ES2537633T3

ES2537633T3 - Mutaciones del gen de PIK3CA en cánceres humanos

Info

Publication number: ES2537633T3
Application number: ES12164819.0T
Authority: ES
Inventors: Yardena Samuels; Victor Velculescu; Kenneth W. Kinzler; Bert Vogelstein
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 2004-03-02
Filing date: 2005-02-18
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2025-02-18
Also published as: CA2560696A1; JP2018153189A; JP5894110B2; PT1730303E; WO2005091849A2; AU2011200600B2; JP7001735B2; JP7169315B2; PL3296407T3; DK1730303T3; LT3296407T; JP2018023400A; PT3556866T; EP2896703A2; US20200248275A1; JP6694543B2; CA2560696C; EP2497836B1; JP6695381B2; US10704105B2

Abstract

Método para identificar un individuo como candidato para terapia contra el cáncer con un inhibidor de p110α, que comprende: someter a prueba una primera muestra corporal obtenida del individuo, en el que la primera muestra corporal es un primer tejido que se sospecha que es neoplásico y una segunda muestra corporal obtenida del individuo en el que la segunda muestra corporal es un segundo tejido que no se sospecha que sea neoplásico para una mutación no sinónima, intragénica, activante en el exón 1, 9 ó 20 de una secuencia que codifica para PIK3CA, o la secuencia de proteína correspondiente, en el que una secuencia que codifica para PIK3CA de tipo natural comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2; e identificar el individuo como candidato para terapia contra el cáncer con un inhibidor de p110α si se determina una mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA o en una secuencia que codifica para PIK3CA en la primera muestra corporal y si la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA 15 o en una secuencia que codifica para PIK3CA está ausente en la segunda muestra corporal.

Description

DESCRIPCIÓN

Mutaciones del gen de PIK3CA en cánceres humanos

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

La invención se refiere al campo de métodos terapéuticos para el cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

10

Las PI3K son lípido cinasas que funcionan como transductores de señales aguas abajo de receptores de la superficie celular y median rutas importantes para el crecimiento, la proliferación, la adhesión, la supervivencia y la motilidad celulares (1, 2). Aunque se ha observado aumento de la actividad de PI3K en muchos tumores colorrectales y otros (3, 4), no se ha identificado ninguna mutación intragénica de PI3K.

15

Se ha notificado anteriormente que miembros de la ruta de PIK3 están alterados en cánceres, por ejemplo, el gen supresor de tumores PTEN (15, 16), cuya función es revertir la fosforilación mediada por PI3K (17, 18). Se ha notificado la reduplicación o amplificación de las regiones cromosómicas que contienen PIK3CA y AKT2 en algunos cánceres humanos (2, 19, 20), pero los genes que son las dianas de tales acontecimientos genéticos a gran escala no se han definido ni pueden definirse fácilmente. 20

El documento WO 98/31324, Zhang et al (Cancer Research, 63 (14), 4225-4231), Ma et al (Oncogene, 19 (23), 2739-2744) y Shayesteh et al (Nature Genetics, 21 (1), 99-102) dan a conocer la amplificación del gen de PIK3CA o la sobreexpresión del ARNm de PIK3CA en células cancerosas. Philip et al (Cancer Research, 61 (2), 7426-7429) sugieren que tumores humanos pueden albergar mutaciones somáticas en genes de P13K. Sin embargo, no hay 25 ninguna descripción en estos documentos de una mutación no sinónima, intragénica, activante en el exón 1, 9 ó 20 de la secuencia que codifica para PIK3CA, o la secuencia de proteína correspondiente.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

30

En una primera realización, se proporciona un método para identificar a un individuo como candidato para terapia contra el cáncer con un inhibidor de P110 según la reivindicación 1.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

35

Figura 1. Detección de mutaciones en PIK3CA. Ejemplos representativos de mutaciones en los exones 9 y 20. En cada caso, se obtuvo el cromatograma de secuencia superior de tejido normal y los tres cromatogramas de secuencia inferiores de los tumores indicados. Las flechas indican la ubicación de las mutaciones de cambio de sentido. Las alteraciones de nucleótidos y aminoácidos se indican por encima de la flecha.

40

Figura 2. Distribución de mutaciones en PIK3CA. Las flechas indican la ubicación de mutaciones de cambio de sentido, y los recuadros representan dominios funcionales (p85BD, dominio de unión a p85; RBD, dominio de unión a Ras; dominio C2; dominio helicoidal; dominio cinasa). El porcentaje de mutaciones detectado dentro de cada región en cánceres se indica a continuación.

45

Figuras 3A-3C. Aumento de la actividad lípido cinasa de p110 mutante. Se transfectaron células NIH3T3 con vector vacío o con constructos de vector que contenía o bien p110 de tipo natural o bien p110 mutante (H1047R) tal como se indica por encima de los carriles. Se realizaron inmunoprecipitaciones con o bien IgG control o bien anticuerpos policlonales anti-p85. (Figura 3A) La mitad de los inmunoprecipitados se sometieron a un ensayo de PI3-cinasa usando fosfatidilinositol como sustrato. “PI3P” indica la posición de PI-3-fosfato determinada con marcadores 50 de fosfatidilo patrón y “Ori” indica el origen. (Figura 3B) La otra mitad de los inmunoprecipitados se analizó mediante inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpo anti-p110. (Figura 3C) Los lisados celulares de células transfectadas contenían cantidades similares de proteína total tal como se determina mediante inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-tubulina . Se observaron resultados idénticos a los mostrados en esta figura en tres experimentos de transfección independientes. 55

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El agrupamiento de mutaciones dentro de PIK3CA lo convierten en un excelente marcador para la detección temprana o para el seguimiento de la progresión de la enfermedad. Las pruebas centradas en las regiones 60 agrupadas producirán la mayor parte de los alelos mutantes.

La secuencia que codifica para PIK3CA humana se notifica en la bibliografía y se muestra en SEQ ID NO: 1. Esta es la secuencia de un individuo particular en la población de seres humanos. Los seres humanos varían entre sí en sus secuencias génicas. Estas variaciones son muy mínimas, produciéndose algunas veces a una frecuencia de 65

aproximadamente 1 a 10 nucleótidos por gen. Existen formas diferentes de cualquier gen particular dentro de la población humana. Estas formas diferentes se denominan variantes alélicas. Las variantes alélicas a menudo no cambian la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada; tales variantes se denominan sinónimas. Incluso si cambian el aminoácido codificado (no sinónimas), la función de la proteína no se ve afectada normalmente. Tales cambios son evolutiva o funcionalmente neutros. Cuando se hace referencia a PIK3CA humana en la presente 5 solicitud, se pretende que todas las variantes alélicas se abarquen por el término. La secuencia de SEQ ID NO: 1 se proporciona meramente como ejemplo representativo de una secuencia humana de tipo natural. La invención no se limita a esta forma alélica individual de PIK3CA. Para los fines de determinar una mutación, pueden compararse las secuencias de PIK3CA determinadas en una muestra de prueba con una secuencia determinada en un tejido diferente del ser humano. Una diferencia en la secuencia en los dos tejidos indica una mutación somática. 10 Alternativamente, puede compararse la secuencia determinada en un gen de PIK3CA en una muestra de prueba con la secuencia de SEQ ID NO: 1. Puede identificarse una diferencia entre la secuencia de muestra de prueba y SEQ ID NO: 1 como una mutación. Pueden someterse a prueba tejidos que se sospecha que son cancerosos, como también muestras corporales que puede esperarse que contengan células descamadas de tumores o células de cáncer. Las muestras corporales adecuadas para las pruebas incluyen sangre, suero, plasma, esputo, orina, heces, 15 aspirado del pezón, saliva y líquido cefalorraquídeo.

Las mutaciones en PIK3CA se agrupan en los exones 9 (SEQ ID NO: 4) y 20 (SEQ ID NO: 5). Se producen otras mutaciones, pero estos dos exones parecen ser los puntos activos para las mutaciones. Muchas mutaciones se producen en el dominio helicoidal de PIK3CA (nt 1567-2124 de SEQ ID NO: 2) y en su dominio cinasa (nt 2095-3096 20 de SEQ ID NO: 2). Menos se producen en el dominio P85BD de PIK3CA (nt 103-335 de SEQ ID NO: 2). Se han encontrado mutaciones en los exones 1, 2, 4, 5, 7, 9, 13, 18 y 20. Puede someterse a prueba cualquier combinación de estos exones, opcionalmente junto con pruebas en otros exones. Las pruebas para detectar mutaciones pueden realizarse a lo largo de la secuencia codificante completa o pueden centrarse en las zonas en la que se ha encontrado que se agrupan las mutaciones. Se producen zonas activas particulares de mutaciones en las posiciones 25 de nucleótido 1624, 1633, 1636 y 3140 de la secuencia que codifica para PIK3CA.

