ES2552343T3 - Un procedimiento para el análisis de cromosomas de células - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de análisis de la información cromosómica de las células muestra, que incluye las etapas de: romper al azar un genoma de ADN de las células muestra para obtener fragmentos de ADN de un tamaño determinado; secuenciar los fragmentos de ADN para obtener secuencias de ADN; alinear estrictamente las secuencias de ADN resultantes contra una secuencia de referencia del genoma humano para obtener información sobre la ubicación de las secuencias de ADN en los cromosomas específicos; determinar un número total de secuencias de ADN resultantes que se encuentran en regiones únicas en un cromosoma N particular; calcular un valor del % de CrN para el cromosoma N, en el que % de CrN >= el número total de secuencias de ADN resultantes situadas en las regiones únicas en el cromosoma N / un número total de secuencias de ADN resultantes situadas en regiones únicas en todos los cromosomas; y determinar si existe una diferencia entre el número de cromosomas en las células muestra y el número de cromosomas en las células estándar en base al valor calculado de % de CN y un valor de referencia de % de CrN para las células estándar, en el que la determinación se realiza mediante la comparación de una "puntuación z_CrN" contra un valor de referencia Z, en el que la puntuación z CrN >= (el % de CrN calculado de las células muestra - un valor medio del % de CrN ) / una desviación estándar del % de CrN, el valor medio del % de CrN determinado en base al % de CrN para al menos 10 muestras de células estándar y la desviación estándar del % de CrN determinada en base a un valor medio de los valores medios del % de CrN para al menos 10 muestras de celulares estándar, en el que el valor de referencia Z >= (media de % de CrN × 0,5 × % X) / desviación estándar de % de CrN, siendo X un número entero entre -100 y 100 ambos incluidos, y En el que un valor absoluto de la puntuación z_CrN es mayor que o igual a 3 y alcanza un valor absoluto del valor de referencia Z, se determina que hay una diferencia del % de X entre el número de cromosomas en las células muestra y el de las células estándar.
Description
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La figura 1 muestra un diagrama de caja representado de conformidad con 53 muestras celulares de detección, en la que la abscisa representa el número de cromosomas, y la ordenada representa el valor de % CrN.
La Figura 1A muestra los cromosomas 1-6, la figura 1B muestra los cromosomas 7 – 12, la figura 1C muestra los cromosomas 13-17, y la figura 1D muestra los cromosomas 18-22.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La forma de realización de la invención se describirá con detalle en combinación con los siguientes ejemplos. Una persona experta en la técnica apreciará, sin embargo, que los siguientes ejemplos son meramente con la intención de hacer una descripción de la invención y no se considerarían como la limitación del alcance de la invención. Si las condiciones específicas no están especificadas en los ejemplos, estos ejemplos se realizan de acuerdo con las condiciones de uso habitual o con las recomendadas por los fabricantes. Si no se especifican las fuentes de los reactivos o equipos o instrumentos utilizados en la invención, tales como sus fabricantes, todos ellos están disponibles comercialmente. Los conectores utilizados para la secuenciación y el índice de secuencias marcadas proceden del kit Multiplexing Sample Preparation Oligonutide Kit proporcionado por Illumina.
En los siguientes paréntesis está el número de producto de los fabricantes para cada uno de los reactivos o kits.
Ejemplo 1: Análisis cromosómico de células amnióticas no cultivadas
1. Aislamiento y secuenciación de ADN
El ADN de las células amnióticas se aisló de acuerdo con el procedimiento de manipulación de una pequeña cantidad de genoma de Tiangen Micro Kit (DP316) y se cuantificó con Qubit (Invitrogen, el Kit Quant–iT™ dsDNA HS Assay). La cantidad total de ADN aislado varió de 100 ng a 500 ng.
El ADN aislado era o todo el ADN genómico o ADN de tipo frotis degradado parcialmente. Se construyó una biblioteca de ADN conforme al procedimiento estándar de creación de bibliotecas proporcionada por el Illumina / Solexa modificado. Se añadieron adaptadores en ambos extremos de las moléculas de ADN rotas al azar y se unieron con diferentes índices de secuencia marcados. A continuación, estas moléculas se hibridaron con adaptadores complementarios en la superficie de una célula de flujo, y se dejaron agrupar en condiciones particulares. Se llevaron a cabo 36 ciclos de secuenciación en un analizador Illumina Genome Analyzer II, produciendo fragmentos de ADN con 35 pb.
