ES2533461T3

ES2533461T3 - Determinación de la abundancia de mensajes y el número de copias de alelos usando TIV con constructos cebador-promotor-selector monocatenarios

Info

Publication number: ES2533461T3
Application number: ES06815137.2T
Authority: ES
Inventors: Michael Seul; Nataliya Korzheva
Original assignee: Bioarray Solutions Ltd
Current assignee: Bioarray Solutions Ltd
Priority date: 2005-09-21
Filing date: 2006-09-21
Publication date: 2015-04-10
Anticipated expiration: 2026-09-21
Also published as: CA2623310C; CN101589154A; WO2007035893A3; CA2623310A1; EP1926835B1; US8206953B2; PT1926835E; US20070065864A1; JP2009508497A; JP5477888B2; WO2007035893A2; EP1926835A2; EP1926835A4

Abstract

Constructo cebador-promotor-selector monocatenario para detectar la presencia o la cantidad relativa de una subsecuencia diana en una muestra, que comprende tres subsecuencias que incluyen: una subsecuencia de cebador complementaria a dicha subsecuencia diana, que tiene su extremo 5' adyacente al extremo 3' de una subsecuencia de promotor, pudiendo dicha subsecuencia de promotor dirigir la transcripción de una subsecuencia de selector única, que tiene su extremo 3' adyacente al extremo 5' de la subsecuencia de promotor.

Description

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La figura 9 muestra dispositivos y métodos para captura magnética, purificación directa y purificación con membrana del producto de ensayo del exceso de constructo.

La figura 10 muestra la señal relativa generada tanto a los 100 milisegundos como a los 500 milisegundos de exposición, tras la reacción de TIV con diferentes moldes-constructos descritos en la leyenda de la figura (con y sin una parte de NT para el promotor de T7 añadido y con y sin digestión de ARNm por ARNasaH).

La figura 11 muestra un ensayo realizado usando los constructos descritos en el presente documento para la detección y amplificación de kanamicina-ARNm, incluyendo purificación en columna y eliminación de la etapa de digestión con ARNasaH de ARNm.

La figura 12 muestra los resultados para mmc-TIV en fase sólida con constructos cebador-T7-selector inmovilizados en microperlas recubiertas con estreptavidina seguida por detección mediante RT-eMAP.

La figura 13 representa múltiples tandas para un método de amplificación mediante TIV de alto rendimiento (reacciones acopladas de ligamiento -mmc-TIV) usando los constructos descritos en el presente documento.

La figura 14 muestra algunas secuencias de maíz estrechamente homólogas con sitios polimórficos mostrados en negrita.

La figura 15 Fragmentación de ADNg con la siguiente extensión del cebador introducido.

La figura 16 muestra un alineamiento de perlas coensambladas en el que la reacción de mmc-TIV usando constructo cebador-T7-selector inmovilizado descrito en el presente documento o ADNbc se lleva a cabo de modo integrado con la detección del ARN que resultó mediante elongación mediada por captura.

La figura 17 muestra los resultados de la reacción de TIV/RT simultánea usando diferentes concentraciones de ADNbc biotinilado inmovilizado sobre un alineamiento de perlas coensambladas.

La figura 18 muestra un protocolo para la detección de ARN viral mediada por ligamiento.

Descripción detallada

Tal como se indicó anteriormente, los constructos cebador-promotor-selector para su uso en los métodos dados a conocer en el presente documento comprenden hasta tres subsecuencias diferentes, cada una de longitud designada, concretamente: la secuencia de cebador específica de gen, la secuencia de hebra molde para promotor de T7 (u otro), diseñada para dirigir la transcripción in vitro hacia el extremo 5’ del constructo; y una secuencia de “selección” o “selector” única. El método de la invención dirige la TIV para que avance de modo que produzca copias de ARN de la secuencia de selector. Los transcritos de ARN se detectan mediante captura en micropartículas codificadas (“perlas”) que presentan sondas que coinciden con secuencias de selector específicas. Secuencias de selector únicas hacen que los productos de la reacción sean únicos y permite la selección de amplicones específicos de un conjunto de dianas de secuencia (originalmente) similar (véase también la sección 2.2, Recuento de alelos). Todos los mensajes se “cuentan”, independientemente de si la reacción de RT en la que sirven como moldes produce producto de ADNc de longitud completa o sólo parcial, reflejando esto último reacciones de RT abortadas. Preferiblemente, para la detección de mensajes específicos dentro de un contexto de mensajes similares, así como para la detección de mutaciones o polimorfismos, se usan pares de constructos específicos de alelo de modo que sólo una secuencia de cebador coincidente en el constructo media en la elongación y formación de los transcritos amplificados. Este enfoque es particularmente útil para la detección y el análisis de un subconjunto designado de ARNm, ARN/ADN genómicos virales, alelos y genes.

