ES2541136T3 - Nuevos promotores de la beta-actina y rpS21, y sus usos - Google Patents
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Abstract
Un promotor de β-actina aislado que se escoge de las secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NOs: 1 ó 3, o una variante del mismo que tiene actividad promotora, en el que dicha variante es una secuencia nucleotídica que tiene al menos 95% de identidad con una secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 1 ó 3 a lo largo de toda la longitud de esa secuencia de referencia.
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La presente descripción proporciona secuencias nucleotídicas para promotores de -actina de roedor, incluyendo hámster, rata y ratón, y métodos de uso de las mismas. La presente descripción proporciona además métodos para la identificación y aislamiento de variantes de promotores de la invención, incluyendo homólogos y fragmentos de promotores que tienen actividad promotora. Adicionalmente, la presente descripción proporciona una secuencia nucleotídica para el promotor de rpS21 de hámster, y métodos de uso de la misma.
En los experimentos que conducen a la presente invención, un clon genómico para el promotor de -actina de hámster se aisló a partir de células CHO tras su identificación como un promotor activo mediante una técnica denominada Análisis en Serie de Expresión Génica o “SAGE” (Valculesco et al. (1995) Science, 270: 484-487 y Valculesco et al. (1987) Cell, 88: 243-251). La técnica de SAGE se puede usar para la obtención del perfil de transcripción de todo el genoma. El promotor de -actina se identificó como uno de los promotores más activos en células CHO usando SAGE. Esto condujo a la clonación del promotor para -actina en células CHO. Se usó un enfoque similar para el aislamiento del promotor de rpS21 de hámster a partir de células CHO. Este enfoque se puede usar para la obtención del perfil de transcripción de otros genoma para confirmar que los promotores de actina o promotor de rpS21 correspondientes son activos en otro genoma. Tal promotor se puede clonar usando técnicas estándar conocidas en la técnica, o aquellas descritas aquí. Las variantes de promotores de la presente descripción se pueden identificar mediante hibridación a una o más de las secuencias promotoras expuestas en SEC ID NOs: 1, 2, 3, o 39. Es bien conocido que la temperatura de fusión (Tm) de un ácido nucleico bicatenario disminuye 1-1,5ºC cada 1% de disminución de la homología (véase, por ejemplo, Bonner et al. (1973) J. Mol. Biol.,
81: 123). Por lo tanto, los homólogos de las especies se pueden identificar, por ejemplo, hibridando una secuencia nucleotídica putativa con una secuencia nucleotídica de SEC ID NOs: 1, 2, 3, o 39, o una variante de la misma, y comparando la temperatura de fusión de tal híbrido con la temperatura de fusión de un híbrido que comprende una secuencia nucleotídica de SEC ID NOs: 1, 2, 3, o 39, o una variante de la misma, y una secuencia nucleotídica complementaria. El número de desemparejamientos de pares de bases se puede calcular entonces para el híbrido de ensayo. Por lo tanto, una menor diferencia entre las temperaturas de fusión del híbrido de ensayo y un híbrido que contiene un homólogo putativo de una cualquiera de las secuencias en SEC ID NOs: 1, 2,3, o 39, indicará una mayor homología entre la secuencia nucleotídica putativa y una secuencia promotora de la presente descripción. Por ejemplo, las variantes en otras especies de roedores, tales como cobaya, marmota, rata almizclera, jerbo, ardilla, ardilla rayada, perro de las praderas, castor, puerco espín, y topillo, pueden exhibir una mayor homología con promotores de la presente descripción y sus variantes.
Se sabe que una variedad de factores afectan a la eficiencia de hibridación de dos hebras de secuencia nucleotídica. Estos pueden incluir, por ejemplo, la longitud de la secuencia nucleotídica, la concentración de sal y el contenido de G/C de las secuencias. Por ejemplo, para la hibridación de fragmentos largos de ADN, Howley et al. (1979) J. Biol. Chem., 254: 4876, determinaron que la temperatura de fusión a la que 50% de un ADN se hibrida a una hebra complementaria se define mediante:
Tm = 81,5 + 16,6 log M + 41 (%G + %C) – 500/L –0,62F
en la que
M es la concentración molar de cationes monovalentes;
(%G + %C) es la fracción respectiva de nucleótidos G y C en las secuencias;
L es la longitud del ADN híbrido; y
F es la concentración molar de formamida.
Las condiciones de hibridación apropiadas se pueden seleccionar por los expertos en la técnica con una experimentación mínima, como se ejemplifica en Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, secciones 2, 4, y 6. Adicionalmente, las condiciones restrictivas se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Press, capítulos 7, 9, y 11.
Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridación de baja restricción es como sigue. Los filtros que contienen ADN se pretratan durante 6 h a 40ºC en una disolución que contiene 35% de formamida, 5 x SSC, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM de EDTA, 0,1% de PVP, 0,1% de Ficoll™, 1% de BSA, y 500 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma disolución con las siguientes modificaciones: se usa 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll™, 0,2% de BSA, 100 g/ml de ADN de esperma de salmón, 10% (peso/vol) de sulfato de dextrano, y 5-20 x 106 sonda marcada con 32P. Los filtros se incuban en mezcla de hibridación durante 18-20 h a 40ºC, y después se lavan durante 1,5 horas a 55ºC en una disolución que contiene 2 x SSC, 25 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM de EDTA, y 0,1% de SDS. La disolución de lavado se sustituye por disolución reciente y se incuba durante 1,5 horas adicionales a 60ºC. Los filtros se secaron y se expusieron para autorradiografía. Se pueden usar otras condiciones de baja restricción bien conocidas en la técnica (por ejemplo, como se emplean para hibridaciones de entre especies).
Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridación de restricción elevada es como sigue. La prehibridación de
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filtros que contienen ADN se lleva a cabo durante 8 h toda la noche a 65ºC en tampón que contiene 6 x SSC, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de EDTA, 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll™, 0,02% de BSA, y 500 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante 48 horas a 65ºC en la mezcla de prehibridación que contiene 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 x 106 cpm de sonda marcada con 32P. El lavado de los filtros se realiza a 37ºC durante 1 hora en una disolución que contiene 2 x SSC, 0,01% de PVP, 0,01% de Ficoll™, y 0,01% de BSA. Esto fue seguido de un lavado en 0,1 x SSC a 50ºC durante 45 minutos.
Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridación de restricción moderada incluye prelavar los filtros en 5 x SSC, 0,5% de SDS, 1,0 mM de EDTA, pH 8,0; hibridar en 50% de formamida, 6 x SSC a 42ºC; y lavar los filtros en 0,5 x SSC, 0,1% de SDS a 60ºC.
Las variantes de los promotores de la presente descripción también se pueden identificar mediante el porcentaje de identidad entre secuencias nucleotídicas para variantes putativas y las secuencias expuestas en SEC ID NOs: 1, 2, 3, o 39, o sus hebras complementarias. El porcentaje de identidad se puede determinar, por ejemplo, mediante inspección visual o usando diversos programas de ordenador conocidos en la técnica, o como se describe en los Ejemplos. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de dos secuencias nucleotídicas se puede determinar comparando la información de secuencia usando el programa de ordenador GAP descrito por Devereux et al. (1984) Nucl. Acids. Res., 12: 387 y disponible en la University de Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El porcentaje de identidad también se puede determinar alineando dos secuencias nucleotídicas usando el programa BLAST (www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST) como se describe por Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett., 174:
247. Por ejemplo, para alineamientos de secuencias nucleotídicas usando el programa BLAST, los ajustes por defecto son los siguientes: el premio para emparejamiento es 2, la penalización para desemparejamiento es -2, las penalizaciones de apertura de salto y de extensión de salto son 5 y 2 respectivamente, el valor de X-dropoff del salto es 50, el valor esperado es 10, el tamaño de palabra es 11, y el filtro está OFF.
Los promotores de la presente descripción identificados mediante identidad de secuencia incluyen, por ejemplo, secuencias expuestas en SEC ID NOs: 2 y 3 para promotores de -actina de rata y de ratón, que muestran 67% y 80% de identidad, respectivamente, con nt 1 a nt 3007 de la secuencia del promotor de -actina de hámster expuesta en SEC ID NO:1. Se pueden identificar fácilmente variantes adicionales usando las diversas técnicas descritas aquí y aquellas conocidas en la técnica.
El porcentaje de identidad entre el promotor de -actina de hámster (SEC ID NO:1) y promotores de -actina conocidos se puede determinar como se describe. Por ejemplo, cuando SEC ID NO:1 se compara con el promotor de -actina humano (SEC ID NO:5) usando el alineamiento de secuencias BLAST con parámetros por defecto, exhibe solamente alrededor de una identidad de 10% a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO:1. De forma similar, cuando SEC ID NO:1 se compara con el promotor de -actina de pollo (SEC ID NO:6), exhibe solamente alrededor de 1% de identidad a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO:1. Debido a tales niveles bajos de homología, los promotores de -actina humano y de pollo no se consideran variantes de la secuencia del promotor de -actina de hámster de SEC ID NO:1. Además, la porción de 3’ de SEC ID NO:1 muestra homología significativa con la porción de 5’ de la secuencia del gen de -actina de hámster (nº de acceso de GenBank® U20114; SEC ID NO:4). En particular, los primeros 1232 nucleótidos de SEC ID NO:4 muestran una identidad de 98% con la porción de 3’ de SEC ID NO:1, como se representa en la Figura 3. Esta identidad está en la región del primer intrón en el gen de -actina de hámster. En conjunto, SEC ID NO:4 muestra solamente 40% de identidad a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO:1. Además, no se ha descrito actividad promotora para SEC ID NO:4, o fragmentos de la misma.
