ES2532946T3 - Polipéptidos PUfH meningocócicos - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 23

Description

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Las infecciones por Neisseria afectan a varias áreas del cuerpo por lo que las composiciones de la invención puede prepararse de varias formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, bien como soluciones líquidas o suspensiones. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. La composición puede prepararse para administración tópica, por ejemplo, como una pomada, crema o polvos. La composición puede prepararse para administración oral, por ejemplo, como un comprimido o cápsula, o como un jarabe (opcionalmente con sabor). La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino

o un pulverizador. La composición puede prepararse como un supositorio o pesario. La composición puede prepararse para administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, como gotas.

La composición es preferentemente estéril. Está preferentemente libre de pirógeno. Está preferentemente amortiguada, por ejemplo, entre pH 6 y pH 8, generalmente alrededor de pH 7. Donde una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, es preferente usar un tampón de histidina [22]. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a humanos.

Las composiciones inmunogénicas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de inmunógeno, así como cualquier otro componente especificado. Por “cantidad inmunológicamente efectiva” se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, bien en una única dosis o como parte de una serie, es efectiva para tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo que se tratará, edad, grupo taxonómico del individuo que se tratará (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado deseado de protección, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica del doctor que está tratando y otros factores relevante. Se espera que la cantidad corresponda a un rango relativamente amplio que puede determinarse a través de ensayos rutinarios. El tratamiento con dosis puede ser un programa de una única dosis o un programa con dosis múltiples (por ejemplo, incluyendo dosis de refuerzo). La composición puede administrarse junto con otros agentes inmunoreguladores.

Los adyuvantes que pueden usarse en composiciones de la invención incluyen, aunque no se limitan a:

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales para su uso como adyuvante en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. [por ejemplo, véase capítulos 8 y 9 de ref. 23] o mezclas de diferentes compuestos minerales, tomando los compuestos cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), y siendo preferente la adsorción. Las composiciones que contienen minerales pueden también formularse como una partícula de sal metálica [24]

Un adyuvante de fosfato de aluminio útil es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una proporción molar de PO4/Al de entre 0,84 y 0,92, incluido en 0,6 mg Al3+/ml.

B. Emulsiones de aceite

Las composiciones de emulsión de aceite para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno en agua, tal como MF59 [Capítulo 10 de ref. 23; veas también ref. 25] (5% Escualeno, 0,5% Tween 80 y 0,5% Span 85, formulado en partículas submicrón usando un microfluidizador). También pueden usarse adyuvante completo de Freund (ACF) y adyuvante incompleto de Freund (AIF).

Las emulsiones útiles de aceite en agua incluyen al menos un aceite y al menos un surfactante, siendo los aceites y surfactantes biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Las gotitas de aceite en la emulsión son generalmente inferiores a 1 µm en diámetro, conseguiéndose estos tamaños pequeños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Las gotitas con un tamaño inferior a 220nm son preferentes ya que pueden someterse a esterilización con filtro.

La emulsión puede comprender aceites tales como aquellos procedentes de una fuente animal (tal como un pescado) o fuente vegetal. Las fuentes para aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos. Aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de coco y aceite de oliva, comúnmente los más disponibles, ejemplifican los aceites de frutos secos. Puede usarse aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido de la vaina de jojoba. Aceites de semillas incluyen aceite de alazor, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de los granos, aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero el aceite de otros cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, tef, triticale y similares también pueden usarse. Ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, mientras no ocurran de manera natural en aceites de semillas, pueden prepararse mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de aceites de frutos secos y semillas. Las grasas y aceites de leche de mamífero pueden metabolizarse y por lo tanto pueden usarse en la práctica de esta invención. Los procedimientos para separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales son bien conocidos en la técnica. La mayoría de los pescados contienen aceites que pueden metabolizarse que pueden reconvertirse fácilmente. Por ejemplo, aceite

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de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes puede encontrase en las refs 69-76. Un mutante CT útil es o CT-E29H [77]. Las referencia numérica para sustituciones de aminoácido se basa preferentemente en los alineamientos de las subunidades A y B de toxinas ADP-ribosilantes expuestas en la ref. 78.