Específicamente, se utilizó Diagenode Bioruptor para romper al azar aproximadamente 100-500ng de ADN aislado de células amnióticas en fragmentos de 300 pb. 100-500ng del ADN roto inicialmente se utilizaron para construir una biblioteca bajo Illumina / Solexa. Véase en la técnica anterior el un procedimiento detallado (manual de Illumina / Solexa para la creación de la biblioteca estándar proporcionado por http://www.illumina.com/). El tamaño de la biblioteca de ADN se determinó por medio del 2100 Bioanalyzer (Agilent) y los fragmentos insertados fueron de 300 pb. Después de la cuantificación exacta mediante QPCR, se realizó la secuenciación.
En el ejemplo, la secuenciación por lotes se realizó en 53 muestras de ADN aisladas de las células amnióticas de acuerdo a Cluster Station and GA II x (SE sequencing) publicados oficialmente por Illumina / Solexa.
2. Alineación y estadística
Consúltese en la técnica anterior (véase el procedimiento Pipeline relativo al manual proporcionado en http://www. illumina. com/), la información sobre secuencias obtenida en la etapa 1 se sometió a un solo proceso Pipeline y se eliminaron las secuencias con baja calidad, lo que en última instancia tuvo como resultado un resultado de la alineación de ELAND contra la secuencia de referencia del genoma humano de NCBI versión 36. A continuación, se analizó estadísticamente el número de las secuencias únicas localizadas en los cromosomas.
Se calculó el % de CrN para 22 cromosomas y los cromosomas X / Y, respectivamente, de 53 muestras y un diagrama de caja (ver figura 2) se ha elaborado en base a los datos El % de CrN para un cromosoma N particular en una muestra concreta M se calcula con la fórmula siguiente:
Porcentaje e un cromosoma particular en la muestra de detección M, el % de CrN= número total de las secuencias únicas contenidas en la muestra M y localizadas en el correspondiente cromosoma de la secuencia de referencia a través del alineamiento (81)/el número total de las secuencias únicas contenidas en la muestra M y localizadas en todos los cromosomas de la secuencia de referencia mediante alineación (82).
3. Análisis de datos
De acuerdo con el diagrama de caja dibujado en la etapa 2, primero se determinó si existía un valor atípico. Es decir, en comparación con los límites superior e inferior, si se una muestra sospechosa se ha desviado lejos del punto que
Por otra parte, con el fin de examinar si existía el caso de medio o un cromosoma más en las muestras sospechosas, se asignó a X un valor de 50 o 100 y se calculó el correspondiente valor de referencia cromosómica Z (valor de corte) (véase la tabla 2):
Z = (media_% Cr N x 0,5 x % X) / S.D._% Cr N, en la que N representa los cromosomas 1 ~ 22, X es 50 o 100.
Tabla 2: Determinación del valor de referencia Z (valor de corte) para trisomía en las células de detección
- Número de cromosoma
- media_% CrN S.D._% CrN Valor de referencia Z
- por encima del 50 %
- por encima del 100 %
- Cr1
- 7,9307295 0,1159668 17,0969881 34,1939762
- Cr2
- 9,0408152 0,1458970 15,4917815 30,9835629
- Cr3
- 7,3394728 0,1633916 11,2298783 22,4597567
- Cr4
- 6,8980316 0,3000703 5,7470125 11,4940249
- Cr5
- 6,6213096 0,1717845 9,6360687 19,2721373
- Cr6
- 6,3996516 0,1482759 10,7901077 21,5802154
- Cr7
- 5,4613809 0,0819567 16,6593481 33,3186962
- Cr8
- 5,2953272 0,0912159 14,5131676 29,0263351
- Cr9
- 4,0009382 0,0572472 17,4721938 34,9443876
- Cr10
- 4,8192433 0,0693516 17,3725054 34,7450108
