ES2541921T3 - Proteínas mutantes de la proteína F de PIV-5 y de PIV-2 - Google Patents
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Abstract
Proteína mutante, cuya secuencia en aminoácidos comprende una secuencia que difiere de la de la proteína F de un virus PIV-5 o PIV-2: - por sustitución: - del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 22, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 24, por el aminoácido P, y - del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 132, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 133, por el aminoácido E, y - del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 290, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 294, por el aminoácido A, y - del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 449, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 439, por el aminoácido P, - y, opcionalmente: - por sustitución del sitio de escisión nativo de dicha proteína F por otro sitio de escisión enzimático, y/o por inserción en dicha proteína F de un sitio de escisión enzimático diferente del sitio de escisión nativo de esta proteína F, y/o - por supresión de una parte C-terminal de dicha proteína F, extendiéndose dicha parte C-terminal en dirección Nterminal a partir del último aminoácido en el extremo C-terminal de la proteína, pero sin extenderse más allá del dominio HR2 de dicha proteína F, la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5 o PIV-2 que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 34.
Description
E09784341
08-07-2015
- Cepa
- aa
- W3A (SEC ID NO: 35)
- WR (SEC ID NO: 31) MIL (SEC ID NO: 36) DEN (SEC ID NO: 37) LN (SEC ID NO: 38) MEL (SEC ID NO: 39) Criptovirus (SEC ID NO: 40) CPI+ (SEC ID NO: 41) CPI(SEC ID NO: 42) H221 (SEC ID NO: 43) 78524 (SEC ID NO: 44) T1 (SEC ID NO: 45) SER (SEC ID NO: 46)
- S
- P P 71
- V
- M 76
- N
- Y Y Y 92
- E
- K K K K K K 132
- A
- T 134
- A
- V V V 135
- A
- T 149
- V
- I 176
- I
- M 271
- T
- A 279
- A
- V 290
- T
- K K 307
- M
- I I I I I I I 310
- M
- R 346
- L
- F 366
- V
- M 370
- Y
- F F 377
- M
- I I 407
- Y
- H H H 408
- N
- D 417
- F
- L L 420
- V
- I 428
- S
- T T T T T T T 438
- S
- P P P P P P P P P P P P 443
- H
- N N 451
- I
- M 489
- L
- F F F F 498
- L
- S S 500
- V
- A A 507
- K
- R R 510
- V
- A A A A A A A A A A A T 516
- K
- N N N N N N N N N N N 529
- Stop
- Stop
- Q S S S S S S S 530
- H
- Y Y 533
- S
- Stop P 535
- Q
- R R R R R R R 536
- aa: posición del aminoácido
En la tabla anterior, una casilla vacía indica que la proteína F en cuestión presenta el mismo aminoácido que la proteína F de la cepa W3A indicada en la columna de la izquierda.
5 Los aminoácidos cuyas posiciones no están expresamente listadas en esta tabla son por supuesto idénticos a los que les corresponden en la secuencia de la proteína F de W3A. Estos aminoácidos son en sí mismos idénticos a los que les corresponden en la secuencia de la proteína F del aislado WR (véase la secuencia de la SEC ID NO: 31).
Así, las secuencias de SEC ID NO: 35 a 46 son las secuencias que resultan de la sustitución en la secuencia de la 10 SEC ID NO: 31 de los aminoácidos indicados en la tabla 1 para cada una de estas secuencias (y, llegado el caso, de
la adición de la secuencia de la SEC ID NO: 31 de los aminoácidos indicados en la parte C-terminal).
La proteína F del aislado W3A, así como la de los otros aislados anteriormente mencionados, presenta:
15 -en la posición 147, el aminoácido T,
-en la posición 158, el aminoácido T,
-en la posición 447, el aminoácido L, y
-en la posición 449, el aminoácido I.
20 Se observa así que los aislados W3A y WR no presentan la extensión citoplásmica que, en los otros aislados, se
extiende más allá de la posición 529. Según el aislado en cuestión, esta extensión citoplásmica contiene de dos a
siete aminoácidos.
Se observa también que las secuencias de las proteínas F de estos aislados varían de menos del 5% (más 25 particularmente, de como máximo el 3%) con respecto a la secuencia de la proteína F de la cepa WR (sin tener en
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▪ eventualmente seguida de 18 aminoácidos en el extremo C-terminal, más particularmente de los aminoácidos ENPAFFSKNNHGNIYGIS en el extremo C-terminal, o
b) una secuencia variante de la secuencia descrita en a) anteriormente, siendo dicha secuencia variante:
▪ o bien:
i. de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 31 o inferior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31 o superior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31, preferiblemente de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 31 o superior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31, y
ii. que presenta una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 31 o a dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443" (siendo esta identidad calculada sobre la longitud de la secuencia de la SEC ID NO: 31 o, llegado el caso, de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443");
▪ o bien:
i. de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 33 o inferior en un máximo de dos aminoácidos al de la SEC ID NO: 33
o superior en un máximo de dos aminoácidos al de la SEC ID NO: 33, preferiblemente de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 33, y
ii. que presenta una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 33 (siendo esta identidad calculada sobre la longitud de la secuencia de la SEC ID NO: 33).
Proteínas mutantes de la invención:
La presente solicitud se refiere a una proteína mutante, cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que es susceptible de derivar de la de la proteína F de un virus PIV-5 o PIV-2:
-por sustitución:
-del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 22, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 24, por el aminoácido P (mutación 22P en F de PIV-5; mutación 24P en F de PIV-2), y
-del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 132, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 133 (mutación 132E en F de PIV-5; mutación 133E en F de PIV-2), por el aminoácido E, y
-del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 290, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 294, por el aminoácido A (mutación 290A en F de PIV-5; mutación 294A en F de PIV-2), y
-del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 449, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 439, por el aminoácido P(mutación 449P en F de PIV-5; mutación 439P en F de PIV-2),
-y, opcionalmente:
-por sustitución del sitio de escisión nativo (o natural) de dicha proteína F por otro sitio de escisión enzimática, y/o por inserción en dicha proteína F de un sitio de escisión enzimático diferente del sitio de escisión nativo (o natural) de esta proteína F, y/o
-por supresión de una parte C-terminal de dicha proteína F, extendiéndose dicha parte C-terminal en dirección Nterminal a partir del último aminoácido en el extremo C-terminal de la proteína, pero sin extenderse más allá del dominio HR2 de dicha proteína F.
