptides are also excreted in the urine.
En primer lugar se llevó a cabo un ensayo en el cuál se obtuvieron muestras de orina de individuos sanos que llevaban una dieta normal que contenía gluten (DCG) (n=10). Dado que es esperable que los péptidos del gluten estén en muy bajas First, a trial was carried out in which urine samples were obtained from healthy individuals who had a normal gluten-containing diet (DCG) (n = 10). Since it is expected that gluten peptides are at very low
concentraciones en la orina, consideramos llevar a cabo una etapa de preconcentración que posiblemente también elimine potencial material de interferencia y así se mejoren las posibilidades de detección de GIPs. Los individuos voluntarios fueron divididos en dos grupos, un grupo (n=10) recibió una dieta no estandarizada en urine concentrations, we consider carrying out a preconcentration stage that may also eliminate potential interference material and This improves the chances of GIP detection. Volunteer individuals were divided into two groups, one group (n = 10) received a non-standardized diet in
la que el gluten se consumió diariamente, y otro grupo (n=10), se sometió a DSG durante una semana. Se obtuvo consentimiento escrito de los individuos participantes. Para la realización del estudio se llevó a cabo el siguiente protocolo: which gluten was consumed daily, and another group (n = 10), underwent DSG for a week. Written consent was obtained from the participating individuals. To carry out the study, the following protocol was carried out:
-Dieta: Todos los sujetos participantes en el estudio fueron instruidos para cumplir con la dieta establecida. Así, los que consumieron DCG, recibieron -Diet: All subjects participating in the study were instructed to Comply with the established diet. Thus, those who consumed DCG, received
asesoramiento de la dieta con alimentos con gluten y los de la DSG recibieron instrucciones de los alimentos permitidos. Al final del estudio, el cumplimiento de las condiciones de alimentación se determinó a través de una entrevista estructurada. Diet counseling with gluten-free foods and those of the DSG were instructed on allowed foods. At the end of the study, compliance with the feeding conditions was determined through a structured interview.
-Toma de muestras de orina: Se recogieron las muestras de orina de los sujetos participantes en el estudio en tubos Falcon estériles y posteriormente fueron - Urine sample collection: Urine samples were collected from the subjects participating in the study in sterile Falcon tubes and subsequently were
envasados y almacenados a -20ºC hasta su análisis. Todas las muestras fueron homogeneizadas y alicuotadas en menos de 3 horas después de la micción. packaged and stored at -20ºC until analysis. All samples were homogenized and aliquoted in less than 3 hours after urination.
-Concentración de los péptidos en las muestras de orina: Para concentrar los péptidos y eliminar las impurezas de las muestras de orina recogidas se utilizó la técnica SPE. Los cartuchos de octadecilsilano utilizados se acondicionaron -Concentration of peptides in urine samples: To concentrate the peptides and remove the impurities from the urine samples collected the SPE technique. The octadecylsilane cartridges used were conditioned
previamente con 1 ml de ácido fórmico al 0,1% en 80% de metanol mediante la aplicación de vacío y se desechó el eluyente. Posteriormente, se añadieron 7,5 ml de ácido trifluoroacético (TFA) y después del vacío el eluyente se descartó. Por separado, una mezcla de 5 ml de 50% de orina en TFA se centrifugó 10 min a 2500 g. y los péptidos concentrados de interés se eluyeron con 1 ml de solución tampón PBS previously with 1 ml of 0.1% formic acid in 80% methanol by vacuum application and the eluent was discarded. Subsequently, 7.5 ml of trifluoroacetic acid (TFA) was added and after vacuum the eluent was discarded. Separately, a 5 ml mixture of 50% urine in TFA was centrifuged 10 min at 2500 g. and the concentrated peptides of interest were eluted with 1 ml of PBS buffer solution
compatible con las tiras Glutentox. compatible with Glutentox strips.
Tras concentración de las muestras de orina de todos los voluntarios sanos (n=20) utilizando cartuchos SPE posteriormente, se llevó a cabo la detección de GIPs en las muestras de orina de los individuos incluidos en los dos grupos de dieta diferentes utilizando las tiras inmunocromatográficas Glutentox Sticks (Biomedal S.L., After concentration of urine samples of all healthy volunteers (n = 20) using SPE cartridges later, GIP detection was carried out in the urine samples of the individuals included in the two diet groups different using Glutentox Sticks immunochromatographic strips (Biomedal S.L.,
Sevilla, España). Los péptidos del gluten se detectaron en todas las orinas concentradas de los sujetos en DCG. Sin embargo, en las personas en DSG, no detectamos péptidos tóxicos del gluten en ninguna orina concentrada. Estos resultados indican que la señal fue dependiente de la ingesta de gluten. Sevilla Spain). Gluten peptides were detected in all concentrated urine of subjects in DCG. However, in people on DSG, we do not detect toxic gluten peptides in any concentrated urine. These results indicate that the signal was dependent on gluten intake.