Se han encontrado mutaciones de PIK3CA en una variedad de diferentes tipos de tumores. Por tanto, puede someterse a prueba cualquiera de una variedad de tumores para detectar mutaciones de PIK3CA. Estos tejidos incluyen, sin limitación: tejido colorrectal, tejido cerebral, tejido gástrico, tejido de mama y tejido pulmonar. 30

Puede detectarse cualquier tipo de mutación intragénica. Éstas incluyen mutaciones por sustitución, mutaciones por deleción y mutaciones por inserción. Es probable que el tamaño de las mutaciones sea pequeño, del orden de 1 a 3 nucleótidos. Las mutaciones que pueden detectarse incluyen, pero no se limitan a, G1624A, G1633A, C1636A, A3140G, G113A, T1258C, G3129T, C3139T y G2702T. Puede someterse a prueba cualquier combinación de estas 35 mutaciones.

Las mutaciones que se encuentran en PIK3CA parecen ser mutaciones activantes. Por tanto, pueden usarse regímenes terapéuticos que implican la inhibición de la actividad o expresión de p110 para inhibir la progresión de un tumor en un ser humano. Las moléculas inhibidoras que pueden usarse incluyen oligonucleótidos antisentido o 40 constructos antisentido, una molécula que comprende una región de unión a anticuerpo y moléculas de ARNip. Las moléculas que comprenden una región de unión a anticuerpo pueden ser anticuerpos completos, regiones variables de cadena sencilla, fragmentos de anticuerpo, conjugados de anticuerpo, etc. Las regiones de unión a anticuerpo pueden pero no necesitan unirse a los epítopos contenidos dentro del dominio cinasa (nt 2095-3096 de SEQ ID NO: 2) de PIK3CA, el dominio helicoidal (nt 1567-2124 de SEQ ID NO: 2) de PIK3CA o el dominio P85BD (nt 103-335 de 45 SEQ ID NO: 2) de PIK3CA.

Pueden usarse constructos antisentido, oligonucleótidos antisentido, constructos de interferencia de ARN o moléculas de ARN de dúplex de ARNip para interferir con la expresión de PIK3CA. Normalmente, al menos 15, 17, 19 ó 21 nucleótidos del complemento de la secuencia de ARNm de PIK3CA son suficientes para una molécula 50 antisentido. Normalmente al menos 19, 21, 22 ó 23 nucleótidos de PIK3CA son suficientes para una molécula de interferencia de ARN. Preferiblemente, una molécula de interferencia de ARN tendrá una proyección en 3’ de 2 nucleótidos. Si la molécula de interferencia de ARN se expresa en una célula a partir de un constructo, por ejemplo a partir de una molécula de horquilla o a partir de una repetición invertida de la secuencia de PIK3CA deseada, entonces la maquinaria celular endógena creará las proyecciones. Pueden prepararse moléculas de ARNip 55 mediante síntesis química, transcripción in vitro o digestión de ARNbc largo mediante ARNasa III o Dicer. Éstas pueden introducirse en las células mediante transfección, electroporación u otros métodos conocidos en la técnica. Véanse Hannon, GJ, 2002, RNA Interference, Nature 418: 244-251; Bernstein E et al., 2002, The rest is silence. RNA 7: 1509-1521; Hutvagner G et al., RNAi: Nature abhors a double-strand. Curr. Opin. Genetics & Development 12: 225-232; Brummelkamp, 2002, A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. 60 Science 296: 550-553; Lee NS, Dohjima T, Bauer G, Li H, Li M-J, Ehsani A, Salvaterra P y Rossi J. (2002). Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnol. 20:500-505; Miyagishi M y Taira K. (2002). U6-promoter-driven siRNAs with four uridine 3’ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nature Biotechnol. 20:497-500; Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, Hannon GJ y Conklin DS. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in 65

mammalian cells. Genes & Dev. 16:948-958; Paul CP, Good PD, Winer I y Engelke DR. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnol. 20:505-508; Sui G, Soohoo C, Affar E-B, Gay F, Shi Y, Forrester WC y Shi Y. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6):5515-5520; Yu J-Y, DeRuiter SL y Turner DL. (2002). RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99(9):6047-5 6052.

Pueden suministrarse moléculas de interferencia de ARN o antisentido in vitro a células o in vivo, por ejemplo, a tumores de un mamífero. Pueden usarse medios de suministro típicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede lograrse el suministro a un tumor mediante inyecciones intratumorales. Pueden usarse otros modos de suministro sin 10 limitación, incluyendo: suministro intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, local durante cirugía, endoscópico, subcutáneo y oral. En un modelo de ratón, la interferencia de ARN o el ARN antisentido puede administrarse a una célula tumoral in vitro, y la célula tumoral puede administrarse posteriormente a un ratón. Pueden seleccionarse vectores para propiedades deseables para cualquier aplicación particular. Los vectores pueden ser virales o de plásmido. Los vectores adenovirales son útiles a este respecto. Pueden usarse promotores 15 específicos de tejido, específicos del tipo de célula o regulables de otro modo para controlar la transcripción de las moléculas de polinucleótido inhibidoras. También pueden usarse portadores no virales tales como liposomas o nanoesferas.

Usando la proteína p110, un experto habitual en la técnica puede generar fácilmente anticuerpos que se unen 20 específicamente a las proteínas. Tales anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Pueden ser quiméricos, humanizados o totalmente humanos. Pueden usarse cualquier derivado o fragmento funcional de un anticuerpo incluyendo Fab, Fab’, Fab2, Fab’2, y regiones variables de cadena sencilla. Pueden usarse siempre que el fragmento o derivado conserve la especificidad de unión para la proteína. Pueden someterse a prueba anticuerpos para determinar su especificidad de unión comparando la unión a un antígeno apropiado con la unión a un antígeno 25 o mezcla de antígenos irrelevantes en un conjunto de condiciones dado. Si el anticuerpo se une al antígeno apropiado al menos 2, 5, 7 y preferiblemente 10 veces más que al antígeno o mezcla de antígenos irrelevantes, entonces se considera que es específico.

En la técnica se conocen técnicas para preparar tales anticuerpos de parcial a completamente humanos y puede 30 usarse cualquiera de tales técnicas. Según una realización particularmente preferida, se preparan secuencias de anticuerpos completamente humanos en un ratón transgénico que se ha modificado por ingeniería genética para expresar genes de anticuerpos de cadenas pesadas y ligeras humanas. Se han preparado múltiples cepas de tales ratones transgénicos que pueden producir diferentes clases de anticuerpos. Pueden fusionarse células B de ratones transgénicos que están produciendo un anticuerpo deseable para preparar líneas celulares de hibridoma para la 35 producción continua del anticuerpo deseado. Véanse por ejemplo, Nina D. Russel, Jose R. F. Corvalan, Michael L. Gallo, C. Geoffrey Davis, Liise-Anne Pirofski. Production of Protective Human Antipneumococcal Antibodies by Transgenic Mice with Human Immunoglobulin Loci Infection and Immunity. Abril de 2000, págs. 1820-1826; Michael L. Gallo, Vladimir E. Ivanov, Aya Jakobovits y C. Geoffrey Davis. The human immunoglobulin loci introduced into mice: V (D) and J gene segment usage similar to that of adult humans European Journal of Immunology 30: 534-540, 40 2000; Larry L. Green. Antibody engineering via genetic engineering of the mouse: XenoMouse strains are a vehicle for the facile generation of therapeutic human monoclonal antibodies Journal of Immunological Methods 231 11-23, 1999; Yang X-D, Corvalan JRF, Wang P, Roy CM-N y Davis CG. Fully Human Anti-interleukin-8 Monoclonal Antibodies: Potential Therapeutics for the Treatment of Inflammatory Disease States. Journal of Leukocyte Biology vol. 66, págs. 401-410 (1999); Yang X-D, Jia X-C, Corvalan JRF, Wang P, CG Davis y Jakobovits A. Eradication of 45 Established Tumors by a Fully Human Monoclonal Antibody to the Epidermal Growth Factor Receptor without Concomitant Chemotherapy. Cancer Research vol. 59, número 6, págs. 1236-1243 (1999); Jakobovits A. Production and selection of antigen-specific fully human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig loci. Advanced Drug Delivery Reviews vol. 31, págs: 33-42 (1998); Green L y Jakobovits A. Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial 50 chromosomes. J. Exp. Med. Vol. 188, número 3, págs.: 483-495 (1998); Jakobovits A. The long-awaited magic bullets: therapeutic human monoclonal antibodies from transgenic mice. Exp. Opin. Invest. Drugs vol. 7(4), págs.: 607-614 (1998); Tsuda H, Maynard-Currie K, Reid L, Yoshida T, Edamura K, Maeda N, Smithies O, Jakobovits A. Inactivation of Mouse HPRT locus by a 203-bp retrotransposon insertion and a 55-kb gene-targeted deletion: establishment of new HPRT-Deficient mouse embryonic stem cell lines. Genomics vol. 42, págs: 413-421 (1997); 55 Sherman-Gold, R. Monoclonal Antibodies: The Evolution from ’80s Magic Bullets To Mature, Mainstream Applications as Clinical Therapeutics. Genetic Engineering News vol. 17, número 14 (agosto de 1997); Mendez M, Green L, Corvalan J, Jia X-C, Maynard-Currie C, Yang X-d, Gallo M, Louie D, Lee D, Erickson K, Luna J, Roy C, Abderrahim H, Kirschenbaum F, Noguchi M, Smith D, Fukushima A, Hales J, Finer M, Davis C, Zsebo K, Jakobovits A. Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. 60 Nature Genetics vol. 15, págs.: 146-156 (1997); Jakobovits A. Mice engineered with human immunoglobulin YACs: A new technology for production of fully human antibodies for autoimmunity therapy. Weir’s Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System vol. IV, págs.: 194.1-194.7 (1996); Jakobovits A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology vol. 6, n.º 5, págs.: 561-566 (1995); Mendez M, Abderrahim H, Noguchi M, David N, Hardy M, Green L, Tsuda H, Yoast S, Maynard-Currie C, Garza D, Gemmill 65

