ES2521740T3 - Cofactores, dadores y aceptores de ligasa modificados químicamente - Google Patents

Abstract

Un método para detectar una mutación en un ácido nucleico diana, dicho método comprendiendo: incubar dicho ácido nucleico diana en una mezcla de reacción comprendiendo una ligasa de ácido nucleico dependiente de un cofactor, un cofactor de ligasa ATP modificado, un polinucleótido dador y un polinucleótido aceptor, en el que uno o más de dichos cofactores de ligasa ATP, polinucleótido dador y polinucleótido aceptor están modificados; y supervisar la ligadura de los polinucleótidos dador y aceptor, donde la cantidad de ligadura es indicativa de la presencia o la ausencia de la mutación y donde la presencia del cofactor de ligasa ATP modificado mejora la especificidad de ligadura en relación con el cofactor de ligasa ATP no modificado correspondiente.

Description

Cofactores, dadores y aceptores de ligasa modificados químicamente

REFERENCIA CRUZADA CON LA APLICACIÓN RELACIONADA

[0001] Esta aplicación de patente reivindica prioridad sobre la publicación estadounidense Num. 2011/0008788, titulada “Chemically Modified Ligasa Cofactors, Donors and Acceptors”, presentada el 6 de julio de 2009.

DECLARACIÓN DE APOYO GUBERNAMENTAL

[0002] El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la presente invención de conformidad con la Subvención Núm. GM085860 concedida por el Instituto Nacional de Ciencia Médica General.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0003] Se proporcionan aquí métodos y composiciones para ligar ácidos nucleicos. En aspectos y modos de realización particulares, los métodos y composiciones mejoran la especificidad de ligasa entre los ácidos nucleicos diana emparejados y los mal emparejados y/o reducen o inhiben la ligadura independiente del molde utilizando cofactores, dadores y aceptores de ligasa modificados y combinaciones de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0004] Se proporciona la siguiente descripción para ayudar al entendimiento del lector. Ninguna información proporcionada o ninguna referencia citada se admiten como técnica anterior a la presente invención.

[0005] Las ligasas de ácido nucleico pertenecen a una clase de enzimas que catalizan la formación de enlace fosfodiéster entre los extremos adyacentes 3’-hidroxil y 5’-fosforil en ácido nucleico (p.ej., ARN o ADN) en presencia de un cofactor, como ATP o NAD+. Las ligasas se emplean en un número de aplicaciones de biología molecular incluyendo la detección de secuencia de ácido nucleico, detección de polimorfismo de nucleótido simple (SNP), detección de proteína, secuenciación por ligadura y reacción en cadena de ligasa (LCR).

[0006] En experimentos de fidelidad bioquímica, se ha descubierto que las ADNligasas toleran una variedad de malos emparejamientos del sustrato de ácido nucleico. Por ejemplo, T4 ADNligasa tiene una tolerancia de malos emparejamientos que resulta en una propensión para sellar una de cada 103 dobles hélices mal emparejadas. Showalter, A. K., et al., 106 Chem. Rev, 340-360 (2006). En comparación, la tasa de error de una ADNpolimerasa convencional es aproximadamente un error por cada 105-106 inserciones dNTP, varios órdenes de magnitud más altos en fidelidad que la ligasa. Otras reacciones de enlace atípicas de la ADNligasa incluyen la formación de enlaces intermoleculares (Western, L., et al., 19 Nucleic Acids Res, 809-813 (1991)), uniones de dobles hélices de extremo no afilado que no se solapan (Barringer, K., et al., 89 Gene, 117-122 (1990), Cao, W., 22 Trends Biotechnol., 38-44 (2004)) y reacciones independientes a el molde (Barringer, K., et al., Kuhn, H., et al., 272 FEBS J, 5991-6000 (2005)).

[0007] Se han descrito varios enfoques para mejorar la fidelidad de ADN ligadura. Por ejemplo, Luo, J., et al., 24 Nucleic Acids Res, 3079-3085 (1996) publica modificar el tercer nucleótido anterior a partir de 3’-OH, un aceptor con base universal 3-nitropirrol y una mutagénesis dirigida al sitio de la proteína ligasa. Tong, J., et al., 27 Nucleic Acids Res, 788-794 (1999); Feng, H., et al., 43 Biochemistry, 12648-12659 (2004); Jeon, H., et al., 237 FEMS Microbiol Lett., 111-118 (2004); Lim, J., et al., 388 Arch Biochem Biophys., 253-260 (2001); y Luo, J., et al., 24 Nucleic Acids Res, 3071-3078 (1996) publican residuos de amino ácido mutando en la ADNligasa. Cao, W., 22 Trends Biotechnol., 38-44 (2004) publica utilizar una endonucleasa en la reacción de ligadura. Egholm, M., et al., Patente Estadounidense Núm. 6,297,016 publica modificaciones de aceptor. Fung, S., et al., Patente Estadounidense Núm. 5,593,826 publica sondas de aceptor substituido 3’-NH2. Bandaru, R., et al., patentes estadounidenses nums. 6,811,986 y 6,635,425 publican el uso de 5’-tiofosfatos en la hebra del dador (5’-fosfato).