1. Transcripción in vitro usando constructos cebador-promotor-selector -propiedades generales

El ejemplo I ilustra el rendimiento de mmc-TIV en condiciones de reacción relevantes, usando un constructo que comprende cebador de RT específico de secuencia, el promotor de T7 y una subsecuencia de selector que está asociada de manera única con el cebador de RT. Tal como se muestra, la reacción de mmc-TIV presenta una respuesta a la dosis específica de secuencia, con un límite de detección, en el sistema modelo, de 1 fmol de cebador/rxn (en este caso, como en otras partes, a menos que se establezca de otro modo, el volumen de la reacción (“rxn”) es de 10 ul). La adición de hebra que no es molde aumenta la intensidad de señal 10 veces a lo largo de un intervalo significativo de concentración de diana, pero no tiene ningún efecto sobre el límite de detección (figura 5). Por tanto, las intensidades de señal obtenidas en el ensayo permiten que se realice la mmc-TIV o bien con, o bien sin, la adición de la hebra que no es molde del promotor de T7, dependiendo de los requisitos de aplicaciones específicas.

En la figura 6, se muestra el transcurso temporal de la reacción de mmc-TIV, ilustrado para ADNmc de IL-2R RT/T7/Sel + NT T7 que produce ARN cortos. La reacción es muy rápida inicialmente, y se completa en gran medida en el plazo de 2 horas, aunque se observa una mejora adicional en el rendimiento para bajas concentraciones del

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molde (1 fmol/rxn) tras 4 h de incubación.

2. Análisis de ARN

2.1 Recuento de ARNm: determinación de la abundancia de mensajes

El método de la invención permite la realización de un formato para la obtención rápida de perfiles de expresión génica; es decir, la determinación simultánea de las abundancias respectivas de un conjunto de mensajes designados (normalmente en presencia de otros mensajes). Esto será de particular interés para aplicaciones que implican la monitorización o la obtención de perfiles de patrones de expresión de un conjunto de genes específicos en respuesta a estímulos externos tales como agentes terapéuticos o infecciosos.

El actual protocolo incluye 4 etapas (figura 2):

1.: Síntesis de ADNc (mediante transcripción inversa) usando constructos de RT cebador/T7/selector

2.: Retirada de constructos no usados, en un modo, mediante captura de ADNc

3.: La amplificación lineal de secuencias de selector correspondientes a ADNc individuales

4.: Detección en chip de productos de ARN mediante transcripción inversa/hibridación

Alternativamente, pueden combinarse las etapas 3 y 4:

3. Amplificación/detección simultáneas usando un alineamiento “coensamblado” de micropartículas, tal como se describe en mayor detalle a continuación.

El ejemplo II demuestra la sensibilidad del ensayo usando el modelo kanamicina-ARNm a lo largo de un intervalo de concentración de diana de desde 1300 fmol/rxn hasta 0,1 fmol/rxn Esta variante del ensayo emplea purificación en columna (no separación magnética) y por tanto no requeriría dNTP biotinilados (o modificados de otro modo) para la síntesis de ADNc. El ensayo, en este formato, demuestra una respuesta a la dosis con un límite de detección de 0,1 fmol/rxn (figura 7).

Retirada de cebador no usado (“limpieza”) – el constructo cebador-promotor-selector no usado debe retirarse cuidadosamente antes de iniciar la mmc-TIV para impedir la formación de transcritos a partir de cebadores no usados solos. Es decir, dependiendo de la cantidad de remanente, la mmc-TIV puede producir una señal independiente de diana cuya intensidad puede limitar la sensibilidad del ensayo.

Además, el uso de dNTP biotinilados (o unidos con hapteno de otro modo) para la síntesis de ADNc requiere la retirada de nucleótidos no usados antes de la captura sobre partículas recubiertas con estreptavidina (o hapteno-AC) magnéticas o no magnéticas.

La retirada de dNTP también es deseable para mejorar el grado de incorporación de dNTP marcados de manera fluorescente durante una reacción de RT-eMAP en chip posterior (que tienden si no a excluirse en favor de dNTP no marcados) y por tanto para potenciar la intensidad de señal del ensayo.

Varios métodos de purificación se proporcionan en el presente documento. En un enfoque convencional, se combina un tratamiento con exonucleasa, para digerir el cebador de RT en exceso, con un tratamiento con fosfatasa alcalina, para retirar los dNTP antes de la reacción de TIV (usando, por ejemplo ExoSap-IT, n.º 78200, USB).