R, Jakobovits A, Klapholz S. Analysis of the structural integrity of YACs comprising human immunoglobulin genes in yeast and in embryonic stem cells. Genomics vol. 26, págs.: 294-307 (1995); Jakobovits A. YAC Vectors: Humanizing the mouse genome. Current Biology vol. 4, n.º 8, págs.: 761-763 (1994); Arbones M, Ord D, Ley K, Ratech H, Maynard-Curry K, Otten G, Capon D, Tedder T. Lymphocyte homing and leukocyte rolling and migration are impaired in L-selectin-deficient mice. Immunity vol. 1, n.º 4, págs.: 247-260 (1994); Green L, Hardy M, Maynard-5 Curry K, Tsuda H, Louie D, Mendez M, Abderrahim H, Noguchi M, Smith D, Zeng Y, et al. Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nature Genetics vol. 7, n.º 1, págs.: 13-21 (1994); Jakobovits A, Moore A, Green L, Vergara G, Maynard-Curry K, Austin H, Klapholz S. Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificial chromosome. Nature vol. 362, n.º 6417, págs.: 255-258 (1993); Jakobovits A, Vergara G, Kennedy J, Hales J, McGuinness R, Casentini-Borocz D, Brenner D, Otten 10 G. Analysis of homozygous mutant chimeric mice: deletion of the immunoglobulin heavy-chain joining region blocks B-cell development and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences USA vol. 90, n.º 6, págs.: 2551-2555 (1993); Kucherlapati et al., documento U.S. 6.1075.181.

También pueden prepararse anticuerpos usando técnicas de presentación en fago. Tales técnicas pueden usarse 15 para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con características de especificidad o avidez alteradas. También pueden usarse Fv de cadena sencilla según sea conveniente. Pueden prepararse a partir de ratones transgénicos vacunados, si se desea. Pueden producirse anticuerpos en cultivo celular, en fago o en diversos animales, incluyendo pero sin limitarse a vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés, simios. 20

Los anticuerpos pueden marcarse con un resto detectable tal como un átomo radiactivo, un cromóforo, un fluoróforo o similar. Tales anticuerpos marcados pueden usarse para técnicas de diagnóstico, o bien in vivo, o bien en una muestra de prueba aislada. Los anticuerpos también pueden conjugarse, por ejemplo, con un agente farmacéutico, tal como un fármaco quimioterápico o una toxina. Pueden unirse a una citocina, a un ligando, a otro anticuerpo. Los 25 agentes adecuados para acoplarse a anticuerpos para lograr un efecto antitumoral incluyen citocinas, tales como interleucina 2 (IL-2) y factor de necrosis tumoral (TNF); fotosensibilizadores, para su uso en terapia fotodinámica, incluyendo tetrasulfonato de ftalocianina de aluminio (III), hematoporfirina y ftalocianina; radionúclidos, tales como yodo-131 (131I), itrio-90 (90Y), bismuto-212 (212Bi), bismuto-213 (213Bi), tecnecio-99m (99mTc), renio-186 (186Re) y renio-188 (188Re); antibióticos, tales como doxorubicina, adriamicina, daunorubicina, metotrexato, daunomicina, 30 neocarzinostatina y carboplatino; toxinas bacterianas, vegetales y otras, tales como toxina diftérica, exotoxina A de Pseudomonas, enterotoxina A estafilocócica, toxina abrina-A, ricina A (ricina A desglicosilada y ricina A nativa), toxina TGF-alfa, citotoxina de cobra china (Naja naja atra) y gelonina (una toxina vegetal); proteínas inactivantes de ribosomas de plantas, bacterias y hongos, tales como restrictocina (una proteína inactivante de ribosomas producida por Aspergillus restrictus), saporina (una proteína inactivante de ribosomas de Saponaria officinalis) y ARNasa; 35 inhibidores de tirosina cinasas; ly207702 (un nucleósido de purina difluorado); liposomas que contienen agentes antitumorales (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, plásmidos que codifican para toxinas, metotrexato, etc.); y otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, tales como F(ab).

Los expertos en la técnica comprenderán fácilmente y podrán preparar tales derivados de anticuerpos, ya que se 40 conocen bien en la técnica. Los anticuerpos pueden ser citotóxicos por sí mismos, o pueden usare para suministrar agentes citotóxicos a ubicaciones particulares en el cuerpo. Los anticuerpos pueden administrarse a individuos que lo necesitan como forma de inmunización pasiva.

Dado el éxito de los inhibidores de proteína cinasas de molécula pequeña, pueden desarrollarse inhibidores 45 específicos o no específicos de p110 para el tratamiento del gran número de pacientes con estas mutaciones o cánceres en general. Claramente, es posible desarrollar inhibidores de PI3K de amplio espectro, tal como se documenta mediante estudios de LY294002 y wortmanina (2, 21, 22). Los datos sugieren que merecería la pena el desarrollo de inhibidores más específicos que seleccionen como diana p110 pero no otras PI3K.

50

Pueden identificarse agentes quimioterápicos candidatos como agentes que inhiben la actividad o expresión de p110. Los compuestos de prueba pueden ser sintéticos o producirse de manera natural. Puede identificarse previamente como que tienen actividad fisiológica o no. Las pruebas sobre agentes quimioterápicos candidatos pueden realizarse en sistemas libres de células o en células completas. Puede someterse a prueba la actividad de p110 mediante cualquier medio conocido en la técnica. Éstos incluyen los métodos enseñados en las referencias 2, 55 22 y en Truitt et al., J Exp. Med., 179, 1071-1076 (1994). La expresión puede monitorizarse determinando la proteína o el ARNm de PI3KCA. Pueden usarse métodos de anticuerpos tales como inmunotransferencia de tipo Western para determinar la proteína. Puede usarse transferencia de tipo Northern para medir el ARNm. Pueden usarse otros métodos sin limitación. Cuando se somete a prueba para determinar agentes quimioterápicos, la p110 usada en el ensayo puede ser una forma de tipo natural o una forma activada. La forma activada puede contener una mutación 60 por sustitución seleccionada del grupo que consiste en E542K, E545K, Q546K y H1047R. Además, pueden someterse a prueba inhibidores para determinar su especificidad por o bien p110 o bien una forma activada de p110. Pueden realizarse pruebas comparativas frente a enzimas similares incluyendo PIK3CB, PIK3CG, PIK3C2A, PIK3C2B, PIK3C2G, PIK3C3, A-TM, ATR, FRAP1, LAT1-3TM, SMG1, PRKDC y TRRAP para determinar la especificad relativa por la enzima p110. 65

Una vez que se identifica una mutación activante intragénica, no sinónima en una secuencia que codifica para PIK3CA en un tejido de prueba de un paciente, puede usarse esa información para tomar decisiones terapéuticas. Pacientes con tales mutaciones son buenos candidatos para la terapia con un inhibidor de p110. Tales inhibidores pueden ser específicos o generales para la familia de inhibidores. Tales inhibidores incluyen LY294002 y 5 wortmanina. Tales inhibidores incluyen además moléculas que comprenden una región de unión a anticuerpo específica para p110. Tales moléculas se comentaron anteriormente.

Pueden proporcionarse conjuntos de cebadores para amplificar y/o secuenciar PIK3CA en kits o ensamblarse a partir de componentes. Los conjuntos útiles incluyen pares de cebadores directos e inversos opcionalmente 10 combinados con cebadores de secuenciación. Los cebadores directos se muestran en SEQ ID NO: 6 a 158. Los cebadores inversos se muestran en SEQ ID NO: 159 a 310. Los cebadores de secuenciación se muestran en: SEQ ID NO: 311 a 461. Pueden envasarse pares o tripletes o combinaciones de estos pares o tripletes y usarse juntos para amplificar y/o secuenciar partes del gen de PIK3CA. Pueden envasarse pares en recipientes individuales o divididos. Pueden proporcionarse instrucciones para usar los cebadores según los métodos de la presente invención 15 en cualquier medio que sea conveniente, incluyendo papel, electrónico o una dirección de Internet.

EJEMPLOS

Ejemplo 1-Este ejemplo demuestra que el gen de PIK3CA es la diana predominante de mutaciones en esta familia 20 génica

Para evaluar si PI3K están implicadas genéticamente en tumorigénesis, se examinaron directamente las secuencias de ADN de miembros de esta familia génica en cánceres colorrectales.

