ES2525769A1 - Method of obtaining a structure of polymer of molecular imprint (mip) (Machine-translation by Google Translate, not legally binding) - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a new method for the realization of mip patterns on a micrometric and sub-micrometric scale by direct writing by electron beam. The mip precursor mixture contains compounds sensitive to electron irradiation and is deposited as a film on a substrate. The areas of the film irradiated with an electron beam are removed with a chemical or developer solvent. The resulting film contains the desired patterns and is polymerized using light and/or heat. The pattern synthesis method of mips of the invention allows the realization of arrays of numerous mip-based sensors on a substrate or chip of small dimensions for the simultaneous detection of multiple (bio) chemical compounds, in addition to several other applications. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Description

DESCRIPCIÓN DESCRIPTION

MÉTODO DE OBTENCIÓN DE UNA ESTRUCTURA DE POLÍMERO DE IMPRONTA MOLECULAR (MIP) METHOD OF OBTAINING A MOLECULAR PRINT POLYMER STRUCTURE (MIP)

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Campo de la invención Field of the Invention

La presente invención pertenece al campo de la fabricación o síntesis de estructuras para detección molecular. En concreto, en la producción de microsensores químicos basados en patrones de polímeros de impronta molecular (MIPs) sobre substratos, en la fabricación de chips para detección de analitos con aplicación en química analítica y 10 medicina. The present invention belongs to the field of manufacturing or synthesis of structures for molecular detection. Specifically, in the production of chemical microsensors based on patterns of molecular imprint polymers (MIPs) on substrates, in the manufacture of chips for analyte detection with application in analytical chemistry and medicine.

Antecedentes de la invención Background of the invention

La tendencia de la técnica en el desarrollo de dispositivos sensores químicos es su miniaturización a escala micrométrica o sub-micrométrica. La utilización de 15 componentes minitaurizados presenta numerosas ventajas, entre otras que el volumen de analito puede ser reducido, el consumo de energía para su funcionamiento también es menor, se reducen los costes de producción y diversifican las aplicaciones. The tendency of the technique in the development of chemical sensing devices is their miniaturization on a micrometric or sub-micrometric scale. The use of 15 miniturized components has numerous advantages, among others that the analyte volume can be reduced, the energy consumption for its operation is also lower, production costs are reduced and applications are diversified.

La técnica ha desarrollado transductores ópticos, eléctricos y mecánicos basados en 20 los materiales tradicionales de la industria microelectrónica, que son los semiconductores y dieléctricos inorgánicos, metales y resinas poliméricas. Sin embargo, dotar a estos transductores de una función sensora tal como el reconocimiento molecular para identificar analitos de origen químico o biológico requiere la incorporación de materiales sensores o funcionales “blandos”. Los 25 materiales blandos son materiales orgánicos amorfos de alta viscosidad que normalmente no son compatibles con las técnicas de fabricación utilizadas en la industria de semiconductores. The technique has developed optical, electrical and mechanical transducers based on the traditional materials of the microelectronic industry, which are inorganic semiconductors and dielectrics, metals and polymeric resins. However, providing these transducers with a sensor function such as molecular recognition to identify analytes of chemical or biological origin requires the incorporation of "soft" sensor or functional materials. The soft materials are high viscosity amorphous organic materials that are not normally compatible with the manufacturing techniques used in the semiconductor industry.

Los biosensores integran biomoléculas como elementos de reconocimiento tales como 30 enzimas, anticuerpos o ADN, con frecuencia inestables cuando se sacan de su ambiente natural. Suelen requerir conservación a bajas temperaturas y pueden no resistir ciertas condiciones de operación y almacenamiento, lo cual limita su utilidad especialmente en sistemas portátiles. Biosensors integrate biomolecules as recognition elements such as enzymes, antibodies or DNA, often unstable when removed from their natural environment. They usually require conservation at low temperatures and may not withstand certain operating and storage conditions, which limits their usefulness especially in portable systems.

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Una estrategia alternativa es la integración en el sensor de receptores sintéticos biomiméticos, tales como los polímeros de impronta molecular o MIPs (“Molecularly Imprinted Polymers”) (K. Haupt, “Creating a good impression”, Nat. Biotech. 2002, 20, 884). An alternative strategy is the integration into the sensor of biomimetic synthetic receptors, such as molecular imprint polymers or MIPs ("Molecularly Imprinted Polymers") (K. Haupt, "Creating a good impression", Nat. Biotech. 2002, 20, 884).

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Los MIPs son materiales sintéticos que se utilizan como elementos de reconocimiento molecular. La patente EP 1237936 B1 describe un procedimiento general para la obtención de MIPs basado en la formación de una estructura macromolecular entrecruzada alrededor de una molécula que actúa como plantilla molecular o molde y que se extrae tras la polimerización. Cuando los MIPs son estructurados a escala sub-10 micrométrica aumenta su sensibilidad en el reconocimiento de moléculas debido a que presentan una mayor superficie de detección. MIPs are synthetic materials that are used as molecular recognition elements. EP 1237936 B1 describes a general procedure for obtaining MIPs based on the formation of a cross-linked macromolecular structure around a molecule that acts as a molecular template or template and is extracted after polymerization. When MIPs are structured at a sub-10 micrometric scale, their sensitivity in the recognition of molecules increases because they have a greater detection surface.

Entre las ventajas que aporta el empleo de MIPs frente a los biomoléculas, por ejemplo anticuerpos, ácidos nucleicos, enzimas, etc., constan su capacidad de trabajar 15 en condiciones extremas de pH, temperatura y en presencia de disolventes orgánicos, sin perder por ello su estructura o afinidad por el analito. Among the advantages of the use of MIPs against biomolecules, for example antibodies, nucleic acids, enzymes, etc., are their ability to work in extreme conditions of pH, temperature and in the presence of organic solvents, without losing its structure or affinity for the analyte.

La mayoría de MIPs se preparan en la técnica a partir de mezclas precursoras de monómeros. Las mezclas precursoras que utilizan oligómeros o polímeros se 20 desarrollan para usos y analitos muy específicos. Li describe la preparación de una mezcla precursora de MIPs para teofilina que comprende polímeros de composición muy parecida a las de la presente invención, también con presencia de dobles enlaces en cadenas laterales de dichos polímeros (Li et al. “Synthesis and Characterization of Functional Methacrylate Copolymers and their Application in Molecular Imprinting”, 25 Macromolecules 2005, 38, 2620-2625). La publicación especula con la posibilidad de utilizar estos MIPs como biosensores, aunque no dice ni sugiere ningún procedimiento para realizarlo, y por tanto el experto en la técnica no encontraría obvio llegar a la presente invención a partir de las enseñanzas de esta publicación. Most MIPs are prepared in the art from monomer precursor mixtures. Precursor mixtures using oligomers or polymers are developed for very specific uses and analytes. Li describes the preparation of a precursor mixture of MIPs for theophylline comprising polymers of composition very similar to those of the present invention, also with the presence of double bonds in side chains of said polymers (Li et al. "Synthesis and Characterization of Functional Methacrylate Copolymers and their Application in Molecular Imprinting ”, 25 Macromolecules 2005, 38, 2620-2625). The publication speculates on the possibility of using these IPMs as biosensors, although it does not say or suggest any procedure to perform it, and therefore the person skilled in the art would not find it obvious to arrive at the present invention from the teachings of this publication.

