ES2535134T3 - Thyroid hormone analogs to inhibit angiogenesis - Google Patents

Abstract

Un agente antiangiogénesis para su uso en el tratamiento del glioma o el cáncer de mama, en donde el agente antiangiogénesis es ácido tetrayodotiroacético (TETRAC) o ácido triyodotiroacético (TRIAC), o una de sus combinaciones, y en donde el agente antiangiogénesis actúa en la superficie celular para inhibir un agente proangiogénesis y en donde el agente antiangiogénesis se conjuga con un polímero mediante un enlace covalente.An anti-angiogenesis agent for use in the treatment of glioma or breast cancer, wherein the anti-angiogenesis agent is tetraiodothyroacetic acid (TETRAC) or triiodothyroacetic acid (TRIAC), or one of its combinations, and where the anti-angiogenesis agent acts in the cell surface to inhibit a proangiogenesis agent and wherein the antiangiogenesis agent is conjugated to a polymer by a covalent bond.

Description

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DESCRIPCIÓN DESCRIPTION

Análogos de hormonas tiroideas para inhibir la angiogénesis Thyroid hormone analogs to inhibit angiogenesis

5 Campo de la invención 5 Field of the invention

La presente invención se refiere a hormonas tiroideas, análogos de hormonas tiroideas y sus derivados, y sus formas poliméricas. Se describen también métodos para utilizar dichos compuestos y las composiciones farmacéuticas que los contienen. La invención se refiere también a los métodos para preparar dichos compuestos. The present invention relates to thyroid hormones, analogs of thyroid hormones and their derivatives, and their polymeric forms. Methods for using said compounds and the pharmaceutical compositions containing them are also described. The invention also relates to the methods for preparing said compounds.

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Antecedente de la invención Background of the invention

Las hormonas tiroideas, L-tiroxina (T4) y L-triyodotironina (T3), regulan muchos procesos fisiológicos diferentes en diferentes tejidos en vertebrados. La mayoría de las acciones de las hormonas tiroideas están mediadas por el 15 receptor de la hormona tiroidea ("TR"), que es un miembro de la superfamilia de receptores nucleares de los reguladores de la transcripción activados por ligandos. Esta superfamilia incluye también receptores de las hormonas esteroides, retinoides, y 1,25-dihidroxivitamina D3. Estos receptores son factores de la transcripción que pueden regular la expresión de genes específicos en diversos tejidos y son dianas de fármacos ampliamente utilizados, tales como tamoxifeno, un antagonista parcial del receptor de estrógeno. Existen dos genes diferentes que codifican dos TR Thyroid hormones, L-thyroxine (T4) and L-triiodothyronine (T3), regulate many different physiological processes in different tissues in vertebrates. Most of the actions of thyroid hormones are mediated by the thyroid hormone receptor ("TR"), which is a member of the nuclear receptor superfamily of ligand-activated transcription regulators. This superfamily also includes receptors for steroid hormones, retinoids, and 1,25-dihydroxyvitamin D3. These receptors are transcription factors that can regulate the expression of specific genes in various tissues and are targets of widely used drugs, such as tamoxifen, a partial estrogen receptor antagonist. There are two different genes that encode two TR

20 diferentes, TRα y TRβ. Estos dos TR se expresan a menudo simultáneamente a diferentes niveles en diferentes tejidos. La mayoría de las hormonas tiroideas no discriminan entre los dos TR y se unen a ambos con similares afinidades. 20 different, TRα and TRβ. These two TRs are often expressed simultaneously at different levels in different tissues. Most thyroid hormones do not discriminate between the two TRs and bind to both with similar affinities.

Los estudios de inactivación génica en ratones indican que TRβ juega un papel en el desarrollo del sistema auditivo y Studies of gene inactivation in mice indicate that TRβ plays a role in the development of the auditory system and

25 en la retroalimentación negativa de la hormona estimuladora del tiroides por T3 en la pituitaria, mientras que TRα modula el efecto de la hormona tiroidea en la calorigénesis y en sistema cardiovascular. La identificación de los antagonistas de TR podría jugar un importante papel en el tratamiento futuro del hipotiroidismo. Dichas moléculas podrían actuar rápidamente antagonizando directamente el efecto de la hormona tiroidea en el receptor, una significativa mejora para los individuos con hipotiroidismo que requieren cirugía, tienen enfermedades cardiacas, o 25 in the negative feedback of the thyroid stimulating hormone by T3 in the pituitary, while TRα modulates the effect of the thyroid hormone on calorigenesis and cardiovascular system. The identification of TR antagonists could play an important role in the future treatment of hypothyroidism. Such molecules could act quickly by directly antagonizing the effect of thyroid hormone on the recipient, a significant improvement for individuals with hypothyroidism who require surgery, have heart disease, or

30 están en riesgo de una crisis tirotóxica con riesgo para la vida. 30 are at risk of a thyrotoxic crisis with risk to life.

Por tanto, sigue existiendo una necesidad de desarrollo de compuestos que modulen selectivamente la acción de las hormonas tiroideas funcionando como agonistas o antagonistas selectivos de las isoformas de los receptores de las hormonas tiroideas (TR) que se demuestren útiles para el tratamiento médico. Los últimos esfuerzos se han centrado 35 en el diseño y en la síntesis de antagonistas de las hormonas tiroideas (T3/T4) como potenciales agentes terapéuticos y sondas químicas. Existe también una necesidad de desarrollo de compuestos tiromiméticos que sean más accesibles que la hormona natural, y que tengan propiedades de unión y activación al receptor potencialmente útiles. Therefore, there is still a need for the development of compounds that selectively modulate the action of thyroid hormones functioning as agonists or selective antagonists of the isoforms of thyroid hormone receptor (TR) that are proven useful for medical treatment. Recent efforts have focused on the design and synthesis of thyroid hormone antagonists (T3 / T4) as potential therapeutic agents and chemical probes. There is also a need for the development of thyromimetic compounds that are more accessible than the natural hormone, and that have potentially useful binding and receptor activation properties.

Los receptores de las hormonas tiroideas se unen preferentemente a la 3,5,3'-triyodo-L-tironina (T3), un análogo de Thyroid hormone receptors preferentially bind to 3,5,3'-triiodo-L-thyronine (T3), an analogue of

40 hormona derivado por desyodación tisular de la L-tiroxina circulante (T4). Sin embargo, varios laboratorios han descrito recientemente la capacidad de T4 y de T3 de activar las cascadas intracelulares de transducción de señales, independientemente de TR. Actuando independientemente de TR, la hormona tiroidea modula también la actividad del intercambiador Na+/H+ de la membrana plasmática, de la ATPasa estimulable por Ca2+, otras bombas o canales iónicos diferentes, y la actividad de la GTPasa de los sinaptosomas. Estudios de varios laboratorios han demostrado la 40 hormone derived by tissue deiodination of circulating L-thyroxine (T4). However, several laboratories have recently described the ability of T4 and T3 to activate intracellular signal transduction cascades, regardless of TR. Acting independently of TR, the thyroid hormone also modulates the activity of the Na + / H + exchanger of the plasma membrane, of the ATPase stimulable by Ca2 +, other pumps or different ion channels, and the GTPase activity of the synaptosomes. Studies of several laboratories have demonstrated the

45 capacidad de la hormona tiroidea de activar la cascada de transducción de la señal de MAPK. Estas rutas se activan normalmente mediante señales físicas y químicas en la superficie celular. Aunque se han notificado repetidamente la cinética y la especificidad de análogos para la unión de la hormona tiroidea a la membrana plasmática, no se había identificado previamente un receptor de la superficie celular que represente estas acciones dependientes de TR para la hormona tiroidea. The ability of the thyroid hormone to activate the MAPK signal transduction cascade. These routes are normally activated by physical and chemical signals on the cell surface. Although the kinetics and analogue specificity for the binding of thyroid hormone to the plasma membrane have been repeatedly reported, a cell surface receptor that represents these TR-dependent actions for thyroid hormone had not been previously identified.

50 El laboratorio de los inventores ha mostrado en la línea celular CV-1 de fibroblastos de mono, que carece de TR funcional, y en otras células que T4 activa la cascada de señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK; ERK112) y promueve la fosforilación y la translocación nuclear de MAPK tan pronto como 10 min tras la aplicación de una concentración fisiológica de T4. En fracciones nucleares de células tratadas con hormonas tiroideas, The inventors' laboratory has shown in the CV-1 cell line of monkey fibroblasts, which lacks functional TR, and in other cells that T4 activates the mitogen-activated protein kinase signaling cascade (MAPK; ERK112) and promotes phosphorylation and nuclear translocation of MAPK as early as 10 min after the application of a physiological concentration of T4. In nuclear fractions of cells treated with thyroid hormones,

55 los inventores han descrito complejos de MAPK activados y nucleoproteínas transactivadoras que son sustratos para la actividad de la serina quinasa de MAPK. Estas proteínas incluyen el transductor de la señalización y el activador de la transcripción (STAT)-1α, STAT3, p53, receptor (ER)-α de estrógeno y, en células que contienen TR, el receptor nuclear de la hormona tiroidea para T3 (TRβ1). La fosforilación de estas proteínas dependiente de MAPK dirigida por la hormona tiroidea potencia sus capacidades de transcripción. Los efectos de la activación de MAPK inducida por T4 The inventors have described activated MAPK complexes and transactivating nucleoproteins that are substrates for MAPK serine kinase activity. These proteins include the signaling transducer and the transcription activator (STAT) -1α, STAT3, p53, estrogen receptor (ER) -α and, in cells containing TR, the nuclear thyroid hormone receptor for T3 ( TRβ1). The phosphorylation of these MAPK-dependent proteins directed by the thyroid hormone enhances their transcription capabilities. The effects of T4-induced MAPK activation

60 queda bloqueada por inhibidores de la ruta de transducción de la señal de MAPK y por el ácido tetrayodotiroacético (tetrac), un análogo de la hormona tiroidea que inhibe la unión de Tq a la superficie celular. MAPK activado por la hormona tiroidea puede actuar también localmente en la membrana superficial, por ejemplo, sobre el antiportador N+/H+, en lugar de cuando se transloca a los núcleos celulares. No se ha identificado anteriormente un receptor de la superficie celular para T4 que esté vinculado a la activación de la cascada de MAPK. 60 is blocked by inhibitors of the MAPK signal transduction pathway and by tetraiodothyroacetic acid (tetrac), an analogue of thyroid hormone that inhibits Tq binding to the cell surface. MAPK activated by thyroid hormone can also act locally on the surface membrane, for example, on the N + / H + antiporter, rather than when it translocates to cell nuclei. A cell surface receptor for T4 that is linked to the activation of the MAPK cascade has not been previously identified.

65 Las integrinas son una familia de glicoproteínas transmembrana que forman heterodímeros no covalentes. Los dominios extracelulares de las integrinas interactúan con varios ligandos, que incluyen glicoproteínas de la matriz extracelular, y el dominio intracelular se une al citoesqueleto. Se ha mostrado desde hace una década que la hormona tiroidea tiene influencia sobre la interacción de la integrina con la proteína de la matriz extracelular, laminina, pero no 65 Integrins are a family of transmembrane glycoproteins that form non-covalent heterodimers. The extracellular domains of the integrins interact with several ligands, which include extracellular matrix glycoproteins, and the intracellular domain binds to the cytoskeleton. It has been shown for a decade that thyroid hormone has an influence on the interaction of integrin with extracellular matrix protein, laminin, but not

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5 se ha conocido el mecanismo. La integrina αVβ3 tiene un gran número de ligandos de proteínas extracelulares, incluyendo factores de crecimiento, y tras la unión del ligando puede activar la cascada de MAPK. Algunas de las integrinas contienen un sitio de reconocimiento Arg-Gly-Asp ("RGD") que es importante para la unión de la matriz y otras proteínas extracelulares que contienen una secuencia Arg-Gly-Asp. 5 the mechanism has been known. The integrin αVβ3 has a large number of extracellular protein ligands, including growth factors, and after ligand binding can activate the MAPK cascade. Some of the integrins contain an Arg-Gly-Asp recognition site ("RGD") that is important for the binding of the matrix and other extracellular proteins that contain an Arg-Gly-Asp sequence.

Por tanto, sería deseable identificar y proporcionar un sitio de inicio para la inducción de cascadas de señalización de MAPK en células tratadas con hormonas tiroideas, o sus análogos y polímeros, proporcionando de esta forma métodos para modular los factores de crecimiento y otros polipéptidos cuyos receptores de la superficie celular se agrupan alrededor de este sitio de inicio. Therefore, it would be desirable to identify and provide a starting site for the induction of MAPK signaling cascades in cells treated with thyroid hormones, or their analogs and polymers, thereby providing methods to modulate growth factors and other polypeptides whose receptors of the cell surface are grouped around this start site.

15 Se estima que cinco millones de personas padecen de angina estable crónica en los Estados Unidos. Cada año, 15 It is estimated that five million people suffer from chronic stable angina in the United States. Every year,

200.000 personas fallecen con menos de 65 años de edad debido a la "enfermedad cardiaca isquémica prematura". A pesar del tratamiento médico, muchos van a sufrir infarto de miocardio y síntomas debilitantes que dan lugar a la necesidad de revascularización tanto con angioplastia coronaria transluminal percutánea o cirugía de derivación de la arteria coronaria. Se ha postulado que una manera de aliviar la isquemia de miocardio sería potenciar la circulación coronaria colateral. 200,000 people die with less than 65 years of age due to "premature ischemic heart disease". Despite medical treatment, many will suffer from myocardial infarction and debilitating symptoms that lead to the need for revascularization with both percutaneous transluminal coronary angioplasty or coronary artery bypass surgery. It has been postulated that one way to alleviate myocardial ischemia would be to enhance collateral coronary circulation.

Se han realizado ahora correlaciones entre la apariencia anatómica de los vasos coronarios colaterales ("colaterales") visualizados en el momento del tratamiento trombolítico intracoronario durante la fase aguda del infarto de miocardio y la curva de tiempo-actividad de la creatina quinasa, tamaño del infarto, y formación del aneurisma. Estos estudios Correlations have now been made between the anatomical appearance of the collateral ("collateral") coronary vessels displayed at the time of intracoronary thrombolytic treatment during the acute phase of myocardial infarction and the time-activity curve of creatine kinase, infarct size , and aneurysm formation. These studies

25 demuestran un papel protector de los colaterales en corazones con enfermedad obstructiva coronaria, que muestra infartos más pequeños, menos formación de aneurismas, y función ventricular mejorada en comparación con pacientes en los que no se visualizan los colaterales. Cuando los miocitos cardiacos se vuelven isquémicos, los colaterales se desarrollan activamente por crecimiento con replicación del ADN y mitosis de las células musculares endoteliales y lisas. Una vez que se desarrolla la isquemia, estos factores se activan y se vuelven disponibles para la ocupación del receptor, que puede iniciar la angiogénesis tras exposición a la heparina exógena. Desafortunadamente, el proceso "natural" por el cual se produce la angiogénesis es inadecuado para invertir la isquemia en casi todos los pacientes con enfermedad de las arterias coronarias. 25 demonstrate a protective role of collaterals in hearts with coronary obstructive disease, showing smaller infarcts, less aneurysm formation, and improved ventricular function compared to patients in whom collaterals are not visualized. When cardiac myocytes become ischemic, collaterals actively develop by growth with DNA replication and mitosis of endothelial and smooth muscle cells. Once ischemia develops, these factors are activated and become available for receptor occupation, which can initiate angiogenesis after exposure to exogenous heparin. Unfortunately, the "natural" process by which angiogenesis occurs is inadequate to reverse ischemia in almost all patients with coronary artery disease.

Durante la isquemia, se libera adenosina a través de la descomposición del ATP. La adenosina participa en muchos During ischemia, adenosine is released through the breakdown of ATP. Adenosine participates in many

35 acontecimientos biológicos cardioprotectores. La adenosina tiene un papel en los cambios hemodinámicos tales como bradicardia y vasodilatación, y se ha sugerido que la adenosina tiene un papel en fenómenos no relacionados como el preacondicionamiento y posiblemente la reducción en la lesión por reperfusión (Ely y Beme, Circulation, 85: 893 (1992). 35 cardioprotective biological events. Adenosine has a role in hemodynamic changes such as bradycardia and vasodilation, and it has been suggested that adenosine has a role in unrelated phenomena such as preconditioning and possibly reduction in reperfusion injury (Ely and Beme, Circulation, 85: 893 (1992).

La angiogénesis es el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de los vasos sanguíneos ya existentes (Mousa, Angiogenesis is the development of new blood vessels from existing blood vessels (Mousa,

S. A., In Angiogenesis Inhibitors and Stimulators: Potential Therapeutic Implications, Landes Bioscience, Georgetown, Texas; Capítulo 1, (2000)). Fisiológicamente, la angiogénesis asegura el desarrollo adecuado de los organismos maduros, prepara el útero para la implantación del óvulo, y juega un papel clave en la cicatrización de las heridas. El desarrollo de redes vasculares durante la embriogénesis o la angiogénesis normal y patológica depende de factores S. A., In Angiogenesis Inhibitors and Stimulators: Potential Therapeutic Implications, Landes Bioscience, Georgetown, Texas; Chapter 1, (2000)). Physiologically, angiogenesis ensures the proper development of mature organisms, prepares the uterus for implantation of the ovule, and plays a key role in wound healing. The development of vascular networks during embryogenesis or normal and pathological angiogenesis depends on factors

45 de crecimiento e interacciones celulares con la matriz extracelular (Breier et al., Trends in Cell Biology 6:454-456 (1996); Folkman, Nature Medicine 1:27-31 (1995); Risau, Nature 386:671-674 (1997). Los vasos sanguíneos surgen durante la embriogénesis debido a dos procesos: vasculogénesis y angiogénesis (Blood et al., Bioch. Biophys. Acta 1032:89-118 (1990). La angiogénesis es un proceso multietapa controlado por el equilibrio de factores pro y antiangiogénicos. Las últimas etapas de este proceso implican la proliferación y la organización de células endoteliales (EC) en estructuras de tipo tubo. Se piensa que los factores de crecimiento tales como FGF2 y VEGF juegan papeles clave en la promoción del crecimiento y la diferenciación de células endoteliales. Growth and cellular interactions with the extracellular matrix (Breier et al., Trends in Cell Biology 6: 454-456 (1996); Folkman, Nature Medicine 1: 27-31 (1995); Risau, Nature 386: 671-674 (1997) Blood vessels arise during embryogenesis due to two processes: vasculogenesis and angiogenesis (Blood et al., Bioch. Biophys. Acta 1032: 89-118 (1990). Angiogenesis is a multistage process controlled by the balance of pro and anti-angiogenic factors The last stages of this process involve the proliferation and organization of endothelial cells (EC) in tube-like structures Growth factors such as FGF2 and VEGF are thought to play key roles in promoting growth and Differentiation of endothelial cells.

El control de la angiogénesis es un proceso complejo que implica la liberación local de factores de crecimiento vascular (P Carmeliet, Ann NY Acad Sci 902:249-260, 2000), matriz extracelular, moléculas de adhesión y factores metabólicos Angiogenesis control is a complex process that involves the local release of vascular growth factors (P Carmeliet, Ann NY Acad Sci 902: 249-260, 2000), extracellular matrix, adhesion molecules and metabolic factors

55 (RJ Tomanek, GC Schatteman, Anat Rec 261:126-135, 2000). Las fuerzas mecánicas en el interior de los vasos sanguíneos también tienen un papel (O Hudlicka, Molec Cell Biochem 147:57-68, 1995). Las principales clases de factores de crecimiento endógenos implicados en el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos son la familia del factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Páginas G, Ann NY Acad Sci 902:187-200, 2000). La cascada de transducción de la señal de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK ERK1/2) está implicada en la expresión génica de VEGF y en el control de la proliferación de células endoteliales vasculares. 55 (RJ Tomanek, GC Schatteman, Anat Rec 261: 126-135, 2000). The mechanical forces inside the blood vessels also have a role (O Hudlicka, Molec Cell Biochem 147: 57-68, 1995). The main classes of endogenous growth factors involved in the growth of new blood vessels are the family of fibroblast growth factor (FGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) (Pages G, Ann NY Acad Sci 902: 187 -200, 2000). The mitogen-activated protein kinase signal transduction cascade (MAPK ERK1 / 2) is involved in VEGF gene expression and in the control of vascular endothelial cell proliferation.

La adenosina intrínseca puede facilitar la respuesta del flujo coronario a las demandas crecientes de oxígeno del miocardio y de esta manera modula la reserva del flujo coronario (Ethier et al., Am. J. Physiol., H131 (1993) demostró 65 que la adición de concentraciones fisiológicas de adenosina a los cultivos de células endoteliales de la vena umbilical humana estimula la proliferación, posiblemente mediante un receptor superficial. La adenosina puede ser un factor del Intrinsic adenosine can facilitate the response of coronary flow to the increasing oxygen demands of the myocardium and thus modulates the reserve of coronary flow (Ethier et al., Am. J. Physiol., H131 (1993) demonstrated 65 that the addition of physiological concentrations of adenosine to endothelial cell cultures of the human umbilical vein stimulates proliferation, possibly by means of a superficial receptor.Adenosine may be a factor in

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crecimiento celular endotelial humano y posiblemente de la angiogénesis. La angiogénesis parece ser protectora en pacientes con flujo sanguíneo obstruido tal como enfermedad de las arterias coronarias ("CAD"), pero la velocidad a la cual los vasos sanguíneos crecen naturalmente es inadecuada para invertir la enfermedad. Por tanto, las estrategias para potenciar y acelerar la angiogénesis potencial natural del cuerpo deben ser beneficiosas en pacientes con CAD. Human endothelial cell growth and possibly angiogenesis. Angiogenesis appears to be protective in patients with clogged blood flow such as coronary artery disease ("CAD"), but the rate at which blood vessels grow naturally is inadequate to reverse the disease. Therefore, strategies to enhance and accelerate the body's natural potential angiogenesis should be beneficial in patients with CAD.

5 De manera similar, la cicatrización de heridas es un problema principal en muchos países en vías de desarrollo, y las personas diabéticas tienen afectada negativamente la cicatrización de heridas y los trastornos inflamatorios crónicos, con un uso creciente de diversos inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (CoX2). La angiogénesis es necesaria para la reparación de heridas porque los nuevos vasos proporcionan nutrientes para apoyar las células activas, promueven la formación del tejido de granulación y facilita el aclaramiento de los desechos. Aproximadamente un 60 % de la masa del tejido está compuesta de vasos sanguíneos que suministran también el oxígeno necesario para estimular la reparación y el crecimiento de vasos. Está bien documentado que los factores angiogénicos están presentes en el fluido de cicatrización y promueven la reparación mientras que los factores antiangiogénicos inhiben la reparación. La angiogénesis de la cicatrización es un complejo proceso multietapa. A pesar de un conocimiento detallado acerca de 5 Similarly, wound healing is a major problem in many developing countries, and diabetic people have negatively affected wound healing and chronic inflammatory disorders, with increasing use of various cyclooxygenase-2 inhibitors (CoX2). Angiogenesis is necessary for wound repair because new vessels provide nutrients to support active cells, promote the formation of granulation tissue and facilitate clearance of wastes. Approximately 60% of the tissue mass is composed of blood vessels that also supply the oxygen necessary to stimulate the repair and growth of vessels. It is well documented that angiogenic factors are present in the healing fluid and promote repair while anti-angiogenic factors inhibit repair. The angiogenesis of healing is a complex multistage process. Despite detailed knowledge about

15 muchos factores angiogénicos, se han realizado pocos avances para definir la fuente de estos factores, los elementos reguladores implicados en la angiogénesis de la cicatrización y en el uso clínico de estimulantes angiogénicos para promover la reparación. Complicando adicionalmente la comprensión de la angiogénesis de la cicatrización y reparación de heridas se encuentra el hecho de que los mecanismos y mediadores implicados en la reparación varían probablemente dependiendo de la profundidad de la herida, el tipo de herida (quemadura, trauma, etc.), y la localización (músculo, piel, hueso, etc.). El estado y edad del paciente (diabético, parapléjico, en tratamiento con esteroides, anciano comparado con niño, etc.) pueden determinar también la velocidad de reparación y respuesta a factores angiogénicos. El sexo del paciente y el estado hormonal (premenopáusico, postmenopáusico, etc.) puede influenciar también los mecanismos y respuestas de reparación. Una curación mejorada de la herida afecta particularmente a los ancianos y a muchos de los 14 millones de diabéticos en los Estados Unidos. Debido a que una In many angiogenic factors, little progress has been made to define the source of these factors, the regulatory elements involved in the angiogenesis of healing and in the clinical use of angiogenic stimulants to promote repair. Further complicating the understanding of the angiogenesis of wound healing and repair is the fact that the mechanisms and mediators involved in the repair probably vary depending on the depth of the wound, the type of wound (burn, trauma, etc.). , and the location (muscle, skin, bone, etc.). The patient's condition and age (diabetic, paraplegic, on steroid treatment, elderly compared to child, etc.) can also determine the speed of repair and response to angiogenic factors. The patient's sex and hormonal status (premenopausal, postmenopausal, etc.) can also influence repair mechanisms and responses. Improved wound healing particularly affects the elderly and many of the 14 million diabetics in the United States. Because one

25 angiogénesis reducida es a menudo un agente causante de problemas en la cicatrización de heridas en estas poblaciones de pacientes, es importante definir los factores angiogénicos importantes en la reparación de heridas y desarrollar usos clínicos para prevenir y/o corregir la mejora en la cicatrización de heridas. Reduced angiogenesis is often an agent causing problems in wound healing in these patient populations, it is important to define important angiogenic factors in wound repair and develop clinical uses to prevent and / or correct the improvement in wound healing. wounds

Por tanto, sigue habiendo una necesidad de un tratamiento eficaz en forma de agentes angiogénicos como tratamiento principal o auxiliar para el estímulo de la cicatrización de heridas, la angiogénesis coronaria, u otras enfermedades relacionadas con la angiogénesis, con efectos secundarios mínimos. Dicho tratamiento sería particularmente útil para pacientes que tienen trastornos vasculares tales como infartos de miocardio, ictus o enfermedades de las arterias periféricas y podrían utilizarse profilácticamente en pacientes que tienen una mala circulación coronaria, que los coloca en un alto riesgo de isquemia y de infartos de miocardio. Therefore, there remains a need for an effective treatment in the form of angiogenic agents as a primary or auxiliary treatment for the stimulation of wound healing, coronary angiogenesis, or other diseases related to angiogenesis, with minimal side effects. Such treatment would be particularly useful for patients who have vascular disorders such as myocardial infarction, stroke or peripheral artery disease and could be used prophylactically in patients who have poor coronary circulation, which puts them at a high risk of ischemia and heart attacks. myocardium

35 Las hormonas tiroideas, análogos, y las conjugaciones poliméricas juegan importantes papeles en el desarrollo del cerebro. Evidencias crecientes sugieren que la privación de hormonas tiroideas poliméricas en la etapa de desarrollo inicial produce déficits estructurales y funcionales en el SNC, pero el mecanismo preciso subyacente sigue siendo desconocido. 35 Thyroid hormones, analogs, and polymer conjugates play important roles in brain development. Growing evidence suggests that the deprivation of polymeric thyroid hormones in the initial development stage produces structural and functional deficits in the CNS, but the precise underlying mechanism remains unknown.

El sistema nervioso de los mamíferos comprende un sistema nervioso periférico (SNP) y un sistema nervioso central (SNC, que comprende el cerebro y la médula espinal), y está compuesto por dos clases principales de células: neuronas y células gliales. Las células gliales rellenan los espacios entre las neuronas, alimentándolas y modulando su función. Determinadas células gliales, tales como las células de Schwann en el SNP y los oligodendrocitos en el The mammalian nervous system comprises a peripheral nervous system (SNP) and a central nervous system (CNS, which comprises the brain and spinal cord), and is composed of two main classes of cells: neurons and glial cells. Glial cells fill the spaces between neurons, feeding them and modulating their function. Certain glial cells, such as Schwann cells in the SNP and oligodendrocytes in the

45 SNC, proporcionan también una vaina de mielina que rodea los procesos neurales. La vaina de mielina permite una rápida conducción a lo largo de la neurona. En el sistema nervioso periférico, axones de múltiples neuronas pueden enmarañarse entre sí a fin de formar una fibra nerviosa. Estos, a su vez, pueden combinarse en fascículos o haces. 45 CNS, also provide a myelin sheath that surrounds the neural processes. The myelin sheath allows rapid conduction along the neuron. In the peripheral nervous system, axons of multiple neurons can become entangled with each other in order to form a nerve fiber. These, in turn, can be combined into fascicles or beams.

Durante el desarrollo, la diferenciación de las neuronas desde los sistemas nerviosos central y periférico lanza axones que crecen y hacen contacto con células diana específicas. En algunos casos, los axones deben cubrir enormes distancias; algunos crecen en la periferia, mientras que otros están confinados en el sistema nervioso central. En mamíferos, esta etapa de neurogénesis se completa durante la fase embriónica de la vida y las células neuronales no se multiplican una vez que se han diferenciado completamente. During development, differentiation of neurons from the central and peripheral nervous systems releases axons that grow and make contact with specific target cells. In some cases, axons must cover huge distances; some grow in the periphery, while others are confined in the central nervous system. In mammals, this stage of neurogenesis is completed during the embryonic phase of life and neuronal cells do not multiply once they have completely differentiated.

55 Se ha identificado un hospedador de neuropatías que afecta al sistema nervioso central. Las neuropatías, que pueden afectar a las propias neuronas o asociarse con células gliales, pueden ser el resultado de una disfunción metabólica celular, infección, exposición a agentes tóxicos, autoinmunidad, desnutrición, o isquemia. En algunos casos, se piensa que la neuropatía celular induce la muerte celular directamente. En otros casos, la neuropatía puede inducir suficiente necrosis tisular para estimular el sistema inmune/inflamatorio del cuerpo y la respuesta inmune a la lesión neural que destruye a continuación las rutas neurales. 55 A host of neuropathies that affects the central nervous system has been identified. Neuropathies, which can affect the neurons themselves or be associated with glial cells, may be the result of cellular metabolic dysfunction, infection, exposure to toxic agents, autoimmunity, malnutrition, or ischemia. In some cases, cell neuropathy is thought to induce cell death directly. In other cases, neuropathy can induce enough tissue necrosis to stimulate the body's immune / inflammatory system and the immune response to the neural lesion that then destroys the neural pathways.

Cuando la ruta neural dañada es resultado de daño axonal en el SNC, se han utilizado injertos de nervios periféricos autólogos para realizar uniones en lesiones en el sistema nervioso central y permitir a los axones retornar posteriormente a su área diana normal. En contraste a las neuronas del SNC, las neuronas del sistema nervioso When the damaged neural pathway is a result of axonal damage in the CNS, autologous peripheral nerve grafts have been used to make joints in lesions in the central nervous system and allow the axons to return later to their normal target area. In contrast to CNS neurons, neurons of the nervous system

65 periférico pueden extender nuevos procesos periféricos en respuesta al daño de los axones. Se piensa que esta propiedad regenerativa de los axones del sistema nervioso periférico es suficiente para permitir injertar estos segmentos en axones del SNC. El injerto satisfactorio parece estar limitado, sin embargo, por numerosos factores, que incluyen la longitud de la lesión axonal en el SNC que se va a derivar, y la distancia de los sitios del injerto desde los cuerpos de células neuronales del SNC, con injertos satisfactorios que se producen próximos al cuerpo celular. Peripheral 65 can extend new peripheral processes in response to axon damage. It is thought that this regenerative property of the axons of the peripheral nervous system is sufficient to allow grafting of these segments in axons of the CNS. Successful grafting seems to be limited, however, by numerous factors, including the length of the axonal lesion in the CNS to be derived, and the distance of the graft sites from the CNS neuronal cell bodies, with grafts. satisfactory that occur near the cell body.

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5 En el sistema nervioso periférico, esta propiedad regenerativa celular de las neuronas tiene una capacidad limitada para reparar la función de una ruta neural dañada. Específicamente, los nuevos axones se extienden aleatoriamente, y se dirigen a menudo de manera incorrecta, entrando en contacto con dianas inapropiadas que pueden producir una función anómala. Por ejemplo, si un nervio motor está dañado, los axones que han vuelto a crecer pueden entrar en contacto con músculos incorrectos, dando como resultado parálisis. Además, cuando los procesos dañados dan como resultado un hueco más largo de unos pocos milímetros, por ejemplo, más de 10 milímetros (mm), no se produce la regeneración nerviosa adecuada, debido tanto a que los procesos no consiguen crecer la distancia necesaria, como debido a un crecimiento axonal dirigido de manera incorrecta. Los esfuerzos para reparar el daño nervioso periférico por medios quirúrgicos han tenido resultados mixtos, particularmente cuando el daño se extiende a una distancia significativa. En algunos casos, las etapas de sutura utilizadas para obtener una alineación adecuada de los extremos 5 In the peripheral nervous system, this cellular regenerative property of neurons has a limited ability to repair the function of a damaged neural pathway. Specifically, the new axons spread randomly, and are often directed incorrectly, coming into contact with inappropriate targets that can produce an abnormal function. For example, if a motor nerve is damaged, axons that have grown back can come into contact with incorrect muscles, resulting in paralysis. In addition, when damaged processes result in a longer gap of a few millimeters, for example, more than 10 millimeters (mm), adequate nerve regeneration does not occur, because the processes fail to grow the necessary distance, as due to incorrectly directed axonal growth. Efforts to repair peripheral nerve damage by surgical means have had mixed results, particularly when the damage extends a significant distance. In some cases, the suture stages used to obtain proper alignment of the ends

15 nerviosos dañados estimulan la formación de tejido de cicatrización que se piensa que inhibe la regeneración del axón. Incluso cuando se ha reducido la formación de tejido de cicatrización, como con el uso de canales de guiado de nervios u otras prótesis tubulares, la regeneración satisfactoria sigue estando limitada a lesiones nerviosas de menos de 10 milímetros de distancia. Además, la capacidad reparadora de las neuronas periféricas está significativamente inhibida cuando una lesión o neuropatía afecta al propio cuerpo celular o da como resultado una extensa degeneración de un axón distal. 15 damaged nerves stimulate the formation of scar tissue that is thought to inhibit axon regeneration. Even when the formation of scar tissue has been reduced, as with the use of nerve guidance channels or other tubular prostheses, satisfactory regeneration is still limited to nerve lesions less than 10 millimeters away. In addition, the repair capacity of peripheral neurons is significantly inhibited when an injury or neuropathy affects the cell body itself or results in extensive degeneration of a distal axon.

La rutas neurales de mamíferos también están en riesgo debido al daño causado por lesiones neoplásicas. Se han identificado neoplasias de neuronas y células gliales. Las células transformadas de origen neural pierden generalmente su capacidad de comportarse como células normales diferenciadas y pueden destruir las rutas neurales Mammalian neural pathways are also at risk due to damage caused by neoplastic lesions. Neoplasms of neurons and glial cells have been identified. Transformed cells of neural origin generally lose their ability to behave as normal differentiated cells and can destroy neural pathways

25 mediante la pérdida de la función. Además, los tumores proliferativos pueden inducir lesiones perturbando la estructura normal del tejido nervioso, inhibiendo las rutas mediante la compresión de los nervios, inhibiendo el fluido cerebroespinal o el suministro de flujo sanguíneo, y/o estimulando la respuesta inmune del cuerpo. Los tumores metastásicos, que son una causa significativa de lesiones neoplásicas en el cerebro y la médula espinal, pueden dañar también de manera similar las rutas neurales e inducir la muerte de células neuronales. 25 through loss of function. In addition, proliferative tumors can induce lesions by disturbing the normal structure of nerve tissue, inhibiting the pathways by compressing nerves, inhibiting cerebrospinal fluid or blood flow supply, and / or stimulating the body's immune response. Metastatic tumors, which are a significant cause of neoplastic lesions in the brain and spinal cord, can also similarly damage neural pathways and induce the death of neuronal cells.

Un tipo de molécula morforreguladora asociada con el crecimiento, la diferenciación y el desarrollo de células neuronales es la molécula de adhesión celular ("CAM"), de forma más notable, la molécula de adhesión de células nerviosas (N-CAM). Las CAM son miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Median las interacciones entre células durante el desarrollo y en los tejidos adultos mediante la unión homofílica, es decir, la unión CAM-CAM en 35 células opuestas. Se han identificado numerosas CAM diferentes. De estas, las más estudiadas son la N-CAM y la L-CAM (moléculas de adhesión a hepatocitos), ambas de las cuales se han identificado en todas las células en las etapas iniciales del desarrollo, así como en diferentes tejidos adultos. En el desarrollo del tejido neural, se cree que la expresión de N-CAM es importante en la organización del tejido, la migración neuronal, la adhesión del tejido muscular a los nervios, la formación de la retina, sinaptogénesis, y degeneración neuronal. Se piensa también que la expresión reducida de N-CAM está asociada con la disfunción nerviosa. Por ejemplo, la expresión de al menos una forma de N-CAM, N-CAM-180, se reduce en un ratón mutante desmielinizado. Bhat, Brain Res. 452: 373-377 (1988). Se han asociado también los niveles reducidos de N-CAM con hidrocéfalo de presión normal, Werdelin, Acta Neurol. Scand. One type of morphoregulatory molecule associated with the growth, differentiation and development of neuronal cells is the cell adhesion molecule ("CAM"), most notably, the nerve cell adhesion molecule (N-CAM). CAMs are members of the immunoglobulin superfamily. Interactions between cells during development and in adult tissues mediate through homophilic binding, that is, CAM-CAM binding in 35 opposite cells. Numerous different CAMs have been identified. Of these, the most studied are N-CAM and L-CAM (hepatocyte adhesion molecules), both of which have been identified in all cells in the initial stages of development, as well as in different adult tissues. In the development of neural tissue, N-CAM expression is believed to be important in tissue organization, neuronal migration, muscle tissue adhesion to nerves, retinal formation, synaptogenesis, and neuronal degeneration. It is also thought that reduced expression of N-CAM is associated with nerve dysfunction. For example, the expression of at least one form of N-CAM, N-CAM-180, is reduced in a demyelinated mutant mouse. Bhat, Brain Res. 452: 373-377 (1988). Reduced levels of N-CAM have also been associated with normal pressure hydrocephalus, Werdelin, Acta Neurol. Scand.

79: 177-181 (1989), y con esquizofrenia de tipo II. Lyons, et al., Biol. Psychiatry 23: 769-775 (1988). Además, los 79: 177-181 (1989), and with type II schizophrenia. Lyons, et al., Biol. Psychiatry 23: 769-775 (1988). In addition, the

anticuerpos contra N-CAM han demostrado perturbar la recuperación funcional en nervios lesionados. Remsen, Exp. 45 Neurobiol. 110: 268-273 (1990). Antibodies against N-CAM have been shown to disrupt functional recovery in injured nerves. Remsen, Exp. 45 Neurobiol. 110: 268-273 (1990).

Actualmente no existe método satisfactorio para reparar el daño producido por lesiones traumáticas en las neuronas motoras y enfermedades de las neuronas motoras. Existen de 15.000 a 18.000 nuevos casos de lesiones de médula espinal cada año en los Estados Unidos. Además, existen aproximadamente 200.000 supervivientes de lesiones de médula espinal. El coste anual de cuidados para estos pacientes excede de 7.000 millones. La patofisiología que sigue al traumatismo agudo de médula espinal es un mecanismo complejo y no se entiende completamente. El daño al tejido primario producido mediante traumatismo mecánico se produce inmediatamente y es irreversible. Allen, J. Am. Med. Assoc. 57: 878-880 (1911). La evidencia experimental indica que la mayoría del daño al tejido postraumático es el resultado de un proceso reactivo que comienza minutos después de la lesión y continúa durante días o semanas. 55 Janssen, et al., Spine 14: 23-32 (1989) y Panter, et al., (1992). Este proceso autodestructivo progresivo incluye mecanismos patofisiológicos tales como hemorragias, isquemia postraumática, edema, necrosis axonal y neuronal, y desmielinización seguida por formación de quistes e infarto. Para una revisión, véase Tator, et al., J. Neurosurg, 75: 15-26 (1991) y Faden, Crit. Rev. Neurobiol. 7: 175-186 (1993). Los factores de lesión propuestos incluyen cambios electrolíticos debido a los cuales, el inicio del calcio intracelular inicia una cascada de acontecimientos (Young, J. Neurotrauma 9, Supl. 1: S9-S25 (1992) y Young, J. Emerg. Med 11: 13-22 (1993)), cambios bioquímicos con liberación descontrolada de transmisores (Liu, et al., Cell 66: 807-815 (1991) y Yanase, et al., J. Neurosurg 83: 884-888 (1995), liberación de ácido araquidónico, producción de radicales libres, peroxidación lipídica (Braughler, et al., J. Neurotrauma 9, Supl. 1: S1-S7 (1992), producción eicosanoide (Demediuk, et al., J. Neurosci. Res. 20: 115-121 (1988), opiáceos endógenos (Faden, et al., Ann Neurol. 17: 386-390 (1985), cambios metabólicos que incluyen 65 alteraciones en el oxígeno y la glucosa (Faden, Crit. Rev. Neurobiol. 7: 175-186 (1993)), cambios inflamatorios (Blight, There is currently no satisfactory method to repair the damage caused by traumatic injuries to motor neurons and motor neuron diseases. There are 15,000 to 18,000 new cases of spinal cord injuries each year in the United States. In addition, there are approximately 200,000 survivors of spinal cord injuries. The annual cost of care for these patients exceeds 7,000 million. The pathophysiology that follows acute spinal cord trauma is a complex mechanism and is not fully understood. Damage to the primary tissue produced by mechanical trauma occurs immediately and is irreversible. Allen, J. Am. Med. Assoc. 57: 878-880 (1911). Experimental evidence indicates that most posttraumatic tissue damage is the result of a reactive process that begins minutes after the injury and continues for days or weeks. 55 Janssen, et al., Spine 14: 23-32 (1989) and Panter, et al., (1992). This progressive self-destructive process includes pathophysiological mechanisms such as hemorrhages, posttraumatic ischemia, edema, axonal and neuronal necrosis, and demyelination followed by cyst formation and infarction. For a review, see Tator, et al., J. Neurosurg, 75: 15-26 (1991) and Faden, Crit. Rev. Neurobiol. 7: 175-186 (1993). The proposed injury factors include electrolyte changes due to which, the onset of intracellular calcium initiates a cascade of events (Young, J. Neurotrauma 9, Suppl. 1: S9-S25 (1992) and Young, J. Emerg. Med 11 : 13-22 (1993)), biochemical changes with uncontrolled release of transmitters (Liu, et al., Cell 66: 807-815 (1991) and Yanase, et al., J. Neurosurg 83: 884-888 (1995) , release of arachidonic acid, free radical production, lipid peroxidation (Braughler, et al., J. Neurotrauma 9, Suppl. 1: S1-S7 (1992), eicosanoid production (Demediuk, et al., J. Neurosci. Res .20: 115-121 (1988), endogenous opioids (Faden, et al., Ann Neurol. 17: 386-390 (1985), metabolic changes including 65 alterations in oxygen and glucose (Faden, Crit. Rev. Neurobiol. 7: 175-186 (1993)), inflammatory changes (Blight,

J. Neurotrauma 9, Supl. 1: S83-S91 (1992), y edema astrocítico (Kimelberg, J. Neurotrauma 9, Supl. 1: S71-S81 (1992). Durante los últimos 400 años, las soluciones quirúrgicas que incluyen laminectomía y descompresión, acompañadas por fusión, han sido las estrategias de tratamiento más comúnmente practicadas. Hansebout, "Early Management of Acute Spinal Cord Injury", pp. 181-196 (1982) y Janssen, et al., Spine 14: 23-32 (1989). Sin embargo, estos procedimientos no han implicado la aplicación de técnicas que aumentan las propiedades regenerativas del J. Neurotrauma 9, Suppl. 1: S83-S91 (1992), and astrocytic edema (Kimelberg, J. Neurotrauma 9, Suppl. 1: S71-S81 (1992). During the past 400 years, surgical solutions including laminectomy and decompression, accompanied by fusion, they have been the most commonly practiced treatment strategies Hansebout, "Early Management of Acute Spinal Cord Injury", pp. 181-196 (1982) and Janssen, et al., Spine 14: 23-32 (1989). These procedures have not involved the application of techniques that increase the regenerative properties of

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5 tejido de la médula espinal. 5 spinal cord tissue.

Se ha identificado un hospedador de enfermedades de las neuronas motoras, incluyendo las enfermedades desmielinizantes, mielopatías, y las enfermedades de las neuronas motoras tales como la esclerosis lateral amiotrófica ("ALS"). INTERNAL MEDICINE, ch. 121-123 (4ª ed., J. H. Stein, ed., Mosby, 1994). La esclerosis múltiple ("EM") es la enfermedad desmielinizante más común del sistema nervioso central, que produce redes esclerotizadas (es decir, placas) en el cerebro y en la médula espinal. La EM tiene manifestaciones clínicas proteicas, dependiendo de la localización y del tamaño de la placa. Los síntomas típicos incluyen pérdida visual, diplopía, nistagmo, disantria, debilidad, parestesias, anomalías de la vejiga, y alteraciones del estado de ánimo. Se han propuesto miles de tratamientos para esta enfermedad variable a largo plazo. La lista de tratamientos propuestos abarca todos desde la A host of motor neuron diseases has been identified, including demyelinating diseases, myelopathies, and motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis ("ALS"). INTERNAL MEDICINE, ch. 121-123 (4th ed., J. H. Stein, ed., Mosby, 1994). Multiple sclerosis ("MS") is the most common demyelinating disease of the central nervous system, which produces sclerotized networks (i.e., plaques) in the brain and spinal cord. MS has clinical protein manifestations, depending on the location and size of the plaque. Typical symptoms include visual loss, diplopia, nystagmus, dysantria, weakness, paraesthesia, bladder abnormalities, and mood disorders. Thousands of treatments have been proposed for this long-term variable disease. The list of proposed treatments covers all from the

15 dieta a la estimulación eléctrica a la acupuntura, apoyo emocional, y diversas formas de tratamientos inmunosupresores. Ninguno ha demostrado ser satisfactorio. 15 diet to electric stimulation to acupuncture, emotional support, and various forms of immunosuppressive treatments. None has proven satisfactory.

Se produce la pérdida progresiva de neuronas motoras inferiores y superiores en algunas enfermedades (por ejemplo, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular espinal, amiotrofia focal benigna). Sin embargo, La ELA es la más común de la enfermedad de las neuronas motoras. Se produce la pérdida de las neuronas motoras inferiores y superiores en la ELA. Los síntomas incluyen la degeneración progresiva del músculo esquelético, debilidad, fasciculaciones, y calambres. Algunos casos tienen una implicación predominante de motoneuronas del pedúnculo cerebral (parálisis bulbar progresiva). Desafortunadamente, el tratamiento de las neuronas motoras y de las enfermedades relacionadas es paliativo. INTERNAL MEDICINE, ch. 123 (4ª ed., J. H. Stein, ed., Mosby, 1994). The progressive loss of lower and upper motor neurons occurs in some diseases (for example, primary lateral sclerosis, spinal muscular atrophy, benign focal amyotrophy). However, ALS is the most common of motor neuron disease. Loss of lower and upper motor neurons occurs in ALS. Symptoms include progressive degeneration of skeletal muscle, weakness, fasciculations, and cramping. Some cases have a predominant involvement of brain peduncle motor neurons (progressive bulbar paralysis). Unfortunately, the treatment of motor neurons and related diseases is palliative. INTERNAL MEDICINE, ch. 123 (4th ed., J. H. Stein, ed., Mosby, 1994).

25 Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de los tratamientos de los trastornos y las lesiones de las neuronas motoras, y los déficits relacionados en funciones neurales. Es, por lo tanto, un objetivo de la presente invención proporcionar composiciones y métodos para estimular la angiogénesis, para inducir la diferenciación neuronal, y para prevenir la muerte o la degeneración de las células neuronales. 25 Accordingly, there is a need in the art for the treatment of motor neuron disorders and injuries, and related deficits in neural functions. It is, therefore, an objective of the present invention to provide compositions and methods to stimulate angiogenesis, to induce neuronal differentiation, and to prevent death or degeneration of neuronal cells.

Las tirosinas están yodadas en uno (monoyodotirosina) o dos sitios (diyodotirosina) y a continuación se acoplan para formar las hormonas activas (diyodotirosina + diyodotirosina → tetrayodotironina [tiroxina, T4]; diyodotirosina + monoyodotirosina →triyodotironina [T3]. Otra fuente de T3 en la glándula tiroidea es el resultado de la desyodación del anillo externo de T4 mediante una selenoenzima: 5’-desyodinasa de tipo I (5’D-I). La tiroglobulina, una glicoproteína The tyrosines are iodized at one (monoiodothyrosine) or two sites (diiodothyrosine) and then coupled to form the active hormones (diiodothyrosine + diiodothyrosine → tetraiodothyronine [thyroxine, T4]; diiodothyrosine + monoiodothyrosine → triiodothyronine [T3] at another. The thyroid gland is the result of deiodination of the outer ring of T4 by a selenoenzyme: 5'-deiodinase type I (5'DI). Thyroglobulin, a glycoprotein

35 que contiene T3 y T4 en su matriz, se captura en el folículo como gotículas de coloides por las células tiroideas. 35 which contains T3 and T4 in its matrix, is captured in the follicle as droplets of colloids by thyroid cells.

Los lisosomas que contienen proteasas escinden T3 y T4 a partir de la tiroglobulina, dando como resultado la liberación de T3 y T4 libres. Las yodotirosinas (monoyodotirosina y diyodotirosina) se liberan también a partir de la tiroglobulina, pero solo cantidades muy pequeñas alcanzan el torrente sanguíneo. El yodo se elimina de las mismas mediante desyodinasas intracelulares, y la glándula tiroides usa este yodo. Lysosomes containing proteases cleave T3 and T4 from thyroglobulin, resulting in the release of free T3 and T4. Iodothyrosines (monoiodothyrosine and diiodothyrosine) are also released from thyroglobulin, but only very small amounts reach the bloodstream. Iodine is removed from them by intracellular deiodinases, and the thyroid gland uses this iodine.

La T4 y la T3 liberadas desde el tiroides por la proteólisis alcanzan el torrente sanguíneo, donde se unen a las proteínas séricas de unión a las hormonas tiroideas para el transporte. La proteína de unión a la hormona tiroidea mayor es la globulina de unión a tiroxina ("TGB"), que tiene una alta afinidad pero una baja capacidad para T4 y T3. TGB representa T4 and T3 released from the thyroid by proteolysis reach the bloodstream, where they bind to serum thyroid hormone binding proteins for transport. The major thyroid hormone binding protein is thyroxine binding globulin ("TGB"), which has a high affinity but a low capacity for T4 and T3. TGB represents

45 normalmente aproximadamente un 75 % de las hormonas unidas. Otras proteínas de unión a hormonas tiroideas--principalmente prealbúmina de unión a tiroxina, denominada también transtiretina ("TTR"), que tiene una alta afinidad pero una baja capacidad para T4, y la albúmina, que tiene una baja afinidad pero una alta capacidad por T4 y T3-representan el resto de las hormonas tiroideas séricas unidas. Aproximadamente un 0,03 % de T4 sérica total y un 0,3 % de T3 sérica total están libres y en equilibrio con las hormonas unidas. Solo las T4 y T3 libres están disponibles en los tejidos periféricos para la acción de las hormonas tiroideas. Normally about 75% of the hormones bound. Other thyroid hormone binding proteins - mainly thyroxine binding prealbumin, also called transthyretin ("TTR"), which has a high affinity but a low capacity for T4, and albumin, which has a low affinity but a high capacity by T4 and T3 - they represent the rest of the united serum thyroid hormones. Approximately 0.03% of total serum T4 and 0.3% of total serum T3 are free and in equilibrium with bound hormones. Only free T4 and T3 are available in peripheral tissues for the action of thyroid hormones.

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisiológicos principales: (1) Aumentan la síntesis de proteínas en virtualmente cada tejido corporal. (T3 y T4 penetran en las células, donde T3, que se deriva de la circulación y de la conversión de T4 a T3 en la célula, se une a receptores nucleares discretos y tiene influencia sobre la formación del Thyroid hormones have two main physiological effects: (1) They increase protein synthesis in virtually every body tissue. (T3 and T4 penetrate the cells, where T3, which is derived from the circulation and conversion of T4 to T3 in the cell, binds to discrete nuclear receptors and influences the formation of the

55 ARNm). (2) T3 aumenta el consumo de O2 aumentando la actividad de la Na+, K+-ATPasa (bomba de Na), principalmente en tejidos responsables del consumo basal de O2 (es decir, hígado, riñón, corazón, y músculo esquelético). La actividad aumentada de la Na+, K+-ATPasa es secundaria a la síntesis aumentada de esta enzima; por lo tanto, el aumento en el consumo de O2 está también probablemente relacionado con la unión nuclear de las hormonas tiroideas. Sin embargo, no se ha descartado un efecto directo de T3 sobre la mitocondria. Se cree que T3 es la hormona tiroidea activa, aunque la propia T4 puede ser biológicamente activa. 55 mRNA). (2) T3 increases the consumption of O2 by increasing the activity of Na +, K + -ATPase (Na pump), mainly in tissues responsible for baseline O2 consumption (i.e., liver, kidney, heart, and skeletal muscle). The increased activity of Na +, K + -ATPase is secondary to the increased synthesis of this enzyme; therefore, the increase in O2 consumption is also probably related to the nuclear binding of thyroid hormones. However, a direct effect of T3 on mitochondria has not been ruled out. It is believed that T3 is the active thyroid hormone, although T4 itself may be biologically active.

El combinado de hormonas tiroideas crítico para las acciones biológicas de las hormonas es el combinado de la hormona tiroidea libre. El tamaño de este combinado se determina durante cortos periodos de tiempo mediante la captación/liberación de hormonas tiroideas en/a partir de células y la unión/liberación de hormonas tiroideas por las 65 proteínas de unión a hormonas tiroideas. Tanto las proporciones como las concentraciones absolutas de estas proteínas difieren en el plasma sanguíneo y en el fluido cerebroespinal ("CSF"). La diferencia más pronunciada se The combination of thyroid hormones critical for the biological actions of hormones is the combination of free thyroid hormone. The size of this combination is determined for short periods of time by the uptake / release of thyroid hormones in / from cells and the binding / release of thyroid hormones by the thyroid hormone binding proteins. Both the proportions and the absolute concentrations of these proteins differ in blood plasma and cerebrospinal fluid ("CSF"). The most pronounced difference is

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encuentra para la trastirretina ("TTR"), que es la única proteína plasmática de unión a la hormona tiroidea sintetizada en el cerebro (Schreiber G, Southwell BR, Richardson SJ. Hormone delivery systems to the brain-transthyretin. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 1995;103(2):75-80). TTR es también distinta de las otras dos proteínas plasmáticas de unión a hormonas tiroideas en seres humanos en ausencia de deficiencias genéticas. La expresión génica de TTR se inició found for trastirretin ("TTR"), which is the only plasma thyroid hormone binding protein synthesized in the brain (Schreiber G, Southwell BR, Richardson SJ. Hormone delivery systems to the brain-transthyretin. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 1995; 103 (2): 75-80). TTR is also distinct from the other two plasma thyroid hormone binding proteins in humans in the absence of genetic deficiencies. TTR gene expression began

5 durante la evolución mucho antes en el cerebro que en el hígado. Se ha conservado completamente la estructura de los dominios de TTR implicados en la unión de T4 a la tiroxina (TR) durante 350 millones de años. Estas observaciones apuntan a una significancia funcional especial de TTR en el cerebro. Se ha propuesto que esta es la determinación del nivel de T4 libre en el compartimento extracelular del cerebro. T4 puede a continuación convertirse en el cerebro a triyodotironina T3 mediante desyodinasas específicas. Esta T3 puede interactuar con receptores en los núcleos de las células, regulando la transcripción génica. 5 during evolution much earlier in the brain than in the liver. The structure of the TTR domains involved in the binding of T4 to thyroxine (TR) has been completely preserved for 350 million years. These observations point to a special functional significance of TTR in the brain. It has been proposed that this is the determination of the level of free T4 in the extracellular compartment of the brain. T4 can then be converted in the brain to triiodothyronine T3 by specific deiodinases. This T3 can interact with receptors in cell nuclei, regulating gene transcription.

La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurodegenerativo grave, y actualmente, aproximadamente 4 millones de americanos padecen de esta enfermedad. A medida que la población envejece continúa aumentando, este número podría alcanzar 14 millones a la mitad del próximo siglo a no ser que se encuentre una cura o prevención. De hecho, no 15 existe ensayo previo a la muerte sensible y específico para el diagnóstico inicial de esta enfermedad. La enfermedad de Alzheimer se diagnostica actualmente basándose en la observación clínica del declive cognitivo, vinculada a la eliminación sistemática de otras posibles causas de aquellos síntomas. La confirmación del diagnóstico clínico de "enfermedad de Alzheimer probable" puede solo realizarse mediante el examen del cerebro postmortem. El cerebro de la enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la aparición de dos depósitos proteináceos anómalos distintos en regiones del cerebro responsables del aprendizaje y la memoria (por ejemplo, corteza cerebral e hipocampo). Estos depósitos son placas amiloides extracelulares, que son características de la enfermedad de Alzheimer, y de los ovillos neurofibrilares intracelulares ("NFT"), que se pueden encontrar también en otros trastornos neurodegenerativos. Los péptidos amiloides son normalmente tanto de 40 o 42 aminoácidos de longitud ("A1-40" o "A1-42", respectivamente) y se forman a partir de un procesamiento anómalo de una proteína más grande asociada a membrana de función Alzheimer's disease is a serious neurodegenerative disorder, and currently, approximately 4 million Americans suffer from this disease. As the population ages continues to increase, this number could reach 14 million in the middle of the next century unless a cure or prevention is found. In fact, there is no sensitive and specific pre-death trial for the initial diagnosis of this disease. Alzheimer's disease is currently diagnosed based on the clinical observation of cognitive decline, linked to the systematic elimination of other possible causes of those symptoms. Confirmation of the clinical diagnosis of "probable Alzheimer's disease" can only be done by examining the postmortem brain. The brain of Alzheimer's disease is characterized by the appearance of two distinct anomalous proteinaceous deposits in regions of the brain responsible for learning and memory (for example, cerebral cortex and hippocampus). These deposits are extracellular amyloid plaques, which are characteristic of Alzheimer's disease, and of intracellular neurofibrillary tangles ("NFTs"), which can also be found in other neurodegenerative disorders. The amyloid peptides are normally both 40 or 42 amino acids in length ("A1-40" or "A1-42", respectively) and are formed from an abnormal processing of a larger membrane-associated protein of function

25 desconocida, la proteína precursora amiloide ("APP"). Se piensa que los agregados oligoméricos de estos péptidos son neurotóxicos, dando como resultado eventualmente la degeneración sináptica y la perdida neuronal. La cantidad de deposición amiloide está correlacionada de manera grosera con la gravedad de los síntomas en el momento de la muerte. 25 unknown, the amyloid precursor protein ("APP"). Oligomeric aggregates of these peptides are thought to be neurotoxic, eventually resulting in synaptic degeneration and neuronal loss. The amount of amyloid deposition is grossly correlated with the severity of symptoms at the time of death.

En el pasado, se han hecho algunos intentos para el diseño de agentes radiofarmacéuticos que podrían utilizarse como agentes diagnósticos para un diagnóstico premortem de la enfermedad de Alzheimer. Bornebroek et al. mostró que el componente P amiloide asociado a la proteína amiloide (SAP), marcado con 123I, se acumula a bajos niveles en la corteza cerebral, posiblemente en las paredes del recipiente, de pacientes con amiloidosis cerebral (Bornebroek, M., et al., Nucl. Med. Commun. (1996), Volumen 17, págs. 929-933). In the past, some attempts have been made to design radiopharmaceutical agents that could be used as diagnostic agents for a premortem diagnosis of Alzheimer's disease. Bornebroek et al. showed that the amyloid P component associated with amyloid protein (SAP), labeled with 123I, accumulates at low levels in the cerebral cortex, possibly in the vessel walls, of patients with cerebral amyloidosis (Bornebroek, M., et al. , Nucl. Med. Commun. (1996), Volume 17, pp. 929-933).

35 Saito et al. propusieron una administración mediada por vector de A1-40 marcado con 123I a través de la barrera hematoencefálica. Se ha notificado que A1-40 yodado se une a la placa de la proteína amiloide A en las secciones tisulares (Saito, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, Vol. 92, pp.10227-10231). Las Patentes de los Estados Unidos Nº 5.231.000 describen anticuerpos con especificidad por el polipéptido amiloide A4 que se encuentran en el cerebro de los pacientes con enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, no se ha descrito un método para administrar estos anticuerpos a través de la barrera hematoencefálica. Zhen et al. describieron modificaciones del colorante de unión a la proteína amiloide conocido como "Rojo Congo.TM.", y complejos de estas moléculas modificadas con tecnecio y renio. Se han propuesto los complejos con iones radioactivos como potenciales agentes de diagnóstico por imágenes para la enfermedad de Alzheimer (Zhen et al., J. Med. Chem. (1999), Vol. 42, págs. 2805-2815). Sin 35 Saito et al. proposed a vector-mediated administration of 123-1 labeled A1-40 through the blood brain barrier. It has been reported that iodinated A1-40 binds to the amyloid protein A plate in tissue sections (Saito, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, Vol. 92, pp. 10227 -10231). US Patents No. 5,231,000 describe antibodies with specificity for the A4 amyloid polypeptide found in the brains of patients with Alzheimer's disease. However, a method for administering these antibodies through the blood brain barrier has not been described. Zhen et al. described modifications of the amyloid protein binding dye known as "Congo RedTM.", and complexes of these modified molecules with technetium and rhenium. Complexes with radioactive ions have been proposed as potential imaging agents for Alzheimer's disease (Zhen et al., J. Med. Chem. (1999), Vol. 42, pp. 2805-2815). Without

45 embargo, el potencial de los complejos para cruzar la barrera hematoencefálica es limitado. However, the potential of the complexes to cross the blood brain barrier is limited.

Un grupo de la Universidad de Pensilvania en los EE.UU. (Skovronsky, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2000, Vol. 97, pp. 7609-7614) ha desarrollado un derivado marcado fluorescentemente de rojo congo que es permeable al cerebro y que no se une específicamente a materiales amiloides (esto es, péptidos en conformación de vaina plegada). Este compuesto necesitaría radiomarcarse y a continuación seguir un procedimiento de cribado preclínico para determinar su farmacocinética y toxicidad antes del ensayo clínico. Por el contrario, la invención de los inventores utiliza derivados de sustancias que se producen naturalmente solas o en combinaciones para el diagnóstico, prevención, pronóstico y tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Klunk et al. notificaron experimentos con un derivado de Rojo Congo™, Chrisamina G ("CG"). Se ha notificado que CG se une bien al amiloide sintético in vitro, y cruza la barrera A group from the University of Pennsylvania in the US (Skovronsky, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2000, Vol. 97, pp. 7609-7614) has developed a fluorescently labeled derivative of Congo red that is permeable to the brain and does not specifically bind to amyloid materials (that is, peptides in folded sheath conformation). This compound would need to be radiolabelled and then follow a preclinical screening procedure to determine its pharmacokinetics and toxicity before the clinical trial. On the contrary, the invention of the inventors uses derivatives of substances that occur naturally alone or in combinations for the diagnosis, prevention, prognosis and treatment of Alzheimer's disease. Klunk et al. reported experiments with a derivative of Congo Red ™, Chrisamina G ("CG"). It has been reported that GC binds well to the synthetic amyloid in vitro, and crosses the barrier

55 hematoencefálica en ratones normales (Klunk et al., Neurobiol. Aging (1994), Vol. 15, Nº 6, pp. 691-698). Bergstrom et al. han presentado un compuesto marcado con 123I como un radioligando potencial para la visualización de los receptores M1 y M2 de la acetilcolina muscarínica en la enfermedad de Alzheimer (Bergstrom et al., Eur. J. Nucl. Med. (1999), Vol. 26, pp. 1482-1485). Hematoencephalic 55 in normal mice (Klunk et al., Neurobiol. Aging (1994), Vol. 15, No. 6, pp. 691-698). Bergstrom et al. have presented a compound labeled with 123I as a potential radioligand for the visualization of M1 and M2 receptors of muscarinic acetylcholine in Alzheimer's disease (Bergstrom et al., Eur. J. Nucl. Med. (1999), Vol. 26 , pp. 1482-1485).

Recientemente, se ha descubierto que determinados receptores de la quimioquina específicos están regulados en exceso en los cerebros de los pacientes con enfermedad de Alzheimer (Horuk, R. et al., J. Immunol. (1997), Vol. 158, pp. 2882-2890); Xia et al., J. NeuroVirol (1999), Vol. 5, pp. 32-41). Además, se ha mostrado recientemente que el receptor CCR1 de la quimioquina está regulado en exceso en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer avanzada y ausente en cerebros envejecidos normales (Halks-Miller et al, CCR1 Immunoreactivity in Alzheimer’s Recently, it has been found that certain specific chemokine receptors are overregulated in the brains of patients with Alzheimer's disease (Horuk, R. et al., J. Immunol. (1997), Vol. 158, pp. 2882 -2890); Xia et al., J. NeuroVirol (1999), Vol. 5, pp. 32-41). In addition, it has recently been shown that the chemokine CCR1 receptor is overregulated in the brains of patients with advanced and absent Alzheimer's disease in normal aged brains (Halks-Miller et al, CCR1 Immunoreactivity in Alzheimer’s

65 Disease Brains, Society for Neuroscience Meeting Abstract, Nº 787.6, Volumen 24, 1998). Se describen antagonistas del receptor CCRI y su uso como agentes antiinflamatorios en la solicitud de patente PCT publicada WO 98/56771. 65 Disease Brains, Society for Neuroscience Meeting Abstract, No. 787.6, Volume 24, 1998). CCRI receptor antagonists and their use as anti-inflammatory agents are described in published PCT patent application WO 98/56771.