- Cr11
- 4,6436180 0,0780559 14,8727280 29,7454561
- Cr12
- 4,6690652 0,0647597 18,0245772 36,0491544
- Cr13
- 3,7325287 0,1346539 6,9298575 13,8597151
- Cr14
- 3,2568057 0,0398485 20,4324240 40,8648480
- Cr15
- 2,8578247 0,0553827 12,9003599 25,8007199
- Cr16
- 2,5948409 0,1465308 4,4271266 8,8542531
- Cr17
- 2,6442999 0,1753843 3,7692929 7,5385857
- Cr18
- 2,9780305 0,0598664 12,4361514 24,8723027
- Cr19
- 1,4242524 0,1868697 1,9054083 3,8108167
- Cr20
- 2,1171964 0,0985564 5,3705200 10,7410400
- Cr21
- 1,2858576 0,0205784 15,6214179 31,2428358
- Cr22
- 1,0872769 0,1204085 2,2574758 4,5149516
- CrX-M
- 4,1819271 0,0615940 –16,9737663 –33,9475326
- CrY–M
- 0,0034667 0,0006359 / /
- CrX–V
- 2,1387665 0,0545815 9,7962061 19,5924123
- CrY–V
- 0,1207910 0,0055482 5,4468013 10,8856025
La puntuación z_CrN para cada cromosoma en las muestras sospechosas se calculó con la siguiente fórmula:
Tabla 3: Puntuación z_CrN para cada cromosoma en las muestras sospechosas
- Número de cromosoma
- Media SD PI P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
- Cr1
- 7,931 0,116 –1,566 0,349 –0,274 2,466 –0,537 –0,733 –0,028 –2,100
- Ch2
- 9,041 0,146 –0,843 0,799 –1,326 –1,063 –0,771 –0,605 –0,341 –0,856
- Cr3
- 7,339 0,163 –0,487 0,498 –1,781 –0,924 –0,346 –0,394 0,256 0,129
- Cr4
- 6,898 0,300 0,238 0,988 –1,045 –1,548 –0,469 –0,177 0,151 0,774
- Cr5
- 6,621 0,172 –0,726 –0,122 –1,514 –1,370 –0,522 –0,501 –0,137 –0,071
- Cr6
- 6,400 0,148 –0,572 0,174 –0,929 –1,521 –0,509 –0,181 –0,281 –0,172
- Cr7
- 5,461 0,082 –0,582 –0,312 –1,889 –1,166 –0,674 0,073 –0,292 –1,247
- Cr8
- 5,295 0,091 –0,618 0,492 –2,122 –2,192 –0,863 –0,406 –1,501 –0,336
- Cr9
- 4,001 0,057 –1,659 0,700 0,747 –2,107 –0,038 –0,916 –0,546 –1,032
- Cr10
- 4,819 0,069 –0,644 –0,051 –0,385 0,131 –0,174 –0,849 –0,997 –0,712
- Cr11
- 4,644 0,078 –2,056 –0,749 –0,513 1,071 –0,147 –0,764 –1,099 –2,300
- Cr12
- 4,669 0,065 –1,121 –0,489 –1,854 –2,140 –0,616 –0,562 –0,137 –0,682
- Cr13
- 3,733 0,135 –0,163 0,544 –1,460 –2,573 –0,515 –0,102 0,514 7,393
- Cr14
- 3,257 0,040 –1,301 –1,548 –1,184 –1,124 –0,268 –1,574 –0,683 –0,763
- Cr15
- 2,858 0,055 –1,966 –1,048 –0,421 0,865 0,465 0,044 1,002 –0,542
- Cr16
- 2,595 0,147 –0,963 –0,739 0,305 0,779 –0,096 –0,336 –0,405 –1,787
- Cr17
- 2,644 0,175 –0,913 –0,766 0,394 0,846 0,278 –0,236 –0,561 –1,736
- Cr18
- 2,978 0,060 –0,111 0,506 –2,574 –0,127 23,853 26,141 24,438 –0,951
- Cr19
- 1,424 0,187 –0,586 –0,664 0,660 0,340 0,191 –0,141 –0,608 –1,489
- Cr20
- 2,117 0,099 –0,907 –0,697 0,211 0,210 –0,002 –0,018 –0,659 –0,023
- Cr21
- 1,286 0,021 27,203 31,507 29,820 21,831 –0,305 –1,262 –0,729 –0,750
- Cr22
- 1,087 0,120 –0,604 –0,743 0,616 0,747 –0,026 –0,220 –0,467 –1,310
- CrX–V
- 2,139 0,055 / 0,650 / / –0,967 –0,678 –1,963 /
- CrY–V
- 0,121 0,006 / –1,117 / / –0,551 0,215 –0,197 /
- CrXM
- 4,182 0,062 –1,347 / –1,428 –2,272 / / / 0,700
- CrY–M
- 0,003 0,001 0,881 / –0,741 0,616 / / / –0,303
Como se muestra en el análisis anterior, las muestras sospechosas fueron 8 en total entre las 53 muestras de
5 detección de células amnióticas, en el que, para los cromosomas en cada una de las muestras sospechosas, se detectaron 8 anomalías del número de cromosoma con el valor absoluto de una puntuación z_CrN mayor de 3 fueron detectados (véase la tabla 3). En concreto, fueron los siguientes:
1) Cr21 para P1, Cr21 para P2, Ch21 para P3, y Cr21 para P4; 2) Ch18 para P5,Cr18 para P6, y Cr18 para P7; y
10 3) Cr13 para P8.
