ES2524067T3 - Formulación nutricional que comprende un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca y/o péptidos derivados del mismo para la inducción de tolerancia - Google Patents

Abstract

Formulación nutricional o complemento que comprende un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados y/o una fracción que contiene péptidos del hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados y/o uno o más péptidos que contienen epítopos de células T aislados del hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados para su uso en la inducción de tolerancia a la leche de vaca, a una proteína contenida en la leche de vaca o a un alérgeno contenido en la leche de vaca en un sujeto humano, en el que dichos péptidos contenidos en el hidrolizado o la fracción de hidrolizado comprenden péptidos que contienen epítopos de células T o en el que dicho uno o más péptidos son péptidos que contienen epítopos de células T, en el que dichos péptidos que contienen epítopos de células T pueden dirigir la reacción inmunitaria tras la ingesta de la formulación nutricional hacia la tolerancia y en el que el hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados comprende menos del 1% de péptidos con un tamaño mayor de 1,5 kD.

Description

Formulación nutricional que comprende un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca y/o péptidos derivados del mismo para la inducción de tolerancia.

La presente invención se refiere en una realización a una formulación nutricional o complemento que comprende un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados y/o una fracción que contiene péptidos del hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados y/o uno o más péptidos que contienen epítopos de células T aislados del hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados para su uso en la inducción de tolerancia a la leche de vaca, a una proteína contenida en la leche de vaca o a un alérgeno contenido en la leche de vaca en un sujeto humano, en el que dichos péptidos contenidos en el hidrolizado o la fracción de hidrolizado comprenden péptidos que contienen epítopos de células T o en el que dicho uno o más péptidos son péptidos que contienen epítopos de células T, en el que dichos péptidos que contienen epítopos de células T pueden dirigir la reacción inmunitaria tras la ingesta de la formulación nutricional hacia la tolerancia y en el que el hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados comprende menos del 1% de péptidos con un tamaño mayor de 1,5 kD.

La alergia a la leche de vaca es una de las alergias alimentarias más comunes en niños pequeños, experimentando aproximadamente del 2% al 2,5% de los lactantes reacciones alérgicas a la leche. La mayoría de los niños superan su alergia a la leche de vaca antes de los 3 años de edad, pero el 15% de estos lactantes conservará su sensibilidad a la leche de vaca hasta su segunda década de vida. Por tanto, los sujetos que tienen una alergia a la leche de vaca están presentes en todos los grupos de edad. Las enfermedades alérgicas como la alergia a la leche son trastornos inmunológicos que provienen de la activación de un subconjunto de células T que secretan factores alérgicos, inflamatorios que incluyen IL-4, IL-5 y/o IL-13 (Schmidt-Weber et al., Allergy 2002, vol. 57, págs. 762-768). Este subconjunto de células T controla la conmutación isotípica de las células B específicas de antígeno a IgE y por tanto desempeña un papel clave en el inicio de los síntomas alérgicos, así como en la inducción de la tolerancia (Kondo et al., Pediatr Allergy lmmunol. 2008, vol. 19, págs. 592-598). Por tanto, la regulación de las células T específicas de alérgeno es una estrategia prometedora para controlar las enfermedades alérgicas.

Con el fin de evitar reacciones alérgicas tras la exposición a la leche de vaca en un sujeto alérgico a la leche de vaca, y en particular en lactantes que tienen alergia a la leche de vaca, actualmente se usan sobre todo fórmulas sustitutivas de la leche que remplazan la nutrición a base de leche de vaca. Estas formulaciones proporcionan adicionalmente al sujeto una fuente completa de nutrición. Los sustitutivos de la leche incluyen aminoácidos libres (tales como Nutramigen™ AA, Neocate), fórmulas a base de soja (tal como Pregomin) o fórmulas hipoalergénicas a base de proteínas parcial o intensamente hidrolizadas (tales como Nutramigen™, Alimentum y Pregestemil). La patente estadounidense n.º 6.077.558 describe un sistema emulsionante para composiciones dietéticas elementales que comprende una fuente de proteína que puede ser una proteína intensamente hidrolizada, aminoácidos libres, péptidos de cadena corta, o una mezcla de los mismos. El documento WO 2008/056983 se refiere a complementos alimenticios y dietéticos probióticos para lactantes y niños que contribuyen a la resistencia general contra patógenos y a la incidencia de enfermedades respiratorias en niños. Los complementos pueden incluir un hidrolizado de caseína, tal como, por ejemplo, un hidrolizado de caseína intensamente hidrolizada bajo en grasas no alergénico. Ruiter, B. et al., Characterization of a T cell epitopes in s1-casein in cow´s milk allergic, atopic and non-atopic children, Clinical and Experimental Allergy, 36, 303-310 (2006) se refiere a la identificación de epítopos de células T que pueden ser dianas útiles en el desarrollo de inmunoterapia con péptidos. Lake, Alan M., Food-Induced Eosinophilic Proctocolitis, Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition, volumen 30, número 1, págs. S58-S60, enero (2000) describe que una formulación a base de caseína intensamente hidrolizada puede administrarse a lactantes con proctocolitis eosinofílica con el fin de eliminar proteínas agresivas de la dieta. Si sujetos alérgicos no responden a las fórmulas de hidrolizado de proteína, las fórmulas a base de aminoácidos no derivados de la leche son adecuadas para el tratamiento de alergia a la leche tanto leve-moderada como severa. Las fórmulas a base de la soja tienen un riesgo de sensibilidad alérgica, porque algunos sujetos que son alérgicos a la leche también pueden ser alérgicos a la soja. Las fórmulas de hidrolizado parcial están caracterizadas por una mayor proporción de cadenas de aminoácidos largas (péptidos) en comparación con los hidrolizados intensos y se consideran más sabrosas. Habitualmente están destinadas a uso profiláctico y generalmente no se consideran adecuadas para el tratamiento de alergia/intolerancia a la leche. Las proteínas intensamente hidrolizadas, por otra parte, comprenden principalmente aminoácidos libres y péptidos cortos. La caseína y el suero de la leche son las fuentes de proteína usadas con mayor frecuencia para los hidrolizados debido a su alta calidad nutricional y su composición de aminoácidos.

Por tanto, la mayoría de las fórmulas sustitutivas de la leche de vaca actualmente en el mercado son a base de leche de vaca que se ha hidrolizado hasta diversos grados y/o de formulaciones de aminoácidos. Estas fórmulas de leche de vaca se usan para remplazar la leche de vaca y de ese modo reducir las reacciones alérgicas en sujetos alérgicos a la leche de vaca. Además, las fórmulas de leche de vaca pueden prevenir potencialmente el desarrollo de alergia a la lecha de vaca en un sujeto que corre el riesgo de desarrollar una alergia a la leche. Sin embargo, se ha observado que incluso los productos intensamente hidrolizados han provocado ocasionalmente reacciones alérgicas ilícitas en lactantes sensibilizados (Rosendal et al. Journal of Dairy Science 2000, vol. 83, n.º 10, págs. 2200-2210).