En otro enfoque, pueden retirarse los cebadores y NTP en exceso de la reacción mediante purificación en columna (véase también el ejemplo II). Para garantizar la separación eficaz de cebadores del ADNc o producto de elongación, los cebadores deben ser sustancialmente más cortos que los productos.

En el tercer enfoque, la purificación en columna puede combinarse con la digestión con Exo I del constructo. En el ejemplo III, se muestra la eficacia de retirada del cebador no usado usando una combinación de tratamiento con exonucleasa I y purificación en columna. Los resultados sugieren que la concentración óptima de cebador en las versiones actuales de los protocolos de ensayo no debe superar los 100 fmol/rxn. El tratamiento con Exo I mejora la relación señal/ruido (mediante la reducción adicional de la concentración residual de cebador de RT) pero no aumenta la concentración admisible de cebador.

Otro método de retirada del constructo en exceso es mediante captura en perlas magnéticas, y separación de las perlas mediante atracción magnética. Este método tiene la ventaja adicional de facilitar la integración de TIV y elongación en un formato “en chip”.

La separación magnética puede realizarse en al menos tres (3) diferentes configuraciones directas, tal como se

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muestra en la figura 9, concretamente usando una “punta sobre imán,” un dispositivo de nansoseparación (Pall, véase el catálogo) o una nanorreactor (tal como se representa en la figura 9). Los protocolos de mmc-TIV que invocan separación magnética usan una mezcla de dNTP biotinilados y no modificados para la síntesis de ADNc, seguida por captura del producto biotinilado usando nanopartículas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Otra (cuarta) configuración para la limpieza de perlas magnéticas es recoger las perlas mediante centrifugación de 1 ml de tampón de lavado en tubos de 1,5 ml normales, luego colocar los tubos junto a un imán para elevar el sedimento a lo largo de la pared del tubo, luego retirar todo el tampón de lavado del fondo del tubo; y repetir este procedimiento 2-3 veces hasta completar la retirada del cebador.

La unión de ADNc a una matriz en fase sólida, incluyendo perlas y micropartículas, justo tras la síntesis de ADNc en el actual protocolo, permite la separación, purificación y concentración significativa del ADNc en un pequeño volumen, y por tanto tiene el potencial de aumentar la sensibilidad del ensayo.

Las partículas pueden ser de cualquier tipo adecuado (véanse, por ejemplo, las solicitudes estadounidenses con n.º de serie 10/973.700; 10/348.123), incluyendo partículas de captura magnéticas (véase, por ejemplo, la solicitud estadounidense con n.º de serie 10/032.657), que permite que el producto de elongación, unido a la partícula, se concentre cerca o sobre una superficie de sustrato mediante la aplicación de un campo magnético.

El formato de ensayo de la presente invención ofrece las siguientes ventajas, tal como se describe a continuación:

Flexibilidad de diseño – al permitir la colocación de las secuencias de cebado en cualquier parte a lo largo del ARNm, la reacción de mmc-TIV dada a conocer en el presente documento elimina el requisito de colocación del cebador cerca del extremo 5’ del ARNm de interés, para limitar el tamaño del producto que va a detectarse mediante detección en chip tal como se describe en la solicitud estadounidense con n.º de serie 10/974.036, o cerca del extremo 3’, tal como se requiere por los métodos de expresión génica convencionales, mejorando por tanto la flexibilidad de diseño. Además, mediante la producción de transcritos que difieren en las secuencias independientemente del grado de similitud en las secuencias diana originales, la especificidad del análisis multiplexado se potencia sustancialmente.

Transcritos cortos de secuencia específica -el cebador específico de diana puede colocarse en cualquier parte a lo largo del ARNm diana de interés, sin afectar a la secuencia o longitud del transcrito que están determinadas por la secuencia y longitud de la secuencia de selector; para maximizar la eficacia de captura de transcritos en micropartículas codificadas (véase la solicitud estadounidense con n.º de serie 10/974.036), tal como se describe a continuación, los transcritos son preferiblemente cortos.

La secuencia específica y única de secuencias de selector de mmc-TIV en los constructos, y el uso de diseños de cebador y el ligamiento de constructos (tal como se describe en el presente documento) permite la introducción de disimilitud de secuencia significativa entre mensajes homólogos para permitir la distinción entre la expresión de genes similares. Esto es una característica de diseño que es especialmente beneficiosa para el análisis de genes específicos dentro de familias de genes; por ejemplo, recuento de copias de gen; y la distinción de un conjunto de mensajes de citocinas o mensajes de familias de genes del maíz.