Dichas posiciones de aminoácidos se calculan con respecto a la secuencia de la forma precursora (F0) de dicha proteína F (es decir la secuencia de la proteína F antes de la escisión), contando las posiciones del extremo Nterminal hacia el extremo C-terminal.
Las posiciones indicadas en la proteína F de PIV-2 son las posiciones que corresponden a las indicadas en la proteína F de PIV-5: véase la figura 2B, que da la tabla de las correspondencias de posiciones.
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La secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5 o PIV-2 es tal como se ha definido anteriormente. Por lo tanto, se puede definir como que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 34 (secuencia consenso de las proteínas F de PIV-5 y PIV-2).
Proteína mutante de la proteína F de PIV-5:
Según un aspecto de la invención, una proteína mutante de la invención comprende una secuencia que es susceptible de derivar de la de la proteína F de un virus PIV-5.
La secuencia de dicha proteína F de PIV-5 es tal como se ha definido anteriormente. Puede consistir en particular en:
-la secuencia de la SEC ID NO: 31 (secuencia de la proteína F del aislado WR de PIV-5 presentada en la figura 1A),
o de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", o en
-una secuencia variante de esta secuencia de la SEC ID NO: 31 o de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", esta secuencia variante:
- *
- es de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 31 (es decir que consiste en 529 aminoácidos), o es de un tamaño superior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31 (es decir que consiste en 530, 531, 532, 533, 534, 535 o 536 aminoácidos), o es de un tamaño inferior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31 (es decir que consiste en 522, 523, 524, 525, 526, 527 o 528 aminoácidos), y
- *
- presenta una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 31 o a dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", siendo esta identidad calculada sobre la longitud de la secuencia de la SEC ID NO: 31 o (llegado el caso) de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443".
Preferentemente, la secuencia de dicha proteína F de PIV-5 consiste en:
-la secuencia de la SEC ID NO: 31 (secuencia de la proteína F del aislado WR de PIV-5 presentada en la figura 1A),
o dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", o en
-una secuencia variante de esta secuencia de la SEC ID NO: 31 o de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", esta secuencia variante:
- *
- es de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 31 (es decir que consiste en 529 aminoácidos), o es de un tamaño superior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31 (es decir que consiste en 530, 531, 532, 533, 534, 535 o 536 aminoácidos), y
- *
- presenta una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 31 o a dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", siendo esta identidad calculada sobre la longitud de la secuencia de la SEC ID NO: 31, o, llegado el caso, de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443".
Unos ejemplos de tales secuencias variantes comprenden en particular la secuencia de la proteína F de uno de los aislados W3A, MIL, DEN, LN, MEL, Criptovirus, CPI+, CPI-, H221, 78524, T1 y SER presentada en la tabla 1 en la presente solicitud (véase anteriormente), es decir en una de las secuencias de la SEC ID NO: 35 a 46.
Preferentemente, la secuencia de dicha proteína F de PIV-5 consiste en la secuencia de la SEC ID NO: 31 (secuencia de la proteína F del aislado WR de PIV-5 presentada en la figura 1A), o en dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", muy preferiblemente en dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443".
Dicha secuencia susceptible de derivar de la de la proteína F de PIV-5 puede no comprender mutación diferente que las mutaciones 22P, 132E, 290A, 449P mencionadas antes, con respecto a dicha secuencia de la proteína F de PIV
5. Es el caso en particular de la secuencia de la SEC ID NO: 65 (Fus8).
Alternativamente, dicha secuencia susceptible de derivar de la de la proteína F de PIV-5 puede ser susceptible de derivar de esta secuencia de la proteína F por dichas mutaciones 22P, 132E, 290A, 449P mencionadas antes y por al menos una mutación diferente de estas mutaciones 22P, 132E, 290A, 449P mencionadas antes, preferiblemente por:
-al menos una mutación de pre-fusión seleccionada de entre:
-la sustitución del aminoácido en la posición 49 por el aminoácido A, -la sustitución del aminoácido en la posición 402 por el aminoácido A,
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-la sustitución del aminoácido en la posición 147 por un aminoácido hidrófobo, -la sustitución del aminoácido en la posición 158 por un aminoácido hidrófobo.
Tal secuencia susceptible de derivar de la de dicha proteína F puede ser en particular una secuencia seleccionada 5 de entre las secuencias de SEC ID NO: 68, 69, 70 (Fus10.4, Fus10.5, Fus 11, respectivamente); véase la tabla 4 más adelante.
Preferentemente, dicha secuencia, que es susceptible de derivar de la de dicha proteína F de PIV-5, es susceptible de derivar de esta secuencia de la proteína F por dichas mutaciones 22P, 132E, 290A, 449P mencionadas antes, y 10 por las dos mutaciones de post-fusión, es decir por:
-la sustitución del aminoácido en la posición 147 por un aminoácido hidrófobo, -la sustitución del aminoácido en la posición 158 por un aminoácido hidrófobo.
15 Tal secuencia susceptible de derivar de la de dicha proteína F puede ser en particular una secuencia seleccionada de entre les secuencias de SEC ID NO: 76, 78 (Fus8.7, Fus10.2, respectivamente); véase la tabla 4 más adelante.
Tabla 4: selección de las proteínas mutantes de la invención (proteínas mutantes de la proteína F de PIV-5)
- N° de Fus
- Resultado de fusión (véase la figura 6B) SEC ID NO: Mutación(es) adicional(es) además de las tres mutaciones de autonomía (22P, 132E, 290A) y de la mutación de pre-fusión 449P
- Pre-fusión
- Post-fusión
- 8
- Aproximadamente 7 65 - -
- 10
- Aproximadamente 6 67 49ª -
- 10.4
- Aproximadamente 7 68 402A 147V, 158V, 463V
- 10.5
- Aproximadamente 7,5 69 49A, 402A 147V, 158V, 463V
- 11
- Aproximadamente 7,5 70 402A -
- 8.1
- Aproximadamente 6,5 71 - 147V
- 8.2
- Aproximadamente 6,5 72 - 158V
- 8.4
- Aproximadamente 7,5 73 147V, 158V
- 8.5
- Aproximadamente 6,5 74 147V,463V
- 8.6
- Aproximadamente 6 75 158V,463V
- 8.7
- Aproximadamente 9 76 147V, 158V, 463V
- 10.1
- Aproximadamente 5 77 158V
- 10.2
- Aproximadamente 7 78 147V, 158V
- 10.3
- Aproximadamente 6,5 79 147V, 158V, 463V
20 Las mutaciones indicadas en la tabla 4 se pueden introducir en la proteína F de cualquier aislado PIV-5, es decir del aislado WR o de un aislado variante.