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Ninguno de los anteriores propósitos descritos ha dado como resultado el desarrollo clínico de un agente de diagnóstico por imágenes para el diagnóstico precoz de la enfermedad de Alzheimer. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad clínica de un agente de diagnóstico que podría utilizarse para un diagnóstico fiable y precoz de la enfermedad de Alzheimer. Adicionalmente, las estrategias propuestas podrían ser también útiles para la None of the above described purposes has resulted in the clinical development of an imaging agent for the early diagnosis of Alzheimer's disease. Therefore, there is still a clinical need for a diagnostic agent that could be used for a reliable and early diagnosis of Alzheimer's disease. Additionally, the proposed strategies could also be useful for the

5 inhibición de la formación o acumulación de la placa amiloide en pacientes de Alzheimer. 5 inhibition of the formation or accumulation of amyloid plaque in Alzheimer's patients.

Es interesante señalar que la angiogénesis se produce también en otras situaciones, pero que son indeseables, que incluyen el crecimiento y la metástasis de tumores sólidos; artritis reumatoide; psoriasis; escleroderma; y tres causas comunes de ceguera -retinopatía diabética, fibroplasia retrolental y glaucoma neovascular (de hecho, las enfermedades de los ojos están casi siempre acompañadas por vascularización. El proceso de angiogénesis de la herida tiene realmente muchas características en común con la angiogénesis tumoral. Por tanto, existen algunas dolencias, tales como la retinopatía diabética o la incidencia de tumores primarios o metastásicos, en los que la angiogénesis es indeseable. Por tanto, sigue habiendo una necesidad de métodos mediante los cuales se inhiba el efecto de los agentes angiogénicos para el tratamiento de cánceres. It is interesting to note that angiogenesis also occurs in other situations, but they are undesirable, which include the growth and metastasis of solid tumors; rheumatoid arthritis; psoriasis; scleroderma; and three common causes of blindness - diabetic retinopathy, retrolental fibroplasia and neovascular glaucoma (in fact, eye diseases are almost always accompanied by vascularization. The wound angiogenesis process actually has many features in common with tumor angiogenesis. Therefore, there are some ailments, such as diabetic retinopathy or the incidence of primary or metastatic tumors, in which angiogenesis is undesirable, therefore, there is still a need for methods by which the effect of angiogenic agents for cancer treatment

15 El documento WO 2005/027895 se refiere a la hormona tiroidea, a los análogos y los derivados de las hormonas tiroideas y sus formas poliméricas para el uso en la promoción o en la inhibición de la angiogénesis en un sujeto. 15 WO 2005/027895 refers to thyroid hormone, analogs and derivatives of thyroid hormones and their polymeric forms for use in the promotion or inhibition of angiogenesis in a subject.

El documento US 6. 740.680 se refiere a tratamientos que utilizan tetrac y/u otros compuestos tiromiméticos. Las composiciones se dirigen a suprimir la secreción de TSH sin inhibir la monodesyododinasa de tipo II específica de pituitaria y reduciendo o evitando a la vez la estimulación tiromimética de los tejidos periféricos en comparación con las dosis de L-tiroxina (T4) equivalentes supresoras de TSH. US 6,740,680 refers to treatments using tetrac and / or other thyromimetic compounds. The compositions are aimed at suppressing TSH secretion without inhibiting pituitary-specific type II monodesiododinase and reducing or avoiding at the same time the thyromimetic stimulation of peripheral tissues compared to equivalent doses of L-thyroxine (T4) equivalent suppressors of TSH .

El documento WO 00/78815 se refiere a anticuerpos injertados con LM609 potenciado que presentan afinidad de unión 25 selectiva para αvβ3 o uno de sus fragmentos funcionales y se refiere a enfermedades mediadas por integrina. WO 00/78815 refers to antibodies grafted with enhanced LM609 that exhibit selective binding affinity for αvβ3 or one of its functional fragments and refers to integrin-mediated diseases.

El documento WO 03/075741 se refiere a la prevención, el tratamiento, la gestión o la mejora de trastornos que utilizan un antagonista de la integrina αvβ3, y se menciona la vitaxina, junto con un inhibidor de la HMG-CoA reductasa y/o un bifosfonato. WO 03/075741 refers to the prevention, treatment, management or improvement of disorders using an αvβ3 integrin antagonist, and vitaxin is mentioned, together with an HMG-CoA reductase inhibitor and / or a bisphosphonate.

Sumario de la invención Summary of the invention

La invención está basada, en parte, en el descubrimiento de que las hormonas tiroideas, los análogos de las hormonas tiroideas, y sus formas poliméricas, actúan en la membrana celular y tienen propiedades proangiogénicas que son 35 independientes de los efectos de las hormonas tiroideas. Por consiguiente, estos análogos de las hormonas tiroideas y las formas poliméricas (es decir, agentes angiogénicos) se pueden usar para tratar varios trastornos. De manera similar, la invención se basa también en el descubrimiento de que los antagonistas de análogos de las hormonas tiroideas inhiben el efecto proangiogénico de dichos análogos, y se pueden usar también para tratar varios trastornos. The invention is based, in part, on the discovery that thyroid hormones, analogs of thyroid hormones, and their polymeric forms, act on the cell membrane and have proangiogenic properties that are independent of the effects of thyroid hormones. Therefore, these analogs of thyroid hormones and polymeric forms (ie, angiogenic agents) can be used to treat various disorders. Similarly, the invention is also based on the discovery that thyroid hormone analogue antagonists inhibit the proangiogenic effect of such analogs, and can also be used to treat various disorders.

Específicamente, la presente invención proporciona un agente antiangiogénesis para el uso en el tratamiento del glioma o el cáncer de mama, en el que el agente antiangiogénesis es ácido tetrayodotiroacético (TETRAC) o ácido triyodotiroacético (TRIAC), o una de sus combinaciones, y en el que el agente antiangiogénesis actúa en la superficie celular para inhibir un agente proangiogénesis y en el que donde el agente antiangiogénesis se conjuga a un polímero mediante un enlace covalente. Specifically, the present invention provides an antiangiogenesis agent for use in the treatment of glioma or breast cancer, wherein the antiangiogenesis agent is tetraiodothyroacetic acid (TETRAC) or triiodothyroacetic acid (TRIAC), or one of its combinations, and in wherein the anti-angiogenesis agent acts on the cell surface to inhibit a proangiogenesis agent and wherein the anti-angiogenesis agent is conjugated to a polymer by a covalent bond.

45 En la presente invención, el agente antiangiogénesis es opcionalmente para la administración parenteral, oral, rectal o tópica, o una de sus combinaciones. In the present invention, the anti-angiogenesis agent is optionally for parenteral, oral, rectal or topical administration, or one of its combinations.

En la presente invención, el agente antiangiogénesis se administra simultáneamente con uno o más tratamientos antiangiogénesis o agentes quimioterapéuticos diferentes. In the present invention, the anti-angiogenesis agent is administered simultaneously with one or more different anti-angiogenesis treatments or chemotherapeutic agents.

La presente divulgación proporciona información acerca de cómo tratar una dolencia susceptible de tratamiento promoviendo la angiogénesis administrando a un sujeto que lo necesita una cantidad de una forma polimérica de la hormona tiroidea, o uno de sus análogos, eficaz para promover la angiogénesis. Se proporcionan ejemplos de dichas The present disclosure provides information on how to treat a condition susceptible to treatment by promoting angiogenesis by administering to a subject in need thereof an amount of a polymeric form of the thyroid hormone, or one of its analogs, effective in promoting angiogenesis. Examples of such are provided.

55 dolencias susceptibles de tratamiento para promover la angiogénesis en el presente documento y pueden incluir la enfermedad vascular oclusiva, enfermedad coronaria, disfunción eréctil, infarto de miocardio, isquemia, ictus, trastornos vasculares de las arterias periféricas, y heridas. 55 conditions susceptible to treatment to promote angiogenesis herein and may include occlusive vascular disease, coronary heart disease, erectile dysfunction, myocardial infarction, ischemia, stroke, vascular disorders of the peripheral arteries, and wounds.

Se proporcionan también análogos de hormonas tiroideas en el presente documento y pueden incluir triyodotironina (T3), levotiroxina (T4), ácido 3,5-dimetil-4-(4’-hidroxi-3’-isopropilbencil)-fenoxi acético (GC-1), o ácido 3,5-diyodotiropropiónico (DITPA), ácido tetrayodotiroacético (TETRAC), y triiodotiroacético (TRIAC). En la Figura 20 hay análogos adicionales Tablas A-D. Estos análogos pueden conjugarse en alcohol polivinílico, copolímero de ácido acrílico etileno, poli(ácido láctico), o agarosa. La conjugación es mediante enlaces covalentes o no covalentes dependiendo del polímero utilizado. Thyroid hormone analogs are also provided herein and may include triiodothyronine (T3), levothyroxine (T4), 3,5-dimethyl-4- (4'-hydroxy-3'-isopropylbenzyl) -phenoxy acetic acid (GC- 1), or 3,5-diiodothyropropionic acid (DITPA), tetraiodothyroacetic acid (TETRAC), and triiodothyroacetic acid (TRIAC). In Figure 20 there are additional analogues Tables A-D. These analogs can be conjugated in polyvinyl alcohol, ethylene acrylic acid copolymer, poly (lactic acid), or agarose. The conjugation is by covalent or non-covalent bonds depending on the polymer used.

65 En una realización la hormona tiroidea, los análogos de las hormonas tiroideas, o sus formas poliméricas se administran mediante medios parenteral, oral, rectal, o tópico, o una de sus combinaciones. Los modos parenterales de administración incluyen, por ejemplo, los modos subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular, o intravenoso, tales como mediante catéter. Los modos tópicos de administración pueden incluir, por ejemplo, una tirita. 65 In one embodiment the thyroid hormone, the analogues of the thyroid hormones, or their polymeric forms are administered by parenteral, oral, rectal, or topical means, or one of their combinations. Parenteral modes of administration include, for example, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, or intravenous modes, such as by catheter. Topical modes of administration may include, for example, a band aid.

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5 En otra realización, las hormonas tiroideas, los análogos de las hormonas tiroideas, o sus formas poliméricas pueden encapsularse o incorporarse en una micropartícula, liposoma, o polímero. El polímero puede incluir, por ejemplo, una poliglicolida, polilactida, o sus copolímeros. El liposoma o la micropartícula tienen un tamaño de aproximadamente menos de 200 nanómetros, y se puede administrar mediante una o más rutas parenterales, u otro modo de administración. En otra realización, el liposoma o la micropartícula pueden presentarse en lechos capilares que rodean el tejido isquémico, o aplicarse l interior de un vaso sanguíneo mediante un catéter. 5 In another embodiment, thyroid hormones, thyroid hormone analogues, or their polymeric forms can be encapsulated or incorporated into a microparticle, liposome, or polymer. The polymer may include, for example, a polyglycolide, polylactide, or its copolymers. The liposome or microparticle is about 200 nanometers in size, and can be administered by one or more parenteral routes, or another mode of administration. In another embodiment, the liposome or the microparticle can be presented in capillary beds surrounding the ischemic tissue, or applied inside the blood vessel using a catheter.

Las hormonas tiroideas, los análogos de las hormonas tiroideas, o sus formas poliméricas de acuerdo con la invención pueden también administrarse simultáneamente con una o más sustancias biológicamente activas que pueden incluir, por ejemplo, factores de crecimiento, vasodilatadores, anticoagulantes, antivíricos, antibacterianos, antiinflamatorios, Thyroid hormones, analogs of thyroid hormones, or their polymeric forms according to the invention may also be administered simultaneously with one or more biologically active substances that may include, for example, growth factors, vasodilators, anticoagulants, antivirals, antibacterials, anti-inflammatories,

15 inmunosupresores, analgésicos, agentes de vascularización, o moléculas de adhesión celular, o una de sus combinaciones. En una realización, el análogo de la hormona tiroidea o la forma polimérica se administra como una inyección en bolo antes de o tras la administración de una o más sustancias biológicamente activas. 15 immunosuppressants, analgesics, vascularization agents, or cell adhesion molecules, or one of their combinations. In one embodiment, the thyroid hormone analogue or polymeric form is administered as a bolus injection before or after administration of one or more biologically active substances.

Los factores de crecimiento pueden incluir, por ejemplo, factor alfa de crecimiento transformante ("TGFα"), factor beta de crecimiento transformante ("TGFβ"), factor básico de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento epitelial, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, y factor de permeabilidad vascular. Los vasodilatadores pueden incluir, por ejemplo, adenosina, derivados de adenosina, o una de sus combinaciones. Los anticoagulantes incluyen, pero no se limitan a, heparina, derivados de heparina, anti-factor Xa, anti-trombina, aspirina, clopidogrel, o una de sus combinaciones. Growth factors may include, for example, transforming growth factor alpha ("TGFα"), transforming growth factor beta ("TGFβ"), basic fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, epithelial growth factor, nerve growth factor, platelet-derived growth factor, and vascular permeability factor. Vasodilators may include, for example, adenosine, adenosine derivatives, or one of their combinations. Anticoagulants include, but are not limited to, heparin, heparin derivatives, anti-factor Xa, anti-thrombin, aspirin, clopidogrel, or one of their combinations.

25 En otro aspecto de la presente divulgación, se proporcionan métodos para promover la angiogénesis junto o alrededor de un dispositivo médico recubriendo el dispositivo con una hormona tiroidea, un análogo de hormona tiroidea, o un análogo de sus formas poliméricas como se describe aquí antes de insertar el dispositivo en un paciente. La etapa de revestimiento puede incluir además revestir el dispositivo con una o más sustancias biológicamente activas, tales como, pero sin limitación, un factor de crecimiento, un vasodilatador, un anticoagulante, o una de sus combinaciones. Los ejemplos de dispositivos médicos que se pueden revestir con análogos de la hormona tiroidea o las formas poliméricas incluyen prótesis endovasculares, catéteres, cánulas o electrodos. In another aspect of the present disclosure, methods are provided to promote angiogenesis together or around a medical device by coating the device with a thyroid hormone, a thyroid hormone analogue, or an analog of its polymeric forms as described herein before Insert the device into a patient. The coating step may further include coating the device with one or more biologically active substances, such as, but not limited to, a growth factor, a vasodilator, an anticoagulant, or one of its combinations. Examples of medical devices that can be coated with thyroid hormone analogs or polymeric forms include endovascular prostheses, catheters, cannulas or electrodes.

Se describen también métodos para tratar una dolencia susceptible de tratamiento inhibiendo la angiogénesis en un Methods are also described for treating a condition susceptible to treatment by inhibiting angiogenesis in a

35 sujeto que lo necesita una cantidad de un agente antiangiogénesis eficaz para inhibir la angiogénesis. Los ejemplos de las dolencias susceptibles de tratamiento que inhiben la angiogénesis incluyen tumores primarios o metastásicos, retinopatía diabética, y dolencias relacionadas. Se proporcionan también ejemplos de los agentes antiangiogénicos utilizados para inhibir la angiogénesis por la invención e incluyen el ácido tetrayodotiroacético (TETRAC), ácido triyodotiroacético (TRIAC), anticuerpo LM609 monoclonal, XT 199 o sus combinaciones. Dichos agentes antiangiogénesis pueden actuar en la superficie celular para inhibir los agentes pro-angiogénesis. A subject in need of an amount of an antiangiogenesis agent effective to inhibit angiogenesis. Examples of treatment ailments that inhibit angiogenesis include primary or metastatic tumors, diabetic retinopathy, and related ailments. Examples of the antiangiogenic agents used to inhibit angiogenesis by the invention are also provided and include tetraiodothyroacetic acid (TETRAC), triiodothyroacetic acid (TRIAC), monoclonal LM609 antibody, XT 199 or combinations thereof. Such anti-angiogenesis agents can act on the cell surface to inhibit pro-angiogenesis agents.

En una realización, el agente antiangiogénesis se administra mediante un modo parenteral, oral, rectal, o tópico, o una de sus combinaciones. En otra realización, el agente antiangiogénesis puede administrarse simultáneamente con uno In one embodiment, the anti-angiogenesis agent is administered by a parenteral, oral, rectal, or topical mode, or one of its combinations. In another embodiment, the anti-angiogenesis agent can be administered simultaneously with one

o más tratamientos o agentes quimioterapéuticos antiangiogénesis . or more antiangiogenesis chemotherapeutic treatments or agents.

45 Además, un aspecto adicional proporciona composiciones (es decir, agentes angiogénicos) que incluyen hormonas tiroideas, y análogos conjugados a un polímero. La conjugación puede ser a través de un enlace covalente o no covalente, dependiendo del polímero. Se puede producir un enlace covalente a través de un enlace éster o anhídrido, por ejemplo. Se proporcionan también análogos de hormonas tiroideas e incluyen levotiroxina (T4), triyodotironina (T3), ácido 3,5-dimetil-4-(4’-hidroxi-3’-isopropilbencil)-fenoxi acético (GC-1), o ácido 3,5-diyodotiropropiónico (DITPA). En una realización, el polímero puede incluir alcohol polivinílico, copolímero de ácido acrílico etileno, poli(ácido láctico), In addition, a further aspect provides compositions (ie, angiogenic agents) that include thyroid hormones, and analogs conjugated to a polymer. The conjugation can be through a covalent or non-covalent bond, depending on the polymer. A covalent bond can be produced through an ester or anhydride bond, for example. Thyroid hormone analogs are also provided and include levothyroxine (T4), triiodothyronine (T3), 3,5-dimethyl-4- (4'-hydroxy-3'-isopropylbenzyl) -phenoxy acetic acid (GC-1), or acid 3,5-diiodothyropropionic (DITPA). In one embodiment, the polymer may include polyvinyl alcohol, ethylene acrylic acid copolymer, poly (lactic acid),

o agarosa. or agarose.

Se describen formulaciones farmacéuticas que incluyen agentes angiogénicos en un vehículo farmacéuticamente Pharmaceutical formulations that include angiogenic agents in a pharmaceutical vehicle are described.

55 aceptable. Las formulaciones farmacéuticas pueden incluir también uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. 55 acceptable. Pharmaceutical formulations may also include one or more pharmaceutically acceptable excipients.

Las formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden estar encapsuladas o incorporadas en un liposoma, micropartícula, o polímero. El liposoma o la micropartícula tiene un tamaño de menos de aproximadamente 200 nanómetros. Cualquiera de las formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se puede administrar por medios parenteral, oral, rectal, o tópico, o una de sus combinaciones. En otra realización, las formulaciones farmacéuticas pueden administrarse simultáneamente a un sujeto que lo necesita con una o más sustancias biológicamente activas que incluyen, pero no se limitan a, factores de crecimiento, vasodilatadores, anticoagulantes, o una de sus combinaciones. The pharmaceutical formulations according to the present invention may be encapsulated or incorporated into a liposome, microparticle, or polymer. The liposome or microparticle is less than about 200 nanometers in size. Any of the pharmaceutical formulations according to the present invention can be administered by parenteral, oral, rectal, or topical means, or one of their combinations. In another embodiment, the pharmaceutical formulations can be administered simultaneously to a subject in need thereof with one or more biologically active substances that include, but are not limited to, growth factors, vasodilators, anticoagulants, or one of their combinations.

65 En otros aspectos, esta divulgación se refiere al uso de análogos de las hormonas tiroideas y a las formulaciones farmacéuticas que contienen dichas hormonas, para la restauración de las funciones neuronales y la potenciación de la supervivencia de las células neurales. Para el fin de esta divulgación, se supone que la función neuronal significa los mecanismos fisiológicos, bioquímicos y anatómicos colectivos que permiten el desarrollo del sistema nervioso durante los periodos preeembrionario y postnatal y que, en el animal adulto, es la base de los mecanismos regenerativos de las 65 In other aspects, this disclosure refers to the use of analogs of thyroid hormones and pharmaceutical formulations containing such hormones, for the restoration of neuronal functions and the enhancement of the survival of neural cells. For the purpose of this disclosure, it is assumed that the neuronal function means the collective physiological, biochemical and anatomical mechanisms that allow the development of the nervous system during the pre-embryonic and postnatal periods and that, in the adult animal, is the basis of the regenerative mechanisms of the

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5 neuronas dañadas y de la capacidad adaptativa del sistema nervioso central cuando algunas partes del mismo degeneran y no pueden regenerarse. 5 damaged neurons and the adaptive capacity of the central nervous system when some parts of it degenerate and cannot regenerate.

Por lo tanto, se producen los siguientes procesos para conseguir funciones neuronales: desnervación, reinervación, sinaptogénesis, represión sináptica, expansión sináptica, la formación de yemas axonales, regeneración neural, desarrollo y organización de rutas y circuitos neurales para sustituir los dañados. Por lo tanto, los pacientes adecuados que se van a tratar con los análogos de las hormonas tiroideas poliméricas o sus combinaciones son pacientes que padecen de patologías degenerativas del sistema nervioso central (enfermedad de Alzheimer de tipo demencia senil, Parkinsonismo, corea de Huntington, adrenoleucodistrofia cerebelar -espinal), trauma e isquemia cerebral. Therefore, the following processes occur to achieve neuronal functions: denervation, reinervation, synaptogenesis, synaptic repression, synaptic expansion, axonal bud formation, neural regeneration, development and organization of neural pathways and circuits to replace the damaged ones. Therefore, suitable patients who are to be treated with analogs of the polymeric thyroid hormones or their combinations are patients suffering from degenerative pathologies of the central nervous system (Alzheimer's disease of senile dementia, Parkinsonism, Huntington's chorea, adrenoleukodystrophy cerebellar-spinal), trauma and cerebral ischemia.

15 Se describen también métodos para tratar defectos de las neuronas motoras, que incluyen la esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, y lesión de la médula espinal, que comprende administrar un análogo polimérico de la hormona tiroidea, o una de sus combinaciones, y junto con factores de crecimiento, factores de crecimiento nervioso, u otros factores proangiogénicos o neurogénicos. Las lesiones de la médula espinal incluyen lesiones resultantes de un tumor, trauma mecánico, y trauma químico. Se contemplan los mismos o similares métodos para restaurar la función motora en un mamífero que tiene esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, o una lesión de médula espinal. Administrar uno de los análogos de hormonas tiroideas poliméricas anteriormente mencionados solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos proporciona también una función profiláctica. Dicha administración tiene el efecto de preservar la función motora en un mamífero que tiene, o está en riesgo de tener, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, o una lesión de médula espinal. También, la administración de 15 Methods are also described for treating motor neuron defects, including amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, and spinal cord injury, which comprises administering a polymeric analog of the thyroid hormone, or one of its combinations, and together with growth factors, nerve growth factors, or other proangiogenic or neurogenic factors. Spinal cord injuries include injuries resulting from a tumor, mechanical trauma, and chemical trauma. The same or similar methods are contemplated for restoring motor function in a mammal that has amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, or a spinal cord injury. Administering one of the aforementioned polymeric thyroid hormone analogues alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors also provides a prophylactic function. Such administration has the effect of preserving motor function in a mammal that has, or is at risk of having, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, or a spinal cord injury. Also, the administration of

25 análogos de hormonas tiroideas poliméricas solos o junto con factores de crecimiento nervioso o factores neurogénicos preserva la integridad de la ruta nigroestriatal. 25 analogs of polymeric thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or neurogenic factors preserve the integrity of the nigrostriatal pathway.

Específicamente, los métodos para tratar (pre o postsintomáticamente) la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis múltiple, o una lesión de médula espinal comprenden administrar un análogo de hormona tiroidea polimérica solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos. Opcionalmente, la hormona tiroidea polimérica sola o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos es un complejo soluble, que comprende al menos una hormona tiroidea polimérica sola o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos. Specifically, methods to treat (pre or postsymptomatically) amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, or spinal cord injury include administering a polymeric thyroid hormone analogue alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors. Optionally, the polymeric thyroid hormone alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors is a soluble complex, comprising at least one polymeric thyroid hormone alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors.

35 Se describen también composiciones y métodos de tratamiento terapéuticos que comprenden administrar a una mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína morfogénica ("un análogo de la hormona tiroidea polimérica solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos"), tal como se define en el presente documento, tras la lesión de una ruta neural, o como anticipo de dicha lesión, durante un tiempo y a una concentración suficiente para mantener la ruta neural, incluyendo la reparación de las rutas dañadas, o la inhibición adicional del daño de las anteriores. Therapeutic treatment compositions and methods are also described which comprise administering to a mammal a therapeutically effective amount of a morphogenic protein ("an analogue of the polymeric thyroid hormone alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors"), such as defined herein, after the injury of a neural pathway, or as an advance of said injury, for a time and at a sufficient concentration to maintain the neural pathway, including repair of the damaged pathways, or additional inhibition of the damage of previous.

Se describen también composiciones y métodos de tratamiento terapéuticos para mantener las rutas neurales. Dichos métodos de tratamiento incluyen administrar al mamífero, tras la lesión a una ruta neural o como anticipo de dicha lesión, un compuesto que estimula una concentración terapéuticamente eficaz de un análogo endógeno de hormona 45 tiroidea polimérica. Estos compuestos se denominan en el presente documento como análogos de hormonas tiroideas poliméricas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros agentes estimuladores de factores neurogénicos, o una lesión de médula espinal comprenden administrar un análogo polimérico de hormona tiroidea solo Compositions and therapeutic treatment methods for maintaining the neural pathways are also described. Such treatment methods include administering to the mammal, after injury to a neural pathway or as an advance of said injury, a compound that stimulates a therapeutically effective concentration of an endogenous polymeric thyroid hormone analogue. These compounds are referred to herein as analogs of polymeric thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factor stimulating agents, or a spinal cord injury comprising administering a polymeric analog of thyroid hormone alone.

o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, y se entiende que incluyen sustancias que, cuando se administran a un mamífero, actúan sobre el/los tejido(s) u órgano(s) que normalmente son responsables de, or together with nerve growth factors or other neurogenic factors, and it is understood that they include substances that, when administered to a mammal, act on the tissue (s) or organ (s) that are normally responsible for,

o capaces de, producir un análogo polimérico de hormona tiroidea solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos y/o secretar un análogo polimérico de hormona tiroidea solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, y que ocasionan una alteración en el nivel endógeno de los análogos de la hormona tiroidea polimérica sola o junto con un factor de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos. or capable of producing a polymeric analogue of thyroid hormone alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors and / or secreting a polymeric analogue of thyroid hormone alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors, and causing a alteration in the endogenous level of polymeric thyroid hormone analogues alone or together with a nerve growth factor or other neurogenic factors.

55 En particular, esta divulgación proporciona métodos para proteger neuronas de los efectos destructores del tejido asociados con la respuesta inmune e inflamatoria del cuerpo a la lesión nerviosa. Se proporcionan también métodos para estimular las neuronas para mantener su fenotipo diferenciado, que incluyen inducir la re diferenciación de las células transformadas de origen neuronal hasta una morfología característica de neuronas no transformadas. En uno, esta divulgación puede proporcionar medios para estimular la producción de moléculas de adhesión celular, particularmente, moléculas de adhesión de células nerviosas ("N-CAM"). 55 In particular, this disclosure provides methods to protect neurons from the destructive effects of tissue associated with the body's immune and inflammatory response to nerve damage. Methods are also provided to stimulate neurons to maintain their differentiated phenotype, including inducing re-differentiation of transformed cells of neuronal origin to a characteristic morphology of non-transformed neurons. In one, this disclosure may provide means to stimulate the production of cell adhesion molecules, particularly, nerve cell adhesion molecules ("N-CAM").

Se proporcionan también métodos, composiciones y dispositivos para estimular la reparación celular de las neuronas dañadas y las rutas neurales, incluyendo la regeneración de dendritas o axones dañados. Además, se proporcionan 65 también medios para evaluar el estado del tejido nervioso, y para detectar y vigilar neuropatías controlando las fluctuaciones en los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u Methods, compositions and devices are also provided to stimulate cellular repair of damaged neurons and neural pathways, including the regeneration of damaged dendrites or axons. In addition, 65 means are also provided to assess the state of nerve tissue, and to detect and monitor neuropathies by controlling fluctuations in polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or

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otros niveles de factores neurogénicos. other levels of neurogenic factors.

En un aspecto de la presente divulgación, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos descritos en el presente documento son útiles en la reparación de 5 rutas neurales dañadas del sistema nervioso periférico. En particular, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores son útiles en la reparación de rutas neurales dañadas, que incluyen fibras nerviosas seccionadas o dañadas de otra manera. Específicamente, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos descritos en el presente documento son capaces de estimular la regeneración nerviosa axonal completa, incluyendo la vascularización y la reformación de la vaina de mielina. Preferentemente, se proporcionan análogos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos en el sitio de lesión en un transportador resorbible biocompatible que pueden mantener los análogos de poliméricos de la hormona tiroidea solos In one aspect of the present disclosure, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors described herein are useful in the repair of 5 damaged neural pathways of the peripheral nervous system. In particular, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other factors are useful in repairing damaged neural pathways, which include sectioned or otherwise damaged nerve fibers. Specifically, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors described herein are capable of stimulating complete axonal nerve regeneration, including vascularization and reformation of the myelin sheath. Preferably, analogs of thyroid hormones are provided alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors at the site of injury in a biocompatible resorbable transporter that can hold polymeric analogs of thyroid hormone alone.

o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos en el sitio y, según necesidad, medios para dirigir el crecimiento axonal desde los extremos proximales a los distales de una neurona cortada. Por ejemplo, pueden or together with nerve growth factors or other neurogenic factors at the site and, as necessary, means to direct axonal growth from the proximal to the distal ends of a severed neuron. For example, they can

15 requerirse medios para dirigir el crecimiento axonal cuando se va a inducir la regeneración nerviosa en una distancia mayor, tal como de más de 10 mm. Están abarcados muchos transportadores que pueden proporcionar estas funciones. Por ejemplo, los transportadores útiles incluyen materiales sustancialmente insolubles o soluciones viscosas preparadas tal como se describe en el presente documento que comprenden laminina, ácido hialurónico o colágeno, u otros materiales poliméricos biocompatibles sintéticos adecuados, tales como ácidos polilácticos, poliglicólicos o polibutíricos y/o sus copolímeros. Un transportador preferido comprende una composición de matriz extracelular derivada, por ejemplo, de células de sarcoma de ratón. 15 means are required to direct axonal growth when nerve regeneration is to be induced at a greater distance, such as more than 10 mm. Many conveyors that can provide these functions are covered. For example, useful carriers include substantially insoluble materials or viscous solutions prepared as described herein comprising laminin, hyaluronic acid or collagen, or other suitable synthetic biocompatible polymeric materials, such as polylactic, polyglycolic or polybutyric acids and / or its copolymers. A preferred carrier comprises an extracellular matrix composition derived, for example, from mouse sarcoma cells.

Un análogo polimérico de hormona tiroidea solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros puede estar dispuesto en un canal de guiado de nervios que abarca la distancia de la ruta dañada. El canal actúa como una A polymeric analog of thyroid hormone alone or together with nerve or other growth factors may be arranged in a nerve guide channel that spans the distance of the damaged route. The channel acts as a

25 cubierta protectora y un medio físico para guiar el crecimiento de una neurita. Los canales útiles comprenden una membrana biocompatible, que puede tener una estructura tubular, que tiene una dimensión suficiente para abarcar el hueco en el nervio que se va a reparar, y que tiene aberturas adaptadas para recibir extremos nerviosos cortados. La membrana puede prepararse de cualquier material no irritante biocompatible, tal como un polímero de silicona o biocompatible, tal como polietileno o poliacetato de etilenvinilo. El material colado puede estar compuesto de polímeros bioresorbibles biocompatibles incluyendo, por ejemplo, colágeno, ácido hialurónico, ácidos poliláctico, polibutírico, y poliglicólico. La superficie externa del canal puede ser sustancialmente impermeable. 25 protective cover and a physical means to guide the growth of a neurite. Useful channels comprise a biocompatible membrane, which can have a tubular structure, which is of sufficient size to cover the hole in the nerve to be repaired, and which has openings adapted to receive severed nerve ends. The membrane can be prepared from any biocompatible non-irritating material, such as a silicone or biocompatible polymer, such as polyethylene or ethylene vinyl polyacetate. The cast material may be composed of biocompatible bioresorbable polymers including, for example, collagen, hyaluronic acid, polylactic, polybutyric acids, and polyglycolic acids. The outer surface of the channel can be substantially impermeable.

Los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos pueden estar dispuestos en el canal en asociación con un material transportador biocompatible, o puede Polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors may be arranged in the canal in association with a biocompatible carrier material, or it may

35 adsorberse o asociarse de otra manera con la superficie interna del material colado, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos nº 5.011.486, con la condición de que los análogos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nerviosos u otros factores neurogénicos sean accesibles. Adsorbed or otherwise associated with the internal surface of the cast material, as described in US Patent No. 5,011,486, with the proviso that thyroid hormone analogues alone or together with nerve growth factors or Other neurogenic factors are accessible.

Los análogos poliméricos de hormonas tiroideas, solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos descritos en el presente documento son útiles para proteger el daño asociado con la respuesta inmune/inflamatoria del cuerpo a una lesión inicial en el tejido nervioso. Dicha respuesta puede seguir al traumatismo del tejido nervioso, producida, por ejemplo, por una disfunción autoinmune, lesión neoplásica, infección, trauma químico o mecánico, enfermedad, interrupción del flujo sanguíneo a las neuronas o a las células gliales, o por otros traumatismos en los nervios o el material que los rodea. Por ejemplo, se cree que el daño principal resultante de 45 hipoxia o reperfusión por isquemia que sigue a la oclusión de un suministro de sangre neural, como en un ictus embólico, está inmunológicamente asociado. Además, al menos parte del daño asociado con numerosos tumores cerebrales primarios parece también estar inmunológicamente relacionado. La aplicación de un análogo polimérico de la hormona tiroidea solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos alivia y/o inhibe tanto directa como sistémicamente la respuesta inmunológicamente relacionada con una lesión neural. Como alternativa, también puede usarse la administración de un agente que pueda estimular la expresión y/o la secreción in vivo de análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos de expresión, preferentemente en el sitio de la infección. En el que la lesión que se va a inducir, como durante la cirugía u otro tratamiento clínico agresivo, los análogos poliméricos de las hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores o agentes neurogénicos se pueden proporcionar antes de la Polymeric analogs of thyroid hormones, alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors described herein are useful for protecting the damage associated with the body's immune / inflammatory response to an initial injury to nerve tissue. This response can follow the trauma of nerve tissue, caused, for example, by autoimmune dysfunction, neoplastic injury, infection, chemical or mechanical trauma, disease, interruption of blood flow to neurons or glial cells, or by other trauma to the nerves or the surrounding material. For example, it is believed that the main damage resulting from hypoxia or reperfusion due to ischemia that follows the occlusion of a neural blood supply, as in an embolic stroke, is immunologically associated. In addition, at least part of the damage associated with numerous primary brain tumors also seems to be immunologically related. The application of a polymeric analog of the thyroid hormone alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors relieves and / or directly and systemically inhibits the response immunologically related to a neural lesion. Alternatively, the administration of an agent that can stimulate the expression and / or secretion of polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic expression factors, preferably at the site of the administration, can also be used. infection. In which the lesion to be induced, such as during surgery or other aggressive clinical treatment, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors or agents may be provided before

55 inducción de la lesión para proporcionar un efecto neuroprotector al tejido nervioso en riesgo. 55 induction of the lesion to provide a neuroprotective effect to the nerve tissue at risk.

En general, los análogos poliméricos de las hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos útiles en los métodos y composiciones de la invención son proteínas diméricas que inducen la morfogénesis de una o más células tejidos u órganos eucariotas (por ejemplo, de mamíferos). La morfogénesis del tejido incluye la formación de tejido de novo o regenerativa, tal como se produce en embriones de vertebrados durante el desarrollo. De particular interés son los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos que inducen la morfogénesis específica del tejido al menos del tejido óseo o el tejido neural. Tal como se ha definido en el presente documento, un análogo polimérico de hormona tiroidea solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos 65 comprenden una pareja de polipéptidos que, cuando se pliegan, forman una proteína dimérica que estimula respuestas morfogenéticas en células y tejidos que expresan receptores tiroideos. Esto es, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos inducen generalmente una cascada de acontecimientos que incluyen los siguientes en un entorno morfogénicamente permisivo: estimulación de la proliferación de células precursoras; estimulando la diferenciación de células precursoras; estimulando la proliferación de células diferenciadas; y, soportando el crecimiento y el mantenimiento de 5 células diferenciadas. Células "precursoras" son células no comprometidas que son competentes para diferenciarse en uno a más tipos específicos de células diferenciadas, dependiendo de su repertorio genómico y de la especificidad del tejido del entorno permisivo en el que se induce la morfogénesis. Una célula precursora ilustrativa es un citoblasto hematopoyético, un citoblasto mesenquimatoso, una célula del epitelio basal, una célula de la cresta neural, o similares. Además, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos pueden retrasar o mitigar el comienzo de la senescencia o quiescencia asociada a la pérdida de fenotipo y/o la función tisular. Adicionalmente además, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos pueden estimular la expresión fenotípica de un tipo de célula diferenciada, incluyendo sus propiedades de expresión metabólica y/o funcional, por ejemplo, secretoria. Además, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento In general, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors useful in the methods and compositions of the invention are dimeric proteins that induce the morphogenesis of one or more tissue cells or eukaryotic organs (eg. , of mammals). Tissue morphogenesis includes de novo or regenerative tissue formation, as occurs in vertebrate embryos during development. Of particular interest are polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors that induce tissue-specific morphogenesis at least of bone tissue or neural tissue. As defined herein, a polymeric analogue of thyroid hormone alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors 65 comprises a pair of polypeptides that, when folded, form a dimeric protein that stimulates morphogenetic responses in cells and tissues that express thyroid receptors. That is, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors generally induce a cascade of events that include the following in a morphogenically permissive environment: stimulation of precursor cell proliferation; stimulating the differentiation of precursor cells; stimulating the proliferation of differentiated cells; and, supporting the growth and maintenance of 5 differentiated cells. "Precursor" cells are uncommitted cells that are competent to differentiate into one or more specific types of differentiated cells, depending on their genomic repertoire and the tissue specificity of the permissive environment in which morphogenesis is induced. An illustrative precursor cell is a hematopoietic cytoblast, a mesenchymal cytoblast, a basal epithelial cell, a neural crest cell, or the like. In addition, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors may delay or mitigate the onset of senescence or quiescence associated with loss of phenotype and / or tissue function. Additionally, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors can stimulate the phenotypic expression of a differentiated cell type, including its metabolic and / or functional expression properties, for example, secretory. In addition, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with growth factors

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15 nervioso u otros factores neurogénicos pueden inducir la rediferenciación de células comprometidas (por ejemplo, osteoblastos, neuroblastos, o similares) en condiciones adecuadas. Tal como se ha indicado anteriormente, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos que inducen la proliferación y/o la diferenciación de al menos un tejido óseo o tejido neural, y/o soporten el crecimiento, el mantenimiento y/o las propiedades funcionales del tejido neural, son de particular interés en el presente documento. Nervous or other neurogenic factors may induce redifferentiation of compromised cells (eg, osteoblasts, neuroblasts, or the like) under appropriate conditions. As indicated above, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors that induce proliferation and / or differentiation of at least one bone tissue or neural tissue, and / or support growth , the maintenance and / or functional properties of neural tissue, are of particular interest herein.

De particular interés son los análogos poliméricos de hormonas tiroidea solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos que, cuando se proporcionan a un tejido específico de un mamífero, inducen la morfogénesis específica de tejido o mantiene el estado normal de la diferenciación y el crecimiento de este tejido. El Of particular interest are polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors that, when provided to a specific mammalian tissue, induce tissue specific morphogenesis or maintain the normal state of differentiation and The growth of this tissue. He

25 presente análogo polimérico de hormona tiroidea solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos puede inducir la formación de tejidos corporales de vertebrados (por ejemplo, aves o mamíferos), tales como pero sin limitarse a nervios, ojo, hueso, cartílago, médula ósea, ligamento, dentina de diente, periodonto, hígado, riñón, pulmón, corazón, o revestimiento gastrointestinal. Se pueden llevar a cabo los métodos preferidos en el contexto de desarrollo del tejido embrionario, o en un sitio de herida aséptica no cicatrizada en el tejido post embrionario. The present polymeric analogue of thyroid hormone alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors may induce the formation of vertebrate body tissues (eg, birds or mammals), such as but not limited to nerves, eye, bone, cartilage. , bone marrow, ligament, tooth dentin, periodontium, liver, kidney, lung, heart, or gastrointestinal lining. Preferred methods can be carried out in the context of embryonic tissue development, or at an unhealed aseptic wound site in post embryonic tissue.

Se describen también composiciones y métodos para utilizar análogos y polímeros de hormonas tiroideas para la obtención de imágenes y el diagnóstico de trastornos neurodegenerativos, tales como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, se describen análogos de T4 que tienen una elevada especificidad para los sitios diana cuando se administran a un sujeto in vivo. Los análogos de T4 preferidos muestran una relación diana a no diana de al Compositions and methods for using analogs and polymers of thyroid hormones for imaging and diagnosis of neurodegenerative disorders, such as, for example, Alzheimer's disease, are also described. For example, T4 analogs are described that have high specificity for target sites when administered to a subject in vivo. Preferred T4 analogs show a target to non-target ratio of al

35 menos 4:1, son estables in vivo y se localizan sustancialmente con la diana 1 hora después de la administración. Se describen también composiciones farmacéuticas comprendidas por un enlazador unido a los análogos de T4 para la obtención de imágenes de rayos gamma para tecnecio, indio, utilizando emisión de fotón único ("SPECT") y con agentes de contraste para la obtención de imágenes de RMI. Adicionalmente, los análogos halogenados que se unen a TTR pueden inhibir la formación de fibrillas amiloides y de esta manera se pueden utilizar para la prevención y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Dichos compuestos se pueden usar también con métodos de diagnóstico por imágenes de tomografía de emisión de positrones ("PET"). 35 minus 4: 1, are stable in vivo and are located substantially with the target 1 hour after administration. Pharmaceutical compositions comprising a linker linked to the T4 analogs for obtaining gamma ray images for technetium, indium, using single photon emission ("SPECT") and with contrast agents for obtaining RMI images are also described. . Additionally, halogenated analogs that bind to TTR can inhibit the formation of amyloid fibrils and thus can be used for the prevention and treatment of Alzheimer's disease. Such compounds can also be used with diagnostic imaging methods of positron emission tomography ("PET").

Esta divulgación incluye también composiciones y métodos para modular acciones de factores de crecimiento y otros polipéptidos cuyos receptores de la superficie celular se agrupan alrededor de la integrina αVβ3, u otros receptores de This disclosure also includes compositions and methods for modulating actions of growth factors and other polypeptides whose cell surface receptors are grouped around the αVβ3 integrin, or other receptors of

45 la superficie celular que contienen la secuencia de aminoácidos Arg-Gly-Asp ("RGD"). Los polipéptidos que se pueden modular incluyen, por ejemplo, insulina, factores de crecimiento de tipo insulina, factores de crecimiento epidérmico, e interferon-γ. 45 the cell surface containing the amino acid sequence Arg-Gly-Asp ("RGD"). Polypeptides that can be modulated include, for example, insulin, insulin-like growth factors, epidermal growth factors, and interferon-γ.

Breve descripción de los dibujos Brief description of the drawings

Figura 1. Efectos de L-T4 y L-T3 sobre la angiogénesis cuantificada en el ensayo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM). A, Se expusieron las muestras del control a PBS y las muestras adicionales a 1 nM de T3 o 0,1 µmol/l de T4 durante 3 días. Ambas hormonas produjeron una ramificación creciente de vasos sanguíneos en estas imágenes representativas de 3 experimentos. B, Tabulación del promedio ±SEM de las Figure 1. Effects of L-T4 and L-T3 on quantified angiogenesis in the chicken chorioallantoid membrane (CAM) assay. A, Control samples were exposed to PBS and additional samples at 1 nM of T3 or 0.1 µmol / l of T4 for 3 days. Both hormones produced a growing branching of blood vessels in these images representative of 3 experiments. B, Tabulation of the mean ± SEM of the

55 nuevas ramificaciones formadas a partir de vasos sanguíneos existentes durante el periodo experimental elaborado de 3 experimentos, cada uno de los cuales incluyó 9 ensayos de membranas corialantoideas. A las concentraciones que se muestran, T3 y T4 produjeron efectos similares (aumentos de 1,9 veces y 2,5 veces, respectivamente, en la formación de ramificaciones). **P<0,001 mediante un ANOVA monolateral, comparando las muestras de CAM tratadas con PBS y tratadas con hormonas. 55 new branches formed from existing blood vessels during the experimental period developed from 3 experiments, each of which included 9 trials of choriolantoid membranes. At the concentrations shown, T3 and T4 produced similar effects (increases of 1.9 times and 2.5 times, respectively, in the formation of branches). ** P <0.001 using a monolateral ANOVA, comparing CAM samples treated with PBS and treated with hormones.

Figura 2. Tetrac inhibe la estimulación de la angiogénesis por T4 y T4 unido a la agarosa (T4-ag). A, Se observa un aumento de 2,5 veces en la formación de ramificaciones de vasos sanguíneos en una preparación de CAM representativa expuesta a 0,1 µmol/l de T4 durante 3 días. En 3 experimentos similares, se produjo un aumento de 2,3 veces. Se inhibió este efecto de la hormona mediante tetrac (0,1 µmol/l), un análogo de T4 del que 65 se ha mostrado anteriormente que inhibe las acciones de la membrana plasmática de T4. 13 Tetrac solo no estimulan la angiogénesis (C). B, T4-ag (0,1 µmol/l) estimula la angiogénesis 2,3 veces (2,9 veces en los 3 Figure 2. Tetrac inhibits the stimulation of angiogenesis by T4 and T4 bound to agarose (T4-ag). A, A 2.5-fold increase in blood vessel branch formation is observed in a representative CAM preparation exposed to 0.1 µmol / L of T4 for 3 days. In 3 similar experiments, an increase of 2.3 times occurred. This hormone effect was inhibited by tetrac (0.1 µmol / l), a T4 analogue of which 65 has been shown above that inhibits the actions of the T4 plasma membrane. 13 Tetrac alone does not stimulate angiogenesis (C). B, T4-ag (0.1 µmol / l) stimulates angiogenesis 2.3 times (2.9 times in the 3

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experimentos), un efecto también bloqueado por tetrac. C, Resumen de los resultados de 3 experimentos que examinan las acciones de tetrac, T4-ag, y T4 en el ensayo de CAM. Se obtuvieron datos (promedio ± SEM) de 10 imágenes de cada condición experimental en cada uno de 3 experimentos. **P<0.001 mediante ANOVA, comparando las muestras tratadas con T4 y las muestras tratadas con T4-agarosa con las muestras del control experiments), an effect also blocked by tetrac. C, Summary of the results of 3 experiments examining the actions of tetrac, T4-ag, and T4 in the CAM assay. Data (average ± SEM) of 10 images of each experimental condition were obtained in each of 3 experiments. ** P <0.001 by ANOVA, comparing the samples treated with T4 and the samples treated with T4-agarose with the control samples

5 tratadas con PBS. 5 treated with PBS.

Figura 3. Comparación de los efectos proangiogénicos de FGF2 y T4. A, Los efectos en paralelo de T4 (0,05 µmol/l) y FGF2 (0,5 µg/ml) en concentraciones submáximas son aditivos en el ensayo de CAM e igualan el nivel de la angiogénesis que se observa con FGF2 (1 µg/ml en ausencia de T4). B, Resumen de resultados de 3 Figure 3. Comparison of the proangiogenic effects of FGF2 and T4. A, The parallel effects of T4 (0.05 µmol / l) and FGF2 (0.5 µg / ml) at submaximal concentrations are additive in the CAM assay and match the level of angiogenesis observed with FGF2 (1 µg / ml in the absence of T4). B, Summary of results of 3

10 experimentos que examinaron las acciones de FGF2 y T4 en el ensayo de CAM (promedios ± SEM) como en A. *P<0,05; **P<0,001, comparando los datos de las muestras tratadas con los de las muestras del control tratadas con PBS en 3 experimentos. 10 experiments that examined the actions of FGF2 and T4 in the CAM assay (means ± SEM) as in A. * P <0.05; ** P <0.001, comparing the data of the treated samples with those of the control samples treated with PBS in 3 experiments.

Figura 4. Efecto de anti-FGF2 sobre la angiogénesis producida por T4 o FGF2 exógeno. A, FGF2 produjo un Figure 4. Effect of anti-FGF2 on angiogenesis produced by exogenous T4 or FGF2. A, FGF2 produced a

15 aumento de 2 veces en la angiogénesis en el modelo de CAM en 3 experimentos, un efecto inhibido por el anticuerpo (ab) de FGF2 (8 µg). T4 también estimuló la angiogénesis en 1,5 veces, y este efecto fue bloqueado también por el anticuerpo de FGF2, indicando que la acción de la hormona tiroidea en el modelo CAM está mediado por un efecto autocrino/paracrino de FGF2 debido a que T4 y T3 producen la liberación de FGF2 de las células en el modelo CAM (Tabla 1). Los inventores habían demostrado previamente que un anticuerpo de IgG no A 2-fold increase in angiogenesis in the CAM model in 3 experiments, an effect inhibited by FGF2 antibody (ab) (8 µg). T4 also stimulated angiogenesis 1.5 times, and this effect was also blocked by the FGF2 antibody, indicating that the action of the thyroid hormone in the CAM model is mediated by an autocrine / paracrine effect of FGF2 because T4 and T3 produce the release of FGF2 from the cells in the CAM model (Table 1). The inventors had previously shown that an IgG antibody did not

20 específico no tiene efecto sobre la angiogénesis en el ensayo de CAM. B, Resumen de los resultados de 3 experimentos de CAM que estudió la acción de FGF2-ab en presencia de FGF2 o T4. *P<0,01; **P<0,001, indicando efectos significativos en 3 experimentos que estudian los efectos de la hormona tiroidea y de FGF2 sobre la angiogénesis y la pérdida de estos efectos en presencia del anticuerpo dirigido a FGF2. 20 has no effect on angiogenesis in the CAM assay. B, Summary of the results of 3 CAM experiments that studied the action of FGF2-ab in the presence of FGF2 or T4. * P <0.01; ** P <0.001, indicating significant effects in 3 experiments studying the effects of thyroid hormone and FGF2 on angiogenesis and the loss of these effects in the presence of the antibody directed to FGF2.

25 Figura 5. Efecto de PD 98059, un inhibidor de la cascada de transducción de la señal de MAPK (ERK1/2), sobre la angiogénesis inducida por T4, T3, y FGF2. A, La angiogénesis estimulada por T4 (0,1 µmol/l) y T3 (1 nmol/l) juntos quedó completamente inhibida por PD 98059 (3 µmol/l). B, La angiogénesis inducida por FGF2 (1 µg/ml) también quedó inhibida por PD 98059, indicando que la acción del factor de crecimiento es también dependiente de la activación de la ruta de ERK1/2. En el contexto de los experimentos que implican T4-agarosa Figure 5. Effect of PD 98059, an inhibitor of the MAPK signal transduction cascade (ERK1 / 2), on angiogenesis induced by T4, T3, and FGF2. A, The angiogenesis stimulated by T4 (0.1 µmol / l) and T3 (1 nmol / l) together was completely inhibited by PD 98059 (3 µmol / l). B, FGF2-induced angiogenesis (1 µg / ml) was also inhibited by PD 98059, indicating that the action of the growth factor is also dependent on the activation of the ERK1 / 2 pathway. In the context of experiments involving T4-agarose

30 (T4-ag) y tetrac (Figura 2) indicando que T4 inicia su efecto proangiogénico en la membrana celular, los resultados que se muestran en A y B son consistentes con 2 papeles jugados por MAPK en la acción proangiogénica de la hormona tiroidea: ERK1/2 transduce la señal inicial de la hormona que conduce a la elaboración de la señal inicial de la hormona que conduce a la elaboración de FGF2 y transduce la acción posterior de FGF2 sobre la angiogénesis. C, Resumen de resultados de 3 experimentos, representados por A y B, que muestran el efecto de 30 (T4-ag) and tetrac (Figure 2) indicating that T4 initiates its proangiogenic effect on the cell membrane, the results shown in A and B are consistent with 2 roles played by MAPK in the proangiogenic action of thyroid hormone: ERK1 / 2 transduces the initial signal of the hormone that leads to the elaboration of the initial signal of the hormone that leads to the elaboration of FGF2 and transduces the subsequent action of FGF2 on angiogenesis. C, Summary of results of 3 experiments, represented by A and B, showing the effect of

35 PD98059 sobre las acciones de T4 y FGF2 en el modelo de CAM. *P<0,01; **P<0,001, indicando los resultados de ANOVA sobre los datos de 3 experimentos. 35 PD98059 on the actions of T4 and FGF2 in the CAM model. * P <0.01; ** P <0.001, indicating the results of ANOVA on the data of 3 experiments.

Figura 6. T4 y FGF2 activan MAPK en células endoteliales ECV304. Se prepararon las células en medio M199 con suero de hormona agotado al 0,25 % y se trataron con T4 (0,1 µmol/l) durante 15 minutos a 6 horas. Se 40 recogieron las células y se prepararon las fracciones nucleares como se ha descrito anteriormente. Las nucleoproteínas, separadas mediante electroforesis en gel, se inmunotransfirieron con anticuerpos a MAPK fosforilado (pERK1 y pERK2, 44 y 42 kDa, respectivamente), seguido por un segundo anticuerpo unido a un sistema de detección mediante luminiscencia. La inmunotransferencia de A β-actina de fracciones nucleares sirve como control de la carga del gel en cada parte de esta figura. Cada inmunotransferencia es representativa de 3 45 experimentos. A, T4 produce un aumento de la fosforilación y la translocación nuclear de ERK1/2 en células ECV304. El efecto es máximo en 30 minutos, aunque el efecto sigue permaneciendo durante ≥6 horas. B, Se trataron células ECV304 con el inhibidor de la activación de ERK1/2, PD 98059, (PD; 30 µmol/l) o el inhibidor de PKC CGP41251 (CGP; 100 nmol/l) durante 30 minutos, tras lo cual se añadió T4 10-7 M 15 minutos a las muestras de células tal como se muestra. Se recogieron los núcleos, y este experimento representativo muestra un aumento Figure 6. T4 and FGF2 activate MAPK in ECV304 endothelial cells. The cells were prepared in M199 medium with 0.25% depleted hormone serum and treated with T4 (0.1 µmol / L) for 15 minutes to 6 hours. Cells were collected and nuclear fractions were prepared as described above. Nucleoproteins, separated by gel electrophoresis, were immunoblotted with antibodies to phosphorylated MAPK (pERK1 and pERK2, 44 and 42 kDa, respectively), followed by a second antibody bound to a luminescence detection system. Immunoblotting of Aβ-actin from nuclear fractions serves as a control of the gel load in each part of this figure. Each immunoblot is representative of 3,345 experiments. A, T4 produces an increase in phosphorylation and nuclear translocation of ERK1 / 2 in ECV304 cells. The effect is maximum in 30 minutes, although the effect remains for ≥6 hours. B, ECV304 cells were treated with the ERK1 / 2 activation inhibitor, PD 98059, (PD; 30 µmol / l) or the PKC inhibitor CGP41251 (CGP; 100 nmol / l) for 30 minutes, after which 10-7 M T4 added 15 minutes to the cell samples as shown. The nuclei were collected, and this representative experiment shows an increase

50 de la fosforilación (activación) de ERK1/2 por T4 (banda 4), que se bloqueó por ambos inhibidores (bandas 5 y 6), sugiriendo que la actividad de PKC es un requisito para la activación de MAPK por T4 en células endoteliales. C, Se trataron las células ECV304 tanto con T4 (10-7 mol/l), FGF2 (10 ng/ml), o ambos agentes durante 15 minutos. La figura muestra la acumulación de pERK1/2 en núcleos por el tratamiento tanto con hormonas como con los factores de crecimiento y la mejora en la acumulación nuclear de pERK1/2 con ambos agentes juntos. 50 of phosphorylation (activation) of ERK1 / 2 by T4 (lane 4), which was blocked by both inhibitors (bands 5 and 6), suggesting that PKC activity is a requirement for activation of MAPK by T4 in endothelial cells . C, ECV304 cells were treated with both T4 (10-7 mol / l), FGF2 (10 ng / ml), or both agents for 15 minutes. The figure shows the accumulation of pERK1 / 2 in nuclei by treatment with both hormones and growth factors and the improvement in nuclear accumulation of pERK1 / 2 with both agents together.

55 Figura 7. T4 aumenta la acumulación de ADN de FGF2 en células endoteliales ECV304. Se trataron las células durante 6 a 48 horas con T4 (10-7 mol/l) y se aislaron los ADNc de FGF2 y GAPDH de cada alícuota de células. Los niveles de ADNc de FGF2, que se muestran en la transferencia superior, se corrigieron para las variaciones en el ADNc de GAPDH, que se muestran en la transferencia inferior, y se ilustran a continuación en la 55 Figure 7. T4 increases the accumulation of FGF2 DNA in ECV304 endothelial cells. The cells were treated for 6 to 48 hours with T4 (10-7 mol / l) and the FGF2 and GAPDH cDNAs were isolated from each aliquot of cells. FGF2 cDNA levels, which are shown in the upper transfer, were corrected for variations in the GAPDH cDNA, which are shown in the lower transfer, and are illustrated below in the

60 gráfica los niveles corregidos de FGF2 (promedio ± SE del promedio; n = 2 experimentos). Hubo una mayor abundancia del transcrito de FGF2 en el ARN extraído de las células tratadas con T4 en todos los puntos temporales. *P<0,05; **P<0,01, indicando la comparación mediante ANOVA de los valores en cada punto temporal hasta el valor del control. 60 graph the corrected levels of FGF2 (mean ± SE of the average; n = 2 experiments). There was a greater abundance of the FGF2 transcript in the RNA extracted from T4 treated cells at all time points. * P <0.05; ** P <0.01, indicating the ANOVA comparison of the values at each time point to the control value.

65 Figura 8. Modelo de crecimiento de tumor en embriones de pollo en el día 7. Ilustración del modelo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM) de implante tumoral. 65 Figure 8. Tumor growth model in chicken embryos on day 7. Illustration of the chicken chorioallantoid membrane (CAM) model of tumor implant.

imagen13image13

Figura 9. T4 estimula la cicatrización 3D de la herida. Las fotografías de células de fibroblastos dérmicos 5 humanos se expusieron a T4 y al control, de acuerdo con el ensayo 3D de cicatrización de heridas descrito en el presente documento. Figure 9. T4 stimulates 3D wound healing. Photographs of human dermal fibroblast cells 5 were exposed to T4 and to control, according to the 3D wound healing assay described herein.

Figura 10. T4 dependiente de dosis aumenta la cicatrización de heridas, Día 3. Como se indica por la gráfica, T4 aumenta la cicatrización de heridas (medida por células que emigran) de una manera dependiente a la dosis entre concentraciones de 0,1 µM y 1,0 µM. No se observa el mismo aumento en concentraciones de T4 entre 1,0 µMy3,0 µM. Figure 10. Dose-dependent T4 increases wound healing, Day 3. As indicated by the graph, T4 increases wound healing (measured by cells that migrate) in a dose-dependent manner between concentrations of 0.1 µM and 1.0 µM. The same increase in T4 concentrations between 1.0 µM and 3.0 µM is not observed.

Figura 11. Efecto de T4 y T3 en la unión de 125I-T4 a una integrina purificada. Se añadieron T4 (10-4 M a 10-11 M) Figure 11. Effect of T4 and T3 on the binding of 125I-T4 to a purified integrin. T4 (10-4 M to 10-11 M) were added

o T3 (10-4 M a 10-8 M) a una integrina αVβ3 purificada (2 µg/muestra) y se dejó incubar durante 30 min a temperatura or T3 (10-4 M to 10-8 M) to a purified αVβ3 integrin (2 µg / sample) and allowed to incubate for 30 min at temperature

15 ambiente. Se añadieron dos microcurios de T4 marcado con 125I a cada muestra. Las muestras se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente, se mezclaron con un colorante cargado, y se analizaron en un gel Native al 5 % durante 24 horas a 4 ºC a 45 mA. Tras la electroforesis, los geles se envolvieron en una envoltura de plástico y se expusieron a una película. 125I-T4 unida a αVβ3 purificada no se vio afectada por T4 no marcada en el intervalo de 10-11 M a 10-7 M, pero es competitiva de una manera dependiente de la dosis con una T4 no marcada a una concentración de 10-6 M. La unión de T4 caliente a la integrina está casi completamente desplazada por la T4 no marcada a 10-4 M. n T3 es menos eficaz en la unión competitiva de T4 a αVβ3, reduciendo la señal en un 11 %, 16 %, y 28 % a 10-6 M, 10-5 M, y 10-4 M T3, respectivamente. 15 environment. Two microcurios of 125I-labeled T4 were added to each sample. The samples were incubated for 20 min at room temperature, mixed with a charged dye, and analyzed on a 5% Native gel for 24 hours at 4 ° C at 45 mA. After electrophoresis, the gels were wrapped in a plastic wrap and exposed to a film. 125I-T4 bound to purified αVβ3 was not affected by unlabeled T4 in the range of 10-11 M to 10-7 M, but is competitive in a dose-dependent manner with an unlabeled T4 at a concentration of 10- 6 M. The binding of hot T4 to integrin is almost completely displaced by unmarked T4 at 10-4 M. n T3 is less effective in the competitive binding of T4 to αVβ3, reducing the signal by 11%, 16% , and 28% at 10-6 M, 10-5 M, and 10-4 M T3, respectively.

Figura 12. Tetrac y un péptido que contiene RGD, pero no un péptido que contiene RGE, compiten por la Figure 12. Tetrac and a peptide containing RGD, but not a peptide containing RGE, compete for the

25 unión de T4 a αVβ3 purificada. A) La adición de tetrac a αVβ3 purificada reduce la unión de T4 marcada con 125I a la integrina de una manera dependiente de la dosis. 10-8 M de tetrac es ineficaz en la unión competitiva de T4 mediante calor a la integrina. La asociación de T4 y αVβ3 se redujo en un 38 % en presencia de 10-7 M de tetrac y en un 90 % con 10-5 M de tetrac. La adición de un péptido RGD a 10-5 M compite por la unión de T4 a αVβ3. La aplicación de 10-5 M y 10-4 M del péptido RGE, como control para el péptido RGD, no pudo disminuir la unión de T4 mediante calor a αVβ3 purificada. B) representación gráfica de los datos de tetrac y RGD procedentes del panel A. Los datos puntuales se muestran como el promedio ± S.D. para 3 experimentos independientes. 25 T4 binding to purified αVβ3. A) The addition of tetrac to purified αVβ3 reduces the binding of 125I-labeled T4 to integrin in a dose-dependent manner. 10-8 M of tetrac is ineffective in the competitive binding of T4 by heat to integrin. The association of T4 and αVβ3 was reduced by 38% in the presence of 10-7 M of tetrac and by 90% with 10-5 M of tetrac. The addition of a 10-5 M RGD peptide competes for the binding of T4 to αVβ3. The application of 10-5 M and 10-4 M of the RGE peptide, as a control for the RGD peptide, could not decrease T4 binding by heat to purified αVβ3. B) graphical representation of the tetrac and GDPR data from panel A. The point data is shown as the average ± S.D. for 3 independent experiments.

Figura 13. Efectos del anticuerpo monoclonal LM609 sobre la unión de T4 a αVβ3. A) Se añadió LM609 a αVβ3 a las concentraciones indicadas. Un µg de LM609 por muestra reduce la unión de T4 marcada a la integrina Figure 13. Effects of the LM609 monoclonal antibody on the binding of T4 to αVβ3. A) LM609 was added to αVβ3 at the indicated concentrations. One µg of LM609 per sample reduces the binding of labeled T4 to integrin

35 en un 52 %. Se alcanzó la inhibición máxima de la unión de T4 a la integrina cuando las concentraciones de LM609 son de 2 µg por muestra y se mantiene con concentraciones de anticuerpo tan elevadas como de 8 µg. Como control para la especificidad del anticuerpo, se añadieron 10 µg/muestra de mAB Cox-2 y 10 µg/muestra de IgG de ratón a αVβ3 antes de la incubación con T4. B) representación gráfica de los datos del panel A. Los datos puntuales se muestran como el promedio ± S.D. para 3 experimentos independientes. 35 by 52%. Maximum inhibition of T4 binding to integrin was achieved when LM609 concentrations are 2 µg per sample and maintained with antibody concentrations as high as 8 µg. As a control for the specificity of the antibody, 10 µg / sample of mAB Cox-2 and 10 µg / sample of mouse IgG were added to αVβ3 before incubation with T4. B) graphical representation of panel A data. Point data is shown as the average ± S.D. for 3 independent experiments.

Figura 14. Efecto de RGD, RGE, tetrac, y el mAB LM609 en la activación de MAPK inducida por T4. A) Células CV-1 (hasta un 50-70 % de confluencia) se trataron durante 30 min. con T4 10-7 M (10-7 M de concentración total, concentración 10-10 M en forma libre. Las muestras seleccionadas se trataron durante 16 horas con las concentraciones indicadas de cualquiera de un péptido que contiene RGD, un péptido que contiene RGE, tetrac, o Figure 14. Effect of RGD, RGE, tetrac, and the LM609 mAB on MAPK activation induced by T4. A) CV-1 cells (up to 50-70% confluence) were treated for 30 min. with 10-7 M T4 (10-7 M total concentration, 10-10 M concentration in free form. Selected samples were treated for 16 hours with the indicated concentrations of any of a peptide containing RGD, a peptide containing RGE , tetrac, or

45 LM609 antes de la adición de T4. Se separaron las proteínas nucleares mediante SDS-PAGE y se inmunotransfirieron con anticuerpo dirigido contra fosfo-MAPK (pERK 1/2). La acumulación nuclear de pERK1/2 disminuyó en las muestras tratadas con 10-6 M del péptido RGD o más, pero no se alteró significativamente en muestras tratadas con 10-4 M de RGE. La acumulación de pERK1/2 disminuyó en un 76 % en células CV1 tratadas con 10-6 M de tetrac, mientras que 10-5 M y concentraciones mayores de tetrac reducen la acumulación nuclear de pERK1/2 a niveles similares a las muestras del control no tratadas. El anticuerpo monoclonal LM609 dirigido contra αVβ3 disminuye la acumulación de MAPK activado en el núcleo cuando se aplica a cultivos de CV1 a una concentración de 1 µg/ml. B) Representación gráfica de los datos de RGD, RGE, y tetrac mostrados en el panel A. Los datos puntuales representan el promedio ± S.D. de 3 experimentos separados. 45 LM609 before the addition of T4. Nuclear proteins were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with antibody directed against phospho-MAPK (pERK 1/2). Nuclear accumulation of pERK1 / 2 decreased in samples treated with 10-6 M of the RGD peptide or more, but did not significantly alter in samples treated with 10-4 M of RGE. The accumulation of pERK1 / 2 decreased by 76% in CV1 cells treated with 10-6 M of tetrac, while 10-5 M and higher concentrations of tetrac reduce the nuclear accumulation of pERK1 / 2 to levels similar to the control samples untreated The LM609 monoclonal antibody directed against αVβ3 decreases the accumulation of activated MAPK in the nucleus when applied to CV1 cultures at a concentration of 1 µg / ml. B) Graphical representation of the RGD, RGE, and tetrac data shown in panel A. The point data represent the average ± S.D. of 3 separate experiments.