Eliminación de la síntesis de segunda hebra -un aspecto problemático de protocolos actuales para el análisis de la expresión génica es la necesidad de la síntesis de ADN de segunda hebra, que requiere a su vez la digestión (o retirada) del molde de ARN. Aunque la actividad de ADN polimerasa de determinadas transcriptasas inversas puede catalizar la síntesis de ADN, en la práctica, debe añadirse una ADN polimerasa a la reacción tras la digestión del ARNm. Un protocolo ampliamente usado (patente estadounidense n.º 5.545.522; patente estadounidense n.º 5.514.545; Gubler, V., 1983) se basa en cebado al azar, pero requiere la adición de una ligasa, llevando el número requerido de enzimas a tres (antes de la adición de la ARN polimerasa para TIV). Sin embargo, particularmente si se proporciona el conjunto designado de mensajes de interés, los métodos de la presente invención permiten una simplificación sustancial del protocolo.

La unión de la ARN polimerasa y su avance hacia el extremo 5’ del constructo se producen con eficacia sustancial incluso en ausencia de una secuencia de promotor bicatenaria. Es decir, tras la síntesis de primera hebra (ADNc) y la retirada del cebador no usado, preferiblemente mediante captura del ADNc en una fase sólida, o mediante purificación en columna, la reacción de TIV produce copias de la secuencia de selector. Preferiblemente, la hebra de T7 que no es molde (NT) puede añadirse como parte del tampón de TIV para potenciar el aumento de amplificación en un factor de 10, reflejando posiblemente un aumento de la afinidad de unión de la ARN polimerasa cuando se encuentra con la secuencia de promotor bicatenaria.

Eliminación de la digestión con ARNasaH – en el actual protocolo para el análisis de la expresión génica, el molde para mmc-TIV forma parte del constructo de cebador de RT y permanece en forma monocatenaria tras la síntesis de ADNc. El ejemplo IV demuestra el experimento realizado para determinar si podría omitirse la etapa convencional para la digestión con ARNasaH de ARN, requerida por lo demás en una reacción de TIV bicatenaria convencional para permitir la síntesis de ADNc de segunda hebra. Usando un constructo modelo para la reacción de mmc-TIV (figura 10) y el protocolo de ensayo completo (figura 11), los experimentos descritos en el ejemplo IV demuestran

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La transcripción inversa específica de alelo o el ligamiento específico de alelo pueden combinarse con mmc-TIV para el recuento de alelos multiplexado, por ejemplo, para determinar selectivamente el patrón de expresión de genes designados en presencia de genes similares y para la detección de polimorfismos alélicos (Syvanen A.C., 2005).

2.2.1 Análisis mediado por transcripción inversa

La transcripción inversa específica de alelo se combina con TIV en un protocolo de ensayo que comprende las siguientes cuatro etapas (figura 3):

1.: Hibridación de cebador de transcripción inversa específica de alelo, con T7/selector y síntesis de ADNc mediante transcripción inversa; (en caso de análisis de ADN: extensión de cebadores usando ADN polimerasa);

2.: Retirada de cebador no usado (usando uno de los métodos disponibles descritos en el presente documento);

3.: Transcripción de la secuencia de selector; y

4.: Detección en chip del ARN resultante mediante transcripción inversa o hibridación.

Los principios del método se asemejan a los ilustrados en el ejemplo II, excepto en que ahora, el extremo 3’ del cebador específico de diana está diseñado para alelos específicos de manera que se produce extensión de cebadores sólo si el cebador y la diana coinciden en (y están cerca de) el extremo 3’ de la secuencia de cebador. En una realización preferida, un par de cebadores que difieren en la composición en el extremo 3’ pueden usarse para discriminar entre dos alelos.

2.2.2 Análisis mediado por ligamiento

El ligamiento específico de alelo usando un molde de ARN (patente estadounidense n.º 5.686.243, solicitud de patente estadounidense n.º 2003/0082584 A1) se combina con TIV para garantizar la amplificación lineal específica de alelo en un protocolo que comprende las siguientes cuatro etapas (figura 4):

1.: Hibridación de dos sondas de oligonucleótido, una el “promotor”, la otra el “selector”, con el molde de ARNm, inmediatamente adyacente al sitio de interés variable designado;

2.: Ligamiento de las sondas para producir un constructo promotor-selector intacto;

3.: Transcripción de la secuencia de selector;