Usando el alineamiento de secuencias BLAST con parámetros por defecto, no se detectó homología entre el promotor de rpS21 humano previamente conocido (nt 1-2344 de nº de acceso GenBank® AJ250907) y nt 1 a 1958 de promotor de rpS21 de hámster de SEC ID NO:39. Se detecta un nivel muy bajo de homología entre el promotor de rpS21 de hámster de SEC ID NO:39 y ADN genómico de ratón que abarca el gen de rpS21 de ratón (nº de acceso GenBank® NT_039212). Hay dos regiones de homología en las secuencias de ratón. La primera va de nt 1775 a nt 1945 de SEC ID NO:39 (137 de 172 nts coinciden). La segunda va de nt 580 a nt 851 de SEC ID NO:39 (208 de 274 nts coinciden). Estas dos regiones de homología están separadas por 923 nts en la secuencia de hámster (SEC ID NO:39) y por 1745 nts en la secuencia genómica de ratón (NT_039212).
En consecuencia, en algunos casos, un promotor aislado o una variante del mismo que tiene actividad promotora comprende la secuencia o secuencias nucleotídicas como se exponen desde nt 1775 a nt 1945 de SEC ID No: 39, y/o de nt 580 a nt 851 de SEC ID NO: 39. Opcionalmente, tal promotor o variante comprende además toda o una porción de SEC ID NO:39 como se expone desde nt 852 a nt 1774.
Las secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NOs: 1, 2, 3, o 39, o sus variantes, se pueden usar como sondas para identificar bibliotecas genómicas para el aislamiento de secuencias genómicas que se hibridan a una o más de las secuencias expuestas en SEC ID NOs: 1, 2, 3, o 39, o sus variantes.
Un promotor, según la invención, o una variante del mismo, está ligado operablemente a un ácido nucleico heterólogo que lo expresa. El promotor se puede usar solo o en combinación con otros elementos reguladores tales
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como, por ejemplo, potenciadores y represores. Como alternativa, tal promotor se puede integrar en el genoma de una célula hospedante o de un animal, para expresar de ese modo un gen endógeno en el hospedante. Un promotor según la invención se puede usar en un vector para la expresión de ácidos nucleicos heterólogos. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo codifica una proteína terapéutica. Los ejemplos de proteínas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a, -glucosidasa, esfingomielinasa ácida, insulina, activador de plasminógeno tisular, hormona estimulante de la tiroides, eritropoyetina, glucocerebrosidasa, -galactosidasa, y diversos anticuerpos. Los ejemplos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos que se unen a miembros de la familia de TGF-, tales como, por ejemplo, TGF--1, 2, y 3.
Esta invención proporciona además vectores que comprenden un promotor de la invención o una variante del mismo que tiene actividad promotora. En algunas realizaciones, los vectores de la invención incluyen un sitio de enzima de restricción adecuado en dirección 3’ del promotor, para la inserción del ácido nucleico heterólogo. Tal sitio de enzima de restricción puede incluir un sitio de restricción para una única enzima de restricción, o puede incluir sitios de restricción para una variedad de enzimas de restricción a fin de facilitar la inserción de muchos ácidos nucleicos heterólogos diferentes. Un vector según la invención también puede contener una secuencia de poliadenilación en dirección 3’ del sitio para insertar un ácido nucleico heterólogo. Los vectores que comprenden promotores de la invención también pueden contener elementos de ADN procariotas para la replicación bacteriana, y un marcador de selección por antibióticos para el crecimiento y selección del vector en células bacterianas, y elementos de ADN adicionales que controlan el procesamiento de transcritos, tales como, por ejemplo, señales de terminación. Los vectores pueden contener además secuencias de ADN para dirigir la secreción de una proteína fuera de las células hospedantes.
En ciertas realizaciones, un vector que contiene una secuencia promotora de la invención es un vector bicistrónico. Se diseñan vectores bicistrónicos de manera que dos ácidos nucleicos se puedan transcribir para producir un único transcrito. Tal transcrito contiene habitualmente una primera porción que es traducida en una proteína, y una segunda porción traducida en una segunda proteína. Una proteína puede ser una proteína de interés, tal como una proteína terapéutica, y una segunda proteína se puede usar como un marcador seleccionable. Los vectores bicistrónicos contienen habitualmente un promotor y un sitio interno de entrada al ribosoma o IRES situado entre dos ácidos nucleicos. Esto permite la transcripción de los dos ácidos nucleicos como un único ARNm bicistrónico. De esta manera, se puede construir un vector que incluye un promotor de -actina de la invención, o una variante del mismo, y un IRES entre dos ácidos nucleicos heterólogos. Un vector bicistrónico que contiene un promotor de actina de la invención, o una variante del mismo, se puede usar para expresar una proteína terapéutica tal como, por ejemplo, esfingomielinasa ácida o -glucosidasa, junto con un gen informador.
