ES2534330T3 - Método de análisis biológico para anticuerpo contra el receptor de la hormona estimuladora tiroidea, kit de medición para el anticuerpo, y célula modificada genéticamente novedosa para su uso en el método de análisis biológico o en el kit de medición - Google Patents

Método de análisis biológico para anticuerpo contra el receptor de la hormona estimuladora tiroidea, kit de medición para el anticuerpo, y célula modificada genéticamente novedosa para su uso en el método de análisis biológico o en el kit de medición Download PDF

Info

Publication number
ES2534330T3
ES2534330T3 ES10794054.6T ES10794054T ES2534330T3 ES 2534330 T3 ES2534330 T3 ES 2534330T3 ES 10794054 T ES10794054 T ES 10794054T ES 2534330 T3 ES2534330 T3 ES 2534330T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
concentration
antibody
luminescence
cell
added
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10794054.6T
Other languages
English (en)
Inventor
Naohiro Araki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Otsuka Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2534330T3 publication Critical patent/ES2534330T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/046—Thyroid disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

Un kit para el diagnóstico de enfermedades de la tiroides, que comprende una célula que expresa un receptor de la hormona estimuladora de la tiroides (TSHR), un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, en donde la proteína sensible al calcio es una proteína que emite luminiscencia en respuesta al calcio.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
imagen7
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
E10794054
31-03-2015
integrados) de las proteínas sensibles al calcio en las células tratadas con muestras de sangre de una gran población de individuos normales, por ejemplo, de 50 a 100 individuos normales, y se pueden calcular la media de las mismas y la desviación típica (DT). Cuando la cantidad de luminiscencia inducida por forskolina de la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de ensayo es superior a la media + nDT (por ejemplo, n = 1, 2, 3, 4,
o 5) de las cantidades de luminiscencia inducida por forskolina (valores integrados) de las células tratadas con las muestras de sangre de la población de individuos normales, se puede determinar que la concentración en suero de un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides (TSBAb) del sujeto de ensayo es más alta que la de los individuos normales. Por lo tanto, también se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo.
Alternativamente, se puede calcular la cantidad de luminiscencia (valor integrado) emitida desde la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de ensayo/la cantidad de luminiscencia (valor integrado) emitida desde la célula tratada con una muestra de sangre de un individuo normal × 100 (%) (en lo sucesivo, este valor calculado se define como un valor calculado C). Las cantidades respectivas de luminiscencia (valores integrados) atribuidas a las respectivas muestras de sangre de una gran población de individuos normales y una gran población de pacientes de hipotiroidismo no tratado (por ejemplo, de 50 a 100 individuos por población) se miden de antemano, y se ajusta un valor de corte de tal manera que una verdadera tasa positiva de hipotiroidismo y/o una tasa negativa verdadera (es decir, ser un individuo normal) son, por ejemplo, 80% o más, 90% o más, 92% o más, 94% o más, 96% o más, o 98% o más, respectivamente. Cuando el valor calculado C es mayor que el valor de corte, también se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. El valor de corte se puede ajustar apropiadamente dependiendo de las propiedades de una población diana, tales como la edad y sexo y se puede ajustar a, por ejemplo, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800% o 900%. Además, también se utiliza un patrón de anticuerpo (TSBAb) que tiene una concentración conocida, y su concentración se puede diluir seriadamente para preparar una curva de calibración. La concentración real en suero de un anticuerpo (TSBAb) se calcula a partir de la luminiscencia inducida por forskolina medida de la proteína sensible al calcio en la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de ensayo. Esta concentración se puede comparar con la concentración en suero medida previamente de un anticuerpo (TSBAb) en cada una de una gran población de individuos normales y una gran población de pacientes hipotiroidismo no tratados (por ejemplo, de 50 a 100 individuos por población), o datos conocidos referidos en un documento para diagnosticar o no el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. Por ejemplo, cuando la concentración es superior a la media + nDT (por ejemplo, n = 1, 2, 3, 4, o 5) de las concentraciones en suero de (TSBAb) de la población de individuos normales, se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. Para la medición de la cantidad de luminiscencia, se prefiere para medir el valor integrado por el tiempo dado. Por ejemplo, el valor integrado se puede medir durante 5 s, 10 s, 15 s, 20 s, 30 s, 40 s, 50 s, o 1 min.
Por otra parte, se puede determinar un ser humano que tiene un alto riesgo de desarrollar una enfermedad de la tiroides, por ejemplo, un ser humano que tiene un alto riesgo de desarrollar la enfermedad de Graves o hipotiroidismo, utilizando la composición anterior. Por ejemplo, cuando la concentración en suero de un anticuerpo estimulador de la tiroides medida utilizando la composición anterior en el examen médico es menor que el valor numérico de un paciente con la enfermedad de Graves y más alto que el valor numérico de un individuo normal, se puede determinar que esta persona es un ser humano que tiene un alto riesgo de desarrollar la enfermedad de Graves. Cuando la concentración en suero de un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides es menor que el valor numérico de hipotiroidismo y mayor que el valor numérico de un individuo normal, se puede determinar que esta persona es un ser humano que tiene un alto riesgo de desarrollar hipotiroidismo. Por otra parte, cuando la concentración de suero de un anticuerpo estimulador de la tiroides medida utilizando la composición anterior en el examen médico se incrementa gradualmente con el tiempo, se puede determinar que esta persona es un ser humano que tiene un alto riesgo de desarrollar la enfermedad de Graves. Cuando la concentración en suero de un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides se incrementa gradualmente con el tiempo, se puede determinar que esta persona es un ser humano que tiene un alto riesgo de desarrollar hipotiroidismo.
Además, también se puede determinar la eficacia del tratamiento para un ser humano en tratamiento de enfermedad de la tiroides, por ejemplo, un ser humano con la enfermedad de Graves o hipotiroidismo bajo tratamiento de las mismas utilizando la composición anterior. Por ejemplo, la concentración de un anticuerpo estimulador de la tiroides o un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides de muestras de sangre tomadas del mismo individuo, tanto antes como después del tratamiento, y el cambio dependiente del tiempo en la concentración se pueden medir utilizando la composición anterior para determinar la presencia o ausencia de eficacia del tratamiento. Cuando la concentración en suero del anticuerpo estimulador de la tiroides medida utilizando la composición anterior es menor después del tratamiento que antes del tratamiento, se puede determinar que el tratamiento de la enfermedad de Graves es eficaz. Cuando la concentración de suero del anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides medida utilizando la composición anterior es menor antes del tratamiento que después del tratamiento, se puede determinar que el tratamiento del hipotiroidismo es eficaz.
La presente invención proporciona un kit que comprende la célula que expresa un receptor de la hormona
imagen8
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
E10794054
31-03-2015
caso, la proteína sensible al calcio en la célula emite luminiscencia debido a la TSH. Por lo tanto, se puede diagnosticar la enfermedad de Graves en este paciente, aunque él o ella sea un paciente de hipotiroidismo. Sin embargo, se añade una muestra de sangre derivada del paciente de hipotiroidismo que tiene una alta cantidad de TSH junto con el anticuerpo anti-TSH a la célula para neutralizar la TSH derivada del paciente. Por lo tanto, se puede evitar el diagnóstico incorrecto de la enfermedad de Graves en el paciente. Por otra parte, la cantidad de luminiscencia emitida desde la proteína sensible al calcio se puede comparar entre el caso en el que se añade el anticuerpo anti-TSH junto con la muestra de sangre derivada del paciente a la célula de la presente invención y el caso en el que la muestra de sangre derivada del paciente se añade a la célula de la presente invención sin la adición del anticuerpo anti-TSH, y de este modo se puede obtener información sobre la cantidad de TSH de la sangre del paciente. Un médico puede diagnosticar más correctamente la enfermedad de la tiroides mediante la combinación de la información con los síntomas clínicos de la paciente.