Oligonucleótidos de “promotor” y “selector” -Para cada diana de interés, se diseñan los dos oligonucleótidos para coincidir con el molde en ambos lados del sitio de interés. El ligamiento (mediante ADN ligasa de T4 o ADN ligasa de Taq, New England Biolabs) de los oligonucleótidos de promotor y selector produce un constructo promotor-selector intacto. El constructo intacto se produce sólo si o bien la secuencia de oligonucleótido de promotor, en su extremo 5’,

o bien la secuencia de oligonucleótido de selector, en su extremo 3’, coincide con la secuencia diana en el sitio de interés. El constructo promotor-selector sirve como molde para la reacción de mmc-TIV, que produce copias de ARN de selector, que entonces se detecta. Es decir, alelos de diana distintos del alelo de interés, no mediarán en la formación de un constructo promotor-selector de TIV intacto y por tanto no se contarán. Por tanto, el método permite el recuento de secuencias de ARNm específicas en presencia de otras secuencias de ARNm que difieren de las de interés en tan sólo un nucleótido individual, como en el caso de determinadas familias de genes en híbridos de maíz demostrados en el ejemplo VI (véase la figura 14) y más generalmente en el caso de otras familias de genes. A la inversa, si todos los alelos van a contarse, pueden proporcionarse múltiples oligonucleótidos de cebadores degenerados para coincidir con alelos normales o variantes en el sitio designado.

Generalmente, en este formato, el molde de ARN debe retirarse o digerirse (mediante métodos convencionales) antes de iniciar la mmc-TIV. Como con el recuento de ARNm, la eficacia de la reacción se mejora mediante la adición de la hebra que no es molde del promotor (preferiblemente como parte del tampón de la reacción de TIV). Una ventaja importante de este método es que elimina la necesidad de una etapa de purificación: el cebador no usado no se conectará a la subsecuencia de selector y por tanto no se detectará.

Otra alternativa es usar ligamiento en vez de transcripción inversa para introducir un resto de captura tal como biotina en una hebra molde de mmc-TIV mediante la unión de un constructo cebador-promotor-selector con un segundo oligonucleótido de “captura” que contiene el resto de captura en su extremo 3’ (tal como se muestra en la figura 4; segunda versión). Como con el recuento de ARNm, este formato requerirá la retirada del cebador no usado.

El constructo biotinilado resultante puede usarse con el fin de concentración tras el ligamiento en pequeño volumen

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o para la colocación del constructo en un alineamiento coensamblado junto con perlas de detección.

3. Análisis de ADN

Los métodos de la invención se adaptan fácilmente para el análisis de ADNg o amplicones producidos mediante PCR. En la realización preferida, un constructo cebador-promotor-selector se dirige contra una subsecuencia de ADN de interés. Entonces, en condiciones (por ejemplo desnaturalización de ADNbc diana mediante calentamiento) que permiten la hibridación del constructo con ADN monocatenario, el constructo se extiende en una reacción catalizada por ADN polimerasa cuando coincide en o está cerca del extremo 3’ (figura 3).

Como alternativa, para introducir la secuencia de T7 en ADNg (o amplicones de ADN), la diana bicatenaria se degrada en primer lugar químicamente (Maniatis T., 1982) dejando extremos 3’ cohesivos para una posible hibridación del constructo específico de diana. Entonces, por medio de versiones de desplazamiento de hebra de una ADN polimerasa, se extiende el cebador, introduciendo por tanto la secuencia de T7 (figura 15). Tras la retirada del cebador no usado específico de diana, se usa el producto elongado para amplificación mediante mmc-TIV de la subsecuencia de selector, seguida por detección tal como se muestra en la figura 3.

3.1 Análisis de polimorfismo en el número de copias del gen

Se sabe que la presencia de múltiples copias de cromosomas y genes está asociada con varios trastornos, por ejemplo: síndrome de Down (Dutta S., 2005) y atrofia muscular espinal (AME) (Ogino S.,2004) así como con varios tipos de cáncer: cáncer de mama (Seo, M. Y., et al, 2004), cáncer de piel (Sellers, W. R. 2005) y otros. El número de copias del gen puede predecir la respuesta del paciente al tratamiento con un fármaco particular, por ejemplo, tratamiento de cáncer de pulmón con gefitinib (Hirsch F.R. 2005). Por tanto, son deseables formatos de análisis rápidos y cómodos para aplicaciones clínicas de rutina.

