ES2552773T3 - Motivos estructurales de polipéptidos asociados con la actividad de señalización celular - Google Patents

Motivos estructurales de polipéptidos asociados con la actividad de señalización celular Download PDF

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Abstract

Un polipéptido de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado que consiste en 60-300 residuos de aminoácido, en donde el polipéptido de AARS comprende tres hebras ß antiparalelas flanqueadas en cada extremo por una hélice α y muestra una actividad de señalización celular, en donde el polipéptido comprende los residuos 325-410 del SEQ ID NO: 6 o un fragmento activo o variante que muestra una identidad de al menos 90% con los residuos 325-410 del SEQ ID NO: 6, y en donde el polipéptido tiene actividad quimioquina.

Description

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o la orientación de células a tejidos que proporcionan señales específicas críticas para la maduración celular. Otras quimioquinas son inflamatorias y son liberadas de una amplia variedad de células en respuesta a la infección bacteriana, a virus y a agentes que causan un daño físico. Su liberación es estimulada a menudo por citoquinas proinflamatorias tales como la interleuquina 1. Las quimioquinas inflamatorias funcionan principalmente como quimioatrayenes para los leucocitos, reclutando monocitos, neutrófilos y otras células efectoras desde la sangre a sitios de infección o lesión tisular. Ciertas quimioquinas inflamatorias activan las células para iniciar una respuesta inmunitaria o promover la curación de heridas. Éstas son liberadas de muchos tipos de células diferentes y sirven para guiar a las células tanto del sistema inmunitario innato como del sistema inmunitario adaptativo. Las quimioquinas ejercen muchos de los efectos biológicos interaccionando con receptores transmembrana unidos a proteína G denominados receptores de quimioquinas, que se encuentran selectivamente en las superficies de sus células diana.
Dados estos papeles y actividades biológicos, las actividades quimioquina, citoquina o de señalización celular de un polipéptido de la presente descripción se pueden determinar utilizando cualquiera de los numerosos análisis de rutina y reconocidos en la técnica. En cierta realización, la actividad de señalización celular se determina utilizando esencialmente cualquier análisis que mida la quimiotaxis, la migración celular, la liberación de citoquina, la diferenciación celular y/o la viabilidad celular. En realizaciones más específicas de la presente descripción, la actividad quimioquina se determina, por ejemplo, utilizando un análisis que mide la quimiotaxis de monocitos dependiente de GPCR, la liberación de interleuquinas y/o la apoptosis.
Los polipéptidos aislados de la presente descripción pueden tener esencialmente cualquier longitud y pueden ser esencialmente de cualquier origen con tal que proporcionen los elementos necesarios para constituir un motivo estructural que posea la actividad de señalización celular u otra actividad no canónica deseadas.
En ciertas realizaciones ilustrativas descritas en la presente memoria, un polipéptido de la presente descripción tendrá un tamaño que oscilará de aproximadamente 30-100, 30-200, 30-300, 30-400, 30-500, 40-100, 40-200, 40300, 40-400, 40-500, 50-100, 50-200, 50-300, 50-400, 50-500, 60-100, 60-200, 60-300, 60-400 o 60-500 aminoácidos.
En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, un polipéptido de la presente descripción es una proteína de mamífero truncada (p. ej., humana) o una variante activa de la misma. Una proteína truncada hace referencia a un polipéptido que es más corto que su correspondiente proteína completa, por ejemplo, debido a la eliminación de aminoácidos de sus extremos N y/o C terminales. El grado de truncamiento, esto es, el número residuos de aminoácido N y/o C terminales eliminados de la proteína completa puede variar considerablemente siempre que todavía proporcione los efectos celulares deseados cuando se administren a una célula, tejido o sujeto, como se describe en la presente memoria. En ciertas realizaciones de la presente descripción, se truncan al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos, o más, incluyendo todas las longitudes intermedias, del extremo N y/o C de una proteína completa. Se pretende que las longitudes intermedias incluyan todos los números enteros intermedios, por ejemplo, 6, 7, 8, etc., 51, 52, 53, etc., 201, 202, 203, etc.
En otras realizaciones descritas en la presente memoria, un polipéptido de la presente descripción está formado por uno o más fragmentos de una proteína de mamífero, o variantes activas de los mismos. Por ejemplo, en una realización ilustrativa, un polipéptido de la presente descripción está formado por un tramo lineal de aminoácidos contiguos (p. ej., con una longitud dentro de los intervalos indicados anteriormente) derivado de una proteína de mamífero, tal como una proteína humana. Alternativamente, un polipéptido de la presente descripción puede estar formado por fragmentos no contiguos de una proteína de mamífero, en donde los fragmentos no contiguos son suficientes para constituir un motivo estructural como se describe en la presente memoria.
En una realización específica de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína GlyRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica descrita en la presente memoria, el polipéptido es una forma truncada de una proteína GlyRS que comprende los residuos de aminoácido 345-420 de la proteína GlyRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 1, o un fragmento activo o una variante del mismo.
En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína AspRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína AspRS que comprende los residuos de aminoácido 367-448 de la proteína AspRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 2, o un fragmento activo o una variante del mismo.
En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína HisRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína HisRS que comprende los residuos de aminoácido 294-372 de la proteína HisRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 3, o un fragmento activo o una variante del mismo.
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En otra realización más de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína ThrRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína ThrRS que comprende los residuos de aminoácido 469-586 de la proteína ThrRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 4, o un fragmento activo o una variante del mismo.
En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína GluProRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína GluProRS que comprende los residuos de aminoácido 1171-1253 de la proteína GluProRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 5,
o un fragmento activo o una variante del mismo.
En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína SerRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína SerRS que comprende los residuos de aminoácido 325-410 de la proteína SerRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 6, o un fragmento activo o una variante del mismo.
En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína PheRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido PheRS (FRS) que comprende los residuos 380-449 del SEQ ID NO: 7 o un fragmento activo o una variante del mismo.
En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína LysRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido LysRS (KRS) que comprende los residuos 425-523 del SEQ ID NO: 8 o un fragmento activo o una variante del mismo.
En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína AsnRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido AsnRS (NRS) que comprende los residuos 416-494 del SEQ ID NO: 9 o un fragmento activo o una variante del mismo.
En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína AlaRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido AlaRS (ARS) que comprende los residuos 148-258 del SEQ ID NO: 10 o un fragmento activo o una variante del mismo.
En otra realización más de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína tiorredoxina, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína tiorredoxina que comprende los residuos de aminoácido 20-105 de la proteína tiorredoxina humana mostrada en el SEQ ID NO: 11, o un fragmento activo o una variante del mismo.
En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína de factor inhibidor de macrófagos, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína de factor inhibidor de macrófagos que comprende los residuos de aminoácido 1-90 de la proteína de factor inhibidor de macrófagos humana mostrada en el SEQ ID NO: 12, o un fragmento activo o una variante del mismo.
En otra realización más de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína de isoforma B de peroxirredoxina 5 humana, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una isoforma B de peroxirredoxina 5 humana que comprende los residuos de aminoácido 32-68 y 125-161 de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 13, o un fragmento activo o una variante del mismo.