Por lo tanto, se pueden introducir más particularmente en la secuencia de la proteína F de la SEC ID NO: 31 25 presentada en la figura 1A (proteína F de WR disponible en la base de datos de Genbank bajo el número AB021962).
Como se ha indicado anteriormente, la muestra del aislado WR que los inventores han recibido de ATCC y que han utilizado para la construcción y la producción de las proteínas mutantes descritas en los ejemplos siguientes no
30 presentaba sin embargo el aminoácido P en la posición 443 de la proteína F (contrariamente a lo que se esperaba a la vista de la secuencia disponible en Genbank), sino el aminoácido S. Las mutaciones indicadas en la tabla 4 pueden por lo tanto ser introducidas en dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443" (SEC ID NO: 65, 67 a 79).
35 Proteína mutante de la proteína F de PIV-2:
Según otro aspecto de la invención, une proteína mutante de la invención comprende una secuencia que es susceptible de derivar de la de la proteína F de un virus PIV-2.
40 La secuencia de dicha proteína F de PIV-2 es tal como se ha definido anteriormente. Puede consistir en particular en:
-la secuencia de la SEC ID NO: 33 (secuencia de la proteína F del aislado Greer de PIV-2 presentada en la figura 1B), o en 45 -una secuencia variante de esta secuencia de la SEC ID NO: 33, esta secuencia variante:
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Preferentemente, dicha secuencia, que es susceptible de derivar de la de dicha proteína F, deriva de esta secuencia de la proteína F por dichas mutaciones 24P, 133E, 294A, 439P mencionadas anteriormente y por las dos mutaciones de post-fusión, es decir por:
5 -la sustitución del aminoácido en la posición 151 por un aminoácido hidrófobo, -la sustitución del aminoácido en la posición 162 por un aminoácido hidrófobo.
Este es por ejemplo el caso de la proteína mutante que comprende una de las secuencias de las SEC ID NO: 92, 93, 97, 100, 102, 103 (o que consiste en una de estas secuencias).
10 La presente solicitud se refiere más particularmente a las proteínas mutantes de la proteína F de PIV-2 que corresponden a las presentadas en la tabla 4 anterior para PIV-5, teniendo en cuenta que, como se indica en la figura 2B:
15 -la mutación 49A de F PIV-5 corresponde a la mutación 53A en F PIV-2, -la mutación 402A de F PIV-5 corresponde a 406A en F PIV-2, -la mutación 147V de F PIV-5 corresponde a 151V en F HIV-2, -la mutación 158V de F PIV-5 corresponde a 162V en F PIV-2, -la mutación 463V de F PIV-5 corresponde a 474V en F PIV-2.
20 Tabla 5: selección de las proteínas mutantes de la invención (proteínas mutantes de la proteína F de PIV-2)
- SEC ID NO:
- Mutación(es) adicional(es) además de las tres mutaciones de autonomía (24P, 133E, 294A) y de la mutación de pre-fusión 439P
- Pre-fusión
- Post-fusión
- 90
- - -
- 91
- 53A -
- 92
- 406A 151V, 162V, 474V
- 93
- 53A, 406A 151V, 162V, 474V
- 94
- 406A -
- 95
- - 151V
- 96
- - 162V
- 97
- 151V, 162V
- 98
- 151V, 474V
- 99
- 162V, 474V
- 100
- 151V, 162V, 474V
- 101
- 162V
- 102
- 151V, 162V
- 103
- 151V, 162V, 474V
La mutaciones indicadas en la tabla 5 se pueden introducir en la proteína F de cualquier aislado PIV-2, es decir del 25 aislado Greer o de un aislado variante. Por lo tanto, pueden ser más particularmente introducidas en la secuencia de la proteína F de la SEC ID NO: 33 presentada en la figura 1B (proteína F de Greer; SEC ID NO: 90 a 103).
Sitio de escisión:
30 Conforme a la presente invención, una proteína mutante de la invención puede comprender una secuencia que es susceptible de derivar de la de la proteína F de un virus PIV-5 o PIV-2 por:
-las mutaciones mencionadas anteriormente, y además por
35 -sustitución del sitio de escisión nativo de dicha proteína F por otro sitio de escisión enzimática, y/o por inserción en dicha proteína F de un sitio de escisión enzimática diferente del sitio de escisión nativo de esta proteína F, preferentemente por sustitución del sitio de escisión nativo de dicha proteína F por otro sitio de escisión enzimática.
El sitio de escisión de una proteína F de PIV-5 o PIV-2 es el sitio de escisión de las dos subunidades (FI y F2) de 40 esta proteína F; véase la figura 9 para una ilustración sobre la proteína F de PIV-5.
En la forma nativa de la proteína F de PIV-5 y PIV-2, este sitio de escisión es un sitio escindido por furinas.
En la forma nativa de la proteína F de PIV-5, este sitio de escisión consiste en la secuencia RRRRR (SEC ID NO:
45 23). Se sitúa en las posiciones 98 a 102 de la forma nativa de la proteína F de PIV-5 (véase la figura 1A; véase la figura 9). Un ejemplo de fragmento de secuencia de la proteína F de PIV-5 que comprende el sitio de escisión nativo (o natural) de la proteína F de PIV-5 es: IGENLETIRNQLIPTRRRRRFAGVVIGL (SEC ID NO: 24).
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En la forma nativa de la proteína F de PIV-2, el sitio de escisión consiste en la secuencia KTRQKR (SEC ID NO: 25). Se sitúa en las posiciones 101 a 106 de la forma nativa de la proteína F de PIV-2 (véase la figura 1B). Un ejemplo de fragmento de secuencia de la proteína F de PIV-2 que comprende el sitio de escisión nativo (o natural) de la proteína F de PIV-2 es LTPLIENLSKISTVTDTKTRQKRFAGVVVGLAALGVA (SEC ID NO: 26).
