ES2528330T3

ES2528330T3 - Compartimentación de polipéptidos recombinantes en células anfitrionas

Info

Publication number: ES2528330T3
Application number: ES00904978.4T
Authority: ES
Inventors: Werner Prof. Dr. Lubitz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-01-28
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2015-02-06
Anticipated expiration: 2020-01-28
Also published as: EP1144590A1; CA2359210A1; DK1144590T3; JP2002534998A; AU2667500A; CN100359001C; CA2359210C; NZ512983A; AU779939B2; CN1345370A; WO2000044878A1; DE19903345A1; EP1144590B1; US6610517B1; JP4707836B2

Abstract

Célula anfitriona que comprende por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales, de los cuales por lo menos uno se presenta en una forma fijada a un soporte como una fusión con un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos de ésta, siendo la célula anfitriona una célula de bacteria gram negativa.

Description

Compartimentación de polipéptidos recombinantes en células anfitrionas

El presente invento se refiere a unas células anfitrionas de bacterias gram negativas, que comprenden por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales, de los cuales por lo menos uno se presenta en una forma fijada a un soporte, como una fusión con un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos celulares, p.ej. en el citosol, en la membrana citoplasmática, en el periplasma y en la membrana externa, así como a unos procedimientos para su producción. Las células conformes al invento se adecuan en particular como unos biorreactores para la realización de cascadas de reacciones enzimáticas, en cuyos casos es ventajosa o necesaria una compartimentación de unas enzimas individuales.

La utilización de células vivas como "reactores enzimáticos" para la preparación de sustancias biológicas, p.ej. de poli(hidroxi-ácidos grasos), tiene una gran importancia para la industria biotecnológica. Para esto es conocido el recurso de introducir y expresar ciertos genes ajenos en una célula anfitriona, con el fin de obtener de este modo una célula anfitriona con enzimas recombinantes, que está en la situación de sintetizar un producto deseado. Una desventaja de los procedimientos conocidos residía, sin embargo, en el hecho que las enzimas producidas en las células anfitrionas mediante una expresión de los genes ajenos no eran estables, eran demasiado poco activas o estaban presentes en una cantidad demasiado pequeña. Se presentaron unas dificultades especiales también en el caso de la realización de unas reacciones de múltiples etapas, en las cuales unos substratos o unos productos de una de las etapas pueden repercutir negativamente sobre otras etapas.

La misión del presente invento fue allanar por lo menos parcialmente los problemas del estado de la técnica y poner a disposición unas células anfitrionas, que estén en la situación de presentar de un modo estable unos polipéptidos recombinantes funcionales y llevar a cabo en particular unas reacciones enzimáticas de múltiples etapas.

El problema planteado por esta misión se resuelve mediante la puesta a disposición de una célula anfitriona de bacterias gram negativas, que comprende por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales, de los cuales por lo menos uno se presenta como una fusión de un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos de ésta.

De manera sorprendente, se comprobó que la expresión recombinante fijada a un soporte de unos polipéptidos heterólogos en diferentes compartimentos de células de bacterias gram negativas conduce a una presentación estable de los polipéptidos heterólogos en una forma funcional (es decir activa inmunológica o/y biológicamente, p.ej. activa enzimáticamente). Cuando la célula anfitriona es una célula de bacteria gram negativa, los compartimentos celulares se pueden escoger de manera preferida entre el citosol, la membrana citoplasmática (los lados externo e interno) y la membrana externa (los lados externo e interno).

Las proteínas recombinantes funcionales que se presentan en la célula anfitriona, son de manera preferida cooperativas, es decir que ellas cumplen una función inmunológica o/y biológica común, p.ej. como unas enzimas en una cascada de reacciones de múltiples etapas.

Por lo menos uno, de manera preferida varios, de los polipéptidos recombinantes funcionales se presentan en una forma fijada a un soporte, por ejemplo en forma de unos polipéptidos de fusión y contienen por lo menos un dominio funcional y por lo menos un dominio de soporte. Unas formas preferidas de polipéptidos fijados a un soporte son unas estructuras de capa S (= superficial) (unos polipéptidos de fusión con unos dominios de soporte de capa S), unos polipéptidos fijados a membranas (unos polipéptidos de fusión con unos dominios de soporte que se integran en membranas) o/y unos componentes de estructuras de fagos recombinantes. En el caso de que sea necesaria una exportación de los polipéptidos funcionales desde el citosol a otros compartimentos de la célula, la expresión se efectúa en común con unos apropiados dominios de dirección hacia un objetivo, que hacen posible una exportación al compartimento celular que se desee en cada caso. Unos ejemplos de unos dominios de dirección hacia un objetivo son unas secuencias de péptidos de señal o/y unas secuencias ayudadoras, que hacen posible el paso a través de membranas.

Conforme al invento, por lo menos uno de los polipéptidos fijados a un soporte está presente en forma de una estructura de capa S recombinante. Las capas S son unas proteínas cristalinas bacterianas situadas en la superficie de las células, que están constituidas por unas unidades idénticas, que se ensamblan consigo mismas. Unos datos genéticos y unas informaciones acerca de las secuencias para diferentes genes de capas S procedentes de microorganismos se indican por ejemplo en la cita de Peyret y colaboradores (Mol. Microbiol. 9 (1994), 97-109).