En otra realización específica de la presente descripción, el polipéptido no es un fragmento de una proteína TrpRS o TyrRS.
En otra realización de la presente descripción, el polipéptido no es un fragmento de HisRS que consiste en los primeros 48 aminoácidos de la proteína HisRS.
En otra realización de la presente descripción, el polipéptido no es un fragmento de tiorredoxina que consiste en los primeros 80 u 84 aminoácidos N-terminales de la proteína tiorredoxina.
La presente descripción proporciona adicionalmente variantes de los polipéptidos descritos en la presente memoria. Las variantes de polipéptidos incluidas en la presente descripción mostrarán típicamente una identidad de al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% (determinada,
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por ejemplo, como se describe más abajo), en toda su longitud, con la región correspondiente de una secuencia de tipo salvaje o de referencia a partir de la cual derivan.
Una variante de polipéptido puede diferir de un polipéptido natural de la presente descripción en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Tales variantes pueden ser de origen natural o pueden ser generadas sintéticamente, por ejemplo, modificando una o más de las secuencias polipeptídicas anteriores de la descripción y evaluando su actividad biológica como se describe en la presente memoria utilizando cualquiera de los numerosos mecanismos bien conocidos en la técnica.
En otras realizaciones ilustrativas descritas en la presente memoria, la variante puede ser una variante de empalme, ya sea de origen natural o no natural, en donde la variante de empalme posee al menos una actividad no canónica,
p. ej., como se describe en la presente memoria.
En otras realizaciones ilustrativas descritas en la presente memoria, la variante contiene una o más mutaciones puntuales con respecto a una secuencia de polipéptido de tipo salvaje o de referencia, ya sea de origen natural o no natural, en donde el polipéptido variante posee al menos una actividad no canónica, p. ej., como se describe en la presente memoria.
En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, una variante contendrá sustituciones conservativas. Una "sustitución conservativa" es aquella en la un aminoácido es sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanecieran sustancialmente inalteradas. Se pueden realizar modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente descripción y obtener todavía una molécula funcional que codifique un polipéptido variante o derivado con características deseables. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear una variante de un polipéptido equivalente, o incluso mejorada, de la presente descripción, un experto en la técnica, por ejemplo, puede cambiar uno o más codones de la secuencia de ADN codificante de acuerdo con la Tabla 1.
Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin una pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, receptores, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión sobre una molécula sustrato. Puesto que son la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína las que generalmente definen la actividad funcional biológica de la proteína, se pueden realizar ciertas sustituciones en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de proteína, y, por supuesto, su secuencia codificante de ADN subyacente, y sin embargo obtener una proteína con propiedades similares. De este modo se contempla que se puedan realizar varios cambios en las secuencias de polipéptidos de las composiciones descritas, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos polipéptidos sin una pérdida apreciable de su utilidad o actividad deseadas.
Tabla 1.
Aminoácidos
imagen9 Codones imagen10 imagen11 imagen12 imagen13 imagen14
Alanina
Ala A GCA GCC GCG GCU imagen15 imagen16
Cisteína
Cys C UGC UGU imagen17 imagen18 imagen19 imagen20
Ácido aspártico
Asp D GAC GAU imagen21 imagen22 imagen23 imagen24
Ácido glutámico
Glu E GAA GAG imagen25 imagen26 imagen27 imagen28
Fenilalanina
Phe F UUC UUU imagen29 imagen30 imagen31 imagen32
Glicina
gly G GGA GGC GGG GGU imagen33 imagen34
Histidina
His H CAC CAU imagen35 imagen36 imagen37 imagen38
Isoleucina
Ile I AUA AUC AUU imagen39 imagen40 imagen41
Lisina
Lys K AAA AAG imagen42 imagen43 imagen44 imagen45
Leucina
Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
5
10
15
20
25
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35
Aminoácidos
imagen46 Codones imagen47 imagen48 imagen49 imagen50 imagen51
Metionina
Met M AUG imagen52 imagen53 imagen54 imagen55 imagen56
Asparragina
Asn N AAC AAU imagen57 imagen58 imagen59 imagen60
Prolina
Pro P CCA CCC CCG CCU imagen61 imagen62
Glutamina
Gln Q CAA CAG imagen63 imagen64 imagen65 imagen66
Arginina
Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Serina
Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina
Thr T ACA ACC ACG ACU imagen67 imagen68
Valina
Val V GUA GUC GUG GUU imagen69 imagen70
Triptófano
Trp W UGG imagen71 imagen72 imagen73 imagen74 imagen75
Tirosina
Tyr Y UAC UAU imagen76 imagen77 imagen78 imagen79
Al realizar tales cambios, también se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos al conferir la función biológica interactiva a una proteína es generalmente comprendida en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Por ejemplo, se sabe que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares. Cada aminoácido tiene un índice hidropático asignado basándose en sus características de carácter hidrófobo y carga (Kyte y Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparragina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropáticos similares y todavía dan como resultado una proteína con una actividad biológica similar, esto es, todavía se obtiene una proteína biológicamente funcional equivalente. Al realizar tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están en ±2, son particularmente preferidos aquellos en ±1, y son incluso más concretamente preferidos aquellos en ±0,5.
También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede llevar a cabo eficazmente basándose en el carácter hidrófilo. Como se detalla en la Patente de los Estados Unidos 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de carácter hidrófilo a los residuos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ±1); serina (+0,3); asparragina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ±1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que se puede sustituir un aminoácido por otro que tenga un valor de carácter hidrófilo similar y todavía obtener una proteína biológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de carácter hidrófilo están en ±2, son particularmente preferidos aquellos en ±1, y son incluso aún más particularmente preferidos aquellos en ±0,5.
Como se ha esbozado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se pueden basar en la similitud relativa de los sustituyentes de las cadenas laterales de los aminoácidos, por ejemplo, su carácter hidrófobo, su carácter hidrófilo, su carga, su tamaño, y similares. Las sustituciones ilustrativas que tienen en consideración varias de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparragina; y valina, leucina e isoleucina.
Las sustituciones de aminoácidos se pueden realizar adicionalmente basándose en la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, el carácter hidrófobo, el carácter hidrófilo y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que tienen valores de carácter hidrófilo similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparragina y
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En ciertas realizaciones de la presente descripción, se proporcionan polipéptidos de fusión, y polinucléotidos que codifican los polipéptidos de fusión. Los polipéptidos de fusión hacen referencia a polipéptidos de la presente descripción que se han conectado covalentemente, o bien directamente o bien indirectamente a través de un conector de aminoácidos, a una o más secuencias de polipéptidos heterólogas (compañeros de fusión). Los polipéptidos que forman la proteína de fusión están unidos típicamente del extremo C al extremo N, aunque también pueden unirse del extremo C al extremo C, extremo N a extremo N, o extremo N a extremo C. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden.