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El desarrollo de biochips basados en MIPs se realiza por estampación sobre un substrato, normalmente una oblea. En la técnica actual esto se ha conseguido realizar a escala micrométrica utilizando distintos métodos, que se pueden clasificar en técnicas de “contacto” y “sin contacto”. The development of biochips based on MIPs is done by stamping on a substrate, usually a wafer. In the current technique this has been achieved on a micrometric scale using different methods, which can be classified into "contact" and "contactless" techniques.

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Entre las técnicas de contacto se encuentran el depósito con una micropunta (F. Vandevelde y col. “Direct patterning of molecularly imprinted microdot arrays for sensors and biochips”, Langmuir 2007, 23, 6490), la litografía “blanda” (M. Yan y col. “Fabrication of molecularly imprinted polymer microstructures”, Anal. Chim. Acta 2001, 435, 163) y, recientemente, la fotolitografía de contacto por radiación UV (λ = 365 nm) 5 (S. Guillón y col. “Single step patterning of molecularly imprinted polymers for large scale fabrication of microbiochips”, Lab Chip 2009, 9, 2987). Los métodos de contacto presentan el inconveniente de la incompatibilidad química de las superficies que interaccionan. Por ejemplo, en litografía blanda un sello de polidimetil siloxano (PDMS) se pone en contacto con la solución precursora del MIP para formar el patrón definido 10 por el sello; sin embargo el PDMS es incompatible con los disolventes más habituales empleados en la síntesis de MIPs, y degrada la calidad del material. La reciente demostración realizada por Guillón del uso de fotolitografía para estampar MIPs a escala de oblea con resolución micrométrica es un avance significativo hacia la fabricación en paralelo de biochips basados en MIPs; no obstante, estos autores 15 utilizaron el método fotolitográfico de contacto, es decir, que la máscara contacta la película de material polimérico con el consecuente problema de la calidad final del material. Among the contact techniques are the deposit with a micropunta (F. Vandevelde et al. "Direct patterning of molecularly imprinted microdot arrays for sensors and biochips", Langmuir 2007, 23, 6490), "soft" lithography (M. Yan et al. "Fabrication of molecularly imprinted polymer microstructures", Anal. Chim. Acta 2001, 435, 163) and, recently, UV radiation contact photolithography (λ = 365 nm) 5 (S. Guillón et al. "Single step patterning of molecularly imprinted polymers for large scale fabrication of microbiochips ”, Lab Chip 2009, 9, 2987). The contact methods have the disadvantage of the chemical incompatibility of the interacting surfaces. For example, in soft lithography a polydimethyl siloxane (PDMS) seal is contacted with the MIP precursor solution to form the pattern defined by the seal; However, PDMS is incompatible with the most common solvents used in the synthesis of MIPs, and degrades the quality of the material. Guillón's recent demonstration of the use of photolithography to stamp MIPs on a wafer scale with micrometric resolution is a significant step towards parallel manufacturing of biochips based on MIPs; however, these authors 15 used the contact photolithographic method, that is, that the mask contacts the polymeric material film with the consequent problem of the final quality of the material.

Los métodos sin contacto evitan este inconveniente. Sin embargo, el número de 20 estrategias de polimerización sin contacto aplicadas a MIP y probadas en la técnica se reduce a dos. Contactless methods avoid this inconvenience. However, the number of 20 contactless polymerization strategies applied to MIP and proven in the art is reduced to two.

La primera requiere el empleo de un haz de radiación electromagnética focalizado para polimerizar el material por un mecanismo fotoquímico o térmico. Se han 25 reportado dos realizaciones de esta aproximación: La micro-estereo-litografía por haz láser de λ=364 nm conseguió realizar estructuras MIP del orden de decenas de micras (P.G. Conrad II, y col. “Functional molecularly imprinted polymer microstructures fabricated using microstereolithography”, Advanced Materials 2003, 15, 1541); La segunda realización emplea un haz láser de CO2 de 750 mW que permite incrementar 30 la temperatura local hasta 70oC empleando 35 pulsos consecutivos de 5 ms, para obtener microarrays de puntos de 300 m de diámetro (O.Y.F. Henry, y col. “Fabrication of molecularly imprinted polymer microarray on a chip by mid-infrared laser pulse initiated polymerisation”, Biosensors and Bioelectronics, 2008, 23, 1769). The first requires the use of a focused electromagnetic radiation beam to polymerize the material by a photochemical or thermal mechanism. Two embodiments of this approach have been reported: Laser beam micro-stereo lithography of λ = 364 nm managed to perform MIP structures of the order of tens of microns (PG Conrad II, et al. “Functional molecularly imprinted polymer microstructures fabricated using microstereolithography ”, Advanced Materials 2003, 15, 1541); The second embodiment uses a 750 mW CO2 laser beam that allows the local temperature to be increased up to 70 ° C by using 35 consecutive pulses of 5 ms, to obtain microarrays of points of 300 m in diameter (OYF Henry, et al. “Fabrication of molecularly imprinted polymer microarray on a chip by mid-infrared laser pulse initiated polymerization ”, Biosensors and Bioelectronics, 2008, 23, 1769).

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La segunda estrategia emplea foto-máscaras para la polimerización de las zonas de interés. Esta aproximación se ha aplicado para la fabricación arrays de -puntos de MIP selectivos a fluoresceína de 70-90 m de diámetro (A.V. Linares y Col. “Patterning Nanostructured, Synthetic, Polymeric Receptors by Simultaneous Projection Photolithography, Nanomolding, and Molecular Imprinting” Small, 2011, 7, 2318). La 5 máscara se proyecta a través de un objetivo 10x sobre la solución precursora del MIP depositada sobre un portaobjetos de microscopio para su polimerización con una lámpara de mercurio. Alternativamente, empleando moldes de alúmina nanoporosa funcionalizados con fluoresceína o mioglobina, se han preparado puntos de aprox. 90 m de diámetro formados por nanofilamentos improntados superficialmente con la 10 molécula plantilla de interés, dispuestos paralelamente con un diámetro individual de 150 nm y 4 m de longitud. The second strategy uses photo-masks for the polymerization of the areas of interest. This approach has been applied for the manufacture of -point arrays of fluorescein-selective MIPs of 70-90 m in diameter (AV Linares and Col. “Patterning Nanostructured, Synthetic, Polymeric Receptors by Simultaneous Projection Photolithography, Nanomolding, and Molecular Imprinting ”Small, 2011, 7, 2318). The mask is projected through a 10x objective onto the precursor solution of the MIP deposited on a microscope slide for polymerization with a mercury lamp. Alternatively, using nanoporous alumina molds functionalized with fluorescein or myoglobin, points of approx. 90 m in diameter formed by superficially imprinted nanofilaments with the 10 template molecule of interest, arranged in parallel with an individual diameter of 150 nm and 4 m in length.