25

Las subunidades catalíticas de PI3K se dividen en tres clases principales dependiendo de su especificidad de sustrato (5). Adicionalmente, un conjunto de proteínas relacionadas más lejanamente, incluyendo miembros de la familia mTOR, constituyen una cuarta clase (6). Se usaron modelos de Markov escondidos para identificar 15 genes humanos que contenían dominios cinasa relacionados con los de PI3K conocidas en el genoma humano (7). Éstas comprendían siete PI3K, seis miembros de la subfamilia mTOR y dos genes similares a PI3K no caracterizados 30 (tabla 1).

Tabla 1. Genes de PI3K analizados

Nombre del gen: N.º de registro de Celera N.º de registro de Genbank Nombres alternativos Grupo*

PIK3CA PIK3CB PIK3CD PIK3CG PIK3C2A PIK3C2B PIK3C2G PIK3C3 ATM ATR FRAP1 SMG1 PRKDC TRRAP ninguno ninguno: hCT1640694 hCT7084 hCT229201.1 hCT7976 hCT2270768 hCT7448 hCT1951422 hCT13660 hCT29277 hCT1951523 hCT2292935 hCT2273636 hCT2257127 hCT32594 hCT2257641 hCT13051 NM_006218 NM_006219 NM_005026 NM_002649 NM_002645 NM_002646 NM_004570 NM_002647 NM_000051 NM_001184 NM_004958 NM_014006 NM_006904 NM_003496 ninguno ninguno p190-alfa PIK3C1, p110-beta p110-delta PI3CG, P13K-gamma CPK, PI3-K-C2A, PI3K-C2alfa C2-PI3K, PI3K-C2beta PI3K-C2-gamma Vps34 AT1, ATA, ATC, ATD, ATE, ATDC FRP1, SCKL, SCKL1 FRAP, MTOR, FRAP2, RAFT1, RAPT1 ATX, LIP, KIAA0421 p350, DNAPK, DNPK1, HYRC1, XRCC7 TR-AP, PAF400 Clase IA Clase IA Clase IA Clase IB Clase II Clase II Clase II Clase III Clase IV Clase IV Clase IV Clase lV Clase IV Clase IV Clase IV ’ Clase IV

*Los genes de PI3K se agrupan en las clases descritas anteriormente (S3,S4). Las clases I, II y III comprenden subunidades catalíticas de PI3K, mientras que la clase IV comprende genes similares a PI3K incluyendo miembros de las subfamilias mTOR (diana de rapamicina), ATM (ataxia telangiectasia mutada) y DNAPK (proteína cinasa dependiente de ADN), así como dos genes no caracterizados anteriormente.

35

Se examinaron inicialmente 111 exones que codificaban para los dominios cinasa pronosticados de estos genes (tabla 2). Se amplificaron los exones y se secuenciaron directamente mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de ADN genómico de 35 cánceres colorrectales (8). Sólo uno de los genes (PIK3CA) contenía alguna mutación somática (es decir, específica de tumor).

Tabla 2. Cebadores usaros para la amplificación y secuenciación por PCR

Nombre del gen y el exón: Cebador directo1 Cebador inverso2 Cebador de secuenciación3