Para correlacionar la concentración de GIPs y la señal de salida de las tiras inmunocromatográficas analizadas, el lector de tiras fue calibrado con un estándar de péptido sintético 33-mer de la -gliadina y con orina de un paciente que llevaba más de 2 años en DSG al cuál se les analizaron los marcadores serológicos para confirmar la estricta adherencia a la dieta. Para verificar la ingesta de gluten negativa de la paciente, se realizó un análisis cualitativo mediante el uso de los anti-GIPs Glutentoxstrips que tienen anticuerpos G12, en concentrados de orina y en heces de acuerdo con el protocolo establecido por Comino et al (2012). Se prepararon una serie de 5 estándares del péptido 33-mer a 3,12; 6,25; 12,5; 25; 50; 75; 100 y 200 ng/ml y se añadió la orina control, recogiéndose el valor de la altura máxima de la línea de las tiras IC que se evaluó con el Lector Glutentox Reader® (Biomedal S.L., Sevilla, España). Se calculó el valor medio en cada estándar, así como su desviación estándar (SD) y la desviación estándar relativa (RSD). Se utilizaron los valores medios para el cálculo de la función de calibración que se ajusta a una función Rodbard (Figura 1). A continuación, la función de calibración se introdujo en el software del lector de IC- banda anti GIP para cuantificar GIPs en muestras de orina. El límite de cuantificación (QL) de la técnica fue establecido en 6,48 ng GIPs / ml de orina. To correlate the concentration of GIPs and the output signal of the immunochromatographic strips analyzed, the stripe reader was calibrated with a 33-mer synthetic peptide standard of -gliadin and with the urine of a patient who had been in the patient for more than 2 years. DSG to which serological markers were analyzed to confirm strict adherence to the diet. To verify the patient's negative gluten intake, a qualitative analysis was carried out using the Glutentoxstrips anti-GIPs that have G12 antibodies, in urine concentrates and in feces according to the protocol established by Comino et al (2012) . A series of 5 standards of the 33-mer peptide at 3.12 were prepared; 6.25; 12.5; 25; fifty; 75; 100 and 200 ng / ml and control urine was added, collecting the value of the maximum line height of the IC strips that was evaluated with the Glutentox Reader® Reader (Biomedal S.L., Seville, Spain). The average value in each standard was calculated, as well as its standard deviation (SD) and relative standard deviation (RSD). The average values were used for the calculation of the calibration function that fits a Rodbard function (Figure 1). Next, the calibration function was introduced in the anti-GIP band IC reader software to quantify GIPs in urine samples. The quantification limit (QL) of the technique was set at 6.48 ng GIPs / ml of urine.
Una vez confirmada la viabilidad del método para la detección del gluten en la orina, se llevó a cabo un ensayo con la finalidad de semicuantificar el nivel de GIPs en las muestras de orina. Para ello se llevó a cabo un ensayo en el que se comprobó por entrevista dietética que el gluten había sido consumido por los individuos sanos participantes en el estudio (n=10, 7 mujeres y 3 hombres, edad media 23-39 años). Los criterios de inclusión comprendieron la ausencia de enfermedades, síntomas digestivos, medicamentos, antibióticos en los últimos dos meses y ausencia de historia familiar de EC. Todos los participantes fueron evaluados para la EC, mostrando niveles de tTG sérica normales y su fenotipo HLA-DQ no fue DQ-2/-8. Los niveles de hemoglobina y el análisis de bioquímico de sangre, incluyendo las pruebas renales y hepáticas, se encontraron incluidas en el rango de los valores normales. Este estudio fue aprobado por el Comité Ético local del “Hospital Virgen de Valme” (Sevilla, España). Se obtuvo consentimiento escrito de los individuos participantes. Se llevó a cabo la toma de muestra de orinas de los individuos que mantenían una dieta normal en la que estaba presente el gluten (pan, pasta, galletas, etc.). La presencia de péptidos derivados del gluten en los extractos concentrados de orina se determinó usando tiras inmunocromatográficas (IC, Glutentox Sticks) basadas en el anticuerpo G12 mediante lectura de la intensidad de la señal con un lector de tiras Glutentox Reader®. Las muestras fueron sumergidas en la solución de dilución propuesta por el Once the viability of the method for the detection of gluten in the urine was confirmed, an assay was carried out in order to semi-quantify the level of GIPs in the urine samples. For this, a trial was carried out in which it was verified by dietary interview that gluten had been consumed by healthy individuals participating in the study (n = 10, 7 women and 3 men, mean age 23-39 years). Inclusion criteria included the absence of diseases, digestive symptoms, medications, antibiotics in the last two months and absence of a family history of CD. All participants were evaluated for CD, showing normal serum tTG levels and their HLA-DQ phenotype was not DQ-2 / -8. Hemoglobin levels and blood biochemistry analysis, including kidney and liver tests, were included in the range of normal values. This study was approved by the local Ethical Committee of the "Virgen de Valme Hospital" (Seville, Spain). Written consent was obtained from the participating individuals. The urine sample was taken from individuals who maintained a normal diet in which gluten was present (bread, pasta, cookies, etc.). The presence of gluten-derived peptides in concentrated urine extracts was determined using immunochromatographic strips (IC, Glutentox Sticks) based on the G12 antibody by reading the signal intensity with a Glutentox Reader® strip reader. The samples were immersed in the dilution solution proposed by the
fabricante. Las tiras inmunocromatográficas se sumergieron en las distintas muestras (300 μl) durante 10 min y se dejaron secar al aire. En este caso, todos los individuos presentaron una excreción de péptidos del gluten en orina con valores por encima de 20 ng/ml. maker. Immunochromatographic strips were immersed in the different samples (300 μl) for 10 min and allowed to air dry. In this case, all individuals presented an excretion of gluten peptides in urine with values above 20 ng / ml
Ejemplo 2. Monitorización de péptidos inmunogénicos derivados del gluten en muestras de orina de individuos durante una dieta controlada de gluten. Example 2. Monitoring of gluten-derived immunogenic peptides in urine samples from individuals during a controlled gluten diet.