Además, el kit de la presente invención contiene adicionalmente el suero de un paciente con la enfermedad de la tiroides, por ejemplo, los sueros de un paciente con la enfermedad de Graves y/o un paciente con hipotiroidismo. Un suero de este tipo se puede utilizar como un control o un patrón para el cálculo de la concentración en el diagnóstico de la enfermedad de la tiroides, en la evaluación de un riesgo de desarrollar la enfermedad, o en la evaluación de la eficacia del tratamiento de la enfermedad.
Además, el kit de la presente invención puede contener una sustancia que activa la adenilato ciclasa, por ejemplo, forskolina. La presencia o ausencia de de un anticuerpos de bloqueo de la estimulación de la tiroides en una muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo se pueden determinar mediante la adición de la muestra junto con TSH a la célula, el cultivo de la célula durante el tiempo dado, y a continuación la adición de forskolina a la misma. Por otra parte, también se puede medir la concentración de un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides de la muestra. Como resultado, se puede diagnosticar el hipotiroidismo (por ejemplo, la enfermedad de Hashimoto), se puede determinar un ser humano que tiene un riesgo de desarrollar hipotiroidismo (por ejemplo, la enfermedad de Hashimoto), o se puede determinar el efecto terapéutico en un paciente que ha sufrido el tratamiento del hipotiroidismo (por ejemplo, la enfermedad Hashimoto).
El kit de acuerdo con la presente invención también es útil como coadyuvante de diagnóstico que ayuda a un médico a diagnosticar la enfermedad de Graves y/o el hipotiroidismo en vista de los síntomas clínicos del paciente y/o otros resultados de los exámenes. Por ejemplo, la medición de la cantidad de un anticuerpo estimulador de la tiroides (TSAb) en una muestra de sangre de un paciente que exhibe hipertiroidismo utilizando la composición o el kit de acuerdo con la presente invención puede ser útil para el diagnóstico diferencial entre la enfermedad de Graves y el hipertiroidismo destructivo (p. ej., la tiroiditis indolora o tiroiditis subaguda).
También se proporciona un método para diagnosticar la enfermedad de Graves, que comprende las siguientes etapas (A) a (C):
(A)
preparar una mezcla que contiene una célula como se ha definido anteriormente, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio exento de Ca2+ y una muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo;
(B)
añadir una disolución que contiene Ca2+ a la mezcla preparada en (A); y
(C)
medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida desde la célula.
El medio exento Ca2+ utilizado en la etapa (A) del método puede ser seleccionada apropiadamente por los expertos en la técnica y puede ser un medio exento de Ca2+/ Mg2+. La disolución que contiene Ca2+ utilizada en la etapa (B) del método puede ser seleccionada apropiadamente por los expertos en la técnica y puede ser, por ejemplo, una disolución de CaCl2. La disolución que contiene Ca2+ puede contener adicionalmente un catión que puede ser sustituido por calcio (p. ej., un ion de cadmio o un ión de estroncio), un ion de magnesio, un ion de zinc, un ion de ácido sulfúrico y/o un ion de ácido carbónico. La mezcla preparada en la etapa (A) del método puede contener adicionalmente un anticuerpo anti-TSH. El anticuerpo anti-TSH que contiene en la mezcla preparada en la etapa (A) del método puede evitar que se diagnostique incorrectamente la enfermedad de Graves en un paciente de hipotiroidismo cuya cantidad de TSH en la sangre es un valor alto. El orden de adición de las sustancias descritas en la etapa (A) del método se puede ser ajustado apropiadamente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se proporciona un método para el diagnóstico de la enfermedad de Graves, que comprende las siguientes etapas:
(1)
cultivar una célula que expresa un receptor de la hormona estimuladora de la tiroides (TSHR), un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, en un medio exento de Ca2+ con un suplemento de un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio;
(2)
añadir una muestra derivada de sangre de un sujeto de ensayo a la célula cultivada, que se cultiva adicionalmente; y
imagen9
imagen10
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
E10794054
31-03-2015
El medio exento de Ca2+ utilizado en la etapa (A) del método puede ser seleccionado apropiadamente por los expertos en la técnica y puede ser un medio exento de Ca2+/Mg2+. La disolución que contiene Ca2+ utilizada en la etapa (B) del método puede ser seleccionada apropiadamente por los expertos en la técnica y puede ser, por ejemplo, una disolución de CaCl2. Además, la disolución que contiene Ca2+ puede contener adicionalmente un catión que puede ser sustituido por calcio (p. ej., un ion de cadmio o un ión de estroncio), un ion de magnesio, un ion de zinc, un ion de ácido sulfúrico, y/o un ion de ácido carbónico. El orden de adición de las sustancias descritas en la etapa (A) del método puede ser ajustado apropiadamente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se proporciona un método para el diagnóstico de hipotiroidismo (p. ej., enfermedad de Hashimoto), que comprende las siguientes etapas:
(1)
cultivar una célula que expresa un receptor de la hormona estimuladora de la tiroides (TSHR), un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, en un medio exento de Ca2+ con un suplemento de un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio;
(2)
añadir una muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo junto con la TSH a la célula cultivada, que es cultivada adicionalmente; y
(3)
añadir una disolución de CaCl2 a la célula cultivada, y medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida desde la célula.
Las etapas (1) -(3) pueden ser llevadas a cabo apropiadamente por los expertos en la técnica con referencia al método para el diagnóstico de la enfermedad de Graves descrito anteriormente. En algunos casos, en la etapa (2), se pueden utilizar una muestra derivada de la sangre de un individuo normal como control negativo y/o una muestra derivada de la sangre de un paciente hipotiroidismo como control positivo, y cada una de ellas puede ser añadida a la célula, respectivamente. Por otra parte, el tiempo de incubación en la etapa (2) no está limitado y se puede ajustar a 30-120 min, por ejemplo, 30 min. Además, en la etapa (2), la TSH puede ser TSH bovina. En algunos casos, se puede añadir TSAb en lugar de o además de TSH. El TSAb puede ser un anticuerpo monoclonal.
Como resultado de llevar a cabo el método, cuando la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio (por ejemplo, aequorina) emitida desde la célula tratada con la muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo es menor que la emitida desde la célula tratada con una muestra derivada de la sangre de un individuo normal, se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. Por otra parte, la concentración en suero de un anticuerpo puede ser determinada y comparada con una concentración patrón de anticuerpos de un paciente de hipotiroidismo y/o un individuo normal para diagnosticar o no el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. Por ejemplo, se miden la cantidad de luminiscencia emitida desde la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de ensayo y la cantidad de luminiscencia emitida desde la célula tratada con la misma cantidad de una muestra de sangre (patrón) de un individuo normal como la de la muestra de sangre del sujeto de ensayo. Cuando la cantidad de luminiscencia emitida desde la célula tratada con la muestra de sangre de un sujeto de ensayo es menor que la emitida desde la célula tratada con la muestra de sangre (patrón) de un individuo normal, se puede determinar que la concentración en suero de un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides (TSBAb) del sujeto de ensayo es mayor que la del individuo normal. Por lo tanto, se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. Por otra parte, las cantidades respectivas de luminiscencia inducida por TSH (valores integrados) de las proteínas sensibles al calcio en las células tratadas con muestras de sangre de una población de un gran número de individuos normales, por ejemplo, de 50 a 100 individuos normales, se miden de antemano, y se pueden calcular una media de las mismas y la desviación típica (DT). Cuando la cantidad de luminiscencia inducida por TSH de la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de ensayo es menor que la media -nDT (p. ej., n = 1, 2, 3, 4,
o 5) de las cantidades de luminiscencia inducida por TSH (valores integrados) de las células tratadas con las muestras de sangre de la población de individuos normales, se pueden determinar que la concentración en suero de un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides (TSBAb) del sujeto de ensayo es más alta que la de los individuos normales. Por lo tanto, también se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo.