hCT2270768-Ex21: TTCCAGCCTGGGTAACAAAG CGTCAGAACAAGACCCTGTG AAAGGGGAAATGCGTAGGAC

hCT2270768-Ex22: CCTGACCTCAGGTGTTCTGC CCCGGCCACTAAGTTATTTTTC TCCCAAAGTGCTGGGATTAC

hCT2270768-Ex23: TGCACATTCTGCACGTGTATC CTGCCATTAAATGCGTCTTG CCAGAACTTAAAGTGAAATTTAAAAAG

hCT2270768-Ex24: TCCCAGTTTGTATGCTATTGAGAG CTTTGGGCCTTTTTCATTCC GCGAGGCAAAACACAAAGC

hCT2270768-Ex25: TGGAAATTCAAAAGTGTGTGG TGTCTGGCTTATTTCACACG TTGGAAATGGCTGTACCTCAG

hCT2270768-Ex26: CACTAATGAACCCCTCAAGACTG AACTTTTGACAGCCTACTATGTGC TACTTGAGCAGCCCACAGG

hCT2270768-Ex27-1: TCCTTGGCAAAGTGACAATC GACCATTCATGAAAGAAACAAGC AAAGGAATGAAAGTGGTTTTTGTC

hCT13660-Ex16: CTCTCACATACAACACCATCTCC CCATGTACCGGTAACAAAAGAAG TGCAATGTAATAGTTTTCCAAGG

hCT13660-Ex17: ATGTATCTCATTGAAAACCCAAC TGAGCTTTCTAGGATCGTACCTG CAGCAAATGAACTAAGCCACAG

hCT13660-Ex18: TCCCAAAGTGCTGGGATTAC GCAGGAAGGTCCAACTTGTC TGCTATACTATTTGCCCACAAAAC

hCT13660-Ex19: CCTATGACATAAATGCCAGTACAAAC ATCTTCAACTGCGAACATGC GAATGCATTTATTCAGAGATGAGG

hCT13660-Ex20: TCTTTTGTTCAGTCAGCATCTCTC AAGCATCAATGACTACTTTAATCAAC TGCTAGACACTTGCTGGTCAC

hCT13660-Ex21: TTGAGAATTCAGATGAGAAACCAG TCCCAAAGTGCTGGGATTAC TTGATATTAAAGTTGCACAAACTGC

hCT13660-EX12: GAAGGCCACTCTCAAACCTG TTGTTGCCTTTGTCATTTTG TCAATTGTGTGACATATCACCTACC

hCT13660-Ex23: TCAAGGCTTGCATTTCATTG ATGTGACTGTGGGCAGGAAC TCACTGTAGAAATCCAAGTACCAC

hCT13660-Ex24: TTCCACACTCCAAAGAATGC GCTGGTGAGATGTCAAAACG TCTGCATCAGTTTGATTCTGC

hCT13660-Ex25-1: AATTGCAATCCTCTTGGTAGC TCAACATATTACTTCCTCCAGAACTC AATGCACTTTTTATTTTATTAG

hCT32594-Ex66-2: GCCAAGACCAAGCAACTCC TTCTCCCATGTCAGGGAATC GAAAAGTGCCGGTTCTTGAG

hCT32594-Ex67-1: ATAAACGACCGCTGGCCTAC GACCCTCAAAGGCTAACGTG GCCTACACAGTCCGTTTTCC

hCT32594-Ex67-2: GTACATCCGGGGACACAATG TCCCTGGTCAGCACAGACTAC AGAGGAGCGTGTGTTGCAG

hCT32594-Ex68: ACCGGGTTCTTCCAGCTAAG AGCTGTCTCATTTCCACCATC ACTCTGACGGTGGAGCTGAG

hCT32594-Ex69-1: CAATGCGTGCGTTAAATCTG CGCGTCGTTTATGTCAAATC GCTCTTGGTGCTAAGTTAAAGAGG

hCT32594-Ex69-2: CCCAATGCCACGGACTAC CGCGTCGTTTATGTCAAATC ATCCAGCTGGGTCTGATAGG

hCT32594-Ex70: ATCCAGCTGGCTCTGATAGG CATAACACACAGGGGTGCTG TGAACAGCCAGATCCTCTCC

hCT32594-Ex71: CTGGTGCTGAAACTCGACTG GAACTGGGCGAGGTTGTG GTCCCACCTTGTTAGGAAGC

hCT32594-Ex72-1: GTCTCGTTCTCTCCCTCACG TCCCTTTCTTACACGCAAAC TGGCATTCTGAAAACGGTTC

hCT32594-Ex72-2: CACAACCTCGCCCAGTTC CAGTTCCGCCTGTACATTCAC GCAAACAGCCTGGACAATC

hCT7976-Ex5: AGCATCACCCTCAGAGCATAC AGCGCTCCTGCTTTCAGTC CACATATTTCTGTCCCCTGTTG

hCT7976-Ex6: TGCCATACCTCTTAGGCACTTC GTCTTGGCGCAGATCATCAC TGTGGTTCTTTGGAGCACAG

hCT7976-Ex7: CGACAGAGCAAGATTCCATC TTTTGTCACCAGTTGAAATGC CCAAGGTACATTTCGGAAAAC

hCT7976-Ex8: AGATTGCCATCTGAGGAAGG GACTGGGAAAAAGCATGAGC ACCAGCCCTTTCCTCTTGTC

hCT7976-Ex9: GCATGGAGAGGAAGTGAACC CGGTGATCATAATATTGTCATTGTG TTCTTCCTCATGCCATTGTG

hCT7976-Ex10: TGGCCAGAGAGTTTGATTTATG GGAAGTGTGGGCTTGTCTTC GTGGCATCTGGCTGTCATC

hCT7976-Ex11-1: CCCTCAATCTCTTGGGAAAG TGCACAGTCCATCCTTTGTC CAATTAGTTTTCCTTGAGCACTCC

hCT7976-Ex11-2: TGGTTTCTTCTCATGGACAGG AATGCCAGCTTTCACAATGTC TCTTCTTTATCCAGGACATCTGTG

hCT7448-Ex21: GGGTGTCCACACTTCTCAGG GGCCAAGACCACATGGTAAG CCTGGGAGAGGTCTGGTTC

hCT7448-Ex22: CCGGAAGAAACAATGAGCAG TCCTACATTAAGACAGCATGGAAC GGCAGCATCTTGGTCTGAAG

hCT7448-Ex23: GGTGTGAGCTGAGTGAGCAG TGCCTCCCTTTTAAGGCTATC GAGCACTTGGGAGACCTGAG

hCT7448-Ex24: GTGGGAATGACCTTCCTTTC AGGTCCTTCTGCCAACAAAG AGGGAAGCATGAGCACAGTC

hCT7448-Ex25: GGATGAACAGGCAGATGTGAG CGTCTTCTCTCCTCCAATGC TGAGTTCTGTCTGGCTGTGG

hCT7448-Ex26: AGCCCCTTCTATCCAGTGTG GGTATTCAGTTGGGGCTCAG TGATGAGGGATGAGGGAAAC

hCT7448-Ex27: TGCCCACAGCATCTGTCTAC TGTATCCACGTGGTCAGCTC AGGGTTAGGGAGCCTAGCTG

hCT7448-Ex28-1: ATTGTGTGCCAGTCATTTGC ACAGGACGCTCGGTCAAC TCCTTGGAACACCCCTGTC

hCT1951523-Ex39-2: TTCCACATTAAGCATGAGCAC TTGCCATCAGTACAAATGAGTTTAG CAGTCATGATACCTACACTTCCATC

hCT1951523-Ex40: GACAGTCATTGTTTTCATAGGTCATAG TTCCTGCTTTTTAAGAGTGATCTG CAACTCTGAAATAAAAGCAATCTGG

hCT1953523-Ex41: CCACATAGTAAGCCTTCAATGAC AGGAAGGAAGGGATGGAAAC TTCTTTGGTTATGAAATGAACAATC

hCT1951523-Ex42: TGAAAAATGTTCCTTTATTCTTG AGAAACCACTCATGAAAA TTGAATAAAAGTAGATGTTTCTTGTCC

hCT1951523-Ex43: TCTGAGAACATTCCCTGATCC CGCATTACTACATGATCCACTG TACCAAGAATATAATACGTTGTTATGG

hCT2257127-Ex76: TCAGCTCTCTAATCCTGAACTGC TGTCACAGAAAGCATGAGACC CGGCTTCTGGCACATAAAAC

hCT2257127-Ex77-1: AGCAGAGAAGAAACATATACCAT AGAAATAACTGTCAATATCCCAGTATCAC CCATTGAGCACTCCATTCATTAC

hCT2257127-Ex77-2: CATTTTGGGAAAGGAGGTTC TCATTAAACATTTAGTAATGTGTGCTC CCCTGGGAATCTGAAAGAATG

hCT2257127-Ex78: ATTACAGGCGTGAGCCACTG AGGCAACAGGGCAAGACTC TGGGCCGTRGTCTCATATAC

hCT2257127-Ex79-1: TTTGGCACTGTCTTCAGAGG CCTGAAAGGGAGAATAAAAGG CACTCTGGCTTTTCCCTCTG

hCT2257127-Ex79-2: AGAGGGAACACCCTTTCCTG CCTGAAAGGGAGAATAAAAGG AGGTCATGAATGGGATCCTG

hCT2257127-Ex80: TATAGCGTTGTGCCCATGAC TATTGACCCAGCCAGCAGAC CATATTGCTTGGCGTCCAC

hCT2257127-Ex81: TCCTGCCTCTTTGCTATTTTTCAATG TATATTGAGACTCAAATATCGA TCTTGGTGATCTTTGCCTTTG

hCT2257127-Ex82: TTGCCTCAGAGAGATCATCAAG TGATGCATATCAGAGCGTGAG TCATCAAGATTATTCGATATTTGAGTC

hCT2257127-Ex83-1: TAGGGGCGCTAATCGTACTG TTCAATGACCATGACAAAACG CGAGAAAGTAAAGTGCCTGCTG

hCT2257127-Ex83-2: TCTGATATGCATCAGCCACTG TTCAATGACCATGACAAAACG CGGGATTGGAGACAGACATC

hCT2257127-Ex84: TGATTTCAAGGGAAGCAGAG TGGTTTTCAAGCAGACAATCC GAGGATGCTGCCATTTGTG

hCT2257127-Ex85: TGTAGAAAGCAAGGCTGCTC TCCTCCTCAATGAAAGCAGAG CATGCTAACAGAGTGTCAAGAGC

hCT1951422-Ex19: ACCCCAAAGTCATCCAAGTG CAATGTGATCCCAACTGGTC CGAATTCTTTTTGCCATTTC

hCT1951422-Ex20: AAAGGCTCCAGTTGATGGAC TTATTGCCAATTGGAGTTTGG AAAGTCTGCAAGGGGCTATG

hCT1951422-Ex21: CCATTAAAACCACTCTAAGTCAGG TTCTGTTGGCTTATCATTTTTG TCAGGCTAGAAATGTATCCAAGG

hCT1951422-Ex22: AAGCCTCCTCCAGAAAAGAAG CCCAGAAACTAAATAAAATGCAG AAAGGAAAGGGGTAATCCAG

hCT1951422-Ex23: CCCTCCTGTCCACTGAGATG AATCAAATTTGTTGCATTAAAAATC TTTACTTTTTATGATTACCTCTGATGC

hCT1951422-Ex24: TCTCAAGCTGCCTCACAATG GTTTTCTCATTCCTTTCTCTTCC AAAGAAAATTCAAATGAAAATAAGTCG

hCT1951422-Ex25: AAAGACATTGCCATGCAAAC TTTGGGAAAGGGAACACAAG CATGCAAACTTGGGTCTAGATG

hCT1951422-Ex26: TTGTTGGGCTCCAAATAAAC GATTTTTCCTTGGAACATCCTC TTGGCTTTTTCCCCTCATAC

hCT13051-Ex5: CCCTGGAGTGCTTACATGAG CGGGGATCAGATTTGCTATG TAAAGCCTTTCCCAGCTCAG

hCT13051-Ex6: GACTTTATAAACACTCGACATTAGAGC TAGGGGGTCATCCTCAGGTC CCTGCTGCTTCCACAGGAC

hCT13051-Ex7: ATGATGACCTCTGGCAGGAC GTCTTCCCCTGCTCAATCAC CATGGACGTCCTGTGGAAG