El compañero de fusión puede ser diseñado e incluido esencialmente para cualquier propósito deseado siempre que no afecte adversamente a la actividad deseada del polipéptido. Por ejemplo, en una realización, un compañero de fusión comprende una secuencia que ayuda a expresar la proteína (un intensificador de la expresión) a rendimientos superiores a los de la proteína recombinante nativa. Otros compañeros de fusión pueden seleccionarse para incrementar la solubilidad de la proteína o para permitir que la proteína sea dirigida a compartimentos intracelulares deseados. Otros compañeros de fusión adicionales incluyen etiquetas de afinidad, que facilitan la purificación de la proteína.
Las proteínas de fusión pueden prepararse generalmente usando técnicas convencionales. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican los componentes del polipéptido de una fusión deseada pueden ensamblarse separadamente, y ligarse en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente del polipéptido se liga, con o sin un conector peptídico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente del polipéptido de manera que los marcos de lectura de las secuencias están en fase. Esto permite la traducción en una única proteína de fusión que retiene la actividad biológica de ambos polipéptidos componentes.
Puede emplearse una secuencia de conector peptídico para separar el primer y segundo componentes del polipéptido por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundaria y terciaria, si se desea. Dicha secuencia de conector peptídico se incorpora a la proteína de fusión usando mecanismos convencionales muy conocidos en la técnica. Determinadas secuencias de conector peptídico pueden elegirse tomando como base los factores siguientes: (1) su capacidad de adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad de adoptar una estructura secundaria que podría interaccionar con epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptido; y (3) la ausencia de residuos hidrófobos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias de conector peptídico preferidas contienen residuos Gly, Asn y Ser. También pueden usarse otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala en la secuencia conectora. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de manera útil como conectores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene 40:39 46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986); Patente de los Estados Unidos Núm. 4.935.233 y Patente de los Estados Unidos Núm. 4.751.180. La secuencia conectora puede tener una longitud generalmente de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos. Las secuencias conectoras no se requieren cuando el primer y segundo polipéptido tienen regiones de aminoácidos no esenciales N-terminales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica.
Las secuencias de ADN ligadas están conectadas operablemente a elementos reguladores de la transcripción o la traducción adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN están localizados 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. De manera similar, los codones de parada requeridos para terminar la traducción y las señales de terminación de la transcripción están presentes 3' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.
En general, los polipéptidos y polipéptidos de fusión (así como sus polinucleótidos codificantes) están aislados. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" es uno que se retira de su entorno original. Por ejemplo, una proteína natural está aislada si se separa de parte o todos los materiales que coexisten en el sistema natural. Preferiblemente, dichos polipéptidos son al menos aproximadamente 90% puros, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 99% puros. Un polinucleótido se considera que está aislado si, por ejemplo, se clona en un vector que no es parte del entorno natural.
En otras realizaciones más descritas en la presente memoria, un polipéptido de la presente descripción puede ser parte de un dímero. Los dímeros pueden incluir, por ejemplo, homodímeros entre dos polipéptidos AARS idénticos, heterodímeros entre dos polipéptidos AARS diferentes (p. ej., un polipéptido GlyRS completo y un polipéptido GlyRS truncado, o dos polipéptidos AARS truncados diferentes), y/o heterodímeros entre un polipéptido AARS y un polipéptido heterólogo. Los monómeros y/o dímeros pueden ser solubles y pueden ser aislados o purificados hasta la homogeneidad. Ciertos heterodímeros, tales como aquellos entre un polipéptido AARS y un polipéptido heterólogo, pueden ser bifuncionales.
Asimismo se describen en la presente memoria proteínas monoméricas o sustancialmente monoméricas. En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, una proteína monomérica tiene una capacidad reducida para dimerizarse consigo misma (es decir, homodimerizarse) y/o para dimerizar con otro polipéptido AARS (esto es, heterodimerizar).
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En otras realizaciones descritas en la presente memoria, un polipéptido de la presente descripción puede ser parte de un complejo multi-unitario. Un complejo multi-unitario de la presente descripción puede incluir, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, o 5 o más monómeros. Los monómeros y/o los complejos multi-unitarios pueden ser solubles y se pueden aislar o purificar hasta su homogeneidad. Las unidades monoméricas de un complejo multiunitario pueden ser diferentes, homólogas, sustancialmente homólogas, o idénticas entre sí. No obstante, un complejo multi-unitario de la presente descripción incluye al menos un monómero que comprende un polipéptido como se describe en la presente memoria o, en otras realizaciones descritas en la presente memoria, al menos dos o más polipéptidos, como se describe en la presente memoria.
Los monómeros conectados covalentemente se pueden conectar directamente (por medio de enlaces) o indirectamente (p. ej., a través de un conector). Para conectar directamente los monómeros de polipéptidos en la presente memoria, puede resultar beneficioso modificar los polipéptidos de la presente memoria para intensificar la dimerización o la multimerización. Por ejemplo, se pueden modificar uno o más residuos de aminoácido de un polipéptido AARS mediante la adición o sustitución por una o más cisteínas. Los métodos para crear sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones de cisteína, u otras modificaciones para facilitar la conexión, son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Ciertas realizaciones de la presente descripción también contemplan el uso de AARS modificados u otros polipéptidos, incluyendo modificaciones que mejoran las características deseadas de un AARS u otro polipéptido, como se describe en la presente memoria. Las modificaciones ilustrativas de los polipéptidos AARS de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, derivatizaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constitutivos, incluyendo modificaciones de la cadena lateral, modificaciones de la cadena principal, y modificaciones N y C terminales incluyendo, hidroxilación, metilación, amidación, y el anclaje de radicales carbohidratados o lipídicos, cofactores, y similares. Las modificaciones ilustrativas también incluyen la pegilación de polipéptidos (véase, p. ej., Veronese y Harris, Advanced Drug Delivery Reviews 54: 453-456, 2002).
En ciertos aspectos de la presente descripción, se puede utilizar la tecnología de ligación quimioselectiva para modificar polipéptidos truncados de la presente descripción, por ejemplo atrayendo polímeros de una manera específica del sitio y controlada. Dicha tecnología se basa típicamente en la incorporación de anclajes quimioselectivos en el núcleo de la proteína bien por medios químicos o recombinantes, y la modificación posterior con un polímero que porta un conector complementario. Como resultado, el proceso de ensamblaje y la estructura covalente del conjugado proteína-polímero resultante puede controlarse, permitiendo la optimización racional de las propiedades del fármaco, tal como eficacia y propiedades farmacocinéticas (véase, por ejemplo, Kochendoerfer, Current Opinion in Chemical Biology 9:555-560, 2005).
Los polipéptidos AARS descritos en la presente memoria se pueden preparar mediante cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos en la técnica, tal como mediante mecanismos recombinantes. Por ejemplo, se pueden preparar polipéptidos mediante un procedimiento que incluye las etapas de: (a) preparar un constructo que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido AARS de la presente descripción y que está conectado operablemente a un elemento regulador; (b) introducir el constructo en una célula anfitriona; (c) cultivar la célula anfitriona para expresar el polipéptido; y (d) aislar el polipéptido de la célula anfitriona. Los polipéptidos AARS recombinantes se pueden preparar convenientemente utilizando protocolos convencionales como describen por ejemplo en Sambrook, et al., (1989, supra), en particular en las Secciones 16 y 17; Ausubel et al., (1994, supra), en particular los Capítulos 10 y 16; y Coligan et al., Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997), en particular los Capítulos 1, 5 y 6.