Por tanto, el tratamiento actual para las alergias a la leche es evitar totalmente la leche de vaca en los alimentos. Por consiguiente, una sustancia que pudiera dirigir la reacción inmunitaria tras la ingesta de la sustancia hacia la tolerancia a la leche de vaca o alimentos que comprenden leche de vaca aumentaría drásticamente la calidad de vida de un sujeto que tiene alergia a la leche de vaca o que corre el riesgo de desarrollar una alergia a la leche de vaca. Esta necesidad se aborda mediante la presente invención.

La presente invención está definida por las reivindicaciones. Por consiguiente, la presente invención se refiere en una realización a una formulación nutricional o complemento que comprende un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados y/o una fracción que contiene péptidos del hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados y/o uno o más péptidos que contienen epítopos de células T aislados del hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados para su uso en la inducción de tolerancia a la leche de vaca, a una proteína contenida en la leche de vaca o a un alérgeno contenido en la leche de vaca en un sujeto humano, en el que dichos péptidos contenidos en el hidrolizado o la fracción de hidrolizado comprenden péptidos que contienen epítopos de células T o en el que dicho uno o más péptidos son péptidos que contienen epítopos de células T, en el que dichos péptidos que contienen epítopos de células T pueden dirigir la reacción inmunitaria tras la ingesta de la formulación nutricional hacia la tolerancia y en el que el hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados comprende menos del 1% de péptidos con un tamaño mayor de 1,5 kD.

El término “formulación nutricional” tal como se usa en el presente documento describe una formulación sólida o líquida que puede por tanto comerse o beberse por un sujeto humano para su nutrición. La formulación nutricional de la invención tiene preferiblemente un valor nutricional de al menos 1, más preferible de al menos 10 e incluso más preferible de 50 kcal (kilocalorías)/100 ml para formulaciones líquidas y preferiblemente de al menos 1, más preferible al menos 10, incluso más preferible al menos 50, tal como al menos 100, y lo más preferible al menos 300 kcal/100 g para formulaciones de alimento deshidratado. En una realización preferida de la invención, la formulación nutricional de la invención tiene un valor nutricional de al menos 50-200 kcal/100 ml para las formulaciones líquidas y al menos 300-600 kcal/100 g para las formulaciones de alimento deshidratado. Una formulación nutricional se distingue de una vacuna. A diferencia de una vacuna, una formulación nutricional no comprende ninguno de adyuvantes (a menos que sea como contaminantes), compuestos virales activados o inactivados (a menos que sea como contaminantes), compuestos bacterianos activados o inactivados (a menos que sea como contaminantes) ni compuestos patógenos (a menos que sea como contaminantes).

El término “complemento” tal como se usa en el presente documento se refiere a un complemento nutricional que es una fuente concentrada de nutriente o alternativamente otras sustancias con efectos nutricionales o fisiológicos cuyo propósito es complementar la dieta normal.

Además de los componentes mencionados anteriormente pueden seleccionarse componentes adicionales de lípidos, minerales, hidratos de carbono, aminoácidos, quelatos de aminoácidos, nutrientes anabólicos, vitaminas, antioxidantes, cepas bacterianas probióticas y agentes lipotrópicos con el fin de proporcionar una energía sostenida óptica y una formulación nutricional anabólica. La formulación nutricional puede ser un complemento nutricional o puede proporcionar una nutrición completa. Preferiblemente la formulación nutricional se encuentra en forma de un concentrado de alimento deshidratado. La formulación nutricional de la invención proporciona a un sujeto humano con preferencia creciente al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 25%, al menos un 50%, al menos un 75%

o al menos un 90% del requerimiento calórico diario de un sujeto humano. El experto en la técnica es completamente consciente de que el requerimiento calórico diario depende del género, la altura y la edad del sujeto humano. Por ejemplo, un hombre de 30 años de edad con 80 kg de peso corporal y 180 cm de altura tiene un requerimiento calórico diario de aproximadamente 2900 cal (calorías) para mantener su peso corporal mientras que una mujer de 30 años de edad con 55 kg de peso corporal y 165 cm de altura tiene un requerimiento calórico diario de aproximadamente 2100 cal para mantener su peso corporal. En una realización preferida, la formulación nutricional de la presente invención es un producto nutricional para lactantes o adolescentes.

El término “péptido” tal como se usa en el presente documento describe cadenas moleculares lineales de aminoácidos, incluyendo moléculas de cadena sencilla o sus fragmentos. Un péptido según la invención contiene con preferencia creciente aproximadamente de 2 a 100 aminoácidos, aproximadamente de 5 a 50 aminoácidos, o aproximadamente de 5 a 40 aminoácidos. Adicionalmente los péptidos pueden formar oligómeros que consisten en al menos dos moléculas idénticas o diferentes. Las estructuras de orden superior correspondientes de tales multímeros se denominan, correspondientemente, homo-o heterodímeros, homo-o heterotrímeros, etc. Además, los peptidomiméticos de tales péptidos en los que se han remplazado aminoácido(s) y/o enlace(s) peptídico(s) por análogos funcionales también están abarcados por el término “péptido”. Tales análogos funcionales incluyen todos los aminoácidos conocidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes, tales como selenocisteína. El término “péptido” también se refiere a péptidos modificados de manera natural en los que la modificación se efectúa, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, fosforilación y modificaciones similares que son ampliamente conocidas en la técnica. Un péptido debe distinguirse de una proteína en la presente invención. Una proteína según la presente invención describe un compuesto orgánico compuesto por aminoácidos dispuestos en una cadena lineal y plegados para dar una forma globular. Además, una proteína según la presente invención describe un aminoácido de más de 100 aminoácidos. Los péptidos pueden, por ejemplo, producirse de manera recombinante, de manera (semi)sintética u obtenerse de fuentes naturales tal como tras la hidrolización de proteínas, todo según los métodos

conocidos en la técnica.

El término “hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca” tal como se usa en el presente documento define una fórmula que comprende péptidos derivados de proteínas de leche de vaca hidrolizadas (por ejemplo caseína bovina o suero de la leche bovino). A este respecto, una proteína hidrolizada es una proteína que se ha descompuesto en péptidos y/o aminoácidos constituyentes. Aunque hay muchos medios para lograr la hidrólisis de una proteína, dos de los medios más comunes son la ebullición prolongada en un ácido fuerte o una base fuerte o el uso de una enzima tal como la enzima proteasa pancreática para estimular el proceso hidrolítico que se produce de manera natural. La hidrólisis de proteínas derivadas de la leche se logra preferiblemente usando una enzima o una mezcla de enzimas. Un hidrolizado de leche de vaca puede comprender péptidos derivados de la leche, en los que las proteínas de dicha leche se han hidrolizado hasta diversos grados. Por consiguiente, puede distinguirse entre un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca parcialmente hidrolizados y un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados. A este respecto, un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca parcialmente hidrolizados comprende más de un 20% de proteína de leche de vaca intacta mientras que un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados comprende menos de un 1% de péptidos con un tamaño mayor de 1,5 kD. Además, un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados es preferentemente hipoalergénico.