hCT13051-Ex8: GAATCAACCGTCAGCGTGTC GACACGTTGTGGGCCAGCCAGT GTGTCCCATTCATCCTCACC

hCT13051-Ex9: CTGGCACCGGGGAAAACAGAG CTGCCGGTTATCTTCGGACACGTT AACAGAGGAGGCGCTGAAG

hCT2282983-Ex40: TGGACATCGACTACAAGTCTGG TGAGTGAGGGCAGACAGATG GCCTCACCCTACCCATCC

hCT2282983-Ex41: TCCTTGGGGTTTTGAAGAAG TGGCACCTGAACCATGTAAG AGATTGCTGGGGTTCCTTTC

hCT2282983-Ex42: AAGGCCTTCCAGACTCTTGC CGTACATGCCGAAGTCTGTC CCACCTCACTCCATCTCTGG

hCT2282983-Ex43: CCTCTTTGTTTTTCCCTACCG GCCCTGGTTTTAACCCTTAAC TGGGGTAAGTTCCCTGAGTG

hCT2282983-Ex44-1: CTTCCACAGTGGGGGTACAG CCAGCTCCAGCTTCTGACTC TACAGAGCCAGGGAGAGTGC

hCT2282983-Ex44-2: GACACAACGGCAACATTATGCTG TTGTGTTTTCTTGGAGACAG TATCATCCACATCGGTCAGC

hCT2292935-Ex46: CATTCCAAAGCATCTGGTTTTAC CAATGAGCATGGGAGAGATG TTTGGGACAAGTAATTGTTATTAGC

hCT2292935-Ex47: TTGTGAGGAACGTGTGATTAGG TGGAGTTTCTGGGACTACAGG TTGAATGCAGTGGTGCTCTC

hCT2292935-Ex48: CTGGGCAACAGAGCAAGAC CCTTCTTCAAAGCTGATTCTCTC TCTGCCTGTGTTCTGAGCTG

hCT2292935-Ex49: TCCCTTCTCCTTTGGCTATG CGCTCTACAGCCAATCACAG GAACTCAGCTCTGCCTGGAC

hCT2292935-Ex50: ATAGCACCACTGCCTTCCAG TGGCATCACAATCAATAGGG GCGAGACTCGGTCTCAAAAG

hCT2292935-Ex51: TGCAGAAGTGGAGGTGGAG CTCCAAGGGGGTTAGAGTCC ATCGTTTGCCAACTCCTAGC

hCT2292935-Ex52: AACCCAAGCTGCTTCCTTTC CAGGAAACCAGGTCAGAAGTG AATCAGTGCAGGTGATGCAG

hCT2292935-Ex53: AGTCCTGCCCTGATTCCTTC TTTTTGCAGAAAGGGGTCTTAC ACATGGCCTGTGTCTGCTTC

hCT2292935-Ex54: CCCACCCACTTATTCCTGAG GCCCACCCCACTCTAGAAAC GACTGGAAGAAAATAACCAAGTTTC

hCT2292935-Ex55: TTTCCCCTTTAGGGTAGGTAGG TGGAACCTTTTCTGCTCAAAG GGCAGGCGTTAAAGGAATAG

hCT2292935-Ex56: CGGACATAGAGGAAGGATTGC AGCTGCATGGTGCCAAAG AAAAACAGGGCACCCATTG

hCT2292935-Ex57: TGGCCAAACTTTTCAAATCC ATAACAATGGGCACATGCAG TTAAGCCCACAGGGAACAAG

hCT2292935-Ex58-1: TGGGAGAGCTCAGGGAATAC GGTCATTCTTCCATCAGCAAG TGTCAGACCTTGGCCTTTTC

hCT2273636-Ex35-1: TCCCAAAGTGCTGGGATTAC CACACCCACACTCACACAAAG TCTTCTGAAAAATGGAGGAAGTC

hCT2273636-Ex35-2: TTGGCTGCCATGACTAACAC GGCACTGCAGGCTAATAATG GCTCTTCCTGGGGAAGTCTC

hCT2273636-Ex36-1: GCTCTCAGTGTGCCTCATGG GGGACCTCAAGTCTTTTCCTTC CAGTTTTTGACTGCCACTGC

hCT2273636-Ex36-2: AAGAAACACCCCGGTTCC GGGACCTCAAGTCTTTTCCTTC TCCATGCTCGACACTATTCTG

hCT2273636-Ex37-1: AAATTTAGTTGAGTAATGAGAGAATGC GGAAGGGAAGGAGGACAAAC TTCTACTTTACATACAAAAGGCACTC

hCT2273636-Ex37-2: GTAAAATTGGCCCTGCTTTG CGTCTCAAACTACCAAGTCTGG AGTTGGGCTTAGCCTGGATG

hCT2273636-Ex38: CATAACCACATGCAGCAACC CACCCAGTGCTGTTTCAATG AGTATCACGTCCATGTTGGAG

hCT2273636-Ex39: AATTGGCCTTGGAGACAGAC CGCCGCATAATGTGTAAAAC CAATGTTTGCTTTGAAAAAGG

hCT2273636-Ex40-1: TTCATGTGAGCAGGTATGCTG TGCCATATTTAACTGCCATTTC TGAGCAAAACCTGTGGAATG

hCT2273636-Ex40-2: TTGTGTACGACCCTCTGGTG TGCCATATTTAACTGCCATTTC TTTGCTGGTGCTGTCTATGG

hCT2273636-Ex41: TTTGTACAGTGGAGGCAACG GCAGTCACTGAGACAGCTTTTATC GGATGTGCAAAATGTTCTTCTG

hCT7084-Ex17: CAGCTGGTTATGTGTGTTTATGG TAAGCATAGCCTCGGAGAAC GGGAGCAGGTGTTATTGATTG

hCT7084-Ex18: TGTCCTCATGGTTGCTTTTC GGACCATTAATAGCTACCTTCCTG GGTGAGGAGTTTTCCCAAGC

hCT7084-Ex19: CAGGGACATGCTATCCAAAG AGGCAAGACAACATATTTGAAAG AGCACAGAGTTTGTTAATGTTTTTAG

hCT7084-Ex20: TGGTGGAACTTGTGTTTTTCC AAGGGCTATGTGTCATTTTGTTC GCTGACTTCTATTGGGAGCATAC

hCT7084-Ex21: TCATACGGTTTTGGCAGCTC CATCAAGCAAGCAAACAAATG CAGAGGTATGGTTTGGGTCTC

hCT7084-Ex22: ACAGAGGGAGAAGGGCTCAG AATTCCCCCAAAAGCTTCC TGGGGGTCTAGGACTATGGAG

hCT7084-Ex23: TGGGACAATTTTCGCAGAAG TTCCCTCCTGGCTAAGAACC GCTGTGTTTTCTTAATTTCCTGTATG

hC77084-Ex24-1: ATGAAGCATGCTGCCTGATG AAAAGCAGAGGGAATCATCG CAGCCTCCTGCAGACTTTG

hCT2257641-Ex1-56: GGGGGCCTTTAGAAGGAAG TCCCATTCATGACCTGGAAG CATTTTGGGAAAGGAGGTTC

hCT2257641-Ex1-57: TGGAGTTCCTGAGAAATGAGC GGCCCGCTTTAAGAGATCAG CGGTCAGTATGACGGTAGGG

hCT2257641-Ex1-58: AGAGGGAACACCCTTTCCTG CATGCCCAAAGTCGATCC AGGTCATGAATGGGATCCTG

hCT2257641-Ex1-59: CATGATGTTGGAGCTTACATGC ACACATCCATGGTGTTGGTG GGCGCTAATCGTACTGAAAC

hCT2257641-Ex1-60: CGGGATTGGAGACAGACATC TGCCACAGCCACATAGTCTC TATGGTGGCCATGGAGACTG

hCT2257641-Ex1-61: CATCATGGTACACGCACTCC TTCTATCTGCAGACTCCCACAG AGGAGCCCTCCTTTGATTG

hCT29277-Ex55: CTCAATCAGAGCCTGAACCAC GGAAAAGAAAGCAGGAGAAGC GGCCAGTGGTATCTGCTGAC

hCT29277-Ex56: CCCGGCCTAAAGTTGTAGTTC AAATGGAGAAAAGCCTGGTTC AAGACAAAATCCCAAATAAAGCAG

hCT29277-Ex57: TGGGAGACTGTCAAGAGGTG AAGCAATCCTCCCACCTTG ATTGGTTTGAGTGCCCTTTG

hCT29277-Ex58: TTCCTCCAAGGAGCTTTGTC CCTTCCTTTTTCACTCACACAC AAAATGCTTTGCACTGACTCTG

hCT29277-Ex59: TTCCCTGTCCAGACTGTTAGC TGATTTAATAATGAAGATGGGTTGG TTCATCTTTATTGCCCCTATATCTG

hCT29277-Ex60: CCGGTTATGCACATCATTTAAG ACTCAGTACCCCAGGCAGAG TTAAAGATTATACCAAGTCAGTGGTC

hCT29277-Ex61: GCAGCCAGAGCAGAAGTAAAC TCAAACTCCTGGGCTCAAAC CATGTGGTTTCTTGCCTTTG

hCT29277-Ex62: TCTAATGAAAGCCCACTCTGC CAGCCACATCCCCCTATG AAGCATAGGCTCAGCATACTACAC

hCT29277-Ex63: AAGTGTGCATGATGTTTGTTCC TGCCTTCTTCCACTCCTTTC CCCATCAACTACCATGTGACTG

hCT29277-Ex64-1: GATGACCAAGAATGCAAACG AAGAGTGAAAGCAGAGATGTTCC GGTCCTGTTGTCAGTTTTTCAG

NM005026Ex17: ATCATCTTTAAGAACGGGGATGG ACTAAGCCTCAGGAGCAGCCT GGTCCTGGGGTGCTCCTAGA

NM005026Ex18: CCTCAGATGCTGGTGCCG GATACTTGGGGAAGAGAGACCTACC TCCTCAACTGAGCCAAGTAGCC

NM005026Ex19: TCTTCATGCCTTGGCTCTGG GAGGGGAGAGGAGGGGGAG TGTGTCCTCCATGTTCTGTTGG

NM005026Ex20: TCCGAGAGAGTGGGCAGGTA CACAAACCTGCCCACATTGC TGGCCCCTCTGCCTAGCA

NM005026Ex21: GGGCAGGTTTGTGGGTCAT CCTGGGCGGCTCAACTCT CCACTGCTGGGTCCTGGG

NM005026Ex22: GGAACTGGGGGCTCTGGG AGGCGTTTCCGTTTATGGC GAATAGAGAGCTTTTCCTGAGATGC

hCT1640694-Ex1-1: GTTTCTGCTTTGGGACAACCAT CTGCTTCTTGAGTAACACTTACG GATTCATCTTGAAGAAGTTGATGG

hCT1640694-Ex1-2: CTCCACGACCATCATCAGG GATTACGAAGGTATTGGTTTAGACAG ACTTGATGCCCCCAAGAATC

hCT1640694-Ex1-3: CCCCCTCCATCAACTTCTTC GGTGTTAAAAATAGTTCCATAGTTCG CTCAAGAAGCAGAAAGGGAAG

hCT1640694-Ex2-1: TCATCAAAAATTTGTTTTAACCTAGC TATAAGCAGTCCCTGCCTTC TCTACAGAGTTCCCTGTTTGC

hCT1640694-Ex2-2: TTCTGAACGTTTGTAAAGAAGCTG TATAAGCAGTCCCTGCCTTC GCTGTGGATCTTAGGGACCTC

hCT1640694-Ex3-1: GCAGCCCGCTCAGATATAAAC CTGGGCGAGAGTGAGATTCC AAAAAGCATTTCTGATATGGATAAAG

hCT1640694-Ex3-2: TCTGAAAATCAACCATGACTGTG ATGAACCCAGGAGGCAGAG TCGAAGTATGTTGCTATCCTCTG

hCT1640694-Ex4-1: TCTTGTGCTTCAACGTAAATCC CGGAGATTTGGATGTTCTCC AAAATAATAAGCATCAGCATTTGAC

hCT1640694-Ex4-2: TCTCAACTGCCAATGGACTG CGGAGATTTGGATGTTCTCC TTATTCCAGACGCATTTCCAC

hCT1640694-Ex5: TAGTGGATGAAGGCAGCAAC TTTGTAGAAATGGGGTCTTGC TTTGAGTCTATCGAGTGTGTGC