La presente descripción proporciona además ensayos para identificar aquellas variantes de promotores de -actina y de rpS21 de la presente descripción que tienen actividad promotora. Por ejemplo, un promotor de la invención o variante del mismo se inserta en un vector adecuado en dirección 5’ de un gen informador, y la expresión del gen informador se usa como un determinante de la actividad promotora. Por ejemplo, para la identificación de variantes de promotores de la invención que tienen actividad promotora, tal variante se clona en dirección 5’ de un gen informador. Un gen informador puede codificar una enzima que cataliza una reacción que produce una señal visualmente detectable. Los ejemplos de tales genes informadores incluyen -galactosidasa y luciferasa. Los ejemplos de otros genes informadores incluyen fosfatasa alcalina, opalina sintasa, octopina sintasa, -glucoronidasa, cloranfenicol acetiltransferasa. En los Ejemplos expuestos más abajo, un gen informador que codifica una proteína fluorescente roja (RFP) de Discosoma striata se usa para medir la actividad promotora. Los expertos en la técnica, sin embargo, pueden usar cualquier gen informador y técnica de ensayo adecuados para determinar la actividad promotora. La expresión de un gen informador a partir del promotor se puede evaluar en un sistema de expresión in vitro, o puede ser intracelular (por ejemplo, in vivo).
La invención proporciona además células hospedantes que se han transfectado con un vector de la invención que comprende un promotor ligado operablemente a un gen heterólogo. Tal célula hospedante puede ser una célula procariota o una célula eucariota. Las células hospedantes pueden ser células en cultivo, o pueden estar presentes en un animal no humano. Los ejemplos de células hospedantes en cultivo incluyen, pero no se limitan a, células HeLa, células CHO, NS0, células HEK, células BHK, NIH-3T3, células MDCK, y células COS. Las células hospedantes en cultivo se pueden hacer crecer en suspensión o en microportadores, como se describe en los Ejemplos.
Para introducir ácidos nucleicos de la invención en una célula hospedante, se pueden usar muchos métodos adecuados. Los vectores que comprenden secuencias promotoras de la invención se pueden introducir en células procariotas o eucariotas. Los ejemplos de técnicas que se pueden usar para la introducción de ácidos nucleicos en células eucariotas incluyen, por ejemplo, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediante DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas, transducción usando vectores víricos, etc.
Para la producción de proteínas usando promotores de la invención, se pueden emplear muchos sistemas de expresión adecuados. Uno de tales sistemas de expresión emplea un gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) que se introduce en el vector que comprende un promotor de la invención o una variante del mismo ligado operablemente a un ácido nucleico heterólogo. Como alternativa, un vector de expresión que expresa DHFR se puede cotransfectar
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- Gen
- Cebador Secuencia SEC ID NO:
- rpS21
- directo GTGGACCTGTACGTGC 12
- rpS21
- inverso TTCTCACTTTTATTTATGAC 13
- ferritina
- directo CGCCAGAACTACCACCAGGAC 14
- ferritina
- inverso TTCAGAGCCACATCATCCCG 15
- galectina
- directo TGGTCGCAAGCAACCTGAATC 16
- galectina
- inverso TTGAAGTCACCGTCTGCCGC 17
C. Transfección de células CHO-K1
Para la transfección transitoria, se colocaron células CHO-K1 en placas de 6 pocillos en medio 925 con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Invitrogen). Las células se hicieron crecer hasta 50-75% de confluencia antes de la transfección usando Lipofectamine™ (Invitrogen). El plásmido pDsRED-1 (Clontech, Palo Alto, CA) se cotransfectó con el plásmido pSV40-CD20, que codifica un marcador CD20 de la superficie celular usado para identificar células transfectadas. Este plásmido pDsRED-1 codifica una proteína fluorescente roja (RFP) de Discosoma striata, cuya expresión se puede detectar mediante FACS. Las transfecciones se llevaron a cabo según las instrucciones del fabricante. De forma breve, las células se incubaron con complejos de lípido-ADN durante 16 h en medio Opti-MEM™ libre de suero (Invitrogen). El medio se renovó con medio 925 con 10% de FBS, y las células se cosecharon 48 horas después de la transfección.
D. Análisis de clasificación celular activada por fluorescencia
Para el análisis de FACS, 1 x 106 células se tripsinizaron y se lavaron con PBS fría que contiene 2% de FBS. Las células se incubaron subsiguientemente con un anticuerpo anti-CD20 marcado con FITC (Pharmingen, San Diego, CA) durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron entonces con PBS fría que contiene 2% de FBS, y se resuspendieron en 1 ml de PBS frío/2% de FBS. El análisis de FACS se llevó a cabo usando FACSCalibur™ (BD Biosciences, San Diego, CA). Todos los sucesos positivos para CD20 se evaluaron en busca de la intensidad de fluorescencia media de la proteína fluorescente roja, para evaluar la potencia del promotor.