El término “péptido derivado de la leche de vaca” tal como se usa en el presente documento define un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es una secuencia de aminoácidos parcial de una proteína de la leche de vaca. Tales péptidos pueden obtenerse como se explica de manera resumida anteriormente mediante hidrólisis o pueden sintetizarse in vitro mediante métodos conocidos por el experto en la técnica y descritos en los ejemplos de la invención.

El término “péptido que contiene epítopos de células T” según la invención describe un péptido que comprende un epítopo que puede unirse a un receptor de superficie que está presente en una célula T. Se prefiere que el epítopo pueda unirse a un receptor de células T (TCR).

El término “fracción que contiene péptidos del hidrolizado” se refiere a una mezcla de péptidos que comprende al menos 2, preferiblemente al menos 5, más preferiblemente al menos 10 y lo más preferiblemente al menos 20 que se han aislado del hidrolizado de la invención mediante técnicas de filtración conocidas por el experto en la técnica. Además, las técnicas para el aislamiento de péptidos a partir del hidrolizado de la invención se describen a continuación en el presente documento.

El término “tolerancia” según la invención se refiere a una tolerancia inmunológica. La tolerancia inmunológica se define en el presente documento como el desarrollo de una ausencia de reactividad específica o una ausencia de reactividad parcial de los tejidos linfoides a un antígeno o grupo de antígenos particular. Este antígeno o grupo de antígenos particular puede inducir una reacción inmunitaria en un sujeto humano atópico tras la ingesta del antígeno

o grupo de antígenos particular. Por consiguiente, la tolerancia al antígeno o grupo de antígenos particular según la presente invención se induce tras la ingesta de uno o más péptidos que contienen epítopos de células T de la invención. Sin querer restringirse a la teoría, la tolerancia puede inducirse, por ejemplo, mediante un mecanismo de anergia y deleción de células T reactivas a alérgeno específicas. Alternativamente, la tolerancia puede, por ejemplo, inducirse mediante factores celulares (es decir citocinas) que podrían dirigir el desarrollo de las células T hacia el desarrollo de un fenotipo de célula T tolerogénico o supresor (células T reguladoras).

A este respecto, el término “péptidos que contienen epítopos de células T que pueden dirigir la reacción inmunitaria tras la ingesta de la formulación nutricional hacia la tolerancia” especifica péptidos que contribuyen al desarrollo de una ausencia de reactividad específica de los tejidos linfoides a un antígeno o grupo de antígenos particular, consiguiéndose esta actividad del péptido mediante la unión a un receptor de superficie de células T. Por consiguiente, los péptidos que contienen epítopos de células T están presentes en la formulación nutricional en una cantidad que permite dirigir la reacción inmunitaria hacia la tolerancia. Se prefiere que la reacción inmunitaria se reduzca mediante la inducción de tolerancia en al menos un 20%, tal como al menos un 50%, tal como en al menos un 75%, preferiblemente en al menos un 90%, más preferiblemente en al menos un 95% y lo más preferiblemente en un 100% en comparación con la reacción inmunitaria tras el contacto con el antígeno sin previa inducción de tolerancia. Los métodos para medir la tolerancia se conocen en la técnica e incluyen por ejemplo los métodos descritos en los ejemplos de la invención. Por consiguiente, la tolerancia puede determinarse por ejemplo midiendo la cantidad de factores proinflamatorios liberados por las células T (por ejemplo interleucinas o interferones) o la proliferación de células T. Un péptido que es un péptido que contiene epítopos de células T que puede dirigir la reacción inmunitaria tras la ingesta de la formulación nutricional hacia la tolerancia puede identificarse mediante métodos conocidos por el experto en la técnica que se describen, por ejemplo, en los ejemplos de la invención a continuación en el presente documento. Por consiguiente, un péptido que puede inhibir la proliferación de células T y/o regula por disminución la liberación de citocinas proinflamatorias y/o citocinas que dirigen la diferenciación de células T cooperadoras 2 (TH2) liberadas en el sobrenadante de PBMC es un péptido que contiene epítopos de células T que puede dirigir la reacción inmunitaria tras la ingesta de la formulación nutricional hacia la tolerancia.

Según la presente invención, se encontró sorprendentemente que los péptidos que contienen epítopos de células T contenidos en el hidrolizado de leche de vaca y péptidos que contienen epítopos de células T que se derivan de una

proteína presente en la leche de vaca pueden usarse en la inducción de tolerancia. Como se evidencia en los ejemplos a continuación, los inventores encontraron que los péptidos contenidos en hidrolizados de leche y péptidos derivados de una proteína presente en la leche de vaca pueden disminuir drásticamente la proliferación de células T cuando hay una exposición posterior a alérgenos de la leche, presumiblemente bloqueando la unión de receptores de células T y MHCII. Péptidos específicos contenidos en hidrolizados de leche o péptidos sintéticos correspondientes a una secuencia parcial de un péptido de leche de vaca pueden incluso bloquear la proliferación de células T cuando hay una exposición posterior a alérgenos de la leche. Mientras que los epítopos de células T en proteínas de leche de vaca se han descrito en la técnica (por ejemplo Kondo et al., Pediatr Allergy Immunol. 2008, vol. 19, págs. 592-598; Elsayed et al., Mol Immunol. 2004, vol. 41(12), págs. 1225-34 ; Ruiter et al., Clin Exp Allergy. 2006, vol. 36(3), págs. 303-10; Ruiter et al., lnt Arch Allergy lmmunol. 2007; vol. 143(2), págs. 119-26; o Nakajima-Adachi et al., J Allergy Clin Immunol. 1998; vol. 101(5), págs. 660-71), no ha sido descrito anteriormente que los péptidos derivados de leche de vaca puedan inducir la tolerancia. Además, según la presente invención también se ha encontrado que los péptidos que contienen epítopos de células T contenidos en hidrolizado de leche de vaca y los péptidos que contienen epítopos de células T que se derivan de una proteína presente en la leche de vaca reducen los niveles de citocinas que dirigen una diferenciación de células T cooperadoras 2 (TH2) y los niveles de citocinas proinflamatorias en comparación con los niveles de dichas citocinas inducidos por proteínas de la leche. Como se conoce en el campo de la inmunología, las citocinas proinflamatorias tienen efectos perjudiciales sobre la integridad de la barrera intestinal y por tanto están involucradas en el desarrollo enfermedad tanto alérgica como inflamatoria. Entre las citocinas proinflamatorias, se conoce en particular que IL-4 e IFN-gamma destruyen la cohesión entre las células epiteliales que revisten la superficie del intestino comprometiendo así la integridad de la barrera intestinal. Como resultado de esto, el intestino se vuelve más permeable con un aumento de la exposición de las células inmunitarias de la pared intestinal a alérgenos y antígenos dietéticos/microbianos.