En el presente ejemplo se muestra cómo se puede determinar el tiempo de eliminación y aparición del gluten ingerido en muestras de orina utilizando tiras IC basadas en el anticuerpo G12. Para ello, un total de 13 voluntarios sanos (9 mujeres y 4 hombres, edad media 23-65 años) fueron sometidos a diferentes condiciones dietéticas. Se recogieron muestras de orina de dichos individuos que consumían una DCG y fueron sometidos a una dieta sin gluten (DSG) hasta que el nivel de GIPs se hizo indetectable en las muestras de orina. Tras esto, una DCG fue reintroducida y se recogieron nuevamente las muestras de orina. Un total de 3-6 diferentes muestras de orina de cada uno de los individuos se recogieron al día. La Figura 2A muestra un ejemplo representativo de la colección de tiras IC reaccionando con muestras de orina recogidas durante el periodo de estudio de un sujeto sano (AH6). Las cinéticas de excreción de GIPs de 4 de los 13 voluntarios sanos (AH1, AH5, AH8 y AH12) This example shows how the elimination time can be determined and appearance of gluten ingested in urine samples using IC strips based on G12 antibody. For this, a total of 13 healthy volunteers (9 women and 4 men, average age 23-65 years) were subjected to different dietary conditions. Urine samples were collected from said individuals who consumed a DCG and were subjected to a gluten-free diet (DSG) until the level of GIPs became undetectable in the urine samples. After this, a DCG was reintroduced and urine samples were collected again. A total of 3-6 different urine samples from each of the individuals were collected daily. Figure 2A shows a representative example of the IC strip collection reacting with urine samples collected during the study period of a healthy subject (AH6). The kinetics of excretion of GIPs from 4 of the 13 healthy volunteers (AH1, AH5, AH8 and AH12)
analizados, revelan que el gluten consumido se elimina completamente entre las 16-34 horas posteriores al comienzo de la DSG en todos los individuos ensayados (Figura 2B). analyzed, reveal that the gluten consumed is completely eliminated between 16-34 hours after the start of the DSG in all tested individuals (Figure 2B).
Tras la reintroducción del gluten de la dieta se detectaron GIPs en muestras de orina a las 3-9 horas. Las diferencias observadas en la excreción entre individuos podrían relacionarse con la dieta, el tipo de alimentos que contienen gluten, y la variabilidad en la capacidad hidrolítica del sistema digestivo (principalmente enzimas) y las actividades microbianas. En 12 de los 13 individuos sanos en DSG, las cantidades de GIPs en orina estaban por debajo del QL del método. El resto de los pacientes tuvieron una buena adherencia a la DSG inicialmente; sin embargo se After the reintroduction of gluten from the diet, GIPs were detected in urine samples at 3-9 hours. The differences observed in excretion between individuals could be related to diet, the type of foods that contain gluten, and the variability in the hydrolytic capacity of the digestive system (mainly enzymes) and microbial activities. In 12 of the 13 healthy individuals in DSG, the amounts of urine GIPs were below the QL of the method. The rest of the patients had good adherence to the DSG initially; however it
detectó en uno de ellos una señal de 40 ng GIPS /ml orina al tercer día de la prueba, como se muestra en el gráfico del individuo AH12. Al ser entrevistado al final del estudio, este individuo confirmó el consumo involuntario de yogur con cereales (trigo, entre otros) unas horas antes de una de las recogidas de orina. detected in one of them a signal of 40 ng GIPS / ml urine on the third day of the test, as shown in the graph of the individual AH12. When interviewed at the end of the study, this individual confirmed the involuntary consumption of yogurt with cereals (wheat, among others) a few hours before one of the urine collections.