Mediante la comprobación del valor Z obtenida cuando X = 100 en la Tabla 2 se determinó que el número de cromosoma 21 en las muestras P1-P4 y el número del cromosoma 18 en las muestras P5-P7 era uno más que el número de cromosomas correspondientes en las células estándar, respectivamente, y el número del cromosoma 13 en P8 era medio más que el número de cromosomas correspondiente en las células estándar. Es decir, P1-P4
15 fueron T21 (síndrome de Down), y P5-P7 fueron T18 (síndrome de Edwards) y P8 fue T13 mosaico (síndrome del mosaico de Patau). Los resultados eran completamente coherentes con los resultados del análisis tradicional del cariotipo cromosómico.
6 muestras adicionales (Q1-Q6) de células amnióticas se trataron y se secuenciaron de la misma forma que el anterior para producir los datos para el análisis. La puntuación z_CrN se calculó en la media_% CrN y S.D. _% CrN de 30 muestras celulares estándar en el ejemplo 1. Se identificaron 3 muestras positivas en las 6 muestras.
Tabla 4: El % de CrN se 6 muestras de detección (Q1–Q6)
- Q1
- Q2 Q3 Q4 Q5 Q6
- Cr1 %
- 7,900099 7,781541 7,965013 7,937310 7,835625 7,756449
- Cr2 %
- 9,195581 8,969471 8,998068 9,137041 8,836921 9,014913
- Cr3 %
- 7,389485 7,365766 7,389563 7,452117 7,134356 7,378118
- Cr4 %
- 7,090694 7,005976 6,921334 7,112517 6,510565 7,058824
- Cr5 %
- 6,759707 6,600836 6,604984 6,768853 6,357255 6,605637
- Cr6 %
- 6,541994 6,468799 6,461957 6,545516 6,170975 6,376054
- Cr7 %
- 5,562187 5,423140 5,522745 5,521768 5,342112 5,403700
- Cr8 %
- 5,387074 5,344078 5,357094 5,318220 5,176933 5,275211
- Cr9 %
- 3,946516 3,924984 4,061791 4,037918 4,007161 3,958868
- Cr10 %
- 4,831699 4,680082 4,876470 4,845395 4,798439 4,700673
- Cr11 %
- 4,634992 4,541423 4,682686 4,637077 4,603257 4,462601
- Cr12 %
- 4,727456 4,552861 4,734034 4,700509 4,571935 4,594756
- Cr13 %
- 3,871131 3,749202 3,677764 3,875716 3,475357 3,776552
- Cr14 %
- 3,261377 3,247342 3,285671 3,281681 3,238633 3,207609
- Cr15 %
- 2,875226 2,782605 2,926826 2,866104 2,830466 2,757703
- Cr16 %
- 2,516559 2,443884 2,624248 2,524383 2,665946 2,413713
- Cr17 %
- 2,519897 2,481007 2,684055 2,561488 2,725292 2,495129
- Cr18 %
- 3,026389 2,939323 3,027751 2,994205 2,893438 2,985936
- Cr19 %
- 1,291162 1,240504 1,479644 1,317938 1,482326 1,235699
- Cr20 %
- 2,096249 2,063225 2,174512 2,076472 2,173705 2,049467
- Cr21 %
- 1,290966 1,267192 1,297270 1,291611 1,896099 1,297050
- Cr22 %
- 0,992960 0,989674 1,125718 1,017386 1,164497 0,995698
- CrX %
- 2,173990 4,134076 2,117655 2,177186 4,104752 4,197133
- CrY %
- 0,116611 0,003010 0,003148 0,001590 0,003956 0,002508