Por tanto, sin querer restringirse a la teoría, se cree que la tolerancia se induce directamente por péptidos derivados de la leche de vaca. Anteriormente los péptidos y los hidrolizados de la leche de vaca sólo se han usado con el fin de remplazar la leche de vaca. Mediante el remplazo de la leche de vaca se ha evitado una reacción alérgica o el desarrollo de una reacción alérgica. Los hallazgos proporcionados en el presente documento muestran que los péptidos que son péptidos que contienen epítopos de células T contenidos en hidrolizado de leche de vaca y los péptidos que contienen epítopos de células T que se derivan de una proteína presente en la leche de vaca pueden además e inesperadamente usarse para inducir tolerancia en un sujeto humano.

Según la invención, se induce tolerancia a la leche de vaca, a una proteína contenida en la leche de vaca o a un alérgeno contenido en la leche de vaca.

La leche de vaca, una proteína contenida en la leche de vaca o un alérgeno contenido en la leche de vaca están comprendidos, por ejemplo, en cualquier alimento que comprenda componentes de la leche de vaca. Ejemplos no limitativos son la leche, la cuajada, la nata, la mantequilla, el yogur y alimentos que contengan cualquiera de éstos.

El término “alérgeno” tal como se usa en el presente documento describe un antígeno que puede estimular una reacción de hipersensibilidad en un sujeto humano atópico (alérgico). Además, un alérgeno es en general una sustancia que es extraña para el cuerpo y puede provocar una reacción alérgica sólo en sujetos humanos atópicos.

En el presente documento también se describe una formulación nutricional o complemento que comprende un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca y/o una fracción que contiene péptidos del hidrolizado y/o uno o más péptidos derivados de una proteína presente en la leche de vaca para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedad inflamatoria del intestino, en el que dichos péptidos contenidos en el hidrolizado o la fracción de hidrolizado comprenden péptidos que contienen epítopos de células T o en el que dicho uno o más péptidos son péptidos que contienen epítopos de células T, y en el que dichos péptidos que contienen epítopos de células T pueden regular por disminución las citocinas proinflamatorias tras la ingesta de la formulación nutricional.

El término “enfermedad inflamatoria del intestino” tal como se usa en el presente documento define un grupo de estados inflamatorios del tracto gastrointestinal. Los principales tipos de enfermedad inflamatoria del intestino son la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. La principal diferencia entre la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa es la ubicación y la naturaleza de los cambios inflamatorios. La enfermedad de Crohn puede afectar a cualquier parte del tracto gastrointestinal, desde la boca hasta el año (lesiones segmentarias), aunque la mayoría de los casos comienzan en el íleon terminal. La colitis ulcerosa, en contraposición, se restringe al colon y el recto. En una realización preferida, la enfermedad inflamatoria del intestino está presente en un sujeto humano que tiene una alergia a la leche o que corre el riesgo de desarrollar una alergia a la leche. En una realización preferida adicional, la enfermedad inflamatoria del intestino se selecciona de una o más de enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD), gastroenteritis, colitis y/o esofagitis. GERD es una enfermedad producida por el reflujo anómalo en el esófago. En particular, la enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD), la gastroenteritis, la colitis y/o la esofagitis son comunes en sujetos humanos que tienen una alergia a la leche.

Tal como se usa en el presente documento, el término “citocinas proinflamatorias” son citocinas que se liberan en un sujeto humano por células del sistema inmunitario, preferiblemente por células presentadoras de antígeno o células T y lo más preferiblemente por células T y median en y/o potencian una enfermedad inflamatoria. Ejemplos no limitativos de citocinas inflamatorias son IL-12, IL-17, IL-5, IL-4, IFN-, IL-8, TNF-, IL-6 o IL-1. Los métodos para

medir el nivel de citocinas liberadas por células del sistema inmunitario se conocen ampliamente por el experto en la técnica e incluyen los métodos descritos en los ejemplos. Por consiguiente, los métodos incluyen, por ejemplo, la medición de los niveles de citocinas en sobrenadantes de cultivo.

El término “péptidos que contienen epítopos de células T que pueden regular por disminución las citocinas proinflamatorias tras la ingesta de la formulación nutricional” se refiere a los péptidos que contienen epítopos de células T en la formulación nutricional que pueden regular por disminución los niveles de citocinas proinflamatorias que se liberan por las células inmunitarias, preferiblemente células T o APC, y más preferiblemente células T. Además, estos péptidos que contienen epítopos de células T pueden administrarse a un sujeto humano en una cantidad que sea suficiente para regular por disminución las citocinas proinflamatorias tras la ingesta de la formulación nutricional. Se prefiere que el nivel de citocinas proinflamatorias se regule por disminución en al menos un 20%, tal como al menos un 50%, tal como en al menos un 75%, preferiblemente en al menos un 90%, más preferiblemente en al menos un 95% y lo más preferiblemente en al 100% en comparación con el nivel de citocinas proinflamatorias en una reacción inmunitaria atópica tras el contacto con el antígeno. Un péptido que es un péptido que contiene epítopos de células T que puede regular por disminución las citocinas proinflamatorias tras la ingesta de la formulación nutricional puede identificarse mediante métodos conocidos por el experto en la técnica que, por ejemplo, se describen en los ejemplos de la invención a continuación en el presente documento. Por consiguiente, la medición del nivel de citocinas proinflamatorias liberadas en el sobrenadante del cultivo de PBMC tras la exposición a un péptido identifica un péptido que contiene epítopos de células T que puede regular por disminución las citocinas proinflamatorias tras la ingesta de la formulación nutricional.

Tal como se describe en el presente documento, se ha encontrado sorprendentemente que los péptidos que contienen epítopos de células T de la invención derivados de la leche de vaca pueden regular por disminución las citocinas inflamatorias que se liberan tras la exposición a o la estimulación mediante alérgenos o antígenos dietéticos/microbianos. Por tanto, la formulación nutricional de la invención es adecuada para tratar la enfermedad inflamatoria del intestino.

Según la invención, el uno o más péptidos son péptidos que contienen epítopos de células T aislados del hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca.

Tal como se detalla anteriormente, el hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca comprende péptidos derivados de proteínas de leche de vaca hidrolizadas. Estos péptidos pueden aislarse del hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca mediante una técnica convencional conocida por el experto en la técnica. Por consiguiente, una purificación analítica generalmente utiliza al menos una de tres propiedades para separar péptidos. En primer lugar, los péptidos pueden purificarse según sus puntos isoeléctricos haciéndolos pasar a través de un gel con gradiente de pH o una columna de intercambio iónico. En segundo lugar, los péptidos pueden separarse según su tamaño o peso molecular mediante cromatografía de exclusión molecular o mediante SDS-PAGE (electroforesis en dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida). En tercer lugar, otra metodología de purificación de péptidos podría involucrar filtración con membranas (por ejemplo ultrafiltración) que generaría una mezcla de péptidos adecuada para la aplicación propuesta. Los péptidos se purifican a menudo usando 2D-PAGE y luego se analizan mediante huella peptídica para establecer la identidad del péptido. El péptido aislado e identificado obtenido del hidrolizado puede producirse entonces de manera recombinante aplicando métodos convencionales conocidos por el experto y usarse o bien solo o bien en combinación con un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca según la invención.