Además de los métodos de producción recombinante, los polipéptidos de la presente descripción pueden ser producidos mediante síntesis peptídica directa utilizando técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). La síntesis de proteínas puede llevarse a cabo usando técnicas manuales o automatizadas. La síntesis automatizada puede conseguirse, por ejemplo, usando el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Alternativamente, varios fragmentos pueden sintetizarse químicamente separadamente y combinarse usando métodos químicos para producir la molécula deseada.
Composiciones de polinucleótido
La presente descripción también proporciona polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos de la presente descripción, así como también composiciones que comprenden tales polinucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos que codifican proteínas ARNt sintetasa, y otras proteínas descritas en la presente memoria, son fácilmente asequibles a través de cualquiera de las numerosas bases de datos de secuencias públicas (p. ej., http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y pueden ser identificadas, elaboradas y utilizadas en el contexto de la presente descripción utilizando mecanismos y metodologías descritos en la presente memoria y/o bien establecidos en la técnica.
Según se utilizan en la presente memoria, los términos "ADN" y "polinucleótido" y "ácido nucleico" se refieren a una molécula de ADN que se ha aislado y que carece de ADN genómico total de un especie concreta. Por lo tanto, un segmento de ADN que codifica un polipéptido se refiere a un segmento de ADN que contiene una o más secuencias codificantes y que aún así está sustancialmente aislado de, o purificado careciendo de, ADN genómico total de la
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recombinantes pueden usarse para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que el polipéptido de interés puede expresarse (Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3224-3227 (1994)).
En células anfitrionas de mamífero, están disponibles generalmente varios sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en los casos en los que se usa un adenovirus como un vector de expresión, las secuencias que codifican un polipéptido de interés pueden ligarse en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región no esencial E1 o E3 del genoma viral puede usarse para obtener un virus viable que es capaz de expresar el polipéptido en células anfitrionas infectadas (Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659 (1984)). Además, se pueden utilizar intensificadores de la transcripción, tales como el intensificador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para incrementar la expresión en células anfitrionas de mamífero.
También pueden usarse señales de inicio específicas para conseguir una traducción más eficiente de secuencias que codifican un polipéptido de interés. Dichas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. En los casos en los que se insertan secuencias que codifican el polipéptido, su codón de inicio, y secuencias aguas arriba en el vector de expresión adecuado, pueden no necesitarse señales de control de la transcripción o traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en los que se inserta sólo la secuencia codificante, o una parte de ésta, deben proporcionarse señales de control de la traducción exógenas incluyendo el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción del inserto completo. Los elementos de la traducción exógenos y codones de inicio pueden tener varios orígenes, tanto natural como sintético. La eficacia de la expresión se puede intensificar por medio de la inclusión de intensificadores que son apropiados para el sistema de células concreto que se utilice, tales como los descritos en la bibliografía (Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)).
Además, una cepa de célula anfitriona puede elegirse por su capacidad de modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada en la forma deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no están limitadas a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. El procesamiento posterior a la traducción que escinde una forma "prepro" de la proteína también puede usarse para facilitar la inserción, plegamiento y/o función correctos. Pueden elegirse diferentes células anfitrionas tales como CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y W138, que tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades posteriores a la traducción, para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína foránea.
Para una producción a largo plazo, con alto rendimiento, de las proteínas recombinantes, se prefiere generalmente la expresión estable. Por ejemplo, pueden transformarse líneas celulares que expresan de manera estable un polinucleótido de interés usando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo vector o en un vector separado. Después de la introducción del vector, puede dejarse que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de las células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células transformadas de manera estable pueden proliferar usando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo celular.
Puede usarse cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Éstos incluyen, pero no están limitados a, los genes de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11:223-232 (1977)) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817-823 (1990)) que pueden emplearse en células tk-o aprt-, respectivamente. También puede usarse resistencia a antimetabolito, antibiótico o herbicida como la base de la selección; por ejemplo, dhfr que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 77:3567-70 (1980)); npt, que confiere resistencia a los aminoglicósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)); y als o pat, que confieren resistencia a clorsulfurón y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murry, supra). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8047-51 (1988)). El uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores tales como antocianinas, β-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, siendo usados ampliamente no sólo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión de proteína temporal o estable atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)).
En la técnica se conoce una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de productos codificados por polinucleótidos, usando bien anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el producto. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y separación de células activada por fluorescencia (FACS). Éstos y otros ensayos se describen, entre otros lugares, en Hampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) y Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983).
Los expertos en la técnica conocen una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y pueden usarse en varios ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir sondas marcadas de hibridación o PCR para detectar secuencias relacionadas con los polinucleótidos incluyen oligomarcaje, traslación de mella, y
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marcaje terminal o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Alternativamente, las secuencias, o cualquier parte de éstas pueden clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores son conocidos en la técnica, están disponibles comercialmente, y pueden usarse para sintetizar sondas de ARN in vitro por la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3, o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden llevarse a cabo usando una variedad de kits disponibles comercialmente. Las moléculas informadoras o marcas adecuadas, que pueden usarse incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, o cromogénicos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares.
Las células anfitrionas transformadas con una secuencia de polinucleótido de interés pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede secretarse o estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o del vector usado. Como comprenderán los expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen los polinucleótidos de la presente descripción se pueden diseñar para que contengan secuencias señal que dirijan la secreción del polipéptido codificado a través de una membrana celular procariótica o eucariótica. Pueden usarse otras construcciones recombinantes para unir secuencias que codifican un polipéptido de interés a la secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de polipéptido que facilitará la purificación de proteínas solubles.
Además de los métodos de producción recombinante, los polipéptidos de la presente descripción, y los fragmentos de los mismos, pueden ser producidos mediante síntesis peptídica directa utilizando técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). La síntesis de proteínas puede llevarse a cabo usando técnicas manuales o automatizadas. La síntesis automatizada puede conseguirse, por ejemplo, usando el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Alternativamente, se pueden sintetizar químicamente por separado diversos fragmentos y combinarlos utilizando métodos químicos para producir la molécula completa.
De acuerdo con otro aspecto de la presente descripción, los polinucleótidos que codifican polipéptidos de la presente descripción se pueden liberar en un sujeto in vivo, p. ej., utilizando técnicas de terapia génica. La terapia génica se refiere en general a la transferencia de ácidos nucleicos heterólogos a ciertas células, células diana, de un mamífero, concretamente un ser humano, con un trastorno o afecciones para los cuales se procura semejante terapia. El ácido nucleico es introducido en las células diana seleccionadas de manera que se exprese el ADN heterólogo y se produzca un producto terapéutico codificado de ese modo.
