ES2553597T3 - Un anticuerpo monoclonal anti-Tat del VIH-1 - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal que es obtenido u obtenible de la línea de hibridoma depositada el 29 de septiembre de 2011 en el CNCM bajo el número de registro I-4535.
Description
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DESCRIPCIÓN
Un anticuerpo monoclonal anti-Tat del VIH-1
La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal (mAb; del inglés, monoclonal Antibody) neutralizante contra la proteína extracelular "transactivador de la transcripción" (Tat; del inglés, trans-activator of transcription) del VIH-1.
Antecedentes técnicos
El tratamiento antiviral HAART (terapia antirretroviral muy activa; del inglés, highly active antiretroviral therapy) contra el VIH-1 se centra principalmente en la transcriptasa inversa y la proteasa, pero el HAART no erradica los virus en el ser humano ni siquiera con la nueva clase de agentes antivirales que se dirigen a la integrasa. Estudios de inmunización pasiva han demostrado el papel protector de los anticuerpos monoclonales (mAb) en el reto del virus de la inmunodeficiencia de seres humanos y simios (SHIV; del inglés, simian-human immunodeficiency virus)
(R. M. Ruprecht, Methods Mol. Biol. 2009, 525: 559-66). En todos estos estudios se han empleado anticuerpos que se dirigen a la proteína Env del VIH-1 pero que no resultaron eficaces en pacientes humanos (W. Chen y D. S. Dimitrov, AIDS Res. Hum. Retroviruses 2011). Entre otras posibles dianas proteicas del VIH-1, Tat parece la más atractiva a causa de sus funciones extracelulares (G. R. Campbell y E. P. Loret, Retrovirology 2009, 6: 50-62).
La proteína transactivador de la transcripción (Tat) del VIH-1 tiene diferentes funciones en el VIH-1. El Tat aumenta la transcripción de genes del VIH-1 en células infectadas, mientras que el Tat extracelular puede atravesar membranas y desencadena la apoptosis mitocondrial de células inmunes que deberían eliminar el virus (G. R. Campbell y E. P. Loret, Retrovirology 2009, 6: 50-62).
También se ha mostrado que Tat modula la propagación del VIH a causa de su interacción con la glicoproteína gp120 en la superficie celular (S. Marchio et al., Blood 2005, 105: 2802-11).
En los años 80 se identificó una variante de Tat, llamada Tat Oyi, de un individuo seropositivo en una zona remota de Gabón, individuo que no desarrolló el sida. Se clonó el VIH-1 Oyi y resultó que tiene genes similares a los de las cepas habituales del VIH-1 salvo el gen tat, que tiene mutaciones nunca halladas en otras variantes de Tat (C. J. Gregoire y E. P. Loret, J. Biol. Chem. 1996, 271: 22.641-6). La inmunización de conejos con Tat Oyi generó anticuerpos capaces de reconocer variantes de Tat de los cinco subtipos principales del VIH-1 (S. Opi et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35.915-9). En el Documento WO 2006/088740 se describe un anticuerpo monoclonal contra un epítopo lineal de la proteína Tat del VIH-1. Al epítopo se hace referencia como panepítopo.
Existe la necesidad de un anticuerpo monoclonal (mAb) claramente neutralizante contra Tat, con potencial terapéutico.
Sumario de la invención
Es importante la obtención de un mAb claramente neutralizante contra Tat, con potencial terapéutico contra el VIH-1. La invención proporciona dicho mAb, denominado 7G12, que reconoce al menos cinco subtipos del Tat extracelular del VIH-1 (A, B, C, D y E). Este mAb, o un fragmento del mismo, podría ser particularmente útil como una herramienta terapéutica o para determinar la cantidad de proteína Tat en una muestra de un paciente infectado con un VIH-1.
Por lo tanto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal (de clase IgG1) obtenido de la línea de hibridoma depositada el 29 de septiembre de 2011 en el CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75015 Paris), bajo el número de registro I-4535.
Queda abarcado todo anticuerpo que comprenda el fragmento Fab del anticuerpo 7G12, particularmente los fragmentos que conservan la actividad neutralizante contra el Tat extracelular del VIH-1.