55 Figura 15. Efectos del ARNip en αV y β3 sobre la activación de MAPK inducida por T4. Se transfectaron células CV1 con ARNip (concentración final 100 nM) de αV, β3, o αV y β3 juntos. Dos días después de la transfección, las células se trataron con T4 10-7 M. A) Se realizó una RT-PCR a partir de ARN aislado procedente de cada grupo de transfección para verificar la especificidad y la funcionalidad de cada ARNip. B) Se aislaron proteínas nucleares de cada transfección y se sometieron a SDS-PAGE. 55 Figure 15. Effects of siRNA on αV and β3 on T4-induced MAPK activation. CV1 cells were transfected with siRNA (final 100 nM concentration) of αV, β3, or αV and β3 together. Two days after transfection, the cells were treated with T4 10-7 M. A) RT-PCR was performed from isolated RNA from each transfection group to verify the specificity and functionality of each siRNA. B) Nuclear proteins were isolated from each transfection and subjected to SDS-PAGE.

Figura 16. Efecto inhibidor del mAB (LM609) dirigido contra αVβ3 sobre la angiogénesis estimulada por T4 en el modelo CAM. A) Se expusieron las muestras a PBS, T4 (0,1 µM), o T4 más 10 mg/ml de LM609 durante 3 días. La angiogénesis estimulada por T4 quedó sustancialmente inhibida por la adición del anticuerpo monoclonal LM609 dirigido contra αVβ3 . B) Tabulación del promedio ±SEM de las nuevas ramificaciones formadas a partir de 65 vasos sanguíneos existentes durante el periodo experimental. Los datos se obtuvieron de 3 experimentos separados, que contenían cada uno 9 muestras en cada grupo de tratamiento. C, D) La angiogénesis estimulada Figure 16. Inhibitory effect of mAB (LM609) directed against αVβ3 on T4-stimulated angiogenesis in the CAM model. A) The samples were exposed to PBS, T4 (0.1 µM), or T4 plus 10 mg / ml of LM609 for 3 days. T4-stimulated angiogenesis was substantially inhibited by the addition of the LM609 monoclonal antibody directed against αVβ3. B) Tabulation of the mean ± SEM of the new branches formed from 65 existing blood vessels during the experimental period. Data were obtained from 3 separate experiments, each containing 9 samples in each treatment group. C, D) Stimulated angiogenesis

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Figura 17. Composiciones poliméricas de análogos de hormonas tiroideas -Conjugación polimérica Figure 17. Polymeric compositions of thyroid hormone analogs - Polymer conjugation

5 mediante un enlace éster utilizando alcohol polivinílico. En esta preparación se puede esterificar alcohol polivinílico comercialmente disponible (o los copolímeros relacionados) mediante tratamiento con el cloruro de ácido de análogos de hormonas tiroideas, concretamente la forma del cloruro de ácido. La sal de clorhidrato se neutralizó mediante la adición de trietilamina para dar como resultado clorhidrato de trietilamina que se puede eliminar por lavado con agua tras la precipitación de la forma de éster polimérico de la hormona tiroidea de diferentes análogos. El enlace éster con el polímero puede experimentar hidrólisis in vivo para liberar el análogo activo de la hormona tiroidea pro-angiogénesis. 5 via an ester link using polyvinyl alcohol. In this preparation commercially available polyvinyl alcohol (or related copolymers) can be esterified by treatment with the acid chloride of thyroid hormone analogues, namely the form of the acid chloride. The hydrochloride salt was neutralized by the addition of triethylamine to result in triethylamine hydrochloride which can be removed by washing with water after precipitation of the polymeric ester form of the thyroid hormone of different analogs. The ester bond with the polymer may undergo hydrolysis in vivo to release the active analog of the pro-angiogenesis thyroid hormone.

Figura 18. Composiciones poliméricas de análogos de hormonas tiroideas -Conjugación polimérica mediante un enlace anhídrido utilizando copolímero de ácido acrílico etileno. Esto es similar a la conjugación Figure 18. Polymeric compositions of thyroid hormone analogs - Polymeric conjugation by an anhydride bond using ethylene acrylic acid copolymer. This is similar to conjugation.

15 covalente de polímero previa, sin embargo, esta vez se realiza a través de un enlace anhídrido que se deriva de la reacción de un copolímero de ácido acrílico. Este enlace anhídrido es también susceptible a hidrólisis in vivo para liberar el análogo de la hormona tiroidea. La neutralización del ácido clorhídrico se consigue mediante tratamiento con trietilamina y el posterior lavado del polímero polianhídrido precipitado con agua elimina el subproducto del clorhidrato de trietilamina. Esta reacción conducirá a la formación de un copolímero de ácido acrílico de la hormona tiroidea + trietilamina. Tras la hidrólisis in vivo, el análogo de la hormona tiroidea se liberará en el tiempo que se puede controlar más un copolímero de ácido acrílico etileno. The previous polymer covalent, however, this time is done through an anhydride bond that is derived from the reaction of an acrylic acid copolymer. This anhydride bond is also susceptible to hydrolysis in vivo to release the thyroid hormone analog. The neutralization of hydrochloric acid is achieved by treatment with triethylamine and subsequent washing of the precipitated polyanhydride polymer with water eliminates the by-product of triethylamine hydrochloride. This reaction will lead to the formation of a copolymer of acrylic acid of the thyroid hormone + triethylamine. After in vivo hydrolysis, the thyroid hormone analog will be released in time that a copolymer of ethylene acrylic acid can be controlled further.

Figura 19. Composiciones poliméricas de análogos de hormonas tiroideas -Atrapamiento en un polímero de ácido poliláctico. Figure 19. Polymeric compositions of thyroid hormone analogues - Trapping in a polylactic acid polymer.

25 Los polímeros de poliéster de ácido poliláctico (PLA) experimentan hidrólisis in vivo del monómero de ácido láctico y esto se ha aprovechado como vehículo para sistemas de administración de fármacos en seres humanos. A diferencia de los dos métodos covalentes anteriores en los que el análogo de la hormona tiroidea está unido mediante un enlace químico al polímero, este sería un método no covalente que encapsularía el análogo de hormona tiroidea en perlas de polímero PLA. Esta reacción conducirá a la formación del análogo de la hormona tiroidea que contiene perlas de PLA en agua. El filtro y el lavado darán como resultado la formación del análogo de la hormona tiroidea que contiene perlas de PLA, que tras hidrólisis in vivo conducirá a la generación de niveles controlados de hormona tiroidea más ácido láctico. 25 Polylactic acid polyester (PLA) polymers undergo in vivo hydrolysis of the lactic acid monomer and this has been used as a vehicle for drug delivery systems in humans. Unlike the two previous covalent methods in which the thyroid hormone analog is bound by a chemical bond to the polymer, this would be a non-covalent method that would encapsulate the thyroid hormone analog in PLA polymer beads. This reaction will lead to the formation of the thyroid hormone analog that contains PLA beads in water. The filter and washing will result in the formation of the thyroid hormone analogue containing PLA beads, which after hydrolysis in vivo will lead to the generation of controlled levels of thyroid hormone plus lactic acid.

Figura 20. Análogos de hormonas tiroideas que se pueden conjugar con diversos polímeros. A-D muestra Figure 20. Thyroid hormone analogs that can be conjugated with various polymers. A-D shows

35 las sustituciones requeridas para conseguir diversos análogos de hormonas tiroideas que se pueden conjugar para crear formas poliméricas de análogos de hormonas tiroideas de la invención. The substitutions required to achieve various thyroid hormone analogs that can be conjugated to create polymeric forms of thyroid hormone analogs of the invention.

Figura 21. Ensayo de angiogénesis tridimensional in vitro La Fig. 21 es un protocolo y una ilustración del ensayo de formación de brotes tridimensional in vitro para las perlas revestidas de fibrina en el endotelio microvascular humano. Figure 21. In vitro three-dimensional angiogenesis test Fig. 21 is a protocol and an illustration of the in vitro three-dimensional outbreak assay for fibrin-coated beads in the human microvascular endothelium.

Figura 22. Angiogénesis de la formación de brotes in vitro de HOMEC en la fibrina 3-D. La Fig. 22 es una ilustración de la formación de brotes en células endoteliales microvasculares humanas en tres dimensiones con diferentes aumentos Figure 22. Angiogenesis of in vitro outbreak formation of HOMEC in 3-D fibrin. Fig. 22 is an illustration of the formation of outbreaks in human microvascular endothelial cells in three dimensions with different magnifications

45 Figuras 23A-E. Liberación de plaquetas derivadas de factores de cicatrización de heridas en presencia de un bajo nivel de colágeno 45 Figures 23A-E. Release of platelets derived from wound healing factors in the presence of a low level of collagen

Figuras 24A-B. T4 y T3 no marcadas desplazan [125I]-T4 de la integrina purificada. T4 (10-11 M a 10-4 M) o T3 no marcadas (10-8 a 10-4 M) se añadieron a la integrina αVβ3 purificada (2 µg/muestra) antes de la adición de [125I]-T4. Figures 24A-B Unlabeled T4 and T3 displace [125I] -T4 from purified integrin. T4 (10-11 M at 10-4 M) or unlabeled T3 (10-8 at 10-4 M) were added to the purified αVβ3 integrin (2 µg / sample) before the addition of [125I] -T4.

(a) La unión de [125I]-T4 a la αVβ3 purificada no se vio afectada por la T4 no marcada en el intervalo de 10-11 M a 10-7 (a) The binding of [125I] -T4 to the purified αVβ3 was not affected by unlabeled T4 in the range of 10-11 M to 10-7

M, sino que se desplazó de una manera dependiente de la concentración por la T4 no marcada a M, but instead moved in a concentration-dependent manner by unmarked T4 to

concentraciones ≥ 10-6 M. T3 fue menos eficaz al desplazar la unión de T4 a αVβ3. (b) La presentación gráfica de concentrations ≥ 10-6 M. T3 was less effective in shifting the binding of T4 to αVβ3. (b) The graphic presentation of

los datos de T4 y T3 muestra el promedio ± S.D. de 3 experimentos independientes. The data of T4 and T3 shows the average ± S.D. of 3 independent experiments.

55 Figuras 25A-B. Tetrac y un péptido que contiene RGD, pero no un péptido que contiene RGE, desplazan la unión de T4 a la αVβ3 purificada. (a) La preincubación de la αVβ3 purificada con tetrac o un péptido que contiene RGD redujo la interacción entre la integrina e [125I]-T4 de una manera dependiente de la dosis. La aplicación de 10-5 M y 10-4 M del péptido RGE, como controles para el péptido RGD, no disminuye la unión de T4 marcada a la αVβ3 purificada. (b) La presentación gráfica de los datos de tetrac y RGD indica el promedio de ± S.D. de los resultados de 3 experimentos independientes. 55 Figures 25A-B. Tetrac and a peptide containing RGD, but not a peptide containing RGE, displace the binding of T4 to purified αVβ3. (a) Preincubation of purified αVβ3 with tetrac or a RGD-containing peptide reduced the interaction between integrin and [125I] -T4 in a dose-dependent manner. The application of 10-5 M and 10-4 M of the RGE peptide, as controls for the RGD peptide, does not decrease the binding of labeled T4 to the purified αVβ3. (b) The graphical presentation of the tetrac and RGD data indicates the average of ± S.D. of the results of 3 independent experiments.

Figuras 26A-B. Los anticuerpos de la integrina inhiben la unión de T4 a αVβ3. Los anticuerpos LM609 y SC7312 se añadieron a αVβ3 a las concentraciones indicadas (µg/ml) 30 min antes de la adición de [125I]-T4. Se alcanzó la 65 inhibición máxima de la unión de T4 a la integrina cuando la concentración de LM609 fue de 2 µg/ml y se mantuvo con concentraciones de anticuerpo tan elevadas como 8 µg/ml. SC7312 redujo la unión de T4 a αVβ3 enun 46 % Figures 26A-B The integrin antibodies inhibit the binding of T4 to αVβ3. The LM609 and SC7312 antibodies were added to αVβ3 at the indicated concentrations (µg / ml) 30 min before the addition of [125I] -T4. Maximum inhibition of T4 binding to integrin was reached when the concentration of LM609 was 2 µg / ml and was maintained with antibody concentrations as high as 8 µg / ml. SC7312 reduced the binding of T4 to αVβ3 by 46%

5 5

15 fifteen

25 25

35 35

45 Four. Five

55 55

65 65

E05796606 E05796606

17-04-2015 04-17-2015

a 2 µg/ml de anticuerpo/muestra y en un 58 % cuando estuvieron presentes 8 µg/ml de anticuerpo. Como control para la especificidad del anticuerpo, se añadieron 10 µg/ml de mAb dirigido contra αVβ3 (P1F6) y 10 µg/ml de IgG de ratón a αVβ3 antes de la incubación con T4. La gráfica muestra el promedio ± S.D. de los datos de 3 experimentos independientes. at 2 µg / ml antibody / sample and in 58% when 8 µg / ml antibody was present. As a control for antibody specificity, 10 µg / ml of mAb directed against αVβ3 (P1F6) and 10 µg / ml of mouse IgG were added to αVβ3 before incubation with T4. The graph shows the average ± S.D. of data from 3 independent experiments.

Figuras 27A-B. Efecto de los péptidos RGD y RGE, tetrac, y el mAb LM609 sobre la activación de T4 inducida por MAPK. (a) La acumulación nuclear de pERK1/2 disminuyó en muestras tratadas con 10-6 M o más del péptido RGD, pero no se alteró significativamente en muestras tratadas con hasta 10-4 M de RGE. La acumulación de pERK1/2 en células CV-1 tratadas con 10-5 M de tetrac y T4 fue similar a los niveles observados en las muestras del control sin tratar. LM609, un anticuerpo monoclonal dirigido contra αVβ3, disminuyó la acumulación de MAPK activado en el núcleo cuando se aplicó a cultivos de CV-1 a una concentración de 1 µg/ml. (b) La gráfica muestra el promedio ± S.D. de los datos de 3 experimentos independientes. Se incluyeron inmunotransferencias con anticuerpos dirigidos contra la α-tubulina como controles de carga de geles. Figures 27A-B Effect of the RGD and RGE peptides, tetrac, and the LM609 mAb on T4 activation induced by MAPK. (a) The nuclear accumulation of pERK1 / 2 decreased in samples treated with 10-6 M or more of the RGD peptide, but did not significantly alter in samples treated with up to 10-4 M of RGE. The accumulation of pERK1 / 2 in CV-1 cells treated with 10-5 M of tetrac and T4 was similar to the levels observed in the untreated control samples. LM609, a monoclonal antibody directed against αVβ3, decreased the accumulation of activated MAPK in the nucleus when applied to CV-1 cultures at a concentration of 1 µg / ml. (b) The graph shows the average ± S.D. of data from 3 independent experiments. Immunoblotting with antibodies directed against α-tubulin were included as gel loading controls.

Figuras 28A-B. Efectos del ARNip para αV y β3 sobre la activación de MAPK inducida por T4. Se transfectaron células CV-1 con ARNip (concentración final 100 nM) de αV, β3, o αV y β3 juntos. Dos días después de la transfección, las células se trataron con T4 10-7 M o el vehículo del control durante 30 min. (a) Se realizó la RT-PCR con ARN aislado de cada grupo de transfección para verificar la especificidad y la funcionalidad de cada ARNip. (b) Se aislaron las proteínas nucleares de cada conjunto de células transfectadas, se sometieron a SDS-PAGE, y se sondearon para determinar pERK1/2 en presencia o ausencia de tratamiento con T4. En las células precursoras y en las tratadas con ARNip codificado, fue evidente la acumulación nuclear de pERK1/2 con T4. Las células tratadas con ARNip para αV o β3 mostraron un aumento de pERK1/2 en ausencia de T4, y una disminución con el tratamiento de T4. Las células que contenían los ARNip de αV y β3 no responden al tratamiento de T4. Figures 28A-B Effects of siRNA for αV and β3 on T4-induced MAPK activation. CV-1 cells were transfected with siRNA (final 100 nM concentration) of αV, β3, or αV and β3 together. Two days after transfection, the cells were treated with 10-7 M T4 or the control vehicle for 30 min. (a) RT-PCR was performed with RNA isolated from each transfection group to verify the specificity and functionality of each siRNA. (b) Nuclear proteins were isolated from each set of transfected cells, subjected to SDS-PAGE, and probed to determine pERK1 / 2 in the presence or absence of T4 treatment. In precursor cells and those treated with encoded siRNA, nuclear accumulation of pERK1 / 2 with T4 was evident. Cells treated with siRNA for αV or β3 showed an increase of pERK1 / 2 in the absence of T4, and a decrease with the treatment of T4. Cells containing αV and β3 siRNAs do not respond to T4 treatment.

Figuras 29A-B. Efecto inhibidor del mAb (LM609) dirigido contra αVβ3 sobre la angiogénesis estimulada por T4-en el modelo CAM. Se expusieron las CAM a discos con filtro tratados con PBS, T4 (10-7 M), o T4 más 10 µg/ml de LM609 durante 3 días. (a) La angiogénesis estimulada por T4 quedó sustancialmente inhibida por la adición del anticuerpo monoclonal LM609 dirigido contra αVβ3. (b) Se muestra la tabulación del promedio ± SEM de las nuevas ramificaciones formadas a partir de vasos sanguíneos existentes durante el periodo experimental. ***P<0,001, comparando los resultados de las muestras tratadas con T4/LM609 con las muestras tratadas con T4 en 3 experimentos separados, que contenían cada uno 9 imágenes en cada grupo de tratamiento. Se realizó el análisis estadístico mediante ANOVA monolateral. Figures 29A-B Inhibitory effect of mAb (LM609) directed against αVβ3 on T4-stimulated angiogenesis in the CAM model. CAMs were exposed to filter discs treated with PBS, T4 (10-7 M), or T4 plus 10 µg / ml of LM609 for 3 days. (a) T4-stimulated angiogenesis was substantially inhibited by the addition of the LM609 monoclonal antibody directed against αVβ3. (b) The tabulation of the mean ± SEM of the new branches formed from existing blood vessels during the experimental period is shown. *** P <0.001, comparing the results of the samples treated with T4 / LM609 with the samples treated with T4 in 3 separate experiments, each containing 9 images in each treatment group. Statistical analysis was performed using monolateral ANOVA.

Descripción detallada de la invención Detailed description of the invention

Las características y otros detalles de la invención se describirán ahora más particularmente con referencia a los dibujos que la acompañan, y como se apunta en las reivindicaciones. Por conveniencia, se recogen aquí determinados términos utilizados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones. Salvo que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente una persona normalmente experta en la materia a la que pertenece la presente invención. The features and other details of the invention will now be described more particularly with reference to the accompanying drawings, and as noted in the claims. For convenience, certain terms used in the specification, examples and claims are collected here. Unless otherwise defined, all the technical and scientific terms used in this document have the same meaning as that usually understood by a person normally skilled in the art to which the present invention belongs.

Tal como se usa en el presente documento, el término "agente angiogénico" incluye cualquier compuesto o sustancia que promueve o estimula la angiogénesis, en solitario o junto con otra sustancia. Los ejemplos incluyen T3, T4, T3 o T4-agarosa, análogos poliméricos de T3, T4, ácido 3,5-dimetil-4-(4’-hidroxi-3’-isopropilbencil)-fenoxi acético (GC-1), o DITPA. Por el contrario, los términos "agente anti-angiogénesis" o "agente anti-angiogénico" se refieren a cualquier compuesto o sustancia que inhibe o perjudica la angiogénesis, en solitario o junto con otra sustancia. Los ejemplos incluyen TETRAC, TRIAC, XT 199, y el mAb LM609. As used herein, the term "angiogenic agent" includes any compound or substance that promotes or stimulates angiogenesis, alone or together with another substance. Examples include T3, T4, T3 or T4-agarose, polymeric analogs of T3, T4, 3,5-dimethyl-4- (4'-hydroxy-3'-isopropylbenzyl) -phenoxy acetic acid (GC-1), or DITPA By contrast, the terms "anti-angiogenesis agent" or "anti-angiogenic agent" refer to any compound or substance that inhibits or damages angiogenesis, alone or together with another substance. Examples include TETRAC, TRIAC, XT 199, and the LM609 mAb.

Tal como se usa en el presente documento, el término "isquemia de miocardio" se define como un suministro de sangre insuficiente al músculo cardiaco producido por una capacidad disminuida de los vasos sanguíneos. Tal como se usa en el presente documento, el término "enfermedad coronaria" se define como enfermedades/trastornos de la función cardiaca debidos a un desequilibrio entre la función del miocardio y la capacidad de loa vasos coronarios de suministrar suficiente flujo de sangre para la función normal. Las enfermedades/trastornos coronarios específicos asociados con la enfermedad coronaria que se pueden tratar con las composiciones y métodos descritos en el presente documento incluyen la isquemia de miocardio, angina de pecho, aneurisma coronario, trombosis coronaria, vasoespasmo coronario, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad cardiaca coronaria, oclusión coronaria y estenosis coronaria. As used herein, the term "myocardial ischemia" is defined as an insufficient blood supply to the heart muscle produced by a decreased capacity of blood vessels. As used herein, the term "coronary heart disease" is defined as diseases / disorders of cardiac function due to an imbalance between myocardial function and the ability of coronary vessels to provide sufficient blood flow for function. normal. Specific coronary diseases / disorders associated with coronary heart disease that can be treated with the compositions and methods described herein include myocardial ischemia, angina pectoris, coronary aneurysm, coronary thrombosis, coronary vasospasm, coronary artery disease, coronary heart disease, coronary occlusion and coronary stenosis.

Tal como se usa en el presente documento, "enfermedad vascular periférica oclusiva" (conocida también como trastorno oclusivo arterial periférico) es un bloqueo que implica un trastorno vascular en las arterias carótida o femoral, que incluyen la arteria ilíaca. El bloqueo en las arterias femorales produce dolor y movimiento restringido. Un trastorno específico asociado con enfermedad vascular periférica oclusiva es el pie diabético, que afecta a pacientes diabéticos, dando como resultado a menudo la amputación del pie. As used herein, "occlusive peripheral vascular disease" (also known as peripheral arterial occlusive disorder) is a blockage that involves a vascular disorder in the carotid or femoral arteries, including the iliac artery. The blockage in the femoral arteries produces pain and restricted movement. A specific disorder associated with occlusive peripheral vascular disease is the diabetic foot, which affects diabetic patients, often resulting in amputation of the foot.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "regeneración de los vasos sanguíneos", "angiogénesis", "revascularización" y "circulación colateral aumentada" (o las palabras que la afectan) se consideran como sinónimos. As used herein, the terms "blood vessel regeneration", "angiogenesis", "revascularization" and "increased collateral circulation" (or the words that affect it) are considered synonymous.

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El término "farmacéuticamente aceptable", cuando se refiere a sustancias naturales o sintéticas significa que la sustancia tiene un efecto tóxico aceptable a la vista de su efecto mucho más beneficioso, mientras que el término relacionado, "fisiológicamente aceptable" significa que la sustancia tiene una toxicidad relativamente baja. El término, "administrado simultáneamente" significa que se administran dos o más fármacos a un paciente en aproximadamente The term "pharmaceutically acceptable", when referring to natural or synthetic substances means that the substance has an acceptable toxic effect in view of its much more beneficial effect, while the related term, "physiologically acceptable" means that the substance has a relatively low toxicity. The term, "administered simultaneously" means that two or more drugs are administered to a patient in approximately

5 el mismo momento o en una estrecha secuencia con el fin de que sus efectos se desarrollen aproximadamente de forma simultánea o sustancialmente solapada. Este término incluye la administración de fármaco secuencial así como simultánea. 5 at the same time or in a narrow sequence so that its effects develop approximately simultaneously or substantially overlapping. This term includes sequential as well as simultaneous drug administration.

"Sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales farmacéuticamente aceptables de los análogos de hormonas tiroideas, las formas poliméricas, y los derivados, donde las sales se derivan de varios contraiones orgánicos e inorgánicos bien conocidos en la materia e incluyen, solamente a modo de ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, tetra-alquil amonio, y similares; y cuando la molécula contiene una funcionalidad básica, las sales de ácidos orgánicos o inorgánicos, tales como clorhidrato, bromhidrato, tartrato, mesilato, acetato, maleato, oxalato y similares se pueden usar como la sal farmacéuticamente aceptable. El término incluye también sales de adición de "Pharmaceutically acceptable salts" refers to the pharmaceutically acceptable salts of thyroid hormone analogs, polymeric forms, and derivatives, where salts are derived from various organic and inorganic counterions well known in the art and include, only by way of example, sodium, potassium, calcium, magnesium, ammonium, tetra-alkyl ammonium, and the like; and when the molecule contains basic functionality, salts of organic or inorganic acids, such as hydrochloride, hydrobromide, tartrate, mesylate, acetate, maleate, oxalate and the like can be used as the pharmaceutically acceptable salt. The term also includes addition salts of

15 ácido y base. 15 acid and base.

"Sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que retienen la eficacia y las propiedades biológicas de las bases libres, que no son biológicamente o de otro modo indeseables, y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido pirúvico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico, y similares. Las sales particularmente preferidas de los compuestos de la invención son las sales de monocloruro y las sales de dicloruro. "Pharmaceutically acceptable acid addition salt" refers to those salts that retain the efficacy and biological properties of free bases, which are not biologically or otherwise undesirable, and which are formed with inorganic acids, such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and the like, and organic acids, such as acetic acid, propionic acid, pyruvic acid, maleic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, Mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, salicylic acid, and the like. Particularly preferred salts of the compounds of the invention are monochloride salts and dichloride salts.

25 "Sal de adición de base farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que retienen la eficacia y las propiedades biológicas de los ácidos libres, que no son biológicamente o de otro modo indeseables. Estas sales se preparan a partir de la adición de una base inorgánica o de una base orgánica al ácido libre. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, cinc, aluminio y similares. Las sales inorgánicas preferidas son las sales de amonio, sodio, potasio, calcio, y magnesio. Las sales obtenidas a partir de bases orgánicas incluyen, pero no se limitan a, las sales de aminas primarias, secundarias, y terciarias, aminas sustituidas incluyendo aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, tales como isopropilamina, trietilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, "Pharmaceutically acceptable base addition salt" refers to those salts that retain the efficacy and biological properties of free acids, which are not biologically or otherwise undesirable. These salts are prepared from the addition of an inorganic base or an organic base to the free acid. Salts derived from inorganic bases include, but are not limited to, sodium, potassium, lithium, ammonium, calcium, magnesium, zinc, aluminum and the like salts. Preferred inorganic salts are the ammonium, sodium, potassium, calcium, and magnesium salts. Salts obtained from organic bases include, but are not limited to, the salts of primary, secondary, and tertiary amines, substituted amines including naturally occurring substituted amines, cyclic amines and basic ion exchange resins, such as isopropylamine, triethylamine , diethylamine, triethylamine, tripropylamine, ethanolamine, 2-dimethylaminoethanol, 2-diethylaminoethanol, trimethamine, dicyclohexylamine, lysine, arginine, histidine, caffeine, procaine, hydrabamine, choline, betaine, ethylenediamine, glucosamine, methylglucamine, pyrograzine, pyrograzine, piperine, purine ,

35 N-etilpiperidina, resinas de poliamina y similares. Las bases orgánicas particularmente preferidas son isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetilamina, diciclohexilamina, colina y cafeína. N-ethylpiperidine, polyamine resins and the like. Particularly preferred organic bases are isopropylamine, diethylamine, ethanolamine, trimethylamine, dicyclohexylamine, choline and caffeine.

"Ureido" se refiere a un radical de la fórmula --N(H)--C(O)--NH2. "Ureido" refers to a radical of the formula --N (H) - C (O) - NH2.

Se entiende a partir de las definiciones y ejemplos anteriores que en los radicales que contienen un grupo alquilo sustituido se puede producir cualquier sustitución de los anteriores en cualquier carbono del grupo alquilo. Los compuestos de la presente invención, o sus sales farmacéuticamente aceptables, pueden tener átomos de carbono asimétricos en su estructura. Los compuestos de la invención y sus sales farmacéuticamente aceptables pueden por tanto existir como enantiómeros individuales, diastereoisómeros, racematos, y mezclas de enantiómeros y It is understood from the definitions and examples above that in the radicals containing a substituted alkyl group any substitution of the above can occur in any carbon of the alkyl group. The compounds of the present invention, or their pharmaceutically acceptable salts, may have asymmetric carbon atoms in their structure. The compounds of the invention and their pharmaceutically acceptable salts may therefore exist as individual enantiomers, diastereoisomers, racemates, and mixtures of enantiomers and

45 diastereómeros. Está previsto que todos los mencionados enantiómeros individuales, diastereoisómeros, racematos y sus mezclas estén comprendidos en el alcance de la presente invención. Las configuraciones absolutas de determinados átomos de carbono en los compuestos, si se saben, están indicadas por el descriptor R o S absoluto adecuado. 45 diastereomers. It is intended that all said individual enantiomers, diastereoisomers, racemates and mixtures thereof are within the scope of the present invention. The absolute configurations of certain carbon atoms in the compounds, if known, are indicated by the appropriate absolute R or S descriptor.

Se pueden preparar enantiómeros independientes mediante el uso de materiales de partida y/o intermedios ópticamente activos o mediante el uso de técnicas de resolución convencionales, por ejemplo, resolución enzimática o HPLC quiral. Independent enantiomers can be prepared by using optically active starting and / or intermediate materials or by using conventional resolution techniques, for example, enzymatic resolution or chiral HPLC.

Tal como se usa en el presente documento, la frase "factores de crecimiento" o "factores de neurogénesis" se refiere a As used herein, the phrase "growth factors" or "neurogenesis factors" refers to

55 proteínas, péptidos u otras moléculas que tienen un crecimiento proliferativo diferenciado, o un efecto trófico sobre las células del SNC o del SNP. Dichos factores se pueden utilizar para inducir la proliferación o la diferenciación y pueden incluir, por ejemplo, cualquier factor trófico que permita proliferar a las células del SNC o del SNP, incluyendo cualquier molécula que se una a un receptor sobre la superficie de la célula para ejercer un efecto trófico, o inductor del crecimiento en la célula. Los factores preferidos incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento nervioso ("NGF"), factor de crecimiento epidérmico ("EGF"), factor de crecimiento derivado de plaquetas ("PDGF"), factor de crecimiento de tipo insulina ("IGF"), factor ácido de crecimiento de fibroblastos ("aFGF" o "FGF-1"), factor básico de crecimiento de fibroblastos ("bFGF" o "FGF-2"), y factor alfa y beta de crecimiento transformante ("TGF-α" y "TGF-β"). 55 proteins, peptides or other molecules that have a differentiated proliferative growth, or a trophic effect on the CNS or SNP cells. Such factors can be used to induce proliferation or differentiation and may include, for example, any trophic factor that allows CNS or SNP cells to proliferate, including any molecule that binds to a receptor on the cell surface to exert a trophic effect, or growth inducer in the cell. Preferred factors include, but are not limited to, nerve growth factor ("NGF"), epidermal growth factor ("EGF"), platelet-derived growth factor ("PDGF"), insulin-like growth factor ( "IGF"), acid fibroblast growth factor ("aFGF" or "FGF-1"), basic fibroblast growth factor ("bFGF" or "FGF-2"), and transforming growth alpha and beta factor ( "TGF-α" and "TGF-β").

"Sujeto" incluye organismos vivos tales como seres humanos, monos, vacas, ovejas, caballos, cerdos, ganado, "Subject" includes living organisms such as humans, monkeys, cows, sheep, horses, pigs, cattle,

65 cabras, perros, gatos, ratones, ratas, células cultivadas a partir de las anteriores, y sus especies transgénicas. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. Se puede realizar la administración de las composiciones de la presente invención a un sujeto que se va a tratar utilizando procedimientos conocidos, en las dosificaciones y durante periodos de tiempo eficaces para tratar la dolencia en el sujeto. Una cantidad eficaz del compuesto terapéutico necesaria para conseguir un efecto terapéutico puede variar de acuerdo con factores tales como la edad, sexo, y peso del sujeto, y la capacidad del compuesto terapéutico para tratar los anteriores agentes en el sujeto. Se pueden ajustar 65 goats, dogs, cats, mice, rats, cells grown from the above, and their transgenic species. In a preferred embodiment, the subject is a human being. Administration of the compositions of the present invention can be performed to a subject to be treated using known procedures, at dosages and for periods of time effective to treat the condition in the subject. An effective amount of the therapeutic compound necessary to achieve a therapeutic effect may vary according to factors such as age, sex, and weight of the subject, and the ability of the therapeutic compound to treat the above agents in the subject. Can be adjusted

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5 regímenes de dosificación para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, varias dosis divididas se pueden administrar diariamente, o la dosis se puede reducir proporcionalmente tal como indiquen las exigencias de la situación terapéutica. 5 dosage regimens to provide the optimal therapeutic response. For example, several divided doses may be administered daily, or the dose may be proportionally reduced as indicated by the requirements of the therapeutic situation.

"Administrar" incluye rutas de administración que permitan a las composiciones realizar su función prevista, por "Manage" includes administration routes that allow compositions to perform their intended function, by

10 ejemplo, promover la angiogénesis. Son posibles varias rutas de administración que incluyen, pero no están necesariamente limitadas a, (por ejemplo, inyección intravenosa, intraarterial, intramuscular, inyección subcutánea), oral (por ejemplo, alimenticia), vía tópica, nasal, rectal, o mediante microvehículos que se liberan lentamente dependiendo de la enfermedad o de la dolencia que se va a tratar. Se prefieren los modos de administración oral, parenteral e intravenosa. La formulación del compuesto que se va a administrar variará de acuerdo con la ruta de 10 example, promote angiogenesis. Several routes of administration are possible that include, but are not necessarily limited to, (for example, intravenous, intraarterial, intramuscular injection, subcutaneous injection), oral (eg, food), topical, nasal, rectal, or via microcarriers that They are released slowly depending on the disease or condition to be treated. Oral, parenteral and intravenous modes of administration are preferred. The formulation of the compound to be administered will vary according to the route of

15 administración seleccionada (por ejemplo, solución, emulsiones, geles, aerosoles, cápsula). Se puede preparar una composición adecuada que comprende el compuesto que se va a administrar en un vehículo o transportador fisiológicamente aceptable y auxiliares y conservantes opcionales. Para las soluciones o emulsiones, los vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas o alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados, agua estéril, cremas, pomadas, lociones, aceites, pastas y vehículos sólidos. Los 15 administration selected (eg, solution, emulsions, gels, aerosols, capsule). A suitable composition comprising the compound to be administered in a physiologically acceptable carrier or carrier and optional auxiliaries and preservatives can be prepared. For solutions or emulsions, suitable vehicles include, for example, aqueous or alcoholic / aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffered media, sterile water, creams, ointments, lotions, oils, pastes and solid vehicles. The

20 vehículos parenterales pueden incluir una solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, solución de Ringer lactada o aceites fijos. Los vehículos intravenosos pueden incluir diversos aditivos, conservantes, o fluidos, rellenadores de nutrientes o electrolitos (véase generalmente, Remington’s Pharmaceutical Science, 16ª edición, Mack, Ed. (1980)). 20 parenteral vehicles may include a solution of sodium chloride, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, lactated Ringer's solution or fixed oils. Intravenous vehicles may include various additives, preservatives, or fluids, nutrient or electrolyte fillers (see generally, Remington’s Pharmaceutical Science, 16th edition, Mack, Ed. (1980)).

25 "Cantidad eficaz" incluye aquellas cantidades de compuestos pro-angiogénicos o anti-angiogénicos que permiten realizar su función prevista, por ejemplo, promover o inhibir la angiogénesis en los trastornos relacionados con la angiogénesis que se describen en el presente documento. La cantidad eficaz dependerá de numerosos factores, incluyendo la actividad biológica, edad, peso corporal, sexo, estado de salud general, la gravedad de la dolencia que se va a tratar, así como las propiedades farmacocinéticas adecuadas. Por ejemplo, las dosificaciones de la sustancia "Effective amount" includes those amounts of pro-angiogenic or anti-angiogenic compounds that allow them to perform their intended function, for example, to promote or inhibit angiogenesis in the disorders related to angiogenesis described herein. The effective amount will depend on numerous factors, including biological activity, age, body weight, sex, general health, the severity of the condition to be treated, as well as the appropriate pharmacokinetic properties. For example, the dosages of the substance

30 activa pueden ser aproximadamente de 0,01 mg/kg/día a aproximadamente 500 mg/kg/día, ventajosamente de aproximadamente 0,1 mg/kg/día a aproximadamente 100 mg/kg/día. Se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la sustancia activa mediante una ruta adecuada en una única dosis o en múltiples dosis. Además, las dosificaciones de la sustancia activa pueden aumentarse o disminuirse proporcionalmente como se ha indicado por las exigencias de la situación terapéutica o profiláctica. 30 active may be from about 0.01 mg / kg / day to about 500 mg / kg / day, advantageously from about 0.1 mg / kg / day to about 100 mg / kg / day. A therapeutically effective amount of the active substance can be administered by a suitable route in a single dose or in multiple doses. In addition, the dosages of the active substance can be increased or decreased proportionally as indicated by the requirements of the therapeutic or prophylactic situation.

35 "Vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares que sean compatibles con la actividad del compuesto y sean fisiológicamente aceptables para el sujeto. Un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable es la solución salina normal tamponada (NaCl 0,15 M). El uso de dichos medios "Pharmaceutically acceptable carrier" includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and delayed absorption agents, and the like that are compatible with the activity of the compound and are physiologically acceptable to the subject . An example of a pharmaceutically acceptable carrier is buffered normal saline (0.15 M NaCl). The use of such means

40 y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la materia. Excepto en la medida que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto terapéutico, se contempla su uso en las composiciones adecuadas para la administración farmacéutica. Pueden incorporarse también compuestos activos suplementarios en las composiciones. 40 and agents for pharmaceutically active substances is well known in the art. Except to the extent that any conventional means or agent is incompatible with the therapeutic compound, its use in compositions suitable for pharmaceutical administration is contemplated. Supplementary active compounds may also be incorporated into the compositions.

45 Los "ingredientes adicionales" incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes. excipientes; agentes tensioactivos; agentes dispersantes; diluyentes inertes; agentes granulantes y desintegrantes; agentes aglutinantes; agentes lubricantes; agentes edulcorantes; agentes aromatizantes; agentes colorantes; conservantes; composiciones fisiológicamente degradables tales como gelatina; vehículos y disolventes acuosos; vehículos y disolventes oleosos; agentes suspensores; agentes dispersantes o humectantes; agentes emulsionantes, emolientes; tampones; sales; 45 "Additional ingredients" include, but are not limited to, one or more of the following. excipients; surfactants; dispersing agents; inert diluents; granulating and disintegrating agents; binding agents; lubricating agents; sweetening agents; flavoring agents; coloring agents; preservatives; physiologically degradable compositions such as gelatin; aqueous vehicles and solvents; oily vehicles and solvents; suspending agents; dispersing or wetting agents; emulsifying agents, emollients; buffers; you go out;

50 agentes espesantes; cargas; agentes emulsionantes; antioxidantes; antibióticos; agentes antifúngicos; agentes estabilizantes; y materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables. Se describen en la técnica otros "ingredientes adicionales" que se pueden incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención y se describen, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences. 50 thickening agents; charges; emulsifying agents; antioxidants; antibiotics; antifungal agents; stabilizing agents; and pharmaceutically acceptable polymeric or hydrophobic materials. Other "additional ingredients" that can be included in the pharmaceutical compositions of the invention are described in the art and are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences.

55 Composiciones 55 Compositions

Se describen en el presente documento agentes angiogénicos que comprenden hormonas tiroideas, sus análogos, y conjugaciones poliméricas de las hormonas y sus análogos. Se pueden usar las composiciones descritas para promover la angiogénesis para tratar trastornos donde la angiogénesis es beneficiosa. Adicionalmente, se puede usar Angiogenic agents comprising thyroid hormones, their analogues, and polymer conjugates of hormones and their analogs are described herein. The compositions described can be used to promote angiogenesis to treat disorders where angiogenesis is beneficial. Additionally, it can be used

60 la inhibición de estas hormonas tiroideas, los análogos y las conjugaciones poliméricas para inhibir la angiogénesis para tratar trastornos asociados con dicha angiogénesis no deseada. Tal como se usa en el presente documento, el término "agente angiogénico" incluye cualquier compuesto o sustancia que promueve o estimula la angiogénesis, en solitario o junto con otra sustancia. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, T3, T4, T3 o T4-agarosa, análogos poliméricos de T3, T4, ácido 3,5-dimetil-4-(4’-hidroxi-3’-isopropilbencil)-fenoxi acético (GC-1), o DITPA. 60 the inhibition of these thyroid hormones, analogs and polymer conjugates to inhibit angiogenesis to treat disorders associated with said unwanted angiogenesis. As used herein, the term "angiogenic agent" includes any compound or substance that promotes or stimulates angiogenesis, alone or together with another substance. Examples include, but are not limited to, T3, T4, T3 or T4-agarose, polymeric analogs of T3, T4, 3,5-dimethyl-4- (4'-hydroxy-3'-isopropylbenzyl) -phenoxy acetic acid (GC-1), or DITPA.

65 Se usan conjugaciones poliméricas para mejorar la viabilidad del fármaco. Aunque muchos agentes terapéuticos antiguos y modernos son bien tolerados, muchos compuestos necesitan tecnologías avanzadas de descubrimiento de fármacos para disminuir la toxicidad, aumentar el tiempo en circulación, o modificar la biodistribución. Una estrategia para mejorar la viabilidad del fármaco es la utilización de polímeros solubles en agua. Diversos polímeros solubles en 65 Polymeric conjugates are used to improve the viability of the drug. Although many ancient and modern therapeutic agents are well tolerated, many compounds need advanced drug discovery technologies to decrease toxicity, increase circulation time, or modify biodistribution. A strategy to improve the viability of the drug is the use of water soluble polymers. Various soluble polymers in

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5 agua han mostrado modificar la biodistribución, aumentar el modo de captación celular, cambiar la permeabilidad a través de barreras fisiológicas, y modificar la velocidad de aclaramiento a través del cuerpo. Para conseguir tanto un direccionamiento como un efecto de liberación sostenida, se han sintetizado polímeros solubles en agua que contienen restos de fármacos como grupos terminales, como parte de la estructura, o como grupos pendientes en la cadena polimérica. 5 water have been shown to modify biodistribution, increase the mode of cellular uptake, change permeability through physiological barriers, and modify the rate of clearance through the body. To achieve both an address and a sustained release effect, water soluble polymers containing drug residues have been synthesized as terminal groups, as part of the structure, or as pending groups in the polymer chain.

Las composiciones representativas de la presente divulgación incluyen hormonas tiroideas o sus análogos conjugados a polímeros. La conjugación con polímeros puede ser tanto con enlaces covalentes como no covalentes. Se puede producir la conjugación polimérica a través de un enlace éster o un enlace anhídrido. Se muestra un ejemplo de conjugación polimérica a través de un enlace éster utilizando alcohol polivinílico en la Figura 17. En esta preparación Representative compositions of the present disclosure include thyroid hormones or their polymer conjugated analogs. The conjugation with polymers can be with both covalent and non-covalent bonds. Polymer conjugation can occur through an ester bond or an anhydride bond. An example of polymer conjugation is shown through an ester link using polyvinyl alcohol in Figure 17. In this preparation

15 se puede esterificar alcohol polivinílico comercialmente disponible (o los copolímeros relacionados) mediante tratamiento con el cloruro de ácido de análogos de hormonas tiroideas, incluyendo la forma del cloruro de ácido. La sal de clorhidrato se neutralizó mediante la adición de trietilamina para dar como resultado clorhidrato de trietilamina que se puede eliminar por lavado con agua tras la precipitación de la forma de éster polimérico de la hormona tiroidea de diferentes análogos. El enlace éster con el polímero puede experimentar hidrólisis in vivo para liberar el análogo activo de la hormona tiroidea pro-angiogénesis. Commercially available polyvinyl alcohol (or related copolymers) can be esterified by treatment with the acid chloride of thyroid hormone analogs, including the form of the acid chloride. The hydrochloride salt was neutralized by the addition of triethylamine to result in triethylamine hydrochloride which can be removed by washing with water after precipitation of the polymeric ester form of the thyroid hormone of different analogs. The ester bond with the polymer may undergo hydrolysis in vivo to release the active analog of the pro-angiogenesis thyroid hormone.

Se muestra en la Figura 18 un ejemplo de conjugación polimérica a través de un enlace anhídrido utilizando copolímero de ácido acrílico etileno. Esto es similar a la conjugación covalente polimérica previa, sin embargo, esta vez se realiza a través de un enlace anhídrido que se deriva de la reacción de un copolímero de ácido acrílico. Este An example of polymer conjugation through an anhydride bond using ethylene acrylic acid copolymer is shown in Figure 18. This is similar to the previous polymeric covalent conjugation, however, this time it is done through an anhydride bond that is derived from the reaction of an acrylic acid copolymer. This

25 enlace anhídrido es también susceptible a hidrólisis in vivo para liberar el análogo de la hormona tiroidea. La neutralización del ácido clorhídrico se consigue mediante tratamiento con trietilamina y el posterior lavado del polímero polianhídrido precipitado con agua elimina el subproducto del clorhidrato de trietilamina. Esta reacción conducirá a la formación de un copolímero de ácido acrílico de la hormona tiroidea + trietilamina. Tras la hidrólisis in vivo, el análogo de la hormona tiroidea se liberará en el tiempo que se puede controlar más un copolímero de ácido acrílico etileno. Anhydride bonding is also susceptible to hydrolysis in vivo to release the analog of thyroid hormone. The neutralization of hydrochloric acid is achieved by treatment with triethylamine and subsequent washing of the precipitated polyanhydride polymer with water eliminates the by-product of triethylamine hydrochloride. This reaction will lead to the formation of a copolymer of acrylic acid of the thyroid hormone + triethylamine. After in vivo hydrolysis, the thyroid hormone analog will be released in time that a copolymer of ethylene acrylic acid can be controlled further.

Otra conjugación polimérica representativa incluye la hormona tiroidea o sus análogos conjugados a polietilenglicol (PEG). La unión de PEG a diversos fármacos, proteínas y liposomas ha mostrado mejorar el tiempo de residencia y disminuir la toxicidad. PEG puede acoplarse a los principios activos a través de grupos hidroxilo en los extremos de las cadenas y mediante otros métodos químicos. Peg por sí mismo, sin embargo, se limita a dos agentes activos por Another representative polymer conjugation includes thyroid hormone or its conjugated analogs to polyethylene glycol (PEG). The binding of PEG to various drugs, proteins and liposomes has been shown to improve residence time and decrease toxicity. PEG can be coupled to the active ingredients through hydroxyl groups at the ends of the chains and by other chemical methods. Peg by itself, however, is limited to two active agents per

35 molécula. En una solución diferente, se exploraron los copolímeros de PEG y los aminoácidos como novedosos biomateriales que retenían las propiedades de biocompatibilidad de PEG, pero que tendrían la ventaja añadida de numerosos puntos de unión por molécula y que podrían diseñarse sintéticamente para adaptarse a varias aplicaciones. 35 molecule In a different solution, PEG copolymers and amino acids were explored as novel biomaterials that retained the biocompatibility properties of PEG, but would have the added advantage of numerous binding points per molecule and could be synthetically designed to adapt to various applications.

Otra conjugación polimérica representativa incluye hormonas tiroideas o sus análogos en conjugación no covalente con polímeros. Esto se muestra en detalle en la Figura 19. Una conjugación no covalente preferida es un atrapamiento de la hormona tiroidea o sus análogos en un polímero de ácido poliláctico. Los polímeros de poliéster de ácido poliláctico (PLA) experimentan hidrólisis in vivo del monómero de ácido láctico y esto se ha aprovechado como vehículo para sistemas de administración de fármacos en seres humanos. A diferencia de los dos métodos covalentes Another representative polymer conjugation includes thyroid hormones or their analogs in non-covalent conjugation with polymers. This is shown in detail in Figure 19. A preferred non-covalent conjugation is a trapping of the thyroid hormone or its analogs in a polylactic acid polymer. Polylactic acid polyester (PLA) polymers undergo in vivo hydrolysis of the lactic acid monomer and this has been used as a vehicle for drug delivery systems in humans. Unlike the two covalent methods

45 anteriores en los que el análogo de la hormona tiroidea está unido mediante un enlace químico al polímero, este sería un método no covalente que encapsularía el análogo de hormona tiroidea en perlas de polímero PLA. Esta reacción conducirá a la formación del análogo de la hormona tiroidea que contiene perlas de PLA en agua. El filtro y el lavado darán como resultado la formación del análogo de la hormona tiroidea que contiene perlas de PLA, que tras la hidrólisis in vivo conducirá a la generación de niveles controlados de hormona tiroidea más ácido láctico. In the above, in which the thyroid hormone analog is linked by a chemical bond to the polymer, this would be a non-covalent method that would encapsulate the thyroid hormone analog in PLA polymer beads. This reaction will lead to the formation of the thyroid hormone analog that contains PLA beads in water. The filter and washing will result in the formation of the thyroid hormone analogue containing PLA beads, which after in vivo hydrolysis will lead to the generation of controlled levels of thyroid hormone plus lactic acid.

Además, las composiciones de la presente divulgación incluyen análogos de hormonas tiroideas o sus análogos conjugados a retinoles (por ejemplo, ácido retinoico (es decir, vitamina A), que se une a la proteína de unión a la hormona tiroidea transtirretina ("TTR") y a la proteína de unión al ácido retinoico ("RBP"). Los análogos de hormonas tiroideas pueden conjugarse también con estilbesteroles halogenados, en solitario o junto con ácido retinoico, para uso In addition, the compositions of the present disclosure include analogs of thyroid hormones or their analogs conjugated to retinoles (eg, retinoic acid (ie, vitamin A), which binds to the thyroid hormone binding protein transthyretin ("TTR" ) and retinoic acid-binding protein ("RBP"). Thyroid hormone analogs can also be conjugated with halogenated stilbestols, alone or together with retinoic acid, for use.

55 en la detección y la supresión de la placa amiloide. Estos análogos combinan las propiedades ventajosas de T4-TTR, a saber, su rápida captación y retención prolongada en el cerebro y las placas amiloides, con las propiedades de los sustituyentes halógenos, que incluyen determinados isotipos útiles de halógenos para la obtención de imágenes de PET que incluye flúor-18, yodo-123, yodo-124, yodo-131, bromo-75, bromo-76, bromo-77 y bromo-82. 55 in the detection and suppression of amyloid plaque. These analogs combine the advantageous properties of T4-TTR, namely its rapid uptake and prolonged retention in the brain and amyloid plaques, with the properties of halogen substituents, which include certain useful halogen isotypes for PET imaging. which includes fluorine-18, iodine-123, iodine-124, iodine-131, bromine-75, bromine-76, bromine-77 and bromine-82.

Además, se puede usar nanotecnología para la creación de materiales y estructuras útiles dimensionadas a escala nanométrica. El inconveniente principal de las sustancias biológicamente activas es la fragilidad. Se pueden combinar materiales nanoescalados con dichas sustancias biológicamente activas para mejorar drásticamente la durabilidad de la sustancia, crear elevadas concentraciones localizadas de la sustancia y reducir costes minimizando las pérdidas. Por lo tanto, las conjugaciones poliméricas adicionales incluyen formulaciones de nanopartículas de hormonas 65 tiroideas y de sus análogos. Se pueden usar nanopolímeros y nanopartículas como matriz para la administración local de hormonas tiroideas y de sus análogos. Esto ayudará a la vez a la administración controlada en la diana celular y In addition, nanotechnology can be used for the creation of useful materials and structures sized on a nanometric scale. The main drawback of biologically active substances is fragility. Nanoscale materials can be combined with said biologically active substances to drastically improve the durability of the substance, create high localized concentrations of the substance and reduce costs by minimizing losses. Therefore, additional polymer conjugates include nanoparticle formulations of thyroid hormones and their analogs. Nanopolymers and nanoparticles can be used as the matrix for local administration of thyroid hormones and their analogs. This will help both the controlled administration on the cell target and

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tisular. tissue.

Las composiciones de la presente divulgación incluyen hormonas tiroideas, análogos, y derivados tanto solos como en conjugación covalente o no covalente con polímeros. En la Figura 20 se muestran ejemplos de análogos y derivados The compositions of the present disclosure include thyroid hormones, analogs, and derivatives both alone and in covalent or non-covalent conjugation with polymers. Examples of analogues and derivatives are shown in Figure 20

5 representativos, Tablas A-D. La Tabla A muestra T2, T3, T4, y bromoderivados. La Tabla B muestra modificaciones en la cadena secundaria de alanilo. La Tabla C muestra grupos hidroxi, enlaces de difenil éster, y configuraciones D. La Tabla D muestra análogos de tirosina. 5 representative, Tables A-D. Table A shows T2, T3, T4, and bromo derivatives. Table B shows modifications in the secondary alanyl chain. Table C shows hydroxy groups, diphenyl ester linkages, and D configurations. Table D shows tyrosine analogs.

Los términos "agente antiangiogénesis" o "agente anti-angiogénico" se refieren a cualquier compuesto o sustancia que The terms "anti-angiogenesis agent" or "anti-angiogenic agent" refer to any compound or substance that

10 inhibe o perjudica la angiogénesis, en solitario o junto con otra sustancia. Los ejemplos incluyen TETRAC, TRIAC, XT 199, y el mAb LM609. 10 inhibits or harms angiogenesis, alone or together with another substance. Examples include TETRAC, TRIAC, XT 199, and the LM609 mAb.

El papel de la hormona tiroidea, los análogos, y las conjugaciones poliméricas en la promoción de la angiogénesis The role of thyroid hormone, analogs, and polymer conjugates in the promotion of angiogenesis

15 El efecto proangiogénico de los análogos de las hormonas tiroideas o las formas poliméricas depende de un inicio no genómico, como se ensaya por la susceptibilidad del efecto hormonal sobre la reducción de la ruta de transducción de la señal de MAPK mediante inhibidores. Dichos resultados indican que otra consecuencia de la activación de MAPK por la hormona tiroidea es el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Esto último se inicia de forma no genómica, pero por supuesto, requiere un complejo programa de transcripción génica consecuente. Las concentraciones 15 The proangiogenic effect of analogs of thyroid hormones or polymeric forms depends on a non-genomic onset, as tested by the susceptibility of the hormonal effect on the reduction of the MAPK signal transduction pathway by inhibitors. These results indicate that another consequence of MAPK activation by thyroid hormone is the growth of new blood vessels. The latter begins non-genomically, but of course, it requires a complex program of consistent gene transcription. Concentrations

20 ambientales de la hormona tiroidea son relativamente estables. El modelo CAM, en el momento en que lo ensayaron los autores, era tiroprivador y, por tanto, se puede considerar como un sistema que no reproduce el organismo intacto. 20 environmental thyroid hormone are relatively stable. The CAM model, at the time the authors tested it, was a tyroprivator and, therefore, can be considered as a system that does not reproduce the intact organism.

La disponibilidad de un ensayo de una membrana corioalantoidea de pollo (CAM) para la angiogénesis ha proporcionado un modelo en el cual cuantificar la angiogénesis y estudiar los posibles mecanismos implicados en la 25 inducción por la hormona tiroidea del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. La presente solicitud describe un efecto proangiogénico de T4 que aproxima el modelo CAM de FGF2 y que puede potenciar la acción de dosis subóptimas de FGF2. Se describe además que el efecto proangiogénico de la hormona se inicia en la membrana plasmática y es dependiente de la activación por T4 de la ruta de transducción de la señal de MAPK. Como se ha proporcionado anteriormente, se describen métodos para el tratamiento de la enfermedad vascular periférica oclusiva 30 y las enfermedades coronarias, en particular, la oclusión de los vasos coronarios, y los trastornos asociados con la oclusión de la vasculatura periférica y/o los vasos sanguíneos coronarios. Se describen también composiciones y métodos para promover la angiogénesis y/o reclutar los vasos sanguíneos colaterales en un paciente que lo necesita. Las composiciones incluyen una cantidad eficaz de análogos de hormonas tiroideas, las formas poliméricas, y los derivados. Los métodos implican la administración simultánea de una cantidad eficaz de análogos de hormonas The availability of a chicken chorioallantoid membrane (CAM) assay for angiogenesis has provided a model in which to quantify angiogenesis and study the possible mechanisms involved in the induction by thyroid hormone of the growth of new blood vessels. The present application describes a proangiogenic effect of T4 that approximates the CAM model of FGF2 and that can enhance the action of suboptimal doses of FGF2. It is further described that the proangiogenic effect of the hormone begins in the plasma membrane and is dependent on the activation by T4 of the MAPK signal transduction path. As provided above, methods for the treatment of occlusive peripheral vascular disease 30 and coronary heart disease, in particular, occlusion of coronary vessels, and disorders associated with occlusion of the peripheral vasculature and / or vessels are described. coronary blood Compositions and methods for promoting angiogenesis and / or recruiting collateral blood vessels in a patient in need are also described. The compositions include an effective amount of thyroid hormone analogs, polymeric forms, and derivatives. The methods involve the simultaneous administration of an effective amount of hormone analogs.

35 tiroideas, las formas poliméricas, y derivados en dosificaciones diarias bajas, durante una semana o más con otros factores de crecimiento proangiogénicos normalizados, vasodilatadores, anticoagulantes, tratamientos trombolíticos u otros tratamientos vasculares relacionados. Thyroid, polymeric forms, and derivatives in low daily dosages, for a week or more with other normalized proangiogenic growth factors, vasodilators, anticoagulants, thrombolytic treatments or other related vascular treatments.

Se ha utilizado el ensayo CAM para validar la actividad angiogénica de varios factores de crecimiento que se cree que The CAM assay has been used to validate the angiogenic activity of several growth factors believed to be

40 promueven el crecimiento. Por ejemplo, se ha mostrado que T4 en concentraciones fisiológicas es proangiogénica en este modelo in vitro y en una base molar que tenga la actividad de FGF2. La presencia de PTU no reduce el efecto de T4, indicando que la desyodación de T4 para generar T3 no fue un prerrequisito en este modelo. En la Tabla 1 se relaciona un resumen de los efectos proangiogénicos de diversos análogos de hormonas tiroideas. 40 promote growth. For example, it has been shown that T4 in physiological concentrations is proangiogenic in this in vitro model and on a molar base that has the activity of FGF2. The presence of PTU does not reduce the effect of T4, indicating that the deiodination of T4 to generate T3 was not a prerequisite in this model. A summary of the proangiogenic effects of various thyroid hormone analogues is listed in Table 1.

45 Tabla 1. Efectos proangiogénicos de diversos análogos de hormonas tiroideas en el modelo CAM 45 Table 1. Proangiogenic effects of various thyroid hormone analogs in the CAM model

TRATAMIENTO TREATMENT

ÍNDICE DE ANGIOGÉNESIS ANGIOGENESIS INDEX

PBS (Control) PBS (Control)

89,4 ± 9,3 89.4 ± 9.3

DITPA (0,01 uM) DITPA (0.01 uM)

133,0 ± 11,6 133.0 ± 11.6

DITPA (0,1 uM) DITPA (0.1 uM)

167,3 ± 12,7 167.3 ± 12.7

DITPA (0,2 mM) DITPA (0.2 mM)

117,9 ± 5,6 117.9 ± 5.6

GC-1 (0,01 uM) GC-1 (0.01 uM)

169,6 ± 11,6 169.6 ± 11.6

GC-1 (0,1 uM) GC-1 (0.1 uM)

152,7 ± 9,0 152.7 ± 9.0

T4-agarosa (0,1 uM) T4-agarose (0.1 uM)

195,5 + 8,5 195.5 + 8.5

T4 (0,1 uM) T4 (0.1 uM)

143,8 ± 7,9 143.8 ± 7.9

FGF2 (1 ug) FGF2 (1 ug)

155 ± 9 155 ± 9

n = 8 por grupo n = 8 per group

La aparición de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en este modelo requiere varios días, indicando que el efecto de la hormona tiroidea fue completamente dependiente de la interacción del receptor nuclear para la hormona tiroidea (TR) con la hormona. Las acciones de las yodotironinas que requieren la complejación intranuclear de TR con su 50 ligando natural, T3, son, por definición, genómicas, y culminan en la expresión génica. Por otra parte, la respuesta preferente de este sistema modelo a T4 en lugar de a T3, el ligando natural de TR aumentó la posibilidad de que la angiogénesis se pueda iniciar no genómicamente en la membrana plasmática por T4 y culmina en los efectos que requiere la trascripción génica. Las acciones no genómicas de T4 se han descrito ampliamente, se suelen iniciar en la membrana plasmática y se pueden mediar mediante rutas de transducción de la señal. No necesitan el ligando intranuclear de yodotironina y TR, pero pueden intervenir o modular la transcripción génica. Las acciones no 5 genómicas de los esteroides también se han descrito correctamente, y se sabe que intervienen en las acciones genómicas de los esteroides o de otros compuestos. Los experimentos realizados con T4 y tetrac o con T4-agarosa indicaron que el efecto proangiogénico de T4 se inició a su vez muy probablemente en la membrana plasmática. Tetrac bloquea los efectos de T4 iniciados en la membrana, pero no activa por sí mismo la transducción de la señal. Por tanto, es una prueba de las acciones no genómicas de la hormona tiroidea. Se piensa que T4-agarosa no accede al interior de la célula y se ha utilizado para examinar modelos para las posibles acciones iniciadas en la superficie celular de la hormona. Las investigación de los efectos proangiogénicos de la hormona tiroidea en el modelo de membrana corioalantoidea de pollo ("CAM") demuestra que la generación de nuevos vasos sanguíneo a partir de los vasos existentes se promovió dos a tres veces tanto por la L-tiroxina (T4) como por la 3,5,3’-triyodo-L-tironina (T3) a 10-7 -10-9 The appearance of new blood vessel growth in this model requires several days, indicating that the effect of thyroid hormone was completely dependent on the interaction of the nuclear receptor for thyroid hormone (TR) with the hormone. The actions of iodothyronines that require intranuclear complexation of TR with its natural ligand, T3, are, by definition, genomic, and culminate in gene expression. On the other hand, the preferred response of this model system to T4 instead of T3, the natural TR ligand increased the possibility that angiogenesis can be initiated non-genomically on the plasma membrane by T4 and culminates in the effects required by the gene transcription. The non-genomic actions of T4 have been widely described, usually initiated in the plasma membrane and can be mediated by signal transduction pathways. They do not need the intranuclear ligand of iodothyronine and TR, but they can intervene or modulate gene transcription. The genomic actions of steroids have also been described correctly, and are known to be involved in the genomic actions of steroids or other compounds. Experiments performed with T4 and tetrac or with T4-agarose indicated that the proangiogenic effect of T4 in turn was most likely initiated in the plasma membrane. Tetrac blocks the effects of T4 initiated on the membrane, but does not activate the signal transduction by itself. Therefore, it is a proof of the non-genomic actions of thyroid hormone. It is thought that T4-agarose does not access the interior of the cell and has been used to examine models for possible actions initiated on the hormone's cell surface. Research into the proangiogenic effects of thyroid hormone in the chicken chorioallantoid membrane ("CAM") model demonstrates that the generation of new blood vessels from existing vessels was promoted two to three times by both L-thyroxine ( T4) as per 3,5,3'-triiodo-L-thyronine (T3) at 10-7-10-9

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M. de forma más interesante, T4-agarosa, un análogo de hormona tiroidea que no cruza la membrana celular, produjo 15 un potente efecto proangiogénico comparable al obtenido con T3 o T4. More interestingly, T4-agarose, a thyroid hormone analog that does not cross the cell membrane, produced a potent proangiogenic effect comparable to that obtained with T3 or T4.

En parte, esta divulgación proporciona composiciones y métodos para promover la angiogénesis en un sujeto que lo necesita. Las condiciones sensibles al tratamiento promoviendo la angiogénesis incluyen, por ejemplo, la enfermedad vascular periférica oclusiva y las enfermedades coronarias, en particular, la oclusión de los vasos coronarios, y los trastornos asociados con la oclusión de la vasculatura periférica y/o los vasos sanguíneos coronarios, disfunción eréctil, ictus, y heridas. Se describen también composiciones y métodos para promover la angiogénesis y/o reclutar los vasos sanguíneos colaterales en un paciente que lo necesita. Las composiciones incluyen una cantidad eficaz de formas poliméricas de análogos y derivados de las hormonas tiroideas y una cantidad eficaz de una adenosina y/o un donante de óxido nítrico. Las composiciones pueden estar en la forma de una formulación farmacéutica inyectable In part, this disclosure provides compositions and methods to promote angiogenesis in a subject in need. Conditions sensitive to treatment promoting angiogenesis include, for example, occlusive peripheral vascular disease and coronary heart disease, in particular, occlusion of coronary vessels, and disorders associated with occlusion of peripheral vasculature and / or blood vessels. coronary, erectile dysfunction, stroke, and wounds. Compositions and methods for promoting angiogenesis and / or recruiting collateral blood vessels in a patient in need are also described. The compositions include an effective amount of polymeric forms of analogs and derivatives of thyroid hormones and an effective amount of an adenosine and / or a nitric oxide donor. The compositions may be in the form of an injectable pharmaceutical formulation.

25 estéril que incluye una cantidad angiogénicamente eficaz de sustancias análogas de hormonas tiroideas y derivados de adenosina en un vehículo fisiológica y farmacéuticamente aceptable, opcionalmente con uno o más excipientes. Sterile including an angiogenically effective amount of analogous substances of thyroid hormones and adenosine derivatives in a physiologically and pharmaceutically acceptable carrier, optionally with one or more excipients.