Preferentemente, dicho sitio de escisión diferente del sitio de escisión nativo es un sitio de escisión específico de tejido.
Preferentemente, dicho sitio de escisión diferente del sitio de escisión nativo es un sitio de escisión para una enzima expresada específicamente por uno o más tejidos tumorales, muy preferiblemente un sitio de escisión para una enzima expresada específicamente por uno o más tejidos metastásicos.
Por ejemplo, dicho sitio de escisión diferente del sitio de escisión nativo puede ser un sitio de escisión para una metalo-proteasa, tal como el sitio de escisión para la metalo-proteasa matricial 9 (MMP-9); véase el ejemplo 2 siguiente.
Un sitio de escisión para la metalo-proteasa matricial 9 (MMP-9) puede comprender o consistir en la secuencia PXXHyS/T (SEC ID NO: 27) con X = cualquier aminoácido, y con Hy = cualquier aminoácido hidrófobo (es decir cualquier aminoácido de entre F, M, V, L, I).
Por ejemplo, un sitio de escisión para la metalo-proteasa matricial 9 (MMP-9) puede comprender o consistir en la secuencia PRRIT (SEC ID NO: 28) y/o la secuencia IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL (SEC ID NO: 29).
Unos ejemplos de proteínas mutantes de la invención que comprenden tal sitio de escisión (por sustitución del sitio de escisión nativo) comprenden les proteínas mutantes cuya secuencia susceptible de derivar de la proteína F (de PIV-5) es la secuencia de la SEC ID NO: 88 o 89 (Fus8M y Fus8.7M, respectivamente; véase el ejemplo 2 siguiente).
Ácidos nucleicos de la invención:
La presente solicitud se refiere también a un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica une proteína mutante según la invención (según el código genético universal y teniendo en cuenta la degeneración de este código), y a un ácido nucleico complementario de tal ácido nucleico (ácido nucleico de misma longitud perfectamente complementaria).
Tales ácidos nucleicos derivan de la secuencia de la SEC ID NO: 30 (secuencia que codifica la proteína F de PIV-5 nativa), o de una secuencia alternativa que codifica dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", o de una secuencia variante que codifica una proteína F variante, o bien de la secuencia de la SEC ID NO: 32 (secuencia que codifica la proteína F de PIV-2 nativa) o de una secuencia variante que codifica una proteína F variante.
Vectores de la invención:
La presente solicitud se refiere también a un vector de ácido nucleico, más particularmente a un vector de transfección, transducción o transformación, que comprende al menos un ácido nucleico según la invención.
Tal vector puede ser ventajosamente un vector de expresión.
Preferentemente, se trata de un vector que permite la expresión de dicho al menos un ácido nucleico en una célula animal (célula animal no humana y/o célula humana), más preferiblemente:
-en una célula humana, ventajosamente en una célula humana patológica, más particularmente una célula humana tumoral, más preferiblemente una célula de melanoma metastática, o
-en una célula placentaria.
Tal vector de expresión puede ser ventajosamente un vector adenoviral.
Este vector adenoviral puede comprender unos elementos de regulación de la expresión de dicho ácido nucleico, preferiblemente un promotor, que permite una expresión de dicho ácido nucleico en células tumorales, preferentemente en células metastásicas, más preferiblemente en células de melanoma metastásicas.
Preferentemente, esta expresión es específica. Ventajosamente, esta expresión es suficientemente específica para permitir la expresión de dicho ácido nucleico en dichas células tumorales o metastásicas, sin que haya por tanto expresión significativa en células no tumorales (incluso no-metastásicas).
Ventajosamente, tal vector adenoviral es un vector adenoviral oncolítico.
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Alternativamente, un vector de expresión de la invención puede ser un vector adenoviral que comprende unos elementos de regulación de la expresión de dicho ácido nucleico, preferiblemente un promotor, que permite una expresión de dicho ácido nucleico en células placentarias, preferentemente en células placentarias patológicas que presentan una insuficiencia de fusogenicidad.
Preferentemente, esta expresión es específica. Ventajosamente, esta expresión es suficientemente específica para permitir la expresión de dicho ácido nucleico en dichas células placentarias, sin que haya por tanto expresión significativa en células no placentarias.
Un vector de la invención puede alternativa o complementariamente ser un vector que permite la inserción de dicho al menos un ácido nucleico en el genoma de una célula animal (célula animal no humana y/o célula humana), más preferiblemente de una célula humana, ventajosamente de una célula humana patológica, más particularmente de una célula humana tumoral, preferiblemente una célula humana metastásica, más preferiblemente en células de melanoma metastásicas. Tal vector está más particularmente destinado a la terapia génica de los tumores, particularmente de los tumores metastásicos, más particularmente de los melanomas metastásicos.
La presente solicitud se refiere también a un vector que comprende al menos un ácido nucleico de la invención, y que permite la inserción de dicho al menos un ácido nucleico en el genoma de una célula animal (célula animal no humana y/o célula humana), más preferiblemente de una célula humana, ventajosamente de una célula placentaria, preferiblemente una célula placentaria humana. Tal vector está más particularmente destinado a la terapia génica de las enfermedades o estados que impliquen una deficiencia del desarrollo placentario.
Células de la invención:
La presente solicitud se refiere también a una célula, que comprende al menos una proteína mutante según la invención, y/o al menos un ácido nucleico, ADN o ARN según la invención, y/o al menos un vector según la invención.
Tal célula puede ser una célula humana o una célula animal no humana.
Preferentemente, tal célula es una célula tumoral, preferiblemente una célula metastásica, más preferiblemente una célula de melanoma metastásica.
Tal célula encuentra en particular unas aplicaciones como célula de capacidad fusogénica capaz de inducir la formación de sincitio, tal como se describe a continuación.
Alternativamente, una célula de la invención puede ser una célula no tumoral del sistema inmunitario humano o animal no humano, preferiblemente una célula dendrítica no tumoral humana o animal no humana, expresando dicha célula en su superficie al menos una proteína mutante según la invención. Tal célula encuentra en particular aplicaciones como agente capaz de inducir la producción de inhibidor de la fusión celular, por ejemplo por inmunización activa, tal como se describe a continuación.