Unos preferidos genes de capas S son los genes sbsA y sbsB de B. stearothermophilus PV72. Las secuencias de estos genes se indican, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 9728263. Allí, se divulga también la producción de una proteína recombinante de fusión de capa S en el citoplasma de células anfitrionas gram negativas. La solicitud de patente internacional WO 9906567 y el documento de Szostak M.P. y colaboradores

(1997), Behring Inst. Mitt. n° 98, 191-196, describen, por su parte, la producción de una proteína de capa S recombinante en diferentes compartimentos de células de bacterias gram negativas. En lo que respecta a la construcción de unos genes de capa S recombinantes y a la producción de unas adecuadas construcciones artificiales de expresión se hace mención expresamente a estas dos citadas solicitudes de patentes internacionales. Allí no se encuentra, sin embargo, ninguna mención acerca de la expresión concomitante (coexpresión) de dos polipéptidos recombinantes funcionales diferentes.

De modo sorprendente se comprobó que es posible realizar una expresión concomitante (Coexpresión) simultánea o/y secuencial de varias proteínas de capa S recombinantes, eventualmente en combinación con otras proteínas heterólogas, p.ej. en diferentes compartimentos de unas células anfitrionas, en particular de células de bacterias gram negativas.

La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína SbsA madura se indica en la SEQ ID No. 1 desde la posición 91 hasta la 3.684. La pertinente secuencia de aminoácidos se representa en la SEQ ID No. 2. La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína SbsB madura se indica en la SEQ ID No. 3 desde la posición 94 hasta la 2.763. La pertinente secuencia de aminoácidos se representa en la SEQ ID No. 4.

En una primera forma de realización preferida (sbsA), el ácido nucleico que codifica el dominio de soporte de un polipéptido funcional, se escoge entre

(i): un ácido nucleico, que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID No. 1 desde la posición 91 hasta la 3.684,

(ii): un ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde al ácido nucleico procedente de (i) dentro del marco de la degeneración del código genético, y

(iii) un ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con los ácidos nucleicos procedentes de (i) o/y (ii).

En una segunda forma de realización preferida (sbsB), el ácido nucleico que codifica el dominio de soporte de un polipéptido funcional, se escoge entre

(i): un ácido nucleico, que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID No. 3 desde la posición 94 hasta la 2.763,

(ii): un ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente al ácido nucleico procedente de (i) dentro del marco de la degeneración del código genético y

(iii) un ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con los ácidos nucleicos procedentes de (i) o/y (i).

Por el concepto de "hibridación en condiciones rigurosas", se entiende en el sentido del presente invento que una hibridación se presenta también después de un lavado a 55°C, de manera preferida a 60°C, en un tampón acuoso con un bajo contenido de sales (p.ej. 0,2 x SSC) (véase también la cita de Sambrook y colaboradores (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual [Clonación molecular. Un manual de laboratorio]).

Como sitios de inserción para unas secuencias que codifican péptidos o polipéptidos en el gen sbsA se prefieren unas regiones situadas entre las posiciones 200 y 3.600 de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID No. 1. Unos sitios de inserción especialmente preferidos son el sitio de corte con NruI en la posición 585, el sitio de corte con PvuII en la posición 881, el sitio de corte con SnaB-I en la posición 920, el sitio de corte con PvuII en la posición 2.507 y el sitio de corte con PvuII en la posición 2.652 (véase el documento WO9728263). Otros preferidos sitios de inserción son las posiciones 562, 1.087, 1.813, 1.947, 2.295, 2.652, 3.046, 3.484 y 3.594. Las posiciones indicadas en cada caso se refieren al primer nucleótido de la inserción.

Como sitios de inserción en el gen sbsB se prefieren unas regiones situadas entre las posiciones 200 y 2.600 de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID No. 3. Unos sitios de inserción especialmente preferidos son las posiciones 410 (el codón 136), 484 (el codón 161/162) y 1.583 (el codón 528/529) (véase el documento WO9728263). Otros preferidos sitios de inserción son las posiciones 598, 1.012, 1.435, 1.808 y 2.301, refiriéndose la posición indicada en cada caso al primer nucleótido de la inserción.

Alternativa o adicionalmente, unos polipéptidos fijados a un soporte se pueden producir también en otra forma, p.ej. como unos componentes de estructuras de fagos recombinantes, p.ej. el ΦX174 o ΦCH1.

Todavía otra posibilidad para la producción de unos polipéptidos fijados a un soporte es la síntesis como unos polipéptidos de fusión con unos dominios de integración en membranas, de tal manera que los polipéptidos funcionales están localizados en unos sitios deseados en cada caso (el lado externo o respectivamente interno de una membrana escogida en cada caso).

En el caso de una integración en la membrana externa de unas células anfitrionas gram negativas procarióticas, como secuencia de soporte se puede utilizar el dominio situado en el extremo terminal de C de la proteasa IgA procedente de Neisseria o Haemophilus (Klauser y colaboradores, J. Mol. Biol. 234 (1993), 579-593). Otras

adecuadas secuencias de dominios de soporte son las secuencias OmpA o LamB o respectivamente unas partes de éstas.