Además, se puede calcular la cantidad de luminiscencia (valor integrado) en la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de ensayo/la cantidad de luminiscencia (valor integrado) de la célula tratada con una muestra de sangre de un individuo normal × 100 (%) (en lo sucesivo, este valor calculado se define como un valor calculado E). Las cantidades respectivas de luminiscencia (valores integrados) atribuidas a las respectivas muestras de sangre de una gran población de individuos normales y una gran población de pacientes hipotiroidismo no tratados (por ejemplo, de 50 a 100 individuos por población) se miden de antemano, y un se fija un valor de corte de tal manera que una tasa positiva verdadera de hipotiroidismo y/o una tasa negativa verdadera (es decir, ser un individuo normal) son cada una, por ejemplo, 80% o más, 90% o más, 92% o más, 94% o más, 96% o más, o 98% o más. Cuando el valor E calculado es menor que el valor de corte, también se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. El valor de corte se puede ajustar apropiadamente dependiendo de las propiedades de una población diana, tales como la edad y sexo y se puede ajustar a, por ejemplo, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,
E10794054
31-03-2015
70%, 80%, o 90%. Además, también se utiliza un patrón de anticuerpo (TSBAb) que tiene una concentración conocida, y su concentración se puede diluir seriadamente para preparar una curva de calibración. Con referencia a la curva de calibración, la concentración real en suero de un anticuerpo (TSBAb) se calcula a partir de la cantidad medida de la
5 luminiscencia emitida desde la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de ensayo. Esta concentración se puede comparar con la concentración de suero medida previamente de un anticuerpo (TSBAb) de cada una de una gran población de individuos normales y una gran población de pacientes hipotiroidismo no tratados (p. ej., de 50 a 100 individuos por población), o datos conocidos referidos en un documento para diagnosticar o no el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. Por ejemplo, cuando la concentración es superior a la
10 media + nDT (por ejemplo, n = 1, 2, 3, 4, o 5) de las concentraciones en suero de (TSBAb) en la población de individuos normales, también se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. Por otra parte, como resultado de llevar a cabo el método, cuando la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio (por ejemplo, aequorina) emitida desde la célula tratada con la muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo es menor que la emitida desde la célula tratada con una muestra derivada de la sangre de un
15 individuo normal y es mayor que la emitida desde la célula tratada con una muestra derivada de la sangre de un paciente de hipotiroidismo, se puede determinar que el sujeto de ensayo es un ser humano que tiene un alto riesgo de desarrollar hipotiroidismo. Alternativamente, la concentración en suero de un anticuerpo puede ser determinada y comparada con una concentración patrón de anticuerpos en un paciente de hipotiroidismo y/o un individuo normal para determinar que el sujeto de ensayo es un ser humano que tiene un alto riesgo de desarrollar o no
20 hipotiroidismo. Además, en la etapa (2), las muestras tomadas antes y después del tratamiento del mismo paciente de hipotiroidismo se añaden como muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo. La cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio (por ejemplo, aequorina) emitida desde la célula puede compararse entre las muestras para determinar la eficacia del tratamiento. Como resultado del ensayo, cuando la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio tal como la aequorina es mayor en la muestra tomada después del
25 tratamiento que en la muestra tomada antes del tratamiento, se puede determinar que el tratamiento es eficaz.
Además se proporciona un método para el diagnóstico del hipotiroidismo, que comprende las siguientes etapas (A) a (C):
(A) preparar una mezcla que contiene una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,
30 un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio que contiene Ca2+, TSH o un anticuerpo monoclonal TSAb estimulador y una muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo;
(B)
añadir forskolina a la mezcla preparada en (A); y
(C)
cuantificar la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida desde la célula.
35 El medio que contiene Ca2+ utilizado en la etapa (A) del método puede ser seleccionado apropiadamente por los expertos en la técnica y puede ser, por ejemplo, un medio que contiene CaCl2. Además, el medio que contiene Ca2+ puede contener adicionalmente un catión que puede ser sustituido por calcio (por ejemplo, un ion de cadmio o un ión de estroncio), un ion de magnesio, un ion de zinc, un ion de ácido sulfúrico, y/o un ion de ácido carbónico. Las concentraciones de Ca2+, el catión que puede ser sustituido por el calcio, el ion de magnesio, el ión zinc, el ion de
40 ácido sulfúrico y el ion de ácido carbónico que puede estar contenido en el medio que contiene Ca2+ pueden ser ajustadas apropiadamente por los expertos en la técnica, de manera que la célula pueda ser mantenida y la proteína sensible al calcio tal como la aequorina emita apropiadamente luminiscencia. El orden de adición de las sustancias descritas en la etapa (A) del método puede ser ajustado apropiadamente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se proporciona un método para el diagnóstico de hipotiroidismo (por
45 ejemplo, enfermedad de Hashimoto), que comprende las siguientes etapas:
(1) cultivar una célula que expresa un receptor de la hormona estimuladora de la tiroides (TSHR), un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, en un medio que contiene Ca2+ tratado con un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio;
50 (2) añadir una muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo junto con TSH a la célula cultivada, que es cultivada adicionalmente; y
(3) añadir forskolina a la célula cultivada, y la medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida desde la célula.
55 Las etapas (1) -(3) pueden ser llevadas a cabo apropiadamente por los expertos en la técnica con referencia al método para el diagnóstico de la enfermedad de Graves descrito anteriormente. En algunos casos, en la etapa (2), se pueden utilizar una muestra derivada de la sangre de un individuo normal como control negativo y/o una muestra derivada de la sangre de un paciente hipotiroidismo como control positivo puede ser utilizado y cada una de ellas se puede añadir a la célula, respectivamente. Por otra parte, el tiempo de
60 incubación en la etapa (2) no está limitado y se puede ajustar a 10-120 min, por ejemplo, 10 min. Además, en la etapa (2), la TSH puede ser TSH bovina. En algunos casos, se puede añadir TSAb en lugar de o además de TSH. El TSAb puede ser un anticuerpo monoclonal. En la etapa (3), la concentración de forskolina puede ser ajustada apropiadamente por los expertos en la técnica.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
E10794054
31-03-2015
Como resultado de llevar a cabo el método, cuando la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio (por ejemplo, aequorina) emitida desde la célula tratada con la muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo es mayor que la emitida desde la célula tratada con una muestra derivada de la sangre de un individuo normal, se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. Por otra parte, la concentración en suero de un anticuerpo puede ser determinada y comparada con una concentración patrón de anticuerpos en un paciente de hipotiroidismo y/o un individuo normal para diagnosticar o no el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. Por ejemplo, se miden la cantidad de luminiscencia emitida desde la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de ensayo y la cantidad de luminiscencia emitida desde la célula tratada con la misma cantidad de una muestra de sangre (patrón) de un individuo normal como la de la muestra de sangre del sujeto de ensayo. Cuando la cantidad de luminiscencia emitida desde la célula tratada con la muestra de sangre de un sujeto de ensayo es mayor que la emitida desde la célula tratada con la muestra de sangre (patrón) de un individuo normal, se puede determinar que la concentración en suero de un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides (TSBAb) del sujeto de ensayo es mayor que la del individuo normal. Por lo tanto, se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. Por otra parte, se miden de antemano las cantidades respectivas de luminiscencia (valores integrados) de las células tratadas con muestras de sangre de una población de un gran número de individuos normales, por ejemplo, de 50 a 100 individuos normales, y se pueden calcular una media de las mismas y la desviación típica (DT). Cuando la cantidad de luminiscencia emitida desde la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de ensayo es superior a la media + nDT (por ejemplo, n = 1, 2, 3, 4, o 5) de las cantidades de luminiscencia (valores integrados) emitidas desde las células tratadas con las muestras de sangre de la población de individuos normales, se puede determinar que la concentración en suero de un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides (TSBAb) del sujeto de ensayo es más alta que la de los individuos normales. Por lo tanto, también se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo.