E. Ensayo de ASM
Se incubaron a 37ºC medios de células transfectadas con un vector que codifica esfingomielinasa ácida (ASM) con el sustrato sintético 2-(N-hexadecanoilamino)-4-nitrofenilfosforilcloro (Calbiochem, San Diego, CA) a la concentración de 12,5 mM en acetato de sodio 250 mM, pH 5,5, que contiene acetato de cinc 0,1 mM, seroalbúmina bovina (BSA) 0,25 mg/ml, y Tween 20 al 0,15%. Las reacciones se detuvieron mediante adición de 0,2 M de glicina-NaOH que contiene 50% de etanol. La actividad o cantidad de ASM se midió mediante la cantidad de 2-(Nhexadecanoilamino)-4-nitrofenolato producida, usando un ensayo colorimétrico midiendo la densidad óptica a 415 nm.
F. Ensayo de GAA
Se incubaron a 37ºC medios procedentes de células transfectadas con un vector que codifica -glucosidasa (GAA) con el sustrato sintético p-nitrofenil-D--glucopiranósido (Sigma, St. Louis, MO) a una concentración de 40 mM en acetato de sodio 50 mM, pH 4,3, que contiene seroalbúmina bovina (BSA) al 0,1%. Las reacciones se detuvieron mediante adición de glicina 0,3 M, pH 10,6. La actividad o cantidad de GAA se midió mediante la cantidad de pnitrofenilo producida, usando un ensayo colorimétrico midiendo la densidad óptica a 400 nm.
Ejemplo 1: Identificación del promotor de -actina en células CHO-K1
Se usó el Análisis en Serie de Expresión Génica (SAGE) para analizar todo el perfil de transcripción de células CHO-K1 que se hicieron crecer en cultivo de agitación perfundido libre de suero.
La primera etapa en SAGE implicó la síntesis de ADN bicatenario a partir de ARNm aislado de células CHO-K1 usando técnicas estándar. El ADNc se escindió subsiguientemente con la endonucleasa de restricción NlaIII, también denominada una enzima de anclaje, que se espera que escinda la mayoría de los transcritos al menos una vez. La porción de 3’ de cada ADNc escindido se aisló mediante unión a perlas de estreptavidina. El conjunto de ADNc se dividió entonces a la mitad y se ligó vía el anclaje del sitio de restricción a un ligador que contiene un sitio de endonucleasa de restricción de tipo II (por ejemplo, FokI). Las endonucleasas de restricción de tipo II escinden a una distancia definida hasta 20 pares de bases lejos de sus sitios de reconocimiento asimétricos. La enzima de tipo II se denomina típicamente una enzima etiquetadora. La escisión del producto de ligación con la enzima etiquetadora da como resultado la liberación de un ligador con trozos cortos del ADNc. Una combinación de las
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enzimas de anclaje y etiquetadoras produce una etiqueta de 10 pares de bases que es única para un gen.
Usando este enfoque, se representaron etiquetas de secuencias para cada gen mediante el sitio NlaIII mayoritariamente 3’ seguido de una secuencia de 10 pb única. En los casos en los que las etiquetas no se pudieron asignar a genes conocidos, un ADNc de biblioteca de SAGE se amplificó mediante PCR usando la etiqueta de
5 SAGE y un cebador directo M13 usado habitualmente (GTTTTCCCAGTCACGAC, SEC ID NO:18). Los productos de la PCR se clonaron subsiguientemente en el vector pCR2.1 (Invitrogen) y se secuenciaron usando técnicas estándar. La identificación de los genes se basó en la homología de la secuencia de productos de PCR con secuencias conocidas en GenBank® (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank).
Se llevó a cabo un alineamiento de BLAST® (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) de secuencias nucleotídicas con sus
10 contrapartes de ratón y/o rata para identificar el gen a partir del que se obtuvo la etiqueta. De las dieciséis etiquetas más abundantes identificadas en este análisis (Tabla 2), se identificó los genes para todas las etiquetas menos una. De los quince genes identificados, cinco tuvieron origen mitocondrial, y tres fueron elementos repetitivos nucleares. La aparición de múltiples copias de estos genes en cada célula fue la causa probable de su abundancia en el resultado de SAGE. Tales secuencias no se consideraron para una evaluación posterior.