E. Inmunomodulares humanos

Los inmunomoduladores humanos adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen citoquinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [79], etc.) [80], interferones (por ejemplo, interferón-γ), factor estimulador de colonia de macrófagos y factor de necrosis tumoral. Un inmunomodulador preferentes es IL-12.

G. Bioahdesivos y Mucoadhesivos

Los bioadhesivos y mucoadhesivos pueden también usase como adyuvantes en la invención. Bioadhesivos adecuados incluyen microesferas esterificadas de ácido hialurónico [81] o mucoadhesivos tales como derivados de enlace cruzado de ácido poliacrílico, alcohol de polivinilo, pirrolidona de polivinilo, polisacáridos y carboximetilcelulosa. El quitosano y derivados del mismo también pueden usarse como adyuvantes en la invención [82].

H. Micropartículas

Las micropartículas también pueden usarse como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (esto es, una partícula de ~100nm a ~150µm en diámetro, más preferentemente de ~200nm a ~30µm en diámetro, y más preferentemente de ~500nm a ~10µm en diámetro) formados a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un ácido poli(α-hidroxi), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoester, un polianhídrido, una policaprolactona, etc), con poli(láctido-co-glicólidos) siendo preferentes, opcionalmente tratados para tener una superficie con carga negativa (por ejemplo, con SDS) o una superficie con carga positiva (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).

I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de ref. 23)

Ejemplos de formulaciones de liposoma adecuados para su uso como adyuvantes se describen en las refs. 83-85.

J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [86]. Tales formulaciones pueden además incluir surfactantes de éster de sorbitán de polioxietileno en combinación con un octoxinol [87] así como éteres de alquilo de polioxietileno o surfactantes de ésteres en combinación con al menso un surfactante adicional no iónico tal como octoxinol [88]. Los éteres de polioxietileno preferentes se seleccionan del siguiente grupo: éter de polioxietileno-9-lauril (laureth 9), éter de polioxietileno-9eteoril, éter de polioxietileno-8-eteoril, éter de polioxietileno-4-lauril, éter de polioxietileno-35-lauril y éter de polioxietileno-23-lauril.

K. Polifosfaceno (PCPP)

Las formulaciones PCPP se describen, por ejemplo, en las refs. 89 y 90.

L. Péptidos de muramilo

Ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para su uso en la invención incluyen N-acetil-muramil-Ltreonil-D-isoglutamina (thr-MDP, n-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no-MDP) y N-acetilmuramil-L-alanil-Disoglutaminil-L-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).

M. Compuestos de imidazoquinolona

Ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo “Resiquimod 3M”, descritos con más detalle en las refs. 91 y 92.

La invención comprende además combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, en la invención pueden usase las siguientes composiciones de adyuvantes: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [93]; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo, 3dMPL [94]; (3) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo, 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [95];

(5) una combinación de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [96]; (6) SAF, que contiene 6% escualano, 0,4% Tween 80™, 5% polímero en bloque plurónico L121, y thr-MDP, bien microfluidizado o

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Si se realiza hidrólisis, el hidrolizado tendrá el tamaño adecuado para eliminar oligosacáridos de longitud corta [100]. Esto puede conseguirse de varias maneras, tal como ultrafiltración seguida de cromatografía de intercambio iónico. Los oligosacáridos con un grado de polimerización inferior a o igual a 6 se eliminan preferentemente del serogrupo A, y aquellos inferiores a aproximadamente 4 se eliminan preferentemente de los serogrupos W135 e Y.

Los antígenos de sacárido MenC preferentes se desvelan en la referencia 120, como los usados en Menjugate™.

El antígeno de sacárido puede modificarse químicamente. Esto es particularmente útil para reducir hidrólisis para serogrupo A [122; veas más abajo]. Puede realizarse de-O-acetilación de sacáridos meningocócicos. Para oligosacáridos, la modificación puede tener lugar antes o después de despolimerización.