En una aproximación parecida, Byrne ha preparado geles improntados microestructurado, improntados con D-glucosa, con un espesor de 13 m y distintas 15 configuraciones geométricas (Byrne y col. “Microfabrication of intelligent biomimetic networks for recognition of D-glucose” Chem. Mater. 2006, 18, 5869). In a similar approach, Byrne has prepared microstructured imprinted gels, imprinted with D-glucose, with a thickness of 13 m and 15 different geometric configurations (Byrne et al. “Microfabrication of intelligent biomimetic networks for recognition of D-glucose” Chem. Mater 2006, 18, 5869).

Tanto las técnicas de contacto como sin contacto de biochips basados en MIPs presentan resoluciones espaciales superiores a la micra. Sin embargo las estructuras 20 sensoras necesitan reducirse por debajo de la micra para incrementar significativamente su sensibilidad. Esto se ha logrado gracias a la posibilidad de crear fenómenos de confinamiento óptico, eléctrico o magnético en regiones sub-micrométricas, lo que consigue una mayor interacción entre el analito y la señal utilizada para su detección. Además, el empleo de estructuras sub-micrométricas 25 permite reducir considerablemente tanto el volumen de muestra como la energía que precisa el sensor. Both contact and non-contact techniques of MIP-based biochips have spatial resolutions greater than micron. However, the sensor structures need to be reduced below the micron to significantly increase their sensitivity. This has been achieved thanks to the possibility of creating optical, electrical or magnetic confinement phenomena in sub-micrometric regions, which achieves greater interaction between the analyte and the signal used for its detection. In addition, the use of sub-micrometric structures 25 allows to reduce considerably both the sample volume and the energy required by the sensor.

Las ventajas más significativas de los sistemas de escritura por haz de electrones para la micro- y nano-fabricación son primero que no se precisa de máscara, eliminando así 30 los costes de amortización de las tradicionales máscaras de litografía y acelerando los ciclos de desarrollo de los chips; y además su capacidad de resolución sub-100 nm, que cumple todos los requerimientos litográficos programados por la ITRS (International Technology Roadmap for Semiconductors) para las futuras generaciones The most significant advantages of electron beam writing systems for micro- and nano-manufacturing are first that no mask is required, thus eliminating the amortization costs of traditional lithography masks and accelerating the development cycles of the chips; and also its capacity of sub-100 nm resolution, which meets all the lithographic requirements programmed by the ITRS (International Technology Roadmap for Semiconductors) for future generations

de circuitos integrados. Además, la gran mayoría de las máscaras de fotolitografía utilizadas en la industria microelectrónica hoy día se fabrican por LHE. of integrated circuits. In addition, the vast majority of photolithography masks used in the microelectronic industry today are manufactured by LHE.

El problema de la técnica es pues conseguir biochips a escala submicrométrica para la 5 detección de analitos. La solución propuesta por la presente invención es un procedimiento que comprende la irradiación parcial de un haz de electrones sobre una película precursora de MIPs, para utilizar como biosensor un motivo dibujado en dicha película que no habría sido irradiado por el haz de electrones. The problem of the technique is therefore to obtain biochips on a submicron scale for the detection of analytes. The solution proposed by the present invention is a process comprising the partial irradiation of an electron beam on a precursor film of MIPs, to use as a biosensor a motif drawn on said film that would not have been irradiated by the electron beam.

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Descripción de la invención Description of the invention

La invención refiere a un procedimiento de micro-nano-estructuración de películas de MIPs depositadas sobre substratos para la fabricación de microbiochips. The invention relates to a process of micro-nano-structuring of films of MIPs deposited on substrates for the manufacture of microbiochips.

De forma que la presente invención es un método de obtención de una estructura de 15 polímero de impronta molecular, que comprende las siguientes etapas: So the present invention is a method of obtaining a molecular imprint polymer structure, comprising the following steps:

(a) irradiación parcial con haz de electrones de una película formada por una mezcla precursora de polímeros de impronta molecular sobre un sustrato, preferiblemente una oblea de silicio o un vidrio, en que dicha mezcla precursora comprende cadenas poliméricas ramificadas; 20 (a) partial electron beam irradiation of a film formed by a precursor mixture of molecular imprint polymers on a substrate, preferably a silicon wafer or glass, wherein said precursor mixture comprises branched polymer chains; twenty

(b) eliminación por revelado con un disolvente químico de las moléculas afectadas por dicha irradiación con haz de electrones, (b) removal by development with a chemical solvent of the molecules affected by said electron beam irradiation,

(c) polimerización de la película resultado de la etapa b); y (c) polymerization of the film resulting from step b); Y

(d) extracción de dicho analito de la película polimerizada del paso c) por lavado químico. 25 (d) extracting said analyte from the polymerized film from step c) by chemical washing. 25

En una realización preferible, el método comprende la etapa previa de preparar la película sobre el substrato por técnica de espineado o “spin-coating”. Esta técnica consiste en depositar una gota o gotas de la mezcla precursora del polímero que se desea formar sobre un substrato, haciéndolo girar a continuación a una determinada 30 velocidad típicamente con un rotor con capacidad para adherir el substrato con un sistema de vacío. El resultado final es la formación de una película de gran uniformidad sobre el substrato. In a preferable embodiment, the method comprises the previous step of preparing the film on the substrate by spinning or spin-coating technique. This technique consists in depositing a drop or drops of the precursor mixture of the polymer to be formed on a substrate, then rotating it at a certain speed, typically with a rotor capable of adhering the substrate with a vacuum system. The end result is the formation of a highly uniform film on the substrate.

Se define “mezcla precursora” o de prepolimerización de MIPs como aquella mezcla de monómeros, oligómeros y/o polipéptidos de la que se obtiene un MIP capaz de reconocer una molécula orgánica tras un proceso de polimerización. Típicamente la mezcla también comprende un disolvente químico, y la molécula orgánica o analito sirve como plantilla molecular. Puede contener también un iniciador de la reacción de 5 polimerización. "Precursor mixture" or prepolymerization of MIPs is defined as that mixture of monomers, oligomers and / or polypeptides from which an MIP capable of recognizing an organic molecule is obtained after a polymerization process. Typically the mixture also comprises a chemical solvent, and the organic molecule or analyte serves as a molecular template. It may also contain a polymerization reaction initiator.