15 TABLA 2
- Abundancia
- Etiqueta Gen SEC ID NO: Identificado
- 38
- CATGGAAGCAGAAT Repetición Alu 19 J00052
- 33
- CATGCAGGAGCTTC COX I Mito 20 PCR
- 27
- CATGGGGGAGCGTT Proteína ribosómica S21 21 PCR
- 27
- CATGGTACTGACAC COX III Mito 22 PCR
- 20
- CATGGCCTCCAAGG GAPDH 23 X52123
- 20
- CATGATAATACGTA ATPasa 6 Mito 24 M14311
- 19
- CATGCCTTTAATCC Repetición B-1 25 PCR
- 18
- CATGAATCGGAGGC Citocromo B Mito 26 J01436
- 18
- CATGAGGCAGACAG EF-1 27 D00522
- 18
- CATGGCGGCAGACG Galectina (L-14) 28 M96676
- 16
- CATGGTGGCTCACA Repetición Alu 29 J00056
- 15
- CATGTTGGCTGCCG Cadena pesada de ferritina 30 M99692
- 14
- CATGCCCTGTGCCG Ninguna coincidencia 31
- 13
- CATGAGAGCGAAGT Proteína ribosómica L41 32 X82550
- 13
- CATGAGGAGGCCTA NADH deshidrogenasa mitocondrial 33 PCR
- 12
- CATGCCCTGAGTCC -Actina 34 AF014363
Usando este enfoque, los promotores de cuatro genes se identificaron como los más activos en células CHO-K1. Estos promotores fueron: -actina, proteína ribosómica S21 (rpS21), factor de alargamiento 1 (EF-1), y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Los niveles elevados de estos ARNm en células CHO-K1 podrían 20 ser debido a la actividad promotora de sus promotores respectivos, o debido a la estabilidad innata de los ARNm. Aunque el análisis de SAGE proporciona una cuantificación de los niveles globales en el estado estacionario para los ARNm para genes, no distingue entre actividad promotora del gen y estabilidad del ARNm como la base de la expresión elevada del ARNm. De este modo, a fin de distinguir entre las dos posibilidades, se midió la semivida de los ARNm. De forma breve, la expresión de los genes candidatos se evaluó mediante análisis de transferencia
25 Northern de células CHO-K1 en cultivos con agitación en puntos variables tras el tratamiento de células con actinomicina D.
Inicialmente, se analizaron los genes de rpS21, GAPDH y EF-1, y se encontró que todos ellos tienen ARNm relativamente estables con semividas mayores que 8 horas. Estos resultados sugieren que la mayor abundancia de estos ARNm resultó de la mayor estabilidad de los ARNm y no necesariamente mayores actividades de los
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Los promotores de -actina previamente conocidos, humano (nº de acceso GenBank® gi28337A) y de pollo (nº de acceso GenBank® gi2170437), se alinearon con el promotor de -actina de hámster para la determinación de la homología con el programa BLAST® usando los ajustes por defecto. Las secuencias del promotor de -actina humano y de pollo tuvieron solamente 10% y 1% de identidad, respectivamente, con el promotor de -actina de hámster (SEC ID NO:1).
Se identificó un supercóntigo genómico de rata (Rattus norvegcus) (nº de acceso GenBank® NW_042778) en el cromosoma 12 del genoma de rata por contener una secuencia nucleotídica que tiene un 67% de identidad a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO:1.
De forma similar, se identificó un cóntigo (nº de acceso GenBank® NT_039324) en el cromosoma 5 del genoma de ratón (Mus musculus) por tener una identidad de 80% a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO:1.
Los alineamientos de secuencias de la secuencia del promotor de -actina de hámster (SEC ID NO:1) con la secuencia del gen de hámster, y promotores de -actina de ser humano, pollo, rata y ratón se representan en las Figuras 3, 4, 5, 1, y 2, respectivamente.
Ejemplo 6: Actividades de los promotores de -actina de rata y de ratón
Las secuencias de los promotores de rata y de ratón expuestas en SEC ID NOs:2 y 3, respectivamente, se clonaron en el plásmido pDsRED-1 (Clontech). El promotor de CMV también se clonó en dirección 5’ del gen de RFP en el plásmido pDsRED-1. Estos plásmidos se transfectan en célula CHO-K1, u otra estirpe celular. La expresión de la RFP se evalúa mediante FACS 48 horas después de la transfección.
Se espera que las células transfectadas con el promotor de -actina de rata o de ratón muestren una expresión de RFP mayor que el promotor de CMV en condiciones similares.
Ejemplo 7: Expresión de proteínas usando promotor de -actina de hámster
Para evaluar adicionalmente la actividad del promotor de -actina de hámster, se usó un sistema de expresión que utiliza selección mediante dihidrofolato reductasa (DHFR) y amplificación mediante metotrexato (MTX). El vector pGZ6 se derivó del plásmido pCLHAXSV2DHFR para contener el promotor de -actina de hámster de 3 kb (SEC ID NO:1) además de un gen de DHFR bajo el control del promotor temprano de SV40. El plásmido pCLHAXSV2DHFR se ha descrito previamente por Cole et al. (1993) Biotechnology, 11:1014-1024. De forma breve, el promotor de metalotionina (MT) en el vector pCLHAXSV2DHFR se sustituyó por el promotor de -actina para crear el vector pGZ6. Los ADNc para dos proteínas de interés terapéutico, esfingomielinasa ácida (ASM) y -glucosidasa (GAA), se ligaron operablemente al promotor de -actina de hámster. El ADNc de ASM se obtuvo a través del consorcio IMAGE™ (nº de acceso GenBank® AI587087). El ADNc para GAA se obtuvo de Dr. Martinuik en la New York University School of Medicine. Las secuencias nucleotídicas de los ADNc de ASM y de GAA se exponen en SEC ID NOs:37 y 38, respectivamente. De forma similar, los dos ADNc se clonaron también en dirección 3’ del promotor de CMV en un vector que contiene el mismo casete de expresión de DHFR. La estirpe celular CHO-K1 deficiente en DHFR, DXB11, se transfectó por triplicado con ambos conjuntos de vectores de expresión. Después de dos semanas de selección en medio deficiente en nucleótidos que contiene MTX 20 nM, se lavó un conjunto no clonado heterogéneo de células con PBS y se transfirió a medio libre de suero. Veinticuatro horas más tarde, se midieron los niveles de ASM o GAA en el medio.