Aplicaciones médicas (pro-fusión):
Una proteína mutante de la invención, y/o un ácido nucleico, ADN o ARN de la invención, y/o un vector de la invención, y/o una célula de la invención, pueden ser utilizados en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique la presencia y/o la proliferación de células patológicas y/o no favorables al estado de salud del organismo, más particularmente en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique una insuficiencia de fusogenicidad celular, preferiblemente en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado neoplásico, tal como un tumor, un tumor metastásico, ventajosamente un melanoma metastásico.
Tales enfermedades o estados pueden ser tratados y/o prevenidos y/o paliados por disminución o supresión de estas células patológicas y/o no favorables.
Una proteína mutante de la invención expresada en la superficie de tales células inducirá la fusión de estas células, y a continuación la formación de sincitio, que conduce a la destrucción (o por lo menos a la disminución del número) de estas células.
Una proteína mutante de la invención, y/o un ácido nucleico, ADN o ARN de la invención, y/o un vector de la invención, y/o una célula de la invención, se pueden utilizar en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique una deficiencia del desarrollo placentario.
Tales enfermedades o estados pueden ser tratados y/o prevenidos y/o paliados por inducción o estimulación de la fusión celular placentaria.
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La presente solicitud se refiere por lo tanto también a una composición farmacéutica o a un medicamento que comprende al menos una proteína mutante de la invención y/o al menos un ácido nucleico, ADN, ARN de la invención, y/o al menos un vector de la invención y/o una célula de la invención.
Tal composición farmacéutica o tal medicamento puede, en particular, estar destinado al tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique la presencia y/o la proliferación de células patológicas y/o no favorables al estado de salud del organismo, tal como se ha indicado anteriormente (por ejemplo, tumor, tumor metastásico, melanoma metastásico), o al tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique una insuficiencia de fusogenicidad celular (por ejemplo, deficiencia del desarrollo placentario).
Tal composición farmacéutica o tal medicamento pueden comprender además al menos un vehículo farmacéutica y/o fisiológicamente aceptable.
Una proteína mutante de la invención (o un ácido nucleico, ADN, ARN, o un vector de expresión de la invención), se puede utilizar para ser expresada por una célula humana o una célula animal no humana, preferiblemente para ser expresada en la superficie de tal célula.
Esta célula puede ser una célula patológica, preferiblemente una célula tumoral, más preferiblemente una célula metastásica, más preferiblemente una célula de melanoma metastásico, o puede ser una célula no-tumoral, por ejemplo una célula sana.
Más particularmente, unas células patológicas que han sido extraídas de un paciente humano o de un sujeto animal no-humano enfermo, pueden ser tratadas ex vivo (o in vitro) mediante la puesta en contacto con al menos una proteína mutante de la invención y/o al menos un ácido nucleico, ADN o ARN de la invención y/o al menos un vector de expresión de la invención a fin de hacerle expresar una proteína mutante de la invención.
Alternativa o complementariamente, unas células no patológicas pero localizadas cerca de las células patológicas del paciente o sujeto pueden ser extraídas para someterlas a este tratamiento.
Las células así tratadas ex vivo (o in vitro) pueden entonces estar destinadas a ser re-administradas a dicho paciente o sujeto.
Tales células son útiles para el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de la patología que padece dicho paciente o sujeto, por ejemplo un tumor, un tumor metastásico o un melanoma metastásico.
Alternativamente, esta célula puede ser una célula placentaria, más particularmente una célula placentaria que sufre una insuficiencia de fusogenicidad. Una vez tratada por expresión de una proteína mutante de la invención en su superficie, tal célula puede estar destinada al tratamiento y/o a la prevención y/o a la paliación de una deficiencia del desarrollo placentario.
La presente solicitud se refiere por lo tanto más particularmente a una proteína mutante según la invención, a un ácido nucleico, ADN o ARN según la invención, a un vector según la invención, a una célula según la invención, para una utilización en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado neoplásico, preferiblemente de un tumor, más preferiblemente de un tumor metastásico, muy preferiblemente de un melanoma metastásico.
La presente solicitud se refiere también más particularmente a una proteína mutante según la invención, a un ácido nucleico, ADN o ARN según la invención, a un vector según la invención, a una célula según la invención, para una utilización en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una deficiencia del desarrollo placentario.
Inhibidores de fusión según la invención:
La presente solicitud se refiere también a unos productos que tienen la capacidad de disminuir o bloquear la fusión celular. Estos productos son unos inhibidores de una o varias proteínas mutantes de la invención.
Tales inhibidores se pueden utilizar en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad celular, preferiblemente en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una infección por virus con envoltura (tal como una infección por VIH, Influenza, Parainfluenza, Rhabdovirus), de una alergia, de una enfermedad autoinmune o de un rechazo de injerto.
Preferentemente, un inhibidor según la invención es:
-un anticuerpo dirigido contra una proteína mutante según la invención, o un fragmento Fab o F(ab')2 de tal anticuerpo, o
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-un ácido nucleico aptámero o un péptido aptámero que se une específicamente a al menos una proteína mutante según la invención, o a un ácido nucleico, ADN, ARN según la invención, o
-una célula del sistema inmunitario recombinante, preferiblemente una célula dendrítica recombinante, que expresa 5 en su superficie al menos una proteína mutante según la invención, o
-un ácido nucleico anti-sentido de un ácido nucleico según la invención, o
-un pequeño ARN interferente (small interfering RNA; siRNA) que comprende un ARN bicatenario de 19 a 22 10 nucleótidos, capaz de unirse (de hibridarse) a un ácido nucleico según la invención.
La presente solicitud se refiere por lo tanto también a una célula no-tumoral del sistema inmunitario humano o animal no humano, preferiblemente a una célula dendrítica humana o animal no humana, expresando dicha célula en su superficie al menos una proteína mutante según la invención, así como a la utilización de esta célula en el
15 tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad celular, preferiblemente en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una infección por virus con envoltura (tal como una infección por VIH, Influenza,Parainfluenza, Rhabdovirus), de una alergia, de una enfermedad autoinmune o de un rechazo de injerto.
20 La presente solicitud se refiere también a un anticuerpo dirigido contra una proteína mutante según la invención, o contra varias de las proteínas mutantes de la invención. Preferentemente, este anticuerpo es un anticuerpo específico de dicha o dichas proteínas mutantes de la invención. Ventajosamente, este anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Un inhibidor de la invención puede ser un fragmento conservante de tal anticuerpo, tal como un fragmento Fab o F(ab')2.