Una realización preferida de la invención se refiere a la formulación nutricional de la invención, en la que el uno o más péptidos tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y/o 4.

Tal como se muestra en los ejemplos a continuación, las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (figura 2, Cas3, alfaS1-péptido 3) y SEQ ID NO: 4 (figura 2, Cas4, alfaS1-péptido 4) suprimen la proliferación de células T cuando se estimulan de nuevo con la proteína de leche de vaca y de ese modo inducen la tolerancia a la leche de vaca (véase la figura 4).

Según la invención, el hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca es un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados.

Una realización preferida de la invención se refiere a la formulación nutricional de la invención, en la que el hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados es un hidrolizado de caseína bovina intensamente hidrolizada.

Tal como se muestra a continuación en los ejemplos de la invención, un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados puede suprimir la proliferación de células T cuando éstas se estimulan de nuevo con proteína de leche de vaca. De ese modo se induce la tolerancia a la leche de vaca. Por consiguiente, VTP 3, VTP11 y VTP15 (véase la figura 1) fueron los más potentes para inducir la tolerancia y son, por tanto, ejemplos preferidos de la formulación nutricional que comprende un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados según la invención, VTP3 es Nutramigen™, VTP11 es la base de Nutramigen™ y VTP15 es la caseína bovina intensamente hidrolizada que se usa en Nutramigen™. VTP3, VTP 11 y VTP 15 pueden

adquirirse de Mead Johnson Nutrition, 2400 West Lloyd Expressway Evansville, Indiana 47721-0001, EE.UU. VTP3, VTP 11 y VTP 15 comprenden caseína bovina intensamente hidrolizada. En la figura 8 se proporciona un perfil de los péptidos derivados de caseína comprendidos en VTP3, VTP 11 y VTP 15. VTP15 solo consiste en los péptidos enumerados en la figura 8. Nutramigen™ (VTP3) comprende además de los péptidos enumerados en la figura 8 los siguientes componentes: jarabe de glucosa, aceite vegetal (aceite de oleína de palma, aceite de coco, aceite de soja, aceite de girasol altamente oleico), almidón de maíz modificado <2%, fosfato de calcio <1%, citrato de calcio, citrato de potasio, cloruro de potasio, L-cisteína, cloruro de colina, L-tirosina, inositol, óxido de magnesio, Ltriptófano, ácido ascórbico, sulfato ferroso, taurina, L-carnitina, acetato de DL-alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, nicotinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de retinilo, sulfato de manganeso, clorhidrato de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, yoduro de sodio, ácido fólico, fitomenadiona, molibdato de sodio, cloruro crómico, colecalciferol, selenito de sodio, biotina, cianocobalamina.

Una realización preferida adicional de la invención se refiere a la formulación nutricional de la invención, en la que el sujeto humano o es un niño o un adolescente.

El término “niño” o el término “adolescente” se usan en el presente documento según las definiciones proporcionas en la técnica. Por tanto, el término “niño” quiere decir un sujeto humano entre las fases de nacimiento y la edad de aproximadamente 10 años y el término “adolescente” quiere decir un sujeto humano entre la edad de aproximadamente 10 años y la pubertad (antes de la madurez sexual).

La invención se refiere en una realización preferida adicional a la formulación nutricional de la invención, en la que el sujeto humano es un adulto.

El término “adulto” se usa en el presente documento según las definiciones proporcionadas en la técnica. Por tanto, este término quiere decir un sujeto después de la pubertad (después de la madurez sexual).

Una realización preferida adicional de la invención se refiere a la formulación nutricional de la invención, en la que el sujeto humano tiene una alergia a la leche de vaca.

El término “alergia a la leche de vaca” describe una alergia alimentaria, es decir una reacción adversa inmunitaria a una o más de las proteínas contenidas en la leche de vaca en un sujeto humano. Los principales síntomas son síntomas gastrointestinales, dermatológicos y respiratorios. Éstos pueden traducirse en erupciones cutáneas, urticaria, vómitos, diarrea, estreñimiento y molestias. El espectro clínico se extiende a diversos trastornos: reacciones anafilácticas, dermatitis atópica, respiración dificultosa, cólico infantil, enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD), esofagitis, colitis, gastroenteritis, cefalea/migraña y estreñimiento.

En otra realización preferida de la formulación nutricional de la invención, la formulación nutricional comprende adicionalmente uno o más de hidratos de carbono, ácidos nucleicos, lípidos, minerales, nutrientes anabólicos, vitaminas, antioxidantes, cepas bacterianas probióticas y agentes lipotrópicos.

Estos compuestos adicionales de la formulación nutricional de la invención se añaden preferiblemente con el fin de proporcionar el valor nutricional de la formulación nutricional descrita anteriormente en el presente documento. También pueden añadirse preferiblemente con el fin de proporcionar una nutrición completa, una energía sostenida óptima y/o una formulación nutricional anabólica. Los ejemplos no limitativos de lípidos incluyen aceite de coco, aceite de soja y mono-y diglicéridos. Hidratos de carbono a modo de ejemplo son, por ejemplo, glucosa, lactosa comestible y almidón de maíz hidrolizado. Ejemplos no limitativos de minerales y vitaminas son calcio, fósforo, potasio, sodio, cloro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, zinc, selenio, yodo, y las vitaminas A, E, D, C, y el complejo B, respectivamente. Las cepas bacterianas probióticas incluyen, por ejemplo, las bacterias del ácido láctico (LAB) y las bifidobacterias. Ejemplos de antioxidantes incluyen antioxidantes naturales tales como ácido ascórbico (AA, E300) y tocoferoles (E306), así como antioxidantes sintéticos tales como galato de propilo (PG, E310), tercbutilhidroquinona (TBHQ), hidroxianisol butilado (BHA, E320) e hidroxitolueno butilado (BHT, E321). Ejemplos no limitativos de ácidos nucleicos son ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN).

Una realización preferida adicional de la invención se refiere a la formulación nutricional de la invención, en la que la tolerancia se induce temporalmente.

El término inducción “temporal” de la tolerancia según la invención se refiere a una tolerancia inmunológica que se induce durante un periodo de tiempo limitado tras la ingesta de la formulación nutricional de la invención en un sujeto humano, que es preferiblemente un sujeto humano que tiene una alergia a la leche de vaca o que corre el riesgo de desarrollar una alergia a la leche de vaca. A este respecto, un periodo de tiempo temporal especifica que el sujeto humano no adquiere una tolerancia constante. La tolerancia temporal se refiere preferiblemente a la tolerancia inducida durante al menos medio día, tal como durante al menos un día, tal como durante al menos dos días, preferiblemente durante al menos una semana, más preferiblemente durante al menos dos semanas, incluso más preferiblemente durante al menos un mes y lo más preferiblemente durante al menos 3 meses. Según la invención, la tolerancia temporal se induce durante menos de 6 meses.