Además, se puede calcular la cantidad de luminiscencia (valor integrado) emitida desde la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de ensayo/la cantidad de luminiscencia (valor integrado) emitida desde la célula tratada con una muestra de sangre de un individuo normal × 100 (%) (en lo sucesivo, este valor calculado se define como un valor calculado F). Las cantidades respectivas de luminiscencia (valores integrados) atribuidas a las respectivas muestras de sangre de una gran población de individuos normales y una gran población de pacientes hipotiroidismo no tratados (por ejemplo, de 50 a 100 individuos por población) se miden de antemano, y un se fija un valor de corte de tal manera que una tasa positiva verdadera de hipotiroidismo y/o una tasa negativa verdadera (es decir, ser un individuo normal) son cada una, por ejemplo, 80% o más, 90% o más, 92% o más, 94% o más, 96% o más, o 98% o más. Cuando el valor F calculado es mayor que el valor de corte, también se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. El valor de corte se puede ajustar apropiadamente dependiendo de las propiedades de una población diana, tales como la edad y sexo y se puede ajustar a, por ejemplo, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800% o 900%. Además, también se utiliza un patrón de anticuerpo (TSBAb) que tiene una concentración conocida, y su concentración se puede diluir seriadamente para preparar una curva de calibración. Con referencia a la curva de calibración, la concentración real en suero de un anticuerpo (TSBAb) se calcula a partir de la cantidad medida de la luminiscencia emitida desde la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de ensayo. Esta concentración se puede comparar con la concentración de suero medida previamente de un anticuerpo (TSBAb) de cada una de una gran población de individuos normales y una gran población de pacientes hipotiroidismo no tratados (por ejemplo, de 50 a 100 individuos por población), o datos conocidos referidos en un documento para diagnosticar o no el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. Por ejemplo, cuando la concentración es superior a la media + nDT (por ejemplo, n = 1, 2, 3, 4, o 5) de las concentraciones en suero de (TSBAb) de la población de individuos normales, también se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo.
Por otra parte, como resultado de llevar a cabo el método, cuando la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio (por ejemplo, aequorina) emitida desde la célula tratada con la muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo es mayor que la emitida desde la célula tratada con una muestra derivada de la sangre de un individuo normal y es menor que la emitida desde la célula tratada con una muestra derivada de la sangre de un paciente hipotiroidismo, se puede determinar que el sujeto de ensayo es un ser humano que tiene un alto riesgo de desarrollar hipotiroidismo. Alternativamente, la concentración en suero de un anticuerpo puede ser determinada y comparada con una concentración patrón de anticuerpo de un paciente de hipotiroidismo y/o un individuo normal para determinar que el sujeto de ensayo es un ser humano que tiene un alto riesgo de desarrollar o no hipotiroidismo. Además, en la etapa (2), las muestras tomadas antes y después del tratamiento del mismo paciente de hipotiroidismo se añaden como muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo. La cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio (por ejemplo, aequorina) emitida desde la célula puede compararse entre las muestras para determinar la eficacia del tratamiento. Como resultado del ensayo, cuando la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio tal como aequorina es menor en la muestra tomada después del tratamiento que en la muestra tomada antes del tratamiento, se puede determinar que el tratamiento es eficaz.
En lo sucesivo, la presente invención se describirá adicionalmente con referencia a los Ejemplos.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
E10794054
31-03-2015
Ejemplos
1.
Detalles sobre el método de construcción de células congeladas
La secuencia de ADNc de un receptor de la hormona estimuladora de la tiroides humana (Núm. GenBank NM_000369) (SEQ ID NO: 5) se amplificó mediante el método de PCR a partir de una biblioteca de ADNc derivada de la glándula tiroides humana y se clonó en pUC18. El ADNc de hTSHR clonado en pUC18 se escindió con BamHI y se volvió a clonar en un vector de pZeoSV2 (Invitrogen Corp.) para preparar pZeoSV2 hTSHR. La secuencia de ADNc de un canal de calcio dependiente de nucleótidos cíclicos (Núm. GenBank BC048775) (SEQ ID NO: 4) se amplificó mediante el método de PCR a partir de una biblioteca de ADNc derivado de células epiteliales olfativas de ratón y se clonó en un vector de expresión de 1994 pb (pCMVSPORT, Invitrogen Corp.) para preparar pmCNGa2 (Figura 18). Además, para mejorar la selectividad de AMPc y la sensibilidad al mismo, se preparó un constructo pmCNGα2MW que expresaba un canal de calcio dependiente de nucleótidos cíclicos modificados (SEQ ID NO: 6) en el que la cisteína 460a (C) estaba sustituida por triptófano (W) y el ácido glutámico 583o (E) estaba sustituido por metionina (M) mediante el método de mutación puntual por PCR. Por otra parte, se trató una secuencias de ADNc de apoaequorina sintética (676 pb) (SEQ ID NO: 7) que se había optimizado para el uso de codones en seres humanos mediante el método de elongación de oligo ADN, y que tenía una señal de direccionamiento mitocondrial con las enzimas de restricción KpnI y NheI y se clonó en pcDNA3.1 (Invitrogen Corp.) tratado con KpnI y NheI para preparar un vector de expresión de apoaequorina pcDNA mt sAEQ (Figura 19). Las células CHO se sembraron a una concentración de células de 1,0 × 105 células/ml en una placa de petri de 10-cm2. Al día siguiente, las células fueron transfectadas con 1 µg de pZeoSV2 hTSHR, 2 µg de pmCNGα2MW, y 2 µg de pcDNA mt sAEQ por placa de Petri utilizando FuGENE6 (TM) (Roche Applied Science). Al día siguiente, las células se disociaron de la placa de Petri por medio de la adición de 400 µl de una disolución de Versene (EDTA) a la placa de Petri y se suspendieron en un medio DMEM/F12 que contenía 10 ml de cFCS al 5%. La suspensión obtenida se centrifugó a 1000 rpm durante 5 min. A continuación, el sedimento se disolvió a una concentración de 2-5 x 106 células/ml en 1 ml de CELLBANKER y se almacenó a -80°C.
2.
Curva dependiente de la concentración y sensibilidad de detección mínima de TSH (bTSH) obtenida utilizando células congeladas
Se descongeló 1 ml (3 × 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 en un baño caliente y se suspendió en 10 ml de un tampón de muestra (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, HEPES 20 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO3 4,8 mM, PEG6000 al 5%, pH 7,4). Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 10 ml de un tampón de muestra al precipitado obtenido, y se añadieron 7,5 µl de ViviRen 4 mM (Promega Corp.) a la misma. La mezcla se sembró a una concentración de 90 µl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Después del cultivo a 37°C durante 3 horas en una atmósfera de CO2, se añadió a esto (n = 6)bTSH diluido seriadamente con PBS a una concentración de 10 µl/pocillo, y las células se cultivaron durante 30 min. A continuación, se añadió una disolución de CaCl2 3 mM a esto a una concentración de 50 µl/pocillo, y se midió la cantidad de luminiscencia utilizando un luminómetro (PerkinElmer Inc., ARVO-Sx; en lo sucesivo, se utilizó el mismo modelo en los Ejemplos). Se muestra una curva dependiente de la concentración bTSH en la Figura 1.
Como se muestra en la Figura 2 (vista aumentada del intervalo de baja concentración), la cantidad mínima detectable para bTSH fue de 0,16 µU/ml de manera que el valor detectado fue susceptible de ser discriminado significativamente del valor que se calcula por el valor del blanco + 3SD. Además, dado que aequorina realiza una reacción luminiscente, se obtuvo una elevada relación de señal con respecto al blanco (razón S/N) (es decir, unos 100 µU/ml de bTSH, razón S/N de aproximadamente 45 veces (9000000/200000)) mediante el método de la presente invención.
Como se muestra en la Figura 2 (vista aumentada del intervalo de baja concentración), la cantidad mínima detectable para bTSH fue de 0,16 µU/ml de manera que el valor detectado fue susceptible de ser discriminado significativamente del valor que se calcula por valor del blanco + 3SD. Por lo tanto, la sensibilidad fue de un orden de magnitud mayor que la de la kit disponible existente de YAMASA CORP: cantidad mínima detectable para bTSH, 1 µU/mL (Atsuo Nagata, et al.: Clinical Endocrinology, 41: 1023, 1993). Por otra parte, dado que la aequorina realiza una reacción luminiscente, la elevada relación de señal con respecto a blanco (S/N), (es decir, unos 100 µU/ml de bTSH, razón S/N de aproximadamente 45 veces (9000000/200000)), obtenida mediante el método de la presente invención fue muy superior a la del kit YAMASA (100 µU/ml de bTSH, SN = 7).