hCT1640694-Ex6: TGCCTTTTCCAATCAATCTC AATTCCTGAAGCTCTCCCAAG TTCCTGTTTTTCGTTTGGTTG

hCT1640694-Ex7: GGGGAAAAAGGAAAGAATGG TGCTGAACCAGTCAAACTCC TGAATTTTCCTTTTGGGGAAG

hCT1640694-Ex8: TTTGCTGAACCCTATTGGTG TTGCAATATTGGTCCTAGAGTTC TGGATCAAATCCAAATAAAGTAAGG

hCT1640694-Ex9: GATTGGTTCTTTCCTGTCTCTG CCACAAATATCAATTTACAACCATTG TTGCTTTTTCTGTAAATCATCTGTG

hCT1640694-Ex10: ACCTTTTGAACAGCATGCAA TGGAAATAATGTTAAGGGTGTTTTT TATTTCATTTATTTATGTGGAC

hCT1640694-Ex11: AAAACACCCTTAACATTATTTCCATAG TCTGCATGGCCGATCTAAAG GAAGTTAAGGCAGTGTTTTAGATGG

hCT1640694-Ex12: TTTATTCTAGATCCATACAACTTCCTTT AAAGTTGAGAAGCTCATCACTGGTAC ACCAGTAATATCCACTTTCTTTCTG

hCT1640694-Ex13: CTGAAACTCATGGTGGTTTTG TGGTTCCAAATCCTAATCTGC TTTATTGGATTTCAAAAATGAGTG

hCT1640694-Ex14: GAGTGTTGCTGCTCTGTGTTG TTGAGGGTAGGAGAATGAGAGAG TCTCATGTGAGAAAGAGATTAGCAG

hCT1640694-Ex15: GGATTCCTAAATAAAAATTGAGGTG CATGCATATTTCAAAGGTCAAG TGGCTTTCAGTAGTTTTCATGG

hCT1640694-Ex16: TTGCTTTCCTGAAGTTTCTTTTG TCAAGTAAGAGGAGGATATGTCAAAG CATGTGATGGCGTGATCC

hCT1640694-Ex17: GGGGAAAGGCAGTAAAGGTC CATCAAATATTTCAAAGGTTGAGC AGGAATACACAAACACCGACAG

hCT1640694-Ex18: TCCTTATTCGTTGTCAGTGATTG GTCAAAACAAATGGCACACG TGCACCCTGTTTTCTTTTCTC

hCT1640694-Ex19: CATGGTGAAAGACGATGGAC TTACAGGCATGAACCACCAC TGGACAAGTAATGGTTTTCTCTG

hCT1640694-Ex20-1: TGGGGTAAAGGGAATCAAAAG CCTATGCAATCGGTCTTTGC TGACATTTGAGCAAAGACCTG

hCT1640694-Ex20-2: TTGCATACATTCGAAAGACC GGGGATTTTTGTTTTGTTTTG TTTGTTTTGTTTTGTTTTTT

1SEQ ID NO: 6 a 165 (cebadores directos) 2SEQ ID NO: 166 a 325 (cebadores inversos) 3SEQ ID NO: 326 a 485 (cebadores de secuenciación)

Ejemplo 2-Este ejemplo demuestra el sorprendente agrupamiento de mutaciones dentro del gen de PIK3CA

Se analizaron entonces todos los exones codificantes de PIK3CA en 199 cánceres colorrectales adicionales, revelando mutaciones en un total de 74 tumores (32%) (tabla 3 y ejemplos en la figura 1).

5

Tabla 3. Mutaciones de PIK3CA en cánceres humanos

Mutaciones de PIK3CA*: Tipo de tumor#

Exón: Nucleótido Aminoácido Dominio funcional Colon GBM Gástrico Mama Pulmón Páncreas Medulo-blastomas Adenomas Total

Exón 1 Exón 1 Exón 1 Exón 1 Exón 1 Exón 1 Exón 1 Exón 2 Exón 2 Exón 2 Exón 4 Exón 4 Exón 5 Exón 7 Exón 7 Exón 9 Exón 9 Exón 9 Exón 9 Exón 9 Exón 9 Exón 9 Exón 9 Exón 9 Exón 12 Exón 13 Exon18 Exón 18 Exón 20 Exón 20: C112T G113A G263A C311G G317T G323C del332-334 G353A G365A C370A T1035A G1048C T1132C T1258C G1357C C1616G G1624A A1625G A1625T G1633A A1634G G1635T C1636A A1637C C1981A A2102C G2702T T2725C T3022C A3073G R38C R38H R88Q P104R G106V R108P delK111 G118D G122D P124T N345K D350H C378R C420R E453Q P539R E542K E542G E542V E545K E545G E545D Q546K Q546P Q661K H701P C901F F909L S1008P T1025A p85 p85 p85 p85 p85 p85 C2 C2 C2 C2 C2 Helicoidal Helicoidal Helicoidal Helicoidal Helicoidal Helicoidal Helicoidal Helicoidal Helicoidal Helicoidal Helicoidal Cinasa Cinasa Cinasa Cinasa 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 9 1 21 1 1 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 -1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 10 1 1 22 1 1 5 1 1 1 2 1 1 1

Exón 20: C3074A T1025N Cinasa 1 1

Exón 20: G3129T M1043R Cinasa 2 2

Exón 20: C3139T H1047Y Cinasa 2 2

Exón 20: A3140G H1047R Cinasa 15 2 1 18

Exón 20: A3140T H1047L Cinasa 1 1

Exón 20: G3145A G1049S Cinasa 1 1

Tumores con mutaciones: 74 4 3 1 1 0 0 2

N.º de muestras examinadas: 234 15 12 12 24 11 12 76

Porcentaje de tumores con mutaciones: 32% 27% 25% 8% 4% 0% 0% 3%

*Nucleótido numerado del exón y cambio de aminoácido que resulta de la mutación. La posición de nucleótido se refiere a la posición dentro de la secuencia

codfiicante, en la que la posición 1 corresponde a la primera posición del codón de iniciación. Se describen dominios funcionales en la leyenda de la figura 1. *Número de mutaciones no sinónimas observadas en tumores indicados. Cánceres de colon, colorrectales; GBM, glioblastomas; gástrico, cánceres gástricos; mama, cánceres de mama; pulmón, cánceres de pulmón; páncreas, cánceres pancreáticos; meduloblastomas; adenomas, tumores colorrectales benignos. Se mostró que todas las mutaciones enumeradas eran somáticas excepto cinco cánceres colorrectales y un glioblastoma en los que no estaba disponible tejido normal correspondiente. Se identificaron mutaciones en 58 de 201 cánceres colorrectales competentes para reparación de apareamientos erróneos (MMR), y 16 de 33 cánceres colorrectales deficientes para MMR. Los tumores somáticos con mutaciones de PIK3CA contenían mutaciones en KRAS o BRAF mientras que otros no, lo que sugiere que estos genes funcionan a través de rutas independientes. Siete tumores contenían dos alteraciones somáticas. Además de las 92 mutaciones no sinónimas registradas en la tabla, se detectaron 3 alteraciones sinónimas.

Ejemplo 3-Este ejemplo demuestra que las mutaciones en PIK3CA se producen de manera tardía en la tumorigénesis.

Para determinar el momento de las mutaciones de PIK3CA durante la progresión neoplásica, se evaluaron 76 tumores colorrectales premalignos de diverso tamaño y grado de displasia. Sólo se encontraron dos mutaciones de 5 PIK3CA (E542K y E542V), ambas en adenomas muy avanzados mayores de 5 cm de diámetro y de tipo tubulovelloso. Estos datos sugieren que las anomalías de PIK3CA se producen en estadios relativamente tardíos de neoplasia, cerca del momento en que los tumores comienzan a invadir y metastatizarse.

Ejemplo 4-Este ejemplo demuestra mutaciones de PIK3CA en una variedad de diferentes tipos de cáncer. 10

Se evaluó entonces PIK3CA para detectar alteraciones genéticas en otros tipos de tumores (tabla 1). Se identificaron mutaciones en cuatro de quince (27%) glioblastomas, tres de doce (25%) cánceres gástricos, uno de trece (8%) cánceres de mama y uno de veinticuatro (4%) cánceres de pulmón. No se observaron mutaciones en once cánceres pancreáticos o doce meduloblastomas. En total, se observaron 89 mutaciones, de las cuales todas 15 menos 3 eran heterocigotas.

Ejemplo 5-Este ejemplo demuestra la naturaleza no aleatoria de las alteraciones genéticas observadas.