Infarto de miocardio Myocardial infarction

Un motivo principal para la insuficiencia cardiaca tras infarto de miocardio agudo es una respuesta inadecuada de formación de nuevos vasos sanguíneos, es decir, angiogénesis. La hormona tiroidea y sus análogos son beneficiosos en la insuficiencia cardiaca y estimulan la angiogénesis coronaria. Los métodos descritos incluyen, en parte, administrar un único tratamiento de un análogo de hormona tiroidea en el momento del infarto tanto mediante inyección directa en el miocardio, como mediante simulación de la inyección coronaria mediante ligadura aórtica A major reason for heart failure after acute myocardial infarction is an inadequate response of formation of new blood vessels, that is, angiogenesis. Thyroid hormone and its analogues are beneficial in heart failure and stimulate coronary angiogenesis. The methods described include, in part, administering a single treatment of a thyroid hormone analogue at the time of the infarction both by direct injection into the myocardium, and by simulation of coronary injection by aortic ligation

35 intermitente para producir contracciones isovolúmicas transitorias para conseguir la angiogénesis y/o la remodelación ventricular. 35 intermittent to produce transient isovolumic contractions to achieve angiogenesis and / or ventricular remodeling.

Por consiguiente, se describen métodos para tratar la enfermedad vascular oclusiva, enfermedad coronaria, infarto de miocardio, isquemia, ictus, y/o los trastornos vasculares de la arteria periférica promoviendo la angiogénesis mediante la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad de una forma polimérica de la hormona tiroidea, o uno de sus análogos, eficaz para promover la angiogénesis. Therefore, methods for treating occlusive vascular disease, coronary heart disease, myocardial infarction, ischemia, stroke, and / or vascular disorders of the peripheral artery promoting angiogenesis by administration to a subject in need of an amount of a polymeric form of the thyroid hormone, or one of its analogs, effective in promoting angiogenesis.

Se proporcionan también en el presente documento ejemplos de formas poliméricas de análogos de hormonas tiroideas y pueden incluir triyodotironina (T3), levotiroxina (T4), (GC-1), o ácido 3,5-diyodotiropropiónico (DITPA) Examples of polymeric forms of thyroid hormone analogs are also provided herein and may include triiodothyronine (T3), levothyroxine (T4), (GC-1), or 3,5-diiodothyroropropic acid (DITPA)

45 conjugado con alcohol polivinílico, copolímero de ácido acrílico etileno, poli(ácido láctico), o agarosa. Conjugated with polyvinyl alcohol, copolymer of ethylene acrylic acid, poly (lactic acid), or agarose.

Los métodos implican también la administración simultánea de una cantidad eficaz de sustancia análoga a la hormona tiroidea y una cantidad eficaz de adenosina y/o de NO en dosificaciones diarias bajas, durante una semana o más. Uno The methods also involve the simultaneous administration of an effective amount of substance similar to thyroid hormone and an effective amount of adenosine and / or NO at low daily dosages, for a week or more. One

o ambos componentes se pueden administrar localmente mediante catéter. Los análogos de las hormonas tiroideas, y los derivados in vivo se pueden administrar a los lechos capilares que rodean el tejido isquémico mediante la incorporación de los compuestos en un liposoma o micropartícula dimensionado adecuadamente. Los análogos de las hormonas tiroideas, las formas poliméricas y los derivados se pueden dirigir al tejido isquémico mediante enlace covalente con un anticuerpo adecuado. or both components can be administered locally by catheter. Thyroid hormone analogues, and derivatives in vivo can be administered to the capillary beds surrounding the ischemic tissue by incorporating the compounds into a properly sized liposome or microparticle. Thyroid hormone analogs, polymeric forms and derivatives can be directed to ischemic tissue by covalently binding with a suitable antibody.

55 El método se puede usar como tratamiento para restaurar la función cardiaca tras un infarto de miocardio. El método se puede usar también para mejorar el flujo sanguíneo en pacientes con enfermedad de la arteria coronaria que padecen de isquemia de miocardio o de flujo sanguíneo inadecuado en áreas diferentes del corazón que incluyen, por ejemplo, enfermedad vascular periférica oclusiva (conocida también como enfermedad oclusiva arterial periférica), o disfunción eréctil. 55 The method can be used as a treatment to restore cardiac function after myocardial infarction. The method can also be used to improve blood flow in patients with coronary artery disease who suffer from myocardial ischemia or inadequate blood flow in different areas of the heart that include, for example, occlusive peripheral vascular disease (also known as disease peripheral arterial occlusive), or erectile dysfunction.

Cicatrización de heridas Wound healing

La angiogénesis de las heridas es una parte importante de la fase proliferativa de la cicatrización. La cicatrización de cualquier herida en la piel que no sea muy superficial no se puede producir sin angiogénesis. No solo debe repararse 65 toda la vasculatura dañada, sino que la mayor actividad celular local necesaria para la cicatrización requiere un suministro creciente de nutrientes procedente del torrente sanguíneo. Además, las células endoteliales que forman el Wound angiogenesis is an important part of the proliferative phase of healing. Healing of any skin wound that is not very superficial cannot occur without angiogenesis. Not only must the entire damaged vasculature be repaired, but the greater local cellular activity necessary for healing requires an increased supply of nutrients from the bloodstream. In addition, the endothelial cells that form the

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revestimiento de los vasos sanguíneos son importantes por sí mismas como organizadores y reguladores de la cicatrización. Lining of the blood vessels are important in themselves as organizers and regulators of healing.

Por tanto, la angiogénesis proporciona una nueva microcirculación para apoyar la cicatrización de heridas. Los nuevos Therefore, angiogenesis provides a new microcirculation to support wound healing. The new ones

5 vasos sanguíneos vuelven a ser clínicamente visibles en el espacio de la herida cuatro días después de la lesión. Las células endoteliales vasculares, fibroblastos, y las células del músculo liso proliferan en coordinación para apoyar la granulación de la herida. De manera simultánea, se produce la reepitelización para restablecer la cubierta epitelial. Las células epiteliales procedentes del margen de la herida o de los folículos pilosos profundos migran a través de la herida y se establecen por sí mismos sobre el tejido de la granulación y la matriz provisional. Los factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento de los queratinocitos (KFG) median en este proceso. Existen algunos modelos de epitelización (células deslizantes frente a células rodantes). 5 blood vessels are again clinically visible in the wound space four days after the injury. Vascular endothelial cells, fibroblasts, and smooth muscle cells proliferate in coordination to support wound granulation. Simultaneously, reepithelialization occurs to restore the epithelial lining. Epithelial cells from the margin of the wound or deep hair follicles migrate through the wound and establish themselves on the granulation tissue and the provisional matrix. Growth factors such as keratinocyte growth factor (KFG) mediate this process. There are some epithelialization models (sliding cells versus rolling cells).

A medida que las hormonas tiroideas regulan la tasa metabólica, cuando el metabolismo se ralentiza debido al hipotiroidismo, se ralentiza también la cicatrización de heridas. El papel de los análogos de hormonas tiroideas As thyroid hormones regulate the metabolic rate, when metabolism slows due to hypothyroidism, wound healing also slows down. The role of thyroid hormone analogues

15 tópicamente aplicados o las formas poliméricas en la cicatrización de heridas representa por tanto una estrategia novedosa para acelerar la cicatrización de heridas en diabéticos y en no diabéticos con capacidades de cicatrización de heridas aumentadas. La administración tópica puede ser en forma de una tirita. Adicionalmente, se pueden usar nanopolímeros y nanopartículas como una matriz para la administración local de hormonas tiroideas y de sus análogos. Esto ayudará a su vez a la administración controlada en la diana celular y tisular. 15 topically applied or polymeric forms in wound healing therefore represents a novel strategy to accelerate wound healing in diabetics and in non-diabetics with increased wound healing capabilities. Topical administration may be in the form of a band aid. Additionally, nanopolymers and nanoparticles can be used as a matrix for local administration of thyroid hormones and their analogs. This will in turn help the controlled administration in the cellular and tissue target.

Por consiguiente, se describen también métodos para tratar las heridas promoviendo la angiogénesis administrando a un sujeto que lo necesita una cantidad de una forma polimérica de hormona tiroidea, o uno de sus análogos, eficaz para promover la angiogénesis. Para los detalles, véanse los Ejemplos 9A y 9B. Therefore, methods for treating wounds promoting angiogenesis by administering to a subject in need thereof an amount of a polymeric form of thyroid hormone, or one of its analogs, effective to promote angiogenesis are also described. For details, see Examples 9A and 9B.

25 El papel de la hormona tiroidea, los análogos, y las conjugaciones poliméricas junto con los factores de crecimiento nervioso en la inducción y el mantenimiento de células neuronales 25 The role of thyroid hormone, analogs, and polymer conjugates together with nerve growth factors in induction and maintenance of neuronal cells

De forma contraria a la comprensión tradicional de la inducción neural, esta divulgación está parcialmente basada en el hallazgo inesperado de que los mecanismos que inician y mantienen la angiogénesis son eficaces promotores y sustentadores de la neurogénesis. Estos métodos y composiciones son útiles, por ejemplo, para el tratamiento de las lesiones de las neuronas motoras y neuropatías en traumatismos, lesiones y trastornos neuronales. Esta divulgación se refiere al uso de diversas estrategias proangiogénicas solas o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos. Los factores proangiogénicos incluyen análogos poliméricos de la hormona tiroidea como se ilustra en el presente documento. Los análogos poliméricos de hormonas tiroideas y sus conjugados poliméricos solos Contrary to the traditional understanding of neural induction, this disclosure is partially based on the unexpected finding that the mechanisms that initiate and maintain angiogenesis are effective promoters and supporters of neurogenesis. These methods and compositions are useful, for example, for the treatment of motor neuron lesions and neuropathies in trauma, injury and neuronal disorders. This disclosure refers to the use of various proangiogenic strategies alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors. Proangiogenic factors include polymeric analogs of thyroid hormone as illustrated herein. Polymeric analogs of thyroid hormones and their polymer conjugates alone

35 o junto con otros factores de crecimiento proangiogénicos conocidos en la materia y con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos se pueden combinar para una neurogénesis óptima. 35 or together with other proangiogenic growth factors known in the art and with nerve growth factors or other neurogenic factors can be combined for optimal neurogenesis.

Se describen métodos, composiciones y dispositivos de tratamiento terapéutico para mantener las rutas neurales en un mamífero, que incluyen potenciar la supervivencia de las neuronas en riesgo de muerte, inducir la reparación celular de las neuronas dañadas y de las rutas neurales, y estimular las neuronas para mantener su fenotipo diferenciado. Adicionalmente, una composición que contiene análogos poliméricos de hormonas tiroideas, y sus combinaciones, en presencia de agentes antioxidantes y/o antiinflamatorios demuestra la regeneración y la protección neuronal. Methods, compositions and therapeutic treatment devices for maintaining neural pathways in a mammal are described, including enhancing the survival of neurons at risk of death, inducing cell repair of damaged neurons and neural pathways, and stimulating neurons. to keep its phenotype differentiated. Additionally, a composition containing polymeric analogs of thyroid hormones, and their combinations, in the presence of antioxidant and / or anti-inflammatory agents demonstrates regeneration and neuronal protection.

45 Esta divulgación proporciona también hormonas tiroideas, análogos, y conjugaciones poliméricas, solas o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, para potenciar la supervivencia de las neuronas y mantener las rutas neurales. Tal como se describe en el presente documento, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos pueden potenciar la supervivencia de las neuronas, estimular la expresión neuronal de CAM, mantener la expresión fenotípica de las neuronas diferenciadas, inducir la rediferenciación de las células transformadas de origen neural, y estimular el crecimiento axonal sobre las ramificaciones en los procesos neurales, particularmente grandes huecos en los axones. Los morfógenos protegen también frente a la destrucción del tejido asociada con el daño al tejido nervioso inmunológicamente relacionado. Finalmente, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos se pueden usar como parte de un método para 45 This disclosure also provides thyroid hormones, analogs, and polymer conjugates, alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors, to enhance the survival of neurons and maintain neural pathways. As described herein, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors can enhance the survival of neurons, stimulate neuronal expression of CAM, maintain phenotypic expression of differentiated neurons. , induce the redifferentiation of transformed cells of neural origin, and stimulate axonal growth on the ramifications in neural processes, particularly large gaps in axons. Morphogens also protect against tissue destruction associated with damage to immunologically related nerve tissue. Finally, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors can be used as part of a method for

55 controlar la viabilidad del tejido nervioso en un mamífero. 55 control the viability of nerve tissue in a mammal.

Esta divulgación proporciona también efectos de hormonas tiroideas poliméricas en la formación de la sinapsis entre neuronas corticales cultivadas de rata, utilizando un sistema para estimar la formación funcional de sinapsis in vitro. La exposición a 10-9 M de hormonas tiroideas poliméricas, 3,5,3’-triyodotironina o tiroxina, produjo un aumento en la frecuencia de cambios oscilatorios síncronos espontáneos en la concentración de calcio intracelular, que se correlacionó con el número de sinapsis formadas. La detección mediante análisis inmunohistoquímico y de inmunotransferencia de la proteína sinapsina I asociada a vesículas sinápticas confirmó también que la exposición a la tiroxina facilitó la formación de sinapsis. La presencia de amiodarona, un inhibidor de la 5'-desyodinasa, o amitrol, un herbicida, inhibió la formación de sinapsis en presencia de tiroxina. Por tanto, la presente divulgación proporciona This disclosure also provides effects of polymeric thyroid hormones on synapse formation among cultured rat cortical neurons, using a system to estimate functional synapse formation in vitro. Exposure to 10-9 M of polymeric thyroid hormones, 3,5,3'-triiodothyronine or thyroxine, produced an increase in the frequency of spontaneous synchronous oscillatory changes in intracellular calcium concentration, which correlated with the number of synapses formed . Detection by immunohistochemical and immunoblot analysis of synapsin I protein associated with synaptic vesicles also confirmed that thyroxine exposure facilitated synapse formation. The presence of amiodarone, a 5'-deiodinase inhibitor, or amitrol, a herbicide, inhibited synapse formation in the presence of thyroxine. Therefore, the present disclosure provides

65 también un sistema de ensayo in vitro útil para el cribado de varios agentes químicos que pueden interferir con la formación de sinapsis en el desarrollo del SNC perturbando el sistema tiroideo polimérico. 65 also an in vitro test system useful for screening various chemical agents that can interfere with synapse formation in the development of the CNS by disrupting the polymeric thyroid system.

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De forma general, estos métodos pueden aplicarse al tratamiento de cualquier sujeto mamífero en riesgo o que padece una lesión o neuropatía del tejido neural. Esta divulgación es adecuada para el tratamiento de cualquier primate, preferentemente un primate superior tal como un ser humano. Además, sin embargo, puede emplearse en el tratamiento de mamíferos domesticados que se mantienen como animales de compañía de seres humanos (por 5 ejemplo, perros, gatos, caballos), que tienen un significativo valor comercial (por ejemplo, cabras, cerdos, ovejas, ganado, de competición o animales de tiro), que tienen un valor científico significativo (por ejemplo, especímenes libres In general, these methods can be applied to the treatment of any mammalian subject at risk or suffering from a neural tissue lesion or neuropathy. This disclosure is suitable for the treatment of any primate, preferably a superior primate such as a human being. In addition, however, it can be used in the treatment of domesticated mammals that remain as companion animals of humans (for example, dogs, cats, horses), which have significant commercial value (eg, goats, pigs, sheep , livestock, competition or draft animals), which have significant scientific value (for example, free specimens

o en cautividad de especies en peligro de extinción, o razas animales engendradas por endogamia o diseñadas mediante ingeniería genética), o que tienen valor de otra manera. or in captivity of endangered species, or animal breeds generated by inbreeding or engineered), or that are otherwise valuable.

Los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos descritos en el presente documento potencian la supervivencia celular, particularmente de las células neuronales en riesgo de muerte. Por ejemplo, las neuronas completamente diferenciadas son no mitóticas y mueren in vitro cuando se cultivan en condiciones normalizadas de cultivos de células de mamíferos, utilizando un medio químicamente definido o bajo en suero conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Charness, J. Biol. Chem. 26: 15 3164-3169 (1986) y Freese, et al., Brain Res. 521: 254-264 (1990). Sin embargo, si se trata un cultivo no mitótico de células neuronales con un análogo tiroideo polimérico solo o junto con un factor de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, la supervivencia de estas células se potencia significativamente. Por ejemplo, se preparó un cultivo primario de ganglios basales estriatales aislado a partir de la sustancia negra de cerebro adulto de rata utilizando procedimientos normalizados, por ejemplo, mediante disociación por trituración con pipeta pasteur de tejido de la sustancia negra, utilizando protocolos normalizados de cultivo de tejidos, y crecimiento en un medio con una concentración baja en suero, por ejemplo, conteniendo un 50 % de DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco), 50 % de medio F-12, suero de caballo inactivado térmicamente suplementado con penicilina/estreptomicina y 4 g/l de glucosa. En condiciones de cultivo normalizadas, estas células experimentan una muerte celular significativa en tres semanas cuando se cultivan en un medio exento de suero. La muerte celular se evidenció morfológicamente por la Polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors described herein enhance cell survival, particularly of neuronal cells at risk of death. For example, completely differentiated neurons are non-mitotic and die in vitro when grown under normalized conditions of mammalian cell cultures, using a chemically defined or low serum medium known in the art. See, for example, Charness, J. Biol. Chem. 26: 15 3164-3169 (1986) and Freese, et al., Brain Res. 521: 254-264 (1990). However, if a non-mitotic culture of neuronal cells is treated with a polymeric thyroid analogue alone or together with a nerve growth factor or other neurogenic factors, the survival of these cells is significantly enhanced. For example, a primary culture of striatal basal ganglia isolated from the black rat adult brain substance was prepared using standardized procedures, for example, by dissociation by crushing with pasteur pipette of black matter tissue, using standardized culture protocols of tissues, and growth in a medium with a low serum concentration, for example, containing 50% DMEM (Eagle medium modified by Dulbecco), 50% F-12 medium, heat inactivated horse serum supplemented with penicillin / streptomycin and 4 g / l glucose. Under normalized culture conditions, these cells experience significant cell death within three weeks when grown in a serum-free medium. Cell death was morphologically evidenced by the

25 incapacidad de las células de permanecer adherentes y por los cambios en sus características ultraestructurales, por ejemplo, mediante aglutinación de la cromatina y desintegración de los orgánulos. Específicamente, las células siguieron siendo adherentes y continuaron manteniendo la morfología de las neuronas viables diferenciadas. En ausencia de análogos tiroideos solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otro tratamiento de factores neurogénicos, la mayoría de las células cultivadas se disociaron y experimentaron necrosis celular. 25 inability of cells to remain adherent and due to changes in their ultrastructural characteristics, for example, by agglutination of chromatin and disintegration of organelles. Specifically, the cells remained adherent and continued to maintain the morphology of differentiated viable neurons. In the absence of thyroid analogues alone or together with nerve growth factors or other treatment of neurogenic factors, most cultured cells dissociated and experienced cell necrosis.

Las disfunciones en los ganglios basales de la sustancia negra se asocian con corea de Huntington y parkinsonismo in vivo. La capacidad de los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos definidos en el presente documento para potenciar la supervivencia de las neuronas indica que estos análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento Dysfunctions in the basal ganglia of the black substance are associated with Huntington's chorea and parkinsonism in vivo. The ability of polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors defined herein to enhance the survival of neurons indicates that these polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with growth factors

35 nervioso u otros factores neurogénicos serán útiles como parte de un tratamiento para potenciar la supervivencia de células neuronales en riesgo de muerte in vivo debido, por ejemplo, a una neuropatía o traumatismo químico o mecánico. Nerve or other neurogenic factors will be useful as part of a treatment to enhance the survival of neuronal cells at risk of death in vivo due, for example, to a chemical or mechanical neuropathy or trauma.

Esta divulgación proporciona además que estos análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos proporcionan un agente terapéutico útil para tratar las neuropatía que afectan a los ganglios basales estriatales, incluyendo la corea de Huntington y la enfermedad de Parkinson. Para las aplicaciones clínicas, se pueden administrar los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos This disclosure further provides that these polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors provide a useful therapeutic agent to treat neuropathy affecting striatal basal ganglia, including Huntington's chorea and Parkinson's disease. . For clinical applications, polymeric analogs of thyroid hormones can be administered alone

o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos o, como alternativa, se puede administrar or together with nerve growth factors or other neurogenic factors or, alternatively, it can be administered

un análogo polimérico de hormonas tiroideas solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otro agente 45 estimulador de factores neurogénicos. a polymeric analog of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factor stimulating agent.

Los compuestos de hormonas tiroideas descritos en el presente documento se pueden usar también para la protección de tejido nervioso a partir de trauma químico. La capacidad de los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos descritos en el presente documento para potenciar la supervivencia de las células neuronales y para inducir la agregación celular y la adhesión célula-célula en células rediferenciadas, indica que los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos serán útiles como agentes terapéuticos para mantener las rutas neurales protegiendo las células que definen la ruta del daño producido por trauma químico. En particular, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos The thyroid hormone compounds described herein can also be used for the protection of nerve tissue from chemical trauma. The ability of polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors described herein to enhance the survival of neuronal cells and to induce cell aggregation and cell-cell adhesion in redifferentiated cells, indicates that polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors will be useful as therapeutic agents to maintain the neural pathways protecting the cells that define the pathway from damage caused by chemical trauma. In particular, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors

55 pueden proteger neuronas, incluyendo neuronas en desarrollo, de los efectos de toxinas conocidas que inhiben la proliferación y la migración de neuronas e interfieren con la adhesión célula-célula. Los ejemplos de dichas toxinas incluyen etanol, una o más de las toxinas presentes en el humo de cigarrillos, y varios opiáceos. Los efectos tóxicos del etanol sobre las neuronas en desarrollo inducen el daño neurológico manifestado en el síndrome alcohólico fetal. Los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos pueden proteger las neuronas de los efectos citotóxicos asociados con los aminoácidos excitatorios tales como glutamato. 55 can protect neurons, including developing neurons, from the effects of known toxins that inhibit proliferation and migration of neurons and interfere with cell-cell adhesion. Examples of such toxins include ethanol, one or more of the toxins present in cigarette smoke, and several opiates. The toxic effects of ethanol on developing neurons induce neurological damage manifested in fetal alcohol syndrome. Polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors can protect neurons from the cytotoxic effects associated with excitatory amino acids such as glutamate.

Por ejemplo, el etanol inhibe los efectos de la adhesión célula-célula inducidos en células NG108-15 tratadas con los análogos poliméricos tiroideos solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos 65 cuando se proporcionan a estas células a una concentración de 25-50 mM. Se puede conseguir la inhibición máxima media con etanol 5-10 mM, la concentración de alcohol en sangre en un adulto tras la ingestión de una única bebida For example, ethanol inhibits the effects of cell-cell adhesion induced in NG108-15 cells treated with thyroid polymer analogs alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors 65 when given to these cells at a concentration of 25 -50 mM. The maximum average inhibition can be achieved with 5-10 mM ethanol, the concentration of blood alcohol in an adult after ingestion of a single beverage

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alcohólica. El etanol interfiere probablemente con la unión homofílica de las CAM entre células, más bien que su inducción, ya que los niveles de N-CAM inducidos por el análogo polimérico tiroideo solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos no se ven afectados por el etanol. Además, el efecto inhibidor es inversamente proporcional a un análogo polimérico tiroideo solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otra alcoholic Ethanol probably interferes with the homophilic union of CAMs between cells, rather than their induction, since N-CAM levels induced by the thyroid polymer analogue alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors are not affected. for ethanol In addition, the inhibitory effect is inversely proportional to a thyroid polymer analog alone or together with nerve or other growth factors.

5 concentración de factores neurogénicos. Por consiguiente, se cree que la administración de un análogo polimérico tiroideo solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos o análogos poliméricos tiroideo solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros agentes estimuladores de factores neurogénicos dirigidos a neuronas, particularmente neuronas en desarrollo, en riesgo de daño debido a exposición a toxinas tales como etanol, puede proteger estas células del daño a tejido nervioso superando los efectos inhibidores de la toxina. El análogo polimérico tiroideo solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos descritos en el presente documento es también útil en tratamientos para tratar las rutas neurales dañadas resultantes de una neuropatía inducida por exposición a estas toxinas. 5 concentration of neurogenic factors. Accordingly, it is believed that the administration of a thyroid polymer analog alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors or thyroid polymer analogs alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factor stimulating agents targeting neurons, particularly neurons In development, at risk of damage due to exposure to toxins such as ethanol, it can protect these cells from damage to nerve tissue by overcoming the toxin inhibitory effects. The thyroid polymer analogue alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors described herein is also useful in treatments to treat damaged neural pathways resulting from neuropathy induced by exposure to these toxins.

Las actividades in vivo de los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento In vivo activities of polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with growth factors

15 nervioso u otros factores neurogénicos descritos en el presente documento se evalúan también fácilmente en un modelo animal que se describe en el presente documento. Un animal adecuado, que presenta preferentemente daño en el tejido nervioso, por ejemplo, genética o ambientalmente inducido, recibe una inyección intracerebral con una cantidad eficaz de análogos poliméricos de la hormona tiroidea sola o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos en una formulación terapéutica adecuada, tal como suero salino tamponado con fosfato, pH 7. Los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso o factores neurogénicos se inyectan preferentemente en el área de las neuronas afectadas. El tejido afectado se corta en un punto temporal posterior y el tejido se evalúa morfológicamente y/o mediante evaluación de un marcador bioquímico adecuado (por ejemplo, mediante análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos o la localización de N-CAM; o midiendo el efecto dependiente de la Nervous or other neurogenic factors described herein are also easily evaluated in an animal model described herein. A suitable animal, which preferably exhibits damage to the nervous tissue, for example, genetically or environmentally induced, receives an intracerebral injection with an effective amount of polymeric analogs of the thyroid hormone alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors in one Suitable therapeutic formulation, such as phosphate buffered saline, pH 7. Polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or neurogenic factors are preferably injected into the area of the affected neurons. The affected tissue is cut at a posterior time point and the tissue is evaluated morphologically and / or by evaluation of a suitable biochemical marker (for example, by polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors or N-CAM location; or measuring the effect dependent on the

25 dosis en un marcador bioquímico de la actividad neurotrófica del SNC o del daño en el tejido del SNC, utilizando por ejemplo, proteína ácida fibrilar glial como marcador. La dosificación y el tiempo de incubación variarán con el animal que se va a ensayar. Se pueden determinar los intervalos de dosificación adecuados para diferentes especies mediante comparación con los modelos animales establecidos. Se presenta a continuación un protocolo ilustrativo para un modelo de incisión en cerebro de rata. 25 doses on a biochemical marker of CNS neurotrophic activity or CNS tissue damage, using, for example, glial fibrillar acid protein as a marker. The dosage and incubation time will vary with the animal to be tested. Suitable dosage ranges for different species can be determined by comparison with established animal models. An illustrative protocol for a rat brain incision model is presented below.

En resumen, se anestesiaron ratas Long Evans machos, obtenidas a partir de fuentes comerciales normalizadas, y se preparó el área de la cabeza para cirugía. Se expuso el cráneo utilizando procedimientos quirúrgicos normalizados y se trepanó un agujero hacia el centro de cada lóbulo utilizando un alambre de 0,035K, simplemente perforando el cráneo. Se proporcionaron a continuación soluciones de 25 ml que contenían tanto análogos poliméricos tiroideos In summary, male Long Evans rats were anesthetized, obtained from standardized commercial sources, and the head area was prepared for surgery. The skull was exposed using standard surgical procedures and a hole was climbed into the center of each lobe using a 0.035K wire, simply piercing the skull. 25 ml solutions containing both thyroid polymer analogs were then provided.

35 solos o junto con factores de crecimiento nervioso como otros factores neurogénicos (por ejemplo, OP-1,25 mg) o bien se proporcionó PBS a continuación a cada uno de los agujeros mediante una jeringuilla de Hamilton. Se administraron las soluciones a una profundidad de aproximadamente 3 mm por debajo de la superficie, en la corteza subyacente, el cuerpo calloso y el hipocampo. A continuación se suturó la piel y se dejó recuperar el animal. 35 alone or together with nerve growth factors such as other neurogenic factors (eg OP-1.25 mg) or PBS was then provided to each of the holes by a Hamilton syringe. The solutions were administered at a depth of approximately 3 mm below the surface, in the underlying cortex, the corpus callosum and the hippocampus. The skin was then sutured and the animal was allowed to recover.

Tres días después de la cirugía, se sacrificaron las ratas mediante decapitación y se procesaron los cerebros para el corte. Se evaluó la formación de tejido de cicatrización mediante tinción con inmunofluorescencia de la proteína ácida fibrilar glial, una proteína marcadora para la cicatrización glial, para determinar cualitativamente el grado de formación de cicatrices. Están comercialmente disponibles los anticuerpos dirigidos contra la proteína ácida fibrilar glial, por ejemplo, de Sigma Chemical Co., San Luis, Mo. Se sondearon también las secciones con anticuerpos dirigidos contra Three days after surgery, the rats were sacrificed by decapitation and the brains were processed for cutting. Healing tissue formation was assessed by immunofluorescence staining of glial fibrillary acidic protein, a marker protein for glial healing, to qualitatively determine the degree of scar formation. Antibodies directed against glial fibrillar acid protein are commercially available, for example, from Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. Sections were also probed with antibodies directed against

45 OP-1 para determinar la presencia de OP-1. Se anticiparon niveles reducidos de proteína ácida fibrilar glial en las secciones de tejido de animales tratados con el análogo polimérico tiroideo solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, evidenciando la capacidad de los análogos poliméricos tiroideos solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos para inhibir la formación de la cicatriz glial y estimular la regeneración nerviosa. 45 OP-1 to determine the presence of OP-1. Reduced levels of glial fibrillar acid protein were anticipated in tissue sections of animals treated with the thyroid polymer analogue alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors, evidencing the ability of the thyroid polymer analogs alone or together with growth factors nervous or other neurogenic factors to inhibit the formation of the glial scar and stimulate nerve regeneration.

El papel de los análogos de hormonas tiroideas y las conjugaciones poliméricas para el diagnóstico la obtención de imágenes del cerebro, diagnóstico, y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas The role of thyroid hormone analogues and polymer conjugates for the diagnosis of brain imaging, diagnosis, and treatment of neurodegenerative diseases

Esta divulgación se refiere a agentes farmacéuticos y radiofarmacéuticos útiles para el diagnóstico temprano, This disclosure refers to pharmaceutical and radiopharmaceutical agents useful for early diagnosis,

55 prevención, y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, tales como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer. Esta divulgación incluye también compuestos químicos novedosos que tienen unión específica en un sistema biológico y pueden utilizarse en tomografía de emisión de positrones (PET), métodos de obtención de imágenes diagnóstico por imágenes utilizando emisión de fotón único (SPECT), y métodos de obtención de imágenes mediante resonancia magnética (IRM). La capacidad de T4 y otros análogos de hormonas tiroideas de unirse a ligandos localizados en el interior del cuerpo hace posible utilizar dichos compuestos para la obtención de imágenes in situ de ligandos mediante PET, SPECT, IRM, y métodos similares de obtención de imágenes. En principio, no se tiene que saber nada acerca de la naturaleza del ligando, siempre que se produzca la unión, y dicha unión sea específica de un tipo de células, órganos, tejidos o receptores de interés. 55 prevention, and treatment of neurodegenerative diseases, such as, for example, Alzheimer's disease. This disclosure also includes novel chemical compounds that have specific binding in a biological system and can be used in positron emission tomography (PET), diagnostic imaging methods using single photon emission (SPECT), and methods of obtaining magnetic resonance imaging (MRI). The ability of T4 and other thyroid hormone analogs to bind ligands located inside the body makes it possible to use such compounds to obtain in situ images of ligands by PET, SPECT, MRI, and similar imaging methods. In principle, nothing has to be known about the nature of the ligand, provided that the binding occurs, and said binding is specific to a type of cells, organs, tissues or receptors of interest.

65 La obtención de imágenes mediante PET se lleva a cabo con la ayuda de compuestos trazadores marcados con isótopos emisores de positrones (Goodman, M. M. Clinical Positron Emission Tomography, Mosby Yearbook, 1992, K. 65 PET imaging is performed with the help of positron-emitting isotope-labeled tracer compounds (Goodman, M.M. Clinical Positron Emission Tomography, Mosby Yearbook, 1992, K.

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F. Hubner et al., Capítulo 14). Para la mayor parte de materiales biológicos, son pocos los isótopos adecuados. EL isótopo de carbono, 11C, se ha usado para PET, pero su corta vida media de 20,5 minutos limita su utilidad a compuestos que se pueden sintetizar y purificar rápidamente, y a instalaciones que están próximas a un ciclotrón en el que se genere el material de partida 11C precursor. Otros isótopos tienen incluso vidas medias más cortas. 13N tiene 5 una vida media 10 minutos y 15O tiene una vida media incluso más corta de 2 minutos. Las emisiones de ambos son más energéticas que las de 11C. Sin embargo, se han realizado estudios de PET con estos isótopos (Hubner, K. F., en Clinical Positron Emission Tomography, Mosby Year Book, 1992, K. F. Hubner, et al., Capítulo 2). Un isótopo más útil,18F, tiene una vida media de 110 minutos. Esto permite tiempo suficiente para su incorporación a un trazador radiomarcado, para la purificación y para la administración a un sujeto humano o animal. Además, instalaciones más alejadas de un ciclotrón, hasta aproximadamente un radio de 200 millas (320 km), pueden hacer uso de compuestos marcados con 18F. Las desventajas de 18F son la relativa escasez de análogos fluorados que tienen equivalencia funcional con materiales biológicos que se producen naturalmente, y la dificultad de diseñar métodos de síntesis que utilicen eficazmente el material de partida generado en el ciclotrón. Dicho material de partida puede ser cualquiera de un ion fluoruro o un gas flúor. En el último caso solo un átomo de flúor del gas bimolecular es realmente un F. Hubner et al., Chapter 14). For most biological materials, there are few suitable isotopes. The carbon isotope, 11C, has been used for PET, but its short half-life of 20.5 minutes limits its usefulness to compounds that can be synthesized and purified quickly, and to facilities that are close to a cyclotron in which the 11C precursor starting material. Other isotopes have even shorter half-lives. 13N has 5 a half-life 10 minutes and 15O has a half-life even shorter than 2 minutes. The emissions of both are more energetic than those of 11C. However, PET studies have been performed with these isotopes (Hubner, K. F., in Clinical Positron Emission Tomography, Mosby Year Book, 1992, K. F. Hubner, et al., Chapter 2). A more useful isotope, 18F, has a half-life of 110 minutes. This allows sufficient time for incorporation into a radiolabelled tracer, for purification and for administration to a human or animal subject. In addition, installations farther from a cyclotron, up to approximately 200 miles (320 km), can make use of compounds marked with 18F. The disadvantages of 18F are the relative shortage of fluorinated analogs that have functional equivalence with naturally occurring biological materials, and the difficulty of designing synthesis methods that effectively utilize the starting material generated in the cyclotron. Said starting material may be any of a fluoride ion or a fluorine gas. In the latter case only one fluorine atom of the bimolecular gas is really a

15 radionucleido, de tal manera que el gas se designa F-18F. Las reacciones que utilizan F-18F como material de partida dan como resultado por tanto productos que tienen solo la mitad de abundancia de radionucleidos de las reacciones que utilizan 18F como material de partida. Por otra parte, F18 se puede preparar en cantidades curie en forma de ion fluoruro para su incorporación a un compuesto radiofarmacéutico en una actividad muy específica, teóricamente 1,7 Ci/nmol utilizando reacciones de sustitución nucleófila exentas de vehículos. La emisión de energía de 18F es de 0,635 MeV, dando como resultado un intervalo promedio de positrones de 2,4 mm, relativamente corto, en el tejido, lo que permite imágenes PET de alta resolución. 15 radionuclide, such that the gas is designated F-18F. Reactions that use F-18F as a starting material therefore result in products that have only half the abundance of radionuclides from reactions that use 18F as a starting material. On the other hand, F18 can be prepared in curie amounts in the form of fluoride ion for incorporation into a radiopharmaceutical compound in a very specific activity, theoretically 1.7 Ci / nmol using vehicle-free nucleophilic substitution reactions. The energy emission of 18F is 0.635 MeV, resulting in an average range of positrons of 2.4 mm, relatively short, in the tissue, allowing high resolution PET images.

La obtención de imágenes SPECT emplea isótopos trazadores que emiten fotones de alta energía (emisores gamma). La gama de isótopos es mayor que para PET, pero SPECT proporciona una resolución tridimensional más baja. Sin SPECT imaging uses tracer isotopes that emit high-energy photons (gamma emitters). The isotope range is larger than for PET, but SPECT provides a lower three-dimensional resolution. Without

25 embargo, SPECT se usa ampliamente para obtener información clínicamente significativa acerca der la unión, localización y tasas de aclaramiento de unión a análogos. Un isótopo útil para la obtención de imágenes mediante SPECT es un emisor α-gamma marcado con 123I con una vida media de 13,3 horas. Los compuestos marcados con 123I se pueden marcar hasta aproximadamente 1000 milésimas a partir del sitio de fabricación, o el propio isótopo se puede transportar para la síntesis en el sitio. El ochenta y cinco por ciento de las emisiones de isótopos tienen fotones 159 KeV, que se miden fácilmente mediante la instrumentación SPECT actualmente en uso. Los compuestos de la invención se pueden marcar con tecnecio. Se sabe que Tecnecio-99m es un radionucleido útil para la obtención de imágenes mediante SPECT. Los análogos de T4 se unen a un clúster metálico de Tc-99m mediante una cadena de 4-6 átomos de carbono que puede estar saturada o tener un doble o triple enlace. However, SPECT is widely used to obtain clinically significant information about binding, localization, and analog binding clearance rates. An isotope useful for imaging using SPECT is an α-gamma emitter labeled with 123I with a half-life of 13.3 hours. Compounds labeled with 123I can be labeled up to about 1000 thousandths from the manufacturing site, or the isotope itself can be transported for synthesis at the site. Eighty-five percent of isotope emissions have 159 KeV photons, which are easily measured by the SPECT instrumentation currently in use. The compounds of the invention can be labeled with technetium. It is known that Technetium-99m is a useful radionuclide for imaging using SPECT. T4 analogs bind to a Tc-99m metal cluster through a chain of 4-6 carbon atoms that can be saturated or have a double or triple bond.

35 El uso de compuestos marcados con 18F en PET se ha limitado a unos pocos compuestos análogos. De forma más notable, se ha usado ampliamente la 18F-fluorodeoxiglucosa en estudios del metabolismo de la glucosa y en la localización de la captación de la glucosa asociada con la actividad cerebral. Se han utilizado también la 18F-L-fluorodopa y otros análogos de receptores de la dopamina en el cartografiado de la distribución de receptores de la dopamina. The use of compounds labeled with 18F in PET has been limited to a few similar compounds. Most notably, 18F-fluorodeoxyglucose has been widely used in studies of glucose metabolism and in the location of glucose uptake associated with brain activity. 18F-L-fluorodopa and other dopamine receptor analogues have also been used in the mapping of the distribution of dopamine receptors.

Otros isótopos de halógenos pueden servir para la obtención de imágenes mediante PET o SPECT, o para el marcado con trazadores convencionales. Estos incluyen 75Br, 76Br, 77Br y 82Br que tienen vidas medias y características de emisión útiles. En general, existen los medios químicos para sustituir cualquier resto halógeno de los isótopos descritos. Por lo tanto, las actividades bioquímicas o fisiológicas de cualquier homólogo halogenado de los Other halogen isotopes can be used for imaging using PET or SPECT, or for marking with conventional plotters. These include 75Br, 76Br, 77Br and 82Br that have useful half-lives and emission characteristics. In general, there are chemical means to replace any halogen moiety of the isotopes described. Therefore, the biochemical or physiological activities of any halogenated counterpart of

45 compuestos descritos están ahora disponibles para el uso por los expertos en la materia, incluyendo homólogos estables de isótopos de halógeno. La astatina se puede sustituir por otros isótopos de halógeno. 210At, por ejemplo, emite partículas alfa con una vida media de 8,3 h. Otros isótopos emiten también partículas alfa con vidas medias razonablemente útiles. Los compuestos sustituidos por At son por tanto útiles para el tratamiento del cerebro, en el que la unión es suficientemente específica del cerebro. The compounds described are now available for use by those skilled in the art, including stable homologs of halogen isotopes. Astatin can be replaced by other halogen isotopes. 210At, for example, emits alpha particles with a half-life of 8.3 h. Other isotopes also emit alpha particles with reasonably useful half-lives. The compounds substituted by At are therefore useful for the treatment of the brain, in which the binding is sufficiently specific to the brain.

Numerosos estudios han demostrado una creciente incorporación de hidratos de carbono y aminoácidos en células malignas del cerebro. Esta acumulación se asocia con la proliferación acelerada y la síntesis de proteínas de dichas células. Se ha utilizado el análogo de glucosa 18F-2-fluoro-2-desoxi-D-glucosa (2-FDG) para distinguir células del cerebro con elevada malignidad de crecimientos de tejido cerebral normales o benignos (DiChiro, G. et al. (1982) Numerous studies have shown a growing incorporation of carbohydrates and amino acids in malignant brain cells. This accumulation is associated with accelerated proliferation and protein synthesis of said cells. The glucose analogue 18F-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose (2-FDG) has been used to distinguish brain cells with high malignancy from normal or benign brain tissue growths (DiChiro, G. et al. ( 1982)

55 Neurology (NY) 32:1323-1329. Sin embargo, 2-FDG marcado con flúor-18 no es el agente de elección para detectar células cerebrales de baja calidad debido a que su elevada captación en tejido normal puede enmascarar la presencia de células del cerebro. Además, 2-FDG marcado con flúor 18 no es el agente radiofarmacéutico ideal para distinguir células de pulmón de un tejido infeccioso o para detectar carcinoma de ovario debido a su elevada captación de la radioactividad de 2-FDG en tejido infeccioso y en la vejiga, respectivamente. Se ha utilizado también el aminoácido metionina que se produce naturalmente, marcado con carbono-11, para distinguir tejido maligno de tejido normal. Pero este tiene también una captación relativamente elevada en tejido normal. Además, la vida media del carbono-11 es solo de 20 minutos; por tanto, la metionina 11C no se puede almacenar durante un largo periodo de tiempo. 55 Neurology (NY) 32: 1323-1329. However, 2-FDG labeled with fluorine-18 is not the agent of choice for detecting low-quality brain cells because its high uptake in normal tissue can mask the presence of brain cells. In addition, fluorine-labeled 2-FDG 18 is not the ideal radiopharmaceutical agent to distinguish lung cells from an infectious tissue or to detect ovarian carcinoma due to its high uptake of 2-FDG radioactivity in infectious tissue and in the bladder, respectively. The naturally occurring amino acid methionine, labeled with carbon-11, has also been used to distinguish malignant tissue from normal tissue. But this also has a relatively high uptake in normal tissue. In addition, the half-life of carbon-11 is only 20 minutes; therefore, methionine 11C cannot be stored for a long period of time.

La transtirretina ("TTR") del líquido cefalorraquídeo ("CSF"), la principal proteína portadora de tirosina del CSF(T4) en Transthyretin ("TTR") of cerebrospinal fluid ("CSF"), the main tyrosine-carrying protein of CSF (T4) in

65 la rata y el ser humano se sintetiza en el plexo coroideo ("CP"). Tras la inyección de 125I-T4 en la rata, la T4 radioactiva se acumula primero en el CP, a continuación en el CSF y posteriormente en el cerebro (Chanoine JP, Braverman LE. 65 the rat and the human being are synthesized in the choroid plexus ("CP"). After the injection of 125I-T4 in the rat, radioactive T4 accumulates first in the CP, then in the CSF and then in the brain (Chanoine JP, Braverman LE.

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The role of transthyretin in the transport of thyroid hormone to cerebrospinal fluid and brain. Acta Med Austriaca. 1992; 19 Supl. 1:25-8). The role of transthyretin in the transport of thyroid hormone to cerebrospinal fluid and brain. Austrian Med Act. 1992; 19 Suppl. 1: 25-8).

Los compuestos de la divulgación proporcionan una obtención de imágenes PET sustancialmente mejoradas para las The compounds of the disclosure provide substantially improved PET imaging for the

5 zonas del cuerpo que tienen proteína amiloide, especialmente del cerebro. Todos los isótopos emisores de positrones disponibles que podrían incorporarse a un compuesto biológicamente activo tienen vidas medias cortas. La utilidad práctica de dichos compuestos marcados depende por tanto de lo rápidamente que se puede sintetizar el compuesto marcado, del rendimiento sintético y de la pureza radioquímica del producto final. Incluso el tiempo de envío desde la fuente de isótopos, una instalación de ciclotrones, al hospital o al laboratorio en el que va a tener lugar la obtención de imágenes PET, está limitado. Un cálculo grosero de la distancia útil es aproximadamente de dos millas (3,22 km) por minuto de vida media. Por tanto, C11, con una vida media de 20,5 m está restringido a aproximadamente un radio de 40 millas (64,4 km) desde una fuente mientras que los compuestos marcados con F18 se pueden usar en un radio de aproximadamente 200 millas (322 km). Los requerimientos adicionales de un compuesto marcado con 18F son que tenga la especificidad de unión por el receptor o molécula diana a la que se pretende que se una, que la unión no 5 areas of the body that have amyloid protein, especially the brain. All available positron emitting isotopes that could be incorporated into a biologically active compound have short half-lives. The practical utility of said labeled compounds therefore depends on how quickly the labeled compound can be synthesized, on the synthetic yield and on the radiochemical purity of the final product. Even the shipping time from the isotope source, a cyclotron facility, to the hospital or to the laboratory where PET imaging is going to take place, is limited. A gross calculation of the useful distance is approximately two miles (3.22 km) per minute of average life. Therefore, C11, with a half-life of 20.5 m, is restricted to approximately 40 miles (64.4 km) from a source while F18-marked compounds can be used within a radius of approximately 200 miles ( 322 km). Additional requirements of an 18F-labeled compound are that it has the specificity of binding by the receptor or target molecule to which it is intended to bind, that the binding does not

15 específica a otras dianas sea suficientemente baja para permitir distinguir entre la unión a la diana y a la no diana, y que la marca sea estable en las condiciones del ensayo para evitar el intercambio con otras sustancias en el entorno del ensayo. Más particularmente, los compuestos deben mostrar una unión adecuada a la diana deseada a la vez que no se unen en ningún grado comparable con otros tejidos o células. 15 specific to other targets is low enough to distinguish between binding to the target and the non-target, and that the mark is stable under the test conditions to avoid exchange with other substances in the test environment. More particularly, the compounds must show adequate binding to the desired target while not binding to any degree comparable with other tissues or cells.

Una solución parcial a los estrictos requisitos para la obtención de imágenes PET es emplear isótopos emisores de rayos gamma en la obtención de imágenes SPECT. 121I es un marcador isotópico comúnmente usado en SPECT, que tienen una vida media de 13 horas para un rango útil de 1000 millas (1610 km) desde el punto de síntesis. Los compuestos de la divulgación pueden marcarse rápida y eficazmente con I para su uso en el análisis SPECT como alternativa a la obtención de imágenes PET. Además, debido al hecho de que el mismo compuesto se puede marcar A partial solution to the strict requirements for obtaining PET images is to use gamma-emitting isotopes in obtaining SPECT images. 121I is an isotopic marker commonly used in SPECT, which has a half-life of 13 hours for a useful range of 1000 miles (1610 km) from the point of synthesis. The compounds of the disclosure can be quickly and efficiently labeled with I for use in SPECT analysis as an alternative to obtaining PET images. In addition, due to the fact that the same compound can be labeled

25 con cualquier isótopo, es posible por primera vez comparar los resultados obtenidos mediante PET y SPECT usando el mismo trazador. With any isotope, it is possible for the first time to compare the results obtained by PET and SPECT using the same tracer.

La especificidad de la unión al cerebro proporciona también utilidad para los compuestos sustituidos con I de la invención. Dichos compuestos se pueden marcar con 123I para la obtención de imágenes mediante SPECT o con 125I de vida más larga para estudios a largo plazo como la vigilancia de la evolución de un tratamiento. Se pueden sustituir otros isótopos de yodo y bromo por los ilustrados. The specificity of brain binding also provides utility for the I-substituted compounds of the invention. These compounds can be labeled with 123I for imaging using SPECT or with 125I longer life for long-term studies such as monitoring the evolution of a treatment. Other iodine and bromine isotopes can be substituted for those illustrated.

Los compuestos de la divulgación proporcionan por tanto métodos mejorados para la obtención de imágenes del cerebro utilizando PET y SPECT. Los métodos implican administrar a un sujeto (que puede ser un ser humano o The compounds of the disclosure thus provide improved methods for imaging the brain using PET and SPECT. The methods involve administering to a subject (which can be a human being or

35 animal, a fines experimentales y/o de diagnóstico) una cantidad generadora de imágenes de un compuesto de la invención, marcados con el isótopo adecuado y medir a continuación la distribución del compuesto mediante PET si se emplea 18F u otro emisor de positrones, o SPECT si se emplea 123I u otro emisor de rayos gamma. Una cantidad generadora de imágenes es aquella cantidad que al menos puede proporcionar una imagen en un escáner de PET o SPECT, teniendo en cuenta la sensibilidad de detección del escáner y el nivel de ruido, la edad del isótopo, el tamaño corporal del sujeto y la ruta de administración, siendo las mencionadas variables ilustrativas de las conocidas y representativas para los cálculos y medidas conocidos por los expertos en la materia sin recurrir a experimentación innecesaria. 35, for experimental and / or diagnostic purposes) an image generating amount of a compound of the invention, labeled with the appropriate isotope and then measuring the distribution of the compound by PET if 18F or other positron emitter is used, or SPECT if 123I or other gamma emitter is used. An image generating amount is that quantity that at least one image can provide on a PET or SPECT scanner, taking into account the sensitivity of the scanner and the noise level, the age of the isotope, the body size of the subject and the route of administration, said variables being illustrative of those known and representative for the calculations and measurements known to those skilled in the art without resorting to unnecessary experimentation.

Se entenderá que los compuestos de la invención pueden marcarse con un isótopo de cualquier átomo o combinación It will be understood that the compounds of the invention can be labeled with an isotope of any atom or combination

45 de átomos en la estructura. Aunque que se hace hincapié en que F18, I123, e I125 en el presente documento son particularmente útiles para PET, SPECT y el análisis de trazadores, se contemplan otros usos que incluyen los que se derivan de propiedades fisiológicas o farmacológicas de homólogos de isótopos estables y serán evidentes a los expertos en la materia. 45 atoms in the structure. Although it is emphasized that F18, I123, and I125 herein are particularly useful for PET, SPECT and plotter analysis, other uses are contemplated which include those derived from physiological or pharmacological properties of stable isotope homologs. and will be apparent to those skilled in the art.

Esta divulgación proporciona también el marcado con tecnecio (Tc) mediante aductos de Tc. Se han usado isótopos de Tc, de forma notable Tc99m, para la obtención de imágenes del cerebro. Esta divulgación proporciona aductos complejados con Tc de los compuestos descritos, que son útiles para la obtención de imágenes del cerebro; Los aductos son complejos de coordinación con Tc unidos al aminoácido cíclico mediante una cadena de 4-6 átomos de carbono que puede estar saturada o poseer un doble o triple enlace. Cuando está presente un doble enlace, se pueden This disclosure also provides technetium labeling (Tc) by Tc adducts. Tc isotopes, notably Tc99m, have been used for imaging the brain. This disclosure provides adducts complexed with Tc of the described compounds, which are useful for imaging the brain; The adducts are coordination complexes with Tc linked to the cyclic amino acid by a chain of 4-6 carbon atoms that can be saturated or have a double or triple bond. When a double bond is present, they can be

55 sintetizar isómeros tanto E (trans) como Z (cis), y se puede emplear cualquier isómero. Se describe la síntesis para incorporar el isótopo 99mTc como última etapa, para maximizar la vida útil del isótopo. 55 synthesize both E (trans) and Z (cis) isomers, and any isomer can be used. The synthesis is described to incorporate the 99mTc isotope as the last stage, to maximize the isotope's shelf life.

Se emplearon los siguientes métodos en los procedimientos notificados en el presente documento. El 18F-fluoruro se produjo a partir de un ciclotrón Siemens utilizando la reacción 18O(p,n) 18F con 11 MeV de protones en agua enriquecida con un 95 % de 18O. Todos los disolventes y compuestos químicos eran de calidad analítica y se utilizaron sin purificación adicional. Se determinaron los puntos de fusión en tubos capilares utilizando un equipo Buchi SP. Se realizó el análisis cromatográfico en capa fina (TLC) utilizando capas de un espesor de 250-mm de gel de sílice G PF-254 revestidas con aluminio (obtenido de Analtech, Inc.). Se realizó la cromatografía en columna utilizando un gel de sílice de malla 60-200 µm (Aldrich Co.). Se registró el espectro de infrarrojos (IR) en un espectrofotómetro Beckman The following methods were used in the procedures notified in this document. 18F-fluoride was produced from a Siemens cyclotron using the 18O (p, n) 18F reaction with 11 MeV of protons in 95% enriched water with 18O. All solvents and chemical compounds were of analytical quality and were used without further purification. Melting points in capillary tubes were determined using a Buchi SP device. Thin layer chromatographic analysis (TLC) was performed using 250-mm thick layers of silica gel G PF-254 coated with aluminum (obtained from Analtech, Inc.). Column chromatography was performed using a 60-200 µm mesh silica gel (Aldrich Co.). The infrared (IR) spectrum was recorded on a Beckman spectrophotometer

65 18A con placas de NaCl. Se obtuvieron espectros de resonancia magnética nuclear de protones (RMN 1H) a 300 MHz con un instrumento de alta resolución. 65 18A with NaCl plates. Proton nuclear magnetic resonance (1 H NMR) spectra at 300 MHz were obtained with a high resolution instrument.

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En otro aspecto, la presente divulgación se dirige a un método para usar un compuesto para la fabricación de un agente radiofarmacéutico para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en un ser humano. Otro aspecto se dirige a un método para preparar los compuestos de esta divulgación. In another aspect, the present disclosure is directed to a method for using a compound for the manufacture of a radiopharmaceutical agent for the diagnosis of Alzheimer's disease in a human being. Another aspect is directed to a method for preparing the compounds of this disclosure.

5 Los compuestos que se describen en el presente documento son análogos de las hormonas tiroideas u otros ligandos de unión a TTR, que se unen a TTR y tienen la capacidad de pasar a través de la barrera hematoencefálica. Los compuestos son por tanto adecuados como agentes diagnósticos in vivo para la obtención de imágenes de la enfermedad de Alzheimer. La detección de la radioactividad se realiza con procedimientos bien conocidos en la materia, utilizando cualquiera de una cámara de rayos gamma o mediante tomografía de emisión de positrones (PET). The compounds described herein are analogs of thyroid hormones or other TTR binding ligands, which bind to TTR and have the ability to pass through the blood brain barrier. The compounds are therefore suitable as in vivo diagnostic agents for imaging Alzheimer's disease. Radioactivity detection is performed with procedures well known in the art, using either a gamma camera or positron emission tomography (PET).

10 Preferentemente, la forma de base libre o una forma de sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una sal de monocloruro o de dicloruro, de un compuesto de la divulgación se utiliza en una formulación galénica como agente diagnóstico. La formulación galénica que contiene el compuesto de la invención contiene opcionalmente adyuvantes conocidos en la materia, por ejemplo, tampones, cloruro sódico, ácido láctico, tensioactivos, etc. Es posible una Preferably, the free base form or a pharmaceutically acceptable salt form, for example, a monochloride or dichloride salt, of a compound of the disclosure is used in a galenic formulation as a diagnostic agent. The galenic formulation containing the compound of the invention optionally contains adjuvants known in the art, for example, buffers, sodium chloride, lactic acid, surfactants, etc. It is possible one

15 esterilización mediante filtración de la formulación galénica en condiciones estériles antes de la utilización. 15 sterilization by filtration of the galenic formulation under sterile conditions before use.

La dosis radioactiva debe estar en el intervalo de 1 a 100 mCi, preferentemente 5 a 30 mCi, y de forma más preferente 5 a 20 mCi por aplicación. The radioactive dose should be in the range of 1 to 100 mCi, preferably 5 to 30 mCi, and more preferably 5 to 20 mCi per application.

20 De los diversos aspectos de la divulgación, se prefieren determinados compuestos (por ejemplo, los compuestos descritos en los Ejemplos 16-20). Se prefieren especialmente dichos compuestos para su uso como agentes diagnósticos en tomografía de emisión de positrones (PET). Of the various aspects of the disclosure, certain compounds (for example, the compounds described in Examples 16-20) are preferred. Such compounds are especially preferred for use as diagnostic agents in positron emission tomography (PET).

Los compuestos se pueden administrar mediante cualquier ruta adecuada, preferentemente en la forma de una The compounds may be administered by any suitable route, preferably in the form of a

25 composición farmacéutica adaptada a la mencionada ruta, y en una dosis eficaz para unirse a TTR en el cerebro y por tanto detectarse mediante una cámara de rayos gamma o PET. Normalmente, la administración es parenteral, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica, o intramuscular. Se prefiere la administración intravenosa. Por tanto, por ejemplo, la presente divulgación proporciona composiciones para la administración parenteral que comprenden una solución de medios de contraste disuelta o suspendida en un transportador aceptable, 25 pharmaceutical composition adapted to the aforementioned route, and in an effective dose to bind TTR in the brain and therefore be detected by means of a gamma or PET camera. Normally, the administration is parenteral, for example, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, or intramuscular. Intravenous administration is preferred. Thus, for example, the present disclosure provides compositions for parenteral administration comprising a solution of contrast media dissolved or suspended in an acceptable carrier,

30 por ejemplo, suero o una solución fisiológica de cloruro de sodio. 30 for example, serum or a physiological solution of sodium chloride.

Los transportadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, suero salino, vehículos parenterales tales como cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, etc. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Se describen otros Aqueous transporters include water, alcoholic / aqueous solutions, saline, parenteral vehicles such as sodium chloride, Ringer's dextrose, etc. Examples of non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil and injectable organic esters such as ethyl oleate. Other described

35 transportadores farmacéuticamente aceptables, excipientes no tóxicos incluyendo sales, conservantes, tampones y similares, por ejemplo, en REMMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15ª Ed. Easton: Mack Publishing Co., pp. 1405-1412 y 1461-1487 (1975) y THE NATIONAL FORMULARY XIV., 14a Ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975). Se prefieren transportadores acuosos. 35 pharmaceutically acceptable carriers, non-toxic excipients including salts, preservatives, buffers and the like, for example, in REMMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15th Ed. Easton: Mack Publishing Co., pp. 1405-1412 and 1461-1487 (1975) and THE NATIONAL FORMULARY XIV., 14th Ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975). Aqueous transporters are preferred.

40 Se produjeron composiciones farmacéuticas de una manera conocida per se suspendiendo o disolviendo los compuestos de la presente invención -combinados opcionalmente con los aditivos individualizados en la farmacopea galénica-en un medio acuoso y a continuación esterilizando opcionalmente la suspensión o solución. Los aditivos adecuados son, por ejemplo, tampones fisiológicamente aceptables (tales como, por ejemplo, trometamina), adiciones de agentes complejantes (por ejemplo, ácido dietilentriamina pentaacético) o -si se requiere-electrolitos, por ejemplo, Pharmaceutical compositions were produced in a manner known per se by suspending or dissolving the compounds of the present invention - optionally combined with the additives individualized in the galenic pharmacopoeia - in an aqueous medium and then optionally sterilizing the suspension or solution. Suitable additives are, for example, physiologically acceptable buffers (such as, for example, tromethamine), additions of complexing agents (for example, diethylenetriamine pentaacetic acid) or -if electrolytes are required, for example,

45 cloruro de sodio o--si es necesario--antioxidantes, tales como ácido ascórbico, por ejemplo. 45 sodium chloride or - if necessary - antioxidants, such as ascorbic acid, for example.

Si las suspensiones o soluciones de los compuestos en agua o solución salina fisiológica son deseables para la administración entérica u otros fines, se mezclan con uno o varios agentes auxiliares (por ejemplo, metilcelulosa, lactosa, manitol) y/o tensioactivos (por ejemplo, lecitinas, "Tween", "Myrj") y/o agentes aromatizantes para mejorar el If the suspensions or solutions of the compounds in water or physiological saline solution are desirable for enteric administration or other purposes, they are mixed with one or more auxiliary agents (for example, methylcellulose, lactose, mannitol) and / or surfactants (for example, lecithins, "Tween", "Myrj") and / or flavoring agents to improve the

50 sabor (por ejemplo, éteres de petróleo), como es habitual en la farmacopea galénica. 50 flavor (for example, petroleum ethers), as usual in the galenic pharmacopoeia.

Las composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas, o pueden filtrarse para esterilizarlas. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso como tales, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución acuosa estéril antes de la administración. Las The compositions can be sterilized by well known conventional sterilization techniques, or they can be filtered to sterilize them. The resulting aqueous solutions can be packaged for use as such, or lyophilized, the lyophilized preparation being combined with a sterile aqueous solution before administration. The

55 composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables tal como se requiere para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes para ajustar el pH y agentes tamponantes, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro sódico, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc. Compositions may contain pharmaceutically acceptable auxiliary substances as required to approximate physiological conditions, such as pH adjusting agents and buffering agents, tonicity adjusting agents, wetting agents and the like, for example, sodium acetate, lactate. sodium, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sorbitan monolaurate, triethanolamine oleate, etc.

60 Para los compuestos descritos en el presente documento que tienen halógenos radioactivos, estos compuestos pueden enviarse como compuestos "calientes", es decir, con el halógeno radioactivo en el compuesto y administrarse en, por ejemplo, una solución salina fisiológicamente aceptable. En el caso de los complejos metálicos, estos compuestos pueden enviarse como compuestos "fríos", es decir, sin el ion radioactivo, y a continuación mezclarse con el eluato generador de Tc o el eluato generador de Re. For the compounds described herein that have radioactive halogens, these compounds may be sent as "hot" compounds, that is, with the radioactive halogen in the compound and administered in, for example, a physiologically acceptable saline solution. In the case of metal complexes, these compounds can be sent as "cold" compounds, that is, without the radioactive ion, and then mixed with the Tc generating eluate or the Re generating eluate.

65 El papel de la hormona tiroidea, los análogos, y las conjugaciones poliméricas en la modulación de las acciones de los polipéptidos cuyos receptores de la superficie celular se agrupan alrededor de la integrina  3, u otros compuestos que contienen RGD 65 The role of thyroid hormone, analogs, and polymer conjugates in modulating the actions of polypeptides whose cell surface receptors are grouped around integrin 3, or other compounds containing RGD

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5 La integrina αVβ3 es una proteína heterodimérica de la membrana plasmática con algunos ligandos de proteínas de la matriz extracelular y una secuencia de aminoácidos Arg-Gly-Asp ("RGD"). Utilizando la integrina purificada, los inventores han descubierto que la integrina αVβ3 se une a T4 y que esta interacción está perturbada por los antagonistas de αVβ3. Los estudios de unión a radioligando han desvelado que αVβ3 purificada se une a T4 con elevada afinidad (CE50, 371 pM), y parece unirse a T4 preferentemente sobre T3. Esto es consistente con los informes previos que muestran la activación de MAPK y la translocación nuclear, así como la angiogénesis inducida por hormonas, por T4, en comparación con T3. Los antagonistas de la integrina αVβ3 inhiben la unión de T4 a la integrina y, de forma importante, evitan la activación por T4 de la cascada de señalización de MAPK. Esta consecuencia funcional -activación de MAPK-de la unión de la hormona a la integrina, junto con la inhibición de la acción proangiogénica dependiente de MAPK de la hormona tiroidea por los antagonistas de la integrina αVβ3, permite a los 5 The αVβ3 integrin is a heterodimeric plasma membrane protein with some extracellular matrix protein ligands and an Arg-Gly-Asp amino acid sequence ("RGD"). Using purified integrin, the inventors have discovered that αVβ3 integrin binds to T4 and that this interaction is disrupted by αVβ3 antagonists. Radioligand binding studies have revealed that purified αVβ3 binds to T4 with high affinity (EC50, 371 pM), and appears to bind T4 preferentially over T3. This is consistent with previous reports showing MAPK activation and nuclear translocation, as well as hormone-induced angiogenesis, by T4, compared to T3. ΑVβ3 integrin antagonists inhibit T4 binding to integrin and, importantly, prevent T4 activation of the MAPK signaling cascade. This functional consequence - MAPK activation - of the binding of the hormone to integrin, together with the inhibition of MAPK-dependent proangiogenic action of thyroid hormone by integrin antagonists αVβ3, allows

15 inventores describir el sitio de unión a la yodotironina en la integrina como un receptor. Debe indicarse que la 3-yodotironamina, un derivado de hormona tiroidea, se une a trazas de un receptor de amina (TAR I) según han indicado Scanlan et al., pero de forma interesante, las acciones de este análogo son antitéticas de las de T4 y T3. 15 inventors describe the iodothyronine binding site in integrin as a receptor. It should be noted that 3-iodothyronamine, a derivative of thyroid hormone, binds to traces of an amine receptor (TAR I) as indicated by Scanlan et al., But interestingly, the actions of this analog are antithetical to those of T4 and T3.