Donde una composición de la invención incluye un antígeno de sacárido MenA, el antígeno es preferentemente un sacárido modificado en el que uno o más de los grupos hidroxilo en el sacárido nativo se ha(n) sustituido por un grupo bloqueador [122]. Esta modificación mejora la resistencia a hidrólisis.

Conjugación covalente

Los sacáridos capsulares en las composiciones de la invención estarán normalmente conjugados con proteínas transportadoras. En general, la conjugación mejora la inmunogenicidad de sacáridos ya que los convierte de antígenos T-independientes a antígenos T-dependientes, permitiendo así la preparación para memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida.

Las proteínas transportadoras típicas son toxinas bacterianas, tales como toxinas de difteria y tétano, o toxoides o mutantes de las mismas. El mutante CRM197 de toxina de difteria [123] es útil, y es el transportador del producto PREVNAR™. Otras proteínas transportadoras adecuadas incluyen complejos de proteína de membrana externa de N. meningitidis [124], péptidos sintéticos [125, 126], proteínas de choque térmico [127, 128], proteínas de pertussis [129, 130], citoquinas [131], linfoquinas [131], hormonas [131], factores del crecimiento [131], proteínas artificiales que comprenden epítopes celulares CD4+ T humanos múltiples de varios antígenos derivados de patógenos [132] tales como N19 [133], proteína D de H. influenzae [134-136], pneumolisina [137] o sus derivados no tóxicos [138], proteína PspA de superficie meningocócica [139], proteínas de adsorción de hierro [140], toxina A o B de C. difficile [141], exoproteína A recombinante de P. aeruginosa (rEPA) [142], etc.

Puede usarse cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier conector adecuado donde sea necesario.

El sacárido típicamente se activará o funcionalizará antes de la conjugación. La activación puede implicar, por ejemplo, reactivos de cianilación tales como CDAP (por ejemplo, 1-ciano-4-dimetilamino piridinio tetrafluoroborato [143, 144, etc.]. Otras técnicas adecuadas usan carbodiimidas, hidracidas, ésteres activos, norborano, ácido p-nitroenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU, etc.

Las uniones por medio de un grupo conector pueden hacerse usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 145 y 146. Otro tipo de unión implica la aminación reductora del polisacárido, acoplando el grupo amino resultante a un extremo de un grupo conector de ácido adípico, y después acoplando una proteína al otro extremo del grupo conector de ácido adípico [147, 148]. Otros conectores incluyen B-propionamido [149], nitrofenil-etilamina [150], haluros de hiloacilo [151], uniones glicosídicas [152], ácido 6-aminocaproico [153], ADH [154], porciones C4 a C12 [155] etc. Como una alternativa a usar un conector, puede usarse una unión directa. Las uniones directas a la proteína pueden comprender oxidación del polisacárido seguida de animación reductora con la proteína, como se describe, por ejemplo, en las referencias 156 y 157.

Un proceso que implica la introducción de grupos amino en el sacárido (por ejemplo, sustituyendo grupos terminales =O por –NH2) seguido de derivación con un diéster adípico (por ejemplo, ácido adípico diéster Nhidroxisuccinimido) y reacción con proteína transportada es preferente. Otra reacción preferente usa activación CDAP con proteína transportadora D, por ejemplo, de MenA o MenC.

Vesículas de membrana externa

Es preferente que las composiciones de la invención no incluyan mezclas complejas o no definidas de antígenos, que son características típicas de VME. Sin embargo, la invención puede usarse junto con VME, ya que se ha descubierto que PUfH mejora su eficacia [6], en particular al sobre-expresar los polipéptidos de la invención en las cepas usadas para preparación de VME.