3. Estudio de reproducibilidad
Se diluyó un patrón TASb derivado de pacientes con enfermedad de Graves humana: MRC Research Standard B 1966 Long-acting Thyroid Stimulator (NIBSC: National Institute for Biological Standards and Control, código 65/122) con suero de un individuo normal para preparar las muestras de control H (1,88 mU LAST/ml), M (1,25 mU LAST/ml) y L (0,94 mU LAST/ml). Se añadieron 150 µl de PEG600 al 30% a 50 µl de cada suero de control preparado, y las mezclas se agitaron y después se dejaron en reposo a 4°C durante 5 min. Después de centrifugación a 3000 rpm a
imagen11
imagen12
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
E10794054
31-03-2015
se observó en la presencia de 100 µU/mL de bTSH, lo que demuestra la inhibición competitiva de acuerdo con la concentración de bTSH competidor (véase la Figura 9). Cuando se detecta el anticuerpo de bloqueo, se observa generalmente una reducción de la señal en presencia de bTSH. Se sabe que los métodos convencionales tienen la desventaja de que la relación S/N es tan baja como 5 a 10 veces y el intervalo de medición se estrecha debido a la baja razón S/N. Por el contrario, el método de la presente invención tiene un amplio intervalo de medición de manera que la razón S/N en presencia o ausencia de bTSH es 50 veces. Por lo tanto, el anticuerpo de bloqueo se puede detectar con una elevada sensibilidad.
10. Estudio sobre el método para la detección de anticuerpos de bloqueo de la estimulación tiroidea (TSBAb) por medio de desensibilización celular
Se descongeló 1 ml (3 × 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 en un baño caliente y se suspendió en 10 ml de un tampón de muestra. Después de centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 10 ml de un medio DMEM/F12 cFCS que contenía calcio al precipitado obtenido, y a esto se le añadieron 7,5 µl de ViviRen 4 mM. La mezcla se sembró a una concentración de 90 µl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Después del cultivo a 37°C durante 3 h en una atmósfera de CO2, se añadieron por separado a esto una fracción de anticuerpo de bloqueo de la estimulación tiroidea derivada de un paciente con hipotiroidismo (TSBAb) y una fracción de IgG derivada de suero de un individuo normal purificada con PEG6000 al 30% a una concentración de 10 µl/pocillo. Al mismo tiempo, se añadió adicionalmente bTSH (concentraciones finales: 100 µU a 2,5 µU/ml) a una concentración de 10 µl/pocillo. Después del cultivo durante 30 min, se añadió a esto una disolución de forskolina 10-4 M a una concentración de 50 µl/pocillo, y se midió la cantidad de luminiscencia utilizando un luminómetro. En la Figura 10, no se observó diferencia entre el anticuerpo de bloqueo y las muestras individuales normales debido a la desensibilización insuficiente en la presencia de bTSH con concentraciones de 5 µU o inferiores. Sin embargo, en la presencia de 100 µU de bTSH, la cantidad de luminiscencia se redujo en el suero de individuo normal, y se observó un aumento de la cantidad de luminiscencia en presencia del anticuerpo de bloqueo, lo que demuestra que de acuerdo con el método de la presente invención, el presencia o ausencia del anticuerpo de bloqueo puede ser detectada utilizando la desensibilización.
[Mecanismo de la luminiscencia en presencia o ausencia de anticuerpo de bloqueo de acuerdo con el método de la presente invención]
En estas condiciones, el calcio está presente en el medio en el momento de la adición de bTSH a las células; por lo tanto la reacción luminiscente se produce inmediatamente después de la adición de bTSH en ausencia del anticuerpo de bloqueo como se observa en sueros de individuos normales. Por el contrario, en presencia del anticuerpo de bloqueo (TSBAb), TSBAb inhibe la acción de bTSH, de manera que no se produce reacción luminiscente. En este estado, tras la subsiguiente adición de forskolina, que activa la adenilato ciclasa, se forma AMPc para provocar la luminiscencia sin la mediación de un receptor de TSH. Sin embargo, en ausencia de TSBAb, las células ya están desensibilizadas por la reacción luminiscente que ya se ha producido a través de la adenilato ciclasa activada por bTSH. Por lo tanto, la luminiscencia no se produce ni siquiera por la adición de más forskolina como segundo estímulo. Por el contrario, en presencia de TSBAb, el anticuerpo de bloqueo impide que bTSH active la adenilato ciclasa. Por lo tanto, tras la subsiguiente adición de forskolina, se forma AMPc que ocasiona una reacción luminiscente.
[Discusión]
Los métodos convencionales para la detección de un anticuerpo de bloqueo se indican mediante el % de inhibición con respecto a un individuo normal. Sin embargo, el problema de la indicación que utiliza el % de inhibición es la falta de fiabilidad cuantitativa en un intervalo de concentración elevada de 90% o más. El método de la presente invención, que utiliza la acción de desensibilización de células y forskolina puede estar indicado por el aumento en la cantidad de luminiscencia con respecto a un individuo normal. Por lo tanto, el límite superior no está definido, y la presencia o ausencia del anticuerpo de bloqueo puede ser detectada con la linealidad, incluso en un intervalo de concentración elevada.
11. Comparación de la sensibilidad con kit existentes que utilizan un patrón de anticuerpo estimulador
Se descongeló 1 ml (3 × 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 en un baño caliente y se suspendió en 10 ml de un tampón de muestra. Después de centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 10 ml de un tampón de muestra al precipitado obtenido, y a esto se le añadieron 7,5 µl de ViviRen 4 mM. La mezcla se sembró a una concentración de 90 µl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se diluyó MRC Research Standard B 1966 (NIBSC 65/122) con suero de un individuo normal para preparar una serie de concentración. Se añadieron 150 µl de PEG6000 30% a 50 µl de cada muestra de control en la serie preparada, y las mezclas se agitaron y luego se dejaron en reposo a 4°C durante 5 min. Después de la centrifugación a 3000 rpm a 4°C durante 20 min, los precipitados obtenidos se disolvieron por separado en 50 µl de un tampón de muestra para preparar soluciones de muestra. Después del cultivo a 37°C durante 3 h en una atmósfera de CO2, las soluciones de muestra se añadieron
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
E10794054
31-03-2015
a esto por separado a una concentración de 10 µl/pocillo, y las células se cultivaron durante 30 min. A esto se le añadió disolución de detección de CaCl2 9 mM a una concentración de 50 µl/pocillo, y se midió la cantidad de luminiscencia utilizando un luminómetro. También se muestran los valores medidos por separado utilizando el kit YAMASA existente utilizando la glándula tiroides porcina. El kit YAMASA existente dio como resultado 200 TSAb% a 0,94 mU LAST/ml y no pudo detectar concentraciones por debajo del umbral de sensibilidad. Por el contrario, se confirmó que el método de la presente invención era capaz de detectar el anticuerpo estimulador con 2018 TSAB% a 0,94 mU LAST/ml y con 242 TSAb% incluso a 0,06 mU LAST/ml y era capaz de detectar el anticuerpo estimulador con una gran sensibilidad que es aproximadamente 16 veces mayor que la de el kit existente (véase la Figura 11).
12.
Estudio sobre el cambio dependiente del tiempo en la luminiscencia utilizando el kit que emplea células congeladas
Se descongeló 1 ml (3 × 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 en un baño caliente y se suspendió en 10 ml de un tampón de muestra (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, HEPES 20 mM, MgCl2 1mM, NaHCO3 4,8 mM, PEG6000 al 5%, pH 7,4). Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 10 ml de un tampón de muestra al precipitado obtenido, y se añadieron a esto 7,5 µl de ViviRen 4 mM (Promega Corp.). La mezcla se sembró a una concentración de 90 µl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Después del cultivo a 37°C durante 3 h en una atmósfera de CO2, se añadieron por separado las muestras H (valor elevado), M (valor medio), y L (valor bajo) purificadas con PEG6000 al 30% (n = 6) a una concentración de 10 µl/pocillo. Después de cultivar durante 30 minutos, se añadió a esto una disolución de CaCl2 9 mM a una concentración de 50 µl/pocillo y se agitó durante 3 s. A continuación, se midió la cantidad de luminiscencia a lo largo del tiempo durante 13 s utilizando un luminómetro. Como resultado, como se muestra en la Figura 12, se observó una luminiscencia relativamente estable tan pronto como se añadió la disolución de CaCl2.
13.
Estudio sobre la fiabilidad cuantitativa del anticuerpo de bloqueo de la estimulación tiroidea (TSBAb)
(1)