Cuando sólo un gen individual o un pequeño número de alelos es de interés, tal como es de manera frecuente el caso en la práctica, los métodos de la invención se usan preferiblemente en combinación con detección de producto de ARN en disolución. Para ello, una variedad de métodos convencionales están disponibles, incluyendo el uso del formato de protección de hibridación (véase, por ejemplo, Arnold et al. en las patentes estadounidenses n.os

5.283.174 y 5.639.599) o el uso de un formato de transferencia de energía por fluorescencia usando balizas moleculares (Vet et al., 2002) o sondas en “configuraciones en bucle cuya transformación tras la hibridación de transcritos produce un cambio en la fluorescencia (véase la solicitud de patente estadounidense con n.º de serie 11/218838; presentada el 2/9/2005).

En una realización preferida, se añaden alícuotas que contienen cantidades crecientes de una muestra de referencia (con número de copias conocido) a una cantidad preseleccionada de la muestra clínica de interés, y la ordenada en el origen de la representación gráfica resultante de la intensidad frente a la cantidad de muestra de referencia con el eje de intensidad indica el número de copias del gen en la muestra clínica.

La sensibilidad de detección aumenta cuando balizas moleculares o sondas “en bucle” (véase también la solicitud estadounidense con n.º de serie presentada el 16/11/2004; n.º de serie 60/628464 relativa a “sondas en bucle”) se presentan en portadores de fase sólida tales como micropartículas; micropartículas magnéticas pueden proporcionar ventajas adicionales. Cuando se combinan con estos métodos de detección, los métodos de la invención también permiten la monitorización en tiempo real de la reacción de amplificación.

3.2 Discriminación alélica

Pueden analizarse sitios variables en una secuencia de ADN que representan mutaciones o polimorfismos usando los métodos de análisis específicos de alelo descritos en el presente documento, usando cebadores específicos de alelo para extensión catalizada por ADN polimerasa. De manera similar, los métodos de análisis mediado por ligamiento descritos anteriormente para análisis de ARN se adaptan fácilmente para el análisis de ADN, usando ADN monocatenario como molde para el ligamiento. La principal diferencia de la discriminación de SNP y alelos mediada por ligamiento (Schouten JP., 2002) es la aplicación de la reacción de TIV en vez de PCR para amplificar constructos tras el ligamiento. Como con el análisis de ARN, el método mediado por ligamiento tiene la ventaja significativa de eliminar la necesidad de la retirada de sondas de oligonucleótido y cebadores, facilitando por tanto la realización de formatos de ensayo homogéneos. Esto será especialmente deseable cuando se aplican los métodos de la invención al examen de patógenos, incluyendo la detección e identificación de patógenos virales, especialmente cuando se combinan con la concentración de ARN viral con posterior amplificación y detección, tal como se describe en mayor detalle a continuación.

4 Integración de etapas del protocolo

4.1 TIV con detección simultánea de productos: alineamiento de perlas coensambladas

También se describen en el presente documento métodos para combinar la amplificación lineal de ADNg, ADNc o

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ARN para generar productos de ARN y la detección simultánea de estos productos usando un formato paralelo de detección, preferiblemente detección de alineamientos codificados al azar (READ™).

Pueden detectarse transcritos de ARN de a-sel cortos producidos mediante mmc-TIV a medida que están produciéndose, por ejemplo mediante transcripción inversa en fase sólida para elongar las sondas de captura o mediante captura en balizas moleculares (citado anteriormente) o sondas en configuraciones “en bucle”, cuya transformación tras la hibridación de transcritos produce un cambio en la fluorescencia (Vet, J.A.M., 2002). Para potenciar la eficacia de captura en las condiciones de baja fuerza iónica que permiten una TIV eficaz, pueden usarse ventajosamente sondas de captura de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) (véase la solicitud con n.º de serie 10/227.012).

Tal como se indicó anteriormente, la integración de mmc-TIV con posterior detección multiplexada eliminará las etapas adicionales en el protocolo de ensayo, potenciando de ese modo la velocidad, reduciendo el consumo de reactivos y reduciendo el potencial de contaminación de las muestras y el error que surge de la manipulación de las muestras. La combinación de análisis y detección directamente en chip, preferiblemente en un compartimento cerrado, será particularmente deseable. Para ello, esta invención da a conocer formatos de amplificación mediante TIV en chip y detección del ARN resultante simultáneas por medio de transcripción inversa

En una realización, un alineamiento al azar de perlas codificadas se coensambla para contener perlas que presentan sondas de captura molde así como sondas de análisis de producto. Tal como se ilustra en la figura 16, un alineamiento coensamblado de este tipo puede incluir perlas recubiertas con neutravidina (o perlas magnéticas) para capturar ADNc biotinilado (o perlas que presentan otros restos de captura, por ejemplo anticuerpos, dirigidos contra haptenos correspondientes incorporados en la hebra diana de ADNc), y perlas codificadas que presentan sondas de oligonucleótido con secuencias de selector para permitir la detección de hebras de ARN específicas producidas en la reacción de mmc-TIV para permitir la detección (por ejemplo, tras elongación con nucleótidos marcados).