Tras el consumo de gluten se observó una gran variabilidad en la concentración y el tiempo para la excreción de péptidos reactivos de gluten entre individuos. Una vez confirmada la viabilidad del método para la detección del gluten en la orina, estudiamos si existía correlación entre la cantidad de gluten ingerida y la After the consumption of gluten a great variability was observed in the concentration and time for excretion of gluten reactive peptides between individuals Once the viability of the gluten detection method in urine, we studied whether there was a correlation between the amount of gluten ingested and the
cantidad de GIPs medidos en la orina con esta metodología. De acuerdo con recientes revisiones sistemáticas, un consumo diario total de gluten inferior a 10-50 mg de gluten puede causar anormalidades histológicas (Hischenhuber et al, 2006; Catassi et al, 2007; Akobeng y Thomas, 2008; Gibert et al., 2013). Para probar si la metodología anti-GIPs LFT era capaz de detectar un bajo consumo de gluten en muestras de orina, number of GIPs measured in the urine with this methodology. According to recent systematic reviews, a total daily consumption of gluten less than 10-50 mg of gluten can cause histological abnormalities (Hischenhuber et al, 2006; Catassi et al, 2007; Akobeng and Thomas, 2008; Gibert et al., 2013 ). To test if the LFT anti-GIPs methodology was able to detect low gluten consumption in urine samples,
se fijaron unas cantidades de gluten ingerido (10 a 50 mg) que se administraron a cuatro individuos sanos (Figura 3). Un tipo único de gluten se utilizó en todos los casos. A los individuos se les dio una pieza estándar para excluir la variabilidad debida a la administración de gluten de diferentes fuentes. Una microdosis inicial de 10 mg de gluten se administró y el contenido de gluten se midió en muestras de orina recogidas amounts of ingested gluten (10 to 50 mg) were fixed and administered to four healthy individuals (Figure 3). A single type of gluten was used in all cases. Individuals were given a standard piece to exclude variability due to the administration of gluten from different sources. An initial microdose of 10 mg of gluten was administered and the gluten content was measured in urine samples collected
mediante el uso de anti- GIPs LFT. A continuación, se administraron dosis de 25 y 50 mg y también se midieron cantidades GIPs en orina hasta que los péptidos reactivos de gluten se hicieron indetectables. Tras el consumo de cantidad equivalente de alimento a 50 mg de gluten, se detectaron GIPs en orina en todos los individuos analizados y, por lo tanto, el límite de detección (LD) de este método es de 50 mg de by using LFT anti-GIPs. Next, 25 and 50 mg doses were administered and GIPs in urine were also measured until the gluten reactive peptides became undetectable. After the consumption of an equivalent amount of food at 50 mg of gluten, urine GIPs were detected in all the individuals analyzed and, therefore, the detection limit (LD) of this method is 50 mg of
gluten. No obstante, la administración de 25 mg de gluten produjo señales medibles en las tiras IC tras análisis de la orina en 3 de las 4 personas analizadas (AH2, AH4 y AH10), aunque sólo en AH10 la señal fue claramente superior al QL. No hubo señales detectables tras la ingestión de 10 mg en ningún individuo. Las variaciones individuales observadas fueron probablemente debidas a las diferencias individuales gluten. However, the administration of 25 mg of gluten produced measurable signals in the IC strips after urinalysis in 3 of the 4 people tested (AH2, AH4 and AH10), although only in AH10 the signal was clearly superior to QL. There were no detectable signals after ingestion of 10 mg in any individual. The individual variations observed were probably due to individual differences.
de metabolismo y dietas, la microbiota intestinal y las variaciones en el consumo diario de alimentos. of metabolism and diets, intestinal microbiota and variations in daily food consumption.
Ejemplo 3. Monitorización de la adherencia a la dieta sin gluten en muestras de orina de pacientes celiacos. Example 3. Monitoring of adherence to gluten-free diet in urine samples of celiac patients.
En el presente ejemplo se muestra cómo se puede monitorizar la adherencia a la DSG This example shows how the adherence to the DSG can be monitored
de los pacientes celiacos mediante la determinación de péptidos inmunogénicos del gluten en orina por un sistema de detección rápido basado en las tiras IC con el anticuerpo G12 (Glutentox Stick, Biomedal, S.L.). El alto porcentaje de pacientes celiacos con recuperación parcial de la mucosa intestinal, probablemente debido a ingestiones involuntarias, ha generado la necesidad de un marcador no invasivo que of celiac patients by means of the determination of immunogenic peptides of gluten in urine by a rapid detection system based on the IC strips with the G12 antibody (Glutentox Stick, Biomedal, S.L.). The high percentage of celiac patients with partial recovery of the intestinal mucosa, probably due to involuntary ingestion, has generated the need for a non-invasive marker that
permita el seguimiento a corto plazo de la adhesión a la DSG. El paso del gluten por el tracto gastrointestinal da lugar a la hidrólisis de la mayor parte de éste. Para evaluar si allow short-term follow-up of adherence to the DSG. The passage of gluten through the gastrointestinal tract results in the hydrolysis of most of it. To evaluate if
el método era adecuado para el seguimiento de la ingestión de gluten en pacientes celiacos, se realizó un estudio en muestras de orina de 76 individuos sanos (42 adultos y 34 niños) que consumían una DCG, y 58 pacientes celiacos en remisión (27 adultos y 31 niños) que habían sido sometidos a DSG durante gt; 2 años. the method was suitable for monitoring gluten intake in patients Celiac patients, a study was conducted on urine samples from 76 healthy individuals (42 adults and 34 children) who consumed a DCG, and 58 celiac patients in remission (27 adults and 31 children) who had undergone DSG during gt; 2 years.