En el caso de una integración en la membrana citoplasmática de unas células anfitrionas procarióticas gram negativas, se utiliza de manera preferida un dominio proteínico hidrófobo, que se integra en una membrana, que no actúa líticamente y que posee una estructura de hélice α. Unos Ejemplos de secuencias de ADN, que codifican un tal dominio proteínico que se integra en una membrana, se describen en el documento de patente europea 0 516

655.

En el caso de una secreción en el periplasma de células procarióticas gram negativas se puede utilizar p.ej. la secuencia del péptido de señal de malE. Otras secuencias, que dan lugar a una secreción en el periplasma, se han descrito, por ejemplo, en las citas bibliográficas de Blondel y Bedouelle (Eur. J. Biochem 193 (1990), 325-330; Adip-Conquy y colaboradores (Protein Eng. 8 (1995), 859-863); Weller y colaboradores (Eur., J. Biochem. 236 (1996), 3439) y Dubreuil y colaboradores (FEMS Immunol. Med. Microbiol. 13 (1996), 317-323).

Para la expresión en la membrana citoplasmática o en unos orgánulos de células eucarióticas, como péptidos de señal se conocen el péptido de tránsito situado en el extremo terminal de N de plastocianina para el transporte en cloroplastos (Weisbeek y colaboradores, J. Cell. Sci. Suppl. 11 (1989), 199-223), unos péptidos de señal mitocóndricos para el transporte en mitocondrios (Skerjanc, Biochem. Cell. Biol. 68 (1990), 9-16), unas secuencias de dirección hacia un objetivo para el transporte en vacuolas (Vitale y Chrispeels, Bioessays 14 (1992), 151-160), unas secuencias de dirección hacia un objetivo para la membrana celular, el citoplasma y el aparato de Golgi (Stanley, Mol. Membr. Biol. 13 (1996), 19-27), unas señales de retención para el retículo endoplasmático (Lencer y colaboradores, J. Cell. Biol. 131 (1995), 951-962) y unas secuencias de transferencia para el aparato de Golgi o para la membrana plasmática (Rambourg y colaboradores, Anat. Rec. 245 (1996), 447-458).

Junto al segmento que codifica el péptido de señal, la secuencia de ADN que codifica el polipéptido ajeno puede contener uno o varios otros segmentos adicionales, que codifican otros dominios de proteínas. Un tal segmento puede estar dispuesto de manera preferida entre el segmento que codifica el péptido de señal y el segmento que codifica el polipéptido ajeno. De manera preferida, este segmento codifica un polipéptido secretorio procedente de bacterias gram negativas o una parte de éste. Un ejemplo preferido de un tal segmento de ácido nucleico es el gen malE, que codifica la proteína que fija la maltosa.

Los polipéptidos ajenos se escogen de manera preferida entre unos epítopos que fijan a un ADN, unos epítopos antigénicos, alergénicos o inmunogénicos, unos epítopos que fijan a metales, estreptavidina, enzimas, citocinas o unas proteínas que fijan a anticuerpos.

Un ejemplo preferido es la estreptavidina, que se adecua p.ej. para el acoplamiento de reaccionantes biotinilados después de una integración en la membrana externa.

Otro ejemplo preferido adicional son unos epítopos antigénicos, alergénicos o inmunogénicos, p.ej. unos epítopos procedentes de microorganismos patógenos, tales como por ejemplo bacterias, hongos, parásitos etc. y virus, o unos epítopos procedentes de plantas o unos epítopos contra sustancias propias del cuerpo, p.ej. citocinas, así como contra toxinas, en particular endotoxinas. Unos ejemplos especialmente preferidos de epítopos inmunogénicos son unos epítopos de virus, p.ej. procedentes de unos herpesvirus (= virus del herpes), tales como el herpesvirus 1, p.ej. la glicoproteína Δ, el herpesvirus 6 o el pseudorabiesvirus (= pseudovirus de la rabia) (Lomniczi y colaboradores, J. Virol. 49 (1984), 970-979), en particular unos epítopos de los genes gB, gC o/y gD, unos epítopos del virus de la glosopeda (FMDV), en particular unos epítopos procedentes de los segmentos de genes, que codifican VP1, VP2 o/y VP3, unos epítopos de flavivirus o unos epítopos de filovirus tales como por ejemplo los virus del Ébola, de Marburg o de Lassa. Los epítopos inmunogénicos se pueden escoger de tal manera que ellos favorezcan la producción de una reacción inmunológica mediada por anticuerpos o/y la producción de una reacción inmunológica celular, p.ej. mediante una estimulación de células T. Unos ejemplos de unos adecuados epítopos alergénicos son unos alérgenos del polen de abedul, p.ej. el Bet v 1 (véase Ebner y colaboradores, J. Immunol. 150 (1993) 1047-1054). Por lo demás se prefieren especialmente unos epítopos antigénicos, que están en la situación de fijar y separar por filtración, a partir de un suero o de otros líquidos corporales, unas sustancias propias del cuerpo o ajenas al cuerpo tales como por ejemplo unas citocinas o toxinas. Tales epítopos pueden ser unos componentes de receptores de citocinas o toxinas o de anticuerpos dirigidos contra citocinas o toxinas.