25 Tal anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar destinado a bloquear o inhibir un mecanismo de fusión celular, por ejemplo administrando este anticuerpo o fragmento de anticuerpo a un paciente o sujeto que lo necesita.
Alternativa o complementariamente, una proteína mutante de la invención puede estar destinada a ser la misma
30 administrada a dicho paciente o sujeto a fin de inducir una inmunización activa contra esta proteína, es decir a fin de inducir la producción por dicho paciente o sujeto de anticuerpos anti-proteína mutante. Si es necesario o deseado, se pueden administrar uno o varios adyuvantes de vacuna de manera conjunta o diferida en el tiempo con esta o estas proteínas mutantes.
35 La presente solicitud se refiere por lo tanto también a una vacuna terapéutica y/o preventiva y/o paliativa, que comprende al menos una proteína mutante de la invención a título de agente inmunógeno, y ventajosamente al menos un adyuvante de inmunización. Tal vacuna puede estar destinada al tratamiento y/o a la prevención y/o a la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad celular, preferiblemente en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una infección por virus con envoltura (tal como una infección por
40 VIH, Influenza, Parainfluenza, Rhabdovirus), de una alergia, de una enfermedad autoinmune, o de un rechazo de injerto.
La presente solicitud se refiere también a:
45 -un ácido nucleico aptámero o un péptido aptámero que se une específicamente a al menos una proteína mutante de la invención, o a un ácido nucleico, ADN, ARN de la invención,
-una célula del sistema inmunitario recombinante, preferiblemente una célula dendrítica recombinante, que expresa en su superficie al menos una proteína mutante de la invención,
50 -un ácido nucleico antisentido de un ácido nucleico de la invención,
-un pequeño ARN interferente (small interfering RNA; siRNA) que comprende un ARN bicatenario de 19 a 22 nucleótidos, capaz de unirse (hibridarse) a un ácido nucleico de la invención, y ventajosamente bloquear o inhibir la
55 transcripción de este ácido nucleico.
Tales productos son también unos inhibidores de la invención. Pueden por lo tanto estar destinados al tratamiento y/o a la prevención y/o a la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad celular, tal como se ha indicado anteriormente. Están más particularmente destinados al tratamiento y/o a la
60 prevención y/o a la paliación de una enfermedad o de un estado que implique al menos un gen expresor o hiperexpresor de la proteína F.
La presente solicitud se refiere por lo tanto también a una composición farmacéutica o a un medicamento que comprende al menos un inhibidor de la invención.
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Se han realizado las proteínas mutantes de la proteína F de PIV-5 por mutación dirigida dentro del plásmido pcDNA3.1 que codifica la proteína de fusión F PIV-5. La(s) mutación(es) se han generado por PCR con la ayuda de cebadores complementarios, siguiendo el protocolo indicado por el fabricante (QuickChange® Site-Directed Mutagenesis system disponible de Stratagene). La lista de cebadores utilizados se da en la tabla 2 siguiente. El conjunto de los plásmidos se controló por secuenciación.
Tabla 2: lista de cebadores
- Mutación
- Región diana en PIV-5 Secuencias de los cebadores utilizadas para la mutagénesis por PCR SEC ID NO:
- L22P
- F2 Sentido 5' GGAGCAGGCAGCCTTGATCCAGCTGCTCTCATGCAAATCGG 3' 3
- Antisentido
- 5' CCGATTTGCATGAGAGCAGCTGGATCAAGGCTGCCTGCTCC 3' 4
- K132E
- HR1 - Mutación pre-existente -
- V290A
- HR3 - Mutación pre-existente -
- I49A
- F2 Sentido 5' GGCCTCATCAGCATTCGCTGTTGTGAAGTTAATGCC 3' 5
- Antisentido
- 5' GGCATTAACTTCACAACAGCGAATGCTGATGAGGCC 3' 6
- V402A
- entre HR3 y HR2 Sentido 5' CAGCCAAGTTCATCTCCTGCAACTGTCATTGACATGTAC 3' 7
- Antisentido
- 5'GTACATGTCAATGACAGTTGCAGGAGAGTGAACTTGGCTG3' 8
- S443P
- hacia arriba de HR2 Sentido 5' GCTTGAATCATCTCAGATCTTGTCCATTGATCCGTTGGATATATCCC 3' 9
- Antisentido
- 5' GGGATATATCCAACGGATCAATGGACAAGATCTGAGATGATTCAAGC 3' 10
- L447P
- hacia arriba de HR2 Sentido 5' CTCAGATCTTGTCCATTGATCCGCCGGATATATCCCAGAATCTAGCTGCG 3' 11
- Antisentido
- 5' CGCAGCTAGATTCTGGGATATATCCGGCGGATCAATGGACAAGATCTGAG 3' 12
- I449P
- hacia arriba de HR2 Sentido 5' CTTGTCCATTGATCCGTTGGATCCATCCCAGAATCTAGCTGCGGTG 3' 13
- Antisentido
- 5'CACCGCAGCTAGATTCGTTGGATTTCTCCCAGAATCTAGCTGCGG3' 14
- I449F
- hacia arriba de HR2 Sentido 5' GCCCATTGATCCGTTGGATTTCTCCCAGAATCTAGCTGCGG 3' 15
- Antisentido
- 5'CCGCAGCTAGATTCTGGGAGAAATCCAACGGATCAATGGGC 3' 16
- T147V
- HR1 Sentido 5'CTCAAAAATGCAATCCAAAAAGTAAATGCAGCAGTTGCAGATG3' 17
- Antisentido
- 5' CATCTGCAACTGCTGCATTTACTTTTTGGATTGCATTTTTGAG 3' 18
- T158V
- HR1 Sentido 5' GCAGATGTGGTCCAGGCCGTACAATCACTAGGAACGGC 3' 19
- Antisentido
- 5' GCCGTTCCTAGTGATTGTACGGCCTGGACCACATCTGC 3' 20
- A463V
- HR2 Sentido 5' GTGAATAAGAGTCTAAGTGATGTACTACAACACTTAGCACAAAGTG 3' 21
- Antisentido
- 5' CACTTTGTGCTAAGTGTTGTAGTACATCACTTAGACTCTTATTCAC 3' 22
10 La mutación 443P está teóricamente preexistente en la proteína F del aislado WR. Sin embargo, en la muestra de este aislado que los inventores han recibido de ATCC, esta mutación no estaba presente. Por lo tanto, tuvo que ser introducida por los inventores.