Las muestras de orina de los individuos sanos tras el consumo de un dieta con gluten presentaron, en todos los casos, niveles de GIPs por encima del LQ del método (76 de 76, 100 % positivos en GIPs en la orina). El rango de valores de GIPs en orina de individuos sanos varió, siendo en adultos de 6,54 a 604 ng/ml orina y en niños de 6,48 a 369 ng ml orina, es decir, entre 57 y 93 veces por encima del LQ del método, lo Urine samples from healthy individuals after eating a gluten diet presented, in all cases, levels of GIPs above the LQ of the method (76 of 76, 100% positive in GIPs in the urine). The range of values of GIPs in urine of healthy individuals varied, being in adults from 6.54 to 604 ng / ml urine and in children from 6.48 to 369 ng ml urine, that is, between 57 and 93 times above the LQ of the method, what
que sugiere que la excreción de los péptidos del gluten está fuertemente afectada por la dieta, el tipo de alimentos que contienen gluten, y/o características individuales tales como la microflora intestinal. Cuando se realizó el ensayo en la orina de los pacientes celiacos, el nivel de GIPs en la orina estuvo por debajo del LQ del método sólo en el 41 % de los adultos y en el 55 % de los niños con EC en remisión clínica. En el resto which suggests that the excretion of gluten peptides is strongly affected by diet, the type of foods that contain gluten, and / or individual characteristics such as intestinal microflora. When the test was conducted in the urine of celiac patients, the level of GIPs in the urine was below the LQ of the method in only 41% of adults and in 55% of children with CD in clinical remission. In the rest
de los individuos celiacos se observó un claro incumplimiento de la DSG, oscilando el contenido en GIPs entre 4,5 y 12 veces por encima del LQ (6,48-78,12 y de 6,48-29,69 ng GIPs/ml de orina, adultos y niños, respectivamente). of the celiac individuals a clear breach of the DSG was observed, oscillating the content in GIPs between 4.5 and 12 times above the LQ (6.48-78.12 and 6.48-29.69 ng GIPs / ml of urine, adults and children, respectively).
Ejemplo 4. Seguimiento de la dieta sin gluten en muestras de orina recogidas durante 24 horas en individuos sometidos a dietas con o sin gluten. Example 4. Follow-up of the gluten-free diet in urine samples collected during 24 hours in individuals subjected to diets with or without gluten.
En el presente ejemplo se muestra cómo se puede realizar el seguimiento de la DSG en muestras de todas las orinas recogidas durante un día utilizando un sistema de lectura inmunocromatográfico con anticuerpos anti-GIPs. Las sustancias eliminadas por el riñón no se excretan a la misma velocidad o en las mismas cantidades durante diferentes períodos del día y de la noche; en condiciones normales de excreción la This example shows how the DSG can be monitored in samples of all the urine collected during one day using an immunochromatographic reading system with anti-GIP antibodies. The substances eliminated by the kidney are not excreted at the same rate or in the same amounts during different periods of the day and night; under normal conditions of excretion the
eliminación de orina es menor durante la noche que durante el día. Por lo tanto, una muestra de orina al azar podría no generar una imagen integrada de posibles ingestiones puntuales de gluten que tienen lugar durante un día. El análisis de muestras de orina de 24 horas, además de los estudios serológicos, ha sido utilizada por lo general para obtener datos relevantes en muchos trastornos. Urine removal is lower during the night than during the day. Therefore, a random urine sample may not generate an integrated image of possible specific gluten intakes that take place during a day. 24-hour urine sample analysis, in addition to serological studies, has generally been used to obtain relevant data in many disorders.
Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue determinar la capacidad de esta técnica para medir los péptidos derivados del gluten en orina de 24 horas como indicador de la adherencia de la DSG en pacientes celiacos. Para ello, 3 individuos sanos que seguían una DCG y 1 paciente celiaco en remisión con DSG gt; 2 años participaron en el estudio. Se recogieron separadamente todas las muestras de orina Therefore, the objective of this study was to determine the ability of this technique to measure peptides derived from gluten in urine for 24 hours as an indicator of the adherence of DSG in celiac patients. For this, 3 healthy individuals who followed a DCG and 1 celiac patient in remission with gt DSG; 2 years participated in the study. All urine samples were collected separately
excretadas durante 24 horas de 4 participantes adultos. Cada muestra de orina se excreted for 24 hours from 4 adult participants. Each urine sample is
analizó separadamente para determinar su contenido de gluten y, a continuación, se confinaron todas las muestras de orina en un recipiente único. La detección y cuantificación de GIPs por tiras IC se realizó en las 4 muestras de 24 horas. Los 3 sujetos sanos mostraron niveles de GIPs en las muestras de orina individuales así como en la muestra de 24 horas, oscilando el nivel de los péptidos de gluten desde 12,4 hasta 87,6 ng/ml. Sin embargo, las muestras de orina del paciente celíaco estuvieron por debajo del QL del método así como la muestra de 24 horas. Las medidas de GIPs obtenidas en muestras de orina discontinuas fueron muy similares a las obtenidas en las orinas completas 24 horas. Por lo tanto, los resultados indicaron analyzed separately to determine its gluten content and then They confined all urine samples in a single container. Detection and Quantification of GIPs by IC strips was performed on the 4 24-hour samples. The 3 healthy subjects showed levels of GIPs in individual urine samples as well as in the 24-hour sample, the level of gluten peptides ranging from 12.4 to 87.6 ng / ml. However, the urine samples of the celiac patient were below the QL of the method as well as the 24-hour sample. The measurements of GIPs obtained in discontinuous urine samples were very similar to those obtained in complete urine 24 hours. Therefore, the results indicated
que la medida de gluten en orina de 24 horas proporciona información valiosa sobre el valor promedio del metabolismo y la excreción de gluten consumidos por un día completo en un individuo. The 24-hour urine gluten measurement provides valuable information on the average value of metabolism and excretion of gluten consumed for a full day in an individual.