Las figuras muestran:

Figura 1

Visión general de las muestras de prueba de leche denominadas VTP1-VTP16 que se obtuvieron de diferentes proveedores y contenían fórmulas de proteínas de leche entera de vaca, parcialmente hidrolizadas, y caseína intensamente hidrolizada y proteínas del suero de la leche así como fórmulas de aminoácidos de leche de vaca así como fórmulas de aminoácidos.

Figura 2

Péptidos y proteínas sintéticas. Se enumeran el nombre de los péptidos o proteínas, sus secuencias de aminoácidos, la longitud, el pI y el peso molecular en kDa.

Figura 3

Caracterización demográfica, clínica y serológica de los individuos analizados en los ensayos de proliferación.

Figura 4

Se llevaron a cabo ensayos de proliferación con PBMC para someter a prueba la reactividad de las células T con las muestras de leche VTP1-VTP16. Se estimularon PBMC de 6 individuos no alérgicos y de 7 pacientes alérgicos a la leche de vaca con muestras de leche, con alérgenos de leche de vaca (rS1-caseína, rS2-caseína, n-caseína), con péptidos derivados de S1-caseína (S1-péptido 1, S1-péptido 6), con alérgeno de polen de abedul rBet v 1a y alérgeno de polen de césped Phl p 5-péptido 1. Se presentan los índices de estimulación.

Figura 5

Con el fin de analizar qué citocinas se inducen en PBMC por las diferentes muestras de leche (VTP1-VTP16), se realizaron análisis con Luminex en los sobrenadantes de PBMC. Se presentan el análisis de niveles de citocina (eje

y: pg/ml) en los sobrenadantes de cultivos de PBMC de 6 individuos no alérgicos (NA) y 5 pacientes alérgicos a la leche de vaca (CMA) que se habían estimulado con muestras de leche VTP1-VTP16 (1-16) o medio (17).

Figura 6

Se realizaron experimentos de tolerancia con individuos no alérgicos (AB) para mostrar que los péptidos pueden inducir tolerancia en células T de manera específica de alérgeno. Los experimentos en personas no alérgicas también pueden mostrar tolerancia porque la tolerancia se mide como una reducción de la reactividad de las células T (Ebner et al., J lmmunol 1995, vol. 154, págs. 1932-1940). Siempre que una persona no alérgica contenga células T reactivas al alérgeno, puede medirse la tolerancia al alérgeno a nivel de células T.

Se aislaron PBMC y se obtuvieron fracciones enriquecidas en células presentadoras de antígenos (APC) y células T mediante tecnología de separación MACS. Se preincubaron las fracciones de células T durante la noche con grandes cantidades de péptidos (S1-caseína péptido 1, S1-caseína péptido 2, S1-caseína péptido 3 y un péptido control, Phl p 5-péptido 1) o con un hidrolizado de suero de la leche intenso (VTP8) o un hidrolizado de suero de la leche/caseína parcial (VTP16). Al día siguiente se combinaron las células T y las APC y se estimularon con muestras de proteínas de leche entera de vaca VTP13, VTP14) o con S1-caseína intacta.

Se realizaron dos experimentos con el mismo individuo. En los paneles a y c se presentan las cuentas por minutos (cpm; que reflejan la proliferación de células T) y en los paneles b y d, los índices de estimulación (Sl).

Figura 7

Experimento de tolerancia con un individuo no alérgico (KFI) que evalúa hidrolizados de leche para determinar su capacidad para inducir tolerancia en células T. Se preincubaron fracciones de células T durante la noche con altas cantidades de base de Nutramigen™ (VTP11), hidrolizado de caseína intenso (VTP15), proteínas de suero de la leche entera de vaca (VTP14), Nutramigen™ (VTP3), péptidos sintéticos (S1-caseína péptido 4 y un péptido control Phl p 5-Pep 1), o tampón (UCO). Al día siguiente se combinaron y las células T y las APC y se estimularon con muestras de leche (VTP14, VTP1). La estimulación de las células T se facilita o bien en cuentas por minuto (cpm) o bien como índice de estimulación (SI). Se presentan las cpm de experimentos individuales y las medias de los mismos. Los datos obtenidos por medio de la estimulación con 10 g de VTP14 están resaltados.

Figura 8

Perfil de los péptidos derivados de caseína comprendidos en VTP3, VTP 11 y VTP 15 (figura 1). Se enumeran la puntuación iónica, las secuencias de aminoácidos de los péptidos, la puntuación de hidrofobicidad y la puntuación de amargor.

Los ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1:

Procedimientos experimentales

Materiales biológicos y pacientes

Se obtuvieron de diferentes proveedores las muestras denominadas VTP1-VTP16 que contenían proteínas de leche entera de vaca, parcialmente hidrolizada, intensamente hidrolizada así como formulaciones de aminoácidos. Se aisló ADNc que codifica para S1-caseína (rS1-cas) mediante inmunodeteccion de IgE a partir de una biblioteca de expresión de ADNc preparada a partir de glándulas mamarias bovinas (Schulmeister et al., J Immunol. 2009). Se expresaron alérgenos recombinantes en la cepa de Escherichia coli BL21 Codon 25 Plus (DE3)-RIPL (Stratagene, La Jolla, CA) como proteínas con etiqueta de hexahistidina y se purificaron mediante cromatografía de afinidad de Ni2+ (QIAGEN, Hilden, Alemania). Se adquirió el recombinante Bet v1 de Biomay (Viena, Austria).

Se obtuvo leche de vaca pasteurizada que contenía un 3,5% de grasa de un mercado local (NÖM, Austria, lote: 22 550 2:00) y se adquirieron proteínas de leche de vaca natural de Sigma-Aldrich (Viena, Austria).

Se obtuvo suero de conejo inmunizando conejos tres veces con rS1-cas, rS2-cas, r-cas, r-cas, r-1a, r-lg y rlf (Charles River, Kissleg, Alemania).

Se seleccionaron pacientes alérgicos a la leche de vaca según una historia de caso positivo, reacciones positivas a la prueba de pinchazo en la piel o determinación de IgE específica para extracto de leche de vaca usando el sistema ImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Suecia).

Se incluyeron como controles personas sin problema alguno tras el consumo de leche. Comprendían pacientes no alérgicos así como pacientes con alergia mediada por IgE a fuentes de alérgenos distintas de la leche.

Caracterización de las muestras de leche

Se evaluó la composición de las muestras de leche VTP1-VTP16 mediante SDS-PAGE y tinción con azul brillante de Coomassie (Biorad, Hercules, CA).

Para el análisis de inmunotransferencia, se realizaron transferencias puntuales de alícuotas de 1 g de VTP1-VTP16 sobre una membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania).Se bloquearon las tiras de nitrocelulosa con PBST (PBS, Tween 20 al 0,5% v/v) y se expusieron a sueros de pacientes alérgicos a la leche, individuos sanos o antisueros de conejo diluidos 1:10, 1:20 ó 1:2000 durante la noche a 4ºC. Se detectaron los anticuerpos IgE humanos unidos con anticuerpos anti-IgE humano marcados con 125I (IBL, Hamburgo, Alemania), diluidos 1:15, o IgG de conejo unidos con anticuerpos anti-IgG de conejo marcados con 125I (Perkin Elmer, EE.UU.) diluidos 1:2000 en PBST y se visualizaron mediante autorradiografía usando películas XOMAT de Kodak (Kodak, Austria) a -80ºC.