Esta técnica puede usarse en general para mejorar preparaciones de vesículas de N.meningitidis serogrupos B [158], “VME nativas” [159], ampollas o vesículas de membrana externa [por ejemplo, refs. 160 a 165, etc.]. Éstas pueden prepararse a partir de bacterias que se han manipulado genéticamente [166-169], por ejemplo,

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para aumentar la inmunogenicidad (por ejemplo, hiper-expresar inmunógenos), para reducir toxicidad, para inhibir síntesis de polisacárido capsular, para reducir la expresión PorA, etc. Pueden prepararse a partir de cepas de hipervaculolización [170-173]. Pueden incluirse vesículas de una Neisseria no patogeénica [174]. VsME pueden prepararse si uso de detergentes [175, 176]. Pueden expresar proteínas de no Neisseria en su superficie [177]. Pueden estar sin LPS. Pueden mezclase con antígenos recombinantes [160, 178]. Pueden usarse vesículas de bacterias con diferentes subtipos de proteína de membrana exterior clase I, por ejemplo, seis subtipos diferentes [179, 180] usando dos poblaciones diferentes de vesículas fabricadas genéticamente mostrando cada una tres subtipos, o nueve subtipos diferentes usando tres poblaciones diferentes de vesículas fabricadas genéticamente mostrando cada una tres subtipos, etc. Los subtipos útiles incluyen: P1.7,16; P1.5,16; P1.7,1,2-2; P1.19,15-1; P1.52,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1; P1.18-1,3,6.

Más abajo se dan más detalles.

Expresión de proteínas

Las técnicas de expresión bacteriana son conocidas en la técnica. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a polimerasa bacteriana de ARN e iniciar una transcripción corriente abajo (3’) de una secuencia codificadora (por ejemplo, un gen estructural) en mARN. Un promotor tendrá una región de iniciación de transcripción que normalmente se coloca próxima al extremo 50 de la secuencia codificadora. Esta región de iniciación de transcripción normalmente incluye un sitio de unión de polimerasa de ARN y un sitio de iniciación de transcripción. Un promotor bacteriano también puede tener un segundo dominio llamado un operador, que puede sobreponerse a un sitio de unión de polimerasa ARN adyacente en el comienza la síntesis de ARN. El operador permite una transcripción regulada negativa (inducible), ya que una proteína represora de gen puede unirse al operador y de este modo inhibir la transcripción de un gen específico. Puede ocurrir expresión constitutiva en ausencia e elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además, la regulación positiva puede conseguirse por una secuencia de unión de proteína activadora de gen, que, si está presente está normalmente próxima (5’) a la secuencia de unión de polimerasa. Un ejemplo de proteína activadora de gen es la proteína activadora por catabolito (CAP), que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) [Ribaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. La expresión regulada puede por lo tanto ser positiva o negativa, aumentando o reduciendo de este modo la transcripción.

Las secuencias que codifican enzimas de vía metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas que metabolizan azúcar, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198:1056], y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids. Res. 9:731; patente de Estados Unidos 4.738.921; EP-A0036776 y EP-A-0121775]. El sistema promotor de β-lactamasa (bla) [Weissman (1981) “La clonación de interferón y otros errores”. En Interferon 3 (ed. I. Gresser)], los sistemas de PL lambda bacteriófago [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128] y promotor T5 [patente de Estados Unidos 4.689.406] también proporcionan secuencias promotoras útiles. Otro promotor de interés es un promotor inducible de arabinosa (pBAD).

Además, los promotores sintéticos que no ocurren en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago pueden unirse con las secuencias de operón de otro promotor bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético [patente de Estados Unidos 4.551.433]. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lac híbrido que comprende secuencias de promotor trp y de operón lac que está regulado por el represor lac [Amann et al. (1983) Gene 25:167; e Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores que ocurren de manera natural de origen no bacteriano que tienen la habilidad de unirse a polimerasa bacteriana de ARN e iniciar transcripción. Un promotor que ocurre de manera natural de origen no bacteriano también puede acoplarse a polimerasa de ARN compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema polimerasa/promotor ARN bacteriófago T7 es un ejemplo de sistema promotor acoplado [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al., (1985) Proc Natl. Acad. Sci. 82:1074]. Además, un promotor híbrido puede también comprender un promotor bacteriófago y una región de operador E. coli (EP-A-0 267 851).