Unos polipéptidos ajenos modificados, p.ej. unas proteínas de capas S, que tienen unos epítopos inmunogénicos o/y antigénicos con unos sitios de glicosilación, pueden ser producidos en unas células anfitrionas eucarióticas, en las que es posible una glicosilación. En este caso, pueden ser glicosiladas también las secuencias de capas S naturales. Ejemplos de unos sitios potenciales de glicosilación en N en el gen de capa S sbsA son las posiciones de aminoácidos 26, 285, 343, 384, 387, 388, 418, 421, 483, 653, 675, 902, 924, 1.048, 1.058, 1.118, 1.154 y 1.161. En el gen sbsB puede tener lugar una potencial glicosilación en N en las posiciones 155, 184, 213, 302, 303, 400, 463, 606, 755 y 915. Otras posibles modificaciones del gen sbsA comprenden una amidación, una fosforilación mediante una caseína cinasa II, una miristoílación en N y una fosforilación mediante una proteína cinasa C. Otras posibles modificaciones del gen sbsB comprenden una fosforilación por una proteína cinasa dependiente de cAMP y cGMP,

una fosforilación por una caseína cinasa II, una miristoílación en N, una fosforilación mediante una proteína cinasa C y un adosamiento a un receptor de fibronectina (a través de la secuencia RGD).

Asimismo, como polipéptidos ajenos se prefieren unas citocinas, tales como, por ejemplo unas interleucinas, unos interferones o unos factores de necrosis tumoral. Estas moléculas pueden ser utilizadas por ejemplo en combinación con unos epítopos inmunogénicos para la producción de vacunas. Además, también se prefieren unas proteínas que fijan a anticuerpos, de manera preferida la proteína A o la proteína G, o unos epítopos que fijan a ADN o/y metales, tales como por ejemplo los de cremallera de leucina, dedos de zinc, etc.

De manera especialmente preferida, los polipéptidos recombinantes son unas enzimas, en particular unas enzimas que catalizan una reacción enzimática de múltiples etapas. Unos ejemplos específicos de ellas son unas enzimas para la síntesis de poli(hidroxialcanoatos), p.ej. la poli(hidroxiácido butírico) sintasa (Lubitz y Resch, DE 44 171 69 A1; Slater, S.C., Voige W.H., Dennis, A.E. J. Bacteriol. (1988), 170:4431).

Todavía otro objeto del presente invento son unos fantasmas de bacterias (de “bakterienghosts”) recombinantes, que son obtenibles a partir de una célula anfitriona gram negativa conforme al invento con por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales, de los cuales por lo menos uno se presenta en una forma fijada a un soporte como una fusión con un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos de los mismos.

La producción de unos adecuados "fantasmas de bacterias" se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO9201791. Allí se divulgan unas bacterias modificadas, que son obtenibles mediante una transformación de una bacteria gram negativa con el gen de una proteína de membrana que actúa de un modo lítico, procedente de bacteriófagos, con el gen de una proteína de liberación de toxinas, que actúa de un modo lítico, o con unos genes, que contienen unas secuencias parciales de éstos, y que codifican unas proteínas líticas, mediante una cultivación de la bacteria, una expresión de este gen de lisis y un aislamiento del resultante fantasma de bacteria a partir del medio de cultivo.

A la membrana de estas bacterias, tal como se ha descrito en la patente europea 0 516 655, puede estar fijada una proteína recombinante, que es obtenible mediante expresión de un ADN recombinante en estas bacterias gram negativas. Este ADN recombinante comprende una primera secuencia de ADN, que codifica un dominio proteínico hidrófobo, que se integra en una membrana, que no actúa de un modo lítico, el cual posee una estructura de hélice α y se compone de 14-20 aminoácidos, que pueden estar flanqueados en los extremos terminales de N y C en cada caso por 2-30 aminoácidos arbitrarios. En unión operativa con esta primera secuencia de ADN se encuentra una segunda secuencia de ADN, que codifica una deseada proteína recombinante. Por lo demás, la bacteria gram negativa contiene una tercera secuencia de ADN, que está bajo un control separado de las primera y segunda secuencias de ADN, y que codifica una proteína de membrana, que actúa de un modo lítico, procedente de bacteriófagos o una proteína de liberación de toxinas, que actúa de un modo lítico, o que codifica sus partes que actúan de un modo lítico. Mediante una expresión y una lisis de tales bacterias gram negativas recombinantes se obtienen unos denominados "fantasmas de bacterias", que contienen una estructura superficial intacta con unos epítopos inmunogénicos unidos a la superficie.