Método para la detección de anticuerpo de bloqueo de la estimulación tiroidea (TSBAb) utilizando la inhibición competitiva contra bTSH Se descongeló 1 ml (3 × 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 en un baño caliente y se suspendió en 10 ml de un tampón de muestra (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, HEPES 20 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO3 4,8 mM, PEG6000 al 5%, pH 7,4). Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 10 ml de un tampón de muestra al precipitado obtenido, y a esto se le añadieron 7,5 µl de ViviRen 4 mM (Promega Corp.). Después del cultivo a 37°C durante 3 h en una atmósfera de CO2, se mezclaron 90 µl de la disolución de células con 10 µl de cada muestra en una serie de diluciones de un anticuerpo de bloqueo derivado de un paciente con hipotiroidismo purificado con PEG6000 al 30%, y se cultivaron durante 30 min. A continuación, se añadió a esto una disolución de CaCl2 9 mM a una concentración de 50 µl/pocillo y se midió la cantidad de luminiscencia utilizando un luminómetro. Como se muestra en la Figura 13, el anticuerpo de bloqueo de la estimulación tiroidea (TSBAb) se detectó cuantitativamente utilizando esta célula congelada.
(2)
Dependencia de la concentración del método para detectar anticuerpo de bloqueo de la estimulación tiroidea (TSBAb) utilizando la desensibilización celular Se descongeló 1 ml (3 × 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 en un baño caliente y se suspendió en 10 ml de un tampón de muestra (CaCl2 3 mM, NaCl 130 mM, KCl 5 mM, HEPES 20 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO3 4,9 mM, PEG6000 al 5%, pH 7,4). Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 10 ml de un tampón de muestra al precipitado obtenido, y a esto se le añadieron 7,5 µl de ViviRen 4 mM (Promega Corp.). La mezcla se sembró a una concentración de 90 µl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Cada muestra de una serie de diluciones de anticuerpo de bloqueo derivado de un paciente con hipotiroidismo purificado con PEG6000 al 30% se añadió a esto a una concentración de 10 µl/pocillo, y, adicionalmente, se añadió a esto una disolución de bTSH (concentración final: 100 µl/ml) a una concentración de 10 µl/pocillo. Después del cultivo a 37°C durante 30 min en una atmósfera de CO2, se añadió a esto una disolución de forskolina 10-4 M a una concentración de 50 µl/pocillo, y se midió la cantidad de luminiscencia utilizando un luminómetro.
Como se muestra en la Figura 14, se detectó el anticuerpo de bloqueo de la estimulación tiroidea (TSBAb) de una manera dependiente de la concentración utilizando esta célula congelada.
14. Estudio sobre la duración de la acción (tiempo de incubación) del anticuerpo estimulador de la tiroides (TSAb) o del anticuerpo de bloqueo de la estimulación tiroidea (TSBAb)
(1) Método para la detección de anticuerpo estimulador (TSAb) Se descongeló 1 ml (3 × 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 en un baño caliente y se suspendió en 10 ml de un tampón de muestra (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, HEPES 20 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO3 4,8 mM, PEG6000 al 5%, pH 7,4). Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
E10794054
31-03-2015
añadieron 10 ml de un tampón de muestra al precipitado obtenido, y a esto se le añadieron 7,5 µl de ViviRen 4 mM (Promega Corp.). La mezcla se sembró a una concentración de 90 µl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se añadieron por separado a esto muestras de de suero de individuos con valor elevado (H), valor medio (M), valor bajo (L), y normal (N) purificadas con PEG6000 al 30% a una concentración de 10 µl/pocillo. Después del cultivo durante 30 minutos a 1,5 h, se añadió a esto una disolución de CaCl2 9 mM a una concentración de 50 µl/pocillo, y se midió la cantidad de luminiscencia utilizando un luminómetro. Como se muestra en la Figura 15, la cantidad de luminiscencia alcanzó una meseta después de 30 min a1-h de duración de la acción del anticuerpo estimulador (TSAb) sobre la célula de acuerdo con la presente invención.
(2)
Estudio sobre la duración de la acción en el método para la detección del anticuerpo de bloqueo de la estimulación tiroidea (TSBAb) utilizando la inhibición competitiva contra bTSH Se descongeló 1 ml (3 × 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 en un baño caliente y se suspendió en 10 ml de un tampón de muestra (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, HEPES 20 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO3 4,8 mM, PEG6000 al 5%, pH 7,4). Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 10 ml de un tampón de muestra al precipitado obtenido, y a esto se le añadieron 7,5 µl de ViviRen 4 mM (Promega Corp.). La mezcla se sembró a una concentración de 90 µl/pocillo en una placa de 96 pocillos, y las células se cultivaron durante 3 h. Una muestra de suero derivado de un paciente con hipotiroidismo y una muestra de suero de un individuo normal purificadas con PEG6000 al 30% se añadieron por separado a esto a una concentración de 10 µl/pocillo, y, además, se añadió a esto una disolución de bTSH (concentración final: 10 µU/ml) a una concentración de 10 µl/pocillo. Después de cultivar durante 10 minutos a 2 horas, se añadió a esto una disolución de CaCl2 9 mM a una concentración de 50 µl/pocillo, y la cantidad de luminiscencia se midió utilizando un luminómetro. Como se muestra en la Figura 16, la cantidad de luminiscencia alcanzó una meseta después de una duración de 30 min de acción de bTSH (que compite con el anticuerpo de bloqueo (TSBAb)) sobre la célula de acuerdo con la presente invención.
(3)
Método para la detección de anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides (TSBAb) utilizando la desensibilización de células Se descongeló 1 ml (3 × 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 en un baño caliente y se suspendió en 10 ml de un medio independiente de CO2 (Núm. Cat 18045, Invitrogen Corp.). Después de una centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 10 ml de un medio independiente de CO2 al precipitado obtenido, y se añadieron a esto 7,5 µl de ViviRen 4 mM (Promega Corp.). La mezcla se sembró a una concentración de 90 µl/pocillo en una placa de 96 pocillos, y las células se cultivaron durante 3 h. Se añadieron por separado a esto una muestra de suero derivado de un paciente con hipotiroidismo y una muestra de suero de un individuo normal purificadas con PEG6000 al 30% a una concentración de 10 µl/pocillo, y, además, se añadió a esto una disolución bTSH (concentración final: 100 µU/ml) a una concentración de 10 µl/pocillo. Después de cultivar durante 10 min a 2 h, se añadió a esto una disolución de forskolina 10-4 M a una concentración de 50 µl/pocillo, y se midió la cantidad de luminiscencia utilizando un luminómetro. Como se muestra en la Figura 17, la cantidad de luminiscencia alcanzó una meseta después de una duración de 10 min de acción de bTSH (que compite con el anticuerpo de bloqueo (TSBAb)) sobre la célula de acuerdo con la presente invención.
15. Análisis que utiliza diversas muestras de pacientes con enfermedades de la tiroides
Se utilizaron las células congeladas preparadas en 1 y un kit de diagnóstico para la enfermedad de Graves proporcionado por la presente invención que contenía un medio para el cultivo celular, una disolución de lavado de células, ViviRen, una disolución de calcio, un anticuerpo anti-hTSH de cabra, un suero de control y una placa de 96 pocillos descrita más abajo para estudiar la actividad de TSAb en suero en diferentes grupos de pacientes con enfermedades de la tiroides. Específicamente, se utilizaron los sueros de 198 pacientes con enfermedad de Graves no tratada, 18 pacientes con hipotiroidismo, 48 individuos normales, 2 casos de enfermedad de Plummer, 6 casos de tiroiditis postparto, 22 casos de tiroiditis indolora y 22 casos de tiroiditis subaguda, todos los cuales habían sido clínicamente y definitivamente diagnosticados, (véase la Tabla 2). Se añadieron 150 µl de PEG6000 al 30% a 50 µl del suero de cada paciente, y las mezclas se agitaron y a continuación se dejaron reposar a 4°C durante 5 min. Después de una centrifugación a 3000 rpm a 4°C durante 20 min, los precipitados obtenidos se disolvieron por separado en 400 µl de un medio para el cultivo de células (PEG6000 al 5%, medio independiente de CO2 (cloruro de calcio, D-pantotenato de calcio, L-glutamina, libre de rojo fenol, Invitrogen Corp.)) para preparar soluciones de las muestras. Las soluciones de las muestras se añadieron por separado (n = 2) a una concentración de 10 µl/pocillo a una placa de 96 pocillos. Se descongeló 1 ml (3 × 106 células/ml) de las células congeladas en un baño caliente y se suspendió en 10 ml de una disolución de lavado celular (medio independiente de CO2). Tras la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 12 ml de un medio para el cultivo de células al precipitado obtenido para preparar una disolución celular. Se añadieron 7,5 µl de ViviRen 4 mM a la disolución celular, y la mezcla se sembró a una concentración de 90 µL/pocillo en una placa de 96 pocillos. Después de cultivar durante 4 h, se le añadió a esto una disolución de calcio 3 mM a una concentración de 100 µl/pocillo, y se midió la cantidad de luminiscencia utilizando
imagen13