Los ligandos tradicionales de las integrinas son proteínas. Que una molécula pequeña, una hormona tiroidea, sea también un ligando de una integrina es un hallazgo novedoso. Se describe también que resveratrol, un polifenol con cierta actividad estrogénica, se une a la integrina αVβ3 con una consecuencia funcional celular, la apoptosis, diferente del que resulta de la unión de la hormona tiroidea. El sitio de la integrina al cual se une T4 está en o próximo a la ranura de unión de RGD de la integrina heterodimérica. Es posible, sin embargo, que αVβ3 se una a T4 en otra parte de la proteína y que la ocupación del sitio de reconocimiento de RGD por tetrac o por los péptidos que contienen RGD Traditional integrin ligands are proteins. That a small molecule, a thyroid hormone, is also a ligand of an integrin is a novel finding. It is also described that resveratrol, a polyphenol with a certain estrogenic activity, binds to the αVβ3 integrin with a cellular functional consequence, apoptosis, different from that resulting from thyroid hormone binding. The integrin site to which T4 binds is at or near the RGD binding slot of the heterodimeric integrin. It is possible, however, that αVβ3 binds to T4 in another part of the protein and that the occupation of the RGD recognition site by tetrac or by the RGD-containing peptides

25 bloquee alostéricamente el sitio de unión a T4 o produzca un cambio conformacional en la integrina que convierta el sitio T4 en no disponible. Por consiguiente, la modulación por T4 de la interacción laminina-integrina de los astrocitos puede ser una consecuencia de la unión de la hormona a la integrina. Existe por tanto la posibilidad de que las hormonas tiroideas en el exterior de las células puedan afectar la unión mediante la integrina αVβ3 de las proteínas de la matriz extracelular además de la laminina. 25 allosterically block the T4 binding site or produce a conformational change in integrin that makes the T4 site unavailable. Therefore, T4 modulation of the laminin-integrin interaction of astrocytes may be a consequence of the binding of the hormone to integrin. There is therefore the possibility that thyroid hormones outside the cells may affect the binding by means of the αVβ3 integrin of extracellular matrix proteins in addition to laminin.

En los últimos años se han documentado bien las acciones de T4 que no tienen un mecanismo genómico. Numerosas de estas actividades están mediadas por MAPK. Los inventores han demostrado que las etapas iniciales de la activación de la cascada de MAPK por las hormonas tiroideas, incluyendo la activación de la proteína quinasa C, son sensibles a GTPγS y a la toxina de la tosferina, indicando que el receptor de la membrana plasmática para la hormona 35 tiroidea es sensible a la proteína G. Debe señalarse que otros autores han demostrado que determinadas funciones celulares mediadas por la integrina αVβ3 están moduladas por la proteína G. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio del dominio de unión a RGD anula la capacidad del receptor de nucleótidos P2Y2 de activar G0, aunque no se haya visto afectada la activación de Gq. Wang et al. han demostrado que una proteína asociada a la integrina, IAP/CD47, indujo la migración de células del músculo liso mediante la inhibición mediada por la activación de MAPK. The actions of T4 that do not have a genomic mechanism have been well documented in recent years. Numerous of these activities are mediated by MAPK. The inventors have shown that the initial stages of MAPK cascade activation by thyroid hormones, including activation of protein kinase C, are sensitive to GTPγS and pertussis toxin, indicating that the plasma membrane receptor for Thyroid hormone 35 is sensitive to protein G. It should be noted that other authors have shown that certain cellular functions mediated by integrin αVβ3 are modulated by protein G. For example, site-directed mutagenesis of the RGD binding domain cancels the ability of the P2Y2 nucleotide receptor to activate G0, although the activation of Gq has not been affected. Wang et al. have demonstrated that an integrin-associated protein, IAP / CD47, induced smooth muscle cell migration by inhibition mediated by MAPK activation.

Además de vincular la unión de T4 y otros análogos mediante la integrina αVβ3 a la activación de una ruta específica de transducción de la señal intracelular, se describe que la ligadura de la hormona por la integrina es fundamental para la inducción mediante T4 de la angiogénesis dependiente de MAPK. En el modelo CAM se produce un crecimiento significativo de vasos después de 48-72 h de tratamiento con T4, indicando que el efecto de T4 sobre la membrana In addition to linking the binding of T4 and other analogs by means of the αVβ3 integrin to the activation of a specific intracellular signal transduction pathway, it is described that the binding of the hormone by the integrin is fundamental for T4 induction of dependent angiogenesis. from MAPK. In the CAM model there is a significant growth of vessels after 48-72 h of treatment with T4, indicating that the effect of T4 on the membrane

45 plasmática puede dar como resultado cambios transcripcionales complejos. Por tanto, lo que se inició como una acción no genómica de la hormona -transducción de la señal de T4 en la superficie celular-interacciona con los efectos genómicos de la hormona que culminan en la neovascularización. Se han descrito anteriormente interfases de acciones no genómicas y genómicas de las hormonas tiroideas, por ejemplo, la fosforilación dependiente de MAPK en Ser-142 de TRβ1 que inicia T4 en la superficie celular y que da como resultado la replicación de las proteínas r por TR y el reclutamiento de coactivadores. Plasma can result in complex transcriptional changes. Therefore, what began as a non-genomic action of the hormone - transduction of the T4 signal on the cell surface - interacts with the genomic effects of the hormone that culminate in neovascularization. Interfaces of non-genomic and genomic actions of thyroid hormones have been described above, for example, MAPK-dependent phosphorylation in Ser-142 of TRβ1 that initiates T4 on the cell surface and that results in the replication of r proteins by TR and recruitment of coactivators.

Se ha descrito también que T4 estimula el crecimiento de células gliales C-6 mediante un mecanismos dependiente de MAPK que se inhibe mediante el péptido RGD, y que la hormona tiroidea produce la fosforilación de la serina mediada por MAPK del receptor de estrógenos nucleares (ERα) en células MCF-7 mediante un proceso que los inventores It has also been described that T4 stimulates the growth of C-6 glial cells by a MAPK-dependent mechanism that is inhibited by the RGD peptide, and that thyroid hormone produces phosphorylation of the MAPK-mediated serine of the nuclear estrogen receptor (ERα) ) in MCF-7 cells by a process that the inventors

55 saben ahora que se inhibe mediante un péptido RGD. Estos hallazgos en algunas líneas de células respaldan la participación de la integrina en las respuestas funcionales de las células a las hormonas tiroideas. 55 now know that it is inhibited by an RGD peptide. These findings in some cell lines support the involvement of integrin in the functional responses of cells to thyroid hormones.

La identificación de αVβ3 como un receptor de membrana para las hormonas tiroideas indica una significancia clínica de la interacción entre la integrina y la hormona y la consecuencia en la dirección descendente de la angiogénesis. Por ejemplo, αVβ3 se expresa en exceso en muchos tumores y esta expresión en exceso parece jugar un papel en la invasión y el crecimiento tumoral. Niveles en circulación relativamente constantes de la hormona tiroidea pueden facilitar la angiogénesis asociada a tumor. Además de demostrar la acción proangiogénica de T4 en el modelo CAM en la presente memoria y en otros sitios, se describe también que las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas forman también nuevos vasos sanguíneos cuando se exponen a hormonas tiroideas. La administración local 65 de antagonistas de αVβ3 o tetrac alrededor de células tumorales puede inhibir la angiogénesis estimulada por hormonas tiroideas. Aunque tetrac carece de muchas de las actividades biológicas de las hormonas tiroideas, The identification of αVβ3 as a membrane receptor for thyroid hormones indicates a clinical significance of the interaction between integrin and hormone and the consequence in the downward direction of angiogenesis. For example, αVβ3 is expressed in excess in many tumors and this expression in excess seems to play a role in tumor invasion and growth. Relatively constant levels of thyroid hormone can facilitate tumor-associated angiogenesis. In addition to demonstrating the proangiogenic action of T4 in the CAM model herein and elsewhere, it is also described that human dermal microvascular endothelial cells also form new blood vessels when exposed to thyroid hormones. Local administration of αVβ3 or tetrac antagonists around tumor cells can inhibit angiogenesis stimulated by thyroid hormones. Although tetrac lacks many of the biological activities of thyroid hormones,

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consigue acceder al interior de determinadas células. El anclado de tetrac, o de antagonistas específicos de RGD, a sustratos no inmunógenos (agarosa o polímeros) excluiría la posibilidad de que los compuestos pudieran cruzar la membrana plasmática, pero que retengan, como se muestra en la presente memoria descriptiva, la capacidad de prevenir la angiogénesis inducida por T4. La agarosa-T4 utilizada en los presentes estudios es de esta manera un get access to the interior of certain cells. Tetrac anchoring, or specific RGD antagonists, to non-immunogenic substrates (agarose or polymers) would exclude the possibility that the compounds could cross the plasma membrane, but retain, as shown herein, the ability to prevent T4 induced angiogenesis. The agarose-T4 used in the present studies is thus a

5 prototipo de una nueva familia de análogos de hormonas tiroideas que tienen efectos celulares específicos, pero que no pueden acceder al interior de la célula. 5 prototype of a new family of thyroid hormone analogs that have specific cellular effects, but cannot access the interior of the cell.

Por consiguiente, los Ejemplos del presente documento identifican la integrina αVβ3 como un receptor de la superficie celular para las hormonas tiroideas (L-tiroxina, T4) y como sitio de inicio para la activación inducida por T4 de las cascadas de señalización intracelular. αVβ3 se une de manera disociable a T4 con elevada afinidad; la unión al radioligando está desplazada por el ácido tetrayodotiroacético (tetrac), los anticuerpos αVβ3 y por un péptido del sitio de reconocimiento de la integrina RGD. Las células CV-1 carecen de receptores nucleares de hormonas tiroideas pero la membrana plasmática soporta el tratamiento de estas células con αVβ3 a concentraciones fisiológicas de T4 que activan la ruta de MAPK, un efecto inhibido por tetrac, el péptido RGD y los anticuerpos αVβ3. Los inhibidores de la Accordingly, the Examples herein identify the αVβ3 integrin as a cell surface receptor for thyroid hormones (L-thyroxine, T4) and as a starting site for T4 induced activation of intracellular signaling cascades. αVβ3 binds dissociably to T4 with high affinity; radioligand binding is displaced by tetraiodothyroacetic acid (tetrac), αVβ3 antibodies and by a peptide from the RGD integrin recognition site. CV-1 cells lack nuclear thyroid hormone receptors but the plasma membrane supports the treatment of these cells with αVβ3 at physiological concentrations of T4 that activate the MAPK pathway, an effect inhibited by tetrac, the RGD peptide and the αVβ3 antibodies. Inhibitors of

15 unión de T4 a la integrina bloquean también la acción proangiogénica de T4 mediada por MAPK. La fosforilación de MAPK inducida por T4 queda bloqueada por la inactivación de αV y β3 mediante el ARNip. Estos hallazgos indican de T4 se une a αVβ3 cerca del sitio de reconocimiento de RGD y demuestran que la unión de la hormona con αVβ3 tiene consecuencias fisiológicas. T4 binding to integrin also blocks the proangiogenic action of MAP4-mediated T4. T4-induced MAPK phosphorylation is blocked by the inactivation of αV and β3 by siRNA. These findings indicate that T4 binds to αVβ3 near the RGD recognition site and demonstrate that the binding of the hormone with αVβ3 has physiological consequences.

El papel de la hormona tiroidea, los análogos, y las conjugaciones poliméricas en la inhibición de la angiogénesis The role of thyroid hormone, analogs, and polymer conjugates in inhibition of angiogenesis

La divulgación proporciona composiciones y métodos para inhibir la angiogénesis en un sujeto que lo necesita. Las condiciones sensibles al tratamiento por inhibición de la angiogénesis incluyen, por ejemplo, tumores primarios o metastásicos y retinopatía diabética. Las composiciones pueden incluir una cantidad eficaz de TETRAC, TRIAC o del The disclosure provides compositions and methods to inhibit angiogenesis in a subject in need. Conditions sensitive to treatment by inhibition of angiogenesis include, for example, primary or metastatic tumors and diabetic retinopathy. The compositions may include an effective amount of TETRAC, TRIAC or of the

25 mAb LM609. La composición puede estar en la forma de o una formulación farmacéutica inyectable estéril, la formulación farmacéutica incluye una cantidad antiangiogénicamente eficaz de una sustancia antiangiogénica en un transportador fisiológica y farmacéuticamente aceptable, opcionalmente con uno o más excipientes. 25 mAb LM609. The composition may be in the form of or a sterile injectable pharmaceutical formulation, the pharmaceutical formulation includes an antiangiogenically effective amount of an antiangiogenic substance in a physiologically and pharmaceutically acceptable carrier, optionally with one or more excipients.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona métodos para tratar una dolencia susceptible de tratamiento inhibiendo la angiogénesis en un sujeto que lo necesita una cantidad de un agente antiangiogénesis eficaz para inhibir la angiogénesis. In a further aspect, the disclosure provides methods for treating a condition susceptible to treatment by inhibiting angiogenesis in a subject in need of an amount of an antiangiogenesis agent effective to inhibit angiogenesis.

Se proporcionan también en la invención ejemplos de los agentes antiangiogénicos utilizados para inhibir la angiogénesis entre los que se incluyen, pero sin limitación, ácido tetrayodotiroacético (TETRAC), ácido Examples of the antiangiogenic agents used to inhibit angiogenesis are also provided in the invention, including, but not limited to, tetraiodothyroacetic acid (TETRAC), acid

35 triyodotiroacético (TRIAC), anticuerpo LM609 monoclonal, o una de sus combinaciones. Dichos agentes antiangiogénesis pueden actuar en la superficie celular para inhibir los agentes pro-angiogénesis. Triiodothyroacetic acid (TRIAC), monoclonal LM609 antibody, or one of its combinations. Such anti-angiogenesis agents can act on the cell surface to inhibit pro-angiogenesis agents.

Crecimiento de nuevos vasos sanguíneos relacionados con el cáncer Growth of new blood vessels related to cancer

Los ejemplos de las dolencias susceptibles de tratamiento que inhiben la angiogénesis incluyen tumores primarios o metastásicos, incluyendo, glioma y cáncer de mama. En dicho método se usan compuestos que inhiben el efecto angiogénico inducido por la hormona tiroidea para inhibir la angiogénesis. Se ilustran detalles de dicho método en el Ejemplo 12. Examples of treatment ailments that inhibit angiogenesis include primary or metastatic tumors, including glioma and breast cancer. In said method, compounds that inhibit the angiogenic effect induced by thyroid hormone are used to inhibit angiogenesis. Details of said method are illustrated in Example 12.

45 Retinopatía diabética 45 Diabetic Retinopathy

Los ejemplos de las dolencias susceptibles de tratamiento que inhiben la angiogénesis incluyen la retinopatía diabética y dolencias relacionadas. En dicho método se usan compuestos que inhiben el efecto angiogénico inducido por la hormona tiroidea para inhibir la angiogénesis. Se ilustran los detalles de dicho método en los Ejemplos 8A y B. Examples of treatment ailments that inhibit angiogenesis include diabetic retinopathy and related ailments. In said method, compounds that inhibit the angiogenic effect induced by thyroid hormone are used to inhibit angiogenesis. Details of said method are illustrated in Examples 8A and B.

Se sabe que la retinopatía proliferativa inducida por hipoxia (más que por diabetes) depende de la expresión de la integrina alfaV (αV) (E Chavakis et al., Diabetologia 45:262-267, 2002). Se propone en el presente documento que la acción de la hormona tiroidea sobre una integrina alfa Vbeta-3 (αVβ3) específica sea permisiva del desarrollo de la retinopatía diabética. La integrina αVβ3 se identifica en el presente documento como el receptor de la superficie celular It is known that hypoxia-induced proliferative retinopathy (rather than diabetes) depends on the expression of integrin alfaV (αV) (E Chavakis et al., Diabetologia 45: 262-267, 2002). It is proposed herein that the action of thyroid hormone on a specific alpha Vbeta-3 integrin (αVβ3) be permissive to the development of diabetic retinopathy. The integrin αVβ3 is identified herein as the cell surface receptor

55 de la hormona tiroidea. Las hormonas tiroideas, sus análogos, y las conjugaciones poliméricas, actúan mediante este receptor para inducir la angiogénesis. 55 thyroid hormone. Thyroid hormones, their analogues, and polymer conjugates, act by this receptor to induce angiogenesis.

Métodos de tratamiento y formulaciones Treatment methods and formulations

Los análogos de las hormonas tiroideas, las formas poliméricas, y los derivados se pueden usar en un método para promover la angiogénesis en un paciente que lo necesita. El método implica la administración simultánea de una cantidad eficaz de análogos de hormonas tiroideas, formas poliméricas y derivados en dosificaciones diarias bajas, durante una semana o más. El método se puede usar como tratamiento para restaurar la función cardiaca tras un infarto de miocardio. El método se puede usar también para mejorar el flujo sanguíneo en pacientes con enfermedad 65 de la arteria coronaria que padecen de isquemia de miocardio o de flujo sanguíneo inadecuado en áreas diferentes que el corazón, por ejemplo, enfermedad vascular periférica, por ejemplo, enfermedad oclusiva de las arterias periféricas, Thyroid hormone analogs, polymeric forms, and derivatives can be used in a method to promote angiogenesis in a patient in need. The method involves the simultaneous administration of an effective amount of thyroid hormone analogs, polymeric forms and derivatives at low daily dosages, for a week or more. The method can be used as a treatment to restore cardiac function after myocardial infarction. The method can also be used to improve blood flow in patients with coronary artery disease 65 who suffer from myocardial ischemia or inadequate blood flow in areas other than the heart, for example, peripheral vascular disease, for example, occlusive disease. of the peripheral arteries,

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en la que un flujo sanguíneo disminuido es un problema. in which a decreased blood flow is a problem.

Los compuestos se pueden administrar mediante cualquier medio médicamente aceptable que sea adecuado para el compuesto que se va a administrar, incluyendo la administración oral, rectal, tópica o parenteral (incluyendo The compounds may be administered by any medically acceptable means that is suitable for the compound to be administered, including oral, rectal, topical or parenteral administration (including

5 subcutánea, intramuscular e intravenosa). Por ejemplo, la adenosina tiene una vida media muy corta. Por este motivo, es preferible administrar por vía intravenosa. Sin embargo, se han desarrollado agonistas de adenosina A2 que tienen vidas medias mucho más largas, y que se pueden administrar mediante otros medios. Se pueden administrar los análogos de las hormonas tiroideas, formas poliméricas y derivados, por ejemplo, mediante administración intravenosa, oral, tópica, e intranasal. 5 subcutaneous, intramuscular and intravenous). For example, adenosine has a very short half-life. For this reason, it is preferable to administer intravenously. However, adenosine A2 agonists have been developed that have much longer half-lives, and that can be administered by other means. Analogues of thyroid hormones, polymeric forms and derivatives may be administered, for example, by intravenous, oral, topical, and intranasal administration.

En algunas realizaciones, los análogos de las hormonas tiroideas, formas poliméricas y sus derivados se administran mediante diferentes medios. In some embodiments, analogs of thyroid hormones, polymeric forms and their derivatives are administered by different means.

La cantidades de las hormonas tiroideas, sus análogos, formas poliméricas y derivados necesarias para ser eficaces The amounts of thyroid hormones, their analogues, polymeric forms and derivatives necessary to be effective

15 en la estimulación de la angiogénesis, variarán, por supuesto, con el individuo que se está tratando y en última instancia a la discreción del médico a cargo del tratamiento. Los factores que se van a considerar incluyen el estado del paciente que se está tratando, la eficacia del agonista del receptor A2 de adenosina concreto que se está utilizando, la naturaleza de la formulación, y el peso corporal del paciente. Las dosificaciones de los análogos de hormonas tiroideas 15 in the stimulation of angiogenesis, they will vary, of course, with the individual being treated and ultimately at the discretion of the doctor in charge of the treatment. The factors to be considered include the condition of the patient being treated, the efficacy of the specific adenosine A2 receptor agonist being used, the nature of the formulation, and the patient's body weight. Dosages of thyroid hormone analogues

o sus formas poliméricas, y sus derivados para tratar oclusiones cualquier dosificación que proporcione el efecto deseado. or its polymeric forms, and its derivatives to treat occlusions any dosage that provides the desired effect.

Los compuestos descritos anteriormente se administran preferentemente en una formulación que incluye análogos de hormonas tiroideas o sus formas poliméricas, y sus derivados junto con un transportador aceptable para el modo de administración. Se puede utilizar cualquier formulación o sistema de administración de fármacos que contenga los The compounds described above are preferably administered in a formulation that includes analogs of thyroid hormones or their polymeric forms, and their derivatives together with a transporter acceptable for the mode of administration. Any formulation or drug delivery system containing the drugs may be used.

25 principios activos, que sea adecuada para el uso previsto, como saben generalmente los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica conocen los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración oral, rectal, tópica o parenteral (incluyendo subcutánea, intraperitoneal, intramuscular e intravenosa). El transportador debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible con el resto de ingredientes de la formulación y no ser perjudicial para el receptor de los mismos. 25 active ingredients, which is suitable for the intended use, as those skilled in the art generally know. Those skilled in the art know pharmaceutically acceptable carriers suitable for oral, rectal, topical or parenteral administration (including subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular and intravenous). The transporter must be pharmaceutically acceptable in the sense of being compatible with the rest of the ingredients of the formulation and not being detrimental to the recipient thereof.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen convenientemente preparaciones acuosas estériles del compuesto activo, que es preferentemente isotónico con la sangre del receptor. Por tanto, dichas formulaciones pueden contener convenientemente agua destilada, dextrosa al 5 % en agua destilada o solución salina. Las formulaciones útiles incluyen también soluciones concentradas o sólidos que contienen el compuesto de Formulations suitable for parenteral administration conveniently include sterile aqueous preparations of the active compound, which is preferably isotonic with the blood of the recipient. Therefore, said formulations may conveniently contain distilled water, 5% dextrose in distilled water or saline. Useful formulations also include concentrated or solid solutions containing the compound of

35 fórmula (I), que tras dilución con un disolvente adecuado proporciona una solución adecuada para la anterior administración parenteral. Formula (I), which after dilution with a suitable solvent provides a solution suitable for the previous parenteral administration.

Para la administración entérica, se puede incorporar un compuesto en un transportador inerte en unidades discretas tales como cápsulas, sellos, comprimidos o pastillas para chupar, conteniendo cada uno de ellos una cantidad predeterminada del principio activo; en forma de polvo o gránulos; o una solución o suspensión en un líquido acuoso o líquido no acuoso, por ejemplo, un jarabe, un elíxir, una emulsión o una dosis. Los vehículos adecuados pueden ser almidones o azúcares e incluyen lubricantes, aromatizantes, aglutinantes, y otros materiales de la misma naturaleza. For enteric administration, a compound can be incorporated into an inert carrier in discrete units such as capsules, seals, tablets or lozenges, each containing a predetermined amount of the active ingredient; in the form of powder or granules; or a solution or suspension in an aqueous liquid or non-aqueous liquid, for example, a syrup, an elixir, an emulsion or a dose. Suitable carriers may be starches or sugars and include lubricants, flavorings, binders, and other materials of the same nature.

Puede prepararse un comprimido mediante compresión o moldeo, de manera opcional con uno o más ingredientes A tablet can be prepared by compression or molding, optionally with one or more ingredients

45 auxiliares. Se pueden preparar comprimidos preparados mediante compresión del principio activo en una máquina adecuada en forma de flujo libre, por ejemplo, un polvo o gránulos, mezclados opcionalmente con los ingredientes auxiliares, por ejemplo, aglutinantes, lubricantes, diluyentes inertes, tensioactivos o agentes dispersantes. Pueden prepararse comprimidos moldeados mediante moldeo en una máquina adecuada, una mezcla del compuesto activo en polvo con un transportador adecuado. 45 auxiliaries Tablets prepared by compression of the active ingredient can be prepared in a suitable machine in the form of free flow, for example, a powder or granules, optionally mixed with the auxiliary ingredients, for example, binders, lubricants, inert diluents, surfactants or dispersing agents. Molded tablets can be prepared by molding in a suitable machine, a mixture of the active powder compound with a suitable carrier.

Se puede preparar un jarabe o suspensión añadiendo el compuesto activo a una solución acuosa concentrada de un azúcar, por ejemplo, sacarosa, al cual se pueden añadir también ingredientes auxiliares. Dichos ingredientes auxiliares pueden incluir aromatizantes, un agente para retrasar la cristalización del azúcar o un agente para aumentar la solubilidad de cualquier otro ingrediente, por ejemplo, como un alcohol polihídrico, por ejemplo, glicerol o sorbitol. A syrup or suspension can be prepared by adding the active compound to a concentrated aqueous solution of a sugar, for example, sucrose, to which auxiliary ingredients can also be added. Such auxiliary ingredients may include flavorings, an agent to delay the crystallization of sugar or an agent to increase the solubility of any other ingredient, for example, as a polyhydric alcohol, for example, glycerol or sorbitol.

55 Las formulaciones para administración rectal se pueden presentar como un supositorio con un transportador convencional, por ejemplo, manteca de cacao o Witepsol S55 (marca comercial de Dynamite Nobel Chemical, Alemania), para una base de supositorio. 55 Formulations for rectal administration can be presented as a suppository with a conventional carrier, for example, cocoa butter or Witepsol S55 (trademark of Dynamite Nobel Chemical, Germany), for a suppository base.

Como alternativa, el compuesto se puede administrar en liposomas o microesferas (o micropartículas). Los métodos para preparar liposomas y microesferas para su administración a un paciente son bien conocidos por los expertos en la materia. La Patente de los Estados Unidos Nº 4.789.734, describe métodos para encapsular materiales biológicos en liposomas. Esencialmente, el material se disuelve en una solución acuosa, se añaden los fosfolípidos y lípidos adecuados, junto con los tensioactivos si se requiere, y el material se somete a diálisis o sonicación, según sea Alternatively, the compound can be administered in liposomes or microspheres (or microparticles). The methods for preparing liposomes and microspheres for administration to a patient are well known to those skilled in the art. U.S. Patent No. 4,789,734 describes methods for encapsulating biological materials in liposomes. Essentially, the material is dissolved in an aqueous solution, the appropriate phospholipids and lipids are added, together with the surfactants if required, and the material is subjected to dialysis or sonication, as appropriate.

65 necesario. Se proporciona una revisión de los métodos conocidos por G.Gregoriadis, Capítulo 14, "Liposomes," Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341 (Academic Press, 1979). 65 needed. A review of the methods known by G. Gregoriadis, Chapter 14, "Liposomes," Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341 (Academic Press, 1979).

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Son bien conocidas de los expertos en la materia las microesferas formadas de polímeros o proteínas, y se pueden acondicionar para su paso a través del tracto gastrointestinal directamente al torrente sanguíneo. Como alternativa, el compuesto puede incorporarse y las microesferas, o materiales compuestos de microesferas, implantarse para una liberación lenta durante un periodo de tiempo que varía de días a meses. Véanse, por ejemplo, las patentes Patente de 5 los Estados Unidos Nos 4.906.474,4.925.673 y 3.625.214, y Jein, TIPS 19:155-157 (1998), los análogos de las hormonas tiroideas o sus formas poliméricas, y los derivados de adenosina se pueden formular en un liposoma o micropartícula que está dimensionado de manera adecuada para alojarse en lechos capilares tras su administración intravenosa. Cuando el liposoma o la micropartícula se alojan en los lechos capilares que rodean el tejido isquémico, los agentes se pueden administrar localmente en el sitio en el cual pueden ser más eficaces. Los liposomas adecuados para dirigirse al tejido isquémico tienen generalmente menos de aproximadamente 200 nanómetros y son también normalmente vesículas unilamelares, según se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos Nº Microspheres formed of polymers or proteins are well known to those skilled in the art, and can be conditioned to pass through the gastrointestinal tract directly into the bloodstream. Alternatively, the compound can be incorporated and the microspheres, or microsphere composites, implanted for a slow release over a period of time that varies from days to months. See, for example, US Patent Nos. 4,906,474,4,925,673 and 3,625,214, and Jein, TIPS 19: 155-157 (1998), thyroid hormone analogues or their polymeric forms, and adenosine derivatives can be formulated in a liposome or microparticle that is sized appropriately to accommodate in capillary beds after intravenous administration. When the liposome or microparticle is lodged in the capillary beds surrounding the ischemic tissue, the agents can be administered locally at the site where they can be most effective. Liposomes suitable for targeting ischemic tissue generally have less than about 200 nanometers and are also usually unilamellar vesicles, as described, for example, in U.S. Patent No.

5.593.688 de Baldeschweiler, titulada "Liposomal targeting of ischemic tissue". 5,593,688 to Baldeschweiler, entitled "Liposomal targeting of ischemic tissue".

Las micropartículas preferidas son las preparadas a partir de polímeros biodegradables, tales como poliglicolidas, Preferred microparticles are those prepared from biodegradable polymers, such as polyglycolides,

15 polilactidas y sus copolímeros. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente un sistema de vehículo adecuado dependiendo de diversos factores, que incluyen la velocidad deseada de liberación del fármaco y la dosificación deseada. 15 polylactides and their copolymers. Those skilled in the art can easily determine a suitable vehicle system depending on various factors, including the desired drug release rate and the desired dosage.

Las formulaciones se administran mediante catéter directamente al interior de los vasos sanguíneos. Se puede producir la administración, por ejemplo, a través de agujeros en el catéter. En aquellas realizaciones donde los compuestos activos tienen una vida media relativamente larga (del orden de 1 día a una semana o más), se pueden incluir las formulaciones en hidrogeles poliméricos biodegradables, tales como los descritos en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.410.016 de Hubbell et al. Estos hidrogeles poliméricos se pueden administrar al interior de la luz del tejido y los compuestos activos liberarse en el tiempo a medida que el polímero se degrada. Si es deseable, los The formulations are administered by catheter directly into the blood vessels. Administration may occur, for example, through holes in the catheter. In those embodiments where the active compounds have a relatively long half-life (of the order of 1 day to a week or more), formulations in biodegradable polymeric hydrogels, such as those described in US Patent No. 5,410, may be included. 016 by Hubbell et al. These polymeric hydrogels can be administered into tissue light and the active compounds are released over time as the polymer degrades. If desirable, the

25 hidrogeles poliméricos pueden tener micropartículas o liposomas que incluyen el compuesto activo dispersado en el anterior, lo que proporciona otro mecanismo para la liberación controlada de los compuestos activos. Polymeric hydrogels may have microparticles or liposomes that include the active compound dispersed therein, which provides another mechanism for the controlled release of the active compounds.

Las formulaciones se pueden presentar de forma cómoda en forma farmacéutica unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en la farmacopea. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar compuesto activo con un transportador, que constituye uno o más ingredientes auxiliares. En general, las formulaciones se preparan asociando de forma uniforme e íntima el compuesto activo con un transportador líquido o un transportador sólido finamente dividido y a continuación, si es necesario, conformar el producto en una forma farmacéutica unitaria deseada. The formulations can be conveniently presented in unit dosage form and can be prepared by any of the methods well known in the pharmacopoeia. All methods include the step of associating active compound with a carrier, which constitutes one or more auxiliary ingredients. In general, the formulations are prepared by uniformly and intimately associating the active compound with a liquid carrier or a finely divided solid carrier and then, if necessary, forming the product in a desired unit dosage form.

35 Las formulaciones pueden incluir opcionalmente componentes adicionales, tales como diversas sustancias biológicamente activas como factores de crecimiento (que incluyen TGF-.beta., factor básico de crecimiento de fibroblastos (FGF2), factores de crecimiento epitelial(EGF), factores alfa y beta de crecimiento transformante, (TGF alfa. y beta.), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), y factor de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF)), antivíricos, antibacterianos, antiinflamatorios, inmunosupresores, analgésico, agentes de vascularización, y moléculas de adhesión celular. The formulations may optionally include additional components, such as various biologically active substances such as growth factors (including TGF-.beta., Basic fibroblast growth factor (FGF2), epithelial growth factors (EGF), alpha and beta factors of transforming growth, (TGF alpha. and beta.), nerve growth factor (NGF), platelet-derived growth factor (PDGF), and vascular endothelial growth factor / vascular permeability factor (VEGF / VPF)), antivirals , antibacterial, anti-inflammatory, immunosuppressive, analgesic, vascularization agents, and cell adhesion molecules.

Además de los ingredientes anteriormente mencionados, las formulaciones pueden incluir además uno o más ingrediente(s) accesorios opcionales utilizados en la técnica de las formulaciones farmacéuticas, por ejemplo, diluyentes, tampones, agentes aromatizantes, aglutinantes, agentes tensioactivos, espesantes, lubricantes, agentes In addition to the aforementioned ingredients, the formulations may also include one or more optional ingredient (s) used in the art of pharmaceutical formulations, for example, diluents, buffers, flavoring agents, binders, surfactants, thickeners, lubricants, agents

45 suspensores, conservantes (incluyendo antioxidantes) y similares. 45 suspensions, preservatives (including antioxidants) and the like.

Formulaciones y métodos de tratamiento Formulations and treatment methods

Los análogos poliméricos de la hormona tiroidea solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros inductores de factores neurogénicos, o los agonistas de análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros receptores de factores neurogénicos de la presente invención se pueden administrar mediante cualquier ruta que sea compatible con el análogo concreto de la hormona tiroidea polimérica solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, inductores, o agonistas empleados. Por tanto, según sea apropiado, la administración puede ser oral o parenteral, incluyendo rutas de administración intravenosa e Polymeric analogs of thyroid hormone alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factor inducers, or agonists of polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factor receptors of the present invention are they can be administered by any route that is compatible with the specific analogue of the polymeric thyroid hormone alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors, inducers, or agonists employed. Therefore, as appropriate, administration may be oral or parenteral, including intravenous routes of administration and

55 intraperitoneal. Además, la administración puede ser mediante inyecciones periódicas de un bolo del análogo polimérico de la hormona tiroidea solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, inductores o agonistas, o se pueden preparar de una forma más continua mediante la administración intravenosa o intraperitoneal desde un depósito que es externo (por ejemplo, una bolsa i.v.) o interno (por ejemplo, un implante bioerosionable, o una colonia de análogos tiroideos poliméricos implantados solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otras células productoras de factores neurogénicos). 55 intraperitoneal. In addition, administration may be by periodic injections of a bolus of the polymeric analog of the thyroid hormone alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors, inducers or agonists, or they may be prepared more continuously by intravenous administration or intraperitoneal from a reservoir that is external (for example, an iv bag) or internal (for example, a bioerodible implant, or a colony of polymeric thyroid analogues implanted alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factor producing cells).

Los agentes terapéuticos de la divulgación (es decir, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, los inductores o agonistas de análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos) se pueden 65 proporcionar a un individuo mediante cualquier medio adecuado, de forma directa (por ejemplo, local, como mediante inyección, implante o administración tópica a un locus de tejido) o sistémicamente (por ejemplo, de forma parenteral u Therapeutic agents of the disclosure (ie, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors, inducers or agonists of polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other factors neurogenic) can be provided to an individual by any suitable means, directly (for example, locally, such as by injection, implantation or topical administration to a locus of tissue) or systemically (for example, parenterally or

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oral). Cuando el agente se va a proporcionar parenteralmente, tal como mediante administración intravenosa, subcutánea, intramolecular, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intranasal o en aerosol, el agente comprende preferentemente parte de una suspensión o solución acuosa de fluido fisiológicamente compatible. Por oral). When the agent is to be provided parenterally, such as by intravenous, subcutaneous, intramolecular, ophthalmic, intraperitoneal, intramuscular, buccal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracranial, intraspinal, intraventricular, intrathecal, intracisternal, intracapsular, intranasal or intranasal administration. aerosol, the agent preferably comprises part of an aqueous suspension or solution of physiologically compatible fluid. By

5 tanto, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros transportadores o vehículos de factores neurogénicos son fisiológicamente aceptables de tal manera que además de administrar el agente deseado al paciente, no afectan sin embargo de forma adversa a los electrolitos y/o al equilibrio volumétrico del paciente. El medio fluido para el agente puede comprender por tanto solución salina fisiológica normal (por ejemplo, una solución acuosa al 9,85 % de NaCl, 0,15 M, pH 7-7,4). Thus, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other carriers or vehicles of neurogenic factors are physiologically acceptable so that in addition to administering the desired agent to the patient, they do not adversely affect the electrolytes and / or the patient's volumetric balance. The fluid medium for the agent can therefore comprise normal physiological saline solution (for example, a 9.85% aqueous solution of NaCl, 0.15 M, pH 7-7.4).

La asociación del dímero con un prodominio de análogo polimérico de la hormona tiroidea da como resultado la proforma del análogo polimérico de la hormona tiroidea que es normalmente más soluble en soluciones fisiológicas que la forma madura correspondiente. The association of the dimer with a dominance of the polymeric analog of the thyroid hormone results in the proforma of the polymeric analog of the thyroid hormone that is normally more soluble in physiological solutions than the corresponding mature form.

15 Se pueden preparar soluciones útiles para la administración parenteral mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica, como se ha descrito, por ejemplo, en REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Gennaro, A., ed.), Mack Pub., 1990. Las formulaciones de los agentes terapéuticos de la invención pueden incluir, por ejemplo, polialquiilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados, y similares. Las formulaciones para la administración directa, en particular, pueden incluir glicerol y otras composiciones de elevada viscosidad para ayudar a mantener el agente en el locus deseado. Los polímeros biocompatibles, preferentemente bioresorbibles, incluyendo, por ejemplo, polímeros de ácido hialurónico, colágeno, fosfato tricálcico, polibutirato, lactida, y glicolida y copolímeros de lactida/glicolida, pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación de agente in vivo. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles para estos agentes incluyen partículas de copolímero de acetato de etilenvinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión Solutions useful for parenteral administration can be prepared by any of the methods well known in the pharmaceutical art, as described, for example, in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Gennaro, A., ed.), Mack Pub., 1990. Formulations of the therapeutic agents of the invention may include, for example, polyalkylene glycols such as polyethylene glycol, oils of vegetable origin, hydrogenated naphthalenes, and the like. Formulations for direct administration, in particular, may include glycerol and other high viscosity compositions to help keep the agent in the desired locus. Biocompatible polymers, preferably bioresorbable, including, for example, polymers of hyaluronic acid, collagen, tricalcium phosphate, polybutyrate, lactide, and glycolide and lactide / glycolide copolymers, may be useful excipients for controlling agent release in vivo. Other parenteral administration systems potentially useful for these agents include ethylene vinyl acetate copolymer particles, osmotic pumps, infusion systems.

25 implantables, y liposomas. Las formulaciones para su administración mediante inhalación contienen como excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, lauril éter-9-polioxietilenado, glicocolato y desoxicolato, o soluciones oleosas para su administración en la forma de gotas nasales, o como un gel que se va a aplicar intranasalmente. Las formulaciones para la administración parenteral pueden incluir también glicocolato para la administración bucal, metoxisalicilato para la administración rectal, o ácido cítrico para la administración vaginal. Pueden prepararse también supositorios para la administración rectal mezclando los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, inductores o agonistas con un excipiente no irritante tal como manteca de cacao u otras composiciones que son sólidas a temperatura ambiente y líquidas a temperaturas corporales. 25 implantable, and liposomes. Formulations for administration by inhalation contain as excipients, for example, lactose, or they may be aqueous solutions containing, for example, lauryl ether-9-polyoxyethylene, glycocholate and deoxycholate, or oily solutions for administration in the form of nasal drops. , or as a gel to be applied intranasally. Formulations for parenteral administration may also include glycocholate for oral administration, methoxysalicylate for rectal administration, or citric acid for vaginal administration. Suppositories for rectal administration can also be prepared by mixing the polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors, inducers or agonists with a non-irritating excipient such as cocoa butter or other compositions that are solid at room temperature. and liquids at body temperatures.

35 Se pueden preparar formulaciones para su administración tópica a la superficie de la piel dispersando los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, inductores o agonistas con un vehículo dermatológicamente aceptable tal como una loción, crema, pomada o jabón. Particularmente útiles son los transportadores capaces de formar una película o capa sobre la piel para localizar la aplicación e inhibir la eliminación. Para la administración tópica a las superficies internas de tejidos, el agente se puede dispersar en un tejido líquido adhesivo u otra sustancia conocida para potenciar la adsorción de una superficie de tejido. Por ejemplo, se pueden usar de forma ventajosa hidroxipropilcelulosa o soluciones de fibrinógeno/trombina. Como alternativa, se pueden usar soluciones para revestir tejidos, tales como formulaciones que contienen pectina. Formulations for topical administration to the surface of the skin can be prepared by dispersing polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic, inducing or agonist factors with a dermatologically acceptable vehicle such as a lotion, cream, ointment or soap. Particularly useful are the carriers capable of forming a film or layer on the skin to locate the application and inhibit removal. For topical administration to internal tissue surfaces, the agent can be dispersed in an adhesive liquid tissue or other known substance to enhance the adsorption of a tissue surface. For example, hydroxypropylcellulose or fibrinogen / thrombin solutions can be advantageously used. Alternatively, solutions for coating fabrics, such as formulations containing pectin, can be used.

Como alternativa, los agentes descritos en el presente documento se pueden administrar por vía oral. No se practica Alternatively, the agents described herein can be administered orally. Not practiced

45 generalmente la administración oral de proteínas como agentes terapéuticos, dado que la mayoría de proteínas se degradan fácilmente por enzimas y ácidos digestivos en el sistema digestivo de mamíferos antes de que se puedan absorber en el torrente sanguíneo. Sin embargo, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos descritos en el presente documento son normalmente estables a ácidos y resistentes a la proteasa (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos Nº 4.968.590). Además, se ha identificado OP-1 en el extracto de glándulas de mamíferos, calostro y leche de 57 días. Además, OP-1 purificada de extractos de glándulas mamarias es morfogenéticamente activo y se detecta también en el torrente sanguíneo. La administración maternal, mediante leche ingerida, puede ser una ruta de administración natural de proteínas de la superfamilia TGF-β. Letterio, et al., Science 264: 1936-1938 (1994), informan que TGF-β está presente en leche de murino, y que TGF-β radiomarcado se absorbe por la mucosa gastrointestinal de lactantes juveniles. In general, oral administration of proteins as therapeutic agents, since most proteins are easily degraded by enzymes and digestive acids in the mammalian digestive system before they can be absorbed into the bloodstream. However, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors described herein are normally acid stable and protease resistant (see, for example, U.S. Patent No. 4,968 .590). In addition, OP-1 has been identified in the 57-day extract of mammalian, colostrum and milk glands. In addition, purified OP-1 from mammary gland extracts is morphogenetically active and is also detected in the bloodstream. Maternal administration, through ingested milk, can be a route of natural administration of TGF-β superfamily proteins. Letterio, et al., Science 264: 1936-1938 (1994), report that TGF-β is present in murine milk, and that radiolabeled TGF-β is absorbed by the gastrointestinal mucosa of juvenile infants.

55 TGF-β marcada, ingerida, aparece rápidamente en forma intacta en tejidos corporales juveniles, incluyendo pulmón, corazón e hígado. Finalmente, las formas solubles de análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, por ejemplo, maduran análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos con o sin agentes antioxidantes o antiinflamatorios. Estos hallazgos, así como los descritos en los ejemplos siguientes, indican que la administración oral y parenteral son medios viables para administrar proteínas de la superfamilia TGF-β, incluyendo análogos poliméricos tiroideos solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, a un individuo. Además, aunque las formas maduras de algunos análogos tiroideos poliméricos solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos descritos en el presente documento son normalmente rara vez solubles, el análogo tiroideo polimérico solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otras formas de factores Ingested, labeled TGF-β rapidly appears intact in juvenile body tissues, including lung, heart and liver. Finally, soluble forms of polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors, for example, polymeric analogs of thyroid hormones mature alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors with or without antioxidant agents or anti-inflammatory. These findings, as well as those described in the following examples, indicate that oral and parenteral administration are viable means of administering TGF-β superfamily proteins, including thyroid polymer analogs alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors, to An individual. In addition, although mature forms of some polymeric thyroid analogues alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors described herein are normally rarely soluble, the polymeric thyroid analogue alone or together with nerve growth factors or other forms of factors

65 neurogénicos que se encuentran en la leche (y en extractos de glándulas mamarias y calostro) es fácilmente soluble, probablemente por asociación de la forma activa morfológicamente madura con parte o todo el prodominio de la secuencia polipeptídica de longitud completa expresada y/o por asociación con uno o más componentes de la leche. Por consiguiente, los compuestos proporcionados en el presente documento pueden también asociarse con moléculas capaces de potenciar su solubilidad in vitro o in vivo. 65 neurogenic found in milk (and in extracts of mammary glands and colostrum) is easily soluble, probably by association of the morphologically mature active form with part or all of the dominance of the expressed full length polypeptide sequence and / or by association with one or more milk components. Accordingly, the compounds provided herein can also be associated with molecules capable of enhancing their solubility in vitro or in vivo.

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5 Cuando los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos están previstos para su uso como agente terapéutico para los trastornos del SNC, debe resolverse un problema adicional: superar la barrera hematoencefálica, la estructura de paredes capilares del cerebro que filtran eficazmente todas las categorías seleccionadas de sustancias presentes en la sangre, evitando su paso al cerebro. La barrera hematoencefálica puede derivarse eficazmente mediante la infusión directa de análogos 5 When polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors are intended for use as a therapeutic agent for CNS disorders, an additional problem must be resolved: overcoming the blood brain barrier, capillary wall structure of the brain that effectively filter all selected categories of substances present in the blood, preventing their passage to the brain. The blood brain barrier can be derived effectively by direct infusion of analogues

10 poliméricos de hormonas tiroideas en el cerebro, o mediante la administración intranasal o inhalación de formulaciones adecuadas para la captación y el transporte retrógrado por neuronas olfatorias. Como alternativa, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas se pueden modificar para potenciar su transporte a través de la barrera hematoencefálica. Por ejemplo, las formas truncadas de análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos o un análogo polimérico de hormonas tiroideas solo o 10 polymeric thyroid hormones in the brain, or by intranasal administration or inhalation of formulations suitable for uptake and retrograde transport by olfactory neurons. Alternatively, polymeric analogs of thyroid hormones can be modified to enhance their transport across the blood brain barrier. For example, truncated forms of polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors or a polymeric analogue of thyroid hormones alone or

15 junto con factores de crecimiento nervioso u otro agente estimulador de factores neurogénicos pueden ser más satisfactorias. Como alternativa, los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, inductores o agonistas proporcionados en el presente documento se pueden derivatizar o conjugar a un resto lipófilo a una sustancia que se transporta activamente a través de la barrera hematoencefálica, utilizando medios normalizados conocidos por los expertos en la materia. Véase, por 15 together with nerve growth factors or other neurogenic factor stimulating agent may be more satisfactory. Alternatively, polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic, inducing or agonist factors provided herein may be derivatized or conjugated to a lipophilic moiety to a substance that is actively transported through the blood brain barrier, using standardized means known to those skilled in the art. See for

20 ejemplo, Pardridge, Endocrine Reviews 7: 314-330 (1986) y la patente de los Estados Unidos Nº 4.801.575. 20 example, Pardridge, Endocrine Reviews 7: 314-330 (1986) and U.S. Patent No. 4,801,575.

Los compuestos proporcionados en el presente documento pueden también asociarse con moléculas capaces de dirigirse a los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, inductores o agonistas del tejido deseado. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo, The compounds provided herein may also be associated with molecules capable of targeting polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors, inducers or agonists of the desired tissue. For example, an antibody can be used,

25 fragmento de anticuerpo, u otra proteína de unión que interactúa específicamente con una molécula superficial en las células del tejido deseado. Se pueden diseñar moléculas directoras útiles, por ejemplo, utilizando la tecnología del sitio de unión de cadena única descrita en la patente de los Estados Unidos Nº 5.091.513. Las moléculas directoras se pueden asociar de forma covalente o no covalente con análogos poliméricos de las hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, inductores o agonistas. 25 antibody fragment, or other binding protein that specifically interacts with a surface molecule in the cells of the desired tissue. Useful directing molecules can be designed, for example, using the single chain binding site technology described in US Patent No. 5,091,513. The directing molecules can be covalently or non-covalently associated with polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic, inducing or agonist factors.

30 Como apreciarán los expertos en la materia, las composiciones formuladas contienen cantidades terapéuticamente eficaces de análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, sus inductores o agonistas. Esto es, contienen una cantidad que proporciona concentraciones adecuadas del agente al tejido afectado del sistema nervioso durante un tiempo suficiente para estimular una As those skilled in the art will appreciate, the formulated compositions contain therapeutically effective amounts of polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors, their inducers or agonists. That is, they contain an amount that provides adequate concentrations of the agent to the affected tissue of the nervous system for a sufficient time to stimulate a

35 restauración detectable de la función afectada del sistema nervioso central o periférico, hasta e incluir una restauración completa del mismo. Como apreciarán los expertos en la materia, estas concentraciones variarán dependiendo de numerosos factores, incluyendo la eficacia biológica del agente seleccionado, las características químicas (por ejemplo, la hidrofobicidad) del agente específico, la formulación del mismo, incluyendo una mezcla con uno o más excipientes, la vía de administración, y el tratamiento abarcado, incluyendo cualquier principio activo que se 35 detectable restoration of the affected function of the central or peripheral nervous system, up to and including a complete restoration thereof. As those skilled in the art will appreciate, these concentrations will vary depending on numerous factors, including the biological efficacy of the selected agent, the chemical characteristics (e.g., hydrophobicity) of the specific agent, the formulation thereof, including a mixture with one or more. excipients, the route of administration, and the treatment covered, including any active substance that is

40 administrará directamente en un sitio del tejido, o cualquiera que se administre sistémicamente. La dosificación preferida que se va a administrar es también probable que dependa de variables tales como el estado de los tejidos enfermos o dañados, y el estado global de salud del mamífero concreto. De forma general, son suficientes dosis únicas, diarias, dos veces a la semana o semanales de 0,00001-1000 mg de un análogo tiroideo polimérico solo o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos en presencia de agentes antioxidantes y / o 40 will be administered directly to a tissue site, or any that is administered systemically. The preferred dosage to be administered is also likely to depend on variables such as the condition of diseased or damaged tissues, and the overall health status of the particular mammal. In general, single, daily, twice weekly or weekly doses of 0.00001-1000 mg of a polymeric thyroid analogue alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors in the presence of antioxidant agents and / or are sufficient

45 antiinflamatorios, siendo preferible 0,0001-100 mg, y siendo incluso más preferible 0,001 a 10 mg. Como alternativa, se pueden emplear de forma ventajosa dosis únicas, diarias, dos veces a la semana o semanales de 0,01-1000 µg/kg de peso corporal, de forma más preferente 0,01-10 mg/kg de peso corporal. Se puede administrar la dosis eficaz presente en una dosis única o en una pluralidad (dos o más) de dosis aplazadas, según se desee o se considere adecuado en las circunstancias específicas. Se puede usar una inyección en bolo de una formulación para infusión 45 anti-inflammatories, 0.0001-100 mg being preferable, and 0.001 to 10 mg being even more preferable. As an alternative, single, daily, twice weekly or weekly doses of 0.01-1000 µg / kg body weight may be used advantageously, more preferably 0.01-10 mg / kg body weight. The effective dose present in a single dose or in a plurality (two or more) of deferred doses may be administered, as desired or deemed appropriate in the specific circumstances. A bolus injection of an infusion formulation can be used

50 difundible. Si se desea facilitar infusiones repetidas o frecuentes, el implante de una prótesis endovascular semipermanente (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intracisternal o intracapsular) puede ser aconsejable. 50 diffusible. If it is desired to facilitate repeated or frequent infusions, the implantation of a semi-permanent endovascular prosthesis (for example, intravenous, intraperitoneal, intracisternal or intracapsular) may be advisable.

Los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos, inductores o agonistas de la invención pueden, por supuesto, administrarse solos o junto con otras 55 moléculas conocidas por ser beneficiosas en el tratamiento de las dolencias descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden administrar diversos factores de crecimiento bien conocidos, hormonas, enzimas, composiciones terapéuticas, antibióticos, u otros agentes bioactivos con los análogos poliméricos de hormonas tiroideas solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos. Por tanto, se pueden incluir diversos factores de crecimiento conocidos tales como NGF, EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-α, y TGF-β, así como enzimas, inhibidores Polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors, inducers or agonists of the invention can, of course, be administered alone or together with other 55 molecules known to be beneficial in the treatment of the conditions described in This document. For example, various well-known growth factors, hormones, enzymes, therapeutic compositions, antibiotics, or other bioactive agents can be administered with the polymeric analogs of thyroid hormones alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors. Thus, various known growth factors may be included such as NGF, EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-α, and TGF-β, as well as enzymes, inhibitors

60 enzimáticos, antioxidantes, agentes antiinflamatorios, agentes secuestrantes con radicales libres, antibióticos y/o factores quimioatractivos/quimiotácticos, en los análogos poliméricos de hormonas tiroideas presentes solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otras formulaciones de factores neurogénicos. 60 enzymes, antioxidants, anti-inflammatory agents, sequestering agents with free radicals, antibiotics and / or chemoattractive / chemotactic factors, in the polymeric analogs of thyroid hormones present alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factor formulations.

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Materiales y métodos Materials and methods

Reactivos: Todos los reactivos eran de calidad química y se adquirieron de Sigma Chemical Co. (San Luis, MO) o a través de VWR Scientific (Bridgeport, NJ). Se adquirieron acetato de cortisona, albúmina de suero bovino (BSA) y 5 solución de gelatina (2 % de tipo B procedente de piel de bovino) de Sigma Chemical Co. Se adquirieron huevos de pollo fertilizados de Charles River Laboratories, SPAFAS Avian Products & Services (North Franklin, CT). T4,3,5,3’-triyodo-L-tironina (T3), ácido tetrayodotiroacético (tetrac), T4-agarosa, 6-N-propil-2-tiouracilo (PTU), péptidos que contienen RGE, y péptidos que contienen RGE se obtuvieron de Sigma; PD 98059 de Calbiochem; y CGP41251 fue un regalo de Novartis Pharma (Basel, Suiza). Se obtuvieron anticuerpos policlonales dirigidos contra FGF2 y anticuerpos monoclonales dirigidos contra la β-actina de Santa Cruz Biotechnology y FGF2 y VEGF recombinantes humanos de Invitrogen. Los anticuerpos policlonales contra ERK1/2 fosforilada eran de New England Biolabs y el anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de conejo, de DAKO. Se adquirieron anticuerpos monoclonales dirigidos contra αVβ3 (SC73 12) y α-tubulina (E9) de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Se adquirieron IgG de ratón normal y anticuerpo de cabra dirigido contra Ig de conejo de Dako Cytomation (Carpinteria, CA). Se adquirieron anticuerpos Reagents: All reagents were of chemical quality and were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) or through VWR Scientific (Bridgeport, NJ). Cortisone acetate, bovine serum albumin (BSA) and 5 gelatin solution (2% type B from bovine skin) were purchased from Sigma Chemical Co. Fertilized chicken eggs were purchased from Charles River Laboratories, SPAFAS Avian Products & Services (North Franklin, CT). T4,3,5,3'-triiodo-L-thyronine (T3), tetraiodothyroacetic acid (tetrac), T4-agarose, 6-N-propyl-2-thiouracil (PTU), RGE-containing peptides, and peptides containing RGE were obtained from Sigma; PD 98059 from Calbiochem; and CGP41251 was a gift from Novartis Pharma (Basel, Switzerland). Polyclonal antibodies directed against FGF2 and monoclonal antibodies directed against β-actin from Santa Cruz Biotechnology and recombinant human FGF2 and VEGF were obtained from Invitrogen. The polyclonal antibodies against phosphorylated ERK1 / 2 were from New England Biolabs and the goat antibody directed against rabbit IgG, from DAKO. Monoclonal antibodies directed against αVβ3 (SC73 12) and α-tubulin (E9) were acquired from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Normal mouse IgG and goat antibody directed against rabbit Ig from Dako Cytomation (Carpinteria, CA) were purchased. Antibodies were acquired

15 monoclonales dirigidos contra αVβ3 (LM609) y αVβ3 (P1F6), así como αVβ3 purificado, de Chemicon (Temecula, CA). Se obtuvieron L-[125I]-T4(actividad específica, 1250 µCi/µg) de Perkin Elmer Life Sciences (Boston, MA). 15 monoclonal directed against αVβ3 (LM609) and αVβ3 (P1F6), as well as purified αVβ3, from Chemicon (Temecula, CA). L- [125I] -T4 (specific activity, 1250 µCi / µg) was obtained from Perkin Elmer Life Sciences (Boston, MA).

Modelo de Angiogenesis en la membrana corioalantoidea (CAM): Se examinó la neovascularización in vivo mediante los métodos descritos previamente. 9-12 Embriones de pollo de diez días de edad se adquirieron de SPAFAS (Preston, CT) y se incubaron a 37 ºC con una humedad relativa del 55 %. Se utilizó una aguja hipodérmica para practicar un pequeño orificio en el extremo romo del huevo implicando el saco aéreo, y se practicó un segundo orificio en el lado ancho del huevo, directamente sobre una parte avascular de la membrana embriónica que se identificó a la luz de una vela. Se creó un falso saco de aire bajo el segundo orifico mediante la aplicación de presión negativa al primer orificio, haciendo que CAM se separara de la cáscara. Se recortó una ventana de aproximadamente 1,0 cm2 en Chorioallantoid Membrane Angiogenesis (CAM) Model: Neovascularization was examined in vivo using the methods described previously. 9-12 Ten-day-old chicken embryos were purchased from SPAFAS (Preston, CT) and incubated at 37 ° C with a relative humidity of 55%. A hypodermic needle was used to make a small hole in the blunt end of the egg involving the air sac, and a second hole was made on the wide side of the egg, directly over an avascular part of the embryonic membrane that was identified in the light of a candle. A false air sack was created under the second hole by applying negative pressure to the first hole, causing CAM to separate from the shell. A window of approximately 1.0 cm2 was cut in

25 la cáscara sobre CAM caído con una rueda amoladora de marquetería (Dremel, división de Emerson Electric Co.), permitiendo el acceso directo a la CAM subyacente. FGF2 (1 µg/ml) se utilizó como agente proangiogénico normalizado para inducir nuevas ramas de vasos sanguíneos en la CAM de los embriones de 10 días de edad. Se pretrataron discos estériles de papel de filtro nº 1 (Whatman International) con 3 mg/ml de acetato de cortisona y 1 mM/l de PTU y se secaron al aire en condiciones de esterilidad. La hormona tiroidea, los análogos de hormona, FGF2 25 the shell on fallen CAM with a marquetry grinder wheel (Dremel, division of Emerson Electric Co.), allowing direct access to the underlying CAM. FGF2 (1 µg / ml) was used as a normalized proangiogenic agent to induce new branches of blood vessels in the CAM of 10-day-old embryos. Sterile discs of No. 1 filter paper (Whatman International) were pretreated with 3 mg / ml cortisone acetate and 1 mM / l PTU and air dried under sterile conditions. Thyroid hormone, hormone analogues, FGF2

o disolventes de control y los inhibidores se aplicaron a continuación a los discos, que se dejaron secar. Después, los discos se suspendieron en PBS y se colocaron sobre CAM en crecimiento. Los filtros tratados con T4 o FGF2 se colocaron el primer día en una incubación de 3 días, con adición del anticuerpo de FGF2 30 minutos después a las muestras seleccionadas, tal como se indica. A las 24 horas, el inhibidor de la cascada de MAPK, PD 98059, también se añadió a los CAM de forma tópica mediante los discos filtrantes. or control solvents and inhibitors were then applied to the discs, which were allowed to dry. Then, the discs were suspended in PBS and placed on growing CAM. Filters treated with T4 or FGF2 were placed the first day in a 3-day incubation, with the addition of the FGF2 antibody 30 minutes later to the selected samples, as indicated. At 24 hours, the MAPK cascade inhibitor, PD 98059, was also added to the CAMs topically using the filter discs.

35 Análisis microscópico de secciones de CAM: Tras incubación a 37 ºC con una humedad relativa del 55 % durante 3 días, se extirpó el tejido de CAM directamente por debajo de cada disco de filtro a partir del control y se trataron las muestras de CAM. Se lavaron los tejidos 3X con PBS, se colocaron en placas Petri de 35-mm (Nalge Nunc), y se examinaron bajo un estereomicroscopio SV6 (Zeiss) a un aumento de X50. Se recogieron imágenes digitales de secciones de CAM expuestas a filtros utilizando un sistema de videocámara de color con un dispositivo acoplado de 3 cargas (Toshiba) y se analizaron con el software Image-Pro (media Cybernetics). Se contaron el número de puntos de ramificación de los vasos incluidos en una región circular igual al área del disco filtrante. Se contó una imagen en cada preparación de CAM, y se analizaron los hallazgos de 8 a 10 preparaciones de CAM para cada estado de tratamiento (hormona o análogos tiroideos, FGF2, anticuerpo de FGF2, PD 98059). Además, se realizó cada experimento 3 veces. 35 Microscopic analysis of CAM sections: After incubation at 37 ° C with a relative humidity of 55% for 3 days, the CAM tissue was removed directly below each filter disc from the control and the CAM samples were treated. 3X tissues were washed with PBS, placed in 35-mm Petri dishes (Nalge Nunc), and examined under an SV6 stereomicroscope (Zeiss) at an X50 magnification. Digital images of CAM sections exposed to filters were collected using a color camcorder system with a 3-load coupled device (Toshiba) and analyzed with Image-Pro software (media Cybernetics). The number of branching points of the vessels included in a circular region equal to the area of the filter disc was counted. An image was counted in each CAM preparation, and the findings of 8 to 10 CAM preparations for each treatment state (thyroid hormone or analogues, FGF2, FGF2 antibody, PD 98059) were analyzed. In addition, each experiment was performed 3 times.

45 El índice de angiogénesis resultante es el promedio ±SEM de nuevos puntos de ramificación en cada conjunto de muestras. 45 The resulting angiogenesis index is the mean ± SEM of new branching points in each set of samples.

Ensayos FGF2: Se cultivaron células endoteliales ECV304 en medio M199 suplementado con suero de feto bovino al 10 %. Se sembraron en placas células ECV304 (106 células) en placas de 24 pocillos revestidas con gel al 0,2 % en medio completo durante la noche, y a continuación se lavaron las células con medio libre de suero y se trataron con T4 FGF2 Assays: ECV304 endothelial cells were cultured in M199 medium supplemented with 10% bovine fetal serum. ECV304 cells (106 cells) were plated in 24 well plates coated with 0.2% gel in complete medium overnight, and then the cells were washed with serum free medium and treated with T4

o T3 como se ha indicado. Después de 72 horas, Se recogieron los sobrenadantes y se realizaron los ensayos de FGF sin dilución utilizando un sistema ELISA comercial (R&D Systems). or T3 as indicated. After 72 hours, the supernatants were collected and FGF assays were performed without dilution using a commercial ELISA system (R&D Systems).

Activación de MAPK: Se cultivaron células ECV304 endoteliales en medio M199 con un 0,25 % de suero 13 con MAPK activation: Endothelial ECV304 cells were grown in M199 medium with 0.25% serum 13 with

55 hormonas agotadas durante 2 días. A continuación las células se trataron con T4 (10-7 mol/l) durante 15 minutos a 6 horas. En experimentos adicionales, se trataron las células con T4 o FGF2 o con T4 en presencia de PD 98059 o CGP41251. Se prepararon fracciones nucleares de todas las muestras mediante un método de los inventores notificado anteriormente, se separaron las proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, y se transfirieron a membranas para la inmunotransferencia con anticuerpos dirigidos a ERK 1/2 fosforilado. La apariencia de ERK1/2 nuclear fosforilado significa la activación de estas isoformas de MAPK mediante T4. 55 hormones depleted for 2 days. The cells were then treated with T4 (10-7 mol / l) for 15 minutes to 6 hours. In additional experiments, cells were treated with T4 or FGF2 or with T4 in the presence of PD 98059 or CGP41251. Nuclear fractions of all samples were prepared by a method of the inventors reported above, the proteins were separated by polyacrylamide gel electrophoresis, and transferred to membranes for immunoblotting with antibodies directed to phosphorylated ERK 1/2. The appearance of phosphorylated nuclear ERK1 / 2 means the activation of these MAPK isoforms by T4.

Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa: Se trataron células ECV304 confluentes en placas de 10-cm con T4 (10-7 mol/l) durante 6 a 48 horas y se extrajo el ARN total utilizando isotiocianato de guanidino (Biotecx Laboratories). Se sometió el ARN (1 µg) a reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa Polymerase chain reaction with reverse transcription: Confluent ECV304 cells were treated in 10-cm plates with T4 (10-7 mol / l) for 6 to 48 hours and total RNA was extracted using guanidino isothiocyanate (Biotecx Laboratories) . RNA (1 µg) was subjected to polymerase chain reaction with reverse transcription

65 (RT-PCR) utilizando el sistema Access RT-PCR (Promega). Se transcribió de manera inversa el ARN total en ADNc a 48 ºC durante 45 minutos, a continuación se desnaturalizó a 94 ºC durante 2 minutos. Se realizó la síntesis de la segunda hebra y la amplificación mediante la PCR durante 40 ciclos con desnaturalización a 94 ºC durante 30 s, hibridación a 60 ºC durante 60 s, y extensión a 68 ºC durante 120 s, con una extensión final durante 7 minutos a 68 ºC tras el agotamiento de todos los ciclos. Los cebadores de la PCR para FGF2 fueron como sigue: FGF2, hebra de sentido directo 5’-TGGTATGTGGCACTGAAACG-3’ (SEC ID Nº:1), hebra de sentido contrario 5’ 65 (RT-PCR) using the Access RT-PCR system (Promega). Total RNA was reverse transcribed in cDNA at 48 ° C for 45 minutes, then denatured at 94 ° C for 2 minutes. Second strand synthesis and amplification was performed by PCR for 40 cycles with denaturation at 94 ° C for 30 s, hybridization at 60 ° C for 60 s, and extension at 68 ° C for 120 s, with a final extension for 7 minutes at 68 ° C after exhaustion of all cycles. The PCR primers for FGF2 were as follows: FGF2, strand of direct sense 5’-TGGTATGTGGCACTGAAACG-3 ’(SEQ ID NO: 1), strand of opposite direction 5’

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5 CTCAATGACCTGGCGAAGAC-3’ (SEC ID Nº:2); la longitud del producto de la PCR fue de 734 pb. Los cebadores de GAPDH incluían la hebra de sentido directo 5’-AAGGTCATCCCTGAGCTGAACG-3’ (SEC ID Nº:3), y la hebra de sentido contrario 5’-GGGTGTCGCTGTTGAAGTCAGA-3’ (SEC ID Nº:4); la longitud del producto de la PCR fue de 218 pb. Se separaron los productos de la RT-PCR mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5 % y se visualizaron con bromuro de etidio. Se cuantificaron las bandas diana del gel utilizando el software Lablmage (Kapelan), y se calculó el valor de [FGF2/GAPDH]X10 para cada punto temporal. 5 CTCAATGACCTGGCGAAGAC-3 ’(SEQ ID NO: 2); The length of the PCR product was 734 bp. GAPDH primers included the 5′-AAGGTCATCCCTGAGCTGAACG-3 ’direct sense strand (SEQ ID NO: 3), and the 5′-GGGTGTCGCTGTTGAAGTCAGA-3 ′ counter thread (SEQ ID NO: 4); The length of the PCR product was 218 bp. The products of the RT-PCR were separated by electrophoresis in 1.5% agarose gels and visualized with ethidium bromide. The gel target bands were quantified using the Lablmage (Kapelan) software, and the value of [FGF2 / GAPDH] X10 was calculated for each time point.