Se define “polímero” como una secuencia de monómeros con peso molecular igual o mayor de 1,5 kD. Por debajo de ese peso molecular se trataría de cadenas de oligómeros, que no son objeto de la presente invención. 10 "Polymer" is defined as a sequence of monomers with molecular weight equal to or greater than 1.5 kD. Below that molecular weight would be oligomer chains, which are not the subject of the present invention. 10

En una realización preferible de la invención, dicha irradiación de la etapa a) se realiza con una máquina de litografía por haz de electrones. El método sin contacto para la realización de estructuras MIP de escritura directa por haz de electrones resulta una herramienta adecuada para nanofabricación gracias a su resolución sub-micrométrica, 15 y puede ser utilizada para la fabricación de biochips de múltiples nanosensores químicos o bioquímicos. De forma que una realización muy preferible es que la zona no irradiada de la película resultado de la etapa a) sea inferior a 1 µm en alguna de sus dimensiones. In a preferable embodiment of the invention, said irradiation of step a) is carried out with an electron beam lithography machine. The non-contact method for the realization of direct write MIP structures by electron beam is a suitable tool for nanofabrication thanks to its sub-micrometric resolution, 15 and can be used for the manufacture of biochips of multiple chemical or biochemical nanosensors. So a very preferable embodiment is that the non-irradiated area of the film resulting from step a) is less than 1 µm in any of its dimensions.

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Las mezclas precursoras de MIPs cualquiera sea su composición presentan grupos funcionales y dobles enlaces que determinan la reacción con el analito y su propia polimerización. La proporción de dobles enlaces en las cadenas laterales de los polímeros de la mezcla precursora de la presente invención es del 10% respecto del total de grupos funcionales. 25 The precursor mixtures of MIPs whatever their composition have functional groups and double bonds that determine the reaction with the analyte and its own polymerization. The proportion of double bonds in the side chains of the polymers of the precursor mixture of the present invention is 10% with respect to the total functional groups. 25

En otra realización de la invención, dicho analito es una molécula orgánica seleccionada entre el grupo formado por péptidos, antibióticos, pesticidas, micotoxinas, drogas, colorantes, biomoléculas y moléculas sintéticas de biomoléculas, preferiblemente un colorante. En otra realización muy preferible dicha molécula 30 orgánica es una molécula fluorófora. In another embodiment of the invention, said analyte is an organic molecule selected from the group consisting of peptides, antibiotics, pesticides, mycotoxins, drugs, dyes, biomolecules and synthetic molecules of biomolecules, preferably a dye. In another very preferable embodiment said organic molecule is a fluorophore molecule.

En otra realización preferible más, dicho disolvente químico de la etapa b) con el que se revela la película afectada por el haz de electrones es tetrahidrofurano, metanol o isopropanol, o sus mezclas. 35 In yet another preferable embodiment, said chemical solvent of step b) with which the film affected by the electron beam is revealed is tetrahydrofuran, methanol or isopropanol, or mixtures thereof. 35

En otra realización preferible, la polimerización de la etapa c) de la mezcla precursora se realiza por calor y/o radiación electromagnética. In another preferable embodiment, the polymerization of step c) of the precursor mixture is carried out by heat and / or electromagnetic radiation.

En una realización preferible más, dicho lavado químico final del paso (d) se realiza en 5 presencia de metanol, etanol, acetonitrilo, agua, acido fórmico, ácido acético, ácido trifluoracético o sulfato de tetra-n-butilamonio, o sus mezclas. In a further preferable embodiment, said final chemical washing of step (d) is carried out in the presence of methanol, ethanol, acetonitrile, water, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid or tetra-n-butylammonium sulfate, or mixtures thereof.

La realización más preferible de la invención es una estructura de MIP que presenta un área polimerizada funcional parcial. 10 The most preferable embodiment of the invention is a MIP structure that has a partial functional polymerized area. 10

La posibilidad de emplear procedimientos de funcionalización compatibles con los procesos convencionales microelectrónicos aumenta el campo de aplicación y utilidad de los micro y nano-biosensores, además de simplificar su proceso de fabricación. Desde el punto de vista del proceso litográfico, esto requiere métodos para litografiar 15 motivos sub-micrométricos en materiales funcionales para el reconocimiento de moléculas orgánicas o biomoléculas. The possibility of using functionalization procedures compatible with conventional microelectronic processes increases the scope and utility of micro and nano-biosensors, in addition to simplifying their manufacturing process. From the point of view of the lithographic process, this requires methods to lithograph 15 sub-micrometric motifs in functional materials for the recognition of organic molecules or biomolecules.

El método de la invención comprende las siguientes etapas desarrolladas (Figura 1): The method of the invention comprises the following steps developed (Figure 1):

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A) Escritura (4) de los patrones deseados por irradiación con un haz de electrones (2) sobre una película delgada (1) de la mezcla precursora o de prepolimerización de MIP. Una vez polimerizada, la película de MIP actuará como sensor en aquellas zonas que no han sido irradiadas. Típicamente, los monómeros funcionales constituyentes en una mezcla 25 precursora de MIP están seleccionados de entre monómeros vinílicos, monómeros alílicos, acetilenos, acrilatos, metacrilatos, aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, carbohidratos y heterociclos; monómeros entrecruzantes que estabilicen la estructura polimérica en presencia de la plantilla molecular seleccionados entre diacrilatos o dimetacrilatos de 30 polioles, como 1,2-bis(metacriloiloxi)etano o 2,2-bis(2-metil-2-propanoiloximetil)butil-2-metil-2-propanoato; bisacrilamidas como N,N’-metilenbisacrilamida; y compuestos divinilicos como el divinilbenceno y sus análogos. En la mezcla precursora de la presente invención, estos monómeros están presentes formando polímeros. La mezcla precursora 35 A) Writing (4) of the desired patterns by irradiation with an electron beam (2) on a thin film (1) of the precursor or prepolymerization mixture of MIP. Once polymerized, the MIP film will act as a sensor in those areas that have not been irradiated. Typically, the constituent functional monomers in an MIP precursor mixture are selected from vinyl monomers, allylic monomers, acetylenes, acrylates, methacrylates, amino acids, nucleosides, nucleotides, carbohydrates and heterocycles; cross-linking monomers that stabilize the polymer structure in the presence of the molecular template selected from diacrylates or dimethacrylates of 30 polyols, such as 1,2-bis (methacryloxy) ethane or 2,2-bis (2-methyl-2-propanoyloxymethyl) butyl-2 -methyl-2-propanoate; bisacrylamides such as N, N’-methylene bisacrylamide; and divinyl compounds such as divinylbenzene and its analogues. In the precursor mixture of the present invention, these monomers are present forming polymers. The precursor mixture 35

típica de un MIP también comprende un porógeno, preferiblemente un disolvente orgánico, y una plantilla molecular o analito. Typical of a MIP also comprises a porogen, preferably an organic solvent, and a molecular template or analyte.