Además de una secuencia que funciona como promotora, un sitio de unión de ribosoma eficiente también es útil para la expresión de genes exteriores en procariotas. En E. coli, el sitio de unión de ribosoma se llama secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de iniciación (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud situada 3-11 nucleótidos corriente arriba del codón de iniciación. La secuencia SD está pensada para promotor la unión de mARN con el ribosoma mediante el emparejamiento de bases entre la secuencia SD y el extremo 3’ de E. coli 16S rARN [Steitz et al. (1979) “Señales genéticas y secuencias de nucleótidos en ARN mensajero””. En Biological Regulation and Development: Gene Expresssion (ed. R. F. Goldberger)]. Para expresar genes eucarióticos y genes procarióticos con sitio de unión de ribosoma débil [Sambrook et al. (1989) “Expresión de genes clonados en Escherichia coli”. En Molecular Cloning: A Laboratory Manual.].

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Una secuencia promotora puede estar directamente unida a la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en la terminal N será siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, la metionina en la terminal N puede partirse de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno o mediante incubación in vivo o in vitro con una peptidasa de terminal N de metionina bacteriana (EP-A0219237).

Normalmente, las secuencias de terminación de transcripción reconocidas por las bacterias son regiones reguladoras localizadas 3’ hasta el codón de parada de traslación, y así junto con el promotor flanquean la secuencia codificadora. Estas secuencias dirigen la transcripción de un mARN que puede trasladarse al polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de transcripción frecuentemente incluyen secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de tipo tallo-lazo que ayudan a terminar la transcripción. Ejemplos incluyen secuencias de terminación de transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli así como otros genes biosintéticos.

Normalmente, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, secuencia de señal (si se desea), secuencia codificadora de interés, y secuencia de terminación de transcripción, se ponen juntos en las construcciones de expresión. Las construcciones de expresión a menudo se mantienen en un replicón, tal como un elemento extra-cromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaces de un mantenimiento estable en un huésped, tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema de réplica, permitiendo así mantenerse en una célula procariótica para expresión o para clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido de número alto o bajo de copia. Un plásmido de número alto de copia generalmente tendrá un número de copia que oscile entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y normalmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150. Un huésped que contiene un número alto de copia preferentemente contendrá al menos aproximadamente 10, y más preferentemente al menos aproximadamente 20 plásmidos. Puede seleccionarse un vector con número alto o bajo de copia, dependiendo del efecto del vector y de la proteína externa en el huésped.

Alternativamente, las construcciones de expresión pueden estar integradas en el genoma bacteriano con un vector integrante. Los vectores integrantes normalmente contienen una secuencia homóloga al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores integrantes construidos con ADN de varias cepas Bacillus se integran en el cromosoma de Bacilllus (EP-A-0127328). Los vectores integrantes también pueden comprender secuencias de bacteriófagos o transposones.

Normalmente, las construcciones extra-cromosómicas y de expresión integrantes pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que se han transformado. Los marcadores seleccionables pueden expresarse en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que dan bacterias resistentes a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) y tetraciclina [Davies et al. (1978) Annu. Ref. Microbiol. 32:469]. Los marcadores seleccionables también pueden incluir genes biosintéticos, tales como aquellos en las vías biosintéticas de histidina, triptófano y leucina.

Alternativamente, algunos de los componentes anteriormente descritos pueden unirse en los vectores de transformación. Los vectores de transformación normalmente comprenden un marcador seleccionable que se mantiene en un replicón o se desarrolla en un vector integrante, como se ha descrito anteriormente.

Los vectores de expresión y transformación, bien replicones extra-cromosómicos o vectores integrantes, se han desarrollado para su transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para, entre otras, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis [Palva et al. 81982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036259 y EP-A-0063953; WO84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; EP-A-0 036 776, EP-A-0 136 829 y EPA-0 136 907], Streptococcus cremoris [Powel et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powel et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655], Streptomyces lividans [Patente de Estados Unidos 4.745.056].