Análisis estadístico: Se realizó el análisis estadístico mediante el análisis de varianza monolateral (ANOVA) comparando el grupos experimental con el grupo control respectivo y se calculó la significancia estadística basándose en P <0,05. Statistical analysis: Statistical analysis was performed using the analysis of monolateral variance (ANOVA) comparing the experimental groups with the respective control group and statistical significance was calculated based on P <0.05.

15 Angiogénesis in vivo en Matrigel FGF2 o en implantes de líneas de células cancerosas en ratones: Modelo in vivo de angiogénesis en murino: Se realizó el modelo matrigel de murino de acuerdo con los métodos anteriormente descritos (Grant el al., 1991; Okada et al., 1995) y que se implementó en el laboratorio de los inventores (Powel et al., 2000). En resumen, matrigel exenta de factor de crecimiento (Becton Dickinson, Bedford MA) se descongelará durante la noche a 4 ºC y se colocó en hielo. Se colocaron alícuotas de matrigel en tubos de polipropileno frío y FGF2, se añadirán análogos de hormonas tiroideas o células cancerosas (1 x 106 células) al matrigel. Matrigel con solución salina, FGF2, los análogos de hormonas tiroideas o las células cancerosas se inyectarán por vía subcutánea en la línea media ventral de los ratones. En el día 14, los ratones se sacrificarán y los geles solidificados se retirarán y se analizarán para determinar la presencia de nuevos vasos. Se inyectarán los compuestos A-D por vía subcutánea a 15 Angiogenesis in vivo in Matrigel FGF2 or in implants of cancer cell lines in mice: In vivo model of murine angiogenesis: The murine matrigel model was performed according to the methods described above (Grant el al., 1991; Okada et al., 1995) and which was implemented in the inventors' laboratory (Powel et al., 2000). In summary, growth-free matrigel (Becton Dickinson, Bedford MA) will be thawed overnight at 4 ° C and placed on ice. Aliquots of matrigel were placed in cold polypropylene and FGF2 tubes, analogs of thyroid hormones or cancer cells (1 x 106 cells) will be added to the matrigel. Matrigel with saline solution, FGF2, thyroid hormone analogues or cancer cells will be injected subcutaneously into the ventral midline of the mice. On day 14, mice will be sacrificed and solidified gels will be removed and analyzed to determine the presence of new vessels. Compounds A-D will be injected subcutaneously to

25 diferentes dosis. El control y los implantes de geles experimentales se colocarán en un tubo de microcentrífuga que contiene 0,5 ml de solución de lisis celular (Sigma, San Luis, MO) y se aplastaron con una mano de mortero. Posteriormente, se dejó incubar los tubos durante la noche a 4 ºC y se centrifugaron a 1.500 x g durante 15 minutos al día siguiente. Se añadirá una alícuota de 200 µl de lisado celular a 1,3 ml de una solución de reactivo de Drabkin (Sigma, San Luis, MO) para cada muestra. La solución se analizará en un espectrofotómetro a 540 nm. La absorción de la luz es proporcional a la cantidad de hemoglobina contenida en la muestra. 25 different doses. The control and implants of experimental gels will be placed in a microcentrifuge tube containing 0.5 ml of cell lysis solution (Sigma, San Luis, MO) and crushed with a mortar hand. Subsequently, the tubes were allowed to incubate overnight at 4 ° C and centrifuged at 1,500 x g for 15 minutes the next day. A 200 µl aliquot of cell lysate will be added to 1.3 ml of a Drabkin reagent solution (Sigma, St. Louis, MO) for each sample. The solution will be analyzed in a spectrophotometer at 540 nm. The absorption of light is proportional to the amount of hemoglobin contained in the sample.

Crecimiento y metástasis tumoral -Modelo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM) de implante tumoral: Tumor growth and metastasis - Chicken chorioallantoid membrane (CAM) model of tumor implant:

El protocolo es tal como se ha descrito anteriormente (Kim et al., 2001). En resumen, se colocaron 1 x 107 células tumorales sobre la superficie de cada CAM (embriones de 7 días de edad) y se incubaron durante una semana. Los The protocol is as described previously (Kim et al., 2001). In summary, 1 x 107 tumor cells were placed on the surface of each CAM (7-day-old embryos) and incubated for a week. The

35 tumores resultantes se escindieron y se cortaron en fragmentos de 50 mg. Estos fragmentos se colocarán en 10 CAM por grupo adicionales y se trataron tópicamente el siguiente día con 25 µl de compuestos (A-D) disueltos en PBS. Siete días después, los tumores se escindirán a continuación a partir de los pesos de los huevos y tumorales para cada CAM. La Figura 8 es un bosquejo diagramático que muestra las etapas implicadas en el modelo de crecimiento tumoral in vivo en el CAM. 35 resulting tumors were excised and cut into 50 mg fragments. These fragments will be placed in 10 CAM per additional group and treated topically the next day with 25 µl of compounds (A-D) dissolved in PBS. Seven days later, the tumors will then be excised from the egg and tumor weights for each CAM. Figure 8 is a diagrammatic outline showing the stages involved in the tumor growth model in vivo in CAM.

Los efectos de TETRAC, TRIAC, y los antagonistas de las hormonas tiroideas en la velocidad de crecimiento tumoral, la angiogénesis tumoral, y se puede determinar la metástasis tumoral de líneas de células cancerosas. The effects of TETRAC, TRIAC, and thyroid hormone antagonists on tumor growth rate, tumor angiogenesis, and tumor metastasis of cancer cell lines can be determined.

Crecimiento y metástasis tumoral -Modelo de xenoinjerto tumoral en ratones: El modelo es tal como se describe Tumor growth and metastasis -Tumor xenograft model in mice: The model is as described

45 en las publicaciones de los inventores por Kerr et al., 2000; Van Waes et al., 2000; Ali et al., 2001; y Ali et al., 2001, cada una de ellas incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad). Puede determinarse y compararse la eficacia anticancerosa de TETRAC, TRIAC, y otros antagonistas de hormonas tiroideas a diferentes dosis y contra diferentes tipos de tumores. 45 in the inventors' publications by Kerr et al., 2000; Van Waes et al., 2000; Ali et al., 2001; and Ali et al., 2001, each incorporated herein by reference in its entirety). The anticancer efficacy of TETRAC, TRIAC, and other thyroid hormone antagonists at different doses and against different types of tumors can be determined and compared.

Crecimiento y metástasis tumoral -Modelo experimental de metástasis: El modelo es tal como se describe en las publicaciones recientes de los inventores (Mousa, 2002; Amirkhosravi et al., 2003 a y 2003b, cada una de las cuales se ha incorporado en su totalidad en el presente documento). En resumen, células B16 de melanoma maligno de murino (ATCC, Rockville, MD) y otras líneas cancerosas se cultivarán en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado con suero fetal bovino al 10 %, penicilina y estreptomicina (Sigma, San Luis, MO). Se cultivarán las Tumor growth and metastasis - Experimental model of metastasis: The model is as described in the recent publications of the inventors (Mousa, 2002; Amirkhosravi et al., 2003 a and 2003b, each of which has been fully incorporated into This document). In summary, B16 cells of murine malignant melanoma (ATCC, Rockville, MD) and other cancer lines will be cultured in RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA), supplemented with 10% bovine fetal serum, penicillin and streptomycin (Sigma, San Luis, MO). The

55 células hasta una confluencia del 70 % y se cosecharán con tripsina-EDTA (Sigma) y se lavarán dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se volverán a suspender las células en PBS a una concentración de cualquiera de 2.0 x 105 células/ml para la metástasis experimental. Animales: se utilizarán ratones C57/BL6 (Harlan, Indianápolis, Indiana) que pesaban 18-21 gramos para este estudio. Todos los procedimientos están de acuerdo con la IACUC y las directrices institucionales. Puede determinarse y compararse la eficacia anticancerosa de TETRAC, TRIAC, y otros antagonistas de hormonas tiroideas a diferentes dosis y contra diferentes tipos de tumores. 55 cells to a confluence of 70% and will be harvested with trypsin-EDTA (Sigma) and washed twice with phosphate buffered saline (PBS). The cells will be resuspended in PBS at a concentration of any of 2.0 x 105 cells / ml for experimental metastasis. Animals: C57 / BL6 mice (Harlan, Indianapolis, Indiana) weighing 18-21 grams will be used for this study. All procedures are in accordance with IACUC and institutional guidelines. The anticancer efficacy of TETRAC, TRIAC, and other thyroid hormone antagonists at different doses and against different types of tumors can be determined and compared.

Efecto de análogos de hormonas tiroideas sobre la angiogénesis. Effect of thyroid hormone analogues on angiogenesis.

T4 indujo un aumento significativo en el índice de la angiogénesis (aumento de veces por encima del inicial) en el T4 induced a significant increase in the angiogenesis index (increase in times above the initial) in the

65 modelo CAM. T3 a 0,001-1,0 µM o T4 a 0,1-1.0 µM alcanzó el efecto máximo en la producción de un aumento de 2-2,5 veces en el índice de angiogénesis en comparación con 2-3 veces de aumento en el índice de angiogénesis por 1 µg de FGF2 (Tabla 1 y Figura 1a y 1b). El efecto de T4 en la promoción de la angiogénesis (2-2,5 veces de aumento en el índice de la angiogénesis) se alcanzó en presencia o ausencia de PTU, que inhibe la conversión de T4 a T3. La propia T3 a 91-100 nM) indujo un potente efecto proangiogénico en el modelo CAM. La T4 agarosa produjo un efecto proangiogénico similar al alcanzado por T4. El efecto proangiogénico tanto de T4 como de T4-agarosa se bloqueó en 65 CAM model. T3 at 0.001-1.0 µM or T4 at 0.1-1.0 µM reached the maximum production effect of a 2-2.5 fold increase in the angiogenesis rate compared with 2-3 times the increase in Angiogenesis index per 1 µg of FGF2 (Table 1 and Figure 1a and 1b). The effect of T4 on the promotion of angiogenesis (2-2.5 times increase in the angiogenesis index) was achieved in the presence or absence of PTU, which inhibits the conversion of T4 to T3. T3 itself at 91-100 nM) induced a potent proangiogenic effect in the CAM model. T4 agarose produced a proangiogenic effect similar to that achieved by T4. The proangiogenic effect of both T4 and T4-agarose was blocked in

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5 un 100 % por TETRAC o TRIAC. 5 100% by TETRAC or TRIAC.

Potenciación o mejora de la actividad proangiogénica de FGF2 mediante concentraciones submáximas de T4. Enhancement or improvement of the proangiogenic activity of FGF2 by submaximal concentrations of T4.

La combinación de T4 y FGF2 en concentraciones submáximas dio como resultado un aumento aditivo en el índice de angiogénesis hasta un nivel similar al efecto pro-angiogénesis máximo de cualquiera de FGF2 o T4 (Figura 2). The combination of T4 and FGF2 at submaximal concentrations resulted in an additive increase in the angiogenesis index to a level similar to the maximum pro-angiogenesis effect of either FGF2 or T4 (Figure 2).

Efectos de los inhibidores de la cascada MAPK sobre las acciones pro-angiogénicas de T4 y FGf2 en el modelo CAM. El efecto pro-angiogénesis de cualquiera de FGF2 o T4 quedó completamente bloqueado por PD 98059 a 0,8 -8 µg (Figura 3). Effects of MAPK cascade inhibitors on the pro-angiogenic actions of T4 and FGf2 in the CAM model. The pro-angiogenesis effect of either FGF2 or T4 was completely blocked by PD 98059 at 0.8-8 µg (Figure 3).

 Efectos de los antagonistas específicas de la integrina αVβ3 sobre las acciones pro-angiogénicas de T4 y FGf2 en el modelo CAM. El efecto pro-angiogénesis de cualquiera de FGF2 o T4 quedó completamente bloqueado por el anticuerpo monoclonal específico LM609 a 10 µg (Figura 4a y 4b). Effects of the integrin specific antagonists αVβ3 on the pro-angiogenic actions of T4 and FGf2 in the CAM model. The pro-angiogenesis effect of either FGF2 or T4 was completely blocked by the specific monoclonal antibody LM609 at 10 µg (Figure 4a and 4b).

El ensayo CAM se ha utilizado para validar la actividad angiogénica de varios factores de crecimiento y otros promotores o inhibidores de la angiogénesis. En los presentes estudios, se ha demostrado que T4 en concentraciones fisiológicas era pro-angiogénico, con actividad comparable a la de FGF2. La presencia de PTU no redujo el efecto de T4, lo que indica que la desyodación de T4 para generar T3 no era un requisito previo de este modelo. Puesto que la aparición de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en este modelo necesita varios días, los autores asumen que el 25 efecto de la hormona tiroidea fue completamente dependiente de la interacción del receptor nuclear de la hormona tiroidea (TR). Las acciones de las yodotironinas que requieren la complejación intranuclear de TR con su ligando natural, T3, son, por definición, genómicas, y culminan en la expresión génica. Por otra parte, la respuesta preferente de este sistema modelo a T4 en lugar de a T3, el ligando natural de TR, suscita la posibilidad de que la angiogénesis pudiera iniciarse de forma no genómica en la membrana plasmática mediante T4 y culminar con efectos que requieren la transcripción génica. Las acciones no genómicas de T4 se han descrito ampliamente, se suelen iniciar en la membrana plasmática y se pueden mediar mediante rutas de transducción de la señal. No necesitan la unión del ligando intranuclear de yodotironina y TR, pero pueden intervenir o modular la transcripción génica. Las acciones no genómicas de los esteroides también se han descrito correctamente, y se sabe que intervienen en las acciones genómicas de los esteroides o de otros compuestos. Los experimentos realizados con T4 y tetrac o con agarosa-T4 The CAM assay has been used to validate the angiogenic activity of several growth factors and other promoters or inhibitors of angiogenesis. In the present studies, it has been shown that T4 in physiological concentrations was pro-angiogenic, with activity comparable to that of FGF2. The presence of PTU did not reduce the effect of T4, indicating that the deiodination of T4 to generate T3 was not a prerequisite of this model. Since the appearance of new blood vessel growth in this model takes several days, the authors assume that the effect of the thyroid hormone was completely dependent on the interaction of the nuclear thyroid hormone receptor (TR). The actions of iodothyronines that require intranuclear complexation of TR with its natural ligand, T3, are, by definition, genomic, and culminate in gene expression. On the other hand, the preferred response of this model system to T4 instead of T3, the natural TR ligand, raises the possibility that angiogenesis could be initiated non-genomically on the plasma membrane by T4 and culminated with effects that require gene transcription The non-genomic actions of T4 have been widely described, usually initiated in the plasma membrane and can be mediated by signal transduction pathways. They do not need the binding of the intranuclear ligand of iodothyronine and TR, but they can intervene or modulate gene transcription. The non-genomic actions of steroids have also been described correctly, and are known to be involved in the genomic actions of steroids or other compounds. Experiments performed with T4 and tetrac or with agarose-T4

35 indicaron que el efecto proangiogénico de T4, muy probablemente, se iniciaba en la membrana plasmática. Los autores han demostrado en otra parte que el tetrac bloquea los efectos de T4 iniciados por la membrana, pero no activa por sí mismo la transducción de la señal. Por tanto, es una prueba de las acciones no genómicas de la hormona tiroidea. Se cree que agarosa-T4 no consigue penetrar en el interior celular, y los autores y otros investigadores la han utilizado para examinar posibles acciones de la hormona iniciadas en la superficie celular. 35 indicated that the proangiogenic effect of T4, most likely, began in the plasma membrane. The authors have shown elsewhere that tetrac blocks the effects of T4 initiated by the membrane, but does not activate signal transduction by itself. Therefore, it is a proof of the non-genomic actions of thyroid hormone. It is believed that agarose-T4 fails to penetrate the cell interior, and the authors and other researchers have used it to examine possible actions of the hormone initiated on the cell surface.

Estos resultados sugieren que otra consecuencia de la activación de MAPK por la hormona tiroidea es el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Esto último se inicia de forma no genómica, pero por supuesto requiere un complejo programa de transcripción génica consecuente. These results suggest that another consequence of MAPK activation by thyroid hormone is the growth of new blood vessels. The latter begins non-genomically, but of course requires a complex program of consistent gene transcription.

45 Las concentraciones ambientales de la hormona tiroidea son relativamente estables. El modelo CAM, en el momento en que lo ensayaron los autores, era tiroprivador y, por tanto, se puede considerar como un sistema que no reproduce el organismo intacto. Los inventores proponen que los niveles de T4 en circulación sirven, con varios otros reguladores, para modular la sensibilidad de los vasos a los factores angiogénicos endógenos, tales como VEGF y FGF2. 45 The environmental concentrations of thyroid hormone are relatively stable. The CAM model, at the time the authors tested it, was a tyroprivator and, therefore, can be considered as a system that does not reproduce the intact organism. The inventors propose that the levels of T4 in circulation serve, with several other regulators, to modulate the sensitivity of the vessels to endogenous angiogenic factors, such as VEGF and FGF2.

Ensayo de angiogénesis tridimensional Three-dimensional angiogenesis test

Brotes de angiogénesis tridimensional in vitro de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC) cultivadas sobre microperlas portadores recubiertas de fibrina: Outbreaks of in vitro three-dimensional angiogenesis of human dermal microvascular vascular endothelial cells (HDMEC) cultured on fibrin-coated carrier microbeads:

55 HDMEC confluentes (pasos 5-10) se mezclaron con perlas Cytodex-3 recubiertas de gelatina con una relación de 40 células por perla. Células y perlas (150-200 perlas por pocillos y placa de 24 pocillos) se suspendieron en 5 ml de EBM 55 confluent HDMECs (steps 5-10) were mixed with gelatin coated Cytodex-3 beads with a ratio of 40 cells per bead. Cells and pearls (150-200 pearls per well and 24-well plate) were suspended in 5 ml of EBM

+ suero humano normal al 15 %, se mezclaron suavemente cada hora durante las primeras 4 horas, después se dejaron en cultivo en una incubadora con CO2 durante la noche. Al día siguiente, se añadieron 10 ml de EBM + SH al 5 % reciente, y la mezcla se cultivó durante 3 horas más. Antes de los experimentos, se comprobó el cultivo de EC-perlas; a continuación se añadieron 500 u de PBS a un pocillo de la placa de 24 pocillos, t se añadieron al PBS 100 u del cultivo de EC-perlas. Se contó el número de perlas, y se calculó la concentración de EC/perlas. + 15% normal human serum, mixed gently every hour for the first 4 hours, then left in culture in a CO2 incubator overnight. The next day, 10 ml of fresh 5% EBM + SH was added, and the mixture was cultured for a further 3 hours. Before the experiments, the culture of EC-beads was checked; then 500 u of PBS was added to a well of the 24-well plate, t was added to PBS 100 u of the EC-pearl culture. The number of beads was counted, and the concentration of EC / beads was calculated.

Se preparó una solución de fibrinógeno (1 mg/ml) en medio EBM con o sin factores de angiogénesis o factores de ensayo. Para el control positivo, se utilizaron 50 ng/ml de VEGF + 25 ng/ml de FGF2. Las EC-perlas se lavaron dos 65 veces con medio EBM, y las EC-perlas se añadieron a la solución de fibrinógeno. El experimento se realizó por triplicado para cada condición. Las EC-perlas se mezclaron suavemente en la solución de fibrinógeno, y se añadieron A fibrinogen solution (1 mg / ml) was prepared in EBM medium with or without angiogenesis factors or test factors. For the positive control, 50 ng / ml of VEGF + 25 ng / ml of FGF2 were used. EC-beads were washed twice 65 with EBM medium, and EC-beads were added to the fibrinogen solution. The experiment was performed in triplicate for each condition. EC-beads were mixed gently in the fibrinogen solution, and added

imagen35image35

2,5 ul de trombina humana (0,05 U/ul) a 1 ml de solución de fibrinógeno; 300 ul se transfirieron inmediatamente a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. La solución de fibrinógeno polimeriza en 5-10 minutos; transcurridos 20 minutos, los inventores añadieron EBM + suero humano normal al 20 % + 10 ug/ml de aprotinina. La placa se incubó en una incubadora de CO2. Las HDMEC tardaron aproximadamente 24-48 horas en invadir el gel de fibrina y formar tubos. 2.5 ul of human thrombin (0.05 U / ul) to 1 ml of fibrinogen solution; 300 ul were immediately transferred to each well of a 24-well plate. The fibrinogen solution polymerizes in 5-10 minutes; After 20 minutes, the inventors added EBM + 20% normal human serum + 10 ug / ml aprotinin. The plate was incubated in a CO2 incubator. The HDMEC took approximately 24-48 hours to invade the fibrin gel and form tubes.

5 Un ensayo de angiogénesis in vitro con microportadores previamente diseñado para investigar el comportamiento angiogénico de las células endoteliales de la arteria pulmonar bovina en geles de fibrina bovina [Nehls y Drenckhahn, 1995 a, b] se modificó para el estudio de la angiogénesis de células endoteliales microvasculares humanas en entornos ECM tridimensionales (Figuras 1 y 2). En resumen, fibrinógeno humano, aislado tal como se ha descrito anteriormente [Feng et al, 1999], se disolvió en medio M199 a una concentración de 1 mg/ml (pH 7,4) y se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,22 micrómetros. Se preparó una solución isotónica de colágeno 1,5 mg/ml por mezcla de Vitrogen 100 estéril en medio 5X M199 y agua destilada. El pH se ajustó a 7,4 mediante NaOH 1 N. En algunos experimentos, se añadieron factores de crecimiento y proteínas ECM (tales como VEGF, bFGF, PDGF-BB, suero, gelatina, y fibronectina) a las soluciones de fibrinógeno o colágeno. A continuación se añadieron 5 An in vitro microcarrier angiogenesis assay previously designed to investigate the angiogenic behavior of bovine pulmonary artery endothelial cells in bovine fibrin gels [Nehls and Drenckhahn, 1995 a, b] was modified for the study of cell angiogenesis Human microvascular endothelial in three-dimensional ECM environments (Figures 1 and 2). In summary, human fibrinogen, isolated as described previously [Feng et al, 1999], was dissolved in M199 medium at a concentration of 1 mg / ml (pH 7.4) and sterilized by filtration through a filter of 0.22 micrometers. An isotonic solution of 1.5 mg / ml collagen was prepared by mixing sterile Vitrogen 100 in 5X M199 medium and distilled water. The pH was adjusted to 7.4 by 1N NaOH. In some experiments, growth factors and ECM proteins (such as VEGF, bFGF, PDGF-BB, serum, gelatin, and fibronectin) were added to the fibrinogen or collagen solutions. . Then they were added

15 aproximadamente 500 EC-perlas a las soluciones de fibrinógeno 1 mg/ml o colágeno 1,5 mg/ml. Posteriormente, la suspensión de EC-perlas-colágeno o EC-perlas-fibrinógeno (500 EC-perlas/ml) se sembró en placa de 24 pocillos a 300 ul/pocillo. Los cultivos EC-perla-colágeno se incubaron a 37 ºC para formar un gel. La gelificación de los cultivos de EC-perla-fibrina se produjo en menos de 5 minutos a temperatura ambiente después de la adición de trombina a una concentración final de 0,5 U/ml. Tras la gelificación, se añadió a cada pocillo 1 ml de medio de ensayo reciente (EBM suplementado con suero humano normal al 20 % para HDMEC o EBM suplementado con suero de feto de ternera al 10 %). La respuesta angiogénica se controló visualmente y se registró mediante captura de imagen de video. Específicamente, se observó la formación de brotes de capilares, que se registró con un microscopio invertido Nikon Diaphot-TMD (Nikon Inc.; Melville, NY), provisto de un alojamiento de incubadora con un termostato Nikon NP-2 y un mezclador de flujo de dióxido de carbono Sheldon nº 2004. El microscopio estaba conectado directamente a un Approximately 500 EC-beads to the 1 mg / ml fibrinogen or 1.5 mg / ml collagen solutions. Subsequently, the suspension of EC-beads-collagen or EC-beads-fibrinogen (500 EC-beads / ml) was seeded in a 24-well plate at 300 ul / well. EC-pearl-collagen cultures were incubated at 37 ° C to form a gel. The gelation of the EC-pearl-fibrin cultures occurred in less than 5 minutes at room temperature after the addition of thrombin at a final concentration of 0.5 U / ml. After gelation, 1 ml of fresh test medium (EBM supplemented with 20% normal human serum for HDMEC or EBM supplemented with 10% calf serum) was added to each well. The angiogenic response was monitored visually and recorded by video image capture. Specifically, the formation of capillary outbreaks was observed, which was recorded with a Nikon Diaphot-TMD inverted microscope (Nikon Inc .; Melville, NY), provided with an incubator housing with a Nikon NP-2 thermostat and a flow mixer of carbon dioxide Sheldon No. 2004. The microscope was connected directly to a

25 sistema de video compuesto por una cámara de video Dage-MTI CCD-72S y un monitor de video Sony 12" PVM-122 conectado a un ordenador Macintosh G3. Las imágenes se capturaron a diferentes aumentos mediante Adobe Photoshop. El efecto de los factores angiogénicos sobre la angiogénesis de los brotes se cuantificó visualmente mediante la determinación del número y porcentaje de EC-perlas en los brotes capilares. Se contaron cien perlas (de cinco a seis campos aleatorios de baja potencia) en cada uno de los pozos triplicados para cada condición experimental. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. 25 video system consisting of a Dage-MTI CCD-72S video camera and a Sony 12 "PVM-122 video monitor connected to a Macintosh G3 computer. Images were captured at different magnifications using Adobe Photoshop. The effect of factors Angiogenic on the angiogenesis of the outbreaks was visually quantified by determining the number and percentage of EC-pearls in the capillary outbreaks One hundred pearls (from five to six low-power random fields) were counted in each of the triplicate wells for each experimental condition All experiments were repeated at least three times.

Cultivo celular. Cell culture.

La línea celular de fibroblastos de mono verde africano, CV-1 (ATCC, Manassas, VA), que carece del receptor nuclear The African green monkey fibroblast cell line, CV-1 (ATCC, Manassas, VA), lacking the nuclear receptor

35 de la hormona tiroidea, se sembró a 5000 células/cm2 y se mantuvo en DMEM, suplementado con FBS térmicamente inactivado al 10 % (v/v), 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, y L-glutamina 2 mM. Todos los reactivos de cultivo se obtuvieron de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA). Los cultivos se mantuvieron en una cámara humidificada a 37 ºC con CO2 al 5 %. El medio se cambió cada tres días y las líneas celulares se pasaron a una confluencia del 80 %. Para el tratamiento experimental, las células se sembraron en placas de cultivo celular de 10 cm (Coming Incorporated, Coming, NY) y se dejaron crecer durante 24 h en medio que contiene FBS al 10 %. A continuación las células se lavaron dos veces con suero salino tamponado con fosfato (PBS) y se alimentaron con DMEM exento de suero suplementado con penicilina, estreptomicina, y HEPES. Después de 48 h de incubación en medio exento de suero, las células se trataron con un vehículo de control (concentración final de KOH 0,004 N KOH con polietilenglicol al 0,4 % [v/v]) o T4 (concentración final 10-7 M) durante 30 min; a continuación se recogieron los 35 of the thyroid hormone, was seeded at 5000 cells / cm2 and maintained in DMEM, supplemented with 10% thermally inactivated FBS (v / v), 100 U / ml penicillin, 100 µg / ml streptomycin, and L- 2 mM glutamine. All culture reagents were obtained from Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA). The cultures were kept in a humidified chamber at 37 ° C with 5% CO2. The medium was changed every three days and the cell lines were passed at a confluence of 80%. For experimental treatment, the cells were seeded in 10 cm cell culture plates (Coming Incorporated, Coming, NY) and allowed to grow for 24 h in medium containing 10% FBS. The cells were then washed twice with phosphate buffered saline (PBS) and fed with serum-free DMEM supplemented with penicillin, streptomycin, and HEPES. After 48 h of incubation in serum-free medium, the cells were treated with a control vehicle (final concentration of 0.004 N KOH with 0.4% polyethylene glycol [v / v]) or T4 (final concentration 10-7 M) for 30 min; then the

45 medios, y se determinaron los niveles de T4 libre mediante inmunoensayo enzimático. Los cultivos incubados con una concentración total de 10-7 M de T4 tienen 10-9 a 10-10 M de T4 libre. Tras el tratamiento, las células se recogieron y las proteínas nucleares se prepararon tal como se ha descrito anteriormente. 45 media, and free T4 levels were determined by enzymatic immunoassay. Cultures incubated with a total concentration of 10-7 M of T4 have 10-9 to 10-10 M of free T4. After treatment, the cells were collected and nuclear proteins were prepared as described above.

Transfecciones transitorias con ARNip. Transient transfections with siRNA.

Células -1 se sembraron en placas de 10 cm (150.000 células/placa) y se incubaron durante 24 h en DMEM suplementado con FBS al 10 %. Las células se lavaron con OPTI-MEM (Ambion, Austin, TX) y se transfectaron con ARNip (concentración final 100 nM) hasta αV, β3, o αV y β3 juntos usando siPORT (Ambion) de acuerdo con las directrices del fabricante. Se transfectaron conjuntos adicionales de células CV-1 con un ARNip codificado para servir Cells -1 were seeded in 10 cm plates (150,000 cells / plate) and incubated for 24 h in DMEM supplemented with 10% FBS. The cells were washed with OPTI-MEM (Ambion, Austin, TX) and transfected with siRNA (final 100 nM concentration) to αV, β3, or αV and β3 together using siPORT (Ambion) according to the manufacturer's guidelines. Additional sets of CV-1 cells were transfected with an siRNA encoded to serve

55 como control negativo. Cuatro horas después de la transfección, se añadieron a las placas 7 ml de medio que contenía FBS al 10 % y se dejó incubar los cultivos durante la noche. A continuación, las células se lavaron con PBS y se colocaron en DMEM exento de suero durante 48 antes de su tratamiento con T4. 55 as a negative control. Four hours after transfection, 7 ml of medium containing 10% FBS was added to the plates and the cultures were allowed to incubate overnight. The cells were then washed with PBS and placed in serum-free DMEM for 48 before treatment with T4.

Aislamiento del ARN y RT-PCR. RNA isolation and RT-PCR.

El ARN total se extrajo de los cultivos 72 h después de la transfección usando el kit RNeasy de Qiagen (Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Doscientos nanogramos del ARN total se sometieron a transcripción inversa con el sistema Access RT-PCR (Promega, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores se basaban en secuencias publicadas específicas de la especie: αV (número de acceso NM-002210) 65 F-5’-TGGGATTGTGGAAGGAG y R-5’-AAATC-CCTGTCCATCAGCAT (producto de 319 pb), β3 (NM000212) F-5’-GTGTGAGTGCTCAGAGGAG y R-5’-CTGACT-CAATCTCGTCACGG (producto de 515 pb), y GAPDH Total RNA was extracted from the cultures 72 h after transfection using the RNeasy kit from Qiagen (Valencia, CA) according to the manufacturer's instructions. Two hundred nanograms of total RNA underwent reverse transcription with the Access RT-PCR system (Promega, Madison, WI) according to the manufacturer's instructions. The primers were based on species-specific published sequences: αV (accession number NM-002210) 65 F-5'-TGGGATTGTGGAAGGAG and R-5'-AAATC-CCTGTCCATCAGCAT (319 bp product), β3 (NM000212) F- 5'-GTGTGAGTGCTCAGAGGAG and R-5'-CTGACT-CAATCTCGTCACGG (515 bp product), and GAPDH

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(AF261085) F-5’-GTCAGTGGTGGACCTGACCT y R-5’-TGAGCTTGACMGTGGTCG (producto de 212 pb). La RT-PCR se realizó en el ciclador término Flexigene eom TECHNE (Burlington, NJ). Después de una incubación de 2 minutos a 95 ºC, se realizaron 25 ciclos de las siguientes etapas: desnaturalización a 94 ºC durante 1 min, hibridación a 57 ºC durante 1 min, y extensión durante 1 min a 68 ºC durante 25 ciclos. Los productos de la PCR se visualizaron en (AF261085) F-5’-GTCAGTGGTGGACCTGACCT and R-5’-TGAGCTTGACMGTGGTCG (product of 212 bp). RT-PCR was performed in the term Flexigene eom TECHNE cycler (Burlington, NJ). After a 2 minute incubation at 95 ° C, 25 cycles of the following steps were performed: denaturation at 94 ° C for 1 min, hybridization at 57 ° C for 1 min, and extension for 1 min at 68 ° C for 25 cycles. PCR products were visualized in

5 un gel de agarosa al 1,8 % (p/v) teñido con bromuro de etidio. 5 a 1.8% (w / v) agarose gel stained with ethidium bromide.

Transferencia Western. Western transfer

Alícuotas de proteínas nucleares (10 µg/banda) se mezclaron con el tampón de muestra Laemmli y se separaron mediante SDS-PAGE (gel de resolución al 10 %) y después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Tras bloquear con leche desnatada al 5 % en suero salino tamponado con Tris que contenía Tween 20 al 1 % (TBST) durante 30 min, las membranas se incubaron con una dilución 1:1000 de un anticuerpo monoclonal dirigido a la quinasa MAP p44/42 fosforilada (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) en TBST con leche al 5 % durante la noche a 4 ºC. Después de 3 lavados de 10 min con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpo de cabra dirigido Aliquots of nuclear proteins (10 µg / band) were mixed with the Laemmli sample buffer and separated by SDS-PAGE (10% resolution gel) and then transferred to nitrocellulose membranes. After blocking with 5% skim milk in Tris buffered saline containing 1% Tween 20 (TBST) for 30 min, the membranes were incubated with a 1: 1000 dilution of a monoclonal antibody directed at MAP p44 / 42 kinase phosphorylated (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) in TBST with 5% milk overnight at 4 ° C. After 3 10 min washes with TBST, the membranes were incubated with targeted goat antibody

15 contra Ig de conejo conjugado con HRP (dilución 1:1000) de DakoCytomation (Carpinteria, CA) en TBST con leche al 5 % durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron 3 veces durante 5 min con TBST y las proteínas inmunorreactivas se detectaron mediante quimioluminiscencia (ECL, Amersham). La intensidad de la banda se determinó usando el sistema de captura de imagen VersaDoc 5000 (Bio-Rad, Hercules, CA). 15 against rabbit Ig conjugated with HRP (1: 1000 dilution) of DakoCytomation (Carpinteria, CA) in TBST with 5% milk for 1 h at room temperature. The membranes were washed 3 times for 5 min with TBST and the immunoreactive proteins were detected by chemiluminescence (ECL, Amersham). The intensity of the band was determined using the VersaDoc 5000 image capture system (Bio-Rad, Hercules, CA).

Ensayo de unión a radioligando. Radioligand binding assay.

Dos µg de αV 3 purificado se mezcló con las concentraciones indicadas de compuestos de ensayo y se dejaron incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Se añadió a continuación [125I]-T4 (2 µCi) y la mezcla se dejó incubar durante 30 min más a 20 ºC. Las muestras se mezclaron con tampón de muestra (glicerol al 50 %, Tris-HCl 0,1 M, pH Two µg of purified αV 3 was mixed with the indicated concentrations of test compounds and allowed to incubate for 30 min at room temperature. [125I] -T4 (2 µCi) was then added and the mixture was allowed to incubate for an additional 30 min at 20 ° C. The samples were mixed with sample buffer (50% glycerol, 0.1 M Tris-HCl, pH

25 6,8, y azul de bromofenol) y se analizaron en gel nativo básico al 5 % durante 24 h a 45 mA en frío. El equipo se desmontó, y los geles se colocaron sobre el papel filtrante, se envolvieron con una envoltura de plástico, y se expusieron a la película. La intensidad de la banda se determinó usando el sistema de captura de imagen VersaDoc 5000. 6.8, and bromophenol blue) and analyzed in 5% basic native gel for 24 h at 45 mA cold. The equipment was disassembled, and the gels were placed on the filter paper, wrapped with plastic wrap, and exposed to the film. The intensity of the band was determined using the VersaDoc 5000 image capture system.

Ensayo en la membrana corioalantoidea de pollito (CAM) (estudios con αVβ3). Chorioallantoid chick membrane (CAM) assay (studies with αVβ3).

Embriones de pollo de diez días de edad se adquirieron de SPAFAS (Preston, CT) y se incubaron a 37 ºC con una humedad relativa del 55 %. Se utilizó una aguja hipodérmica para practicar un pequeño orificio en el extremo romo del huevo, y se practicó un segundo orificio en el lado ancho del huevo, directamente sobre una parte avascular de la 35 membrana embriónica. Se aplicó una succión suave al primer orificio para desplazar el saco de aire y sacar la CAM de la cáscara. Con un perfilador modelo Dremel (Dremel, Racine, WI), se recortó una ventana de aproximadamente 1,0 cm 2 en la cáscara sobre el falso saco de aire, permitiendo el acceso a la CAM. Se pretrataron discos estériles de papel de filtro nº 1 (Whatman, Clifton, NJ) con 3 mg/ml de acetato de cortisona y propiltiouracilo 1 mM y se secaron al aire en condiciones de esterilidad. Se aplicaron la hormona tiroidea, los disolventes de control y el mAb LM609 a los discos que se secaron a continuación. Después, los discos se suspendieron en PBS y se colocaron sobre CAM en crecimiento. Después de incubar durante 3 días, la CAM bajo el disco filtrante se resecó y se lavó con PBS. Cada membrana se colocó en una placa Petri de 35 mm y se examinó con un estereomicroscopio SV6 con un aumento de 50X. Las imágenes digitales se capturaron y se analizaron con el programa informático Image-Pro (Mediacybemetics). Se contaron el número de puntos de ramificación de los vasos incluidos en una región circular igual a la del disco Ten-day-old chicken embryos were purchased from SPAFAS (Preston, CT) and incubated at 37 ° C with a relative humidity of 55%. A hypodermic needle was used to make a small hole in the blunt end of the egg, and a second hole was made on the wide side of the egg, directly over an avascular part of the embryonic membrane. A gentle suction was applied to the first hole to move the airbag and remove the CAM from the shell. With a Dremel model profiler (Dremel, Racine, WI), a window of approximately 1.0 cm 2 was cut in the shell over the false airbag, allowing access to the CAM. Sterile discs of filter paper # 1 (Whatman, Clifton, NJ) were pretreated with 3 mg / ml cortisone acetate and 1 mM propylthiouracil and air dried under sterile conditions. Thyroid hormone, control solvents and LM609 mAb were applied to the discs which were then dried. Then, the discs were suspended in PBS and placed on growing CAM. After incubating for 3 days, the CAM under the filter disc was dried and washed with PBS. Each membrane was placed on a 35 mm Petri dish and examined with an SV6 stereomicroscope with a 50X magnification. The digital images were captured and analyzed with the Image-Pro software (Mediacybemetics). The number of branching points of the vessels included in a circular region equal to that of the disk were counted

45 filtrante. Se contó una imagen de cada una de las preparaciones de 8-10 CAM para cada condición de tratamiento, y además, cada experimento se realizó 3 veces. 45 filter. An image of each of the 8-10 CAM preparations was counted for each treatment condition, and in addition, each experiment was performed 3 times.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. The invention will be further illustrated by the following examples.

Ejemplos Examples

Ejemplo 1. Efecto de la hormona tiroidea sobre la angiogénesis: Tal como se observa en la Figura 1A y se resume en la Figura 1B, tanto L-T4 como L-T3 potenciaron la angiogénesis en el ensayo CAM. T4, a una concentración fisiológica total en el medio de 0,1 µmol/l, aumentó la formación de ramificaciones en los vasos sanguíneo en 2,5 veces Example 1. Effect of thyroid hormone on angiogenesis: As seen in Figure 1A and summarized in Figure 1B, both L-T4 and L-T3 enhanced angiogenesis in the CAM assay. T4, at a total physiological concentration in the medium of 0.1 µmol / l, increased the formation of branches in the blood vessels by 2.5 times

55 (P<0,001). T3 (1 nmol/l) también estimuló la angiogénesis en 2 veces. La posibilidad de que T4 solamente fuera eficaz debido a la conversión de T4 en T3 mediante la 5’-monodeyodinasa celular se descartó por el hallazgo de que el inhibidor de la deyodinasa PTU no tenía efecto inhibidor sobre la angiogénesis producida mediante T4. PTU se aplicó a todos los discos filtrantes en el modelo CAM. Por tanto, T4 y T3 estimulan la formación de nuevas ramas en los vasos sanguíneos en un modelo CAM normalizado anteriormente para el ensayo de factores de crecimiento. 55 (P <0.001). T3 (1 nmol / l) also stimulated angiogenesis twice. The possibility that T4 was only effective due to the conversion of T4 to T3 by means of cellular 5'-monodeiodine was ruled out by the finding that the PTU deiodinase inhibitor had no inhibitory effect on the angiogenesis produced by T4. PTU was applied to all filter discs in the CAM model. Therefore, T4 and T3 stimulate the formation of new branches in the blood vessels in a CAM model previously standardized for the growth factor test.

Ejemplo 2. Efectos de T4-agarosa y Tetrac: Los inventores habían demostrado anteriormente que T4-agarosa estimula las rutas celulares de transducción de la señal iniciadas en la membrana plasmática de la misma manera que T4, y que las acciones de T4 y T4-agarosa quedan bloqueadas mediante el análogo de yodotironina desaminado, tetrac, que se sabe que inhibe la unión de T4 a las membranas plasmáticas. En el modelo CAM la adición de tetrac 65 (0,1 µmol/l) inhibió la acción de T4 (Figura 2A), pero el tetrac en solitario no tuvo efectos sobre la angiogénesis (Figura 2C). La acción de T4-agarosa, añadido a una concentración de hormona de 0,1 µmol/l, fue comparable a la de T4 en el Example 2. Effects of T4-agarose and Tetrac: The inventors had previously shown that T4-agarose stimulates cell signal transduction pathways initiated in the plasma membrane in the same manner as T4, and that the actions of T4 and T4- Agarose are blocked by the deaminated iodothyronine analog, tetrac, which is known to inhibit the binding of T4 to plasma membranes. In the CAM model, the addition of tetrac 65 (0.1 µmol / l) inhibited the action of T4 (Figure 2A), but tetrac alone had no effect on angiogenesis (Figure 2C). The action of T4-agarose, added at a hormone concentration of 0.1 µmol / l, was comparable to that of T4 in the

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modelo CAM (Figura 2B), y el efecto de T4-agarosa también quedó inhibido por la acción del tetrac (Figura 2B; resumido en 2C). CAM model (Figure 2B), and the effect of T4-agarose was also inhibited by the action of tetrac (Figure 2B; summarized in 2C).

Ejemplo 3. Potenciación de la actividad proangiogénica de FGF2 mediante una concentración submáxima de Example 3. Enhancement of the proangiogenic activity of FGF2 by a submaximal concentration of

5 T4: La angiogénesis es un proceso complejo que habitualmente requiere la participación de factores de crecimiento polipeptídicos. El ensayo CAM requiere al menos 48 horas para que se manifieste el crecimiento de vasos; por lo tanto, es probable que los efectos aparentes sobre la membrana plasmática de la hormona tiroidea en este modelo sean resultado de una respuesta transcripcional compleja a la hormona. Por tanto, los inventores determinaron si FGF2 5 T4: Angiogenesis is a complex process that usually requires the participation of polypeptide growth factors. The CAM test requires at least 48 hours for the growth of vessels to manifest; therefore, the apparent effects on the plasma membrane of thyroid hormone in this model are likely to result from a complex transcriptional response to the hormone. Therefore, the inventors determined whether FGF2

10 estaba implicado en la respuesta a la hormona y si la hormona podría potenciar el efecto de niveles subfisiológicos de este factor de crecimiento. T4 (0,05 µmol/l) y FGF2 (0,5 µg/ml) estimularon individualmente la angiogénesis en un grado modesto (Figura 3). El efecto angiogénico de esta concentración submáxima de FGF2 quedó potenciado mediante una concentración subfisiológica de T4 hasta el nivel producido por 1,0 µg de FGF2 en solitario. Por tanto, los efectos de las concentraciones submáximas de la hormona y del factor de crecimiento parecen ser aditivos. Para 10 was involved in the response to the hormone and if the hormone could potentiate the effect of subphysiological levels of this growth factor. T4 (0.05 µmol / l) and FGF2 (0.5 µg / ml) individually stimulated angiogenesis to a modest degree (Figure 3). The angiogenic effect of this submaximal concentration of FGF2 was enhanced by a subphysiological concentration of T4 to the level produced by 1.0 µg of FGF2 alone. Therefore, the effects of submaximal hormone and growth factor concentrations appear to be additive. For

15 definir con más precisión el papel de FGF2 en la estimulación de la angiogénesis por la hormona tiroidea, se añadió un anticuerpo policlonal dirigido contra FGF2 a los filtros tratados con FGF2 o T4, y se midió la angiogénesis después de 72 horas. La Figura 4 demuestra que el anticuerpo de FGF2 inhibió la angiogénesis estimulada bien por FGF2 o por T4 en ausencia de FGF2 exógeno, lo que sugiere que el efecto de T4 en el ensayo CAM estuvo mediado por una mayor expresión de FGF2. El anticuerpo IgG de control no tuvo efecto estimulador o inhibidor en el ensayo CAM. 15 defining more precisely the role of FGF2 in the stimulation of angiogenesis by thyroid hormone, a polyclonal antibody directed against FGF2 was added to filters treated with FGF2 or T4, and angiogenesis was measured after 72 hours. Figure 4 demonstrates that the FGF2 antibody inhibited angiogenesis stimulated either by FGF2 or by T4 in the absence of exogenous FGF2, suggesting that the effect of T4 in the CAM assay was mediated by increased FGF2 expression. The control IgG antibody had no stimulatory or inhibitory effect in the CAM assay.

20 twenty

Ejemplo 4. Estimulación de la liberación de FGF2 desde las células endoteliales mediante la hormona tiroidea: Example 4. Stimulation of the release of FGF2 from endothelial cells by thyroid hormone:

Los niveles de FGF2 se midieron en el medio de células endoteliales ECV304 tratadas bien con T4 (0,1 µmol/l) o T3 (0,01 µmol/l) durante 3 días. Como puede observarse en la Tabla 2, T3 estimuló la concentración de FGF2 3,6 veces en el medio, mientras que T4 causó un aumento de 1,4 veces. Este hallazgo indica que la hormona tiroidea puede FGF2 levels were measured in the middle of ECV304 endothelial cells treated well with T4 (0.1 µmol / L) or T3 (0.01 µmol / L) for 3 days. As can be seen in Table 2, T3 stimulated the concentration of FGF2 3.6 times in the medium, while T4 caused an increase of 1.4 times. This finding indicates that thyroid hormone may

25 potenciar el efecto angiogénico de FGF2, al menos en parte, mediante un aumento en la concentración de factor de crecimiento disponible para las células endoteliales. 25 enhance the angiogenic effect of FGF2, at least in part, by increasing the concentration of growth factor available to endothelial cells.

Tabla 2. Efecto de T4 y T3 sobre la liberación de FGF2 desde las células endoteliales ECV304 Table 2. Effect of T4 and T3 on the release of FGF2 from ECV304 endothelial cells

Tratamiento de la célula FGF2 (pg/ml/106 células) FGF2 cell treatment (pg / ml / 106 cells)

Control 27,7 ± 3,1 Control 27.7 ± 3.1

T3 (0,01 µmol/l) 98.8 ± 0,5* T3 (0.01 µmol / l) 98.8 ± 0.5 *

T3 + PD 98059 (2 µmol/l) 28,4 ± 3,2 T3 + PD 98059 (2 µmol / l) 28.4 ± 3.2

T3 + PD 98059 (20 µmol/l) 21,7 ± 3,5 T3 + PD 98059 (20 µmol / l) 21.7 ± 3.5

T4 (0,1 µmol/l) 39,2 ± 2,8Ϯ T4 (0.1 µmol / l) 39.2 ± 2.8Ϯ

T4 +PD 98059 (2 µmol/l) 26,5 ± 4,5 T4 + PD 98059 (2 µmol / l) 26.5 ± 4.5

T4 + PD 98059 (20 µmol/l) 23,2 ± 4,8 T4 + PD 98059 (20 µmol / l) 23.2 ± 4.8

*P<0,001, comparación de las muestras tratadas con T3 con las muestras de control mediante ANOVA; ϮP<0,05, comparación de las muestras tratadas con T4 con las muestras de control mediante ANOVA. * P <0.001, comparison of the samples treated with T3 with the control samples by ANOVA; ϮP <0.05, comparison of the samples treated with T4 with the control samples by ANOVA.

30 Ejemplo 5. Papel de la ruta de transducción de la señal ERK1/2 en la estimulación de la angiogénesis mediante la hormona tiroidea y FGF2: Una ruta mediante la cual T4 ejerce un efecto no genómico sobre las células es la cascada de transducción de la señal MAPK, específicamente la de la activación de ERK1/2. Se sabe que T4 potencia la activación de ERK1/2 mediante el factor de crecimiento epidérmico. El papel de la ruta MAPK en la estimulación de la expresión de FGF2 mediante la hormona tiroidea se examinó mediante el uso de PD 98059 (2 a 30 Example 5. Role of the ERK1 / 2 signal transduction pathway in the stimulation of angiogenesis by thyroid hormone and FGF2: One route by which T4 exerts a non-genomic effect on cells is the transduction cascade of the MAPK signal, specifically that of the activation of ERK1 / 2. T4 is known to potentiate the activation of ERK1 / 2 by epidermal growth factor. The role of the MAPK pathway in stimulating the expression of FGF2 by thyroid hormone was examined by using PD 98059 (2 a

35 20 µmol/l), un inhibidor de la activación de ERK1/2 mediante las tirosina-treonina quinasas MAPK quinasa-1 (MEK1) y MEK2. Los datos de la tabla demuestran que PD 98059 bloquea eficazmente el aumento de la liberación de FGF2 desde las células endoteliales ECV304 tratadas con cualquiera de T4 o T3. Se realizaron estudios paralelos sobre la inhibición de ERK1/2 en los ensayos CAM, y los resultados representativos se muestran en la Figura 5. Una combinación de T3 y T4, cada uno en concentraciones fisiológicas, produjo un aumento de 2,4 veces en la ramificación 20 µmol / l), an inhibitor of the activation of ERK1 / 2 by tyrosine-threonine kinases MAPK kinase-1 (MEK1) and MEK2. The data in the table demonstrate that PD 98059 effectively blocks the increase in FGF2 release from ECV304 endothelial cells treated with either T4 or T3. Parallel studies were carried out on the inhibition of ERK1 / 2 in CAM trials, and the representative results are shown in Figure 5. A combination of T3 and T4, each in physiological concentrations, produced a 2.4-fold increase in branch

40 de los vasos sanguíneos, un efecto que quedó completamente bloqueado mediante 3 µmol/l de PD 98059 (Figura 5A). La estimulación mediante FGF2 de la formación de ramificaciones (2,2 veces) también quedó bloqueada de forma eficaz mediante este inhibidor de la activación de ERK1/2 (Figura 5B). Por tanto, el efecto proangiogénico de la hormona tiroidea se inicia en la membrana plasmática e implica la activación de la ruta ERK1/2 para estimular la liberación de FGF2 desde las células endoteliales. La activación de ERK1/2 se requiere de nuevo para transducir la 40 of the blood vessels, an effect that was completely blocked by 3 µmol / l of PD 98059 (Figure 5A). FGF2 stimulation of branching (2.2 times) was also effectively blocked by this ERK1 / 2 activation inhibitor (Figure 5B). Therefore, the proangiogenic effect of thyroid hormone begins in the plasma membrane and involves the activation of the ERK1 / 2 pathway to stimulate the release of FGF2 from endothelial cells. The activation of ERK1 / 2 is required again to transduce the

45 señal FGF2 y ocasionar la formación de nuevos vasos sanguíneos. 45 FGF2 signal and cause the formation of new blood vessels.

Ejemplo 6. Acción de la hormona tiroidea y FGF2 sobre la activación de MAPK La estimulación de la fosforilación y la translocación nuclear de los MAPK de ERK1/2 se estudiaron en células ECV304 tratadas con T4 (10-7 mol/l) durante 15 minutos a 6 horas. La aparición del ERK1/2 fosforilado en los núcleos celulares se produjo a los 15 minutos 50 del tratamiento con T4, alcanzó un nivel máxima a los 30 minutos, y siguió siendo evidente a las 6 horas (Figura 6A). Este efecto de la hormona quedó inhibido por PD 98059 (Figura 6B), un resultado a esperar porque este compuesto bloquea la fosforilación de ERK1/2 mediante la quinasa MAPK. El inhibidor tradicional de la proteína quinasa C (PKC)-α, PKC-β, y PKC-γ, CGP41251, también bloqueó el efecto de la hormona sobre la activación de MAPK en estas células, como los inventores han observado con T4 en otras líneas celulares. La hormona tiroidea potencia la acción 55 de varias citoquinas y factores de crecimiento, tal como el interferón-γ13 y el factor de crecimiento epidérmico. En las Example 6. Action of thyroid hormone and FGF2 on MAPK activation. Stimulation of phosphorylation and nuclear translocation of ERK1 / 2 MAPKs were studied in ECV304 cells treated with T4 (10-7 mol / l) for 15 minutes. 6 hours The appearance of phosphorylated ERK1 / 2 in the cell nuclei occurred at 15 minutes 50 of T4 treatment, reached a maximum level at 30 minutes, and remained evident at 6 hours (Figure 6A). This effect of the hormone was inhibited by PD 98059 (Figure 6B), a result to be expected because this compound blocks the phosphorylation of ERK1 / 2 by MAPK kinase. The traditional protein kinase C (PKC) -α, PKC-β, and PKC-γ inhibitor, CGP41251, also blocked the hormone's effect on MAPK activation in these cells, as the inventors have observed with T4 in others. cell lines Thyroid hormone potentiates the action of several cytokines and growth factors, such as interferon-γ13 and epidermal growth factor. In the

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células ECV304, T4 potenció la activación de MAPK causada por FGF2 tras una incubación simultánea de 15 minutos (Figura 6C). Aplicando las observaciones realizadas con las células ECV304 al modelo CAM, los inventores proponen que el complejo mecanismo mediante el cual la hormona induce la angiogénesis incluye la liberación de FGF2 por las células endoteliales y la potenciación del efecto autocrino del FGF2 liberado sobre la angiogénesis. ECV304, T4 cells potentiated the activation of MAPK caused by FGF2 after a simultaneous incubation of 15 minutes (Figure 6C). Applying the observations made with the ECV304 cells to the CAM model, the inventors propose that the complex mechanism by which the hormone induces angiogenesis includes the release of FGF2 by endothelial cells and the potentiation of the autocrine effect of FGF2 released on angiogenesis.

5 Ejemplo 7. RT-PCR en células ECV304 tratadas con la hormona tiroidea: La cuestión final abordada en los estudio s del mecanismo de la acción proangiogénica de T4 fue si la hormona puede inducir la expresión génica de FGF2. Las células endoteliales se trataron con T4 (10-7 mol/l) de 6 a 48 horas, y realizó la estimación del ARN de FGF2 y GAPDH según la RT-PCR (inferido a partir de las medidas de ADNc, Figura 7). Fue evidente un aumento en el ADNc de FGF2, 5 Example 7. RT-PCR in ECV304 cells treated with thyroid hormone: The final issue addressed in the studies of the mechanism of proangiogenic action of T4 was whether the hormone can induce gene expression of FGF2. The endothelial cells were treated with T4 (10-7 mol / l) for 6 to 48 hours, and estimated the FGF2 and GAPDH RNA according to the RT-PCR (inferred from the cDNA measurements, Figure 7). An increase in the FGF2 cDNA was evident,

10 corregido para el contenido de GAPDH, a las 6 horas del tratamiento con la hormona que se potenció adicionalmente a las 48 horas. 10 corrected for the content of GAPDH, at 6 hours of treatment with the hormone that was further potentiated at 48 hours.

Ejemplo 8A. Modelo de neovascularización retinal en ratones (diabéticos y no diabéticos): Para evaluar la actividad farmacológica de un artículo de ensayo sobre la neovascularización retinal, se expusieron crías de ratón a un Example 8A Retinal neovascularization model in mice (diabetic and non-diabetic): To evaluate the pharmacological activity of a test article on retinal neovascularization, mouse pups were exposed to a

15 entorno con alto contenido en oxígeno durante 7 días y se dejaron recuperar, estimulando de esta manera la formación de nuevos vasos en la retina. Se evaluaron los artículos de ensayo para determinar si la neovascularización retinal quedaba suprimida. Las retinas se examinaron con tinción de hematoxilina-eosina y con al menos un tinte, lo que demuestra la neovascularización (normalmente un tinte de Selectin). Otros tintes (tal como PCNA, PAS, GFAP, marcadores de la angiogénesis, etc.). Se indica a continuación un resumen del modelo: 15 environment with high oxygen content for 7 days and were allowed to recover, thus stimulating the formation of new vessels in the retina. The test articles were evaluated to determine if retinal neovascularization was suppressed. The retinas were examined with hematoxylin-eosin staining and with at least one dye, which demonstrates neovascularization (usually a Selectin dye). Other dyes (such as PCNA, PAS, GFAP, markers of angiogenesis, etc.). A summary of the model is indicated below:

20 Modelo animal 20 Animal model

• Crías de ratón (P7) y sus madres se colocaron en un entorno hiperoxigenado (70-80 %) durante 7 días. • Mouse pups (P7) and their mothers were placed in a hyperoxygenated environment (70-80%) for 7 days.

• •

En P12, los ratones se retiraron del entorno oxigenado y se colocaron en un entorno normal 25 • Se dejó durante 5-7 días que los ratones se recuperaran. At P12, the mice were removed from the oxygenated environment and placed in a normal environment 25 • It was left for 5-7 days for the mice to recover.

• •

Después, los ratones se sacrificaron y se recogieron los ojos. Then, the mice were sacrificed and the eyes were collected.

• •

Los ojos bien se congelaron o se fijaron según fue adecuado Eyes were either frozen or fixed as appropriate.

• •

Los ojos se tiñeron con tintes histoquímicos adecuados The eyes were stained with suitable histochemical dyes

• •

Los ojos se tiñeron con tintes inmunohistoquímicos adecuados 30 • Se pueden recoger la sangre, el suero u otros tejidos The eyes were stained with appropriate immunohistochemical dyes 30 • Blood, serum or other tissues can be collected

• Los ojos, con referencia especial a las alteraciones microvasculares, se examinaron para descubrir todos y cada uno de los hallazgos. El crecimiento neovascular se puntuó de forma semicuantitativa. El análisis por imágenes también está disponible. • The eyes, with special reference to microvascular alterations, were examined to discover each and every one of the findings. Neovascular growth was scored semiquantitatively. Image analysis is also available.

35 Ejemplo 8B: Hormona tiroidea y retinopatía diabética 35 Example 8B: Thyroid hormone and diabetic retinopathy

Se usó un protocolo descrito en J de la Cruz et al., J Pharmacol Exp Ther 280:454-459, 1997, para la administración de Tetrac a ratas que tenían diabetes inducida por estreptozotocina (STZ) y retinopatía diabética. El criterio de valoración es la inhibición mediante Tetrac de la aparición de la retinopatía proliferativa (angiogénesis). A protocol described in J de la Cruz et al., J Pharmacol Exp Ther 280: 454-459, 1997, was used for the administration of Tetrac to rats having streptozotocin-induced diabetes (STZ) and diabetic retinopathy. The assessment criterion is Tetrac inhibition of the occurrence of proliferative retinopathy (angiogenesis).

40 Ejemplo 9 A. Cicatrización de heridas y tratamiento hemostático usando la formulación farmacéutica polimérica novedosa de hormona tiroidea y sus análogos Example 9 A. Wound healing and hemostatic treatment using the novel polymeric pharmaceutical formulation of thyroid hormone and its analogues

La divulgación incluye también un tratamiento hemostático y de cicatrización de heridas novedoso que incluye un The disclosure also includes a novel hemostatic and wound healing treatment that includes a

45 análogo de hormona tiroidea inmovilizado, preferentemente análogos de T4, cloruro de calcio, y colágeno. Esta formulación novedosas controla de forma significativa las hemorragias tanto venosas como arteriales, reduce el tiempo de sangrado, genera un tapón de fibrina/plaquetas, libera factores de cicatrización de heridas derivados de plaquetas de manera sostenida en presencia de un bajo nivel de colágeno, y seguro. El desarrollo de dicho apósito hemostático y de cicatrización de heridas puede ser muy valioso para uso a corto y largo plazo en la atención sanitaria de bajas en Immobilized thyroid hormone analogue, preferably analogues of T4, calcium chloride, and collagen. This novel formulation significantly controls both venous and arterial hemorrhages, reduces bleeding time, generates a fibrin / platelet plug, releases wound healing factors from platelets steadily in the presence of a low level of collagen, and sure. The development of such hemostatic dressing and wound healing can be very valuable for short-term and long-term use in health care for casualties in

50 combate. Se puede optimizar la formulación farmacéutica de la L-tiroxina inmovilizada (T4) y el hexasacárido globular en un hidrogel o apósito que contiene colágeno y cloruro de calcio. Este tratamiento hemostático y de cicatrización de heridas (formulación WH) en hidrogel o apósito también puede incluir la adición de un microbicida. 50 fights The pharmaceutical formulation of immobilized L-thyroxine (T4) and globular hexasaccharide in a hydrogel or dressing containing collagen and calcium chloride can be optimized. This hemostatic and wound healing treatment (WH formulation) in hydrogel or dressing can also include the addition of a microbicide.

La L-tiroxina conjugada con un polímero o inmovilizada sobre agarosa ha demostrado una estimulación potente de la L-thyroxine conjugated to a polymer or immobilized on agarose has demonstrated potent stimulation of

55 angiogénesis mediante la activación de los receptores de adhesión en la superficie celular (integrina αvβ3) que conduce a la activación de un evento de señalización intracelular, que a su vez conduce a una regulación en exceso de varias producciones de factor de crecimiento. Además, el T4 inmovilizado induce la migración celular epitelial de fibroblastos y de queratinocitos. El T4 inmovilizado, pero no el T3 u otros análogos, potencian la agregación y secreción de plaquetas inducidas por colágeno, que estimularía la formación del tapón plaquetario del propio sujeto. Angiogenesis by activating adhesion receptors on the cell surface (αvβ3 integrin) that leads to the activation of an intracellular signaling event, which in turn leads to overregulation of several growth factor productions. In addition, immobilized T4 induces epithelial cell migration of fibroblasts and keratinocytes. The immobilized T4, but not the T3 or other analogs, enhance the aggregation and secretion of collagen-induced platelets, which would stimulate the formation of the platelet plug of the subject itself.

60 Además, el T4 inmovilizado también estimula la migración de células sanguíneas, lo que podría ser fundamental para luchar contra las infecciones. De este modo, el T4 inmovilizado puede ayudar al organismo a fabricar más de un compuesto utilizado para regenerar los vasos sanguíneos dañados, y también aumenta la cantidad de leucocitos que producen radicales libres en el sitio de la herida. Los radicales libres ayudan a eliminar las bacterias potencialmente patógenas de una herida. 60 In addition, immobilized T4 also stimulates blood cell migration, which could be essential to fight infection. In this way, immobilized T4 can help the body make more than one compound used to regenerate damaged blood vessels, and also increases the amount of leukocytes that produce free radicals at the wound site. Free radicals help eliminate potentially pathogenic bacteria from a wound.

65 Por tanto, T4 o T4-agarosa (10-100 nM), pero no T3, DIPTA, o GC-1, es eficaz para potenciar la agregación y la secreción de plaquetas (desgranulación). Por consiguiente, T4 (o sus análogos y conjugaciones poliméricas, por ejemplo, T4-agarosa), junto con cloruro de calcio 10 mM, y con o sin colágeno, se prefiere para la cicatrización de heridas. Véanse las Figs. 23A-E. Therefore, T4 or T4-agarose (10-100 nM), but not T3, DIPTA, or GC-1, is effective in enhancing platelet aggregation and secretion (degranulation). Therefore, T4 (or its polymer analogs and conjugates, for example, T4-agarose), together with 10 mM calcium chloride, and with or without collagen, is preferred for wound healing. See Figs. 23A-E.

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5 5

TROMBOELASTOGRAFÍA: TROMBOELASTOGRAPHY:

La tromboelastografía (TEG) se ha utilizado en varios escenarios hospitalarios desde su desarrollo por Hartert en 1948. El principio de la TEG se basa en la medición de la propiedad física viscoelasticidad del coágulo sanguíneo. La formulación del coágulo se sigue a 37 ºC en una cubeta cilíndrica oscilante de plástico ("copa") y un pistón estacionario suspendido de forma estacionaria ("púa") con 1 mm de separación entre las superficies, usando un tromboelastógrafo informatizado (TEG Modelo 3000, Haemoscope, Skokie, IL). La copa oscila en cualquier dirección cada 4,5 segundos, con un periodo estacionario en la parte intermedia del ciclo de 1 segundo; que da como resultado una frecuencia de 0,1 Hz y una velocidad de cizalla máxima de 0,1 por segundo. La púa está suspendida mediante un alambre de torsión que Thromboelastography (TEG) has been used in several hospital settings since its development by Hartert in 1948. The principle of TEG is based on the measurement of the viscoelastic physical property of the blood clot. The clot formulation is followed at 37 ° C in a plastic oscillating cylindrical cuvette ("cup") and a stationary piston stationary ("barb") with 1 mm separation between the surfaces, using a computerized thromboelastograph (TEG Model 3000, Haemoscope, Skokie, IL). The cup oscillates in any direction every 4.5 seconds, with a stationary period in the middle part of the 1 second cycle; which results in a frequency of 0.1 Hz and a maximum shear rate of 0.1 per second. The spike is suspended by a torsion wire that

15 actúa como transducción del par de giro. Cuando se forma el coágulo, las fibrillas de fibrina unen físicamente la copa a la púa y la rotación de la copa se ve afectada por la viscoelasticidad del coágulo (que se transmite a la púa), lo que se visualiza en línea mediante un ordenador personal IBM compatible y un programa informático personalizado (Haemoscope Corp., Skokie, IL). El par de giro que experimenta la púa (con respecto a la oscilación de la copa) se representa gráficamente en función del tiempo. 15 acts as transduction of the torque. When the clot forms, fibrin fibrils physically attach the cup to the spike and the rotation of the cup is affected by the clot's viscoelasticity (which is transmitted to the spike), which is displayed online using a personal computer IBM compatible and a customized computer program (Haemoscope Corp., Skokie, IL). The torque that the spike experiences (with respect to the oscillation of the cup) is plotted as a function of time.