El número absoluto de mutaciones observadas en PIK3CA en cinco tipos de cánceres diferentes sugiere 20 fuertemente que estas mutaciones son funcionalmente importantes. Esta conclusión está respaldada por dos conjuntos de pruebas independientes adicionales. En primer lugar, el análisis de la razón de mutaciones no sinónimas con respecto a sinónimas es una buena medida de selección durante la progresión tumoral, ya que es poco probable que las alteraciones silenciosas ejerzan una ventaja de crecimiento. La razón de mutaciones no sinónimas con respecto a sinónimas en PIK3CA era de 89 a 2, muy superior a la razón 2:1 esperada por casualidad 25 (P<1x10-4). En segundo lugar, la prevalencia de cambios no sinónimos ubicados en los dominios auxiliar y catalítico de PI3K era de 120 por Mb de ADN tumoral, más de 100 veces superior que la de la frecuencia de mutación de fondo de alteraciones no funcionales observadas en el genoma de células cancerosas (P<1x10-4) (9).

Aunque los efectos de estas mutaciones sobre la función cinasa no se ha sometido a prueba aún 30 experimentalmente, sus posiciones y naturaleza dentro de PIK3CA implican que es probable que sean activantes. No se observaron mutaciones de truncamiento y >75% de las alteraciones se producían en dos agrupaciones pequeñas en los exones 9 y 20 (tabla 2 y figura 1). Los residuos afectados dentro de estas agrupaciones están altamente conservados evolutivamente, conservando su identidad en ratón, rata y pollo. El agrupamiento de mutaciones de cambio de sentido somáticas en dominios específicos es similar al observado para mutaciones 35 activantes en otros oncogenes, tales como RAS (10), BRAF (11, 12), -catenina (13) y miembros del tirosina quinoma (14).

Estos datos genéticos sugieren que PIK3CA mutante es probable que funcione como un oncogén en cánceres humanos. 40

Ejemplo 6-Este ejemplo demuestra que la amplificación génica de PIK3CA no es común.

El análisis de PCR cuantitativa de PIK3CA en 96 cánceres colorrectales no mostró pruebas de amplificación génica, lo que sugiere que alteraciones de copias de genes no son un mecanismo significativo de activación de este tipo de 45 tumor. Los cebadores usados fueron:

PI3K hCT1640694 20-1F en tiempo real (intrón)

TTACTTATAGGTTTCAGGAGATGTGTT (SEQ ID NO: 486); y 50

PI3K hCT1640694 20-1R en tiempo real

GGGTCTTTCGAATGTATGCAATG (SEQ ID NO: 487)

55

La lista de secuencias adjunta al final de esta solicitud contiene las siguientes secuencias:

SEQ ID NO: 1 = secuencia codificante sólo (nt 13 a 3201 de SEQ ID NO: 2)

SEQ ID NO: 2 = secuencia de ARNm (NM_006218) 60

SEQ ID NO: 3 = secuencia de proteína (NP_006209)

SEQ ID NO: 4 = exón 9

65

SEQ ID NO: 5 = exón 20

SEQ ID NO: 6 a 165 = cebadores directos

SEQ ID NO: 166 a 325 = cebadores inversos

5

SEQ ID NO: 326 a 485 = cebadores de secuenciación

SEQ ID NO: 486 y 487 cebadores de amplificación

Bibliografía y notas 10

1. R. Katso et al., Annu Rev Cell Dev Biol 17, 615-75 (2001).

2. I. Vivanco, C. L. Sawyers, Nat Rev Cancer 2, 489-501 (julio, 2002).

15

3. W. A. Phillips, F. St Clair, A. D. Munday, R. J. Thomas, C. A. Mitchell, Cancer 83, 41-7 (1 de julio de 1998).

4. E. S. Gershtein, V. A. Shatskaya, V. D. Ermilova, N. E. Kushlinsky, M. A. Krasil’nikov, Clin Chim Acta 287, 59-67 (septiembre, 1999).

20

5. B. Vanhaesebroeck, M. D. Waterfield, Exp Cell Res 253, 239-54 (25 de noviembre de 1999).

6. S. Djordjevic, P. C. Driscoll, Trends Biochem Sci 27, 426-32 (agosto, 2002).

7. Se identificaron las subunidades catalíticas de PI3K mediante análisis de dominios de PI3K InterPro (IPR) 25 (IPR000403) presentes dentro de la secuencia del genoma humano del borrador de Celera. Esto dio como resultado la identificación de 15 PI3K y genes relacionados con PI3K. El dominio cinasa del gen de PIK3CD no estaba representado en el borrador actual de la secuencia del genoma humano y por tanto no se incluyó en este estudio.

8. Se extrajeron secuencias para todos los exones y secuencias intrónicas adyacentes anotados que contenían el 30 dominio cinasa de PI3K identificadas de la secuencia del genoma humano del borrador de Celera (dirección URL: www servidor central, nombre del dominio celera.com). Los números de registro de Celera y Genbank de todos los genes analizados están disponibles en la tabla 1. Se diseñaron cebadores para la amplificación y secuenciación por PCR usando el programa Primer 3 (dirección URL: http tipo de archivo, wwwgenome. wi.mit.edu servidor central, cgi-bin nombre del dominio, directorio del cebador, primer3_www.cgi subdirectorio), y se sintetizaron por MWG (High 35 Point, NC) o IDT (Coralville, IA). Se realizaron la amplificación y secuenciación por PCR en ADN tumoral de líneas celulares de pase temprano o tumores primarios tal como se describió previamente (12) usando un aparato de secuenciación automatizado de 384 capilares (Spectrumedix, State College, PA). Se ensamblaron las trazas de secuencias y se analizaron para identificar posibles alteraciones genómicas usando el paquete de software Mutation Explorer (SoftGenetics, State College, PA). De los exones extraídos, el 96% se analizaron satisfactoriamente. Se 40 proporcionan en la tabla S 1 las secuencias de todos los cebadores usados para la amplificación y secuenciación por PCR.

9. T. L. Wang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99, 3076-80. (2002).

45

10. J. L. Bos et al., Nature 327, 293-7 (1987).

11. H. Davies et al., Nature (9 de junio de 2002).

12. H. Rajagopalan et al., Nature 418, 934. (2002). 50

13. P. J. Morin et al., Science 275, 1787-90 (1997).

14. A. Bardelli et al., Science 300, 949 (9 de mayo de 2003).

55

15. J. Li et al., Science 275, 1943-7 (1997).

16. P. A. Steck et al., Nat Genet 15, 356-62 (1997).

17. T. Maehama, J. E. Dixon, J Biol Chem 273, 13375-8 (29 de mayo de 1998). 60

18. M. P. Myers et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 13513-8 (10 de noviembre de 1998).

19. L. Shayesteh et al., Nat Genet 21, 99-102 (enero, 1999).

65

20. J. Q. Cheng et al., Proc Natl Acad Sci USA 89, 9267-71 (1 de octubre de 1992).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para identificar un individuo como candidato para terapia contra el cáncer con un inhibidor de p110, que comprende:

5

someter a prueba una primera muestra corporal obtenida del individuo, en el que la primera muestra corporal es un primer tejido que se sospecha que es neoplásico y una segunda muestra corporal obtenida del individuo en el que la segunda muestra corporal es un segundo tejido que no se sospecha que sea neoplásico para una mutación no sinónima, intragénica, activante en el exón 1, 9 ó 20 de una secuencia que codifica para PIK3CA, o la secuencia de proteína correspondiente, en el que una secuencia que 10 codifica para PIK3CA de tipo natural comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2; e

identificar el individuo como candidato para terapia contra el cáncer con un inhibidor de p110 si se determina una mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA o en una secuencia que codifica para PIK3CA en la primera muestra corporal y si la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA 15 o en una secuencia que codifica para PIK3CA está ausente en la segunda muestra corporal.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda muestra corporal se someten a prueba para detectar la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA en el exón 1, 9 ó 20 de la secuencia que codifica para PIK3CA. 20
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el inhibidor de p110 se selecciona del grupo que consiste en LY294002, wortmanina y una molécula que comprende una región de unión a anticuerpo específica para p110.

25
4. Método según la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda muestra corporal se someten a prueba para detectar una mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA en el exón 9 ó 20 de la secuencia que codifica para PIK3CA.
5. Método según la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda muestra corporal se someten a prueba 30 para detectar la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA en su dominio helicoidal (nt 1567-2124 de SEQ ID NO: 2).
6. Método según la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda muestra corporal se someten a prueba para detectar la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA en su dominio cinasa (nt 2095-35 3096 de SEQ ID NO: 2).
7. Método según la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda muestra corporal se someten a prueba para detectar la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA en su dominio p85BD (nt 103-335 of SEQ ID NO: 2). 40
8. Método según la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda muestra corporal se someten a prueba para detectar la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA en el nt 1624, 1633, 1636, 3140 de la secuencia que codifica para PIK3CA.

45
9. Método según la reivindicación 1, en el que la mutación no sinónima, intragénica, activante se selecciona del grupo que consiste en PIK3CA G1633A, C1636A, A3140G, G113A, T1258C, G1624A, G3129T, C3139T y G2702T.
10. Método según la reivindicación 1, en el que la mutación no sinónima, intragénica, activante es una mutación 50 de un solo nucleótido.