Los diversos vectores virales que se pueden utilizar para la terapia génica como se ilustra en la presente memoria incluyen adenovirus, virus herpes, vaccinia, virus adeno-asociados (AAV), o, preferiblemente, un virus con ARN tal como un retrovirus. Preferiblemente, el vector retroviral es un derivado de un vector retrovirus murino o aviar, o es un vector lentiviral. El vector retroviral preferido es un vector lentiviral. Los ejemplos de los vectores retrovirales en los que se puede insertar un único gen foráneo incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV), SIV, BIV, VIH y virus del Sarcoma de Rous (RSV). Numerosos vectores retrovirales adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de manera que las células transducidas puedan ser identificadas y generadas. Insertando una secuencia de polipéptido de unión a ADN derivada de un dedo de cinc de interés en el vector viral, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor sobre una célula diana específica, por ejemplo, el vector se puede volver específico de la diana. Los vectores retrovirales se pueden volver específicos de la diana insertando, por ejemplo, un polinucléotido que codifica una proteína (dímero). Se puede lograr un direccionamiento ilustrativo utilizando un anticuerpo para dirigir el vector retroviral. Los expertos en la técnica sabrán, o podrán averiguar fácilmente sin experimentación indebida, secuencias de polinucleótidos específicas que se pueden insertar en el genoma retroviral para permitir la liberación específica de la diana del vector retroviral que contiene el polinucleótido de la proteína de unión al dedo de cinc.
Puesto que los retrovirus recombinantes son defectuosos, requieren ayuda para producir partículas de vector infecciosas. Esta ayuda puede ser proporcionada, por ejemplo, utilizando líneas celulares coadyuvantes que contienen plásmidos que codifican todos los genes estructurales del retrovirus bajo el control de secuencias reguladoras dentro de la LTR. En estos plásmidos falta una secuencia de nucleótidos que permita que el mecanismo de empaquetamiento reconozca un transcrito de ARN para la encapsulación. Las líneas celulares coadyuvantes que tienen deleciones de la señal de empaquetamiento incluyen, pero no se limitan a PSI.2, PA317 y PA12, por ejemplo. Estas líneas celulares producen viriones vacíos, ya que no hay genoma empaquetado. Si se introduce un vector retroviral en tales células en las que la señal de empaquetamiento está intacta, pero se remplazan los genes estructurales por otros genes de interés, el vector puede ser empaquetado y el virión de vector producido. Los viriones de vector producidos mediante este método se pueden utilizar a continuación para infectar una línea celular de tejido, tal como las células NIH 3T3, para producir grandes cantidades de viriones retrovirales quiméricos.
También se pueden utilizar técnicas de liberación "no virales" para la terapia génica incluyendo, por ejemplo, complejos de ADN-ligando, complejos de adenovirus-ligando-ADN, inyección directa de ADN, precipitación de CaPO4, técnicas de pistola génica, electroporación, liposomas, lipofección, y similares. Cualquiera de estos métodos está ampliamente disponible para un experto en la técnica y sería adecuado para su uso en la presente descripción. Otros métodos adecuados se encuentran disponibles para un experto en la técnica, y se debe entender que la presente descripción puede completarse utilizando cualquiera de los métodos de transfección disponibles. La
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La unión inmunológica, tal y como se usa en este contexto, se refiere generalmente a las interacciones no covalentes del tipo que ocurren entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La fuerza, o afinidad de las interacciones de unión inmunológica pueden expresarse en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, en donde una Kd menor representa una mayor afinidad. Las propiedades de la unión inmunológica de polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse usando métodos muy conocidos en la técnica. Uno de dichos métodos conlleva medir las velocidades de la formación del complejo de sitio unión a antígeno/antígeno y disociación, en donde esas velocidades dependen de las concentraciones de las parejas del complejo, la afinidad de la interacción, y de parámetros geométricos que influyen igualmente en la velocidad en ambas direcciones. Así, tanto la "constante de asociación" (kon) como la "constante de disociación" (koff) pueden determinarse por el cálculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociación y disociación. La proporción de koff /kon permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es así igual a la constante de disociación Kd. Véase, generalmente, Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473.
Un "sitio de unión a antígeno," o una "porción de unión" de un anticuerpo se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables N-terminales ("V") de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera son referidos como "regiones hipervariables" que están interpuestos entre los tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco", o "FR". De este modo el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre y adyacentes a regiones hipervariables en las inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas una respecto a otra en espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. La superficie de unión a antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se refieren como "regiones determinantes de la complementariedad," o "CDR."
Un agente de unión puede ser, por ejemplo, un ribosoma, con o sin un componente peptídico, una molécula de ARN
o un polipéptido. En una realización preferida, un agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos pueden prepararse por cualquiera de una variedad de mecanismos conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, los anticuerpos pueden producirse por técnicas de cultivo celular, incluyendo la generación de anticuerpos monoclonales como se describe en la presente memoria, o mediante transfección de genes de anticuerpo en anfitriones celulares bacterianos o de mamífero adecuados, con el fin de permitir la producción de anticuerpos recombinantes. En una técnica, un inmunógeno que comprende el polipéptido se inyecta inicialmente en cualquiera de una amplia variedad de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En esta etapa, los polipéptidos de esta descripción pueden servir como inmunógeno sin modificación. Alternativamente, particularmente para polipéptidos relativamente cortos, puede incitarse una respuesta inmune superior si el polipéptido se une a una proteína vehicular, tal como albúmina de suero bovino o hemocianina de lapa californiana. El inmunógeno se inyecta en el anfitrión animal, preferiblemente según un esquema predeterminado incorporando una o más inmunizaciones de refuerzo, y se toman muestras de sangre de los animales periódicamente. Los anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido pueden purificarse de dichos antisueros, por ejemplo, por cromatografía de afinidad usando el polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.
Los anticuerpos monoclonales específicos para un polipéptido de interés se pueden preparar, por ejemplo, utilizando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976, y las mejoras del mismo. Brevemente, estos métodos implican la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad deseada (es decir, reactividad con el polipéptido de interés). Dichas líneas celulares pueden producirse, por ejemplo, a partir de células del bazo obtenidas de un animal inmunizado como se ha descrito anteriormente. Las células del bazo se inmortalizan, por ejemplo, por fusión con un compañero de fusión de células de mieloma, preferiblemente una que es singénica con el animal inmunizado. Puede emplearse una variedad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y las células de mieloma pueden combinarse con un detergente no iónico durante unos pocos minutos y a continuación cultivarse en placa a baja densidad en un medio selectivo que soporta el crecimiento de las células híbridas, pero no de las células de mieloma. Una técnica de selección preferida usa selección HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente aproximadamente 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan colonias individuales y sus sobrenadantes de cultivo se someten a ensayo para determinar la actividad de unión frente al polipéptido. Se prefieren los hibridomas que tienen alta reactividad y especificidad.
Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en crecimiento. Además, pueden emplearse varias técnicas para aumentar el rendimiento, tal como inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un anfitrión vertebrado adecuado, tal como un ratón. Los anticuerpos monoclonales pueden recogerse del fluido de ascites o la sangre. Los contaminantes pueden eliminarse de los anticuerpos por técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación, y extracción. Los polipéptidos de esta descripción se pueden utilizar en el proceso de purificación, por ejemplo, en una etapa de una cromatografía de afinidad.