[0008] Los cofactores de ligasa modificados se han utilizado para determinar la dependencia del cofactor de ligasa y como inhibidores de ligadura. Véase p.ej., Montecucco, A., et al., 271 Biochem J., 265-268 (1990); Shuman, S., 34 Biochemistry, 16138-16147 (1995); Raae, A., et al., 81 Biochem. Biophys. Res. Commun., 24-27 (1978); Cherepanov, A.V., et al., 269 Eur. J. Biochem., 5993-5999 (2002); Belford, H.G., et al., 268 J Biol Chem, 2444-2450 (1993); Doherty, A.J., et al., 271 J Biol Chem, 11083-11089 (1996); Ho, C.K., et al., 71 J Virol, 19311937 (1997); Lai, X., et al., 6

[0009] M. Zirvi et al. (Nucleic Acid Research 27:e41-47, 1999) estudió la fidelidad de las ligasas termoestables para la detección de secuencia repetida de microsatélite utilizando secuencias de oligonucleótido que contienen análogos a las bases nitrogenadas.

[0010] J. Luo et al. (Nucleic Acid Research 24:3071-3078, 1996) publica el desarrollo de un ensayo cuantitativo para medir la fidelidad de la Tth ADN ligasa utilizando sustratos marcados con fluorescentes. Esta investigación descubrió que la enzima muestra una discriminación mayor contra todos los malos emparejamientos de base única del lado 3’ de la mella en comparación con aquellas del lado 5’ de la mella. La investigación destacó que la fidelidad de la enzima podría ser mejorada adicionalmente introduciendo una base mal emparejada o un análogo a la base nitrogenada universal (Q) en la tercera posición del oligonucleótido discriminante.

[0011] Zirvi et al. y Luo et al. demuestran mejoras en la fidelidad de ADNligasa que son, en el mejor de los casos, 100 veces mejores (desde 4.5x102 hasta 4,2x104) según se describe en Luo et al., indicando que no existe espacio para que la mejora alcance la fidelidad de las ADN polimerasas.

[0012] Shuman (Biochemistry 34(49): 16138-16147, 1995) publica la especificidad, fidelidad e inhibición de la ADN ligasa vaccinia virus. Esta investigación descubrió que la vacuna ligasa catalizaba la hebra eficiente uniendo el ADN con mellas (rupturas del enlace entre dos nucleótidos vecinos) en presencia de magnesio y ATP. Extremophiles, 469-477 (2002); y Sriskanda, V., et al., 28 Nucleic Acids Res, 2221-2228 (2000).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0013] Aquí se proporcionan métodos y composiciones para la ligadura de ácido nucleico. Estos métodos incluyen el uso de ligasa de ácido nucleico, sustratos de ácido nucleico, cofactores, dadores o aceptores de ligasa, en reacciones de ligadura del ácido nucleico. En ciertos aspectos, los métodos se obtienen utilizando cofactores de ligasa modificados, dadores modificados, aceptores modificados o combinaciones de los mismos (denominados colectivamente aquí como “componentes de ligasa modificados”), que proporcionan una fidelidad mejorada en la ligadura de ácido nucleico. En modos de realización preferidos, los cofactores de ligasa modificados son ATP modificado y NAD+ modificado.

[0014] De acuerdo con un aspecto, se proporcionan métodos para detectar una mutación en un ácido nucleico diana. En ciertos modos de realización de los aspectos aquí proporcionados, el método incluye incubar el ácido nucleico diana en una mezcla de reacción que incluye una ligasa de ácido nucleico dependiente de un cofactor, un cofactor de ligasa, un polinucleótido dador y un polinucleótido aceptor, donde uno o más de entre el cofactor de ligasa, polinucleótido dador y polinucleótido aceptor están modificados; y para supervisar la ligadura de los polinucleótidos dador y aceptor, donde la cantidad de ligadura es indicativa de la presencia o ausencia de la mutación.

[0015] En un segundo aspecto, se proporcionan métodos para detectar la presencia o ausencia de una de las bases alternativas en un sitio de polimorfismo de un único nucleótido (SNP) en un ácido nucleico diana. En ciertos modos de realización de los aspectos aquí proporcionados, el método incluye incubar el ácido nucleico diana en una mezcla de reacción que incluye una ligasa ácido nucleico dependiente del cofactor, un cofactor de ligasa, un polinucleótido dador y un polinucleótido aceptor, donde uno o más de entre el cofactor de ligasa, el polinucleótido dador y el polinucleótido aceptor están modificados; y para supervisar la ligadura de los polinucleótidos dador y aceptor, donde la cantidad de ligadura indica la presencia o ausencia de una de las bases alternativas en el polimorfismo de un único nucleótido (SNP) en el ácido nucleico diana.