La descripción proporciona además un anticuerpo monoclonal que es sustancialmente idéntico a, preferiblemente que muestra una secuencia de aminoácidos que muestra más de un 80%, preferiblemente más de un 85%, aún preferiblemente más de un 90%, y aún preferiblemente más de un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de, el anticuerpo 7G12.
Lo más preferiblemente, los anticuerpos de la invención presentan una actividad neutralizante contra el Tat extracelular del VIH-1.
Otro sujeto de la invención es la línea de hibridoma depositada el 29 de septiembre de 2011 en el CNCM bajo el número de registro I-4535.
La descripción proporciona además una línea celular que deriva de, o es una progenie de, la anterior línea de
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hibridoma y es aún capaz de producir un anticuerpo monoclonal (mAb) neutralizante contra la proteína extracelular transactivador de la transcripción (Tat) del VIH-1.
La invención proporciona además un método para detectar o determinar la cantidad de una proteína Tat extracelular en una muestra de un paciente infectado con el VIH, poniendo la muestra en contacto con un anticuerpo de la invención.
Se proporciona además una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica es particularmente útil como un tratamiento terapéutico contra una infección por el VIH1, en donde la infección por el VIH-1 puede ser de cualquier subtipo del VIH-1.
La invención también proporciona un método para obtener el anticuerpo monoclonal de la Reivindicación 1, método que comprende las operaciones siguientes: a) cultivar y multiplicar el hibridoma I-4535 bajo unas condiciones adecuadas que den lugar a la expresión del anticuerpo 7G12, y b) aislar y purificar dicho anticuerpo del sobrenadante de cultivo producido en la operación (a).
Se describe además un método in vitro o in vivo para la inhibición de la replicación viral del VIH-1 en células de mamífero, método que comprende poner las células en contacto con el anticuerpo como se define en esta memoria.
Leyendas de las figuras
La Figura 1 muestra una comparación de secuencias de Tat Oyi y variantes de Tat representativas de los cinco subtipos principales del VIH-1 (en gris, identidades). La secuencia de Oyi C22 se muestra como ID. SEC. nº 1, la secuencia HxB2 se muestra como ID. SEC. nº 2, la secuencia Ug11RP se muestra como ID. SEC. nº 3, la secuencia ELI se muestra como ID. SEC. nº 4, la secuencia CM2 40 se muestra como ID. SEC. nº 5, y la secuencia 96BW se muestra como ID. SEC. nº 6.
Las Figuras 2A y 2B son gráficos que muestran que el mAb 7G12 reconoce cruzadamente variantes de Tat heterógonas. Se obtuvieron curvas de afinidad de los mAbs (A) 7G12 y (B) 27A8 frente a diferentes variantes de Tat: Oyi (cuadrado blanco), HxB2 (rombo blanco), UG11RP (triángulo blanco), Eli (cuadrado negro), CM240 (rombo negro) y 96Bw (triángulo negro). B/B0 corresponde a la densidad óptica (OD; del inglés, optical density) medida para cada dilución de Tat, dividida por la OD máxima. La desviación estándar (SD; del inglés, standard deviation) medida es < 0,02(n = 4).
Las Figuras 3A y 3B son gráficos que muestran que el mAb 7G12 reconoce un epítopo 3D. Se midieron en un ELISA las afinidades (media ± SD, n ≥ 3) de los mAbs 7G12 y 27A8 (1/1000) por (A) los péptidos 1 a 5 (p1 a p5) que se solapan con la secuencia de Tat Oyi (barras grises) y (B) Tat Oyi (barras negras) y Tat HxB2 (barras blancas) plegadas o desnaturalizadas o una colección de péptidos (barras grises). En los gráficos de barras, las diferencias estadísticas significativas (P < 0,01) entre Tats plegadas y proteínas o péptidos desnaturalizados se indican mediante (*). La Figura 3C es una transferencia Western. El reconocimiento de Tat Oyi por los mAbs 7G12 y 27A8 (1/5000) se llevó a cabo después de un análisis por transferencia Western. Se muestra un ensayo representativo de tres experimentos.