Los métodos para introducir ADN exógeno en huéspedes bacterianos son bien conocidos en la técnica, y normalmente incluyen la transformación de bacterias tratadas con CaCl2 u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. ADN también puede introducirse con la especie bacteriana que se transformará. Véase, por ejemplo [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036259 y EP-A-0063953; WO84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang et al. (1990) J. Baceriol. 172:949; Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978). “Un método mejorado para transformación de Escherichia coli con plásmidos derivados de ColE1”. En Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engeneering (eds. H. W. Boyer y S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53:159;Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170:38; Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203; Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander 81987) “Transformación de Streptococcus lactis por electroforación” en. Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun.

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32:1295; Powell et al. (1988). Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th. Ever. Cong. Biotechnology 1:412; Streptococcus].

Células huéspedes

La invención proporciona una bacteria que expresa un polipéptido de la invención. La bacteria puede ser un meningococo. La bacteria puede expresar constitutivamente el polipéptido, pero en algunas realizaciones la expresión puede estar bajo el control de un promotor inducible. La bacteria puede hiper-expresar el polipéptido (cf. Ref. 181). La expresión del polipéptido puede no ser variables de fase.

La invención también proporciona vesículas de membrana externa preparadas a partir de una bacteria de la invención. También proporciona un proceso para producir vesículas a partir de una bacteria de la invención. Las vesículas preparadas a partir de estas cepas incluyen preferentemente el polipéptido de la invención, que debería estar en una forma inmunoaccesible en las vesículas, esto es, un anticuerpo que pueda unirse a un polipéptido purificado de la invención también debería ser capaz de unirse al polipéptido que está presente en las vesículas.

Las vesículas de membrana externa incluyen cualquier vesícula proteoliposómica obtenida mediante alteración de una vacuolización de una membrana externa meningocócica para formar vesículas que incluyen componentes proteicos de la membrana externa. Así, los términos incluyen VsME (algunas veces referidas como “ampollas”), microvesículas (MVs [182] y “VsME nativas” (“VsMEN” [183]).

MS y VsMEN son vesículas de membrana que ocurren de manera natural que se forman espontáneamente durante el crecimiento bacteriano y se liberan en el medio de cultivo. La MVs pueden obtenerse cultivando Neisseria en medio de caldo de cultivo, separando células enteras de las MVs más pequeñas en el medio de caldo de cultivo (por ejemplo, mediante filtración o centrifugación a baja velocidad del medio sin células (por ejemplo, mediante filtración, mediante precipitación diferencial o agregación de MVs, mediante centrifugación a alta velocidad para formar gránulos de las MVs). Las cepas para su uso en la producción de MVs pueden generalmente seleccionarse en base a la cantidad de MVs producidas en cultivo, por ejemplo, refs. 184 y 185 describen Neisseria con alta producción de MV.

VsME se preparan artificialmente a partir de bacterias, y pueden prepararse usando tratamiento con detergente (por ejemplo, con deoxicolato), o con medios no detergentes (por ejemplo, véase referencia 186). Las técnicas para la formación de VsME incluyen tratamiento de bacterias con un detergente de sal ácida de bilis (por ejemplo, sales de ácido litocólico, ácido quenodeoxicólico, ácido ursodeoxicólico, ácido deoxicólico, ácido cólico, ácido ursocólico, etc., con deoxicolato de sodio [187 y 188] siendo preferentes para tratar Neisseria) en un pH suficientemente alto para no precipitar el detergente [189]. Pueden realizarse otras técnicas sustancialmente en ausencia de detergente [186] usando técnicas tales como sonicación, homogenización, microfluidización, cavitación, choque osmótico, pulverización, prensa francesa, mezcla, etc. los método que usan poco o nada de detergente pueden retener antígenos útiles tales como NspA [186]. Así, un método puede usar una tampón de extracción de VME con aproximadamente 0,5% deoxicolato o menos, por ejemplo, aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,1%, <0,05% o cero.