[0016] En un tercer aspecto, se proporcionan métodos para distinguir la presencia de una primera secuencia de ácido nucleico o de una segunda secuencia de ácido nucleico en un ácido nucleico diana. En ciertos modos de realización de los aspectos aquí proporcionados, los métodos incluyen incubar el ácido nucleico diana en una mezcla de reacción incluyendo una ligasa ácido nucleico dependiente del cofactor, un cofactor ligasa, un polinucleótido dador y un polinucleótido aceptor, donde uno o más de entre el cofactor de ligasa, el polinucleótido dador y el polinucleótido aceptor están modificados; y para supervisar la ligadura de los polinucleótidos dador y aceptor, donde la presencia o cantidad de ácido nucleico ligado es indicativa de la presencia o cantidad de la primera secuencia de ácido nucleico en el ácido nucleico diana y/o la ausencia de la segunda secuencia de ácido nucleico en el ácido nucleico diana; y la ausencia de ligadura es indicativa de la ausencia de la primera secuencia de ácido nucleico en el ácido nucleico diana.

[0017] En un cuarto aspecto, se proporcionan métodos que determinan la presencia o ausencia de un nucleótido particular en una posición específica de un ácido nucleico diana. En ciertos modos de realización de los aspectos aquí proporcionados, los métodos incluyen incubar el ácido nucleico diana en una mezcla de reacción que incluye una ligasa de ácido nucleico dependiente del cofactor, un cofactor ligasa, un polinucleótido dador y un polinucleótido aceptor, donde uno o más de entre el cofactor de ligasa, el polinucleótido dador y el polinucleótido

dador están modificados; y supervisar la ligadura de los polinucleótidos dador y aceptor, donde la presencia de un ácido nucleico ligado es indicativa de la presencia del nucleótido particular en la posición especificada del ácido nucleico diana y la ausencia de ligadura es indicativa de la ausencia del nucleótido particular en la posición especificada del ácido nucleico diana.

5 [0018] En un quinto aspecto, se proporcionan kits que incluyen las composiciones proporcionadas aquí y kits para llevar a cabo los métodos aquí proporcionados. También se proporcionan los kits que incluyen componentes de ligadura modificados para llevar a cabo la ligadura según se describe aquí. Por ejemplo, los kits pueden contener enzima ligasa y cofactores modificados para detectar dianas de ácido nucleico comunes como productos de alelo específico. El kit que contiene un componente de ligadura modificado puede incluir un

10 recipiente marcado para la ligadura de ácido nucleico, instrucciones para elaborar la ligadura de ácido nucleico y/o uno o más reactivos seleccionados del grupo que consiste en un cofactor modificado, ligasa de ácido nucleico y un tampón de reacción. El kit que contiene un componente de ligadura modificado también puede incluir uno o más poliucleótidos dador y aceptor. En un modo de realización, los polinucleótidos dador y aceptor modificados se modifican. Los kits pueden incluir un recipiente marcado para la ligadura de ácido nucleico,

15 instrucciones para realizar la ligadura de ácido nucleico y al menos un componente de ligadura modificada y/o uno o más reactivos seleccionados del grupo que consiste en un cofactor de ligasa, una ligasa de ácido nucleico, magnesio, secuencia de dador, secuencia de aceptor y tampón de reacción.

[0019] En un sexto aspecto, también se proporcionan aquí los métodos para identificar los componentes de ligadura modificados para elaborar la ligadura según se describe aquí. En algunos modos de realización, los 20 métodos identifican un cofactor modificado que ha aumentado la especificidad relativa al componente de ligadura natural u otros componentes de ligadura modificados. Por ejemplo, los métodos pueden evaluar la realización de un cofactor modificado en la presencia de un molde emparejada o mal emparejada. En algunos modos de realización, la región mal emparejada hibridará en la sonda de dador y en otros modos de realización, la región mal emparejada hibridará en la sonda de aceptor. En algunos modos de realización la elaboración de un cofactor 25 modificado será evaluada para la reducción o inhibición de la actividad de ligadura en ausencia de un molde de ácido nucleico. En algunos modos de realización, los métodos identifican un componente de ligadura modificado que ha mejorado la especificidad de ligadura relativa al cofactor natural o sin modificar. En algunos modos de realización, los métodos permiten la identificación de un componente de ligadura modificado cuyo uso proporciona una velocidad de ligadura similar relativa al cofactor natural o sin modificar para un ácido nucleico 30 emparejado. En otros modos de realización, los métodos permiten la identificación de un componente de ligadura modificado que ha mejorado la especificidad de ligadura en presencia de un ácido nucleico mal emparejado relativo al cofactor natural o sin modificar. En otros modos de realización adicionales, los métodos evalúan un componente de ligadura modificado para la producción o cantidad de ligadura donde existe uno o más pares de bases mal emparejados en el enlace de ligadura o entre 10 bases del enlace de ligadura. En modos de 35 realización adicionales, los métodos evalúan un componente de ligadura modificado para la habilidad de reducir

o inhibir la ligadura en ausencia de un molde de ácido nucleico.

[0020] En un séptimo aspecto, se proporcionan métodos para reducir o inhibir la ligadura en ausencia de un ácido nucleico diana. En ciertos modos de realización de los aspectos aquí proporcionados, el método incluye incubar el ácido nucleico diana en una mezcla de reacción incluyendo una ligasa de ácido nucleico dependiente

40 de un cofactor, un cofactor ligasa, un polinucleótido dador y un polinucleótido aceptor, donde uno o más de entre el cofactor de ligasa, el polinucleótido dador y el polinucleótido aceptor están modificados, donde la presencia del componente de ligadura modificado inhibibe o reduce la ligadura en ausencia del ácido nucleico diana.