Las Figuras 4A a 4D son gráficos que muestran que el mAb 7G12 neutraliza actividades biológicas de Tat Oyi. La proporción de transactivación (media ± SD, n ≥ 3) se midió sobre células HeLa P4 con (A) Tat Oyi 0,5 µM en presencia de diferentes concentraciones del mAb 7G12 (barras negras) y con (B) Tat Oyi 0,5 µM plegada (f; del inglés, folded) o desnaturalizada (d) o una mezcla de ambas (f + d) en presencia de 50 µg del mAb 7G12. Se compararon las proliferaciones de células Jurkat (media ± SD, n ≥ 3) sin Tat (Testigo, barras de color gris oscuro) con ensayos (C) en presencia de diferentes concentraciones de Tat Oyi o (D) en presencia de Tat Oyi 5 µM y de diferentes concentraciones del mAb 7G12 (barras negras). En los gráficos de barras, las diferencias estadísticas significativas (P < 0,05) se indican mediante (*).
Las Figuras 5A y 5B son gráficos que muestran que el mAb 7G12 también neutraliza cruzadamente actividades biológicas de otras variantes de Tat. Se compararon (A) las proporciones de transactivación (media ± SD, n = 3) de diversas variantes de Tat (0,5 µM) en ausencia (barras grises) o presencia del mAb 7G12 (50 µg, barras negras) o 27A8 (50 µg, barras blancas) en células HeLa P4. Se compararon (B) las proliferaciones de células Jurkat (media ± SD, n = 3) sin Tat (Testigo, barras de color gris oscuro) con ensayos con diversas variantes de Tat 5 µM en ausencia (barras grises) o presencia del mAb 7G12 (20 µg, barras negras) o 27A8 (20 µg, barras blancas). En los gráficos de barras, las diferencias estadísticas significativas (P < 0,05) se indican mediante (*).
Descripción detallada de la invención
Los inventores utilizaron la propiedad inmunogénica de la proteína Tat Oyi para obtener un mAb claramente
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Formulaciones
Por lo tanto, otro objeto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo como ingrediente activo, en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
En la presente descripción, se debe entender que "excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un compuesto
o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica y no causan reacciones secundarias y que, por ejemplo, facilitan la administración del (de los) ingrediente(s) activo(s), aumentan la semivida y/o la eficacia de los mismos en el cuerpo, aumentan la solubilidad de los mismos en disolución o, si no, mejoran el almacenamiento de los mismos.
Estos excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y serán adaptados por quien tiene experiencia en la técnica de acuerdo con la naturaleza y el método de administración escogidos.
Son excipientes adecuados, por ejemplo, el agua, la disolución salina, la dextrosa, el glicerol, el etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsivos o agentes reguladores del pH.
De este modo, el anticuerpo puede ser obtenido en forma purificada, es decir, en una forma que presenta un grado de pureza de al menos 80%, 85%, 90%, 95% o más. El grado de pureza se define con respecto a las demás proteínas presentes en la mezcla, que se considera que son contaminantes. Este grado se evalúa por colorimetría de un SDS-PAGE usando azul de Coomassie. La medición densitométrica de las bandas hace posible cuantificar el grado de pureza. El grado de pureza puede ser también medido por HPLC en fase inversa, midiendo el área de los diferentes picos.
Preferiblemente, la formulación se almacena en forma líquida o en forma liofilizada.
Se pueden emplear compuestos reguladores del pH, por ejemplo, en forma de carbonato, fosfato, citrato, acetato, borato, trimetamina [(2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol), TRIS], glicocola y lisina [PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, volumen 51 (4), 1997: "Excipients and their use in injectable products" (SANDEEP NEMA, R. J. WASHKUHN y R. J. BRENDEL, páginas 166-171)].
También es ventajosa la adición de un agente tensioactivo del tipo polímero no iónico, tal como polisorbato 80 (Tween® 80), o un poloxámero del tipo poloxámero 188 (Pluronic F68® o Lutrol F68®).