15 Transfección de las células
Las células se transfectaron por los plásmidos con la ayuda del reactivo ExGen500 (Fermentas), siguiendo las instrucciones indicadas por el fabricante. Se añadieron de uno a tres microgramos de ADN plasmídico sobre las células (del 70 al 80% confluencia) durante 48h. La eficacia de la transfección se estimó con la ayuda de un
20 plásmido que codifica la proteína verde fluorescente (Green Fluorescence Protein; GFP).
Inmunofluorescencia por microscopía confocal
Les células transfectadas se fijaron con la ayuda de paraformaldehído (1% v/v) en tampón fosfato (Phosphate Buffer
25 Saline; PBS), después se lavaron dos veces. Los tapices celulares se incubaron en presencia de un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína de fusión F PIV-5, en este caso el anticuerpo monoclonal F1a descrito en Randall et al. 1987, diluido al 1/10 en PBS durante 3h. El anticuerpo monoclonal F1a se obtuvo por inmunización de ratones contra un aislado de PIV-5 (en este caso el aislado LN), preparación de los hibridomas y selección de los anticuerpos anti-F específicos.
30 Después, los tapices celulares se lavaron e incubaron con un anticuerpo secundario anti-ratón IgG-Alexa Fluor® 633 (Invitrogen) diluido al 1/200 en PBS durante 30 minutos. Después, del aclarado, las células se incubaron durante 10 minutos con Dapi (4',6'-Di-Amidino-2-fenolindol) al 1/1000 mezclado o no con aglutinina de gérmenes de trigo (Wheat Germ Agglutinin; WGA) acoplada a Alexa Fluor® 488 (WGA-Alexa Fluor® disponible de Invitrogen) al 1/200
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en tampón fosfato (Phosphate Buffer Saline; PBS). Las imágenes se tomaron con la ayuda de un microscopio confocal TCS SP2 (Leica).
Citometría de flujo
La citometría de flujo se realizó como se describe anteriormente en la bibliografía (Horvat y Lamb 1992). Se transfectaron unas células A549 por los plásmidos que codifican los diferentes Fus y se depositaron sobre hielo. Los tapices celulares se aclararon mediante tampón fosfato PBS (Phosphate Buffer Saline; PBS) que comprende el 1% de azida de sodio. Un anticuerpo monoclonal anti-proteína F de PIV-5 (en este caso el anticuerpo monoclonal F1a) se añadió después sobre las alfombras (1/500 en tampón fosfato PBS al 1% en suero fetal de ternero), y se incubó durante 30 minutos a 4°C. Las alfombras se aclararon e incubaron después en presencia de un anticuerpo secundario anti-ratón acoplado a Alexa Fluor® 488 al 1/1000 (Invitrogen). Después de los aclarados, las células se despegaron suavemente con la ayuda de 500 µl de tampón fosfato PBS a 0,5 mM en EDTA (ácido etilen-diaminatetraacético). Las células se transfirieron en tubos dedicados a la citometría de flujo que contienen 500 µl de una solución de paraformaldehído 1%. La intensidad de la fluorescencia de 5000 células se midió sobre un citómetro de flujo seleccionador de células (Fluorescence-activated cell sorting; FACS), en este caso en el FACSVantage™ SE flow de Becton Dickinson.
Ensayo de fusión semi-cuantitativo (resultados de fusión establecidos en función del tamaño del sincitio y del número de núcleo)
Los tapices transfectados por los diferentes plásmidos de expresión Fus y observados en inmunofluorescencia han permitido un análisis semi-cuantitativo. Este análisis consistió en determinar un resultado de fusión para cada uno de los mutantes según los siguientes criterios:
La fusión o no (simples aglomerados), señalada con -/+;
El tamaño del sincitio, anotado en una escala de 1 a 5;
El número de núcleos, anotado en una escala de 1 a 5.
El resultado así calculado es la adición de las dos notas; la nota máxima teórica es por lo tanto de 10 y corresponde a un sintitio de tamaño máximo con un número máximo de núcleo.
Ensayo de fusión cuantitativo (medición de la actividad luciferasa)
Con el fin de cuantificar la fusión célula-célula, de las células A549 "donantes" (2,5 millones de células por pocillo de placa de 6 pocillos) se co-transfectaron con 2 µg de plásmido pcDNA3.1 que codifica las diferentes proteínas mutantes Fus así como 50 ng de un plásmido que expresa la luciferasa bajo la dependencia de la larga repetición terminal del VIH-1 (Long Terminal Repeat; LTR) (Lavillette et al. 2007).
A título de control negativo, se co-transfectaron unas células con 2 µg de plásmido pcDNA3.1 vacío.
Doce horas después de la co-transfección, las células "donantes" se despegaron con la ayuda de tampón fosfato (PBS) a 0,5 mM en EDTA, y se contaron y después se recolocaron en nuevas placas de 6 pocillos (105 células/pocillo). Unas células "indicadoras" HuH7-Tat (4.105 células/pocillo) se despegaron con la ayuda del tampón PBS-EDTA, después se aclararon y se añadieron a las células "donantes".
Se midió la actividad luciferasa a 72h de co-cultivo con la ayuda de un kit de medición de la actividad luciferasa, en este caso el Luciferase Assay system (E1500) kit de Promega, siguiendo las indicaciones dadas por el fabricante.
Resultados:
Unas proteínas mutantes construidas y producidas por los inventores son presentadas en la tabla 3 siguiente.
En esta tabla 3, los inventores han organizado las diferentes mutaciones según la función que se les atribuye, a saber:
-implicación en función de autonomía frente a HN: posiciones 22, 132 y 290 de la proteína F de PIV-5;
-implicación en función de pre-fusión: posiciones 49, 402, 443, 447 y 449 de la proteína F de PIV-5;
-implicación en función de post-fusión: posiciones 147, 158 y 463 de la proteína F de PIV-5.
En las figuras 5A, 5B, 5C y 5D, se ilustran las posiciones de las mutaciones de la tabla 3.