La producción de las células anfitrionas conformes al invento se efectúa de manera preferida mediante un procedimiento, realizándose que

(a): se pone a disposición una célula anfitriona de bacterias gram negativas, que ha sido transformada con por lo menos dos ácidos nucleicos, que codifican diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales, estando unido por lo menos uno de los ácidos nucleicos con una secuencia, que codifica un polipéptido que tiene una estructura de capa S, con el fin de hacer posible una expresión del polipéptido recombinante heterólogo en una forma fijada a un soporte, como una fusión con un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos celulares de éstos,

(b): se cultiva la célula anfitriona en unas condiciones tales que dan lugar a una expresión de los ácidos nucleicos y a una producción de los polipéptidos codificados por éstos en una forma funcional.

Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos recombinantes están unidos operativamente con unas secuencias, que se ocupan de una localización de los polipéptidos recombinantes en cada caso en diferentes compartimentos de la célula anfitriona.

En el caso de una expresión de las proteínas recombinantes en una forma fijada a un soporte como una capa S modificada se pueden expresar en la célula también unos genes que codifican una proteína de capa S no modificada. En este caso, las proteínas de capa S modificadas pueden formar una estructura de capa S que es compatible con las proteínas de capa S no modificadas. Un ejemplo de esta forma de realización del procedimiento conforme al invento es una célula de E. coli, que ha sido transformada con cuatro genes de capa S, de los cuales dos son unos genes sbsA o sbsB naturales y los otros dos son unos genes sbsA o sbsB recombinantes.

Los ácidos nucleicos que codifican unos polipéptidos recombinantes se encuentran localizados de manera preferida en unos vectores recombinantes, que contienen por lo menos una copia del ácido nucleico. Como vectores se pueden emplear unos usuales vectores procarióticos o eucarióticos, cromosómicos o extracromosómicos. Unos ejemplos de tales vectores se han descrito en la cita de Sambrook y colaboradores, véase más arriba. Los vectores contienen los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos recombinantes en una unión operativa con una secuencia de control de la expresión, que es activa en la respectiva célula anfitriona. De manera especialmente preferida, la secuencia de control de la expresión comprende un promotor regulable. Unos ejemplos de apropiados promotores eucarióticos son los promotores de SV40, de CMV o de la metalotioneína. Para la expresión de los ácidos nucleicos que codifican por lo menos dos polipéptidos heterólogos se utilizan de manera preferida dos diferentes promotores regulables, p.ej. dos diferentes promotores λ sensibles a la temperatura, tales como los que ya se han descrito.

Las células anfitrionas recombinantes (unas células anfitrionas vivas o unos fantasmas) son apropiadas para un gran número de usos. Se prefiere una utilización como una vacuna o un adyuvante, utilizándose en este caso unos polipéptidos recombinantes que comprenden unos epítopos inmunógénicos de polipéptidos patógenos y/o inmunoestimuladores que son propios del cuerpo, tales como por ejemplo unas citocinas.

Se prefiere especialmente la utilización de las células anfitrionas conformes al invento o/y de unos fantasmas de bacterias como un reactor enzimático.

Además, el presente invento es ilustrado por los siguientes Ejemplos y Figuras: Allí muestran:

La SEQ ID NO. 1 la secuencia de nucleótidos completa del segmento codificador del gen de capa S sbsA de

B.stearothermophilus; la SEQ ID NO. 2 la secuencia de aminoácidos que se deriva de ésta; la SEQ ID NO. 3 la secuencia de nucleótidos completa del segmento codificador del gen de capa S sbsB de

B.stearothermophilus la SEQ ID NO. 4 la secuencia de aminoácidos que se deriva de ésta;

la Fig.1 una representación esquemática acerca de las posibilidades para la localización de unos polipéptidos heterólogos en diferentes compartimentos de una célula de bacterias gram negativas.

(a): Una célula de una bacteria gram negativa está constituida a base del citoplasma (cy), de la membrana interna (im), del periplasma (pp) y de la membrana externa (om).

(b): Unos polipéptidos heterólogos se pueden exportar al periplasma mediante una unión con unas adecuadas secuencias de dirección hacia un objetivo (pe).

(c): Por el lado interno de la membrana interna se pueden anclar unos polipéptidos heterólogos (mae).

(d): En el periplasma se pueden inmovilizar unos polipéptidos heterólogos en forma de unas capa S recombinantes (sie).

(e): No sólo una, sino también varias especies de polipéptidos heterólogos recombinantes se pueden inmovilizar en el periplasma en forma de una capa S.

La Fig.2 la representación esquemática de una célula de una bacteria recombinante conforme al invento, que contiene diferentes polipéptidos heterólogos (p.ej. enzimas) en diferentes compartimentos.

Ejemplos:

1.: Cepas de bacterias, medios y plásmidos

Unas bacterias gram positivas de la cepa Bacillus stearothermophilus PV72 se cultivaron a 58°C en un medio SVIII (Bartelmus y Perschak, Z.Zuckerind. 7 (1957), 276-281). Unas bacterias E.coli se cultivaron en un medio LB (Sambrook y colaboradores, (1989), véase más arriba). Para la selección de transformantes se añadió ampicilina en una concentración final de 100 µg/ml al medio. El plásmido pPLcAT10 (λpL, bla, colE1) (Stanssens y colaboradores, Gene 36 (1985), 211-223) se utilizó como un vector de clonación.