Ejemplo 5. Seguimiento de la dieta sin gluten en muestras de orina mediante un Example 5. Follow-up of the gluten-free diet in urine samples by means of a
biosensor. biosensor
El presente ejemplo muestra cómo es posible la determinación de la cantidad de GIPs en orina mediante la utilización de un biosensor. Es una técnica de detección selectiva y cuantitativa de los péptidos derivados del gluten de forma directa, sin necesidad de marcadores. Para ello, sobre una matriz hidrófoba de 100 nm con un 2% de dextrano se inmoviliza un anticuerpo anti-GIPs. El tampón en el cual se diluye el anticuerpo The present example shows how it is possible to determine the amount of GIPs in urine by using a biosensor. It is a technique of selective and quantitative detection of gluten-derived peptides directly, without the need for markers. For this, an anti-GIP antibody is immobilized on a 100 nm hydrophobic matrix with 2% dextran. The buffer in which the antibody is diluted
debe favorecer la interacción electrostática entre éste y la matriz de dextrano de forma que se facilite la formación de enlaces. En medio acuoso, el pKa de los grupos de la matriz es aproximadamente 4. Las concentraciones de anticuerpo para la inmovilización oscilan entre 30 y 130 μM, aunque dependen del anti-GIPs utilizado. Esta inmovilización genera una señal de resonancia que se recoge en el detector y se should favor the electrostatic interaction between it and the dextran matrix so as to facilitate the formation of bonds. In aqueous medium, the pKa of the matrix groups is approximately 4. Antibody concentrations for immobilization range from 30 to 130 μM, although they depend on the anti-GIPs used. This immobilization generates a resonance signal that is collected in the detector and
denomina señal basal. A continuación, se conduce la orina por encima del chip sensor en estudio. Si ésta contiene GIPs, se genera en el detector un cambio de señal, que es una respuesta directamente proporcional a la interacción entre los GIPs y el anticuerpo. Finalmente, se lava la superficie para eliminar los restos de orina, permaneciendo el anti-GIPs unido. De este modo la superficie está preparada para un called basal signal. Next, urine is conducted over the sensor chip under study. If it contains GIPs, a signal change is generated in the detector, which is a response directly proportional to the interaction between the GIPs and the antibody. Finally, the surface is washed to remove the remains of urine, the anti-GIPs remaining attached. In this way the surface is prepared for a
nuevo ensayo. new essay
Ejemplo 6. Seguimiento de la dieta sin gluten en muestras de orina mediante un sistema de partículas paramagnéticas y quimioluminiscencia. Example 6. Follow-up of the gluten-free diet in urine samples by means of a paramagnetic particle system and chemiluminescence.
El presente ejemplo muestra cómo se puede determinar la presencia de péptidos del gluten en orina usando una partícula recubierta con anticuerpos anti GIPs. Se inmoviliza un anticuerpo frente a péptido inmunogénico del gluten, el G12, en The present example shows how the presence of gluten peptides in urine can be determined using a particle coated with anti GIP antibodies. An antibody against the immunogenic gluten peptide, G12, is immobilized in
partículas magnéticas de 0,2 micras magnéticas. Alrededor de 0,1 mL de partículas 0.2 micron magnetic particles magnetic. About 0.1 mL of particles
magnéticas con una concentración de al menos 107 partículas/mL se ponen en Magnetic with a concentration of at least 107 particles / mL are put in
contacto con 2 mL de orina para capturar los péptidos que pudiesen estar presentes contact with 2 mL of urine to capture peptides that may be present
en un eppendorf. Se realiza el procedimiento de unión y lavado de las partículas a las in an eppendorf. The procedure of joining and washing the particles to the
5 paredes del tubo por los procedimientos ya habituales para los técnicos en la materia 5 tube walls by the usual procedures for those skilled in the art
usando un imán adaptado al tubo (Life Technologies, Miltenji, Sepmag). Se usa un using a magnet adapted to the tube (Life Technologies, Miltenji, Sepmag). A
anticuerpo anti-GIP conjugado a peroxidasa que se debe unir solo a las partículas que peroxidase-conjugated anti-GIP antibody that should bind only to the particles that
hayan capturado un GIP con dos epítopos. Tras los lavados usando la unión y have captured a GIP with two epitopes. After washing using the joint and
desunión a las paredes del tubo dependiente del imán, se revela con luminol y se usa 10 un luminómetro para cuantificar la señal. La señal por encima del control negativo de disunity to the walls of the magnet-dependent tube, is revealed with luminol and a luminometer is used to quantify the signal. The signal above the negative control of
la muestra sin GIPs, indicaría la presencia de péptidos del gluten. The sample without GIPs would indicate the presence of gluten peptides.
25 25
Claims (20)
- --
- Un patrón estándar de las reivindicaciones 6 y 7, A standard pattern of claims 6 and 7,
- --
- Un anticuerpo reactivo contra los péptidos de la reivindicación 1. An antibody reactive against the peptides of claim 1.
- --
- Una columna de extracción de los péptidos en fase sólida, A solid phase peptide extraction column,
- --
- Un patrón estándar de las reivindicaciones 6 y 7 A standard pattern of claims 6 and 7
- --
- Una solución de reacción, A reaction solution,
- --
- un anticuerpo de la reivindicación 1 o 2. an antibody of claim 1 or 2.