Un proceso útil para la preparación de VME se describe en la referencia 190 e implica la ultrafiltración en VsME crudas, en lugar de centrifugación a alta velocidad. El proceso puede implicar la etapa de ultracentrifugación después de que la ultrafiltración haya tenido lugar.

Las vesículas para su uso con la invención pueden prepararse a partir de cualquier cepa meningocócica. Las vesículas serán normalmente de la cepa de serogrupo B, pero es posible prepararlas a partir de serogrupos diferentes a B (por ejemplo, la referencia 189 desvela un proceso para serogrupo A), tal como A, C, W135 o Y. La cepa puede ser de cualquier serotipo (por ejemplo, 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.), cualquier serosubtipo y cualquier inmunotipo (por ejemplo, L1; L2; L3, L3,3,7; L10; etc.). Los meningococos pueden ser de cualquier linaje adecuado, incluyendo linajes hiperinvasivos e hipervirulentos, por ejemplo, cualquiera de los siguientes siete linajes hipervirulentos: subgrupo I; subgrupo II; subgrupo IV-1; complejo ET-5; complejo Et-37; grupo A4; linaje 3.

Las bacterias de la invención, además de codificar un polipéptido de la invención, pueden tener una o más modificaciones adicionales. Por ejemplo, pueden tener un gen fur modificado [191]. La referencia 199 muestra que la expresión nspA debería aumentar con porA y cps nocaut simultáneos, y estas modificaciones pueden usarse. Más mutantes nocaut de N. meningitidis para producción de VME se desvelan en las referencias 199 a 201. La referencia 192 desvela la construcción de vesículas de cepas modificadas para expresar seis subtipos diferentes de PorA. Neisseria mutante con niveles bajos de endotoxina, conseguida noqueando enzimas implicadas en biosíntesis de LPS, también puede usarse [193, 194]. Estos u otros mutantes pueden usarse en su totalidad con la invención.

Así, una cepa usada con la invención en algunas realizaciones expresan más de un subtipo PorA. Las cepas PorA 6-valentes o 9-valentes se han construido previamente. La cepa puede expresar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de subtipos PorA: P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1 y/o P1.18-1,3,6. En otras realizaciones, una cepa puede reducirse para expresión de PorA, por ejemplo, en la que la cantidad de

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[14] WO2007/060548.

[15] Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453.

[16] Rice et al. (2000) Trends Genet 16:276-277.

[17] Achtman (1995) Epidemiología global de enfermedad meningocócica. Páginas 159-175 de Meningococcal disease (ed. Cartwight). ISBN: 0-471-95259-1.

[18] Caugant (1998) APMIS 106:505-525.

[19] Maiden et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3140-3145.

[20] WO01/30390.

[21] Gennaro (2000) Remington: La Ciencia y Práctica de Farmacia. 20ª edición, ISBN: 0683306472.

[22] WO03/009869.

[23] Vaccine Design… (1995) eds. Powel & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.

[24] WO00/23105.

[25] WO90/14837.

[26] WO90/14837.

[27] Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203.

[28] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680.

[29] Diseño de Vacuna: La Subunidad y Técnica de Adyuvante (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X)

[30] Adyuvantes de Vacuna: Métodos de Preparación y Protocolos de Búsqueda (Volumen 2 de la serie Methods in Molecular Medicine). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O’Hagan.

[31] US 5.057.540.

[32] WO96/33739.

[33] EP-A-0109942.

[34] WO96/11711.

[35] WO00/07621.

[36] Barr et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271.

[37] Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338.

[38] Niikura et al. (2002) Virology 293:273-280.

[39] Lenz et al. (2001) J Immunol 166:5346-5355.

[40] Pinto et al. (2003) J Infect Dis 188:327-338.

[41] Gerber et al. (2001) J Virol 75:4752-4760.

[42] WO03/024480.

[43] WO03/024481.

[44] Gluck et al. (2002) Vaccine 20:B10-B16.