2.: Manipulación de unos fragmentos de ADN

El análisis por restricción de un ADN, la electroforesis en un gel de agarosa y la clonación de los fragmentos de ADN se llevaron a cabo según los métodos clásicos que se han descrito en la cita de Sambrook y colaboradores (1989), véase más arriba.

La transformación de unas células competentes se efectuó mediante una electroporación mediando utilización de un Genepulser Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif., EE.UU.) según los protocolos del fabricante.

El ADN plasmídico se aisló según el método de Birnboim y Doly (Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523). El ADN cromosómico se aíslo según el procedimiento que se describió en la cita de Ausubel y colaboradores (Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos Actuales en la Biología Molecular] (1987), Nueva York, John Wiley).

Las endonucleasas de restricción y otras enzimas se obtuvieron de la entidad Boehringer Mannheim, New England Biolabs, o de la entidad Stratagene, y se emplearon según las prescripciones del fabricante.

5 3. Secuenciación del ADN

El análisis de la secuencia de las moléculas de ADN se efectuó según el método de interrupción de la cadena con didesoxi de Sanger y colaboradores. Los cebadores utilizados para la secuenciación del gen sbsA se construyeron sobre la base de la secuencia ya publicada de sbsA (Kuen y colaboradores, Gene 145 (1994), 115-120).

4. Amplificación del sbsA con ayuda de una PCR

La amplificación del gen sbsA con ayuda de una PCR (= reacción en cadena de la polimerasa) se efectuó de acuerdo con el Ejemplo 4 del documento WO 9906567. Los productos amplificados por una PCR se separaron por

15 electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 % y, mediando utilización del sistema Gene Clean (BIO101 La Jolla, Calif., EE.UU), se purificaron para la clonación.

5. Clonación del gen sbsA

20 5.1. Vector de expresión citoplasmático

El gen sbsA obtenido mediante una PCR, con una longitud de 3,79 kb, se purificó y se disoció con las endonucleasas de restricción XbaI y BamHI. El resultante fragmento de XbaI y BamHI se clonó en los correspondientes sitios de corte por restricción del vector pPLcAT10, de tal manera que el gen sbsA se encontraba

25 bajo el control transcripcional del promotor pL situado corriente arriba. El codón de inicio ATG de la secuencia sbsA se reconstruyó mediante el proceso de clonación. La secuencia clonada de sbsA contenía la secuencia de señal terminal de N de sbsA y finalizaba en 20 nt (nucleótidos) detrás del terminador de la transcripción. El vector resultante se designó como pBK4.

30 5.2. Vector de expresión periplasmático

El gen sbsA se clonó sin ninguna secuencia de señal y con el codón de interrupción junto al extremo terminal 3' en el poliengarzador del plásmido pMAL-P2 obtenible comercialmente (de New England Biolabs). El resultante plásmido pMAL-A contiene bajo el control del promotor tac un gen de fusión, que comprende el gen malE inclusive su

35 secuencia de señal así como el gen sbsA sin la secuencia de señal de éste. Entre los dos dominios está situado un sitio de disociación para el factor Xa.

6. Expresión concomitante recombinante del gen sbsA en el citoplasma y el periplasma de E. coli

40 Unas células de E. coli K12 transformadas concomitantemente con pBK4 y pMAL-A se cultivaron a 28°C hasta la consecución de una densidad óptica OD600 de 0,3. Luego se indujo la expresión citoplasmática de sbsA mediante un aumento de la temperatura de cultivación desde 28°C hasta 42°C. La expresión periplasmática de sbsA se indujo mediante la adición de 1 mM del inductor de lac IPTG. 1,5 ml de una parte alícuota se extrajeron antes, o respectivamente 1, 2, 3 y 5 horas después, de la inducción de la expresión de sbsA. Como testigos se utilizaron las

45 cepas E.coli pop2135/pbPLcAT10 (cultivadas en las mismas condiciones) y B.stearothermophilus PV72.

Los materiales sobrenadantes del cultivo y los extractos celulares procedentes de todas las muestras se investigaron en cuanto a la expresión de la proteína de capa S mediante una SDS-PAGE y un borrón de transferencia inmunitaria Western.

50 Para el borrón de transferencia Western, las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con un antisuero policlonal dirigido contra la SbsA procedente de un conejo. La producción de este antisuero se ha descrito en la cita de Egelseer y colaboradores (J.Bacteriol.177 (1995), 1444-1451). Para la detección de unos anticuerpos fijados, específicos para la SbsA, se utilizó un conjugado a base de una IgG

55 anticonejo de cabra y de una fosfatasa alcalina.

En unos extractos citoplasmáticos procedentes de las células E.coli transformadas concomitantemente se encontró una fuerte banda adicional de una proteína que tenía aproximadamente el mismo peso molecular que la proteína SbsA de tipo silvestre.

60 Un análisis del extracto en bruto de unas células E.coli DH5α transformadas con pMAL-A (Hanahan (1983), véase más arriba) mostró la expresión de un polipéptido de fusión de MalE y SbsA con un peso molecular de aproximadamente 170 kDA en la fracción periplasmática del extracto de células, que se había producido mediante un proceso de choque osmótico en frío (Neu y Heppel, J. Biol. Chem. 240 (1965); 3685-3692).