- Categoría Category
- 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas 56 Documents cited Claims Affected
- X X
- ES 2385455 A1 (UNIVERSIDAD DE SEVILLA) 25.07.2012, todo el documento. 1-17 EN 2385455 A1 (UNIVERSITY OF SEVILLA) 25.07.2012, the whole document. 1-17
- X X
- WO 2004045392 A2 (THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY [US/US]) 03.06.2004, página 4, párrafo 17 – página 5, párrafo 20; página 14, párrafo 51; reivindicaciones 10-13,19,20. 1,2,4 WO 2004045392 A2 (THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY [US / US]) 03.06.2004, page 4, paragraph 17 - page 5, paragraph 20; page 14, paragraph 51; claims 10-13,19,20. 1,2,4
- A TO
- SHAN L. et al. Structural Basis for Gluten Intolerance in Celiac Sprue. Science. 2002. Vol. 297, páginas 2275-2279, todo el documento. 1-17 SHAN L. et al. Structural Basis for Gluten Intolerance in Celiac Sprue. Science 2002. Vol. 297, pages 2275-2279, the whole document. 1-17
- A TO
- MORÓN B. et al. Toward the assessment of food toxicity for celiac patients: characterization of monoclonal antibodies to a main immunogenic gluten peptide. PLoS One. 2008. Vol. 3(5) e:2294, página 1, resumen. 1-17 MORÓN B. et al. Toward the assessment of food toxicity for celiac patients: characterization of monoclonal antibodies to a main immunogenic gluten peptide. PLoS One. 2008. Vol. 3 (5) e: 2294, page 1, summary. 1-17
- Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the date of priority submission of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application
- El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº: This report has been prepared • for all claims □ for claims no:
- Fecha de realización del informe 30.11.2015 Date of realization of the report 30.11.2015
- Examinador M. D. García Grávalos Página 1/5 Examiner M. D. García Grávalos Page 1/5
- Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-17 SI NO Claims Claims 1-17 IF NOT
- Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Inventive activity (Art. 8.1 LP11 / 1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-17 SI NO Claims Claims 1-17 IF NOT
- Documento Document
- Número Publicación o Identificación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date
- D01 D01
- ES 2385455 A1 25.07.2012 ES 2385455 A1 25.07.2012
- D02 D02
- WO 2004045392 A2 03.06.2004 WO 2004045392 A2 03.06.2004
- D03 D03
- SHAN L. et al. Science. 2002. Vol.297, páginas 2275-2279. 2002 SHAN L. et al. Science 2002. Vol. 297, pages 2275-2279. 2002
- D04 D04
- MORÓN B. et al. PLoS One. 2008. Vol. 3(5) e:2294. 2008 MORÓN B. et al. PLoS One. 2008. Vol. 3 (5) e: 2294. 2008
Priority Applications (13)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES201400569A ES2556177B1 (en) | 2014-07-09 | 2014-07-09 | Detection of gluten peptides in human fluids |
CA2954527A CA2954527C (en) | 2014-07-09 | 2015-07-09 | Detecting gluten peptides in human fluids |
US15/324,454 US20170160288A1 (en) | 2014-07-09 | 2015-07-09 | Detecting gluten peptides in human fluids |
PCT/ES2015/070536 WO2016005643A1 (en) | 2014-07-09 | 2015-07-09 | Detecting gluten peptides in human fluids |
RU2017104158A RU2690665C2 (en) | 2014-07-09 | 2015-07-09 | Detection of gluten peptides in human body fluids |
PL15757309T PL3168617T3 (en) | 2014-07-09 | 2015-07-09 | Detecting gluten peptides in human fluids |
AU2015287510A AU2015287510B2 (en) | 2014-07-09 | 2015-07-09 | Detecting gluten peptides in human fluids |
BR112017000238-8A BR112017000238A2 (en) | 2014-07-09 | 2015-07-09 | in vitro procedure for detection and / or quantification of gluten ingested by a human and gluten detection kit in biological fluids and use of said kit |
DK15757309.8T DK3168617T3 (en) | 2014-07-09 | 2015-07-09 | DETECTION OF GLUTENE Peptides IN HUMAN LIQUIDS |
EP15757309.8A EP3168617B1 (en) | 2014-07-09 | 2015-07-09 | Detecting gluten peptides in human fluids |
ES15757309T ES2775580T3 (en) | 2014-07-09 | 2015-07-09 | Detection of gluten peptides in human fluids |
PT157573098T PT3168617T (en) | 2014-07-09 | 2015-07-09 | Detecting gluten peptides in human fluids |
US16/370,287 US20190376982A1 (en) | 2014-07-09 | 2019-03-29 | Detecting Gluten Peptides in Human Fluids |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES201400569A ES2556177B1 (en) | 2014-07-09 | 2014-07-09 | Detection of gluten peptides in human fluids |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2556177A1 ES2556177A1 (en) | 2016-01-13 |
ES2556177B1 true ES2556177B1 (en) | 2016-10-20 |
Family
ID=54035268
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES201400569A Active ES2556177B1 (en) | 2014-07-09 | 2014-07-09 | Detection of gluten peptides in human fluids |
ES15757309T Active ES2775580T3 (en) | 2014-07-09 | 2015-07-09 | Detection of gluten peptides in human fluids |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES15757309T Active ES2775580T3 (en) | 2014-07-09 | 2015-07-09 | Detection of gluten peptides in human fluids |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20170160288A1 (en) |