Claims (1)

  1. imagen1
ES10794054.6T 2009-06-30 2010-06-24 Método de análisis biológico para anticuerpo contra el receptor de la hormona estimuladora tiroidea, kit de medición para el anticuerpo, y célula modificada genéticamente novedosa para su uso en el método de análisis biológico o en el kit de medición Active ES2534330T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009155183 2009-06-30
JP2009155183 2009-06-30
PCT/JP2010/060731 WO2011001885A1 (ja) 2009-06-30 2010-06-24 甲状腺刺激ホルモンレセプターに対する抗体のバイオアッセイ法及び測定キットとこれらに用いる新規の遺伝子組み換え細胞

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2534330T3 true ES2534330T3 (es) 2015-04-21

Family

ID=43410960

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14195873.6T Active ES2642262T3 (es) 2009-06-30 2010-06-24 Método de análisis biologico para anticuerpo contra el receptor de la hormona estimuladora tiroidea, kit de medición para el anticuerpo, y célula modificada genéticamente novedosa para su uso en el método de análisis biológico o en el kit de medición
ES10794054.6T Active ES2534330T3 (es) 2009-06-30 2010-06-24 Método de análisis biológico para anticuerpo contra el receptor de la hormona estimuladora tiroidea, kit de medición para el anticuerpo, y célula modificada genéticamente novedosa para su uso en el método de análisis biológico o en el kit de medición

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14195873.6T Active ES2642262T3 (es) 2009-06-30 2010-06-24 Método de análisis biologico para anticuerpo contra el receptor de la hormona estimuladora tiroidea, kit de medición para el anticuerpo, y célula modificada genéticamente novedosa para su uso en el método de análisis biológico o en el kit de medición

Country Status (11)