[0021] En algunos modos de realización de las composiciones y métodos aquí proporcionados se incluyen componentes de ligadura modificada, particularmente cofactor de ligasa modificado, aceptor modificado, dadores

45 modificados y combinaciones de los mismos. En modos de realización particulares, los componentes de ligadura modificados incluyen aquellos según se muestra en las Fórmulas I-III descritas aquí con más detalle.

[0022] Los componentes de ligadura modificada de los métodos y composiciones proporcionadas aquí tienen ventajas significativas. Por ejemplo, un usuario final puede utilizar los mismos protocolos de ligadura o similares y métodos ya en uso con cofactores modificados/naturales (es decir, ATP y NAD+), sondas de dador sin modificar

50 o sondas de aceptor sin modificar. Los componentes de ligadura modificados de los métodos y composiciones aquí proporcionadas son compatibles con los sistemas de ligadura y reactivos existentes; no se necesitan enzimas ni reactivos adicionales pero pueden utilizarse.

[0023] Los componentes de ligadura modificados de los métodos y composiciones aquí proporcionados preferiblemente tienen al menos aproximadamente la misma eficacia para la ligadura de ácido nucleico en 55 presencia de un objetivo complementario en comparación con el componente de ligadura sin modificar. Preferiblemente, la ligadura en presencia de ácido nucleico diana complementario o mal emparejado se considera deteriorada cuando un componente de ligadura modificado es al menos un 50% menos eficaz que un reactivo en una reacción de ligadura comparado con su componente correspondiente de ligadura sin modificar,

preferiblemente al menos un 60% menos eficaz, preferiblemente al menos un 70% menos eficaz, más preferiblemente al menos un 80% menos eficaz, más preferiblemente al menos un 90% menos eficaz, más preferiblemente al menos un 95% menos eficaz, más preferiblemente al menos un 99% menos eficaz y lo más preferiblemente un 100% menos eficaz como reactivo en una reacción de ligadura que su componente

5 correspondiente de ligadura sin modificar. Alguien con un conocimiento general de la técnica es capaz de determinar fácilmente el nivel de actividad y eficacia de ligadura del componente de ligadura modificado.

[0024] Los componentes de ligadura modificados de los métodos y composiciones aquí proporcionados preferiblemente no tienen, o tienen reducida, eficacia para la ligadura de ácido nucleico en presencia de una diana mal emparejada en comparación con el componente de ligadura sin modificar.

10 [0025] Según se utiliza aquí, la expresión “cofactor ligasa” hace referencia a un compuesto químico que interactúa con una ligasa para que el ϵ-amino grupo de lisina de la ligasa ataque el fosfato alfa (es decir, el fosfato directamente unido al 5’ oxígeno del componente de adenosina) del cofactor (p.ej., ATP o NAD+) para formar una enlace covalente de fosforamidato (p.ej., según se muestra en la Fig.1). En ciertos modos de realización, el cofactor de ligasa es ATP, NAD+ o GTP. Generalmente las ligasas dependen de ATP o de NAD+.

15 [0026] Según se utiliza aquí, la expresión “cofactor de ligasa modificado” hace referencia a un cofactor de ligasa con un grupo de sustitución unido. En modos de realización preferidos, el cofactor de ligasa modificado es ATP modificado o NAD+ modificado. En algunos modos de realización, un cofactor de ligasa modificado tiene más de un grupo de sustitución. Los cofactores modificados incluyen aquellos mostrados aquí, por ejemplo, en la Fórmula I. En ciertos modos de realización, el cofactor de ligasa modificado no es ATP-αS (es decir, 5’-α-thio

20 adenosín trifosfato), ATP-γS (es decir, 5’-[γ-tio]-trifosfato) ni AMP-PNP (es decir, 5’-[β,γ-imido]-trifosfato).

[0027] Según se utiliza aquí, la expresión “cofactor de ligasa sin modificar” o “cofactor de ligasa natural” en relación con un “cofactor de ligasa modificado” hace referencia al cofactor de ligasa correspondiente sin el grupo de sustitución. Por ejemplo, un cofactor de ligasa sin modificar relativo al ATP modificado es ATP.