7. Expresión concomitante de la proteína SbsB en el citoplasma y el periplasma

El gen sbsB se clonó -tal como se ha descrito en los Ejemplos 5 y 6 -en los plásmidos pMAL-P2 y pPLcAT10, obteniéndose los plásmidos pMAL-B y pBK6.

En unas células de E.coli transformadas con los plásmidos pMAL-B y pBK6 se pudo detectar la presencia de la proteína SbsB en el citoplasma y en el periplasma.

8. Sintasa de PHB inmovilizada en la membrana citoplasmática de E.coli

Los poli(hidroxialcanoatos) (PHA) son unas sustancias almacenadoras bacterianas, que se forman en un productor natural en el caso de una limitación de fósforo, azufre u oxígeno, pero con una fuente de C presente en cantidad suficiente. Ellos se componen de unos monómeros esterificados de hidroxiácidos grasos y forman unos polímeros insolubles en agua, que son diferenciados según sea la posición del grupo hidroxilo y la longitud de las cadenas laterales. El PHA más prominente es el poli((R)-3-hidroxibutirato) (P(3-HB)), un homopolímero sin ramificar del ácido (R)-3-hidroxi-butírico (P3-HB)).

En la bacteria de gas detonante gram negativa Ralstonia eutropha, facultativamente quimiolitotrofa, los genes phbA, phbB y phbC que son responsables de la síntesis de PHB están organizados en un operón (phbCAB) (Schubert y colaboradores, J. Bacteriol. (1988), 170:5837). Las secuencias de nucleótidos del marco abierto de lectura así como las regiones de traducción de estos genes fueron publicadas (Steinbüchel, A. Polyhydroxy alcanoic acids (Poli(ácidos hidroxi alcanoicos), en: Biomaterials (1991), 123-213).

Dentro del marco de la investigación acerca de la relación entre la estructura y la función de la PHB sintasa se produjeron diferentes mutantes de inserción y supresión (deleción) así como unas proteínas de fusión y se determinaron unas modificaciones en la actividad enzimática (Kalousek, tesis doctoral S., Universidad de Viena (1993)). De este trabajo procede el plásmido pPHB-L, que contiene un gen que codifica una proteína de fusión a base de la P(3-HB) sintasa (588 aminoácidos de 590) y un anclaje a membrana a base de la secuencia C-terminal de la proteína de lisis del fago MS2. Unas células, que crecen en el medio sólido + 1% de glucosa, acumulan, en el caso de la expresión de pPHB-L, hasta 60 % (p/p) de gránulos de P(3-HB).

La PHB sintasa anclada a una membrana es por lo tanto plenamente capaz de funcionar enzimáticamente.

9. Expresión recombinante de la (ácido 2,5-diceto-D-glucónico) reductasa de un plásmido en bacterias; e inmovilización de la misma en capa S bacterianas

Mediante una expresión de un plásmido recombinante en una cepa de bacteria, ésta debería adquirir la capacidad de producir directamente el 2-KLG a partir de la D-glucosa en una única etapa (fermentación simple = “single fermentation” en inglés). Para esto, en una cepa que produce ácido 2,5-diceto-D-glucónico (2,5-DKG) se clonó una enzima (la 2,5-DKG reductasa de Corynebacterium sp. ATTC. 31090), que es necesaria para la reducción para dar el 2-KLG.

Mediante una utilización del vector pSL, que codifica un gen de capa superficial (sbsA), se aumentó la estabilidad en almacenamiento de la 2,5-DKG reductasa. La proteína de capa S (SbsA) sirvió en este caso como una matriz para la 2,5-DKG reductasa. Mediante la inserción de la 2,5-DKG reductasa en 4 sitios diferentes dentro del gen sbsA se encontró una proteína recombinante con la capacidad de formar unos productos autoensamblables (self-assembly products en inglés).

Con este fin se produjeron unos genes de fusión de sbsA y 2,5-dkg reductasa, que llevan el gen de la 2,5-dkg reductasa en cuatro posiciones diferentes del gen sbsA (las posiciones 581, 881, 916 y 2.649). Como célula anfitriona sirvió la E.coli pop2135. La clonación correcta se comprobó mediante unos análisis por secuenciación del gen insertado y de las regiones limítrofes. La expresión estable de las proteínas de fusión se pudo mostrar mediante una SDS-PAGE y unos análisis por transferencia de borrón Western. Después de una expresión exitosa en E.coli, los plásmidos fueron transformados en el seno de Pectobacterium cypripedii HaPO1.

Mediante una SDS-PAGE y un borrón de transferencia Western se pudo comprobar también en P.cypripedii HaP01 una expresión estable de la proteína de fusión SbsA-2,5-DKG reductasa.

10. Otras enzimas inmovilizadas en capa S

Con el gen sbsA se fusionaron también la enzima luciferasa (los genes luxA y luxB) y la proteína fluorescente verde (gfp, acrónimo del inglés "green fluorescent protein"), con el fin de producir de esta manera luz o respectivamente una fluorescencia.