Se cuantificaron los niveles de endotoxina en las muestras de leche usadas en este estudio mediante el ensayo del lisado de amebocitos de Limulus (Lonza, Basilea, Suiza) con intervalo de sensibilidad de 0,1 UE/ml a -1,0 UE/ml según las instrucciones del fabricante.

Ensayos de leucemia basófila de rata (RBL)

Para la cuantificación de reacciones de tipo inmediata mediadas por anticuerpo IgE, se realizaron ensayos de liberación de mediadores de células huRBL, tal como se describió anteriormente (Schulmeister et al., J Immunol. 2009, vol. 182(11), págs. 7019-29). En resumen, se incubaron células RBL (clon RBL-703/21) transfectadas con el receptor FcRI humano con sueros de pacientes alérgicos a la leche de vaca durante la noche. Al día siguiente se lavaron las células, se añadieron 100 l de componentes de la leche (concentración: 0,3 g/ml) y se incubaron durante 1 hora a 37ºC, 7% de CO2, 95% de de humedad. Se mezclaron alícuotas de los sobrenadantes con la disolución de ensayo (ácido cítrico o citrato de sodio 0,1 M, pH 4,5 + 4-metil-umbeliferil-N-acetil--D-glucosamida 160 M) y se incubaron durante 1 hora a 37ºC, 7% de CO2, 95% de humedad. Se midió la fluorescencia con un lector de microplacas de fluorescencia y pudo calcularse la liberación específica. Se restaron los valores obtenidos con tampón solo y se consideraron positivos los valores que superaban el 5% de liberación total.

Preparación de células y ensayos linfoproliferativos

Se separaron PBMC de individuos no alérgicos y pacientes alérgicos a la leche de vaca de sangre heparinizada mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Se cultivaron las PBMC (2x105 células por pocillo) por triplicado en placas de 96 pocillos (Nunclone; Nalgen Nunc Internacional, Roskilde, Dinamarca) en 200 l de medio Ultra Culture libre de suero (UltraCulture, Lonza, Verviers, Bélgica) complementado con L-glutamina 2 mM (GIBCO, Auckland, NZ), b-mercaptoetanol 50 M (GIBCO) y gentamicina 0,1 mg/ml (GIBCO). Se incubaron las células a 37ºC en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 durante 7 días con o sin diferentes concentraciones de diversas muestras hidrolizadas. Se estimularon las células con diferentes concentraciones, 4 U de IL-2 por pocillo (Roche, Mannheim, Alemania) sirvieron como control positivo y medio solo sirvió como control negativo. Tras 6 días de incubación, se añadió a cada pocillo 0,5 mCi de 3H-timidina (GE Healthcare) durante 16 h, luego se midió la reactividad incorporada mediante recuento de centello líquido. Se expresó la proliferación como

cuentas por minuto (c.p.m.; medias de triplicados) usando un contador de centelleo Microbeta (Wallac ADL, Friburgo, Alemania). Se calculó el índice de estimulación (SI) como el cociente de c.p.m. con antígeno y el control con medio.

Análisis de los niveles de citocina en sobrenadantes

Se midieron los niveles de citocina (IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-, TNF-, GM-CSF, TGF-1, TGF-2 y TGF-3) en los sobrenadantes recogidos de cultivos de PBMC el día 6 de cultivo usando la tecnología basada en perlas fluorescentes xMAP Luminex (Luminex Corp., Austin, TX). Se llevaron a cabo los ensayos según las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Wiesbaden, Alemania), y se leyeron las señales fluorescentes en un sistema Luminex 100 (Luminex Corp.). Los límites de detección fueron de 3,2 pg/ml para IL-2, de 3,5 pg/ml para IL-4, de 1,9 pg/ml para IL-5, de 5,5 pg/ml para IL-6, de 3,1 pg/ml para IL-10, de 57 pg/ml para IL-12, de 47 pg/ml para IL13, de 2,9 pg/ml para IFN-, de 5,3 pg/ml para TNF-, de 3,3 pg/ml para GM-CSF, de 21 pg/ml para TGF-1, de 178 pg/ml para TGF-2 y de 5 pg/ml para TGF-3.

Experimentos de inducción de tolerancia

Para el experimento de inducción de tolerancia, se aislaron PBMC de donantes sanos mediante gradiente de densidad Ficoll y se separaron adicionalmente las células en dos fracciones. Se enriquecieron las células T con un kit de aislamiento de células Pan T humanas (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania), mientras que se enriquecieron las células presentadoras de antígenos con microperlas con CD3 humano (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania) mediante separación magnética de células.

Se confirmó la pureza de las fracciones celulares mediante análisis de FACS.

Se incubaron durante la noche las fracciones celulares que contenían las células T con diferentes péptidos o sólo medio a 37ºC con 5% de CO2 y 95% de humedad, se mantuvieron durante la noche las fracciones de células presentadoras de antígenos en las mismas condiciones sin ningún antígeno. Al día siguiente se lavaron tres veces las fracciones de las células T con DPBS (GIBCO) y se combinaron las fracciones de células T con las de células presentadoras de antígenos. Se cultivaron por triplicado las células (2x105 células por pocillo) en placas de 96 pocillos tal como se describió anteriormente. Se estimularon las células con diferentes concentraciones de muestras de leche, 4 U de IL-2 por pocillo o medio solo. Se realizó el cabo tal como se describió para los ensayos linfoproliferativos.

Ejemplo 2:

Resultados

Los individuos sanos no alérgicos muestran una respuesta de IgG normal pero no de IgE a los alérgenos de la leche de vaca. En los experimentos se compararon las respuestas tanto cuantitativas (proliferación) como cualitativas (es decir, citocinas) en individuos alérgicos a la leche de vaca así como en individuos sanos no alérgicos.

Los experimentos identificaron pequeños péptidos en los hidrolizados que pueden bloquear los receptores de células T y MHCII de manera que haya una proliferación limitada o ausencia de la misma cuando hay exposición posterior a alérgenos de la leche. Por tanto, los experimentos identificaron una fracción de manera que pueda inducirse una tolerancia a los alérgenos de la leche de vaca.

Otro enfoque fue mezclar células T que se han expuesto previamente a péptidos/hidrolizados en un cultivo de células T-APC que se habían preincubado y estimulado de nuevo con preparaciones de proteínas de leche entera. Esto debe demostrar la capacidad de los péptidos para inhibir/amortiguar la respuesta a una exposición a proteínas de leche entera.