[45] EP-A-0689454.

[46] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

[47] Evans et al. (2003) Expert Rev. Vaccines 2:219-229.

[48] Meraldi et al. (2003) Vaccine 21:2485-2491.

[49] Pajak et al. (2003) Vaccine 21:836-842.

[50] Kandimalla et al. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400.

[51] WO02/26757.

[52] WO99/62923.

[53] Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835.

[54] McCluskie et al. (2002). FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185.

[55] WO98/40100.

[56] US 6.207.646.

[57] US 6.239.113.

[58] US 6.429.199.

[59] Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (parte 3):654-658.

[60] Blackwell et al. (2003) J Immunol 170:4061-4068.

[61] Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65.

[62] WO01/95935.

[63] Kandimalla et al. (2003) BBRC 306:948-953.

[64] Bhagat et al. (2003) BBRC 300:853-861.

[65] WO03/035836.

[66] Schellack et al. (2006) Vaccine 24:5461-72.

[67] WO95/17211.

[68] WO98/42375.

[69] Beignon et al. (2002) Infect Immun 70:3012-3019.

[70] Piezza et al. (2001) Vaccine 19:2534-2541.

[71] Pizza et al. (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461.

[72] Scharton-Kersten et al. (2000) Infect Immun 68:5306-5313.

[73] Ryan et al. (1999) Infect Immun 67:6270-6280.

[74] Partidos et al. (1999) Immunol Lett 67:209-216.

[75] Peppoloni et al. (2003) Expert Rev. Vaccines 2:285-293.

[76] Pine et al. (2002) J Control Release 85:263-270.

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NOMBRES ALTERNATIVOS PARA SECUENCIAS EN EL LISTADO SECUENCIAL

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55

SEQ ID NO:

Descripción SEQ ID NO: Descripción

1

PUfH, cepa MC58-familia I 42 PATCH_12B

2

PUfH, cepa 961-5945 y 2996-familia II 43 PATCH_12C

3

PUfH, cepa MC58-familia I 44 PATCH_12D

4

LOOP2 45 PATCH_12E

5

PATCH_1 46 PATCH_12F

6

PATCH_2 47 PATCH_12G

7

PATCH_2S 48 PATCH_12H

8

PATCH_2T 49 PATCH_12I

9

PATCH_2FAT 50 PATCH_12L

10

PATCH_3 51 PATCH_12M

11

PATCH_5 52 PATCH_12N

12

PATCH_5bis 53 PATCH_13

13

PATCH_5tris 54 PATCH_13B

14

PATCH_5tetra 55 PATCH_13C

15

PATCH_5penta 56 PATCH_14

16

PATCH_8 57 PATCH_14B

17

PATCH_8B 58 PATCH_14C

18

PATCH_9 59 PATCH_14D

19

PATCH_9B 60 PATCH_15A

20

PATCH_9C 61 PATCH_15B

21

PATCH_9D 62 PATCH_16A

22

PATCH_9E 63 PATCH_16B

23

PATCH_10A 64 PATCH_16C

24

PATCH_10B 65 PATCH_16D

25

PATCH_10C 66 PATCH_16E

26

PATCH_10D 67 PATCH_16F

27

PATCH_10E 68 PATCH_16G

28

PATCH_10F 69 PATCH_17A

29

PATCH_10G 70 PATCH_17B

30

PATCH_10H 71 PATCH_17C

31

PATCH_11 72 PATCH_18A

32

PATCH_11B 73 PATCH_18B

33

PATCH_11C 74 PATCH_18C

34

PATCH_11D 75 PATCH_18D

35

PATCH_11E 76 NL096

36

PATCH_11F 77 y 78 NL096_FULL

37

PATCH_11G 79 Met-PATCH_9C

38

PATCH_11H 80 Met-PATCH_10A

39

PATCH_11I 81 IC31

40

PATCH_11L 82 IC31

41

PATCH_12 83 AA 27-274 de SEQ 1

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Claims (1)

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