En un modo preferido, la composición farmacéutica comprende de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 5 g/l de anticuerpo, preferiblemente alrededor de 0,3 g/l de anticuerpo.
Preferiblemente, el anticuerpo se administra por la vía sistémica, en particular por la vía intravenosa, la vía intramuscular, la vía intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, o por la vía oral. Más preferiblemente, la composición que comprende los anticuerpos de la invención se proporciona en varias administraciones distribuidas a lo largo del tiempo.
Los anticuerpos pueden ser convencionalmente administrados parenteralmente, por inyección, por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en ciertos casos, formulaciones orales.
Los supositorios pueden incluir agentes aglutinantes y vehículos tradicionales, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; dicho supositorios pueden ser formados a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en una cantidad en el intervalo de 0,5% a 10%, preferiblemente 1-2%. Las formulaciones orales incluyen dichos excipientes normalmente empleados, tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones tienen la forma de disoluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación ininterrumpida o polvos y contienen 10-95% de ingrediente activo, preferiblemente 25-70%.
En muchos casos será deseable tener administraciones múltiples del anticuerpo.
En general, cada dosis puede comprender entre aproximadamente 5 µg y aproximadamente 1 mg del anticuerpo, preferiblemente entre 10 y 200 µg. Quien tiene experiencia en la técnica puede también considerar otros intervalos de dosis.
Indicaciones terapéuticas
La presente invención también pretende cubrir las composiciones farmacéuticas para uso como un producto medicinal, en particular para uso en el tratamiento de una infección por el VIH.
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Los anticuerpos de la invención son anticuerpos neutralizantes con respecto a cualquier subtipo del VIH-1, en particular con respecto a 2, 3, 4 o más subtipos del VIH-1.
En particular, inhiben la actividad inducida de transactivación y apoptosis de Tat Oyi.
En una realización preferida, los anticuerpos de la invención inhiben la transactivación de Tat de dos, tres, cuatro, cinco o más subtipos del VIH-1 seleccionados de entre Oyi, A, B, C, D, E, F, G, H, J y K.
Lo más preferiblemente, los anticuerpos de la invención inhiben la transactivación de Tat de cinco subtipos del VIH-1 (además de Oyi), preferiblemente A, B, C, D y E.
De este modo, la presente invención proporciona un método para tratar una infección por VIH en un paciente, método que comprende administrar un anticuerpo de la invención al paciente.
Los anticuerpos descritos en esta memoria son candidatos valiosos para desarrollar un tratamiento para un gran número de, o incluso todos, los individuos infectados por el VIH.
Los anticuerpos pueden ser utilizados en una composición farmacéutica para la inmunización pasiva de pacientes infectados por el VIH, solos o en combinación con otros mAbs, por ejemplo, anticuerpos anti-gp120. Los anticuerpos de la invención son ventajosamente combinados con una terapia antirretroviral en la que se usan inhibidores de la polimerasa del VIH y/o de la integrasa del VIH.
Se reconoce un efecto terapéutico si los pacientes seropositivos que no reciben tratamiento antiviral presentan una menor viremia y un aumento de linfocitos CD4. Por ejemplo, se reconoce un efecto terapéutico cuando el 30% de una cohorte de al menos 55 pacientes seropositivos para el VIH mantiene su viremia por debajo de 50 copias/ml después de la interrupción de su tratamiento HAART durante dos meses.
En pacientes con sida declarado, dicho tratamiento anti-Tat podría limitar la incidencia de ciertos estados patológicos tales como el sarcoma de Kaposi o de síndromes neurológicos que parecen estar vinculados a una acción directa de la proteína Tat después de su secreción por células infectadas por el VIH.
En pacientes asintomáticos, se espera que la composición farmacéutica de la invención retrase el progreso hacia el sida a causa de una menor viremia y un aumento de linfocitos CD4. Dicho tratamiento permitiría que el paciente restableciera una respuesta celular inmune eficaz contra células infectadas por el VIH, como no parece ser el caso al inicio de la infección; en particular, el restablecimiento de la actividad de los linfocitos T citotóxicos (CTL; del inglés, cytotoxic T lymphocytes), las células NK y los macrófagos, cuya actividad es inhibida por Tat. El tratamiento tendría la consecuencia de permitir que los pacientes al menos llegaran a ser no progresivos.