Country Link
US (3) US20120149036A1 (es)
EP (2) EP2857497B1 (es)
JP (3) JP5819192B2 (es)
KR (1) KR101963904B1 (es)
CN (1) CN102471760B (es)
BR (1) BRPI1015927A2 (es)
CA (1) CA2765558C (es)
ES (2) ES2642262T3 (es)
HK (2) HK1170526A1 (es)
SG (3) SG10201403310PA (es)
WO (1) WO2011001885A1 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2687050T3 (es) 2010-12-24 2018-10-23 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Método de bioensayo para la detección de sustancia fisiológicamente activa
JP5903363B2 (ja) * 2012-10-10 2016-04-13 ヤマサ醤油株式会社 甲状腺刺激抗体測定における試料の前処理方法
US20150346223A1 (en) * 2013-01-09 2015-12-03 Vantix Holdings Limited Ft4 electrochemical assay detection system
WO2016035677A1 (ja) * 2014-09-04 2016-03-10 大塚製薬株式会社 ｉｎ ｖｉｔｒｏサイクリックヌクレオチド測定の為のサンプルの前処理方法
JP5963984B2 (ja) * 2016-01-12 2016-08-03 ヤマサ醤油株式会社 甲状腺刺激抗体測定における試料の前処理方法
EP3828543B1 (en) * 2018-09-05 2024-04-03 Yamasa Corporation Method and kit for rapid measurement of autoantibody activity with respect to tsh receptor
JP7212955B2 (ja) * 2020-12-28 2023-01-26 ヤマサ醤油株式会社 甲状腺刺激ホルモン受容体阻害性自己抗体の活性測定法およびキット

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9720693D0 (en) * 1997-09-30 1997-11-26 Univ Wales Medicine Assay
US8563257B2 (en) 2000-03-30 2013-10-22 Diagnostic Hybrids, Inc. Sensitive and rapid methods of using chimeric receptors to identify autoimmune disease and assess disease severity
JP3650815B2 (ja) 2000-11-22 2005-05-25 大学共同利用機関法人自然科学研究機構 緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質の作成方法、および前記方法により作成されるバイオセンサー蛋白質
DE10138876B4 (de) * 2001-08-08 2008-11-06 Forschungszentrum Jülich GmbH Genetisch modifizierte zyklisch-Nukleotid-gesteuerte lonenkanäle und deren Verwendung
DE10311769A1 (de) * 2003-03-18 2004-09-30 Bayer Healthcare Ag Testmethoden zur Bestimmung der intrazellulären Konzentration zyklischer Nukleotide
JP2007531514A (ja) * 2004-02-12 2007-11-08 インスティチュート・パスツール 非侵襲的でリアルタイムでインビボでの生きた生物における局所Ｃａ２＋動態の生物発光による画像化
JP2006204225A (ja) * 2005-01-31 2006-08-10 Tadashi Yoshida 細胞株の樹立方法
US20070224645A1 (en) * 2006-02-23 2007-09-27 Jianming Lu Novel cell-based phosphodiesterase assays
WO2007139080A1 (ja) * 2006-05-26 2007-12-06 Noacell Science Co., Ltd. 受容体及びイオンチャンネルを介したカルシウムの応答と引き続いて起こる遺伝子発現を測定する連続アッセイ法
JPWO2007142208A1 (ja) * 2006-06-05 2009-10-22 国立大学法人京都大学 温度感応タンパク質、ポリヌクレオチド、温度感応タンパク質発現プラスミド及び発現細胞、温度感応タンパク質の利用方法
WO2008118445A1 (en) * 2007-03-26 2008-10-02 Promega Corporation Methods to quench light from optical reactions
KR101560849B1 (ko) * 2007-10-01 2015-11-20 다이어그노스틱 하이브리즈,인코포레이티드 자가면역 질환을 확인하기 위해 키메라 수용체를 사용하는 민감하고 신속한 방법
JP2009155183A (ja) 2007-12-27 2009-07-16 Taiheiyo Materials Corp カートリッジ型注入方式固着剤

Also Published As

Publication number Publication date
SG10201912617UA (en) 2020-02-27
HK1170526A1 (en) 2013-03-01
JPWO2011001885A1 (ja) 2012-12-13
SG10201403310PA (en) 2014-10-30
US20120149036A1 (en) 2012-06-14
BRPI1015927A2 (pt) 2015-09-01
EP2857497A1 (en) 2015-04-08
HK1204650A1 (en) 2015-11-27
JP5819192B2 (ja) 2015-11-18
CN102471760B (zh) 2018-04-17
US20180259512A1 (en) 2018-09-13
JP2016032472A (ja) 2016-03-10
KR101963904B1 (ko) 2019-03-29
CN102471760A (zh) 2012-05-23
EP2450430A4 (en) 2013-02-27
WO2011001885A1 (ja) 2011-01-06
JP6472488B2 (ja) 2019-02-20
US20140072985A1 (en) 2014-03-13
SG176967A1 (en) 2012-01-30
JP2017192396A (ja) 2017-10-26
CA2765558C (en) 2018-09-25
EP2450430A1 (en) 2012-05-09
EP2450430B1 (en) 2015-03-18
ES2642262T3 (es) 2017-11-16
CA2765558A1 (en) 2011-01-06
EP2857497B1 (en) 2017-09-06
KR20120051657A (ko) 2012-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2534330T3 (es) Método de análisis biológico para anticuerpo contra el receptor de la hormona estimuladora tiroidea, kit de medición para el anticuerpo, y célula modificada genéticamente novedosa para su uso en el método de análisis biológico o en el kit de medición
Chen et al. Structure, function and immunolocalization of a proton‐coupled amino acid transporter (hPAT1) in the human intestinal cell line Caco‐2
ES2771475T3 (es) Método in vitro para la detección temprana de una posible inflamación asociada con el rechazo de un trasplante
EP3002588B1 (en) Use of a biomarker for diagnosing schizophrenia
Srithunyarat et al. Catestatin and vasostatin concentrations in healthy dogs
Brégère et al. Neonatal hypoxia‐ischemia in rat increases doublecortin concentration in the cerebrospinal fluid
WO2006090836A1 (ja) 電離放射線の被曝量測定方法
CN110890133B (zh) 急性反应期蛋白saa1在构建电离辐射后致死性预测模型或制备试剂盒、试剂的应用方法
CN103827310A (zh) 丝裂原蛋白激酶激酶激酶激酶3 (map4k3)作为自体免疫疾病、癌症、发炎及il-17相关疾病的生物标记及治疗标的
ES2386440T3 (es) Diagnóstica y terapéutica para enfermedades asociadas con el receptor acoplado de proteína G ADIPOR2 (ADIPOR2)
WO2002103351A1 (fr) Procede pour detecter un effet de stimulation sur la peau
Sotelo Use of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay in the Diagnosis of Cysticercosis-Reply
Yang et al. Cerebral Lactate Participates in Hypoxia-induced Anapyrexia Through its Receptor G Protein-coupled Receptor 81
WO2016035677A1 (ja) ｉｎ ｖｉｔｒｏサイクリックヌクレオチド測定の為のサンプルの前処理方法
Saftawy et al. Autoimmunity in human CE: Correlative with the fertility status of the CE cyst
ES2648694A1 (es) Citoquinas proinflamatorias como marcador diagnóstico en el síndrome vestibular episódico.
KR101936502B1 (ko) 간암의 진단 및 예후 예측용 바이오 마커 및 그의 용도
Algrain Exploring Melanopsin Function in Mammals With Diverse Photoreceptor Architecture
CN117590004A (zh) Tam受体作为干燥综合征诊断标志物的应用
Maione et al. Second brain tumours after pituitary irradiation: lower risk than once thought
RU2012126312A (ru) Маркерный белок для диабета типа 2
Kühbacher et al. Neurochemical imaging of selenium homeostasis and the selenoproteome in the brain under nutritional deficiency
CN101147066A (zh) Mgc4504的用途
CN108431046A (zh) 诊断、治疗或预防心境障碍的方法
清水秀忠 et al. Glial Nax channels control lactate signaling to neurons for brain [Na+] sensing