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En la técnica se conocen varias moléculas terapéuticamente útiles que comprenden sitios de unión a antígeno que son capaces de presentar propiedades de unión inmunológicas de una molécula de anticuerpo. La enzima proteolítica papaína escinde preferiblemente moléculas de IgG para rendir varios fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos "F(ab)") comprenden cada uno un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión a antígeno intacto. La enzima pepsina es capaz de escindir moléculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, incluyendo el fragmento "F(ab')2" que comprende ambos sitios de unión al antígeno. Un fragmento "Fv" puede producirse por escisión proteolítica preferencial de una IgM, y en raras ocasiones molécula de inmunoglobulina IgG o IgA. Los fragmentos Fv, sin embargo, se obtienen más comúnmente usando mecanismos recombinantes conocidos en la técnica. El fragmento Fv incluye un heterodímero VH::VL no covalente incluyendo un sitio de unión a antígeno que retiene la mayor parte de las capacidades de reconocimiento y unión a antígeno de la molécula de anticuerpo nativa. Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15:2706-2710; y Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096.
Un polipéptido de cadena sencilla Fv ("sFv") es un heterodímero VH::VL unido covalentemente que se expresa a partir de una fusión génica incluyendo genes que codifican VH y VL unidos por un conector que codifica un péptido. Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5879-5883. Se han descrito varios métodos para discernir estructuras químicas para convertir las cadenas de polipéptido de cadena ligera y pesada agregadas naturalmente pero químicamente separadas de una región V de anticuerpo en una molécula sFv que se plegará en un estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión a antígeno. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.091.513 y 5.132.405, de Huston et al.; y Patente de los Estados Unidos Núm. 4.946.778, de Ladner et al.
Cada una de las moléculas anteriormente descritas incluye un conjunto de CDR de cadena pesada y cadena ligera, interpuestas respectivamente entre un conjunto de FR de una cadena pesada y una cadena ligera que proporciona soporte a las CDR y definen la relación espacial de las CDR entre sí. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "conjunto de CDR" se refiere a las tres regiones hipervariables de una región V de cadena pesada o ligera. Desde el extremo N de una cadena pesada o ligera, estas regiones se indican como "CDR1," "CDR2," y "CDR3" respectivamente. Un sitio de unión a antígeno, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una región V de cadena pesada y cadena ligera. Un polipéptido que comprende una única CDR, (por ejemplo, una CDR1, CDR2 o CDR3) se refiere en la presente memoria como una "unidad de reconocimiento molecular." Los análisis cristalográficos de varios complejos antígeno-anticuerpo han demostrado que los residuos de aminoácidos de las CDR forman un contacto extenso con el antígeno unido, en el que el contacto más extenso con el antígeno es con CDR3 de cadena pesada. Así, las unidades de reconocimiento molecular son responsables principalmente de la especificidad de un sitio de unión a antígeno.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "conjunto de FR" se refiere a las cuatro secuencias de aminoácidos flanqueantes que enmarcan las CDR de un conjunto de CDR de una región V de cadena pesada o ligera. Algunos residuos de FR pueden contactar el antígeno unido; sin embargo, las FR son principalmente responsables del plegamiento de la región V en el sitio de unión al antígeno, concretamente los residuos de FR directamente adyacentes a las CDR. En las FR, determinados residuos de aminoácidos y determinadas características estructurales están altamente conservados. A este respecto, todas las secuencias de región V contienen un bucle disulfuro interno de aproximadamente 90 residuos de aminoácidos. Cuando las regiones V se pliegan en un sitio de unión, las CDR se presentan como restos de bucle proyectados que forman una superficie de unión a antígeno. Generalmente se reconoce que existen regiones estructurales conservadas de las FR que influyen en la conformación plegada de los bucles de CDR en ciertas estructuras "canónicas" con independencia de la secuencia de aminoácidos de la CDR precisa. Además, se sabe que determinados residuos de FR participan en contactos interdominio no covalentes que estabilizan la interacción de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.
Se han descrito varias moléculas de anticuerpo "humanizadas" que comprenden un sitio de unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor y sus CDR asociadas fusionadas con dominios constantes humanos (Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224; Shaw et al. (1987) J Immunol. 138:4534-4538; y Brown et al. (1987) Cancer Res. 47:3577-3583), CDR de roedor injertadas en un FR de soporte humano antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado (Riechmann et al. (1988) Nature 332:323327;Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536; y Jones et al. (1986) Nature 321:522-525), y CDR de roedor soportadas por FR de roedor recubiertas recombinantemente (Publicación de Patente Europea No. 519.596, publicada el 23 de dic., 1992). Estas moléculas "humanizadas" se diseñan para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia moléculas de anticuerpos de roedores que limita la duración y la eficacia de las aplicaciones terapéuticas de esos radicales en los receptores humanos.
Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "FR recubiertas" y "FR recubiertas recombinantemente" se refieren al reemplazo selectivo de residuos de FR de, por ejemplo, una región V de cadena pesada o ligera de roedor, con residuos de FR humano con el fin de proporcionar una molécula xenogénica que comprende un sitio de unión a antígeno que retiene sustancialmente toda la estructura de plegamiento del polipéptido FR nativo. Las técnicas de recubrimiento se basan en la comprensión de que las características de unión a ligando de un sitio de unión a antígeno están determinadas principalmente por la estructura y disposición relativa de los conjuntos de CDR de cadena pesada y ligera en la superficie de unión a antígeno. Davies et al. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59:439-473.
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En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, la liberación se puede producir mediante la utilización de liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas de lípidos, vesículas, y similares, para la introducción de las composiciones de la presente descripción en células anfitrionas adecuadas. En particular, las composiciones de la presente descripción se pueden formular para administración bien encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, una nanopartícula o similares. La formulación y uso de dichos vehículos de administración pueden llevarse a cabo usando técnicas conocidas y convencionales.
Kits que comprenden las composiciones
La presente descripción, en otros aspectos, proporciona kits que comprenden uno o más recipientes cargados con uno o más de los polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, complejos multiunitarios, composiciones de los mismos, etc., de la presente descripción, como se describe en la presente memoria. Los kits pueden incluir instrucciones por escrito sobre cómo utilizar tales composiciones (p. ej., para modular la señalización celular, la angiogénesis, el cáncer, afecciones inflamatorias, etc.).
Los kits en la presente memoria también pueden incluir uno o más agentes terapéuticos adicionales u otros componentes adecuados o deseados para la indicación que esté siendo tratada. Un agente terapéutico adicional puede estar contenido en un segundo recipiente, si se desea. Los ejemplos de los agentes terapéuticos adicionales incluyen, pero no se limitan a agentes antineoplásicos, agentes anti-inflamatorios, agentes antibacterianos, agentes antivirales, agentes angiogénicos, etc.
Los kits en la presente memoria también pueden incluir una o más jeringas u otros componentes necesarios o deseados para facilitar un modo de liberación pretendido (p. ej., dispositivos intraluminales, depósitos implantables, etc.).