La película es depositada sobre un substrato (5) por cualquier técnica de recubrimiento de substratos. 5 The film is deposited on a substrate (5) by any substrate coating technique. 5

El proceso de escritura con el haz de electrones se puede realizar con una máquina de litografía o cualquier instrumentación que disponga de un cañón de electrones (2) y una plataforma de traslación en un plano (6), sobre la que se deposita el substrato (5). La plataforma de traslación es un 10 sistema electromecánico que puede moverse manual y/o automáticamente en un plano (X-Y). Así, una vez fijado el sistema substrato (5) - película (1) sobre la plataforma de traslación, es posible escribir con el haz de electrones (2), que suele permanecer en una posición fija, gracias al desplazamiento de la plataforma en el plano X-Y. 15 The writing process with the electron beam can be done with a lithography machine or any instrumentation that has an electron gun (2) and a translation platform in a plane (6), on which the substrate is deposited ( 5). The translation platform is an electromechanical system that can be moved manually and / or automatically in a plane (X-Y). Thus, once the substrate system (5) - film (1) is fixed on the translation platform, it is possible to write with the electron beam (2), which usually remains in a fixed position, thanks to the displacement of the platform in the XY plane. fifteen

B) Eliminación por disolución de las regiones irradiadas (4) de la película (1) con una disolución química que actúe como revelador. La película (1) se sumerge en el revelador, que actúa sobre el material de la mezcla afectado por la irradiación electrónica (4) con gran selectividad sobre el material no 20 irradiado (1,7). El tiempo de revelado dependerá de la velocidad de disolución del material irradiado. B) Elimination by dissolution of the irradiated regions (4) of the film (1) with a chemical solution that acts as a developer. The film (1) is immersed in the developer, which acts on the material of the mixture affected by electronic irradiation (4) with great selectivity on the non-irradiated material (1,7). The development time will depend on the dissolution rate of the irradiated material.

C) Polimerización de la película nanoestructurada (8, 9) que permanece adherida sobre el sustrato y no ha sido irradiada con el haz de electrones. 25 El proceso de polimerización se inicia en presencia de los radicales libres generados en la ruptura homolítica del doble enlace carbono-carbono de las cadenas laterales del polímero lineal tras irradiación con luz UV o tratamiento térmico. Alternativamente, la polimerización puede iniciarse en presencia de iniciadores de radicales libres del tipo peróxido y azo-30 compuesto, que son compuestos que contienen enlaces covalentes cuya ruptura homolítica origina radicales libres (8,9). El resultado de la polimerización es la formación de una estructura polimérica entrecruzada tridimensional. C) Polymerization of the nanostructured film (8, 9) that remains adhered to the substrate and has not been irradiated with the electron beam. The polymerization process begins in the presence of free radicals generated in the homolytic rupture of the carbon-carbon double bond of the side chains of the linear polymer after irradiation with UV light or heat treatment. Alternatively, the polymerization can be initiated in the presence of free radical initiators of the peroxide and compound azo-30 type, which are compounds containing covalent bonds whose homolytic cleavage causes free radicals (8,9). The result of polymerization is the formation of a three-dimensional cross-linked polymer structure.

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D) Extracción de la plantilla molecular de la película entrecruzada nanoestructurada (10,11). Esto se realiza por inmersión de la película (8,9) en un disolvente orgánico del tipo alcohol o nitrilo, o acuoso, capaz de disociar la plantilla molecular del material polimérico entrecruzado. D) Extraction of the molecular template of the nanostructured crosslinked film (10,11). This is done by immersing the film (8.9) in an organic solvent of the alcohol or nitrile, or aqueous type, capable of dissociating the molecular template of the crosslinked polymeric material.

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Así, el método de la invención crea patrones sub-micrométricos en la película por la eliminación selectiva del material alrededor de ellos. El MIP se comportaría como una resina positiva porque la parte irradiada se elimina con el revelado. Los patrones remanentes sobre el substrato, es decir la película estructurada, no reciben bombardeo electrónico, lo cual representa una gran ventaja de la invención ya que la 10 irradiación electrónica podría dañar las plantillas moleculares contenidas en la mezcla, y por tanto degradar las prestaciones del MIP. Thus, the method of the invention creates sub-micrometric patterns in the film by the selective removal of the material around them. The IPM would behave like a positive resin because the irradiated part is removed with development. Remaining patterns on the substrate, ie the structured film, do not receive electronic bombardment, which represents a great advantage of the invention since electronic irradiation could damage the molecular templates contained in the mixture, and thus degrade the performance of the MIP

A este respecto, los electrones incidentes sobre las moléculas producen una serie de reacciones de ruptura de enlaces químicos que favorecen la posterior disolución en un 15 revelador químico de las zonas irradiadas. Para que este efecto tenga lugar, la mezcla precursora de MIP debe contener en su composición moléculas suficientemente reactivas y sensibles a la irradiación electrónica tales como oligómeros, polímeros o copolímeros entrecruzables. La sensibilidad a la irradiación electrónica de estas moléculas se debe en la invención a la presencia de dobles enlaces C=C- en los 20 grupos laterales de dichas cadenas. Al incrementar el número de dobles enlaces aumenta la sensibilidad a la irradiación electrónica. Los dobles enlaces son altamente reactivos cuando interaccionan con electrones energéticos, y pueden romperse para generar radicales libres y sustancias susceptibles de ser disueltas en el revelador. La energía del haz de electrones y dosis electrónica (número de electrones por unidad de 25 tiempo y unidad de área) óptimas del proceso dependerán del grado de reactividad de la mezcla. Como valores ilustrativos, la energía del haz electrónico suele ser del orden de varios KeV, mientras que las dosis electrónicas típicas son del orden de mC/cm2. In this respect, the electrons incident on the molecules produce a series of chemical bond breaking reactions that favor the subsequent dissolution in a chemical developer of the irradiated areas. For this effect to take place, the IPM precursor mixture must contain in its composition molecules sufficiently reactive and sensitive to electronic irradiation such as cross-linkable oligomers, polymers or copolymers. The sensitivity to electronic irradiation of these molecules is due in the invention to the presence of double bonds C = C- in the 20 side groups of said chains. Increasing the number of double bonds increases the sensitivity to electronic irradiation. The double bonds are highly reactive when they interact with energetic electrons, and can be broken to generate free radicals and substances that can be dissolved in the developer. The energy of the electron beam and electronic dose (number of electrons per unit of time and area unit) optimal of the process will depend on the degree of reactivity of the mixture. As illustrative values, the energy of the electronic beam is usually of the order of several KeV, while the typical electronic doses are of the order of mC / cm2.