Las figuras y los ejemplos ilustran la invención sin limitar su alcance.
Ejemplos
Métodos
Variantes de Tat y síntesis de péptidos
Se ensambló Tat Oyi mediante una síntesis en fase sólida de un modo previamente descrito (Péloponèse et al., J. Biol. Chem. 1999, 274: 11.473-8). Una sustitución Ser→Cys en la posición 22 de la secuencia de Tat Oyi (Figura 1) permitió recuperar la actividad biológica de Tat Oyi y su uso en ensayos de neutralización con anticuerpos. También se sintetizaron cinco péptidos que cubrían la secuencia completa con solapamientos (1-22, 13-46, 38-72, 57-86 y 72101), denominados respectivamente péptidos 1 a 5. Otras Tats sintetizadas corresponden al clado A, predominante en Uganda (Ug11RP), el clado D, predominante en la República Democrática del Congo (Eli), el clado recombinante CRF_AE, predominante en Tailandia (CM240), el clado C, predominante en Sudáfrica (96Bw), y el clado B, predominante en Europa y las Américas (HxB2) (Figura 1). Se llevaron a cabo la purificación y el análisis de un modo previamente descrito (J. D. Watkins et al., Retrovirology 2006, 3: 8-17). Después de una liofilización se comprobó la actividad biológica de las variantes de Tat mediante ensayos de transactivación con células HeLa P4 de un modo previamente descrito (S. Opi et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35.915-9).
Inmunización y producción de anticuerpos monoclonales
Se inmunizaron cuatro ratones BALB/c con 10 µg de Tat Oyi sintética en 100 µl de adyuvante de fosfato cálcico (Brenntag Biosector, Dinamarca) por la vía subcutánea. Dos semanas más tarde, los ratones recibieron un refuerzo con la misma preparación. Cinco semanas más tarde, los ratones recibieron de nuevo un refuerzo con la misma preparación por la vía intramuscular. También se inmunizaron tres ratones testigo con los mismos adyuvante y protocolo pero sin proteína Tat. El día 45, los ratones fueron sacrificados y terminalmente sangrados. Los esplenocitos fueron inmediatamente separados para hibridarlos con células de mieloma de un modo descrito (S. A.
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Fuller et al., John Wiley and Sons (redactor), New York, 1991, páginas 11.01-11.11.5). Los sobrenadantes del hibridoma aislado fueron explorados mediante un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA; del inglés, enzyme-linked immunosorbent assay) frente a Tat Oyi para identificar los clones productores. A continuación, se subclonaron estos dos veces mediante diluciones limitantes (< 1,0 célula por pocillo) y se exploraron los clones positivos para el anticuerpo mediante un ELISA primero frente a Tat Oyi y luego frente a las Tats Ug11RP, ELI, CM240, 96BW y HxB2.
Previamente se había llevado a cabo una inmunización similar de cuatro ratas con Tat Oyi y se había seleccionado un mAb (IgG1), denominado 27A8, por su potente reconocimiento de Tat Oyi, anticuerpo que fue utilizado como testigo.
Se cultivaron los hibridomas seleccionados y se purificaron los mAbs (IgG1) mediante cromatografía sobre proteína G (Roche Diagnostics, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Después de la purificación, los anticuerpos fueron sometidos a diálisis frente a tampón de Hepes 20 mM, NaCl 120 mM, pH de 7,3, y fueron concentrados hasta 1 mg/ml.