Hasta ahora se han sometido a prueba 6 personas no alérgicas y 7 personas alérgicas a la leche de vaca en cuanto a las respuestas linfoproliferativas con las 16 muestras de leche de vaca así como con péptidos derivados de S1caseína y antígenos control. Los individuos no alérgicos y los pacientes alérgicos a la leche de vaca indujeron índices de estimulación comparables. Las muestras de Nutramigen™ indujeron proliferación de células T más débil en comparación con las otras muestras de leche. Las formulaciones de aminoácidos indujeron las respuestas más débiles. VTP13 y 14, identificadas mediante SDS-PAGE y análisis de espectrofotometría de masa como fuentes de proteínas intactas de leche de vaca, sirvieron como controles para experimentos de tolerancia, porque indujeron fuertes respuestas linfoproliferativas. Se analizaron los sobrenadantes de cultivos de 11 de los individuos sometidos a prueba en cuanto a la secreción de 13 citocinas mediante análisis de Luminex. Estos resultados son extremadamente interesantes y sorprendentes por dos razones: En primer lugar, el análisis de los niveles de citocinas mostró que las citocinas que impulsan la diferenciación de Th2 (GM-CSF, IL-5 e IL-13) y las citocinas proinflamatorias(IL-6, TNF-alfa e IFN-gamma) se inducen en pequeñas cantidades por las muestras de Nutramigen™ VTP3, 4, 11, 12, 15). En contraposición, se halló una fuerte inducción de citocinas pro-inflamatorias (por ejemplo, IFN-gamma, TNF-alfa, IL-6) en las muestras VTP2, VTP5 y VTP14 que están solo parcialmente hidrolizadas o contienen proteínas intactas. En particular, la inducción de IFN-gamma parece problemática porque existe evidencia de que IFN-gamma puede dañar las células epiteliales. Las cantidades de citocinas secretadas estuvieron en el mismo intervalo en experimentos realizados con individuos no alérgicos y con individuos alérgicos, a excepción de

IFN-gamma, que regulado por incremento más fuertemente en individuos no alérgicos.

Determinados péptidos derivados de leche de vaca (por ejemplo alfa S1 caseína) inducen proliferaciones de células T en PBMC. Puesto que cualquier péptido reactivo con células T también puede inducir tolerancia en células T en determinadas condiciones (por ejemplo, unión al receptor de células T sin coestimulación apropiada, presencia de grandes cantidades de péptidos reactivos con células T en la infancia) se supone que pueden usarse péptidos reactivos con células T derivados de alfaS1-caseína para la inducción de tolerancia para identificar péptidos reactivos con células T adicionales. Con respecto a esto, se demostró actividad tolerogénica de los péptidos derivados de alfa S1-caseína que se generarán de manera sintética. Se dividieron PBMC de personas reactivas en una fracción de células T y una fracción reducida en células T (perlas acopladas anti-CD3) que contenía las APC. Se preincubó la fracción de células T con los péptidos derivados de caseína y los péptidos control (alérgeno de polen de césped Bet v1, péptidos derivados de Phl p 5), se lavó y luego se expuso la fracción de APC con los péptidos. Usando este ensayo fue posible demostrar la actividad tolerogénica específica de la leche de estos péptidos derivados de caseína.

En un esfuerzo por buscar péptidos tolerogénicos, se establecieron satisfactoriamente las condiciones de cultivo. En una etapa siguiente, se identificó un péptido candidato derivado de S1-caseína que mostró en dos experimentos independientes una supresión de respuestas de células T. Cuando se añadió el péptido 3 derivado de alfaS1caseína a una fracción de células T aislada, suprimió la proliferación en la fracción combinada de células T-APC cuando se estimuló de nuevo con concentrado de proteínas de suero de la leche VTP14 o S1-caseína. Se obtuvo un resultado similar para el péptido 4. Además, se estudiaron los posibles efectos supresores de los hidrolizados de caseína VTP3 (Nutramigen™), VTP11, VTP14 y VTP15 en la proliferación inducida por proteínas de leche entera de vaca y se encontró que en una preincubación particular con Nutramigen™ (VTP3) podía inducir tolerancia.

Lista de secuencias

<110> Mead Johnson & Company

<120> FORMULACIÓN NUTRICIONAL QUE COMPRENDE UN HIDROLIZADO QUE CONTIENE PÉPTIDOS DE LECHE DE VACA Y/O PÉPTIDOS DERIVADOS DEL MISMO PARA LA INDUCCIÓN DE TOLERANCIA

<130> R3074 EP

<160> 12

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 32

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 1

<210>2

<211> 33

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 2

<210> 3

<211> 36

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 3

<210> 4

<211> 34

<212> PRT

<213> Bos taurus

10 <400> 4

<210> 5

<211> 35

<212> PRT 15 <213> Bos taurus

<400> 5

<210> 6

<211> 33 20 <212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 6

<210> 7

<211> 205

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 7

<210> 8

<211> 213 <212> PRT 10 <213> Bos taurus

<400> 8

<210> 9

<211> 159

<212> PRT

<213> Betula verrucosa

<400> 9

<210> 10

<211> 32

<212> PRT

<213> Phleum pratense

<400> 10

<210> 11 10 <211> 199

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 11

<210> 12

<211> 207

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 12

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Formulación nutricional o complemento que comprende un hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados y/o una fracción que contiene péptidos del hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados y/o uno o más péptidos que contienen epítopos de

   5 células T aislados del hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados para su uso en la inducción de tolerancia a la leche de vaca, a una proteína contenida en la leche de vaca o a un alérgeno contenido en la leche de vaca en un sujeto humano, en el que dichos péptidos contenidos en el hidrolizado o la fracción de hidrolizado comprenden péptidos que contienen epítopos de células T o en el que dicho uno o más péptidos son péptidos que contienen epítopos de células T, en el que dichos péptidos

   10 que contienen epítopos de células T pueden dirigir la reacción inmunitaria tras la ingesta de la formulación nutricional hacia la tolerancia y en el que el hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados comprende menos del 1% de péptidos con un tamaño mayor de 1,5 kD.
2. 2. Formulación nutricional o complemento según la reivindicación 1, en el que el uno o más péptidos tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y/o 4.

   15 3. Formulación nutricional o complemento según la reivindicación 1, en el que el hidrolizado que contiene péptidos de leche de vaca intensamente hidrolizados es un hidrolizado que contiene caseína bovina intensamente hidrolizada.

3. 4. Formulación nutricional o complemento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el sujeto humano es un niño o un adolescente.

   20 5. Formulación nutricional o complemento según las reivindicaciones 1 a 3, en el que el sujeto humano es un adulto.

4. 6.

   Formulación nutricional o complemento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el sujeto humano tiene una alergia a la leche de vaca.

5. 7.

   Formulación nutricional o complemento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la

   25 formulación nutricional comprende adicionalmente uno o más de hidratos de carbono, ácidos nucleicos, lípidos, minerales, nutrientes anabólicos, vitaminas, antioxidantes, cepas bacterianas probióticas y agentes lipotrópicos.
6. 8. Formulación nutricional o complemento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la tolerancia se induce temporalmente.

   30 9. Formulación nutricional o complemento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que los péptidos consisten en aproximadamente de 5 a 50 aminoácidos.
7. 10. Formulación nutricional o complemento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que los péptidos que contienen epítopos de células T pueden regular por disminución las citocinas inflamatorias tras la ingesta de la formulación nutricional.