Los resultados de uno de tales experimentos se demuestran en las Figuras 8A y 8B. Los niveles de ASM generados a partir del promotor de -actina de hámster en los conjuntos estables fueron 2 a 15 veces mayores que con el promotor de CMV, y en el caso de los conjuntos de GAA, 2 a 5 veces mayores.
Los conjuntos estables se usaron adicionalmente para evaluar la capacidad del promotor de -actina para sostener la expresión proteica a largo plazo. Típicamente, para la producción industrial de proteínas, la expresión elevada se logra seleccionando células con un mayor número de copias de genes a través de un procedimiento que implica incrementar el número de etapas de selección y/o la concentración de MTX. A fin de determinar si se podría lograr una mayor expresión vía esta estrategia con el promotor de -actina (SEC ID NO:1), los conjuntos de ASM seleccionados inicialmente en MTX 20 nM se amplificaron mediante selección durante dos semanas en niveles de MTX (200 nM) mayores de diez veces. Como se resume en la Tabla 4, dos de los tres conjuntos de -actina mostraron niveles de ASM mayores de 2 a 3 veces tras la amplificación con respecto a los conjuntos de 20 nM de partida. Por el contrario, solamente uno de los conjuntos de CMV ensayados mostró niveles mayores que el conjunto de 20 nM, del que deriva. Entre los seis conjuntos de ASM generados con cualquiera de los dos promotores, el conjunto de -actina que se expresa de forma más elevada generó seis veces la cantidad de ASM obtenida con el conjunto que se expresa de forma más elevada generado con el promotor de CMV. Esto demuestra que, al menos en las condiciones ensayadas, el promotor de -actina de hámster es superior al promotor de CMV.
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TABLA 4
- Conjunto
- Expresión de ASM en MTX 20 nM Expresión de ASM en MTX 200 nM
- Conjunto A de CMV-ASM
- 4,3 8,2
- Conjunto B de CMV-ASM
- 16,9 9,5
- Conjunto C de CMV-ASM
- 3,6 3,7
- Conjunto A de -actina-ASM
- 33,5 100,0
- Conjunto B de -actina-ASM
- 59,3 27,9
- Conjunto C de -actina-ASM
- 45,6 90,5
En un experimento distinto, el promotor de -actina de hámster se usó para expresar la proteína del activador de plasminógeno tisular (tPA), que es un agente trombolítico usado en pacientes para disolver coágulos de sangre. Células CHO-DXB11 se transfectaron con un vector de expresión pGZ6-tPA en el que el promotor de -actina de hámster está ligado operablemente al gen de tPA. Los transfectantes estables se seleccionaron mediante crecimiento en medio deficiente en nucleótidos que contiene MTX 200 nM. El conjunto resultante de células sin clonar se sometió entonces a MTX 500 nM, para amplificar el número de copias del transgén. Este conjunto de células se retiró de MTX, se expandió y se sembró sobre 2 microportadores Cytopore™ en un cultivo de agitación de 1 litro. Las células se hicieron crecer durante 7 días en un medio que contiene suero. Durante los siguientes 4 días, el suero se eliminó mediante cambios diarios del 80% con medio libre de suero. Entonces se recogieron cosechas de medios a lo largo de 15 días y se analizaron en busca de la expresión de tPA usando un kit de ELISA comercialmente disponible (kit de tPA TintElize®, Biopool International, Inc., Ventura, CA). Como se representa en la Figura 9 de este experimento, el uso del promotor de -actina de hámster dio como resultado la expresión de tPA a una concentración de alrededor de 30 mg/l por día. Este resultado se compara favorablemente con los informes recientemente publicados en los que se produjo alrededor de 30-40 mg/l de tPA después de 4-8 días usando otros promotores (Senger et al. (2003) Biotechnology Progress 19: 1199-1209; Dowd et al. (2000) Biotechnology Progress 16:786-794).