Otro aspecto clave del método de la invención es que el entrecruzamiento de la 30 mezcla de prepolimerización tiene lugar después del dibujo de los nanopatrones. El proceso de entrecruzamiento es fundamental para crear un MIP. Sin embargo, este entrecruzamiento suele endurecer mecánica y químicamente el material, haciendo difícil trabajarlo a posteriori en condiciones adecuadas para su uso como sensor de moléculas. 35 Another key aspect of the method of the invention is that the cross-linking of the prepolymerization mixture takes place after the drawing of the nanopatterns. The cross-linking process is essential to create a MIP. However, this cross-linking usually hardens the material mechanically and chemically, making it difficult to work afterwards in conditions suitable for use as a molecule sensor. 35

El método de la invención se puede aplicar a cualquier mezcla precursora de MIPs que contenga compuestos químicos sensibles a la irradiación con electrones, de forma que el resultado de esta irradiación sea la ruptura de enlaces químicos y la consiguiente formación de moléculas capaces de ser disueltas en un disolvente orgánico. 5 The method of the invention can be applied to any precursor mixture of MIPs containing chemical compounds sensitive to irradiation with electrons, so that the result of this irradiation is the rupture of chemical bonds and the consequent formation of molecules capable of being dissolved in an organic solvent. 5

La litografía con haz de electrones pertenece al sector de la nanofabricación de componentes electrónicos, ópticos y/o magnéticos con resinas, mientras que los MIPs pertenecen al área de materiales funcionales para fines sensores. La combinación de estas tecnologías en la presente invención pertenece a distintas áreas técnicas, no 10 está sugerida y no resulta obvia para el experto en la técnica y por tanto debe conferir inventividad a la presente invención. Electron beam lithography belongs to the nanofabrication sector of electronic, optical and / or magnetic components with resins, while MIPs belong to the area of functional materials for sensor purposes. The combination of these technologies in the present invention belongs to different technical areas, it is not suggested and it is not obvious to the person skilled in the art and therefore must confer inventiveness to the present invention.

La comparación entre el MIP de la invención y un NIP muestra que el proceso de irradiación con haz de electrones mantiene la capacidad de actuar como impronta 15 molecular de la parte de película no irradiada, frente a un NIP que no reconoce la plantilla molecular (Figura 3). El MIP es altamente selectivo a rodamina 123 ya que no presenta reactividad cruzada frente a moléculas estructuralmente similares a la plantilla tales como rodamina B y rodamina 6G que no contienen el grupo amino primario característico de la rodamina 123, al que se atribuye el reconocimiento 20 selectivo por parte del MIP (Figura 4). The comparison between the IPM of the invention and a PIN shows that the electron beam irradiation process maintains the ability to act as a molecular imprint of the part of the non-irradiated film, compared to a PIN that does not recognize the molecular template (Figure 3). The MIP is highly selective to rhodamine 123 since it does not show cross reactivity against structurally similar template molecules such as rhodamine B and rhodamine 6G that do not contain the characteristic primary amino group of rhodamine 123, to which selective recognition is attributed by the MIP (Figure 4).

La invención posibilita la fabricación de estructuras de MIPs con tamaño inferior a la micra sin necesidad de utilizar ninguna máscara o cualquier otro artilugio en contacto con el MIP, evitando así contaminarlo. El método sin contacto de la invención puede 25 ser llevado a cabo industrialmente utilizando equipamiento disponible comercialmente para realizar Litografía por Haz de Electrones (LHE). The invention makes it possible to manufacture MIP structures with a size smaller than microns without using any mask or any other device in contact with the MIP, thus avoiding contaminating it. The non-contact method of the invention can be carried out industrially using commercially available equipment to perform Electron Beam Lithography (LHE).

Desde el punto de vista económico, la posibilidad de fabricar biochips de múltiples nanosensores basados en MIPs utilizando técnicas propias de la industria de 30 semiconductores permitiría reducir los costes de producción considerablemente. Esta reducción no sólo estaría motivada por la posibilidad de fabricación en masa; la utilización de materiales biológicamente robustos como los MIPs, que actuarían como “anticuerpos artificiales” eliminaría los gastos de conservación que requieren las delicadas macromoléculas biológicas de reconocimiento. Por otro lado, las estructuras 35 From the economic point of view, the possibility of manufacturing biochips of multiple nanosensors based on MIPs using techniques of the semiconductor industry would reduce production costs considerably. This reduction would not only be motivated by the possibility of mass manufacturing; the use of biologically robust materials such as IPMs, which would act as "artificial antibodies" would eliminate the conservation costs required by delicate biological recognition macromolecules. On the other hand, structures 35

sub-micrométricas sensoras, además de ofrecer una mayor sensibilidad, requieren menores volúmenes de muestras y de potencia de funcionamiento. Ambos factores contribuirían a su vez a reducir los costes de utilización de los biochips. Sub-micrometric sensors, in addition to offering greater sensitivity, require lower sample volumes and operating power. Both factors would contribute in turn to reduce the costs of using the biochips.

Como se ha comentado arriba, las modificaciones químicas introducidas en los MIPs 5 para ser capaces de reconocer selectivamente a la rodamina y poder configurar el sensor de la invención, es específica. Si la molécula orgánica que actúa como plantilla es otra, los MIPs correspondientes se tendrían que desarrollar también de forma específica. Esto es por lo que sólo se aporta un ejemplo de realización y sin embargo la invención muestra una línea inventiva común a todos los procesos comprendidos 10 dentro del alcance de la reivindicación principal. As mentioned above, the chemical modifications introduced in the MIPs 5 to be able to selectively recognize rhodamine and to configure the sensor of the invention, is specific. If the organic molecule that acts as a template is another, the corresponding MIPs would also have to be developed specifically. This is why only one embodiment is provided and yet the invention shows an inventive line common to all processes comprised within the scope of the main claim.