TEG evalúa la coagulación midiendo varios parámetros tales como la latencia de tiempo para la iniciación inicial del coágulo (R), el tiempo hasta la iniciación de un coágulo de firmeza fija (k) de aproximadamente 20 mm de amplitud, la cinética del desarrollo del coágulo medida a partir del ángulo (α), y la amplitud máxima del coágulo (MA). El parámetro A mide la anchura de la trazada en cualquier punto del MA. La amplitud A en mm es función de la resistencia o TEG evaluates coagulation by measuring several parameters such as the latency of time for the initial initiation of the clot (R), the time until the initiation of a fixed firmness clot (k) of approximately 20 mm in width, the kinetics of the clot development measured from the angle (α), and the maximum amplitude of the clot (MA). Parameter A measures the width of the plot at any point in the MA. The amplitude A in mm is a function of the resistance or

25 elasticidad del coágulo. La amplitud de la trazada del TEG es una medida de la rigidez del coágulo; la resistencia máxima o el módulo elástico de cizalla que alcanza el coágulo, G, es función de la rigidez del coágulo y se puede calcular a partir de la amplitud máxima (MA) de la trazada del TEG. 25 elasticity of the clot. The amplitude of the TEG plot is a measure of the stiffness of the clot; The maximum resistance or elastic shear modulus that reaches the clot, G, is a function of the stiffness of the clot and can be calculated from the maximum amplitude (MA) of the TEG plot.

Se midieron los siguientes parámetros a partir de la trazada del TEG: The following parameters were measured from the TEG plot:

• •

R, el tiempo de reacción  R, the reaction time

• •

Amplitud máxima (MA, en mm), es la rigidez máxima manifestada por el coágulo. Maximum amplitude (MA, in mm), is the maximum stiffness manifested by the clot.

• •

Modulo elástico de cizalla o resistencia del coágulo (G, dinas/cm2) está definido por: G = (5000A) / (100-A). Elastic shear modulus or clot resistance (G, dynes / cm2) is defined by: G = (5000A) / (100-A).

35 La firmeza del coágulo es un parámetro importante de la trombosis y hemostasia in vivo ya que el coágulo debe soportar la tensión de cizalla en el punto de la lesión vascular. El TEG puede evaluar la eficacia de diferentes intervenciones farmacológicas sobre diferentes factores (activación de la coagulación, generación de trombina, formación de fibrina, activación de plaquetas, interacción plaquetas-fibrina, y polimerización de la fibrina) implicados en la formación y retracción del coágulo. El efecto de la endotoxina (0,63 ug), Xa (0,25 nM), trombina (0,3 mU), y TF (25 ng) sobre los diferentes parámetros del coágulo medidos mediante TEG informatizado sobre sangre humana completa se muestra en la Tabla 3. 35 Clot firmness is an important parameter of thrombosis and hemostasis in vivo since the clot must withstand shear stress at the point of vascular injury. The TEG can evaluate the efficacy of different pharmacological interventions on different factors (coagulation activation, thrombin generation, fibrin formation, platelet activation, platelet-fibrin interaction, and fibrin polymerization) involved in the formation and retraction of the clot . The effect of endotoxin (0.63 ug), Xa (0.25 nM), thrombin (0.3 mU), and TF (25 ng) on the different clot parameters measured by computerized TEG on whole human blood is shown in Table 3.

Extracción de muestras de sangre: Se extrajo sangre de voluntarios que otorgaron su consentimiento según un Blood sample collection: Blood was taken from volunteers who gave their consent according to a

45 protocolo aprobado por el Human Investigations Committee del William Beaumont Hospital. Usando el método de las dos jeringas, se extrajeron las muestras mediante una aguja de mariposa calibre 21, y se descartaron los primeros 3 ml de sangre. La sangre completa (WB) se recogí en tubos Vacutainer siliconados (Becton Dickinson, Rutherford, NJ que contenían citrato trisódico al 3,8 % de tal forma que se mantuvo la relación de citrato a sangre completa de 1:9 (v/v). El TEG se realizó en las 3 horas posteriores a la extracción de sangre. Se volvió a añadir calcio a 1-2,5 mM seguido por la adición de diferentes estímulos. El cloruro de calcio por sí mismo a la concentración utilizada demostró solamente un efecto mínimo sobre la formación del coágulo y la resistencia del coágulo. 45 protocol approved by the Human Investigations Committee of the William Beaumont Hospital. Using the method of the two syringes, the samples were extracted using a 21 gauge butterfly needle, and the first 3 ml of blood was discarded. Whole blood (WB) was collected in silicone Vacutainer tubes (Becton Dickinson, Rutherford, NJ containing 3.8% trisodium citrate so that the citrate to whole blood ratio of 1: 9 (v / v) was maintained. The TEG was performed within 3 hours after the blood collection Calcium was added again at 1-2.5 mM followed by the addition of different stimuli Calcium chloride itself at the concentration used showed only one minimal effect on clot formation and clot resistance.

La formación de coágulo se inició mediante escisión del Fibrinopéptido A a partir de fibrinógeno. Los monómeros de fibrina resultantes polimerizan espontáneamente para formar hebras de fibrillas que experimentan extensión lineal, 55 ramificación, y asociación lateral que conduce a la formación de una red tridimensional de fibras de fibrina. Una propiedad única de las estructuras reticulares es que se comportan como sólidos elásticos sólidos, que pueden resistir esfuerzos de corte deformantes. Esta resistencia a la deformación se puede medir mediante el módulo elástico, un índice de la resistencia del coágulo. A diferencia de los ensayos de coagulación convencionales (como el tiempo de protrombina y el tiempo de tromboplastina parcial) que están basados solamente en el tiempo hasta el principio de la formación del coágulo, el TEG permite la adquisición de información cuantitativa que permite la medida de la resistencia máxima alcanzada por los coágulos. Mediante el receptor GPIIb/IIIa, las plaquetas se unen a fibrina (fibrinógeno) y modulan las propiedades viscoelásticas de los coágulos. Los resultados de los inventores demuestran que la resistencia del coágulo en TF-TEG es claramente una función de la concentración de plaquetas y las plaquetas aumentaron la resistencia del coágulo ~8 veces bajo cizalla. Diferentes antagonistas plaquetarios de GPIIb/IIIa (clase Clot formation was initiated by excision of Fibrinopeptide A from fibrinogen. The resulting fibrin monomers spontaneously polymerize to form strands of fibrils undergoing linear extension, branching, and lateral association leading to the formation of a three-dimensional network of fibrin fibers. A unique property of lattice structures is that they behave as solid elastic solids, which can withstand deformable shear stresses. This resistance to deformation can be measured by the elastic modulus, an index of clot resistance. Unlike conventional coagulation assays (such as prothrombin time and partial thromboplastin time) that are based only on time to the beginning of clot formation, the TEG allows the acquisition of quantitative information that allows the measurement of the maximum resistance reached by the clots. Through the GPIIb / IIIa receptor, platelets bind fibrin (fibrinogen) and modulate the viscoelastic properties of clots. The results of the inventors demonstrate that the clot resistance in TF-TEG is clearly a function of platelet concentration and platelets increased clot resistance ~ 8 times under shear. Different platelet antagonists of GPIIb / IIIa (class

65 I comparada con la clase II) se comportan con diferente eficacia en la inhibición de la resistencia del coágulo mediada profibrina usando TF-TEG bajo cizalla. 65 I compared to class II) behave with different efficacy in inhibiting profibrin-mediated clot resistance using TF-TEG under shear.

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Análisis estadístico Statistic analysis

Los datos se expresaron como promedio ± SEM. Los datos se analizaron mediante parejas o análisis de grupo con el test de la t de Student o ANOVA cuando fue aplicable; se consideraron diferencias significativas a P <0,05. Data were expressed as mean ± SEM. Data were analyzed by couples or group analysis with the Student t test or ANOVA when applicable; significant differences were considered at P <0.05.

Tabla 3: Efecto del cloruro de calcio comparado con el factor tisular sobre la dinámica del coágulo en sangre completa humana citrada usando TEG Table 3: Effect of calcium chloride compared to tissue factor on clot dynamics in human whole blood cited using TEG

Parámetros de TEG TEG parameters

25 ng TF + Ca2+ 2,25 mM (Promedio ± SEM) Ca2+ 10 mM (Promedio ± SEM) 25 ng TF + Ca2 + 2.25 mM (Average ± SEM) Ca2 + 10 mM (Average ± SEM)

r (min) r (min)

29,7 ± 2,3 14,5 ± 2,5* 29.7 ± 2.3 14.5 ± 2.5 *

K (min) K (min)

5,8 ± 1,0 7,0 ± 0,7 5.8 ± 1.0 7.0 ± 0.7

α (ángulo) α (angle)

45,0 ± 2,6 47,3 ± 2,7 45.0 ± 2.6 47.3 ± 2.7

MA (mm) MA (mm)

58,2 ± 1,7 56,5 ± 2,2 58.2 ± 1.7 56.5 ± 2.2

Los datos representan promedio ± SEM, n = 4, *P<0,01. Data represent average ± SEM, n = 4, * P <0.01.

Agregación plaquetaria y desgranulación en sangre completa usando la técnica de la impedancia: Se usaron en el Platelet aggregation and degranulation in whole blood using the impedance technique: They were used in the

10 estudio el agregómetro de sangre completa Modelo 560 y el programa informático asociado Aggro-Link de Chrono-Log Corporation. Se colocaron dos electrodos en sangre diluida y se envió un impulso eléctrico de uno al otro. A medida que las plaquetas se agregan alrededor de los electrodos, el Chrono-Log mide la impedancia de la señal eléctrica en ohmios de resistencia 7. 10 I study the Model 560 full blood aggregometer and the Aggro-Link associated computer program from Chrono-Log Corporation. Two electrodes were placed in diluted blood and an electrical impulse was sent from each other. As platelets are added around the electrodes, the Chrono-Log measures the impedance of the electrical signal in ohms of resistance 7.

15 Extracción de muestras de sangre: 15 Blood sample collection:

Se extrajo diariamente sangre completa de donantes sanos con edades comprendidas entre 17 y 21 en viales Vacutainer de 4,5 mililitros con citrato de sodio tamponado al 3,8 % (Becton Dickinson, Rutherford, Nueva Jersey). La sangre se mantuvo en un agitador oscilante para aumentar la vida de las plaquetas, y los experimentos se realizaron 20 en las 5 horas posteriores a la flebotomía. Procedimiento: Para el control, 500 microlitros de sangre completa, 500 microlitros de suero salino al 0,9 %, y una barrita agitadora magnética se mezclaron en una cubeta, y se calentaron durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Se indujo la agregación sub-umbral con 5 microlitros de colágeno 1-2 µg/ml, con medidas de 6-7 minutos del agregómetro. Los efectos de T4, T4-agarosa comparado con T3 y otros análogos de la hormona tiroidea sobre la agregación y secreción inducidas por colágeno. Ingerman-Wojenski C, Smith Whole blood was collected daily from healthy donors between the ages of 17 and 21 in Vacutainer vials of 4.5 milliliters with 3.8% buffered sodium citrate (Becton Dickinson, Rutherford, New Jersey). The blood was kept on a rocking shaker to increase the life of platelets, and the experiments were performed 20 in the 5 hours after phlebotomy. Procedure: For the control, 500 microliters of whole blood, 500 microliters of 0.9% saline, and a magnetic stir bar were mixed in a bucket, and heated for five minutes at 37 degrees Celsius. Sub-threshold aggregation was induced with 5 microliters of collagen 1-2 µg / ml, with measurements of 6-7 minutes of the aggregometer. The effects of T4, T4-agarose compared with T3 and other thyroid hormone analogs on collagen-induced aggregation and secretion. Ingerman-Wojenski C, Smith

25 JB, Silver MJ. Evaluation of electrical aggregometry: comparison with optical aggregometry, secretion of ATP, and accumulation of radiolabeled platelets. J Lab Clin Med. 1983 Jan;101(1):44-52. 25 JB, Silver MJ. Evaluation of electrical aggregometry: comparison with optical aggregometry, secretion of ATP, and accumulation of radiolabeled platelets. J Lab Clin Med. 1983 Jan; 101 (1): 44-52.

Ensayo de migración celular. Cell migration test.

30 Los granulocitos humanos se aislaron de sangre de oveja por el método de Mousa et al., y los ensayos de migración celular se realizaron como se ha descrito anteriormente (Methods In Cell Science, 19 (3): 179-187, 1997, y Methods In Cell Science 19 (3): 189-195, 1997). En resumen, se usará una cámara de quimiotaxia desechable de 96 pocillos Neuroprobe con un tamaño de poro de 8 µm. Esta cámara permite la cuantificación de la migración celular hacia un gradiente de quimioquina, citoquina o proteínas de la matriz extracelular. Se añadió la suspensión celular (45 µl de 2 x 30 Human granulocytes were isolated from sheep's blood by the method of Mousa et al., And cell migration assays were performed as described previously (Methods In Cell Science, 19 (3): 179-187, 1997, and Methods In Cell Science 19 (3): 189-195, 1997). In summary, a Neuroprobe 96-well disposable chemotaxis chamber with a pore size of 8 µm will be used. This chamber allows the quantification of cell migration to a gradient of chemokine, cytokine or extracellular matrix proteins. The cell suspension was added (45 µl of 2 x

35 106) a una placa de polipropileno que contiene 5 µl de agentes de ensayo tales como flavonoides o derivados de la hormona tiroidea y se incubó durante 10 minutos a 22 ºC. Se añadió IL8 (0,1 -100 ng) con o sin T3/ T4 (33 µl) a 0,001 -0,1 µM a los pocillos inferiores de una cámara de quimiotaxia desechable, y después se ensambla la cámara con el filtro previamente incluido en la carcasa. Se añaden 25 µl de suspensión de células/agente de ensayo a los pocillos superiores del filtro, a continuación se incubó durante la noche (22 horas a 37 ºC, CO2 al 5 %) en una incubadora de 106) to a polypropylene plate containing 5 µl of test agents such as flavonoids or thyroid hormone derivatives and incubated for 10 minutes at 22 ° C. IL8 (0.1 -100 ng) with or without T3 / T4 (33 µl) at 0.001-0.1 µM was added to the lower wells of a disposable chemotaxis chamber, and then the chamber was assembled with the previously included filter in the housing. 25 µl of cell suspension / test agent are added to the upper wells of the filter, then incubated overnight (22 hours at 37 ° C, 5% CO2) in an incubator.

40 cultivo celular humidificada. Tras la incubación durante la noche, las células no migradas y el exceso de medio se eliminaron suavemente usando una pipeta de 12 canales y un rascador celular. A continuación, los filtros se lavaron dos veces con suero salino tamponado con fosfato (PBS) y se fijaron con formaldehído al 1 % en tampón PBS. Las membranas de las células migradas se permearon con Triton X-100 (0,2 %) y a continuación se lavaron 2-3 veces con PBS. Los filamentos de actina de las células migradas se tiñeron con rodamina faloidina (12,8 IU/ml) durante 30 40 humidified cell culture. After overnight incubation, non-migrated cells and excess media were gently removed using a 12-channel pipette and a cell scraper. The filters were then washed twice with phosphate buffered saline (PBS) and fixed with 1% formaldehyde in PBS buffer. The membranes of the migrated cells were permeated with Triton X-100 (0.2%) and then washed 2-3 times with PBS. The actin filaments of the migrated cells were stained with rhodamine phalloidin (12.8 IU / ml) for 30

45 minutos (22 ºC). La rodamina faloidina se preparó nueva cada semana y se reutilizó un máximo de 3 días, y se almacenó protegida de la luz a 4 ºC. La quimiotaxia se determinó cuantitativamente mediante detección de fluorescencia usando un fluorímetro Cytofluor II con microfiltro (530 excitación / 590 emisión). Todos los tratamientos celulares y los lavados posteriores se realizaron usado una estación de tratamiento/lavado diseñada de forma única (Methods In Cell Science, 19 (3): 179-187, 1997). Esta técnica permite la cuantificación precisa de la migración celular 45 minutes (22 ° C). The rhodamine phalloidin was prepared fresh every week and reused for a maximum of 3 days, and stored protected from light at 4 ° C. Chemotaxia was quantitatively determined by fluorescence detection using a Cytofluor II fluorimeter with microfilter (530 excitation / 590 emission). All cell treatments and subsequent washes were performed using a uniquely designed treatment / washing station (Methods In Cell Science, 19 (3): 179-187, 1997). This technique allows precise quantification of cell migration

50 y proporciona resultados reproducibles con una variabilidad mínima inter e intraensayo. 50 and provides reproducible results with minimal inter and intraassay variability.

Ensayos de migración celular: Cell Migration Assays:

Estos ensayos se realizaron usando una cámara de quimiotaxia desechable de 96 pocillos Neuroprobe con un tamaño These tests were performed using a Neuroprobe 96-well disposable chemotaxis chamber with a size

55 de poro de 8 µm. Esta cámara permite la cuantificación de la migración celular hacia un gradiente de vitronectina u osteopontina. Las células cultivadas se retiraron siguiendo un método normalizado usando EDTA / Tripsina (0,01 % / 0,025 %). Tras la retirada, las células se lavaron dos veces y se resuspendieron (2x106/ml) en EBM (medio basocelular endotelila, Clonetics Inc.). Se añadió vitronectina u osteopontina (33 µl) a 0.0125 -100 µg/ml a los pocillos inferiores de 55 pore of 8 µm. This chamber allows the quantification of cell migration to a gradient of vitronectin or osteopontin. Cultured cells were removed following a standardized method using EDTA / Trypsin (0.01% / 0.025%). After removal, the cells were washed twice and resuspended (2x106 / ml) in EBM (endothelial basal cell medium, Clonetics Inc.). Vitronectin or osteopontin (33 µl) at 0.0125 -100 µg / ml was added to the lower wells of

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una cámara de quimiotaxia desechable, ay después se ensambla la cámara con el filtro previamente incluido en la carcasa. Se añadió la suspensión celular (45 µl) a una placa de polipropileno que contiene 5 µl de agente de ensayo a diferentes concentraciones y se incubó durante 10 minutos a 22 ºC. Se añaden 25 µl de suspensión de células/agente de ensayo a los pocillos superiores del filtro, a continuación se incubó durante la noche (22 horas a 37 ºC) en una 5 incubadora de cultivo celular humidificada. Tras la incubación durante la noche, las células no migradas y el exceso de medio se eliminaron suavemente usando una pipeta de 12 canales y un rascador celular. Los filtros se lavaron dos veces en PBS (sin Ca+2 o Mg+2) y se fijaron con formaldehído al 1 %. Las membranas de las células migradas se permearon con Triton X-100 (0,2 %) y a continuación se lavaron 2-3 veces con PBS. Los filamentos de actina de las células migradas se tiñeron con rodamina faloidina (12,8 IU/ml) durante 30 minutos (22 ºC). La rodamina faloidina se 10 preparó nueva cada semana y se reutilizó un máximo de 3 días, y se almacenó protegida de la luz a 4 ºC. La quimiotaxia se determinó cuantitativamente mediante detección de fluorescencia usando un equipo Cytofluor II (530 excitación / 590 emisión). Todos los tratamientos celulares y los lavados posteriores se realizaron usado una estación de tratamiento/lavado diseñada de forma única. Esta estación estaba compuesta de seis unidades de reactivo independientes, cada una de ellas con una capacidad de 30 ml de volumen. Las unidades individuales se llenaron con a disposable chemotaxis chamber, and then the chamber is assembled with the filter previously included in the housing. The cell suspension (45 µl) was added to a polypropylene plate containing 5 µl of test agent at different concentrations and incubated for 10 minutes at 22 ° C. 25 µl of cell suspension / test agent are added to the upper wells of the filter, then incubated overnight (22 hours at 37 ° C) in a humidified cell culture incubator. After overnight incubation, non-migrated cells and excess media were gently removed using a 12-channel pipette and a cell scraper. The filters were washed twice in PBS (without Ca + 2 or Mg + 2) and fixed with 1% formaldehyde. The membranes of the migrated cells were permeated with Triton X-100 (0.2%) and then washed 2-3 times with PBS. The actin filaments of the migrated cells were stained with rhodamine phalloidin (12.8 IU / ml) for 30 minutes (22 ° C). Phenoidin rhodamine was prepared fresh every week and reused for a maximum of 3 days, and stored protected from light at 4 ° C. Chemotaxia was quantitatively determined by fluorescence detection using a Cytofluor II device (530 excitation / 590 emission). All cell treatments and subsequent washings were performed using a uniquely designed treatment / washing station. This station was composed of six independent reagent units, each with a capacity of 30 ml volume. Individual units were filled with

15 uno de los siguientes reactivos: PBS, formaldehído, Triton X-100, o rodamina-faloidina. Usando esta técnica, los filtros se sumergieron suavemente en la solución adecuada, minimizando de esta forma la pérdida de células. Esta técnica permitió la cuantificación máxima de la migración celular y proporciona resultados reproducibles con una variabilidad mínima inter e intraensayo (1,2). One of the following reagents: PBS, formaldehyde, Triton X-100, or rhodamine-phalloidin. Using this technique, the filters were gently immersed in the appropriate solution, thus minimizing cell loss. This technique allowed maximum quantification of cell migration and provides reproducible results with minimal inter and intra-assay variability (1,2).

20 Migración hacia la vitronectina de la proteína de la matriz extracelular 20 Vitronectin migration of extracellular matrix protein

Tratamientos (Unidades de fluorescencia) + SD Migración EC promedio Treatments (Fluorescence Units) + SD Average EC Migration

A. Migración no específica Sin matriz en LC 270 ± 20 A. Non-specific migration Without matrix in LC 270 ± 20

B. Vitronectina (25 ug) en LC 6.116 ± 185 B. Vitronectin (25 ug) in LC 6,116 ± 185

C. T3 (0,1 uM) UC / Vitronectina (25 ug) en LC 22.016 ± 385 C. T3 (0.1 uM) UC / Vitronectin (25 ug) in LC 22.016 ± 385

D. T4 (0,1 uM) UC / Vitronectina (25 ug) en LC 13.083 ± 276 C + XT199 (10 uM) 4.550 ± 225 D + XT199 (10 uM) 3.890 ± 420 C + PD (0,8 ug) 7.555 ± 320 D + PD (0,8 ug) 6.965 ± 390 D. T4 (0.1 uM) UC / Vitronectin (25 ug) in LC 13.083 ± 276 C + XT199 (10 uM) 4.550 ± 225 D + XT199 (10 uM) 3.890 ± 420 C + PD (0.8 ug) 7,555 ± 320 D + PD (0.8 ug) 6,965 ± 390

LC = cámara inferior, UC = cámara superior LC = lower chamber, UC = upper chamber

Se obtuvieron datos similares con otros antagonistas potentes y específicos de avb3 tales como LM609 y SM256 Similar data were obtained with other potent and specific avb3 antagonists such as LM609 and SM256

25 Ejemplo 9B. Cicatrización de heridas in vitro en epitelio y fibroblastos humanos: El método bidimensional de cicatrización de heridas in vitro es como se ha descrito en Mohamed S, Nadijcka D, Hanson, V. Wound healing properties of cimetidine in vitro. Drug Intell Clin Pharm 20: 973-975; 1986. Adicionalmente, se utilizará un método tridimensional de cicatrización de heridas ya establecido en el laboratorio de los inventores (véase más adelante). Los 25 Example 9B. In vitro wound healing in epithelium and human fibroblasts: The two-dimensional method of wound healing in vitro is as described in Mohamed S, Nadijcka D, Hanson, V. Wound healing properties of cimetidine in vitro. Drug Intell Clin Pharm 20: 973-975; 1986. Additionally, a three-dimensional wound healing method already established in the inventors' laboratory will be used (see below). The

30 datos muestran una potente estimulación de la cicatrización de heridas mediante la hormona tiroidea. 30 data show a potent stimulation of wound healing by thyroid hormone.

Ensayo tridimensional in vitro de cicatrización de heridas en células de fibroblastos dérmicos humanos: Three-dimensional in vitro test of wound healing in human dermal fibroblast cells:

Etapa 1: Preparar geles de colágeno contraídos: Stage 1: Prepare collagen gels contracted:

35 1) Revestir una placa de 24 pocillos con 350 ul de BSA al 2 % a TA durante 2 h, 2) NHDF confluentes al 80 % (células de fibroblastos dérmicos normales humanos, Paso 5-9) se tripsinizaron y neutralizaron con medio de crecimiento, se centrifugaron y lavaron una vez con PBS 3) Preparar una mezcla de colágeno-célula, mezclar suavemente y siempre sobre hielo: 1) Coat a 24-well plate with 350 ul of 2% BSA at RT for 2 h, 2) 80% confluent NHDF (human normal dermal fibroblast cells, Step 5-9) were trypsinized and neutralized with medium growth, centrifuged and washed once with PBS 3) Prepare a collagen-cell mixture, mix gently and always on ice:

Solución madre Concentración final Stock solution Final concentration

5xDMEC 1xDMEM 3 mg/ml de vitrogén 2 mg/ml ddH2O óptimo NHDF 2x10-5 células/ml FBS 1% 5xDMEC 1xDMEM 3 mg / ml vitrogén 2 mg / ml ddH2O optimal NHDF 2x10-5 cells / ml FBS 1%

40 4) Aspirar BSA al 2 % de la placa de 24 pocillos, añadir la mezcla de colágeno-célula 350 ul/pocillo, e incubar la placa en una incubadora a 37º C con CO2. 5) Después de 1 h, añadir medio DMEM+FBS al 5 %, 0,5 ml/pocillo, con una punta de 10 ul. Despegar el gel de colágeno del borde de cada pocillo, incubar después durante 2 días. Las células de fibroblastos contraerán el gel de 40 4) Aspirate 2% BSA from the 24-well plate, add the collagen-cell mixture 350 ul / well, and incubate the plate in a 37º C incubator with CO2. 5) After 1 h, add DMEM medium + 5% FBS, 0.5 ml / well, with a 10 ul tip. Peel the collagen gel from the edge of each well, then incubate for 2 days. Fibroblast cells will contract the gel

45 colágeno Etapa 2: Preparar el coágulo tridimensional de fibrina de la herida, y embeberlo en el cultivo de colágeno dañado 1) Preparar la solución de fibrinógeno (1 mg/ml) con o sin reactivos de ensayo. 350 ul de solución de fibrinógeno para cada pocillo en un tubo eppendorf. 45 Collagen Stage 2: Prepare the three-dimensional wound fibrin clot, and embed it in the damaged collagen culture 1) Prepare the fibrinogen solution (1 mg / ml) with or without test reagents. 350 ul of fibrinogen solution for each well in an eppendorf tube.

50 fifty

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Solución madre Concentración final Stock solution Final concentration

5xDMEC 1xDMEM Fibrinógeno 1 mg/ml ddH2O óptimo reactivos de ensayo concentración óptima FBS 1%o5% 5xDMEC 1xDMEM Fibrinogen 1 mg / ml ddH2O optimal test reagents optimal concentration FBS 1% or 5%

2) Recortar cada gel ge colágeno contraído en su parte central con unas tijeras. Lavar el gel con PBS y transferir el gel al centro de cada pocillo de la placa de 24 pocillos 5 3) Añadir 1,5 ul de trombina humana (0,25 U/ul) a cada tubo, mezclar bien y después añadir la solución alrededor del gel de colágeno, la solución polimerizará en 10 min. 2) Cut each collagen ge gel contracted in its central part with scissors. Wash the gel with PBS and transfer the gel to the center of each well of the 24-well plate 5 3) Add 1.5 ul of human thrombin (0.25 U / ul) to each tube, mix well and then add the solution around the collagen gel, the solution will polymerize in 10 min.

Después de 20 min, añadir DMEM+FBS al 1 % (o 5 %) con o sin agente de ensayo, 450 ul/pocillo e incubar la placa en una incubadora a 37º C con CO2 durante un máximo de 5 días. Tomas fotografías cada día. After 20 min, add DMEM + 1% FBS (or 5%) with or without test agent, 450 ul / well and incubate the plate in a 37º C incubator with CO2 for a maximum of 5 days. You take pictures every day.

10 Cicatrización de heridas in vivo en ratas diabéticas: 10 Wound healing in vivo in diabetic rats:

Los efectos de los análogos de la hormona tiroidea y sus formas conjugadas se ensayaron usando un modelo de herida aguda mediante incisión en ratas diabéticas. La tasa de cierre de heridas, análisis de resistencia a la rotura e The effects of thyroid hormone analogues and their conjugate forms were tested using an acute wound model by incision in diabetic rats. The wound closure rate, breakage resistance analysis and

15 histología se realizaron de forma periódica en los días 3-21. 15 histology were performed periodically on days 3-21.

Métodos: Methods:

Los animales (ratones y ratas) del estudio recibieron dos heridas punzantes pequeñas -se aplicó WH a una de las The animals (mice and rats) in the study received two small puncture wounds - WH was applied to one of the

20 heridas, y la otra se cubrió con un suero salino como control. Por otra parte, las heridas se dejaron cicatrizar de forma natural. 20 wounds, and the other was covered with saline as a control. On the other hand, the wounds were allowed to heal naturally.

Los animales se sometieron a eutanasia cinco días después de resultar heridos. Se extirpó una pequeña área de la piel -de 1 a 1,5 milímetros-de los bordes de las heridas tratadas y no tratadas. The animals underwent euthanasia five days after being injured. A small area of the skin - 1 to 1.5 millimeters - was removed from the edges of treated and untreated wounds.

25 Se determinó el cierre de la herida y el tiempo hasta el cierre de la herida. Adicionalmente, se determinaron los niveles de tenascina, una proteína que ayuda a construir tejido conectivo, en el tejido de granulación de las heridas. También se determinó la calidad del tejido de granulación (es decir, tejido rugoso de color rosado que normalmente se forma a medida que cicatrizan las heridas, nuevos capilares y tejido conectivo). 25 The wound closure and the time to wound closure were determined. Additionally, tenascin levels, a protein that helps build connective tissue, were determined in the granulation tissue of wounds. The quality of the granulation tissue was also determined (ie, pinkish rough tissue that normally forms as wounds, new capillaries and connective tissue heal).

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Materiales y métodos Materials and methods

Se prepararon heridas en granulación crónica por métodos bien conocidos en la técnica. Ratas Sprague Dawley macho que pesaban de 300 a 350 gramos se aclimataron durante una semana en la instalación de los inventores antes Wounds were prepared in chronic granulation by methods well known in the art. Male Dawley Sprague rats weighing 300 to 350 grams acclimatized for a week at the inventors' facility before

35 de su uso. Mediante anestesia intraperitoneal con Nembutal (35 mg/kg), el dorso de la rata se afeitó y se depiló. Los animales se enjaularon individualmente y se recibieron alimento y agua ad libitum. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices del Animal Care and Use Committee del Department of Veterans Affairs Medical Center, Albany, NY. 35 of its use. Using intraperitoneal anesthesia with Nembutal (35 mg / kg), the back of the rat was shaved and shaved. The animals were caged individually and food and water were received ad libitum. All experiments were performed according to the guidelines of the Animal Care and Use Committee of the Department of Veterans Affairs Medical Center, Albany, NY.

40 Se había realizado anteriormente la caracterización histológica de esta herida, en comparación con una herida humana en granulación crónica. A continuación, sesenta y cuatro ratas se dividieron en ocho grupos de tratamiento (n=8 / grupo). Los animales se trataron con aplicación tópica de vehículo (controles de vehículo) en los días 5, 9, 12, 15, y 18. El control de vehículo puede ser bien agarosa (Grupo 1) o la forma polimérica (Grupo 2) que se usará en la conjugación de L-tiroxina. Las heridas tratadas con T4-agarosa (Grupos 3-5) o T4-polímero (Grupos 6-8) a 1, 10, 100 40 The histological characterization of this wound had been previously performed, compared to a human wound in chronic granulation. Then, sixty-four rats were divided into eight treatment groups (n = 8 / group). Animals were treated with topical vehicle application (vehicle controls) on days 5, 9, 12, 15, and 18. The vehicle control may be either agarose (Group 1) or the polymeric form (Group 2) that is will use in conjugation of L-thyroxine. Wounds treated with T4-agarose (Groups 3-5) or T4-polymer (Groups 6-8) at 1, 10, 100

45 µg/cm2 en presencia de 10 µg de hexasacárido globular, 10 µg de colágeno, y cloruro de calcio 10 mM a aplicar por vía tópica en los días 5, 9, 12, 15, y 18. Todas las heridas se dejaron expuestas. Cada 48 se trazó sobre láminas de acetato el perfil de las heridas, y se pueden realizar cálculos de área con planimetría digital informatizada. 45 µg / cm2 in the presence of 10 µg of globular hexasaccharide, 10 µg of collagen, and 10 mM calcium chloride to be applied topically on days 5, 9, 12, 15, and 18. All wounds were left exposed. The wound profile was plotted on acetate sheets every 48 hours, and area calculations with computerized digital planimetry can be performed.

Tres tiras transversales de espesor completo de tejido de granulación se recogieron a continuación de los extremos Three full thickness transverse strips of granulation tissue were then collected from the ends

50 cefálico, intermedio y caudal de las heridas en el día 19 y se fijaron en formalina tamponada al 10 por ciento. Se tomaron secciones transversales (5 µm) de cada espécimen, que se tiñeron con hematoxilina y eosina. El espesor del tejido de granulación se puede estimar con un micrómetro óptico a bajo aumento. Los campos a aumento elevado se examinaron inmediatamente por debajo de la capa inflamatoria superficial del tejido de granulación. En cada tira de tejido de granulación, cinco campos adyacentes de alto aumento se pueden fotografiar y codificar. Copias ampliadas 50 cephalic, intermediate and caudal of the wounds on day 19 and were fixed in 10 percent buffered formalin. Cross sections (5 µm) of each specimen were taken, which were stained with hematoxylin and eosin. The thickness of the granulation tissue can be estimated with an optical micrometer at low magnification. The high magnification fields were examined immediately below the superficial inflammatory layer of the granulation tissue. In each strip of granulation tissue, five adjacent high magnification fields can be photographed and encoded. Extended copies

55 de estas exposiciones se utilizaron a continuación para el análisis histométrico de forma enmascarada. Los fibroblastos, células "redondas" (macrófagos, linfocitos, y neutrófilos), y capilares se contaron. Además, la celularidad de cada sección se puntuó según la celularidad en una escala de 1 (recuento celular bajo) a 5 (muy celular). 55 of these exposures were then used for histometric analysis in masked form. Fibroblasts, "round" cells (macrophages, lymphocytes, and neutrophils), and capillaries were counted. In addition, the cellularity of each section was scored according to the cellularity on a scale of 1 (low cell count) to 5 (very cellular).

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Análisis estadístico: Statistic analysis:

Las medidas seriadas del área se representaron gráficamente frente al tiempo. Con los datos de cada animal se ajustó una ecuación de Gompertz (r2 típico = 0,85). Usando esta curva se puede estimar la semivida de la herida. La Serial measurements of the area were plotted against time. With the data of each animal, a Gompertz equation was adjusted (typical r2 = 0.85). Using this curve, the half-life of the wound can be estimated. The

5 comparación entre grupos se realiza usando las tablas de análisis del ciclo de vida y la prueba de rango de Wilcoxon. Estos análisis estadísticos se realizaron usando los paquetes informáticos SAS (SAS/STAT Guide for Personal Computers, Versión 6 Edición, Cary, Carolina del Norte, 1987, p 1028) y BMDP (BMDP Statistical Software Manual, Los Angeles, BMDP Statistical Software, Inc. 1988) en un ordenador personal. 5 comparison between groups is performed using the life cycle analysis tables and the Wilcoxon range test. These statistical analyzes were performed using SAS software packages (SAS / STAT Guide for Personal Computers, Version 6 Edition, Cary, North Carolina, 1987, p 1028) and BMDP (BMDP Statistical Software Manual, Los Angeles, BMDP Statistical Software, Inc . 1988) on a personal computer.

10 Los recuentos celulares de los diferentes grupos de tratamiento se combinaron y se analizaron usando un análisis monolateral de la varianza. Los análisis post-hoc de las diferencias entre grupo se pueden llevar a cabo con la prueba de Tukey (ensayo de comparación múltiple completamente emparejado) donde p <0,05 se considera significativo. El programa informático de estadística Sigma Stat (Jandel Scientific, Corte Madera, California) se utilizará para el análisis de los datos. 10 Cell counts of the different treatment groups were combined and analyzed using a monolateral analysis of variance. Post-hoc analyzes of differences between groups can be carried out with the Tukey test (fully matched multiple comparison test) where p <0.05 is considered significant. The Sigma Stat software (Jandel Scientific, Corte Madera, California) will be used for data analysis.

15 Ejemplo 10. Modelo de infarto de miocardio en roedores:  15 Example 10. Model of myocardial infarction in rodents:

20 practicó una esternotomía mediana. El corazón se extrajo del cuerpo suavemente y se ató firmemente una sutura 6-O alrededor de la arteria coronaria descendente izquierda anterior. El corazón se sustituyó rápidamente en el pecho y se cerró la incisión de la toracotomía con una sutura en forma de bolsa 3-O seguido por el cierre de la piel con suturas interrumpidas o clips quirúrgicos. Los animales se colocaron sobre una manta calefactora con temperatura regulada y se observaron estrechamente durante la recuperación. Se administraron en caso necesario oxígeno suplementario y 20 practiced a median sternotomy. The heart was gently removed from the body and a 6-O suture was firmly tied around the anterior left descending coronary artery. The heart was quickly replaced in the chest and the thoracotomy incision was closed with a 3-O bag suture followed by the closure of the skin with interrupted sutures or surgical clips. The animals were placed on a heated blanket with regulated temperature and were closely observed during recovery. If necessary, supplemental oxygen and

25 resucitación cardiopulmonar. Tras la recuperación, la rata se devolvió a la instalación de cuidado animal. Dicha ligadura de la arteria coronaria produce infartos de miocardio importantes en la pared anterior. La mortalidad a las 48 h de dicho procedimiento puede ser incluso del 50 %, y existe cierta variabilidad en el tamaño del infarto producido mediante este procedimiento. Basándose en estas consideraciones, y en la experiencia anterior, para obtener 16-20 ratas con infartos importantes de forma que se puedan comparar los dos modelos de administración de la hormona 25 cardiopulmonary resuscitation. After recovery, the rat was returned to the animal care facility. Said coronary artery ligation causes major myocardial infarctions in the anterior wall. The 48-hour mortality of this procedure may even be 50%, and there is some variability in the size of the infarction produced by this procedure. Based on these considerations, and previous experience, to obtain 16-20 rats with major infarcts so that the two models of hormone administration can be compared

30 tiroidea se necesitan aproximadamente 400 ratas. Thyroid about 30 rats are needed.

Estos experimentos se diseñaron para mostrar que la administración sistémica de hormona tiroidea bien antes o después de la ligadura de la arteria coronaria conduce a efectos beneficiosos en animales intactos, incluyendo la extensión de anomalías hemodinámicas evaluadas mediante ecocardiografía y mediciones hemodinámicas, y These experiments were designed to show that systemic administration of thyroid hormone either before or after coronary artery ligation leads to beneficial effects in intact animals, including the extent of hemodynamic abnormalities evaluated by echocardiography and hemodynamic measurements, and

35 reducción en el tamaño del infarto. Se proponen medidas de los resultados a las tres semanas del infarto. Aunque algunas ratas puede que no hayan tenido infartos, o solamente se producen infartos pequeños, estas ratas se pueden identificar mediante ecocardiogramas normales y hemodinámicas normales (presión diastólica fina LV < 8 mm Hg). 35 reduction in infarct size. Measures of the results are proposed three weeks after the infarction. Although some rats may not have had heart attacks, or only small heart attacks occur, these rats can be identified by normal and normal hemodynamic echocardiograms (fine diastolic pressure LV <8 mm Hg).

Administración de la hormona tiroidea Thyroid hormone administration

40 Existen dos enfoques para administración. En el primero, la hormona tiroidea se inyectó directamente en el peri-infarto de miocardio. Como la demarcación entre el miocardio normal e isquémico se identifica fácilmente durante la oclusión aguda del tórax abierto, este enfoque proporciona suficiente administración de la hormona para detectar los efectos angiogénicos. 40 There are two approaches to administration. In the first, thyroid hormone was injected directly into the peri-myocardial infarction. As the demarcation between the normal and ischemic myocardium is easily identified during acute occlusion of the open thorax, this approach provides sufficient administration of the hormone to detect angiogenic effects.

45 Aunque el primer modelo es útil en pacientes que se han sometido a cirugía de derivación de la arteria coronaria, y constituye la prueba de principio de que una inyección local induce la angiogénesis, también se puede usar un enfoque más amplio usando un segundo modelo. En el segundo modelo, se colocó un catéter retrógrado en el ventrículo izquierdo vía una arteria carótida en la rata anestesiada antes de inducir el infarto de miocardio. Como alternativa, se 45 Although the first model is useful in patients who have undergone coronary artery bypass surgery, and it is proof of principle that a local injection induces angiogenesis, a broader approach can also be used using a second model. In the second model, a retrograde catheter was placed in the left ventricle via a carotid artery in the anesthetized rat before inducing myocardial infarction. As an alternative, it

50 realiza una punción directa de la aorta con aguja, justo por encima de la válvula aórtica. La inyección intracoronaria de la hormona tiroidea se simuló a continuación por oclusión abrupta de la aorta por encima del origen de los vasos coronario durante varios segundos, produciendo de esta forma contracciones isovolúmicas. A continuación se inyectó la hormona tiroidea en el interior del ventrículo izquierdo o la aorta inmediatamente después de la constricción aórtica. Las contracciones isovolúmicas resultantes impulsan la sangre a lo largo de los vasos coronarios perfundiendo la 50 performs a direct puncture of the aorta with a needle, just above the aortic valve. Intracoronary injection of thyroid hormone was then simulated by abrupt occlusion of the aorta above the origin of the coronary vessels for several seconds, thereby producing isovolumic contractions. The thyroid hormone was then injected into the left ventricle or aorta immediately after the aortic constriction. The resulting isovolumic contractions propel blood along the coronary vessels perfusing the

55 totalidad del miocardio con la hormona tiroidea. Este procedimiento se puede realizar tantas veces como sea necesario para conseguir la eficacia. El número de inyecciones depende de la dosis usada y la formación de nuevos vasos sanguíneos. 55 entire myocardium with thyroid hormone. This procedure can be performed as many times as necessary to achieve efficacy. The number of injections depends on the dose used and the formation of new blood vessels.

Ecocardiografía: Echocardiography:

60 Se ha desarrollado un método para obtener ecocardiogramas bidimensionales y multimodales en ratas no anestesiadas. Las dimensiones del ventrículo izquierdo, función, espesor de la pared y movimiento de la pared se pueden medir de forma reproducible y fiable. La medición se realiza de forma enmascarada para eliminar el sesgo con respecto a la administración de la hormona tiroidea. 60 A method has been developed to obtain two-dimensional and multimodal echocardiograms in non-anesthetized rats. The dimensions of the left ventricle, function, wall thickness and wall movement can be measured reproducibly and reliably. The measurement is performed in a masked way to eliminate bias with respect to thyroid hormone administration.

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Hemodinámica: Hemodynamics:

Las mediciones hemodinámicas se utilizan para determinar el grado de afectación del ventrículo izquierdo. Las ratas se anestesiaron con isoflurano. Mediante una incisión a través del lado derecho anterior del cuello, la arteria carótida 5 derecha y la vena yugular izquierda se aislaron y se canularon con un catéter transductor de presión (Millar, SPR-612, Hemodynamic measurements are used to determine the degree of involvement of the left ventricle. The rats were anesthetized with isoflurane. Through an incision through the right anterior side of the neck, the right carotid artery 5 and the left jugular vein were isolated and cannulated with a pressure transducer catheter (Millar, SPR-612,

1.2 Fr). A continuación se realizaron las siguientes medidas: frecuencia cardiaca, PA sistólica y diastólica, presión arterial media, presión sistólica y diastólica final del ventrículo izquierdo, y + y -dP/dt. Son de especial utilizad las mediciones de la presión sistólica y diastólica final del ventrículo izquierdo, cuya elevación progresiva se correlaciona con el grado de daño del miocardio. 1.2 Fr). The following measures were then taken: heart rate, systolic and diastolic BP, mean arterial pressure, final systolic and diastolic pressure of the left ventricle, and + and -dP / dt. Especially used are the measurements of the final systolic and diastolic pressure of the left ventricle, whose progressive elevation correlates with the degree of myocardial damage.

Tamaño del infarto: Heart attack size:

Las ratas se sacrificaron para medir el tamaño del infarto usando la metodología TTC. The rats were sacrificed to measure the size of the infarction using the TTC methodology.

15 Morfometría 15 Morphometry

La densidad de microvasos [microvasos/mm2] se medirá en la zona infartada, zona peri-infartada, y en el miocardio no afectado opuesto al infarto, normalmente la pared posterior. De cada rata se registraron digitalmente 7-10 imágenes microscópicas de alto campo [x400] con miocitos seccionados de forma transversal usando un programa informático de análisis de imagen. Un investigador enmascarado cuenta los microvasos. La microcirculación se definirá como los vasos más allá de las arteriolas de tercer orden con un diámetro de 150 micrómetros o menos, que alimentan al tejido comprendido entre las arteriolas y las vénulas. Para corregir las diferencias debidas a la hipertrofia ventricular izquierda, la densidad de microvasos se dividirá por el peso de LV corregido según el peso corporal. El miocardio de ratas sometidas a una operación quirúrgica simulada se utilizará como control. The density of microvessels [microvessels / mm2] will be measured in the infarcted area, peri-infarcted area, and in the unaffected myocardium opposite the infarction, usually the posterior wall. From each rat, 7-10 high-field microscopic images [x400] with cross-sectioned myocytes were digitally recorded using an image analysis software. A masked researcher counts the microvessels. Microcirculation shall be defined as the vessels beyond the third order arterioles with a diameter of 150 micrometers or less, which feed the tissue between the arterioles and venules. To correct the differences due to left ventricular hypertrophy, the density of microvessels will be divided by the corrected LV weight according to body weight. The myocardium of rats undergoing a simulated surgical operation will be used as a control.

25 Ejemplo 11: Efectos de los antagonistas de α β3 sobre el efecto proangiogénico de T4 o FGF2: El inhibidor de αVβ3, LM609, inhibió completamente los efectos proangiogénicos inducidos por FGF2 o T4 en el modelo CAM a 10 microgramos (Figura 16). Example 11: Effects of αβ3 antagonists on the proangiogenic effect of T4 or FGF2: The αVβ3 inhibitor, LM609, completely inhibited the proangiogenic effects induced by FGF2 or T4 in the 10 microgram CAM model (Figure 16).

Ejemplo 12: Inhibición del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos relacionados con el cáncer. Example 12: Inhibition of the growth of new blood vessels related to cancer.

Un protocolo descrito en J. Bennett, Proc Natl Acad Sci USA 99:2211-2215, 2002, se utilizó para la administración de ácido tetrayodotiroacético (Tetrac) a ratones SCID que habían recibido implantes de células de cáncer de mama humano (MCF-7). El tetrac se proporcionó en agua potable para aumentar el nivel en circulación del análogo de la A protocol described in J. Bennett, Proc Natl Acad Sci USA 99: 2211-2215, 2002, was used for the administration of tetraiodothyroacetic acid (Tetrac) to SCID mice that had received human breast cancer cell implants (MCF-7 ). Tetrac was provided in drinking water to increase the circulating level of the analog of the

35 hormona en el modelo de ratón hasta 10-6 M. El criterio de valoración es la acción inhibidora del tetrac sobre la angiogénesis alrededor de los tumores implantados. 35 hormone in the mouse model up to 10-6 M. The assessment criterion is the inhibitory action of tetrac on angiogenesis around implanted tumors.

Ejemplo 13: Efecto estimulante de la proangiogénesis de la hormona tiroidea y sus análogos en niveles subumbral de VEGF y FGF2 en un modelo de brotes tridimensional in vitro de tejido endotelial microvascular Example 13: Stimulating effect of proangiogenesis of thyroid hormone and its analogs in subthreshold levels of VEGF and FGF2 in a three-dimensional model of in vitro outbreaks of microvascular endothelial tissue

Tanto T3, T4, T4-agarosa, como el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) junto con el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) produjeron un efecto pro-angiogénesis comparable en el modelo de brotes tridimensional in vitro de tejido endotelial microvascular. El efecto pro-angiogénesis de los análogos de la hormona tiroidea quedaron bloqueados por PD 98059, un inhibidor de la cascada de transducción de la señal de la proteína quinasa activada por Both T3, T4, T4-agarose, and fibroblast growth factor 2 (FGF2) together with vascular endothelial growth factor (VEGF) produced a comparable pro-angiogenesis effect in the in vitro three-dimensional outbreak model of microvascular endothelial tissue . The pro-angiogenesis effect of the thyroid hormone analogues were blocked by PD 98059, an inhibitor of the signal transduction cascade of the protein kinase activated by

45 mitógeno (MAPK; ERK1/2). Adicionalmente, un antagonista (XT199) específico de la integrina αvβ3 inhibió el efecto pro-angiogénesis de cualquiera de los análogos de la hormona tiroidea o de T4-agarosa. Los datos también demuestran que el antagonista de la hormona tiroidea Tetrac inhibe la respuesta pro-angiogénesis del análogo del tiroides. Por tanto, estos análogos de la hormona tiroidea ensayados son pro-angiogénicos, una acción que se inicia en la membrana plasmática y que implica a los receptores de la integrina αvβ3, y es dependiente de MAPK. 45 mitogen (MAPK; ERK1 / 2). Additionally, an αvβ3 integrin-specific antagonist (XT199) inhibited the pro-angiogenesis effect of any of the analogs of thyroid hormone or T4-agarose. The data also demonstrates that the Tetrac thyroid hormone antagonist inhibits the pro-angiogenesis response of the thyroid analog. Therefore, these thyroid hormone analogues tested are pro-angiogenic, an action that starts in the plasma membrane and involves the αvβ3 integrin receptors, and is MAPK dependent.

Esta divulgación describe un efecto estimulante de la pro-angiogénesis de T3, T4, o T4-agarosa en niveles subumbral de VEGF y FGF2 en un modelo de brotes tridimensional in vitro de tejido endotelial microvascular. Esta divulgación también proporciona evidencia de que el efecto de la hormona se inicia en la membrana plasmática de la celular endotelial y que está mediada por la activación de la integrina αvβ3 y la ruta de transducción de la señal ERK1/2. This disclosure describes a stimulating effect of the pro-angiogenesis of T3, T4, or T4-agarose at sub-threshold levels of VEGF and FGF2 in a three-dimensional model of in vitro outbreaks of microvascular endothelial tissue. This disclosure also provides evidence that the effect of the hormone is initiated on the plasma membrane of the endothelial cell and that it is mediated by the activation of the αvβ3 integrin and the ERK1 / 2 signal transduction pathway.

55 Se demostró la potenciación mediante T3, T4 o T4-agarosa de la actividad de angiogénesis de bajas concentraciones de VEGF y FGF2 en el modelo de ensayo de brote tridimensional. Tanto T3, T4 a 10-7-10-8 M, o T4-agarosa a 10-7 M de concentración de hormona total fue comparable, en su actividad pro-angiogénesis, con el efecto de las concentraciones máximas de VEGF y FGF2 en este modelo in vitro. Aunque se ha notificado que el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en el corazón de la rata se produce en paralelo con la inducción de la hipertrofia del miocardio mediante una dosis alta de T4, no se ha considerado a la hormona tiroidea como un factor angiogénico. El presente ejemplo establece que la hormona en concentraciones fisiológicas es pro-angiogénica en un escenario diferente al corazón. The potentiation of angiogenesis activity of low concentrations of VEGF and FGF2 was demonstrated by T3, T4 or T4-agarose in the three-dimensional outbreak test model. Both T3, T4 at 10-7-10-8 M, or T4-agarose at 10-7 M total hormone concentration was comparable, in its pro-angiogenesis activity, with the effect of maximum concentrations of VEGF and FGF2 in This in vitro model. Although it has been reported that the growth of new blood vessels in the rat's heart occurs in parallel with the induction of myocardial hypertrophy by a high dose of T4, thyroid hormone has not been considered as an angiogenic factor. The present example establishes that the hormone in physiological concentrations is pro-angiogenic in a scenario other than the heart.

65 T4-agarosa reprodujo los efectos de T4, y se cree que este derivado de la hormona tiroidea no consigue acceder al interior de la célula; se ha utilizado en el laboratorio de los inventores para examinar modelos de acción de la hormona para determinar posibles acciones de las yodotironinas iniciadas en la superficie celular. Además, los experimentos realizados con T4 y tetrac también respaldan la conclusión de que la acción de la T4 en este modelo se inició en la membrana plasmática. Tetrac bloquea los efectos de T4  65 T4-agarose reproduced the effects of T4, and it is believed that this derivative of thyroid hormone does not gain access to the interior of the cell; It has been used in the inventors' laboratory to examine models of hormone action to determine possible actions of iodothyronines initiated on the cell surface. In addition, the experiments performed with T4 and tetrac also support the conclusion that the action of T4 in this model was initiated in the plasma membrane. Tetrac blocks the effects of T4

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5 Como la hormona tiroidea activa de forma no genómica la ruta de transducción de la señal MAPK (ERK1/2), la acción de la hormona sobre la angiogénesis puede estar mediada por MAPK. Cuando se añade al modelo CAM un inhibidor de la cascada MAPK, PD 98059, inhibió la acción pro-angiogénica de la T4. Aunque este resultado es consistente con una acción sobre la transducción de la señal de la hormona tiroidea corriente arriba de un efecto de T4 sobre la elaboración de FGF2, se sabe que FGF2 también actúa mediante un mecanismo dependiente de MAPK. T4 y FGF2 5 As the thyroid hormone non-genomically activates the MAPK signal transduction pathway (ERK1 / 2), the hormone's action on angiogenesis may be mediated by MAPK. When a MAPK cascade inhibitor, PD 98059, was added to the CAM model, it inhibited the pro-angiogenic action of T4. Although this result is consistent with an action on the transduction of the thyroid hormone signal upstream of an effect of T4 on the production of FGF2, it is known that FGF2 also acts by a MAPK-dependent mechanism. T4 and FGF2

10 ocasionan individualmente la fosforilación y la translocación nuclear de ERK1/2 en células endoteliales y, cuando se utiliza en dosis submáximas, se combina para potenciar aún más la activación de ERK1/2. Para examinar la posibilidad de que solamente el componente dependiente de MAPK de la estimulación hormonal de la angiogénesis esté relacionado exclusivamente con la acción de FGF2 sobre el crecimiento de los vasos, se midió la liberación celular de FGF2 en respuesta a T4 en presencia de PD 98059. El último agente bloqueó el aumento inducido por la hormona en 10 individually cause phosphorylation and nuclear translocation of ERK1 / 2 in endothelial cells and, when used in submaximal doses, is combined to further enhance the activation of ERK1 / 2. To examine the possibility that only the MAPK-dependent component of hormonal stimulation of angiogenesis is exclusively related to the action of FGF2 on vessel growth, cell release of FGF2 was measured in response to T4 in the presence of PD 98059 The last agent blocked the hormone-induced increase in

15 la concentración del factor de crecimiento e indicó que la activación de MAPK está implicada en la acción de la T4 sobre la liberación de FGF2 desde las células endoteliales, así como el consiguiente efecto de FGF2 sobre la angiogénesis. The concentration of the growth factor and indicated that MAPK activation is involved in the action of T4 on the release of FGF2 from endothelial cells, as well as the consequent effect of FGF2 on angiogenesis.

Efecto de la hormona tiroidea sobre la angiogénesis Effect of thyroid hormone on angiogenesis

20 Tanto T4, T3, o T4-agarosa a 0,01-0,1 µM dieron como resultado una estimulación significativa (P < 0,01) de la angiogénesis (Tabla 4). Se demuestra que esto es comparable a la eficacia pro-angiogénesis de FGF2 (50 ng/ml) más VEGF (25 ng/ml). Both T4, T3, or T4-agarose at 0.01-0.1 µM resulted in a significant stimulation (P <0.01) of angiogenesis (Table 4). This is shown to be comparable to the pro-angiogenesis efficacy of FGF2 (50 ng / ml) plus VEGF (25 ng / ml).

Tabla 4. Efecto de los factores de crecimiento, hormona tiroidea, y sus análogos sobre la pro-angiogénesis en el 25 ensayo de brotes tridimensional in vitro de tejido endotelial microvascular Table 4. Effect of growth factors, thyroid hormone, and their analogs on pro-angiogenesis in the in vitro three-dimensional outbreak test of microvascular endothelial tissue.

Grupos de tratamiento Treatment groups

Longitud media del tubo del vaso (mm) ± SD Average glass tube length (mm) ± SD

Control FGF2 (25 ng) + VEGF (50 ng) T3 (20 ng) T4 (23 ng) T4-agarosa (23 ng) Control FGF2 (25 ng) + VEGF (50 ng) T3 (20 ng) T4 (23 ng) T4-agarose (23 ng)

0,76 ± 0,08 2,34 ± 0,25* 1,88 ± 0,21* 1,65 ± 0,15* 1,78 ± 0,20* 0.76 ± 0.08 2.34 ± 0.25 * 1.88 ± 0.21 * 1.65 ± 0.15 * 1.78 ± 0.20 *

Los datos (promedio ±SD) se obtuvieron de 3 experimentos. Las células se pretrataron con un nivel subumbral de FGF2 (1,25 ng/ml) + VEGF (2,5 ng/ml). Los datos representan promedio + SEM, n = 3, *P <0,01 mediante ANOVA, comparación del tratado con el control. Data (mean ± SD) were obtained from 3 experiments. The cells were pretreated with a subthreshold level of FGF2 (1.25 ng / ml) + VEGF (2.5 ng / ml). The data represent average + SEM, n = 3, * P <0.01 by ANOVA, comparison of the treaty with the control.

Efectos del Tetrac sobre la acción pro-angiogénesis del tiroides: Effects of Tetrac on the pro-angiogenesis action of the thyroid:

T3 estimula las rutas de transducción de la señal celular iniciadas en la membrana plasmática. Estas acciones T3 stimulates cell signal transduction pathways initiated in the plasma membrane. These actions

30 pro-angiogénesis quedan bloqueadas por un análogo desaminado de la yodotironina, tetrac, que se sabe que inhibe la unión de T4 a las membranas plasmáticas. La adición de tetrac (0,1 µM) inhibió la acción pro-angiogénesis de cualquiera de T3, T4, o T4-agarosa (Tablas 5-7). Esto se demuestra por la inhibición del número de células del tejido endotelial microvascular que migran y la longitud de los vasos (Tabla 5-7). 30 pro-angiogenesis are blocked by a deaminated analog of iodothyronine, tetrac, which is known to inhibit the binding of T4 to plasma membranes. The addition of tetrac (0.1 µM) inhibited the pro-angiogenesis action of any of T3, T4, or T4-agarose (Tables 5-7). This is demonstrated by the inhibition of the number of migrating microvascular endothelial tissue cells and the length of the vessels (Table 5-7).

35 Papel de la ruta de transducción de la señal ERK1/2 en la estimulación de la angiogénesis mediante la hormona tiroidea: 35 Role of the ERK1 / 2 signal transduction pathway in the stimulation of angiogenesis by thyroid hormone:

Se realizaron en paralelo estudios sobre la inhibición de ERK1/2 en los ensayos de formación de brotes microvasculares tridimensionales. La hormona tiroidea y su análogo a 0,01-0,1 µM ocasionaron un aumento Studies on the inhibition of ERK1 / 2 were performed in parallel in the three-dimensional microvascular sprout formation assays. Thyroid hormone and its analogue at 0.01-0.1 µM caused an increase

40 significativo en la longitud del tubo y el número de células que migran, un efecto que quedó significativamente bloqueado (P < 0,01) mediante PD 98059 (Tablas 5-7). Esto se demuestra por la inhibición del número de células del tejido endotelial microvascular que migran y la longitud de los vasos (Tabla 5-7). 40 significant in the length of the tube and the number of cells that migrate, an effect that was significantly blocked (P <0.01) by PD 98059 (Tables 5-7). This is demonstrated by the inhibition of the number of migrating microvascular endothelial tissue cells and the length of the vessels (Table 5-7).

Papel de la integrina αvβ3 en la estimulación de la angiogénesis mediante la hormona tiroidea: Role of integrin αvβ3 in the stimulation of angiogenesis by thyroid hormone:

45 La pro-angiogénesis mediada por cualquiera de T3, T4 o T4-agarosa a 0,01-0,1 µM en presencia de niveles sub-umbral de VEGF y FGF2 quedó bloqueada (P < 0,01) significativamente mediante el antagonista de la integrina αvβ3, XT199 (Tablas 5-7). Esto se demuestra por la inhibición del número de células del tejido endotelial microvascular que migran y la longitud de los vasos (Tabla 5-7). 45 Pro-angiogenesis mediated by either T3, T4 or T4-agarose at 0.01-0.1 µM in the presence of sub-threshold levels of VEGF and FGF2 was significantly blocked (P <0.01) by the antagonist of integrin αvβ3, XT199 (Tables 5-7). This is demonstrated by the inhibition of the number of migrating microvascular endothelial tissue cells and the length of the vessels (Table 5-7).

50 Por tanto, el efecto pro-angiogénesis de la hormona tiroidea y sus análogos comienza en la membrana plasmática con la integrina αvβ3 e implica la activación de ERK1/2. 50 Therefore, the pro-angiogenesis effect of thyroid hormone and its analogues begins in the plasma membrane with the αvβ3 integrin and involves the activation of ERK1 / 2.

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Tabla 5: Mecanismo de la pro-angiogénesis de la hormona tiroidea T3 en el ensayo de brotes tridimensional in vitro de tejido endotelial microvascular Table 5: Mechanism of pro-angiogenesis of thyroid hormone T3 in the in vitro three-dimensional outbreak test of microvascular endothelial tissue

Tratamiento con HDMEC HDMEC treatment

Número medio de células migradas ± SD Longitud media del vaso (mm) ± SD Average number of migrated cells ± SD Average vessel length (mm) ± SD

Control T3 (0,1 uM) T3 (0,1 uM) + PD98059 (3 ug) T (0,1 uM) + XT199 (2 ug) T3 (0,1 uM) + tetrac (0,15 ug) Control T3 (0.1 uM) T3 (0.1 uM) + PD98059 (3 ug) T (0.1 uM) + XT199 (2 ug) T3 (0.1 uM) + tetrac (0.15 ug)

88 ± 14 188 ± 15* 124 ± 29 118 ± 18 104 ± 15 0,47 ± 0,06 0,91 ± 0,04* 0,48 ± 0,09 0,47 ± 0,04 0,58 ± 0,07 88 ± 14 188 ± 15 * 124 ± 29 118 ± 18 104 ± 15 0.47 ± 0.06 0.91 ± 0.04 * 0.48 ± 0.09 0.47 ± 0.04 0.58 ± 0.07

Se utilizaron células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC). Las células se pretrataron con FGF2 (1,25 ng/ml) + VEGF (2,5 ng/ml). Se obtuvieron imágenes a 4 y 10X, día 3. Los datos representan promedio + SD, n = 3, * P < 0,01. Human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC) were used. The cells were pretreated with FGF2 (1.25 ng / ml) + VEGF (2.5 ng / ml). Images were obtained at 4 and 10X, day 3. The data represent average + SD, n = 3, * P <0.01.

Tabla 6: Mecanismo de la pro-angiogénesis de la hormona tiroidea T4 en el ensayo de brotes tridimensional in vitro de tejido endotelial microvascular Table 6: Mechanism of pro-angiogenesis of thyroid hormone T4 in the in vitro three-dimensional outbreak test of microvascular endothelial tissue

Tratamiento con HDMEC HDMEC treatment

Número medio de células migradas ± SD Longitud media del vaso (mm) ± SD Average number of migrated cells ± SD Average vessel length (mm) ± SD

Control T4 (0,1 uM) T4 (0,1 uM) + PD98059 (3 ug) T4 (0,1 uM) + XT199 (2 ug) T4 (0,1 uM) + Tetrac (0,15 ug) Control T4 (0.1 uM) T4 (0.1 uM) + PD98059 (3 ug) T4 (0.1 uM) + XT199 (2 ug) T4 (0.1 uM) + Tetrac (0.15 ug)

88 ± 14 182 ± 11* 110 ± 21 102 ± 13 85 ± 28 0,47 ± 0,06 1,16 ± 0,21* 0,53 ± 0,13 0,53 ± 0,05 0,47 ± 0,11 88 ± 14 182 ± 11 * 110 ± 21 102 ± 13 85 ± 28 0.47 ± 0.06 1.16 ± 0.21 * 0.53 ± 0.13 0.53 ± 0.05 0.47 ± 0.11

Se utilizaron células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC). Las células se pretrataron con FGF2 (1,25 ng/ml) + VEGF (2,5 ng/ml). Se obtuvieron imágenes a 4 y 10X, día 3. Los datos representan promedio + SD, n = 3, * P < 0,01. Human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC) were used. The cells were pretreated with FGF2 (1.25 ng / ml) + VEGF (2.5 ng / ml). Images were obtained at 4 and 10X, day 3. The data represent average + SD, n = 3, * P <0.01.