Ejemplo 8: Producción de anticuerpos usando promotor de -actina de hámster
A fin de producir un anticuerpo frente a un miembro de la familia de TGF-, un ácido nucleico que codifica una cadena ligera de anticuerpo anti-TGF- o una cadena pesada de anticuerpo anti-TGF- se clona en dirección 3’ del promotor de -actina de hámster en dos vectores de expresión pGZ6 distintos.
La estirpe de células CHO-K1 deficiente en DHFR, DXB11, se transfecta con ambos vectores de expresión. Después de dos semanas de selección en medio deficiente en nucleótidos que contiene MTX, se miden en el medio los niveles de anticuerpo anti-TGF-, incluyendo tanto la cadena ligera como la cadena pesada.
Ejemplo 9: Expresión de proteínas usando promotor de rpS21 de hámster
La actividad del promotor de rpS21 de hámster se comparó con la actividad del promotor de -actina de hámster para la expresión en células CHO-DXB11. Se transfectaron células CHO-DXB11 con vectores de expresión que contienen -glucosidasa humana (rhGAA) ligada operablemente al promotor de rpS21 de hámster de SEC ID NO:39 (pGZ3IC-GAA) o al promotor de -actina de hámster de SEC ID NO:1 (pGZ6IC-GAA). En ambos casos, el gen de rhGAA se ligó al gen que codifica un marcador de la superficie celular (CD20), a través de un sitio interno de entrada al ribosoma.
Secuencia (IRES). Tras la selección de células con MTX 0,2 M en medio deficiente en nucleótidos, las células se marcaron con un anticuerpo conjugado a FITC contra CD20, y se clasificaron mediante FACS para clones que se expresan de forma elevada. Las células seleccionadas se colocaron en placas de 96 pocillos y se expandieron para la evaluación de la expresión de rhGAA. Se analizaron 38 clones para el promotor de rpS21 de hámster, y se analizaron 29 clones para el promotor de -actina de hámster. La Tabla 5 muestra la distribución de intervalos de expresión en los clones resultantes para ambos promotores.
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TABLA 5
- Vector
- Expresión de GAA <2 pg/célula/h Expresión de GAA 2-5 pg/célula/h Expresión de GAA 5-8 pg/célula/h Expresión de GAA 8-10 pg/célula/h
- pGZ3IC-GAA
- 16% 50% 26% 8%
- pGZ6IC-GAA
- 52% 34% 14% 0%
En un experimento distinto, el promotor de rpS21 de hámster se usó para expresar ASM en células CHO-DXB11. La actividad del promotor de rpS21 se comparó con las actividades de ambos promotores de -actina y de CMV. Las
5 células CHO-DXB11 se transfectaron por triplicado y se seleccionaron directamente en MTX 200 nM, o se seleccionaron inicialmente en MTX 20 nM y después se amplificaron durante dos semanas en MTX 200 nM, como se explica en el Ejemplo 7. Los niveles de ASM se midieron en el medio como se describió. La expresión de ASM en células sin transfectar fue indetectable.
Como se resume en la Tabla 6, los tres conjuntos de rpS21 mostraron niveles de ASM mayores de 2 a 3 veces tras
10 la amplificación con respecto a los conjuntos de 20 nM de partida, de los que derivaron. Además, los niveles de ASM generados fueron mayores que los niveles generados con el promotor de CMV (Ejemplo 7).
TABLA 6
- Conjunto
- Expresión de ASM nU/célula/24 h (en MTX 20 nM) Expresión de ASM nU/célula/24 h (en MTX 200 nM)
- Conjunto A de rpS21-ASM
- 12 34
- Conjunto B de rpS21-ASM
- 13 30
- Conjunto C de rpS21-ASM
- 16 41
Los niveles de expresión de ASM generados con selección de los conjuntos directamente en MTX 200 nM se 15 resumen en la Tabla 7.
TABLA 7
- Conjunto
- Expresión de ASM
- Conjunto A de CMV-ASM
- 38
- Conjunto B de CMV-ASM
- 193
- Conjunto C de CMV-ASM
- 44
- Conjunto A de -actina-ASM
- 381
- Conjunto B de -actina-ASM
- 125
- Conjunto C de -actina-ASM
- 515
- Conjunto A de rpS21-ASM
- 342
- Conjunto B de rpS21-ASM
- 60
- Conjunto C de rpS21-ASM
- 51
Los niveles de ASM generados a partir del promotor de rpS21 de hámster en MTX 200 nM fueron de media alrededor de 1 a 2 veces mayores que aquellos con el promotor de CMV. Por otro lado, los niveles de ASM
20 generados a partir del promotor de -actina fueron de media alrededor de 3 a 4 veces mayores que aquellos con el promotor de CMV. De este modo, el promotor de rpS21 fue al menos tan activo como el promotor de -actina cuando se usa para expresar GAA; sin embargo, mostró menor actividad que el promotor de -actina cuando se usó para expresar ASM. Ambos promotores, sin embargo, fueron más activos que el promotor de CMV.
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