Breve descripción de los dibujos Brief description of the drawings

Figura 1: Esquema de procedimiento de la invención. 15 Figure 1: Scheme of the process of the invention. fifteen

A) Escritura por haz de electrones sobre la película: A) Writing by electron beam on the film:

1. Película de mezcla precursora de MIP. 1. MIP precursor mixing film.

2. Haz de electrones. 2. Beam of electrons.

3. Cañón de electrones. 3. Electron cannon.

4. Motivo escrito con el haz de electrones en la película (1). 20 4. Reason written with the electron beam in the film (1). twenty

5. Substrato. 5. Substrate.

6. Plataforma de traslación X-Y. 6. X-Y translation platform.

B) Revelado de la película: B) Movie development:

7. Patrón deseado en la película. 7. Desired pattern in the movie.

C) Polimerización del MIP: 25 C) Polymerization of IPM: 25

8. Película polimerizada o entrecruzada. 8. Polymerized or crosslinked film.

9. Patrón deseado en la película. 9. Desired pattern in the movie.

D) Extracción del analito: D) Extraction of the analyte:

10. Película polimerizada sin la molécula plantilla. 10. Polymerized film without the template molecule.

11. Patrón deseado en la película. 30 11. Desired pattern in the movie. 30

Figura 2: Espectro de 1H-RMN del polímero sintetizado según el ejemplo de realización (300 MHz, d6-DMSO) δ (ppm): 12.39 (br s, HOOC-), 5.99 and 5.63 (s, CH2=C), 4.10 (br s, CO-NH-), 1.85 (s, =C(CH3)-), 1.23, 1.04 and 0.95 (br s, CH3-C). Figure 2: 1 H-NMR spectrum of the polymer synthesized according to the embodiment example (300 MHz, d6-DMSO) δ (ppm): 12.39 (br s, HOOC-), 5.99 and 5.63 (s, CH2 = C), 4.10 (br s, CO-NH-), 1.85 (s, = C (CH3) -), 1.23, 1.04 and 0.95 (br s, CH3-C).

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Figura 3: Gráfico de la intensidad de fluorescencia de la Rodamina 123 reconocida o capturada por el MIP sintetizado en el Ejemplo 2 en función del tiempo de inmersión en una disolución 20 nM de Rodamina 123 en acetonitrilo. Representa la curva de reconocimiento de la plantilla molecular Rodamina 123 por parte del MIP. También se muestra la intensidad de fluorescencia procedente de un Polímero No Improntado 5 (“Non-Imprinted Polymer”, NIP) con la plantilla molecular en las mismas condiciones de incubación. Figure 3: Graph of the fluorescence intensity of Rhodamine 123 recognized or captured by the MIP synthesized in Example 2 as a function of immersion time in a 20 nM solution of Rhodamine 123 in acetonitrile. It represents the recognition curve of the molecular template Rodamina 123 by the MIP. The fluorescence intensity from a Non-Imprinted Polymer 5 ("Non-Imprinted Polymer", NIP) with the molecular template under the same incubation conditions is also shown.

Figura 4: Gráfico de la intensidad de fluorescencia de la Rodamina 123, Rodamina B y Rodamina 6G, reconocida o capturada por el MIP sintetizado en el Ejemplo 2 tras inmersión en una disolución 5 M del indicador en acetonitrilo. Tiempo de incubación 3 10 h. Figure 4: Graph of the fluorescence intensity of Rhodamine 123, Rhodamine B and Rhodamine 6G, recognized or captured by the MIP synthesized in Example 2 after immersion in a 5 µM solution of the indicator in acetonitrile. Incubation time 3 10 h.

Descripción detallada de la invención Detailed description of the invention

Con la intención de mostrar la presente invención de un modo ilustrativo aunque en ningún modo limitante, se aportan los ejemplos siguientes. 15 With the intention of showing the present invention in an illustrative manner but in no way limiting, the following examples are provided. fifteen

Ejemplo 1: Preparación de la mezcla de polimerización Example 1: Preparation of the polymerization mixture

El polímero lineal empleado posteriormente para la obtención del MIP se preparó mezclando 4,5 mL de metacrilato de trimetilsililo (SIMA, ABCR, 97%) con 525 mg de metacrilato de 2-aminoetilo (AEM, Aldrich, 90%) en 20 mL de metanol y polimerizando 20 térmicamente con 50 mg de iniciador 2,2-azobis-(2,4-dimetilvaleronitrilo) (ABDV, Wako Pure Chemical Industries). El polímero se precipitó en acetona y redisolvió en 30 mL de dimetilformamida (DMF, Carlo Ebra), añadiendo 543 mg de N-(metacriloxi)succinimida (MAOS; ABCR) y 1 mL de trietilamina (TEA, Fischer Scientific, síntesis de péptidos). A continuación, se precipitó sobre una disolución de ácido 25 trifluoroacético (TFA, Fluorochem, síntesis de péptidos) en agua al 10 % en volumen y lavó con acetona obteniéndose un sólido blanco pulverulento. Este polímero presentó una cantidad de dobles enlaces del 10% respecto de la cantidad total de grupos funcionales, medido en la relación de señales del espectro de 1H-RMN (Figura 2). La mezcla precursora de polimerización se obtuvo disolviendo 1 g del polímero 30 sintetizado en 50 mL de metanol y añadiendo 1,5 mg de Rodamina 123, que actuó de plantilla molecular. The linear polymer subsequently used to obtain the MIP was prepared by mixing 4.5 mL of trimethylsilyl methacrylate (SIMA, ABCR, 97%) with 525 mg of 2-aminoethyl methacrylate (AEM, Aldrich, 90%) in 20 mL of methanol and thermally polymerizing with 50 mg of 2,2-azobis- (2,4-dimethylvaleronitrile) initiator (ABDV, Wako Pure Chemical Industries). The polymer was precipitated in acetone and redissolved in 30 mL of dimethylformamide (DMF, Carlo Ebra), adding 543 mg of N- (methacryloxy) succinimide (MAOS; ABCR) and 1 mL of triethylamine (TEA, Fischer Scientific, peptide synthesis) . Then, a solution of trifluoroacetic acid (TFA, Fluorochem, peptide synthesis) was precipitated in 10% volume water and washed with acetone to obtain a powdery white solid. This polymer had a 10% double bond quantity with respect to the total number of functional groups, measured in the ratio of 1 H-NMR spectrum signals (Figure 2). The polymerization precursor mixture was obtained by dissolving 1 g of polymer 30 synthesized in 50 mL of methanol and adding 1.5 mg of Rhodamine 123, which acted as a molecular template.

Ejemplo 2: Fabricación de un nanopatrón de MIP sobre un substrato de Si capaz de reconocer la molécula Rodamina 123. Example 2: Manufacture of a MIP nanopattern on a Si substrate capable of recognizing the molecule Rhodamine 123.