Tabla 5: La puntuación z_CrN para 6 muestras calculada a partir de la media–% Cr N y la S.D. _% Cr N de 30 muestras negativas en el ejemplo 1
- Número de cromosoma
- media SD Q1 Q2 Q3 Q4 Q5 Q6
- Cr1
- 7,9310 0,1160 –0,2664 –1,2884 0,2932 0,0544 –0,8222 –1,5048
- Cr2
- 9,0410 0,1460 1,0588 –0,4899 –0,2941 0,6578 –1,3978 –0,1787
- Cr3
- 7,3390 0,1630 0,3097 0,1642 0,3102 0,6940 –1,2555 0,2400
- Cr4
- 6,8980 0,3000 0,6423 0,3599 0,0778 0,7151 –1,2914 0,5361
- Cr5
- 6,6210 0,1720 0,8064 –0,1172 –0,0931 0,8596 –1,5334 –0,0893
- Cr6
- 6,4000 0,1480 0,9594 0,4649 0,4186 0,9832 –1,5475 –0,1618
- Cr7
- 5,4610 0,0820 1,2340 –0,4617 0,7530 0,7411 –1,4499 –0,6988
- Cr8
- 5,2950 0,0910 1,0118 0,5393 0,6823 0,2552 –1,2974 –0,2175
(continuación)
- Número de cromosoma
- media SD Q1 Q2 Q3 Q4 Q5 Q6
- Cr9
- 4,0010 0,0570 –0,9559 –1,3336 1,0665 0,6477 0,1081 –0,7392
- Cr10
- 4,8190 0,0690 0,1840 –2,0133 0,8329 0,3825 –0,2980 –1,7149
- Cr11
- 4,6440 0,0780 –0,1155 –1,3151 0,4960 –0,0888 –0,5223 –2,3256
- Cr12
- 4,6690 0,0650 0,8993 –1,7868 1,0005 0,4848 –1,4933 –1,1422
- Cr13
- 3,7330 0,1350 1,0232 0,1200 –0,4092 1,0572 –1,9085 0,3226
- Cr14
- 3,2570 0,0400 0,1094 –0,2414 0,7168 0,6170 –0,4592 –1,2348
- Cr15
- 2,8580 0,0550 0,3132 –1,3708 1,2514 0,1473 –0,5006 –1,8236
- Cr16
- 2,5950 0,1470 –0,5336 –1,0280 0,1990 –0,4804 0,4826 –1,2332
- Cr17
- 2,6440 0,1750 –0,7092 –0,9314 0,2289 –0,4715 0,4645 –0,8507
- Cr18
- 2,9780 0,0600 0,8065 –0,6446 0,8292 0,2701 –1,4094 0,1323
- Cr19
- 1,4240 0,1870 –0,7104 –0,9813 0,2976 –0,5672 0,3119 –1,0070
- Cr20
- 2,1170 0,0990 –0,2096 –0,5432 0,5809 –0,4094 0,5728 –0,6822
- Cr21
- 1,2860 0,0210 0,2365 –0,8956 0,5367 0,2672 29,0523 0,5262
- Cr22
- 1,0870 0,1200 –0,7837 –0,8111 0,3226 –0,5801 0,6458 –0,7609
- CrX–V
- 2,1390 0,0550 0,6362 / –0,3881 0,6943 / /
- CrY–M
- 0,1210 0,0060 –0,7315 / –19,6420 –19,9016 / /
- CrX–V
- 4,1820 0,0620 / –0,7730 –33,2958 –32,3357 –1,2459 0,2441
- CrY–V
- 0,0030 0,0010 / 0,0100 –1,4100 –1,41/ 0,9564 –0,4919
Como se ve por los resultados, Q5 tenía una copia extra del cromosoma 21 en comparación con las células estándar, que era T21; Q3, Q4 carecían de una copia del cromosoma X, que era 45XO (síndrome de Turner). Los resultados eran completamente coherentes con los resultados del análisis tradicional del cariotipo cromosómico.
Aunque los ejemplos de la invención se han descrito con gran detalle, un experto en la técnica comprenderá que, de acuerdo con todas las enseñanzas divulgadas pueden realizarse diversas modificaciones y sustituciones de esos detalles. Todo el alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.
Claims (1)
-
imagen1
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