[0028] Según se utiliza aquí, la expresión “dador”, “polinucleótido dador”, “polinucleótido dador 5’-fosforilado” o

25 “sonda dador” hace referencia a un polinucleótido con un 5’ fosfato capaz de ser ligado a un aceptor. Un dador puede ser adecuado para la ligadura cuando se hibrida muy cerca de un aceptor o de un ácido nucleico diana complementario en condiciones adecuadas para una ligadura de ácido nucleico; preferiblemente un aceptor y un dador hibridan adyacentes el uno al otro en un ácido nucleico diana complementario. En algunos modos de realización, un dador tiene al menos un sitio de ácido nucleico que no es complementario (mal emparejado) con

30 un ácido nucleico diana. En modos de realización particulares, el mal emparejamiento se da en un nucleótido de interés (p.ej., sitio SNP). Los polinucleótidos alternativos adecuados adicionales para los métodos y composiciones aquí proporcionados incluyen, sin carácter limitativo, ribonucleótidos modificados, desoxirribonucleótidos modificados, oligonucleótidos en la cadena fosfato-azúcar modificados, análogos a nucleótidos y mezclas de los mismos. En modos de realización preferibles, el dador es un oligonucleótido. Según

35 se utiliza aquí, la expresión “dador modificado”, “polinucleótido dador modificado” o “sonda dador modificado” hace referencia a un dador con un grupo de sustitución. Preferiblemente, el grupo de sustitución está muy cerca del enlace de ligadura (p.ej., 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos posterior al enlace de ligadura). En modos de realización preferidos, el grupo de sustitución está en la posición 2’ de la ribosa y/o uno o más fosfatos internucleótidos. En algunos modos de realización, un dador modificado tiene más de un grupo de sustitución. Los dadores

40 modificados incluyen aquellos aquí descritos, por ejemplo, en la Fórmula III.

[0029] Según se utiliza aquí, la expresión “aceptor”, “polinucleótido aceptor”, “polinucleótido aceptor acabado en 3’-hidroxil” o “sonda aceptor” hace referencia a un polinucleótido con un grupo 3’ OH capaz de ligarse a un dador. Un aceptor puede ser adecuado para la ligadura cuando hibrida muy cerca de un dador en un ácido nucleico diana complementario en condiciones adecuadas para la ligadura de ácido nucleico; preferiblemente un aceptor 45 y un dador hibridan adyacentes el uno al otro sobre un ácido nucleico diana complementario. En algunos modos de realización, un aceptor tiene al menos un sitio de ácido nucleico que no es complementario (mal emparejado) al ácido nucleico diana. En modos de realización particulares, el mal emparejamiento es en un nucleótido de interés (p.ej., sitio SNP). Los polinucleótidos alternativos adicionales adecuados para los métodos y composiciones aquí proporcionados incluyen, sin carácter limitativo, ribonucleótidos modificados, 50 deoxiribonucleótidos modificados, oligonucleótidos en la cadena fosfato-azúcar modificados, nucleótidos análogos y mezclas de los mismos. En modos de realización preferidos, el aceptor es un oligonucleótido. Según se utiliza aquí, la expresión “aceptor modificado”, “polinucleótido aceptor modificado” o “sonda aceptor modificado” hace referencia a un aceptor con un grupo de sustitución. Preferiblemente, el grupo de sustitución está muy cerca de la unión de ligadura (p.ej., 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos hacia arriba de la unión de ligadura. En

55 modos de realización preferidos, el grupo de sustitución está en la posición 2’ de la ribosa y/o uno o más fosfatos internucleótidos. En algunos modos de realización, un aceptor modificado tiene más de un grupo de sustitución. Los aceptores modificados incluyen aquellos mostrados aquí, por ejemplo, en la Fórmula II.

[0030] Según se utiliza aquí, la expresión “grupo de sustitución” hace referencia a cualquier fracción química que pueda unirse a un cofactor, dador o aceptor de ligasa. El grupo de sustitución puede unirse en ubicaciones que incluyen pero no se limitan al fosfato, azúcar, trifosfato, fracción de base nucleotídica y enlace internucleótido. El grupo de sustitución puede ser un grupo de cualquier naturaleza compatible con el proceso de ligadura de ácido 5 nucleico. El grupo de sustitución puede ser un grupo de cualquier naturaleza compatible con el proceso de ligadura de ácido nucleico. En modos de realización preferidos, el grupo de sustitución aumenta la especificidad

o fidelidad de la ligadura de ácido nucleico (p.ej., la habilidad para ligar ácido nucleico complementario y no ligar,

o reducir la ligadura de ácido nucleico no complementario) cuando se une a un cofactor ligasa, polinucleótido dador o polinucleótido aceptor. En modos de realización preferidos, el grupo de sustitución cuando se une a un 10 cofactor ligasa, polinucleótido dador o polinucleótido aceptor reduce, inhibe o elimina la ligadura de ácido nucleico no complementario en comparación con la ligadura en ausencia del grupo de sustitución. En modos de realización preferidos, el grupo de sustitución cuando se une a un cofactor ligasa, polinucleotido dador o polinucleotido aceptor reduce, inhibe o elimina la ligadura de ácido nucleico no complementario en comparación con la ligadura de ácido nucleico complementario. En modos de realización preferidos, cuando el grupo de 15 sustitución se une a un cofactor ligasa, polinucleotido dador o polinucleotido aceptor reduce, inhibe o elimina la ligadura en ausencia del molde. En un modo de realización, el grupo de sustitución puede incluir una marca detectable. Así, siguendo la ligadura, un ácido nucleico marcado puede identificarse por tamaño, masa, afinidad de captura y/o color. Las marcas detectables incluyen, sin carácter limitativo, cromóforos, fracciones fluorescentes, enzimas, antígenos, metales pesados, sondas magnéticas, tintes, grupos fosforescentes,

20 materiales radioactivos, fracciones quimioluminiscentes y fracciones que detectan la electroquímica. La marca detectable es preferiblemente un tinte fluorescente; una marca de captura de afinidad preferible es el biotin.