Tabla 7: Mecanismo de la pro-angiogénesis de la hormona tiroidea T4-agarosa en el ensayo de brotes tridimensional in vitro de tejido endotelial microvascular Table 7: Mechanism of pro-angiogenesis of thyroid hormone T4-agarose in the in vitro three-dimensional outbreak test of microvascular endothelial tissue

Tratamiento con HDMEC HDMEC treatment

Número medio de células migradas ± SD Longitud media del vaso (mm) ± SD Average number of migrated cells ± SD Average vessel length (mm) ± SD

Control T4-agarosa (0,1 uM) T4-agarosa (0,1 uM) + PD98059 (3 ug) T4-agarosa (0,1 uM) + XT199 (2 ug) T4-agarosa (0,1 uM) + Tetrac (0,15 ug) Control T4-agarose (0.1 uM) T4-agarose (0.1 uM) + PD98059 (3 ug) T4-agarose (0.1 uM) + XT199 (2 ug) T4-agarose (0.1 uM) + Tetrac (0.15 ug)

88 ± 14 191 ± 13* 111 ± 8 106 ± 5 87 ± 14 0,47 ± 0,06 0,97 ± 0,08* 0,56 ± 0,03 0,54 ± 0,03 0,45 ± 0,09 88 ± 14 191 ± 13 * 111 ± 8 106 ± 5 87 ± 14 0.47 ± 0.06 0.97 ± 0.08 * 0.56 ± 0.03 0.54 ± 0.03 0.45 ± 0.09

Se utilizaron células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC). Las células se pretrataron con FGF2 (1,25 ng/ml) + VEGF (2,5 ng/ml). Se obtuvieron imágenes a 4 y 10X, día 3. Los datos representan promedio + SD, n = 3, * P < 0,01. Human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC) were used. The cells were pretreated with FGF2 (1.25 ng / ml) + VEGF (2.5 ng / ml). Images were obtained at 4 and 10X, day 3. The data represent average + SD, n = 3, * P <0.01.

10 Ejemplo 14: Modelo in vitro para evaluar el transporte de los análogos poliméricos tiroideos a través de la barrera hematoencefálica 10 Example 14: In vitro model to evaluate the transport of thyroid polymer analogs across the blood brain barrier

Se describe a continuación un método in vitro para evaluar la facilidad con la que un análogo polimérico tiroideo, solo o junto con factor de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos pueden atravesar la barrera hematoencefálica. 15 Se proporciona una descripción detallada del modelo y el protocolo en Audus, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci 507: 9-18 (1987). An in vitro method for evaluating the ease with which a thyroid polymer analogue, alone or together with nerve growth factor or other neurogenic factors can cross the blood brain barrier, is described below. 15 A detailed description of the model and protocol is provided in Audus, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci 507: 9-18 (1987).

En resumen, las células endoteliales de los microvasos se aislaron de la materia gris cerebral de cerebros de bovino frescos. Los cerebros se obtuvieron de un matadero local y se transportaron hasta el laboratorio en medio mínimo 20 esencial ("MEM") con antibióticos y hielo. En condiciones de esterilidad se retiraron los vasos sanguíneos superficiales grandes y las meninges usando procedimientos de disección convencionales. La materia gris cortical se eliminó mediante aspiración, y después se trituró en cubos de aproximadamente 1 mm. La materia gris triturada se incubó con dispasa al 0,5 % (BMB, Indianápolis, Ind.) durante 3 horas a 37 ºC en un baño de agua con agitación. Después de la digestión de 3 horas, la mezcla se concentró por centrifugación (1000x g durante 10 min.), se resuspendió a 25 continuación en dextrano al 13 % y se centrifugó durante 10 min. a 5800x g. La grasa sobrenadante, residuos celulares y mielina se descartaron, y el aglomerado bruto de microvasos se resuspendió en colagenasa/dispasa 1 mg/ml y se incubó en un baño de agua con agitación a 37 ºC durante 5 h. Después de la digestión de 5 horas, la suspensión de microvasos se aplicó a un gradiente de Percoll al 50 % ya establecido y se centrifugó durante 10 min a 1000x g. La banda que contenía las células endoteliales purificadas (segunda banda desde la parte superior del gradiente) se retiró In summary, the endothelial cells of the microvessels were isolated from the brain gray matter of fresh bovine brains. Brains were obtained from a local slaughterhouse and transported to the laboratory in minimum essential medium ("MEM") with antibiotics and ice. Under sterile conditions, large surface blood vessels and meninges were removed using conventional dissection procedures. The cortical gray matter was removed by aspiration, and then triturated in approximately 1 mm cubes. The crushed gray matter was incubated with 0.5% dispase (BMB, Indianapolis, Ind.) For 3 hours at 37 ° C in a shaking water bath. After 3 hours digestion, the mixture was concentrated by centrifugation (1000x g for 10 min.), Then resuspended in 13% dextran and centrifuged for 10 min. at 5800x g. The supernatant fat, cell debris and myelin were discarded, and the crude microglass agglomerate was resuspended in collagenase / disparate 1 mg / ml and incubated in a shaking water bath at 37 ° C for 5 h. After the 5-hour digestion, the micro-vessel suspension was applied to an established 50% Percoll gradient and centrifuged for 10 min at 1000x g. The band containing purified endothelial cells (second band from the top of the gradient) was removed

30 y se lavó dos veces con medio de cultivo (por ejemplo, 50 % MEM/50 % mezcla nutriente F-12). Las células se congelaron (-80º C) en medio que contenía DMSO al 20 % y suero de caballo al 10 % para uso posterior. 30 and washed twice with culture medium (for example, 50% MEM / 50% nutrient mixture F-12). The cells were frozen (-80 ° C) in medium containing 20% DMSO and 10% horse serum for later use.

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Tras el aislamiento, aproximadamente 5x105 células/cm2 se sembraron en placas de cultivo o filtros de policarbonato con un tamaño de poro de 5-12 mm que estaban recubiertos con colágeno de rata y fibronectina. 10-12 días tras la siembra de las células, se inspeccionaron las monocapas de células al microscopio para determinar la confluencia. After isolation, approximately 5x105 cells / cm2 were seeded in culture plates or polycarbonate filters with a pore size of 5-12 mm that were coated with rat collagen and fibronectin. 10-12 days after planting the cells, the cell monolayers were inspected under a microscope to determine confluence.

5 La caracterización de las propiedades morfológicas, histoquímicas y bioquímicas de estas células ha demostrado que estas células tienen muchos de los rasgos más importantes de la barrera hematoencefálica. Estos rasgos incluyen: uniones intercelulares estancas, falta de aperturas en las membranas, bajos niveles de actividad pinocítica, y la presencia de gamma-glutamil transpeptidasa, fosfatasa alcalina, y actividades del antígeno del Factor VIII. 5 The characterization of the morphological, histochemical and biochemical properties of these cells has shown that these cells have many of the most important features of the blood brain barrier. These features include: tight intercellular junctions, lack of membrane openings, low levels of pinocytic activity, and the presence of gamma-glutamyl transpeptidase, alkaline phosphatase, and Factor VIII antigen activities.

Las células cultivadas se pueden usar en una amplia variedad de experimentos en los que se necesita un modelo de unión o transporte polarizado. Al sembrar las células en placas multipocillos, se puede realizar la unión al receptor y al no receptor de moléculas tanto grandes como pequeñas. Para realizar las medidas del flujo celular transendotelial, las células se hicieron crecer sobre filtros de membrana de policarbonato poroso (por ejemplo, de Nucleopore, Pleasanton, Calif.). Se usaron filtros de tamaño de poro grande (5-12 mm) para evitar la posibilidad de que el filtro se Cultured cells can be used in a wide variety of experiments in which a polarized binding or transport model is needed. By sowing cells in multiwell plates, binding to the receptor and non-receptor of both large and small molecules can be performed. To perform transendothelial cell flow measurements, the cells were grown on porous polycarbonate membrane filters (eg, from Nucleopore, Pleasanton, Calif.). Large pore size filters (5-12 mm) were used to avoid the possibility of the filter being

15 convierta en una barrera limitante de la velocidad para el flujo molecular. El uso de estos filtros de tamaño de poro grande no permite el crecimiento celular bajo el filtro y permite la inspección visual de la monocapa de células. 15 become a speed limiting barrier to molecular flow. The use of these large pore size filters does not allow cell growth under the filter and allows visual inspection of the cell monolayer.

Cuando las células alcanzaron la confluencia, se colocan en un equipo de difusión celular en paralelo (por ejemplo, de Crown Glass, Sommerville, N.J.). Para las medidas de flujo, la cámara donante de la celdilla de difusión se pulsa con una sustancia de ensayo, a continuación en varios momentos posteriores al pulso, se toma una alícuota de la cámara receptora para su análisis. Las sustancias marcadas de forma radioactiva o fluorescente permite la cuantificación fiable del flujo molecular. La integridad de la monocapa se mide simultáneamente por la adición de una sustancia de ensayo no trasportable tal como sacarosa o inulina y se midieron réplicas de al menos 4 determinaciones con el fin de garantizar la significancia estadística. When the cells reached confluence, they are placed in a cellular diffusion device in parallel (for example, from Crown Glass, Sommerville, N.J.). For flow measurements, the donor chamber of the diffusion cell is pulsed with a test substance, then at several times after the pulse, an aliquot of the receiving chamber is taken for analysis. Substances marked radioactively or fluorescently allow for reliable quantification of molecular flow. The integrity of the monolayer is measured simultaneously by the addition of a non-transportable test substance such as sucrose or inulin and replicates of at least 4 determinations were measured in order to guarantee statistical significance.

25 25

Ejemplo 15: Modelo de lesión traumática Example 15: Traumatic injury model

El modelo de lesión cerebral por percusión de fluido se utilizó para evaluar la capacidad de los análogos poliméricos de la hormona tiroidea solos o junto con factores de crecimiento nervioso u otros factores neurogénicos para restaurar las funciones del sistema nervioso central después de una lesión cerebral traumática significativa. The fluid percussion brain injury model was used to assess the ability of polymeric analogs of thyroid hormone alone or together with nerve growth factors or other neurogenic factors to restore central nervous system functions after significant traumatic brain injury. .

I. Procedimiento de lesión cerebral por percusión de fluido I. Procedure of cerebral percussion fluid injury

Los animales usados en este estudio fueron ratas Sprague-Dawley macho que pesaban 250-300 gramos (Charles The animals used in this study were male Sprague-Dawley rats weighing 250-300 grams (Charles

35 River). La preparación quirúrgica básica para la lesión cerebral por percusión de fluido ya se ha descrito. Dietrich, et al., Acta Neuropathol. 87: 250-258 (1994) que se incorpora al presente documento por referencia. En resumen, las ratas se anestesiaron con halotano al 3 %, oxígeno al 30 %, y resto de óxido de nitroso. Se realizó la intubación traqueal, y las ratas se colocaron en bastidor esterotáctico. A continuación se realizó una craneotomía de 4,8 mm en el la corteza parietal derecha, 3,8 mm posterior respecto a la bregma y 2,5 mm lateral respecto a la línea central. Se instaló un tubo de lesión sobre la dura expuesta y se pegó con adhesivo. Se vertió acrílico dental alrededor del tubo de lesión, y el tubo de lesión de obturó a continuación con una esponja de espuma de gel. El cuero cabelludo se cerró mediante sutura y el animal volvió a su jaula y se dejó recuperar durante la noche. 35 River). The basic surgical preparation for fluid percussion brain injury has already been described. Dietrich, et al., Acta Neuropathol. 87: 250-258 (1994) which is incorporated herein by reference. In summary, the rats were anesthetized with 3% halothane, 30% oxygen, and nitrous oxide residue. Tracheal intubation was performed, and the rats were placed in a stereotactic frame. Next, a 4.8 mm craniotomy was performed in the right parietal cortex, 3.8 mm posterior to the bregma and 2.5 mm lateral to the central line. An injury tube was installed over the exposed hard and was glued with adhesive. Dental acrylic was poured around the lesion tube, and the lesion tube was then obtained with a gel foam sponge. The scalp was closed by suture and the animal returned to its cage and allowed to recover overnight.

Al día siguiente, la lesión cerebral por percusión de fluido se realizó esencialmente como se ha descrito en Dixon, et al., The next day, the fluid percussion brain injury was performed essentially as described in Dixon, et al.,

45 J. Neurosurg. 67: 110-119 (1987) y Clifton, et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 11: 114-121 (1991). El dispositivo de percusión de fluido consistió en un cilindro de plexigás lleno de suero salino provisto de un alojamiento para transductor y un tornillo de lesión adaptado para el cráneo de la rata. El tornillo de metal se conectó firmemente al tubo de lesión de plástico de la rata intubada anestesiada (óxido de nitroso al 70 %, halotano al 1,5 %, y oxígeno al 30 %), y la lesión se indujo mediante el descenso de un péndulo que golpea el pistón. Las ratas experimentaron una lesión leve a moderada en la cabeza, en el intervalo de 1,6 a 1,9 atm (162,3 a 192,5 kPa). La temperatura cerebral se controló indirectamente mediante una sonda termistor insertada en el músculo temporal derecho y que se mantuvo a 37-37.5 ºC. También se midió la temperatura rectal, que se mantuvo a 37 ºC antes y durante el periodo de monitorización. 45 J. Neurosurg. 67: 110-119 (1987) and Clifton, et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 11: 114-121 (1991). The fluid percussion device consisted of a Plexiglas cylinder filled with saline serum provided with a transducer housing and an injury screw adapted for the rat skull. The metal screw was firmly connected to the plastic lesion tube of the anesthetized intubated rat (70% nitrous oxide, 1.5% halothane, and 30% oxygen), and the injury was induced by lowering a pendulum that hits the piston. The rats experienced a mild to moderate head injury, in the range of 1.6 to 1.9 atm (162.3 to 192.5 kPa). The brain temperature was indirectly controlled by a thermistor probe inserted in the right temporal muscle and maintained at 37-37.5 ° C. The rectal temperature was also measured, which was maintained at 37 ° C before and during the monitoring period.

55 Ensayo conductual: 55 Behavioral test:

Se utilizaron tres ensayos funcionales/conductuales normalizados para evaluar la función sensorimotora y de reflejos después de la lesión cerebral. Los ensayos se han descrito completamente en la bibliografía, incluyendo Bederson, et al., (1986) Stroke 17: 472-476; DeRyck, et al., (1992) Brain Res. 573: 44-60; Markgraf, et al., (1992) Brain Res. 575: 238-246; y Alexis, et al., (1995) Stroke 26: 2338-2346. Three standardized functional / behavioral tests were used to assess sensorimotor and reflex function after brain injury. Assays have been fully described in the literature, including Bederson, et al., (1986) Stroke 17: 472-476; DeRyck, et al., (1992) Brain Res. 573: 44-60; Markgraf, et al., (1992) Brain Res. 575: 238-246; and Alexis, et al., (1995) Stroke 26: 2338-2346.

A. Ensayo de colocación de la extremidad anterior A. Anterior limb placement test

La colocación de la extremidad anterior frente a tres estímulos separados (visual, táctil, y propioceptivo) se midió para Anterior limb placement versus three separate stimuli (visual, tactile, and proprioceptive) was measured to

65 evaluar la integración sensorimotora. DeRyck, et al., Brain Res. 573:44-60 (1992). Para el subensayo de colocación visual, el investigador sostuvo al animal en posición vertical y se puso cerca de la superficie de una mesa. La 65 evaluate sensorimotor integration. DeRyck, et al., Brain Res. 573: 44-60 (1992). For the visual placement subtest, the researcher held the animal in an upright position and stood near the surface of a table. The

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colocación normal de la extremidad sobre la mesa recibió una puntuación de "0," la colocación retrasada (<2 s) recibió una puntuación de "1," y la no colocación o la colocación muy retrasada (>2 s) recibió una puntuación de "2". Se obtuvieron puntuaciones separadas en primer lugar cuando el animal se acerca y de nuevo cuando el animal se acerca de forma lateral a la tabla (puntuación máxima por extremidad =4; en cada caso, los números más altos denotan 5 mayores déficits.). Para el subensayo de colocación táctil, el animal se sujetó de forma que no pudiera ver o tocar la parte superior de la mesa con sus bigotes. La pata delantera dorsal toca ligeramente la parte superior de la mesa cuando el animal se acerca y después y después se acerca de forma lateral a la mesa. Cada tiempo de colocación se puntuó como anteriormente (puntuación máxima por extremidad =4). Para el subensayo de colocación propioceptiva, el animal solamente se acercó a la mesa y se aplicó mayor presión a la pata delantera dorsal; la colocación se puntuó normal placement of the limb on the table received a score of "0," the delayed placement (<2 s) received a score of "1," and non-placement or very delayed placement (> 2 s) received a score of "2". Separate scores were obtained first when the animal approaches and again when the animal approaches the table laterally (maximum limb score = 4; in each case, the highest numbers denote 5 major deficits.). For the tactile placement subtest, the animal was held so that it could not see or touch the top of the table with its whiskers. The front dorsal leg slightly touches the top of the table when the animal approaches and then and then approaches laterally to the table. Each placement time was scored as before (maximum score per limb = 4). For the proprioceptive placement subtest, the animal only approached the table and greater pressure was applied to the dorsal front leg; the placement was scored

10 como anteriormente (puntuación máxima por extremidad =2). Finalmente, se ensayó la capacidad de los animales para colocar la extremidad anterior en respuesta a la estimulación del bigote con la parte superior de la mesa (puntuación máxima por extremidad =2). Después se sumaron las subpuntuaciones para obtener la puntuación total de colocación de la extremidad anterior para cada extremidad (intervalo 0-12). 10 as before (maximum score per limb = 2). Finally, the ability of the animals to place the anterior limb in response to the stimulation of the mustache with the top of the table was tested (maximum limb score = 2). Sub-scores were then added to obtain the total anterior limb placement score for each limb (range 0-12).

15 B. El ensayo de equilibrio sobre una viga 15 B. The balance test on a beam

El equilibrio en viga es sensible a los ataques a la corteza motora. Esta tarea se utilizó para evaluar la función vestibulomotora grosera y requirió que una rata se balanceara de forma estacionaria sobre una viga estrecha. Feeney, et al., Science, 217: 855-857 (1982); Goldstein, et al., Behav. Neurosci. 104: 318-325 (1990). El ensayo implicó tres 20 ensayos de prueba de 60 segundos 24 horas antes de la cirugía para adquirir los datos iniciales. El aparato consistió en una viga de 3/4 de pulgada (1,91 cm, 10 pulgadas (25,4 cm) de longitud, suspendida 1 pie (0,31 cm) por encima de la parte superior de una mesa. La rata se colocó sobre la viga y tuvo que mantener una postura estacionaria con todas las extremidades sobre la parte superior de la viga durante 60 segundos. El comportamiento del animal se puntuó con la escala de Clifton, et al., J. Cereb Blood Flow Metab. 11:1114-121 (1991), con un intervalo de 1 a 6, donde una The beam balance is sensitive to attacks on the motor cortex. This task was used to assess gross vestibulomotor function and required a rat to be stationary on a narrow beam. Feeney, et al., Science, 217: 855-857 (1982); Goldstein, et al., Behav. Neurosci. 104: 318-325 (1990). The trial involved three 20 trial trials of 60 seconds 24 hours before surgery to acquire the initial data. The apparatus consisted of a 3/4 inch (1.91 cm, 10 inch (25.4 cm) length beam, suspended 1 foot (0.31 cm) above the top of a table. was placed on the beam and had to maintain a stationary posture with all the limbs on the top of the beam for 60 seconds.The animal's behavior was scored with the Clifton scale, et al., J. Cereb Blood Flow Metab. 11: 1114-121 (1991), with an interval of 1 to 6, where a

25 puntuación de 1 es normal y una puntuación de 6 indica que el animal fue incapaz de sostenerse sobre la viga. 25 score of 1 is normal and a score of 6 indicates that the animal was unable to stand on the beam.

B. El ensayo de deambulación sobre una viga B. The ambulation test on a beam

Se trata de un ensayo de integración sensorimotora que examina específicamente la función de la extremidad anterior. It is a sensorimotor integration test that specifically examines the function of the anterior limb.

30 El equipo de ensayo y los procedimientos de puntuación se adaptaron de Feeney, et al., Science, 217: 855-857 (1982). Una viga de 1 cm de longitud, 4 pies (124 cm) de longitud, se suspendió 3 pies (93 cm) por encima del suelo en una habitación iluminada por una luz tenue. En el extremo más alejado de la viga se colocó una caja meta oscurecida con una entrada estrecha. Equidistantes a lo largo de la viga se colocaron cuatro tornillos de metal de 3 pulgadas (7,62 cm), en angulación desde el centro de la viga. Un generador de ruido blanco y una fuente de luz brillante al inicio de la 30 The test equipment and scoring procedures were adapted from Feeney, et al., Science, 217: 855-857 (1982). A beam of 1 cm in length, 4 feet (124 cm) in length, was suspended 3 feet (93 cm) above the ground in a room illuminated by a dim light. At the far end of the beam, a darkened goal box with a narrow entrance was placed. Equidistant along the beam, four 3-inch (7.62 cm) metal screws were placed at an angle from the center of the beam. A white noise generator and a bright light source at the beginning of the

35 viga motivaron al animal a atravesar la viga y entrar en la caja meta. Una vez en el interior de la caja meta, los estímulos finalizaron. La latencia de la rata hasta alcanzar la caja meta (en segundos) y el comportamiento de la extremidad anterior a medida que atraviesa la viga (basándose en una escala de puntuación de 1 a 7). Una puntuación de 7 indica una deambulación normal con menos de dos resbalones, y una puntuación de 1 indica que la rata fue incapaz de atravesar la viga en menos de 80 segundos. Cada rata se entrenó durante tres días antes de la cirugía para 35 beam motivated the animal to cross the beam and enter the target box. Once inside the target box, the stimuli ended. The latency of the rat until reaching the target box (in seconds) and the behavior of the anterior limb as it passes through the beam (based on a score scale of 1 to 7). A score of 7 indicates normal walking with less than two slips, and a score of 1 indicates that the rat was unable to cross the beam in less than 80 seconds. Each rat was trained for three days before surgery to

40 adquirir la tarea y conseguir un comportamiento normal (una puntuación de 7) sobre tres ensayos consecutivos. Se realizaron tres ensayos iniciales 24 horas antes de la cirugía, y se realizaron tres ensayos de prueba el día posterior. Se calcularon los valores de la latencia y la puntuación de cada día. 40 acquire the task and achieve normal behavior (a score of 7) on three consecutive trials. Three initial trials were performed 24 hours before surgery, and three trial trials were performed the following day. The latency values and the daily score were calculated.

45 Four. Five

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T4-ácido retinoico T4-retinoic acid

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T3-ácido retinoico T3-retinoic acid

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DITPA-ácido retinoico GC-1-ácido retinoico DITPA-retinoic acid GC-1-retinoic acid

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20 En general, los agentes radiactivos para obtención de imágenes (Ejemplos 16-20) se preparan haciendo reaccionar derivados de 4-halobencilo radiactivos con derivados de piperazina. Los preferidos son los derivados de 4-fluorobencilo marcados con F-18 para obtención de imágenes PET. Un método general para la preparación de haluros de 4-fluoro-18 F-bencilo se describe en Iwata et al., Applied Radiation and Isotopes (2000), Vol. 52, págs. 87-92. In general, radioactive imaging agents (Examples 16-20) are prepared by reacting radioactive 4-halobenzyl derivatives with piperazine derivatives. Preferred are F-18-labeled 4-fluorobenzyl derivatives for PET imaging. A general method for the preparation of halides of 4-fluoro-18 F-benzyl is described in Iwata et al., Applied Radiation and Isotopes (2000), Vol. 52, p. 87-92.

25 Para la tomografía de emisión de fotón único (SPECT), se prefieren los compuestos marcados con 99mTc. Una ruta sintética general para este tipo de compuestos comienza con análogos no radiactivos de los compuestos de acuerdo For single photon emission tomography (SPECT), compounds labeled with 99mTc are preferred. A general synthetic route for this type of compounds begins with non-radioactive analogs of the compounds according

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5 con los Ejemplos 16-20 que se hacen reaccionar con quelantes de unión a 99mTC, por ejemplo quelantes N2 S2. La síntesis de quelantes sigue procedimientos normalizados, por ejemplo, los procedimientos descritos en Mahmood et al., A N2 S2 -Tetradentate Chelate for Solid-Phase Synthesis: Technetium, Rhenium in Chemistry and Nuclear Medicine (1999), Vol. 5, p. 71, o en Z. P. Zhuang et al., Bioconjugate Chemistry (1999), Vol. 10, p. 159. 5 with Examples 16-20 which are reacted with 99mTC binding chelators, for example N2 S2 chelators. The synthesis of chelators follows standard procedures, for example, the procedures described in Mahmood et al., A N2 S2-Tetradentate Chelate for Solid-Phase Synthesis: Technetium, Rhenium in Chemistry and Nuclear Medicine (1999), Vol. 5, p. 71, or in Z. P. Zhuang et al., Bioconjugate Chemistry (1999), Vol. 10, p. 159.

Uno de los quelantes se bien se une directamente al nitrógeno del grupo --N(R4)R5 de los compuestos no radioactivos de acuerdo con los Ejemplos 16-20, o mediante un resto enlazador que comprende un radical alquilo que tiene de uno a diez átomos de carbono, en el que el radical alquilo contiene opcionalmente de uno a diez grupos -C(O)-, uno a diez grupos -C(O)N(R)-, uno a diez grupos -N(R)C(O)-, uno a diez grupos -N(R)-, uno a diez grupos -N(R)2, uno a diez grupos hidroxi, uno a diez grupos -C(O)OR-, uno a diez átomos de oxígeno, uno a diez átomos de azufre, uno a diez One of the chelants binds directly to the nitrogen of the group --N (R4) R5 of the non-radioactive compounds according to Examples 16-20, or by a linker moiety comprising an alkyl radical having one to ten carbon atoms, in which the alkyl radical optionally contains one to ten groups -C (O) -, one to ten groups -C (O) N (R) -, one to ten groups -N (R) C ( O) -, one to ten groups -N (R) -, one to ten groups -N (R) 2, one to ten hydroxy groups, one to ten groups -C (O) OR-, one to ten oxygen atoms , one to ten sulfur atoms, one to ten

15 átomos de nitrógeno, uno a diez átomos de halógeno, uno a diez grupos arilo, y uno a diez anillos heterocíclicos saturados o insaturados en el que R es hidrógeno o alquilo. Un resto enlazador preferido es -C(O)--CH2-N(H)-. 15 nitrogen atoms, one to ten halogen atoms, one to ten aryl groups, and one to ten saturated or unsaturated heterocyclic rings in which R is hydrogen or alkyl. A preferred linker moiety is -C (O) - CH2-N (H) -.

Ejemplo 23: T4 es un ligando de la integrina αVβ3 Example 23: T4 is a ligand of integrin αVβ3

Para determinar si T4 es un ligando de la integrina αVβ3, 2 µg de proteína purificada comercialmente disponible se incubó con [125I]T4, y la mezcla se analizó en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. αVβ3seune aT4 radiomarcado y esta interacción es perturbada de forma competitiva por T4, que se añadió a αVβ3 antes de la incubación con [125I]T4, de una forma dependiente de la concentración (Fig. 24). La adición de T4 no mercado redujo la unión de la integrina al ligando radiomarcado en un 13 % para una concentración total de T4 de 10-7 M total (3x10-10 M To determine whether T4 is a ligand of the integrin αVβ3, 2 µg of commercially available purified protein was incubated with [125I] T4, and the mixture was analyzed on a non-denaturing polyacrylamide gel. αVβ3 is radiolabelled aT4 and this interaction is competitively disrupted by T4, which was added to αVβ3 before incubation with [125I] T4, in a concentration dependent manner (Fig. 24). The addition of non-market T4 reduced the binding of integrin to the radiolabeled ligand by 13% for a total T4 concentration of 10-7 M total (3x10-10 M

25 de T4 libre), 58 % a 10-6 M total (1,6x10-9 M libre), y la inhibición de la unión fue máxima para 10-5 M de T4 no marcado. Mediante una regresión no lineal se determinó la interacción de la αVβ3 con T4 libre para tener un valor de Kd de 333 pM y un valor de CE50 de 371 pM. T3 no marcado fue menos eficaz para desplazar la unión de [125I]T4 a αVβ3, reduciendo la señal en un 28 % a 10-4 M total de T3. 25 of free T4), 58% at 10-6 M total (1.6x10-9 M free), and inhibition of binding was maximal for 10-5 M of unlabeled T4. Using a non-linear regression, the interaction of αVβ3 with free T4 was determined to have a Kd value of 333 pM and an EC50 value of 371 pM. Unlabeled T3 was less effective in displacing the binding of [125I] T4 to αVβ3, reducing the signal by 28% to 10-4 M total of T3.

Ejemplo 24: La unión de T4 a αVβ3 queda bloqueada mediante tetrac, el péptido RGD y el anticuerpo de la integrina Example 24: The binding of T4 to αVβ3 is blocked by tetrac, the RGD peptide and the integrin antibody

Los inventores habían demostrado anteriormente que las rutas de señalización estimuladas por T4 que se activan en la superficie celular se pueden inhibir mediante el análogo de la yodotironina tetrac, que es la forma de evitar la unión The inventors had previously shown that T4-stimulated signaling pathways that are activated on the cell surface can be inhibited by the iodothyronine tetrac analog, which is the way to prevent binding

35 de T4 a la membrana plasmática. En el ensayo de unión de radioligando, aunque tetrac 10-8 M no tuvo efecto sobre la unión de [125I]T4 a αVβ3 purificada, la asociación de T4 y αVβ3 se redujo en un 38 % en presencia de tetrac 10-7 M y en 90 % con tetrac 10-5 M (Fig. 25). Para determinar la especificidad de la interacción, un péptido RGD, que se une al sitio de unión de la matriz extracelular de αVβ3, y un péptido RGE, que tiene un resto ácido glutámico en lugar de un resto ácido aspártico y por lo tanto no se une a αVβ3, se añadieron a lo anterior en un intento de desplazar T4 de su unión con la integrina. La aplicación de un péptido RGD, pero no de un péptido RGE, redujo la interacción de [125I]T4 con αVβ3 de una forma dependiente de la dosis (Fig. 25). 35 of T4 to the plasma membrane. In the radioligand binding assay, although 10-8 M tetrac had no effect on the binding of purified [125I] T4 to αVβ3, the association of T4 and αVβ3 was reduced by 38% in the presence of 10-7 M tetrac and in 90% with 10-5 M tetrac (Fig. 25). To determine the specificity of the interaction, an RGD peptide, which binds to the binding site of the extracellular matrix of αVβ3, and an RGE peptide, which has a glutamic acid moiety instead of an aspartic acid moiety and therefore does not binds to αVβ3, they were added to the above in an attempt to displace T4 from its binding with integrin. The application of an RGD peptide, but not of an RGE peptide, reduced the interaction of [125I] T4 with αVβ3 in a dose-dependent manner (Fig. 25).

Para caracterizar adicionalmente la interacción de T4 con αVβ3, se añadieron anticuerpos dirigidos contra αVβ3o αVβ5a αVβ3 purificado antes de la adición de [125I]T4. La adición de 1 µg/ml del anticuerpo monoclonal de αVβ3, 45 LM609, redujo la formación del complejo entre la integrina y T4 en 52 %, en comparación con las muestras de control no tratadas. El aumento de la cantidad de LM609 a 2 µg, 4 µg, y 8 µg/ml disminuyó la intensidad de la banda en 64 %, 63 % y 81 %, respectivamente (Fig. 26). Se observaron resultados similares cuando un anticuerpo monoclonal de αVβ3 diferente, SC7312, se incubó con la integrina. SC7312 redujo la capacidad de T4 para unirse a αVβ3 en 20% con 1 µg/ml del anticuerpo presente, 46 % con 2 µg, 47 % con 4 µg, y en 59 % cuando estuvieron presentes 8 µg/ml de anticuerpo. La incubación con anticuerpos monoclonales de αV y β3, independientemente, no afectó a la unión de [125I]T4 a αVβ3, lo que sugiere que la asociación requiere que el bolsillo de unión generado a partir del complejo heterodimérico de αVβ3 y no necesariamente una región específica de cualquiera de los monómeros. Para verificar que la reducción en la intensidad de la banda se debía al reconocimiento específico de αVβ3 por los anticuerpos, se incubó αVβ3 purificado con un anticuerpo monoclonal de αVβ5 (P1F6) o IgG de ratón antes de la adición de [125I]T4, To further characterize the interaction of T4 with αVβ3, antibodies directed against purified αVβ3 or αVβ5a αVβ3 were added before the addition of [125I] T4. The addition of 1 µg / ml of the αVβ3 monoclonal antibody, 45 LM609, reduced complex formation between integrin and T4 by 52%, compared to untreated control samples. Increasing the amount of LM609 to 2 µg, 4 µg, and 8 µg / ml decreased band intensity by 64%, 63% and 81%, respectively (Fig. 26). Similar results were observed when a different αVβ3 monoclonal antibody, SC7312, was incubated with integrin. SC7312 reduced the ability of T4 to bind αVβ3 by 20% with 1 µg / ml of the antibody present, 46% with 2 µg, 47% with 4 µg, and 59% when 8 µg / ml antibody was present. Incubation with monoclonal antibodies of αV and β3, independently, did not affect the binding of [125I] T4 to αVβ3, suggesting that the association requires that the binding pocket generated from the heterodimeric complex of αVβ3 and not necessarily a region specific to any of the monomers. To verify that the reduction in band intensity was due to the specific recognition of αVβ3 by the antibodies, purified αVβ3 was incubated with a monoclonal antibody of αVβ5 (P1F6) or mouse IgG before the addition of [125I] T4,

55 ninguno de los cuáles tuvo influencia sobre la formación del complejo entre la integrina y el radioligando (Fig. 26). 55 None of which had an influence on the formation of the complex between integrin and radioligand (Fig. 26).

Ejemplo 25: La activación de MAPK estimulada por T4 está bloqueada por inhibidores de la unión de hormonas y de la integrina αVβ3 Example 25: Activation of MAPK stimulated by T4 is blocked by inhibitors of hormone binding and integrin αVβ3

Se estudió la translocación nuclear de MAPK fosforilado (pERK1/2) en células CV-1 tratadas con niveles fisiológicos de una concentración total de hormonas de 10-7 M de T4, 10-10 M de hormonas libres) durante 30 min. Consistente con los resultados que los inventores habían notificado previamente, T4 indujo la acumulación nuclear de MAPK fosforilado en células CV-1 en 30 min (Fig. 27). La preincubación de células CV-1 con las concentraciones indicadas de antagonistas de αVβ3 durante 16 h redujo la capacidad de T4 de inducir la activación y la translocación de MAPK. La 65 aplicación de un péptido RGD a 10-8 y 10-7 M tuvo un efecto mínimo sobre la activación de MAPK. Sin embargo, el péptido RGD 10-6 M inhibió la fosforilación de MAPK en un 62 % en comparación con los cultivos del control y la Nuclear translocation of phosphorylated MAPK (pERK1 / 2) in CV-1 cells treated with physiological levels of a total hormone concentration of 10-7 M of T4, 10-10 M free hormones) was studied for 30 min. Consistent with the results that the inventors had previously reported, T4 induced nuclear accumulation of phosphorylated MAPK in CV-1 cells in 30 min (Fig. 27). Preincubation of CV-1 cells with the indicated concentrations of αVβ3 antagonists for 16 h reduced the ability of T4 to induce MAPK activation and translocation. The application of a 10-8 and 10-7 M RGD peptide had a minimal effect on MAPK activation. However, the 10-6 M RGD peptide inhibited MAPK phosphorylation by 62% compared to the control cultures and the

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activación se redujo máximamente cuando estuvieron presentes 10-5 M de RGD (85 % de reducción) y 10-4 M de RGD (87 % de reducción) en el medio de cultivo. La adición del péptido RGE no específico al medio de cultivo no tuvo efecto sobre la fosforilación de MAPK y la translocación nuclear tras el tratamiento con T4 en células CV-1. activation was maximally reduced when 10-5 M of GDPR (85% reduction) and 10-4 M of GDPR (87% reduction) were present in the culture medium. The addition of the non-specific RGE peptide to the culture medium had no effect on MAPK phosphorylation and nuclear translocation after treatment with T4 in CV-1 cells.

5 Tetrac, que evita la unión de T4 a la membrana plasmática, es un inhibidor eficaz de la activación de MAPK inducida por T4. Cuando estuvo presente a una concentración de 10-6 M con T4, tetrac redujo la fosforilación y la translocación de MAPK en un 86 % cuando se comparó con cultivos tratados con T4 solo (Fig. 27). La inhibición aumentó en un 97 % cuando se añadieron 10-4 M de tetrac al medio de cultivo durante 16 h antes de la aplicación de T4. La adición del anticuerpo monoclonal LM609 dirigido contra αVβ3 al medio de cultivo 16 h antes de la estimulación con T4 redujo 5 Tetrac, which prevents the binding of T4 to the plasma membrane, is an effective inhibitor of T4-induced MAPK activation. When present at a concentration of 10-6 M with T4, tetrac reduced phosphorylation and MAPK translocation by 86% when compared to cultures treated with T4 alone (Fig. 27). The inhibition increased by 97% when 10-4 M of tetrac was added to the culture medium for 16 h before the application of T4. The addition of the monoclonal antibody LM609 directed against αVβ3 to the culture medium 16 h before stimulation with T4 reduced

10 también la activación de MAPK inducida por T4. LM609 a 0,01 y 0,001 µg/ml de medio de cultivo no afecta la activación de MAPK tras el tratamiento con T4. Aumentando la concentración de anticuerpo en el medio de cultivo a 0,1, 1, y 10 µg/ml redujeron los niveles de MAPK fosforilado que se encuentran en las fracciones nucleares de las células en un 29 %, 80 %, y 88 %, respectivamente, cuando se compararon con células tratadas solo con T4. 10 also the activation of MAPK induced by T4. LM609 at 0.01 and 0.001 µg / ml of culture medium does not affect MAPK activation after treatment with T4. Increasing the concentration of antibody in the culture medium to 0.1, 1, and 10 µg / ml reduced the levels of phosphorylated MAPK found in the nuclear fractions of the cells by 29%, 80%, and 88%, respectively, when compared to cells treated only with T4.

15 Se transfectaron transitoriamente células CV1 con ARNip de αV, β3o α β3 y se dejaron recuperar durante 16 h antes de colocarse en medio exento de suero. Tras el tratamiento con T4 durante 30 min, Se recogieron las células y cualquier proteína nuclear o se extrajo el ARN. La Figura 28A demuestra la especificidad de cada ARNip para la subunidad de la integrina diana. Las células CV-1 transfectadas tanto con ARNip de αV o ARNip αV y β3 mostró una disminución de productos de la RT-PCR de la subunidad αV, pero no hubo diferencia en la expresión del ARNm de αV 15 CV1 cells were transiently transfected with αV, β3o α β3 siRNA and allowed to recover for 16 h before being placed in serum-free medium. After treatment with T4 for 30 min, cells and any nuclear protein were collected or RNA was extracted. Figure 28A demonstrates the specificity of each siRNA for the subunit of the target integrin. CV-1 cells transfected with both αV siRNA or αV and β3 siRNA showed a decrease in RT-PCR products of the αV subunit, but there was no difference in the expression of αV mRNA

20 cuando se transfectaron las células con el ARNip específico de β3, o cuando se expone al reactivo de transfección en ausencia de ARNip exógeno. De manera similar, las células transfectadas con ARNip de β3 tienen niveles reducidos de ARNm de β3 pero niveles relativamente inalterados de ARNip de αV. La adición de T4 durante 30 min no altera los niveles de ARNm tanto para αV o β3, sin tener en cuenta el ARNip transfectado en las células. 20 when cells were transfected with the β3 specific siRNA, or when exposed to the transfection reagent in the absence of exogenous siRNA. Similarly, cells transfected with β3 siRNA have reduced levels of β3 mRNA but relatively unchanged levels of αV siRNA. The addition of T4 for 30 min does not alter mRNA levels for both αV or β3, regardless of the transfected siRNA in the cells.

25 Los niveles de MAPK activados se midieron mediante transferencia western en células CV-I transfectadas con ARNip a αV y β3, tanto individualmente como en combinación (Fig. 28B). Células CV-I tratadas con ARNip del control negativo codificado tuvieron niveles ligeramente elevados de MAPK activado indujeron T4 cuando se compararon con la línea de células precursoras. Las células expuestas al reactivo de transfección muestran solo niveles y modelos similares de fosforilación de MAPK como las células CV-1 no transfectadas. Cuando cualquiera entre ARNip de αV o 25 Activated MAPK levels were measured by western blotting in CV-I cells transfected with siRNA to αV and β3, both individually and in combination (Fig. 28B). CV-I cells treated with siRNA of the encoded negative control had slightly elevated levels of activated MAPK induced T4 when compared to the precursor cell line. Cells exposed to the transfection reagent show only similar levels and models of MAPK phosphorylation as non-transfected CV-1 cells. When anyone enters αV siRNA or

30 ARNip de β3, solo o en combinación, se transfectó en células CV-1, se elevó el nivel de MAPK fosforilado en cultivos tratados con vehículos, pero se inhibió la capacidad de T4 de inducir una elevación adicional de los niveles de MAPK. Β3 siRNA, alone or in combination, was transfected into CV-1 cells, the level of phosphorylated MAPK was raised in vehicle-treated cultures, but the ability of T4 to induce further elevation of MAPK levels was inhibited.

Ejemplo 26: La angiogénesis inducida por hormonas queda bloqueada por anticuerpos dirigidos contra αVβ3 Example 26: Hormone-induced angiogenesis is blocked by antibodies directed against αVβ3

35 La angiogénesis está estimulada en el ensayo CAM mediante la aplicación de concentraciones fisiológicas de T4 (Fig. 29A y resumida en la Fig. 29B). T4 10-7 M colocado en el disco de filtro CAM indujeron la formación de ramificaciones en 2,3 veces (P <0,001) cuando se compararon con membranas tratadas con PBS. Propiltiouracilo, que evita la conversión de T4 a T3, no tiene efecto sobre la angiogénesis producida por T4. La adición de un anticuerpo monoclonal, LM609 (10 µg/disco de filtro), dirigido contra αVβ3, inhibió la respuesta proangiogénica a T4. 35 Angiogenesis is stimulated in the CAM assay by the application of physiological concentrations of T4 (Fig. 29A and summarized in Fig. 29B). T4 10-7 M placed in the CAM filter disc induced branching at 2.3 times (P <0.001) when compared to membranes treated with PBS. Propylthiouracil, which prevents the conversion of T4 to T3, has no effect on the angiogenesis produced by T4. The addition of a monoclonal antibody, LM609 (10 µg / filter disc), directed against αVβ3, inhibited the proangiogenic response to T4.

40 Ejemplo 27: Conjugados de polímeros biocompatibles de análogos de hormonas tiroideas para la administración a corto y largo plazo Example 27: Conjugates of biocompatible polymers of thyroid hormone analogues for short and long term administration

Bosquejo 1: Sketch 1:

45 Análogos de hormonas tiroideas: 45 Thyroid hormone analogues:

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Bosquejo 2: Modelos moleculares que muestran la vista en 3 D de la topografía y geometría y molecular en modelos de barras, bolas y barras, disco y espacio sólido para su evaluación comparativa. Modelo de barra: Moléculas en dos conjuntos que muestran la densidad molecular en el conjunto inferior. Conjunto 1: Triac y Tetrac (yodos en amarillo, oxígenos en rojo) Sketch 2: Molecular models that show the 3 D view of the topography and geometry and molecular models of bars, balls and bars, disk and solid space for comparative evaluation. Bar model: Molecules in two sets that show the molecular density in the lower set. Set 1: Triac and Tetrac (iodine in yellow, oxygen in red)

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Conjunto 2 Set 2

15 Modelo de bolas y barras: Triac y Tetrac -conjunto inferior que muestra la densidad molecular y la alineación topográfica. 20 Conjunto 1 15 Ball and bar model: Triac and Tetrac - lower set that shows molecular density and topographic alignment. 20 Set 1

Conjunto 2 Set 2

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Modelo de disco: Triac y Tetrac Disc model: Triac and Tetrac

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Modelo de espacio sólido: Triac y Tetrac Solid space model: Triac and Tetrac

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10 Análogos de hormonas tiroideas y actividad anticancerosa: 10 Thyroid hormone analogues and anticancer activity:

Los metabolitos de las hormonas tiroideas Triac y Tetrac se usan en el tratamiento del cáncer de tiroides para el enriquecimiento y como tratamiento sustituto para sus necesidades. Thyroid hormone metabolites Triac and Tetrac are used in the treatment of thyroid cancer for enrichment and as a substitute treatment for your needs.

15 Hormonas tiroideas comercialmente disponibles y sus análogos: 15 Commercially available thyroid hormones and their analogues:

Existen algunos nombres comerciales de hormonas tiroideas sintéticas disponibles en el mercado que incluyen Unithroid®, Levothroid®, Synthroid® y Levoxyl®. Existen formulaciones genéricas del tipo Levo-T®, Levothyroxine There are some commercial names of commercially available synthetic thyroid hormones that include Unithroid®, Levothroid®, Synthroid® and Levoxyl®. There are generic formulations of the Levo-T® type, Levothyroxine

20 Sodium® y Novothyrox®. 20 Sodium® and Novothyrox®.

Las hormonas tiroideas naturales se comercializan como suplementos alimenticios en forma seca y en polvo obtenidos a partir de glándulas tiroideas de animales sacrificados. Esta píldora de producto desecado puede contener proteína animal no deseada, un equilibrio inadecuado de los compuestos T3 y T4 y los aglutinantes sintéticos que es menos Natural thyroid hormones are marketed as dry and powdered food supplements obtained from the thyroid glands of slaughtered animals. This dried product pill may contain unwanted animal protein, an inadequate balance of compounds T3 and T4 and synthetic binders that is less

25 recomendado para el consumo humano. La relación de T3 a T4 puede variar entre lotes dependiendo de la glándula del animal y no se ha encontrado que sea constante para ninguna administración correcta en sujetos humanos. La complicación en la dosis, la administración y la disponibilidad en el sistema es un argumento para una dosis normalizada, constante, limitada y un régimen de liberación temporal para un consumo humano seguro y otros usos tópicos. 25 recommended for human consumption. The ratio of T3 to T4 may vary between batches depending on the animal's gland and has not been found to be constant for any correct administration in human subjects. Complication in dose, administration and availability in the system is an argument for a standardized, constant, limited dose and a temporary release regimen for safe human consumption and other topical uses.

30 Sistema de liberación regulada de hormonas tiroideas: 30 Regulated Thyroid Hormone Release System:

Hasta el momento no está disponible un régimen específico y normalizado de tratamiento para el tratamiento de sustitución de hormonas tiroideas en pacientes estadounidenses. Los inventores están proponiendo un sistema de A specific and standardized treatment regimen for the treatment of thyroid hormone replacement in American patients is not available so far. The inventors are proposing a system of

35 liberación lenta permanente a largo plazo de los constituyen tiroideos individuales basado en las necesidades personalizadas preclasificadas para la dosis, el perfil de actividad y respuesta deseados en los sistemas de ensayo. Los inventores conseguirán esto a través de la administración de constituyentes tiroideos unidos a polímeros en el sitio de estos productos para definir la dosis y en una distribución limitada. Los conjugados (Fig. 3 -un bosquejo) tendrán una capacidad de liberación a corto y largo plazo conseguida a través de características hidrolizables y no The long-term permanent slow release of the individual thyroid constitutes based on the pre-classified customized needs for the dose, the desired activity profile and response in the test systems. The inventors will achieve this through the administration of polymer-bound thyroid constituents at the site of these products to define the dose and in a limited distribution. The conjugates (Fig. 3 - a sketch) will have a short and long term release capacity achieved through hydrolysable characteristics and not

40 hidrolizables. Esto conseguirá la administración del nivel mínimo de dosis para las propiedades cardiovasculares y de cicatrización de heridas específicas. 40 hydrolysable. This will achieve the administration of the minimum dose level for the cardiovascular and healing properties of specific wounds.

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Bosquejo 3: Conjugados poliméricos ordenados y aleatorios -Sketch 3: Ordered and random polymer conjugates -

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O = Fármaco/Compuesto orgánico/ Entidad que se conjuga 5 Plantillas poliméricas usuales para el fármaco/API del conjugado O = Drug / Organic compound / Entity that is conjugated 5 Polymeric templates customary for the drug / API of the conjugate

Sistemas de Administración de conjugados: Conjugate Administration Systems:

Entre los sistemas de administración en desarrollo, están ganando terreno las entidades químicas conjugadas a Among the developing management systems, chemical entities conjugated to

10 polímeros sintéticos. Están disponibles varios grupos secundarios de origen sintético; natural y biopolimérico con polímeros con una estructura biodegradable eficaz y están en uso en el mercado. Están disponibles polialquil glicoles, poliésteres, polianhídridos, polisacáridos, y poliaminoácidos para la conjugación dependiendo de la característica final del producto conjugado en términos de su hidrofilicidad, naturaleza hidrófoba, hidrólisis por enzimas, cofactores y ácidos biológicamente disponibles in vivo así como en sistemas in vitro a tal fin. 10 synthetic polymers. Several secondary groups of synthetic origin are available; Natural and biopolymer with polymers with an effective biodegradable structure and are in use in the market. Polyalkyl glycols, polyesters, polyanhydrides, polysaccharides, and polyamino acids are available for conjugation depending on the final characteristic of the conjugate product in terms of its hydrophilicity, hydrophobic nature, enzyme hydrolysis, cofactors and biologically available acids in vivo as well as in vitro systems. To that end.

15 fifteen

Conjugación Polimérica-Síntesis y Purificación: Polymeric Conjugation-Synthesis and Purification:

Los inventores están proponiendo una biblioteca de productos conjugados (véase la Fig. 6 y la Tabla 1) para los productos conjugados de polímeros controlados, hidrolizables así como no hidrolizables incluyendo los biopolímeros. 20 Se derivará un caso de ensayo a partir de cada categoría de productos poliméricos para su estudio detallado en términos de su administración que cubre la farmacocinética, el transporte, la vida media y la degradación y/o los datos de la erosión. Se intentará también preparar la serie como un diseño simultáneo o de biblioteca de síntesis combinatoria ajustado a la clase de reacción química similar para el sustrato y los polímeros variables que utilizan DCC, DCC/HOBt y otros reactivos solubles en agua que incluyen la colocación de un enlazador y estrategias sintéticas 25 basadas en ésteres de NHS comúnmente utilizados con vistas a desarrollos futuros en la conjugación polimérica combinatoria de síntesis paralela. Las instalaciones disponibles del sintetizador en PRI se utilizarán dirigidas hacia este efecto y cada producto se purificará individualmente para la adecuabilidad de los sistemas de ensayos biológicos. The inventors are proposing a library of conjugated products (see Fig. 6 and Table 1) for the conjugated products of controlled, hydrolyzable as well as non-hydrolysable polymers including biopolymers. 20 A test case will be derived from each category of polymer products for detailed study in terms of their administration covering pharmacokinetics, transport, half-life and degradation and / or erosion data. An attempt will also be made to prepare the series as a simultaneous or combinatorial synthesis library design adjusted to the similar chemical reaction class for the substrate and the variable polymers using DCC, DCC / HOBt and other water soluble reagents that include the placement of a linker and synthetic strategies based on commonly used NHS esters with a view to future developments in the combinatorial polymer conjugation of parallel synthesis. The available facilities of the synthesizer in PRI will be used directed towards this effect and each product will be purified individually for the suitability of the biological test systems.

Bosquejo 4: Estructuras representativas de conjugados poliméricos procedentes de cadenas de polímeros naturales, 30 sintéticos y polipeptídicos. Sketch 4: Representative structures of polymer conjugates from chains of natural, synthetic and polypeptide polymers.

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n = longitud de la cadena R=H, PEG bifuncional-unido a T3 R=I, PEG bifuncional unido a T4 n = chain length R = H, bifunctional PEG-linked to T3 R = I, bifunctional PEG linked to T4

PEG basado en compuestos tiroideos Sistemas de administración conjugados a polímeros PEG based on thyroid compounds Administration systems conjugated to polymers

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Metoxi-PEG unido a T4 Conjugado polimérico de producto tiroideo Methoxy-PEG bound to T4 Polymeric conjugate of thyroid product

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R = Unidad de repetición de cadena de HEMA Conjugado de T4 unido a Poli (HEMA) R = T4 Conjugated HEMA chain repeat unit linked to Poly (HEMA)

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Conjugado inmovilizado Poli-(anhídrido vinil-co-maleico) A = Constituyente tiroideo (conjugado a través del extremo amina) Conjugate immobilized Poly- (vinyl-co-maleic anhydride) A = Thyroid constituent (conjugated through the amine end)

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R = Unidad de repetición de cadena A = Constituyente tiroideo (conjugado a través del extremo carboxilo) R = Chain repeat unit A = Thyroid constituent (conjugated through the carboxyl end)

Conjugado inmovilizado a poli-(lactida-co-lisina) Conjugate immobilized to poly- (lactide-co-lysine)

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R1 = Cadena de monómeros de sacárido R2 = Constituyentes tiroideos R1 = Saccharide monomer chain R2 = Thyroid constituents

Conjugados unidos a ácido hialurónico R = Constituyentes tiroideos T3/T4/DITPA/GC-1 Constituyentes tiroideos inmovilizados en poliamidoamina multifuncional Conjugates bound to hyaluronic acid R = Thyroid constituents T3 / T4 / DITPA / GC-1 Thyroid constituents immobilized in multifunctional polyamidoamine

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A = Constituyente tiroideo seleccionado conjugado A = Conjugate selected thyroid constituent

Conjugado polipeptídico tiroideo mobilizado Mobilized thyroid polypeptide conjugate

10 10

Conjugados poliméricos-Caracterización física y química: Polymeric conjugates-Physical and chemical characterization:

Se realizará mediante un análisis espectro-analítico y cromatográfico de los compuestos unidos a polímero utilizando RMN(Campo alto y bajo Protones y carbono, DEPT, HOMOCOSY & HETEROCOSY/HETCOR donde sea aplicable), 15 IR, EM, HPLC, análisis de degradación térmica y ambiental para la adecuabilidad de la estabilidad y perfil de la velocidad de degradación. It will be carried out by means of a spectrum-analytical and chromatographic analysis of polymer bound compounds using NMR (High and low field Protons and carbon, DEPT, HOMOCOSY & HETEROCOSY / HETCOR where applicable), 15 IR, MS, HPLC, thermal degradation analysis and environmental for the adequacy of stability and degradation rate profile.

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Estudios de liberación y estabilidad: Release and stability studies:

Se realizará un análisis de HPLC detallado para los análisis de liberación cuantitativos basándose en el protocolo establecido por los inventores para los productos tiroideos individuales, es decir, GC-1, T3, T4 y DITPA así como Triac 5 y Tetrac junto con el polímero individual y el perfil cromatográfico y espectroanalítico del producto conjugado a polímero. A detailed HPLC analysis will be performed for quantitative release analyzes based on the protocol established by the inventors for individual thyroid products, i.e. GC-1, T3, T4 and DITPA as well as Triac 5 and Tetrac together with the individual polymer. and the chromatographic and spectroanalytical profile of the polymer conjugated product.

Criterios de compatibilidad de polímeros para la conjugación: Compatibility criteria of polymers for conjugation:

Se han diseñado polímeros biodegradables y biocompatibles como vehículos probables para vehículos de administración a largo plazo y corto plazo que incluyen conjugados poliméricos no hidrolizables (tabla 1). Los PEG y PEO son los polímeros con extremos hidroxilo más comunes con una amplia gama de pesos moleculares a seleccionar a fines de solubilidad (modo de vehículo fácil), tiempos de degradación y velocidad de conjugación. Se empleará también un extremo protegido con metoxi-PEG como un vehículo de cadena lineal capaz de hincharse y Biodegradable and biocompatible polymers have been designed as probable vehicles for long-term and short-term administration vehicles that include non-hydrolyzable polymer conjugates (Table 1). PEG and PEO are the most common polymers with hydroxyl ends with a wide range of molecular weights to be selected for the purpose of solubility (easy vehicle mode), degradation times and conjugation rates. A methoxy-PEG protected end will also be used as a linear chain vehicle capable of swelling and

15 reducir por tanto los estímulos para obtener la proteína unida o de adherirse durante el transporte subcelular. Determinados copolímeros de etileno y acetato de vinilo, es decir, EVAc que tienen una biocompatibilidad excepcionalmente buena, cristalinidad baja y naturaleza hidrófoba son candidatos ideales para la encapsulación mediada por un vehículo de administración de fármacos. 15 therefore reduce stimuli to obtain bound protein or to adhere during subcellular transport. Certain copolymers of ethylene and vinyl acetate, that is, EVAc that have an exceptionally good biocompatibility, low crystallinity and hydrophobic nature are ideal candidates for encapsulation mediated by a drug delivery vehicle.

Se utilizarán polímeros con una vida media demostrada alta y propiedades de retención en el sistema a fines de conjugación. Entre los polímeros biodegradables más comunes y recomendados se usarán polímeros procedentes de ácido láctico y glicólico. Los copolímeros de L-lactida, y L-lisina son útiles debido a su disponibilidad de grupos funcionales amina para la formación del enlace amida y esto sirve como un sitio de unión covalente duradero del vehículo y el compuesto tiroideo transportable unidos juntos a través del resto carboxi en todos los constituyentes Polymers with a demonstrated high half-life and retention properties in the system will be used for conjugation purposes. Among the most common and recommended biodegradable polymers, polymers from lactic and glycolic acid will be used. The copolymers of L-lactide, and L-lysine are useful due to their availability of amine functional groups for the formation of the amide bond and this serves as a durable covalent binding site of the vehicle and the transportable thyroid compound joined together through the rest. carboxy in all constituents

25 tiroideos. 25 thyroid

Los polisacáridos se producen naturalmente a partir de celulosa, quitina, dextrano, ficol, pectina, carragenato (todos los subtipos), y alginato y algunos de sus derivados semisintéticos son vehículos ideales debido a su elevada biocompatibilidad, biosistemas familiares de productos de degradación (monosacáridos de glucosa y fructosa), naturaleza hidrófila, solubilidad, inmovilización de proteínas/interacción para estabilidad a largo plazo de la matriz polimérica. Esto proporciona una cubierta para la protección extra de la matriz polimérica procedente de la degradación en el tiempo y la adición a la vida media del conjugado. Polysaccharides are naturally produced from cellulose, chitin, dextran, ficol, pectin, carrageenan (all subtypes), and alginate and some of its semi-synthetic derivatives are ideal vehicles due to their high biocompatibility, family biosystems of degradation products (monosaccharides glucose and fructose), hydrophilic nature, solubility, protein immobilization / interaction for long-term stability of the polymer matrix. This provides a cover for extra protection of the polymer matrix from degradation over time and addition to the conjugate half-life.

Las proteínas y polipéptidos procedentes de albúmina de suero, colágeno, gelatina y poli-L-lisina, poli-L-alanina, Proteins and polypeptides from serum albumin, collagen, gelatin and poly-L-lysine, poly-L-alanine,

35 poli-L-serina y aminoácidos naturales basados en transportadores de fármacos con ventaja de biodegradación, biocompatibilidad y tiempos de liberación moderados de la molécula transportadora. La poli-L-serina es de interés adicional debido a sus derivados de cadena diferentes, por ejemplo, éster de poliserina, poliserina imina y estructuras poliméricas de poliserina convencionales con sitios disponibles para la conjugación covalente específica. 35 poly-L-serine and natural amino acids based on drug transporters with advantage of biodegradation, biocompatibility and moderate release times of the transport molecule. The poly-L-serine is of additional interest due to its different chain derivatives, for example, polyserine ester, polyiserine imine and conventional polyserine polymer structures with sites available for specific covalent conjugation.

Se han usado con frecuencia hidrogeles sintéticos procedentes de polímeros derivados de metacrilato en aplicaciones biomédicas debido a su similitud en tejidos vivos. Los hidrogeles sintéticos más ampliamente usados son polímeros de ácido acrílico, acrilamida y 2-hidroxietil metacrilato (HEMA). Los poli HEMA son baratos, biocompatibles, con funcionalidad de alargamiento de la cadena secundaria del alcohol primario disponible para la conjugación y configurada para aplicaciones oculares, intraoculares y otras aplicaciones oftálmicas que las convierten en perfectos Synthetic hydrogels from methacrylate-derived polymers have been frequently used in biomedical applications due to their similarity in living tissues. The most widely used synthetic hydrogels are polymers of acrylic acid, acrylamide and 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Poly HEMA are cheap, biocompatible, with elongation functionality of the secondary chain of the primary alcohol available for conjugation and configured for ocular, intraocular and other ophthalmic applications that make them perfect

45 materiales de administración de fármacos. Los pHEMA son inmunes a la unión celular y proporcionan una motilidad celular cero que los convierten en candidatos ideales para sistemas de administración interna. 45 drug delivery materials. The pHEMA are immune to cell binding and provide zero cell motility that make them ideal candidates for internal administration systems.

Se ha conseguido la conjugación del análogo tiroideo sintético DITPA mediante un programa de diseño de bibliotecas dando como resultado el desarrollo de productos conjugados de DITPA bruto. Se está realizando en la actualidad el acoplamiento de los polímeros hidrófilos PVA y PEG mediado por la dicicolhexil carbodiimida y por otros reactivos de acoplamiento de naturaleza hidrófila e hidrófoba. The conjugation of the synthetic thyroid analogue DITPA has been achieved through a library design program resulting in the development of conjugated products of crude DITPA. The coupling of the hydrophilic polymers PVA and PEG mediated by dicicolhexyl carbodiimide and other coupling reagents of a hydrophilic and hydrophobic nature is currently being carried out.

El diseño para la evolución de síntesis de bibliotecas en un sintetizador en fase sólida está en sus etapas finales y se implantará un modelo para su cribado de alto rendimiento (HTS) basándose en la coincidencia del sistema de ensayo The design for the evolution of synthesis of libraries in a solid phase synthesizer is in its final stages and a model for high performance screening (HTS) will be implemented based on the coincidence of the test system

55 y en criterios paramétricos. Se acumularán los análisis estadísticos para el tiempo de administración, la vida media y la estabilidad concebida de los conjugados a fines del análisis de administración de estructuras (SDA). Lo que sigue es una lista de conjugados poliméricos previstos para la preparación (Tabla 8). 55 and in parametric criteria. Statistical analyzes will be accumulated for the administration time, half-life and stability conceived of the conjugates for the purpose of structure management analysis (SDA). The following is a list of polymer conjugates intended for preparation (Table 8).

Tabla 8: Biblioteca de conjugados poliméricos diseñados para posibles preparaciones basándose en reactividades por clase química y datos de estabilidad. Table 8: Library of polymer conjugates designed for possible preparations based on reactivities by chemical class and stability data.

Nº de serie Serial number

Polímero Propiedades (H hidrolizable, NH no hidrolizable, RR Liberación retardada) Polymer Properties (hydrolysable H, non-hydrolysable NH, RR Delayed Release)

1 one

PEO H PEO H

2 2

m-PEG H m-PEG H

3 3

PVA Hidrófilo, H PVA Hydrophilic, H

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4 4

PLLA Hidrófilo, H PLLA Hydrophilic, H

5 5

PGA Hidrófilo, H PGA Hydrophilic, H

6 6

Poli L-Lisina NH Poly L-Lysine NH

7 7

Seroalbúmina humana Proteína, NH Human serum albumin Protein, NH

8 8

Derivados de celulosa (Carbometoxi/ etil/ hidroxipropil) Polisacárido, RR Cellulose derivatives (Carbomethoxy / ethyl / hydroxypropyl) Polysaccharide, RR

9 9

Ácido hialurónico Polisacárido, RR Hyaluronic acid Polysaccharide, RR

10 10

Folato unido a ciclodextrina/dextrano RR Folate linked to cyclodextrin / dextran RR

11 eleven

Sarcosina/ polímero separado por aminoácido RR Sarcosine / polymer separated by amino acid RR

12 12

Alginato/ carragenato Polisacárido, RR Alginate / Carrageenan Polysaccharide, RR

13 13

Pectina/ Quitosán Polisacárido, RR Pectin / Chitosan Polysaccharide, RR

14 14

Dextrano Polisacárido, RR Dextran Polysaccharide, RR

15 fifteen

Colágeno Proteína, NH Collagen Protein, NH

16 16

Poliamina Amínico, NH Polyamine Aminic, NH

17 17

Polianilina Amínico, NH Polyaniline Aminic, NH

18 18

Polialanina Peptídico, RR Polyalanine Peptide, RR

19 19

Politriptófano Peptídico, NH/ RR Polyprophan Peptide, NH / RR

20 twenty

Politirosina Peptídico, NH/ RR Polytyrosine Peptide, NH / RR

Claims (3)

imagen1image 1 REIVINDICACIONES 1. Un agente antiangiogénesis para su uso en el tratamiento del glioma o el cáncer de mama, en donde el agente antiangiogénesis es ácido tetrayodotiroacético (TETRAC) o ácido triyodotiroacético (TRIAC), o una de sus 1. An anti-angiogenesis agent for use in the treatment of glioma or breast cancer, wherein the anti-angiogenesis agent is tetraiodothyroacetic acid (TETRAC) or triiodothyroacetic acid (TRIAC), or one of its 5 combinaciones, y en donde el agente antiangiogénesis actúa en la superficie celular para inhibir un agente proangiogénesis y en donde el agente antiangiogénesis se conjuga con un polímero mediante un enlace covalente. 5 combinations, and wherein the antiangiogenesis agent acts on the cell surface to inhibit a proangiogenesis agent and wherein the antiangiogenesis agent is conjugated to a polymer by a covalent bond. 2. Un agente antiangiogénesis para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el agente antiangiogénesis es 2. An anti-angiogenesis agent for use according to claim 1 wherein the anti-angiogenesis agent is para su administración por vía parenteral, oral, rectal o tópica, o una de sus combinaciones. 10 for administration parenterally, orally, rectally or topically, or one of its combinations. 10 3. Un agente antiangiogénesis para el uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 en el que el agente antiangiogénesis se administra simultáneamente con uno o más tratamientos antiangiogénesis o agentes quimioterapéuticos diferentes. 3. An anti-angiogenesis agent for use according to claims 1 or 2 wherein the anti-angiogenesis agent is administered simultaneously with one or more different anti-angiogenesis treatments or chemotherapeutic agents. 15 fifteen 63 63