Una de las posibles implementaciones para la amplificación y detección en chip simultáneas se describe en el ejemplo VII. Tal como se muestra en la figura 17, la reacción simultánea muestra una respuesta a la dosis, con un límite de detección de 1 fmol/ul de un ADNbc biotinilado modelo aplicado al chip. Tal como se demostró previamente, la TIV en fase sólida puede realizarse también usando moldes monocatenarios. Estos resultados demuestran la viabilidad de combinar mmc-TIV con elongación de sondas mediada por RT para la detección, en un formato que permite que se miniaturice la reacción y se configure en compartimentos sellados. Este formato de coensamblaje permite que se realice mmc-TIV con análisis del producto simultáneo (tras la captura del ADNc u otros moldes de TIV o mmc-TIV tales como el par de sondas de oligonucleótidos ligadas) en un volumen de reacción total de menos de 1 microlitro, y más preferiblemente de menos de 50 nanolitros (usando, por ejemplo, una configuración tal como la mostrada en la solicitud estadounidense con n.º de serie 11/218838, presentada el 2/9/2005)

4.2 Captura, amplificación y detección multiplexada de ARN

La simplicidad comparativa del protocolo permite la integración de etapas adicionales, especialmente la captura de ARNm en partículas magnéticas según protocolos convencionales (patente estadounidense n.º 5.759.820), con mmc-TIV y detección multiplexada. Tal como se ilustra en la figura 18 para el análisis de ARN mediado por ligamiento (en este caso en particular, la detección de ARN genómico viral, véase también anteriormente), se permite que se hibriden dos constituyentes del constructo promotor-selector con subsecuencias coincidentes de las hebras de ARNm (o ARN viral) capturado, y, tras ligamiento, se realizan la amplificación y detección simultáneas sobre perlas codificadas de manera análoga al formato de alineamiento coensamblado descrito anteriormente, sin la necesidad de retirada del promotor no usado. De hecho, el ligamiento, la mmc-TIV y la elongación de sondas mediada por RT puede realizarse en el mismo tampón.

El uso de partículas magnéticas para la captura de diana en disolución, seguida por coensamblaje de un alineamiento de micropartículas codificadas, o la deposición mediada por campo magnético de las partículas de captura magnéticas sobre un alineamiento de perlas codificadas ya ensamblado para el análisis del producto, permitirá la concentración de las hebras de ARN originales en un pequeño volumen, en el que los productos de la posterior amplificación mediante mmc-TIV permanecen confinados.

Los métodos y dispositivos de la invención se describen e ilustran adicionalmente en los siguientes ejemplos.

Ejemplo I. Caracterización de la reacción de mmc-TIV: respuesta a la dosis y transcurso temporal.

Se usaron dos constructos diferentes, de 64 y 62 nt de longitud, y que comprenden respectivamente secuencias de cebado de RT para ARNm de IL-2R e IL-4I, así como la hebra molde de promotor de T7, y una secuencia de sel única, como molde para mc-TIV, con o sin la adición de la hebra que no es molde del promotor de T7. Para dilucidar la posible sensibilidad de este enfoque, se variaron las concentraciones de estos cebadores en el intervalo de 100 0,1 fmol/10 µl de rxn. Se usó el ARN obtenido (mediante el kit de T7 MEGAshortscript™, Ambion, n.º de cat. 1354) durante 2 h de incubación a 37°C para la transcripción inversa en chip, seguida por la detección de la señal resultante sobre perlas codificadas que se funcionalizaron con secuencias de captura que coinciden con los

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19-03-2015

selectores de IL-2R e IL-4I (figura 5). El transcurso temporal para la reacción de TIV para ADNmc de IL-2R se ha realizado de la misma manera (figura 6) con tiempos de incubación de 2, 4, 6 y 18 horas a 37°C.