E09784341
08-07-2015
Así, se han construido unas proteínas mutantes, producidas y ensayadas por los inventores. Tabla 3: lista de proteínas realizadas
- Autonomía
- Pre-fusión Post-fusión
- L22P
- K132 E V29 0A I49A V402 A S443 P L447 P I449 P I449F T14 7V T158 V A463 V
- Fus1 (SEC ID NO: 47)
- + +
- Fus1.1 (SEC ID NO: 48)
- + + +
- Fus1.2 (SEC ID NO: 49)
- + + +
- Fus2 (SEC ID NO: 50)
- + + +
- Fus3 (SEC ID NO: 51)
- + + +
- Fus3.1 (SEC ID NO: 52)
- + + + +
- Fus3.2 (SEC ID NO: 53)
- + + + + +
- Fus3.3 (SEC ID NO: 54)
- + + + +
- Fus4 (SEC ID NO: 55)
- + + + +
- Fus5 (SEC ID NO: 56)
- + + + +
- Fus6 (SEC ID NO: 57)
- + + + +
- Fus6.1 (SEC ID NO: 58)
- + + + + +
- Fus6.2 (SEC ID NO: 59)
- + + + + +
- Fus6.3 (SEQ D NO: 60)
- + + + + + +
- Fus7 (SEC ID NO: 61)
- + + + +
- Fus7.1 (SEC ID NO: 62)
- + + + + +
- Fus7.2 (SEC ID NO: 63)
- + + + + +
- Fus7.3 (SEC ID NO: 64)
- + + + + + +
- Fus8 (SEC ID NO: 65)
- + + + +
- Fus9 (SEC ID NO: 66)
- + + + +
- Fus10 (SEC ID NO: 67)
- + + + + +
- Fus10.4 (SEC ID NO: 68)
- + + + + + + + +
- Fus10.5 (SEC ID NO: 69)
- + + + + + + + + +
- Fus11 (SEC ID NO: 70)
- + + + + +
- Fus8.1 (SEC ID NO: 71)
- + + + + +
- Fu8.2 (SEC ID NO: 72)
- + + + + +
- Fus8.4 (SEC ID NO: 73)
- + + + + + +
- Fus8.5 (SEC ID NO: 74)
- + + + + + +
- Fus8.6 (SEC ID NO: 75)
- + + + + + +
- Fus8.7 (SEC ID NO: 76)
- + + + + + + +
- Fus10.1 (SEC ID NO: 77)
- + + + + + +
- Fus10.2 (SEC ID NO: 78)
- + + + + + + +
- Fus10.3 (SEC ID NO: 79)
- + + + + + + + +
5 La secuencia de la proteína F de PIV-5 que ha sido utilizada durante la construcción y la producción de estas proteínas mutantes eran una secuencia alternativa de la proteína F de aislado WR. Esta secuencia alternativa era idéntica a la secuencia de SEC ID NO: 31 (secuencia Genbank), con la excepción del aminoácido en la posición 443 que era S y no P (secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443").
10 Las secuencias de la SEC ID NO: 47 a 79 son por lo tanto las secuencias que resultan de la sustitución, dentro de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", de los aminoácidos indicados para cada una de estas secuencias en la tabla 3 anterior.
15 Una ilustración de las observaciones que han sido realizadas con microscopio durante unos ensayos de fusión semicuantitativos se presenta en la figura 6A.
Los resultados obtenidos al final de los ensayos de fusión semi-cuantitativos son presentados en la figura 6B.
20 Las proteínas mutantes Fus 6, Fus 6.1, Fus 6.2 y Fus 6.3 han llevado a la aglutinación de numerosas células, pero ninguna fusión celular.
Las proteínas mutantes Fus 3.3, Fus 3.1, Fus2, Fus 1.1, Fus 1.2 y Fus 1 dan un resultado de fusión nulo.
25 Las proteínas mutantes Fus9, Fus7, Fus 3, Fus5 y Fus4 dan resultados bajos de fusión.
Más allá del resultado de fusión de Fus4, destacan un conjunto de proteínas mutantes con resultados de fusión significativo, a saber:
30 -el grupo de las proteínas mutantes que tienen en común comprender las tres mutaciones de autonomía y la mutación de pre-fusión 449P, tales como las proteínas mutantes Fus8, Fus10, Fus10.4, Fus10.5, Fus11, Fus8.1, Fus8.2, Fus8.4, Fus8.5, Fus8.6, Fus8.7, Fus10.1, Fus10.2, Fus10.3, y
Claims (8)
-
imagen1 imagen2 imagen3 imagen4 imagen5 - 34. Método in vitro para el diagnóstico o el pronóstico de una enfermedad que implique una formación insuficiente, o por el contrario excesiva, de sincitio, caracterizado por que comprende la detección en una muestra biológica de al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o de al menos un ácido nucleico según la reivindicación 23.5
- 35. Método in vitro para el cribado de un compuesto capaz de disminuir o bloquear la formación de sincitio, caracterizado por que comprende la puesta en contacto de un compuesto candidato con unas células que expresan al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, a fin de determinar si este compuesto candidato disminuye o bloquea la fusión de dichas células.10
- 36. Célula tumoral, más particularmente mieloma, que comprende al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, preferiblemente que comprende al menos tal proteína mutante en su superficie, y/o que comprende al menos un ácido nucleico según la reivindicación 23, y/o que comprende al menos un vector según la reivindicación 24.15
-
- 37.
- La célula tumoral, más particularmente el mieloma, según la reivindicación 36, para una utilización en la producción de un hibridoma.
-
- 38.
- Hibridoma, caracterizado por que comprende al menos una proteína mutante según cualquiera de las
20 reivindicaciones 1 a 22, y/o al menos un ácido nucleico según la reivindicación 23, y/o al menos un vector según la reivindicación 24. - 39. Célula madre o progenitora, que presenta una capacidad de diferenciación en célula muscular, caracterizada por que comprende al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, preferiblemente que25 comprende al menos tal proteína mutante en su superficie, y/o que comprende al menos un ácido nucleico según la reivindicación 23, y/o que comprende al menos un vector según la reivindicación 24, no siendo dicha célula una célula embrionaria humana.
- 40. La célula madre o progenitora de la reivindicación 39, para una utilización como célula madre o progenitora de 30 fibra muscular.36
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