PROTOCOLO DE SECUENCIAS:

(1) DATOS GENERALES:

5 (i) Solicitante:

(A): NOMBRE: Werner Lubitz

(B): CALLE: Schoenborngasse 12/7

(C): LUGAR: Viena

(E): PAÍS: Austria 10 (F) CÓDIGO POSTAL: 1080

(ii) DENOMINACIÓN DEL INVENTO Secreción de proteínas de capa S en el periplasma y en el espacio extracelular

(iii) NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 6

(iv): VERSIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR: 15 (A) SOPORTE DE DATOS: disquete

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D): SOFTWARE: Patentin versión ñ1.0, versión 1.30 (EPA)

20 (2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 1:

(i) DATOS CARACTERÍSTICOS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 3687 pares de bases

(B): TIPO: nucleótido 25 (C) Forma de la cadena: ambas

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(vi) PROCEDENCIA ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: Bacillus stearothermophilus 30 (B) CEPA: PV72

(vii) PROCEDENCIA INMEDIATA:

(B) CLON(E): sbsA

35 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

(B): POSICIÓN: 1..3684

(ix): CARACTERÍSTICA: 40 (A) NOMBRE/CLAVE: sig_peptide

(B) POSICIÓN: 1..90

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_peptide45 (B) POSICIÓN: 91..3684

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 2:

5 (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1228 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

10 (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 3:

5 (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 2766 pares de bases

(B): TIPO: nucleótido

(C): FORMA DE LA CADENA: ambas

(D) TOPOLOGÍA: lineal 10

(vi) PROCEDENCIA ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: Bacillus stearothermophilus

(B): CEPA: PV72

15 (vii) PROCEDENCIA INMEDIATA:

(B) CLON(E): sbsB

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS20 (B) POSICIÓN: 1..2.763

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: sig_peptide

(B): POSICIÓN: 1..93 25

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

(B): POSICIÓN: 94..2.763

30 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 4:

(i): CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 921 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína 10

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Célula anfitriona que comprende por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales, de los cuales por lo menos uno se presenta en una forma fijada a un soporte como una fusión con un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos de ésta, siendo la célula anfitriona una célula de bacteria gram negativa.
2.

Célula de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que los compartimentos se escogen entre el citosol, los lados externo e interno de la membrana citoplasmática, el espacio periplasmático y los lados externo e interno de la membrana externa.
3.

Célula de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizada por que varios de los polipéptidos recombinantes están presentes en una forma fijada a un soporte.
4.

Célula de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizada por que están presentes otros polipéptidos fijados a un soporte en forma de estructuras de capa S, como unos polipéptidos fijados a membranas o/y como unos componentes de estructuras de fagos recombinantes.
5.

Célula anfitriona de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizada por que los polipéptidos recombinantes se escogen entre enzimas, citocinas, proteínas que fijan anticuerpos, epítopos que fijan ADN, epítopos antigénicos, alergénicos e inmunogénicos, y estreptavidina.
6.

Célula de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizada por que los polipéptidos recombinantes son unas enzimas.
7.

Célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada por que las enzimas catalizan una reacción enzimática de varias etapas.
8.

Célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, caracterizada por que las enzimas catalizan la síntesis de unos poli(hidroxialcanoatos).
9.

Célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 1, realizándose que los por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales cumplen una función inmunológica y/o biológica común.
10.

Fantasma de bacteria recombinante, que es obtenible a partir de una célula gram negativa, que comprende por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales, de los cuales por lo menos uno se presenta en una forma fijada a un soporte como una fusión con un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos de ésta.
11.

Fantasma de bacteria recombinante de acuerdo con la reivindicación 10, realizándose que los por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales cumplen una función inmunológica y/o biológica común.
12.

Procedimiento para la producción de una célula anfitriona de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes 1 hasta 9, caracterizado por que

(a)

se pone a disposición una célula anfitriona, que ha sido transformada con por lo menos dos ácidos nucleicos que codifican por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales, estando unido por lo menos uno de los ácidos nucleicos con una secuencia, que codifica un polipéptido que tiene una estructura de capa S, con el fin de hacer posible una expresión del polipéptido recombinante heterólogo en una forma fijada a un soporte, como una fusión con un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos celulares de ésta, realizándose que la célula anfitriona es una célula de bacteria gram negativa.

(b)

la célula anfitriona se cultiva en unas condiciones tales que dan lugar a una expresión de los ácidos nucleicos y a una producción de los polipéptidos codificados por éstos en una forma funcional.
13.

Utilización de una célula de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 9 o de un fantasma de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 para la producción de una vacuna o un adyuvante.
14.

Utilización de una célula anfitriona de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 9 o de un fantasma de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 como un reactor enzimático.

FIG.1

Bacteria enzimas exportadas al espacio periplasmático (pe) enzimas ancladas a una membrana (mae) enzimas inmovilizadas en una capa S (sie)

enzimas inmovilizadas en una capa S (sie)

FIG. 2 Bacterias recombinantes con capa S recombinantes

Bacteria

enzimas exportadas al espacio periplasmático enzimas ancladas a una membrana enzimas recombinantes basadas en una capa S