[0031] Según se utiliza aquí, la expresión “componentes de ligadura modificados” hace referencia a cofactores de ligasa modificados, aceptores modificados y dadores modificados hace referencia a cada componente de manera individual, colectiva o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, los componentes de ligadura

25 modificados pueden hacer referencia sólo a cofactores ligasa modificados; cofactores de ligasa modificados con un tipo de modificación; cofactores de ligasa modificados con más de un tipo de modificación; cofactores de ligasa modificados y dadores modificados; cofactores de ligasa modificados y aceptores modificados; o cofactores de ligasa modificados, aceptores de ligasa modificados y dadores de ligasa modificados.

[0032] Según se utiliza aquí, la expresión “ligadura” o “ligar” hace referencia a métodos conocidos en la técnica

30 para unir polinucleótidos. La ligadura preferiblemente se refiere al enlace del extremo 3’ de un polinucleótido aceptor con el extremo 5’ de un polinucleotido dador. En algunos modos de realización, una mella en el doble ácido nucleido está ligada para formar un enlace de fosfodiester o un enlace internucleótido equivalente, formando así una copia más larga complementaria de la secuencia molde de ácido nucleico. Un doble ácido nucleico con mella consiste en un oligonucleotido aceptor terminado en hidroxil 3’ hibridado en un molde de ácido

35 nucleico complementario, con un oligonucleótido dador fosforilado 5’ hibridado inmediatamente hacia debajo de un oligonucleótido aceptor. La ligadura que incluye las composiciones y métodos proporcionados aquí puede emplear uno o más cofactores modificados, uno o más polinucleótidos dadores modificados y aceptores modificados con uniones de ácido nucleico ligasa. La ligadura de sondas dador y aceptor sobre un ácido nucleico diana pueden ocurrir con o sin la renovación de sondas ligadas. Preferiblemente, la ligadura ocurre con la

40 renovción. Un molde de ácido nucleico puede ser ADN, ARN, ADNc, ANP, ANB y/o un molde de ácido nucleico modificado u cualquier combinación de los mismos. Mientras los métodos ejemplares descritos de aquí en adelante hacen referencia a la ligadura, existen numerosos métodos adicionales adecuados para los métodos y composiciones aquí proporcionados conocidos en la técnica para la ligadura enzimática de ácidos nucleicos. Según se utiliza aquí el término “enlace de ligadura” hace referencia a dos posiciones adyacentes de ácido

45 nucleico a lo largo de un molde donde una sonda de dador y una sonda de aceptor están ligadas.

[0033] Según se utiliza aquí, la expresión “ligasa” o “ácido nucleico ligasa” hace referencia a una enzima que es capaz de ligar ácido nucleico. Preferiblemente una ligasa es capaz de ligar el extremo 3’ de un polinucleotido aceptor al extremo 5’ de un polinucleotido dador. En otros modos de realización, la doble hélice con mella puede contener ADN, ARN, ADNc, ANP, ANB y/u otros nucleósidos modificados, o cualquier combinación de los 50 mismos. En algunos modos de realización, la ligasa es uno de los siguientes: bacteriófago T4 ADNligasa, Escherichia coli (E. coli) ADNligasa, Aquifex aeolicus ADNligasa, Thermus aquaticus (Taq) ADNligasa, 9°N™ ADNligasa, Methanobacterium thermoautotrophicum ARN ligasa, Ferroplasma acidiphilum ADNligasa, ADNligasa humano I, ADNligasa humano II, ADNligasa humano III, ADNligasa humano IV, Vaccinia virus ADNligasa, Chlorella virus ADNligasa, Pyrococcus furiosis ADNligasa, Haloferax volcanii ADNligasa, Acidianus ambivalens 55 ADNligasa, Archaeoglobus fulgidus ADNligasa, Aeropyrum pernix ADNligasa, Cenarcheon symbiosum ADNligasa, Haloarcula marismortui ADNligasa, Ferroplasma acidarmanus ADNligasa, Natronomonas pharaosis ADNligasa, Haloquadratum walsbyi ADNligasa, Halobacterium salinarum ADNligasa, Methanosarcina acetivorans ADNligasa, Methanosarcina barkeri ADNligasa, Methanococcoides burtonii ADNligasa, Methanospirillum hungatei ADNligasa, Methanocaldococcus jannaschii ADNligasa, Methanopyrus kandleri ADNligasa, 60 Methanosarcina mazei ADNligasa, Methanococcus maripaludis ADNligasa, Methanosaeta thermophila ADNligasa, Methanosphaera stadtmanae ADNligasa, Methanothermobacter thermautotrophicus ADNligasa,