Sobre un sustrato de silicio (5) se depositó una película (1) de la mezcla de pre-polimerización obtenida en el Ejemplo 1 por la técnica de espineado (D.W. Schubert, T. Dunkel, Spin coating from a molecular point of view: its concentration regimes, 5 influence of molar mass and distribution; Materials Research Innovations Vol. 7, p. 314 (2003)) El espesor de esta película fue aproximadamente de 100 nm. Se dibujó el motivo (4) del patrón según la Figura 3 con un haz de electrones (2) generado por un cañón (3) (CRESTEC CABL-9500C) y acelerados hacia la película (1), siendo la energía de los electrones de 50 KeV y la dosis de 2 mC/cm2, produciendo la rotura de 10 enlaces químicos. La escritura se realizó gracias al movimiento de la plataforma (6) sobre la que se encuentra situado el substrato (5). Se sumergió entonces la película (1) adherida al substrato (5) en un revelador de tetrahidrofurano (THF) durante un minuto que eliminó la zona irradiada (4) dando lugar al patrón deseado (7). A continuación se aplicó calor (170 ºC, 30 min) a la película estructurada (1,7) 15 convirtiéndola en una película estructurada polimerizada o entrecruzada (8,9). Finalmente se extrajeron las moléculas de rodamina de la película estructurada entrecruzada (8,9) por inmersión de la película entrecruzada en una disolución de etanol con ácido trifluoroacético (TFA) al 10 % (v/v), obteniendo una película de MIP con estructuras sub-micrométricas (10,11) de acuerdo con el patrón escrito (4) con el 20 haz de electrones (2) (Figura 3). El patrón obtenido es capaz de detectar moléculas de Rodamina 123, es decir, es un sensor de Rodamina 123 basado en MIPs. On a silicon substrate (5) a film (1) of the pre-polymerization mixture obtained in Example 1 was deposited by the spinning technique (DW Schubert, T. Dunkel, Spin coating from a molecular point of view: its concentration regimes, 5 influence of molar mass and distribution; Materials Research Innovations Vol. 7, p. 314 (2003)) The thickness of this film was approximately 100 nm. The pattern (4) of the pattern according to Figure 3 was drawn with an electron beam (2) generated by a cannon (3) (CRESTEC CABL-9500C) and accelerated towards the film (1), the energy of the electrons being 50 KeV and the dose of 2 mC / cm2, causing the breakage of 10 chemical bonds. The writing was done thanks to the movement of the platform (6) on which the substrate (5) is located. The film (1) adhered to the substrate (5) was then immersed in a tetrahydrofuran (THF) developer for one minute that removed the irradiated area (4) giving rise to the desired pattern (7). Then heat (170 ° C, 30 min) was applied to the structured film (1,7) 15 converting it into a polymerized or crosslinked structured film (8,9). Finally, rhodamine molecules were extracted from the crosslinked structured film (8.9) by immersion of the crosslinked film in a 10% (v / v) ethanol solution with 10% trifluoroacetic acid (TFA), obtaining a MIP film with structures sub-micrometers (10.11) according to the written pattern (4) with the 20 electron beam (2) (Figure 3). The pattern obtained is capable of detecting Rhodamine 123 molecules, that is, it is a Rhodamine 123 sensor based on MIPs.

Claims (13)

REIVINDICACIONES 1. Método de obtención de una estructura de polímero de impronta molecular, caracterizado por que comprende las siguientes etapas: 1. Method of obtaining a molecular imprint polymer structure, characterized in that it comprises the following steps: (a) irradiación parcial con haz de electrones de una película formada por una mezcla precursora de polímeros de impronta molecular sobre un sustrato, 5 en que dicha mezcla precursora comprende cadenas poliméricas ramificadas; (a) partial electron beam irradiation of a film formed by a precursor mixture of molecular imprint polymers on a substrate, 5 wherein said precursor mixture comprises branched polymer chains; (b) eliminación por revelado con un disolvente químico de las moléculas afectadas por dicha irradiación con haz de electrones, (b) removal by development with a chemical solvent of the molecules affected by said electron beam irradiation, (c) polimerización de la película resultado de la etapa b); y 10 (c) polymerization of the film resulting from step b); and 10 (d) extracción de dicho analito de la película polimerizada del paso c) por lavado químico. (d) extracting said analyte from the polymerized film from step c) by chemical washing. 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende la etapa previa de preparar dicha película sobre el substrato por técnica de espineado. 15 2. Method according to claim 1, characterized in that it comprises the previous step of preparing said film on the substrate by spinning technique. fifteen 3. Método según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por que dicho sustrato es una oblea de silicio. 3. Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that said substrate is a silicon wafer. 4. Método según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por que dicho sustrato es un vidrio. 4. Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that said substrate is a glass. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que 20 dicha irradiación de la etapa a) se realiza con una máquina de litografía por haz de electrones. 5. Method according to any of claims 1 to 4, characterized in that said irradiation of step a) is carried out with an electron beam lithography machine. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la zona no irradiada de la película resultado de la etapa a) es inferior a 1 µm en alguna de sus dimensiones. 25 Method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the non-irradiated area of the film resulting from step a) is less than 1 µm in any of its dimensions. 25 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que dicho analito es una molécula orgánica seleccionada entre el grupo formado por péptidos, antibióticos, pesticidas, micotoxinas, drogas, colorantes, biomoléculas y moléculas sintéticas de biomoléculas. Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that said analyte is an organic molecule selected from the group consisting of peptides, antibiotics, pesticides, mycotoxins, drugs, dyes, biomolecules and synthetic molecules of biomolecules. 8. Método según la reivindicación 7, caracterizado por que dicha molécula 30 orgánica es un colorante. Method according to claim 7, characterized in that said organic molecule is a dye. 9. Método según una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado por que dicha molécula orgánica es una molécula fluorófora. 9. Method according to one of claims 7 or 8, characterized in that said organic molecule is a fluorophore molecule. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que dicho disolvente químico de la etapa b) es tetrahidrofurano, metanol o isopropanol, o sus mezclas. 10. Method according to any of claims 1 to 9, characterized in that said chemical solvent of step b) is tetrahydrofuran, methanol or isopropanol, or mixtures thereof. 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que dicha polimerización de la etapa c) se realiza por calor y/o radiación 5 electromagnética. Method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that said polymerization of step c) is carried out by heat and / or electromagnetic radiation. 12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que dicho lavado químico del paso (d) se realiza en presencia de metanol, etanol, acetonitrilo, agua, acido fórmico, ácido acético, ácido trifluoracético o sulfato de tetra-n-butilamonio, o sus mezclas. 10 12. Method according to any of claims 1 to 11, characterized in that said chemical washing of step (d) is carried out in the presence of methanol, ethanol, acetonitrile, water, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid or tetra-n sulfate -butylammonium, or mixtures thereof. 10 13. Estructura de polímero de impronta molecular, caracterizada por que presenta un área polimerizada funcional parcial. 13. Molecular imprint polymer structure, characterized in that it has a partial functional polymerized area.