Detección por ELISA de respuestas de mAbs purificados
Las placas de 96 pocillos fueron revestidas con 100 ng de Tats plegadas o desnaturalizadas o los péptidos 1 a 5 (1 µg/ml en tampón de fosfato 100 mM, pH de 4,5) o la colección de péptidos (cada péptido: 1 µg/ml en tampón de fosfato 100 mM, pH de 4,5). Las Tats (10 µg/ml) fueron desnaturalizadas mediante calentamiento a 90 °C durante 20 minutos en presencia de urea 3 M y fueron luego diluidas 1:10 con tampón frío de fosfato 100 mM, pH de 4,5. Para controlar el efecto de la urea, las Tats plegadas pudieron ser también usadas para revestimiento en presencia de urea 0,3 M. Después del bloqueo con leche desnatada al 5% y de las operaciones de lavado, las placas fueron incubadas durante 1 hora a 37 °C con 100 µl de mAb purificado y diluido. Después de las operaciones de lavado, se añadieron 100 µl de IgG anti-ratón o anti-rata, conjugada con HRP (Amersham, EE.UU.), y se dejaron las placas en incubación durante 1 hora a 37 °C. Después de las operaciones de lavado, se añadieron 100 µl de sustrato ABTS (Roche Diagnostics, Alemania). En 1 hora se midió la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm.
Medición de las constantes de velocidad de asociación del mAb 7G12 con Tats en disolución
Se empleó un método basado en ELISA para medir, en disolución, las constantes de velocidad de asociación de antígeno/anticuerpo (F. Hardy et al., J. Immunol. Methods 1997, 200: 155-9). En resumen, se revistieron placas de 96 pocillos con 100 ng de Tat Oyi en tampón de fosfato 100 mM, pH de 4,5, durante la noche a 4 °C. Un pocillo de cuatro fue dejado sin revestir. Después de las operaciones de lavado, las placas fueron bloqueadas con leche desnatada al 5% en PBS durante 1 hora. El anticuerpo (1 µg/ml) y las disoluciones de variantes de Tat (0 a 0,4 µg/ml) se prepararon en tampón de Hepes 20 mM, NaCl 120 mM, pH de 7,3, al doble de la concentración final. A tiempo cero, se mezclaron volúmenes similares de disoluciones de anticuerpo y antígeno e inmediatamente (tiempo cero del análisis cinético) se transfirieron 100 µl a tres pocillos revestidos y un pocillo sin revestir. Cada cinco minutos, los pocillos fueron llenados con una muestra de mezcla de mAb/Tat. Cada muestra fue incubada en los pocillos durante 4,5 minutos y fue separada. Al final del análisis cinético, las placas fueron lavadas y fueron incubadas con IgG anti-ratón conjugada con HRP. Después de las operaciones de lavado se añadieron 100 µl de sustrato ABTS. En 1 hora se midió la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm. Luego se determinaron las constantes de las velocidades de asociación y disociación (kon y koff), lo que permitió el cálculo de la constante de disociación en equilibrio (KD).
Transferencia Western
Se sometieron proteínas Tat (100 ng) a SDS-PAGE (15%) bajo condiciones reductoras (urea 6 M en tampón para muestras de Laemmli a 96 °C durante 10 minutos). Luego se electrotransfirieron las Tats a membranas de nitrocelulosa. Después del bloqueo con leche desnatada al 5%, las tiras de la membrana fueron incubadas durante 1 hora con mAbs 7G12 o 27A8 en 1:2500. El anticuerpo secundario era IgG anti-ratón o anti-rata, conjugada con HRP y diluida 1/1000, y las bandas se revelaron con H2O2 al 0,1% y tetrahidrocloruro de diaminobencidina (Sigma, EE.UU.) como sustrato.
Neutralización de la transactivación de Tat
Las neutralizaciones de la transactivación de Tat se llevaron a cabo con células HeLa transfectadas con LTR de VIH y se analizaron determinando la producción de β-galactosidasa (β-Gal) en células HeLa-P4 de un modo previamente descrito (Peloponese et al., J. Biol. Chem. 1999, 274: 11.473-8).
Se diluyeron Tats liofilizadas o desnaturalizadas hasta 5 µM (o 10 µM) en tampón de fosfato 100 mM, pH de 4,5. Antes de la adición a las células, se diluyó la Tat hasta 0,5 µM con 400 µl de medio DMEM con albúmina sérica bovina (BSA; del inglés, bovine serum albumin) (Sigma-Aldrich) al 0,1% y protamina A (Sigma, EE.UU.) al 0,01% y
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