Nanoarchaeum equitans ADNligasa, Pyrococcus abyssi ADNligasa, Pyrobaculum aerophilum ADNligasa, Pyrococcus horikoshii ADNligasa, Picrophilus torridus ADNligasa, Sulfolobus acidocaldarius ADNligasa, Sulfolobus shibatae ADNligasa, Sulfolobus solfataricus ADNligasa, Sulfolobus tokodaii ADN ligasa, Thermoplasma acidophilum ADNligasa, Thermococcus fumicolans ADNligasa, Thermococcus kodakarensis 5 ADNligasa, Thermococcus sp. NA1 ADNligasa, Thermoplasma volcanium ADNligasa, Staphylococcus aureus DNA ligasa, Thermus scotoductus NAD+-ADNligasa, T4 ARN ligasa, Staphylococcus aureus ADNligasa, Methanobacterium thermoautotrophicum ADNligasa, Thermus species AK16D ADNligasa, Haemophilus influenzae ADNligasa, Thermus thermophilus ADNligasa, bacteriófago T7 ADNligasa, Haemophilus influenzae ADNligasa, Mycobacterium tuberculosis ADNligasa, Deinococcus radiodurans ARN ligasa, Methanobacterium

10 thermoautotrophicum ARN ligasa, Rhodothermus marinus ARN ligasa, Trypanosoma brucei ARN ligasa, bacteriófago T4 ARN ligasa 1, Ampligasa y bacteriófago T4 ARN ligasa 2.

[0034] Según se utiliza aquí, la expresión “supervisar la ligadura” hace referencia a detectar la presencia, detectar la ausencia y/o medir la cantidad de ácido nucleico. La ligadura puede supervisarse, por ejemplo, detectando y/o cuantificando la cantidad de productos de ligadura utilizando electroforesis en gel o una marca 15 detectable (p.ej., colorante fluorescente o quimioluminiscente) o correlacionando la presencia y/o la cantidad de un producto o de un proceso subsecuente a la presencia y/o cantidad de producto de ligadura (p.ej., correlacionando directamente la presencia y/o cantidad de una amplificación posterior de productos ligados con la cantidad de producto de ligadura). Supervisar la ligadura también incluye cualquier método de evaluar el tamaño de los ácidos nucleicos para indicar si la ligadura ha ocurrido o no o para evaluar qué parte del ácido

20 nucleico total presente en la muestra se ha ligado y qué parte no; dichos resultados pueden expresarse en términos de un porcentaje o una proporción. Supervisar la ligadura incluye cualquiera de los métodos aquí publicados así como métodos conocidos en la técnica.

[0035] Según se utiliza aquí, la expresión “ácido nucleico” hace referencia a un polinucleótido, un oligonucleótido

o cualquier fragmento de los mismos, cualquier derivado de ribosa o de desoxirribosa y a moléculas que ocurren

25 de manera natural o sintética que contienen residuos nucleótidos modificados y/o naturales y enlaces internucleotidos. Estas frases también hace referencia al ADN o al ARN de origen natural (p.ej., genómico) o sintético que puede ser de una hebra, de dos hebras, de tres hebras o de cuatro hebras y puede representar la hebra sentido o antisentido, o a cualquier material similar al ADN o al ARN. Un “equivalente al ARN”, con referencia a una secuencia, se compone de la misma secuencia linear de nucleótidos que la secuencia de ADN

30 de referencia con la excepción de que todas o la mayoría de sucesos de la timina de base nitrogenada se reemplaza con uracilo y la cadena de azúcar se compone de ribosa en lugar de 2’-desoxirribosa. Se proporcionan aquí cadenas de ácido nucleico alternativas adicionales para los métodos y composiciones proporcionados aquí que incluyen, sin carácter limitativo, fosforotioato, fosforoselenoato, alquil fosfotriester, aril fosfotriester, alquil fosfonato, aril fosfonato, ácidos nucleicos bloqueados (ANB) y ácidos nucleicos péptídicos

35 (ANP) y fosfoboronato y combinaciones de los mismos. El ARN puede utilizarse en los métodos aquí descritos y/o puede convertirse en ADNc por transcripción inversa para su uso en los métodos aquí descritos.

[0036] Según se utiliza aquí, la expresión “polinucleótido” hace referencia a una cadena de ácido nucleico, normalmente de una única hebra, que puede ocurrir de forma natural o sintética. A lo largo de esta aplicación, los ácidos nucleicos se designan desde el extremo 5’ hasta el extremo 3’. Los ácidos nucleicos estándar, p.ej., ADN 40 y ARN, se sintetizan químicamente con frecuencia “del 3’ al 5’”, es decir, mediante la adición de nucleótidos al extremo 5’ de un ácido nucleico en crecimiento. Los polinucleótidos pueden incluir ADN, ARN, ANP, ANB, otros nucleósidos modificados, o combinaciones de los mismos. En algunos modos de realización, un polinucleótido es un oligonucleótido. Según se utiliza aquí, la expresión “nucleótido” hace referencia a una subunidad de un ácido nucleico que consiste en un grupo fosfato, un azúcar de 5 carbonos y una base nitrógena. El azúcar de 5’

45 carbonos descubierto en el ARN es ribosa. En el ADN, el azúcar de 5 carbonos es deoxiribosa 2’. El término también incluye análogos de dichas subunidades.