EP (1) | EP3168617B1 (en) |
AU (1) | AU2015287510B2 (en) |
BR (1) | BR112017000238A2 (en) |
CA (1) | CA2954527C (en) |
DK (1) | DK3168617T3 (en) |
ES (2) | ES2556177B1 (en) |
PL (1) | PL3168617T3 (en) |
PT (1) | PT3168617T (en) |
RU (1) | RU2690665C2 (en) |
WO (1) | WO2016005643A1 (en) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK1563300T3 (en) * | 2002-11-20 | 2012-07-23 | Univ Leland Stanford Junior | Diagnostic procedure for celiac disease |
WO2009139887A2 (en) * | 2008-05-16 | 2009-11-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Non-inflammatory gluten peptide analogues as biomarkers for celiac sprue |
ES2385455B2 (en) * | 2010-12-28 | 2013-09-25 | Universidad De Sevilla | DETERMINATION OF LEVELS OF IMMUNOGENIC PEPTIDES OF GLUTEN IN HUMAN SAMPLES. |
WO2013098441A1 (en) * | 2011-12-29 | 2013-07-04 | Universidad De Sevilla | Determination of immunogenic gluten peptides in human samples |
-
2014
- 2014-07-09 ES ES201400569A patent/ES2556177B1/en active Active
-
2015
- 2015-07-09 WO PCT/ES2015/070536 patent/WO2016005643A1/en active Application Filing
- 2015-07-09 DK DK15757309.8T patent/DK3168617T3/en active
- 2015-07-09 ES ES15757309T patent/ES2775580T3/en active Active
- 2015-07-09 RU RU2017104158A patent/RU2690665C2/en active
- 2015-07-09 CA CA2954527A patent/CA2954527C/en active Active
- 2015-07-09 PT PT157573098T patent/PT3168617T/en unknown
- 2015-07-09 BR BR112017000238-8A patent/BR112017000238A2/en not_active Application Discontinuation
- 2015-07-09 US US15/324,454 patent/US20170160288A1/en not_active Abandoned
- 2015-07-09 PL PL15757309T patent/PL3168617T3/en unknown
- 2015-07-09 EP EP15757309.8A patent/EP3168617B1/en active Active
- 2015-07-09 AU AU2015287510A patent/AU2015287510B2/en active Active
-
2019
- 2019-03-29 US US16/370,287 patent/US20190376982A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PL3168617T3 (en) | 2020-06-01 |
EP3168617B1 (en) | 2019-12-04 |
RU2690665C2 (en) | 2019-06-05 |
ES2556177A1 (en) | 2016-01-13 |
DK3168617T3 (en) | 2020-02-24 |
EP3168617A1 (en) | 2017-05-17 |
CA2954527A1 (en) | 2016-01-14 |
AU2015287510B2 (en) | 2021-03-25 |
AU2015287510A1 (en) | 2017-02-16 |
ES2775580T3 (en) | 2020-07-27 |
PT3168617T (en) | 2020-03-03 |
WO2016005643A1 (en) | 2016-01-14 |
CA2954527C (en) | 2022-10-18 |
BR112017000238A2 (en) | 2018-07-03 |
US20190376982A1 (en) | 2019-12-12 |
US20170160288A1 (en) | 2017-06-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Leonard et al. | Evaluating responses to gluten challenge: a randomized, double-blind, 2-dose gluten challenge trial | |
Green et al. | Celiac disease | |
Pinier et al. | The copolymer P (HEMA-co-SS) binds gluten and reduces immune response in gluten-sensitized mice and human tissues | |
RU2519646C2 (en) | Methods and products for diagnostics of autoimmune diseases and gastric cancer, associated with atrophic gastritis | |
Hart et al. | Diagnosis of exocrine pancreatic insufficiency | |
CN105917229B (en) | The method and composition of diagnosis and prognosis for injury of kidney and kidney failure | |
ES2715181T3 (en) | Determination of immunogenic gluten peptide levels in human samples | |
Wessels et al. | Review on pediatric coeliac disease from a clinical perspective | |
WO2011000773A1 (en) | Testing efficacy for celiac disease | |
ES2556177B1 (en) | Detection of gluten peptides in human fluids | |
Krause et al. | Diagnosis and management of laryngopharyngeal reflux | |
WO2013098441A1 (en) | Determination of immunogenic gluten peptides in human samples | |
Yoosuf et al. | Non-dietary therapies for celiac disease | |
US10466238B2 (en) | Determination of levels of immunogenic gluten peptides in human samples | |
Di Sabatino et al. | The spectrum of gluten-related disorders | |
Heikkilä et al. | Associations of tissue transglutaminase antibody seropositivity with coronary heart disease: findings from a prospective cohort study | |
Gilde | Effect of gluten and FODMAP elimination in celiac patients on gut inflammatory biomarkers | |
Alhabbal et al. | The hidden danger in Syria: Silent Celiac Disease | |
Eldredge | Bile Reflux Post-Bariatric Surgery | |
WO2014184435A1 (en) | Cysteine or a derivative thereof for the treatment of atrophic gastritis | |
Muñoz | Exocrine Pancreatic Function Tests | |
Banach | A questionnaire based analysis of celiac disease diagnosis: Identifying the common diagnostic indicators of celiac disease and the healthcare professions that may benefit from additional training |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC2A | Transfer of patent |
Owner name: UNIVERSIDAD DE SEVILLA ( 50%) Effective date: 20150817 |
|
FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2556177 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20161020 |