Métodos de uso
Las realizaciones de la presente descripción también incluyen métodos de utilización de los "agentes" de aminoacil-ARNt (AARS) descritos en la presente memoria para fines de diagnóstico, descubrimiento de fármacos, y/o terapéuticos. El término "agentes" de AARS hace referencia en general a polinucleótidos de AARS, polipéptidos de AARS, agentes de unión tales como peptidomiméticos, y otros compuestos descritos en la presente memoria. Para fines de diagnóstico, se pueden utilizar los agentes de AARS en una variedad de formas no limitantes, por ejemplo para distinguir entre diferentes tipos de células o estados celulares diferentes, o para identificar sujetos que tienen una enfermedad o afección relevante. Con el fin de descubrir fármacos, se pueden utilizar los agentes de AARS para identificar uno o más "compañeros de unión" celulares de un polipéptido de AARS, caracterizar una o más actividades "no canónicas" de un polipéptido de AARS, identificar agentes que tienen un efecto agonístico o antagónico selectivo o no selectivo sobre la interacción de un polipéptido de AARS con sus compañeros de unión, y/o identificar los agentes que tienen un efecto agonístico o antagónico selectivo o no selectivo sobre una o más actividades "no canónicas" de un polipéptido de AARS. Para fines terapéuticos, se pueden utilizar los agentes o composiciones de AARS proporcionados en la presente memoria para tratar una variedad de enfermedades o afecciones, detalladas más abajo.
Descubrimiento de fármacos
Ciertas realizaciones de la presente descripción se refieren al uso de las secuencias de polipéptidos de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) descritas en la presente memoria en el descubrimiento de fármacos, típicamente para identificar agentes que modulan una o más de las actividades no canónicas del polipéptido. Por ejemplo, ciertas realizaciones de la presente descripción incluyen métodos de identificación de uno o más "compañeros de unión" de un polipéptido de AARS de la presente descripción, tal como una proteína celular u otra molécula del anfitrión que está asociada con el polipéptido y participa en su actividad o en sus actividades no canónicas. Asimismo se describen en la presente memoria los métodos para identificar un compuesto (p. ej., polipéptido) u otro agente que suscita agonismo o antagonismo de la actividad no canónica de un polipéptido de referencia o una variante activa del mismo, por ejemplo mediante interacción con el polipéptido y/o uno o más de sus compañeros de unión celulares.
Ciertas realizaciones de la presente descripción incluyen por lo tanto métodos de identificación de un compañero de unión de un polipéptido de AARS, que comprenden a) combinar el polipéptido de AARS con una muestra biológica en condiciones adecuadas, y b) detectar la unión específica del polipéptido de AARS a un compañero de unión, identificando de ese modo un compañero de unión que se une específicamente al polipéptido de AARS. Asimismo se describen en la presente memoria los métodos de escrutinio de un compuesto que se une específicamente a un polipéptido de AARS o un compañero de unión del polipéptido, que comprenden a) combinar el polipéptido o el compañero de unión con al menos un compuesto de ensayo en condiciones adecuadas, y b) detectar la unión del polipéptido o el compañero de unión al compuesto de ensayo, identificando de ese modo un compuesto que se une específicamente al polipéptido o su compañero de unión. En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, el compuesto es un polipéptido o un péptido. En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, el compuesto es una molécula pequeña u otro compuesto químico (p. ej., no biológicos). En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, el compuesto es un peptidomimético.
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Se puede emplear cualquier método adecuado para detectar interacciones proteína-proteína para identificar proteínas celulares que interaccionan con un polipéptido de AARS, interaccionan con uno o más de sus compañeros de unión celulares, o ambos. Los ejemplos de los métodos tradicionales que se pueden emplear incluyen coinmunoprecipitación, entrecruzamiento, y co-purificación a través de columnas con gradientes o cromatográficas de productos lisados celulares o proteínas obtenidas de productos lisados celulares, principalmente para identificar proteínas en el producto lisado que interaccionan con el polipéptido de AARS.
En estas realizaciones y en realizaciones relacionadas de la presente descripción, al menos una porción de la secuencia de aminoácidos de una proteína que interacciona con un polipéptido de AARS o su compañero de unión puede ser averiguada utilizando mecanismos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo a través del mecanismo de degradación de Edman. Véase, p. ej., Creighton Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y., págs. 34 49, 1983. La secuencia de aminoácidos obtenida se puede utilizar como una guía para la generación de mezclas de oligonucleótidos que se pueden utilizar para escrutar secuencias génicas que codifican tales proteínas. El escrutinio se puede completar, por ejemplo, por medio de hibridación convencional o técnicas de PCR, como se describe en la presente memoria y se conoce en la técnica. Las técnicas para la generación de mezclas de oligonucleótidos y el escrutinio son bien conocidas. Véase, p. ej., Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; e Innis et al., eds. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, Inc., Nueva York, 1990.
Adicionalmente, los métodos se pueden emplear en la identificación simultánea de genes que codifican el compañero de unión u otro polipéptido. Estos métodos incluyen, por ejemplo, el sondeo de bibliotecas de expresión, de una manera similar al mecanismo bien conocido de sondeo con anticuerpos de bibliotecas de lambda-gt11, utilizando una proteína AARS marcada, u otro polipéptido, péptido o proteína de fusión, p. ej., un polipéptido de AARS variante o un dominio de AARS fusionado a un marcador (p. ej., una enzima, flúor, una proteína luminiscente,
o un colorante), o un dominio Fc de Ig.
Un método que detecta las interacciones de proteínas in vivo, el sistema de dos híbridos, se describe con detalle solamente como ilustración y no a modo de limitación. Un ejemplo de este sistema ha sido descrito (Chien et al., PNAS USA 88:9578 9582, 1991) y se encuentra disponible en el mercado en Clontech (Palo Alto, Calif.).
En resumen, utilizando semejante sistema, se pueden construir plásmidos que codifican dos proteínas híbridas: un plásmido consiste en nucleótidos que codifican el dominio de unión a ADN de una proteína activadora de la transcripción fusionada a una secuencia de nucleótidos de AARS de referencia (o, en ciertas realizaciones, su compañero de unión), o una variante de la misma, y el otro plásmido consiste en nucleótidos que codifican el dominio de activación de la proteína activadora de la transcripción fusionado a un ADNc (o una colección de ADNc) que codifica una o varias proteínas desconocidas que han sido recombinadas en el plásmido como parte de una biblioteca de ADNc. El plásmido de fusión del ADN-dominio de unión y la biblioteca de ADNc activador se pueden transformar en una cepa de la levadura Saccharomyces cerevisiae que contiene un gen informador (p. ej., HBS o lacZ) cuya región reguladora contiene el sitio de unión del activador de la transcripción. Cualquier proteína híbrida no puede activar la transcripción del gen informador: el híbrido de ADN-dominio de unión no puede porque no proporciona función de activación y el híbrido del dominio de activación no puede porque no puede localizar los sitios de unión del activador. La interacción de las dos proteínas híbridas reconstituye la proteína activadora funcional y da como resultado la expresión del gen informador, que es detectada por medio de un análisis para el producto génico del informador.