Ejemplo II: Sensibilidad del ensayo usando purificación en columna: kanamicina-ARNm

La primera etapa en el ensayo es la síntesis de ADNc. Se diseñó el constructo -cebador de RT que consiste en secuencias de RT/T7/Sel, de 64 nt de longitud, para generar ADNc de 500 nt de longitud. Los reactivos usados fueron los siguientes:

Kanamicina-ARNm, un control positivo (Promega, n.º de cat. C1381)

Sistema de síntesis de primera hebra Superscript™ III (Invitrogen, n.º de cat. 18080-051)

Kit de T7 MEGAshortscript™ (Ambion, n.º de cat. 1354)

dCTP marcado con Cy3 (Amersham, n.º de cat. PA53021)

BeadChip™ de BAS (BioArray Solutions, Ltd)

Kit de purificación de PCR (Qiagen, n.º 28104)

Se llevaron a cabo todas las reacciones en un termociclador.

Para abordar la respuesta a la dosis, se prepararon las siguientes diluciones de ARNm usando agua DEPC tratada con RNase Out (14 l de RNase out 40 U/l + 266 l de agua DEPC): 1300, 100, 10, 1 a 0,1 fmol/ul.

Se realizó la síntesis de ADNc mediante ensamblaje de la mezcla 1: 1 ul de constructo RT/T7/Sel 0,1 M, 1 ul de ARN (diferentes concentraciones), 2 l de tampón FS 5x, 6 l de agua DI tratada con DEPC. Se incubaron los tubos a 65ºC durante 5 minutos seguido por 10 minutos de incubación a 4ºC. Durante la incubación, se añadió la siguiente mezcla 2 a cada tubo: 2 l de tampón FS 5x, 2 l de DTT 0,1 M, 1 l de mezcla de dNTP 10 mM, 1 l de enzima Superscript III (200 U/l), 4 l de agua DI tratada con DEPC. Se realizó la reacción de RT a 50ºC durante 60 minutos y se desactivó la enzima a 85ºC durante 5 minutos seguido por 10 minutos de incubación a 4ºC. Se purificaron 10 l de mezcla de ADNc final en una columna usando un kit de purificación de PCR de Qiagen, según las instrucciones del fabricante.

Se añadió 1 l de ADNc purificado a 10 l de mezcla de TIV que contiene 1 l de cada NTP 75 mM, 1 l de tampón de reacción 10X de T7, 1 l de mezcla enzimática de T7, 1 l de la parte de NT para T7 0,1 M, 2 l de agua DI tratada con DEPC, y se incubó durante 2 h a 37ºC.

Se detectaron los productos de ARN mediante una etapa de marcaje de transcripción inversa en chip tal como sigue: se mezclaron 10 l de la reacción de TIV que resultó con 10 l de mezcla de RT: se pusieron 1 ul de enzima Superscript III (200 U/l), 2 l de tampón FS 5x, 1 l de DTT 0,1 M, 2 l de dNTP 10 M (sin dCTP), 1 l de Cy3dCTP25 M, 3 l de agua DI tratada con DEPC y 20 l del producto encima del chip de perlas ensambladas con perlas de detección que contienen sondas para la secuencia de Sel. Se incubó el chip durante 15 min a 50ºC, se lavó 3 veces con 20 l de agua DI tratada con DEPC y se obtuvieron imágenes. En la figura 7, se muestran los resultados.

Ejemplo III: Purificación

Se realizaron experimentos para determinar el intervalo de concentraciones óptimas de constructo RT realizando la reacción con diferentes concentraciones de constructo usando una combinación de purificación en columna y digestión con Exo I. Específicamente, se colocó la mezcla de reacción en una columna (Qiagen, n.º de cat. 28104), o bien con, o bien sin tratamiento con Exo I previo. Tras purificación en columna, se usaron 2 l de alícuota de eluato directamente en la reacción de mmc-TIV, y se detectaron los productos de ARN por medio de elongación de sondas mediada por RT en chip (figura 8). Se realizó el tratamiento con Exo I en 10 l de mezcla de reacción que consistía en 1 l de constructo (diferentes concentraciones), 1 l de Exo I (New England Biolabs (NEB), n.º de cat. M0293S), 2 l de tampón FS 5x (véase el ejemplo II) durante 30 min a 37ºC seguido por inactivación de Exo I durante 20 min a 80ºC. Se usó el tampón FS para reproducir las condiciones reales del tratamiento con Exo I del ensayo, aunque las condiciones de tampón óptimas para digestión se proporcionan mediante tampón Exo I 10x (NEB).

Ejemplo IV: Eliminación de la etapa de digestión con ARNasaH

En primer lugar se examinó la necesidad de la digestión con ARNasaH en un sistema modelo en el que se supuso que la configuración de los oligonucleótidos hibridados con ARN se asemeja a la configuración en el ensayo real. Se obtuvo el constructo como resultado de la hibridación constructo RT/T7/Sel con ARN de IL-2R de 50 nt de longitud,

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