El sistema de dos híbridos u otra metodología semejante se pueden utilizar para escrutar las bibliotecas de dominios de activación para determinar las proteínas que interaccionan con el producto génico "cebo". A modo de ejemplo, y no de limitación, se puede utilizar un polipéptido de referencia de AARS o una variante como producto génico cebo. También se puede utilizar un compañero de unión de AARS como producto génico "cebo". Las secuencias genómicas o de ADNc totales se fusionan al ADN que codifica un dominio de activación. Esta biblioteca y un plásmido que codifica un híbrido de un producto génico de AARS cebo fusionado al dominio de unión a ADN se transforman simultáneamente en una cepa informadora de levadura, y los transformantes resultantes se escrutan para determinar aquellos que expresan el gen informador.
Se puede elaborar una biblioteca de ADNc de la línea celular de la cual se van a detectar las proteínas que interaccionan con los productos génicos de AARS cebo utilizando métodos rutinarios puestos en práctica en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos de ADNc se pueden insertar en un vector de manera que se fusionan traduccionalmente al dominio de activación transcripcional de GAL4. Esta biblioteca se puede transformar simultáneamente con el plásmido de fusión del gen cebo-GAL4 en una cepa de levadura, que contiene un gen lacZ dirigido por un promotor que contiene la secuencia de activación GAL4. Una proteína codificada por ADNc, fusionada al dominio de activación transcripcional GAL4, que interacciona con el producto génico cebo reconstituirá una proteína GAL4 activa y de ese modo dirigirá la expresión del gen HIS3. Las colonias, que expresan HIS3, se pueden detectar por medio de su crecimiento sobre placas Petri que contienen medios basados en agar semisólido carentes de histidina. El ADNc se puede purificar después a partir de estas cepas, y se puede utilizar para producir y aislar la proteína de interacción con el gen AARS cebo utilizando mecanismos rutinarios puestos en práctica en la técnica.
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Asimismo se describen en la presente memoria sistemas de tres híbridos, que permiten la detección de interacciones ARN-proteína en levaduras. Véase, p. ej., Hook et al., ARN. 11:227-233, 2005. Por consiguiente, se pueden utilizar estos métodos y métodos relacionados para identificar un compañero de unión celular de un polipéptido de AARS, y para identificar otras proteínas o ácidos nucleicos que interaccionan con el polipéptido de AARS, el compañero de unión celular, o ambos.
Como se ha indicado anteriormente, una vez aislados, los compañeros de unión pueden ser identificados y, a su vez, pueden ser utilizados junto con mecanismos convencionales para identificar proteínas u otros compuestos con los cuales interacciona. Ciertas realizaciones de la presente descripción se refieren por lo tanto a métodos de escrutinio de un compuesto que se une específicamente a un compañero de unión de un polipéptido de referencia de AARS, que comprenden a) combinar el compañero de unión con al menos un compuesto de ensayo en condiciones adecuadas, y b) detectar la unión del compañero de unión al compuesto de ensayo, identificando de ese modo un compuesto que se une específicamente al compañero de unión. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el compuesto de ensayo es un polipéptido. En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, el compuesto de ensayo es un compuesto químico, tal como un compuesto de molécula pequeña o un peptidomimético.
Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria incluyen métodos de escrutinio de un compuesto que modula la actividad de un polipéptido de AARS, que comprenden a) combinar el polipéptido con al menos un compuesto de ensayo en condiciones permisivas para la actividad del polipéptido, b) evaluar la actividad del polipéptido en presencia del compuesto de ensayo, y c) comparar la actividad del polipéptido en presencia del compuesto de ensayo con la actividad del polipéptido en ausencia del compuesto de ensayo, en donde un cambio en la actividad del polipéptido en presencia del compuesto de ensayo es indicativa de un compuesto que modula la actividad del polipéptido. Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria incluyen métodos de escrutinio de un compuesto que modula la actividad de un compañero de unión de un polipéptido de AARS, que comprenden a) combinar el polipéptido con al menos un compuesto de ensayo en condiciones permisivas para la actividad del compañero de unión, b) evaluar la actividad del compañero de unión en presencia del compuesto de ensayo, y c) comparar la actividad del compañero de unión en presencia del compuesto de ensayo con la actividad del compañero de unión en ausencia del compuesto de ensayo, en donde un cambio en la actividad del compañero de unión en presencia del compuesto de ensayo es indicativa de un compuesto que modula la actividad del compañero de unión. Típicamente, estas realizaciones y realizaciones relacionadas descritas en la presente memoria incluyen la evaluación de una actividad no canónica seleccionada que está asociada con un polipéptido de AARS o su compañero de unión. Se describen en la presente memoria las condiciones in vitro e in vivo, tales como las condiciones de cultivo celular.
Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria incluyen los métodos de escrutinio de un compuesto para determinar la eficacia como agonista total o parcial de un polipéptido de AARS o un fragmento activo o una variante del mismo, que comprenden a) exponer una muestra que comprende el polipéptido a un compuesto, y b) detectar la actividad agonística en la muestra, típicamente midiendo un incremento en la actividad no canónica del polipéptido de AARS. Ciertos métodos incluyen a) exponer una muestra que comprende un compañero de unión del polipéptido de AARS a un compuesto, y b) detectar la actividad agonística en la muestra, típicamente midiendo un incremento en la actividad no canónica seleccionada del polipéptido de AARS. Ciertas realizaciones de la presente descripción incluyen composiciones que comprenden un compuesto agonista identificado por el método y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptables.
Asimismo se describen en la presente memoria los métodos de escrutinio de un compuesto para determinar la eficacia como antagonista total o parcial de un polipéptido de AARS, que comprenden a) exponer una muestra que comprende el polipéptido a un compuesto, y b) detectar la actividad antagónica en la muestra, típicamente midiendo un descenso en la actividad no canónica del polipéptido de AARS. Ciertos métodos incluyen a) exponer una muestra que comprende un compañero de unión del polipéptido de AARS a un compuesto, y b) detectar la actividad antagónica en la muestra, típicamente midiendo un descenso en la actividad no canónica seleccionada del polipéptido de AARS. Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria incluyen composiciones que comprenden un compuesto antagónico identificado por el método y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptables.
En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, se pueden diseñar sistemas in vitro para identificar compuestos capaces de interaccionar con o modular una secuencia de referencia de AARS o su compañero de unión. Ciertos compuestos identificados por medio de tales sistemas pueden ser útiles, por ejemplo, en la modulación de la actividad de la ruta, y en la elaboración de los componentes de la propia ruta. Asimismo se pueden utilizar en escrutinios para identificar compuestos que interrumpen las interacciones entre los componentes de la ruta; o pueden interrumpir tales interacciones directamente. Un enfoque ilustrativo implica preparar una mezcla de reacción del polipéptido de AARS y un compuesto de ensayo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que los dos interaccionen y se unan, formando de ese modo un complejo que puede ser eliminado de y/o detectado en la mezcla de reacción
Los análisis de escrutinio in vitro se pueden llevar a cabo en una variedad de formas. Por ejemplo, un polipéptido de AARS, un compañero de unión celular, o uno o varios compuestos de ensayo se pueden anclar sobre una fase
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