[0037] Según se utiliza aquí, la expresión “oligonucleótido” hace referencia a un polinucleótido con una secuencia de entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 200 nucleótidos, más preferiblemente de entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 nucleótidos, más preferiblemente de entre aproximadamente 50 10 hasta aproximadamente 70 nucleótidos, más preferiblemente de entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 nucleótidos, más preferiblemente de entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 nucleótidos, o más preferiblemente de entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 25 nucleótidos. En algunos modos de realización, un oligonucleótido incluye una secuencia de al menos 5 nucleótidos, al menos 10 nucleótidos, al menos 15 nucleótidos, al menos 20 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos, al menos 30 55 nucleótidos, al menos 35 nucleótidos, al menos 40 nucleótidos, al menos 45 nucleótidos, al menos 50 nucleótidos, al menos 55 nucleótidos, al menos 60 nucleótidos, al menos 65 nucleótidos, al menos 70 nucleótidos en longitud, al menos 75 nucleótidos, al menos 80 nucleótidos enlongitud, al menos 90 nucleótidos en longitud, al menos 100 nucleótidos en longitud, al menos 200 nucleótidos en longitud; o menos de 200 nucleótidos, menos de 150 nucleótidos, menos de 100 nucleótidos, menos de 90 nucleótidos, menos de 80 60 nucleótidos, menos de 70 nucleótidos, menos de 65 nucleótidos, menos de 60 nucleótidos, menos de 55

nucleótidos, menos de 50 nucleótidos, menos de 45 nucleótidos, menos de 40 nucleótidos, menos de 35 nucleótidos, menos de 30 nucleótidos, menos de 25 nucleótidos, menos de 20 nucleótidos, menos de 15 nucleótidos o combinaciones de los mismos, en longitud. En ciertos modos de realización, un oligonucleótido es 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 nucleótidos en longitud.

[0038] Según se utiliza aquí, la expresión “cebador” u “oligonucleótido cebador” hace referencia a un polinucleótido o un oligonucleótido adecuado para cebar una reacción de extensión de ácido nucleico basada en enzima, p.ej., amplificación y ligadura. El artesano especializado es capaz de diseñar y preparar cebadores que son apropiados para la extensión de una secuencia objetivo. La longitud de los cebadores para su uso en los métodos y composiciones aquí proporcionados depende de varios factores incluyendo la identidad de secuencia nucleótida y la temperatura a la que estos ácidos nucleicos hibridan o se usan durante la extensión de ácido nucleico in vitro. Las consideraciones necesarias para determinar una longitud preferida para el cebador de una identidad de secuencia particular son conocidas por aquellos con un conocimiento general de la técnica. Por ejemplo, la longitud de un ácido nucleico u oligonucleótido corto puede relacionarse con su especificidad o selectividad de hibridación. Según se utiliza aquí, la expresión “secuencia de unión al cebador” o “PBS” (por sus siglas en inglés) hace referencia a una región de ácido nucleico que específicamente se hibrida o recoce en un cebador específico.

[0039] Según se utiliza aquí, la expresión “sonda” o “sonda oligonucleótida” hace referencia a un polinucleótido o un oligonucleótido adecuado para detectar la presencia o ausencia de un ácido nucleico específico.

[0040] Según se utiliza aquí, la expresión “ácido nucleico diana” hace referencia a cualquier ácido nucleico de interés.

[0041] Según se utiliza aquí, la expresión “ácido nucleico molde” hace referencia a un ácido nucleico capaz de unirse a un dador y/o a un aceptor. Preferiblemente el ácido nucleico molde comprende un ácido nucleico diana.

[0042] Según se utiliza aquí, la expresión “mutación” hace referencia a una diferencia en una secuencia de una primera secuencia de ácido nucleico en comparación con una segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un mutación incluye una sustitución (como un polimorfismo de nucleótido simple), supresión, inserción y translocación de ácido nucleico en una primera secuencia nucleica diana relativa a una segunda secuencia de ácido nucleico. Una segunda secuencia de ácido nucleico puede ser una secuencia de tipo silvestre o la secuencia de un sitio mutado alternativo.

[0043] Según se utiliza aquí, la expresión “mal emparejamiento” hace referencia a nucleótidos o ácido nucleótido que no es complementario a un nucleótido o ácido nucleótido diana. Según se utiliza aquí, la expresión “molde de mal emparejamiento” o “molde mal emparejado” hace referencia a un ácido nucleico de doble hebra donde al menos un residuo base en cada hebra no está emparejado con ningún residuo, o emparejado con una base incorrecta, p.ej., A no emparejado con T o C no emparejado con G. Una reacción de ligadura con menos del 100% de fidelidad/especificidad forma un producto de ligadura mal emparejado. Según se utiliza aquí, la expresión “molde emparejado” hace referencia a un ácido nucleico donde todas las bases son complementarias a las sondas dador y aceptor.

[0044] Según se utiliza aquí, la expresión “polimorfismo de nucleótido simple” o “SNP” hace referencia a una variación de secuencia genética de base simple entre diferentes individuos de una especie u otra población específica. En algunos modos de realización, los SNP son posiciones de par de bases simple en un sitio de ácido nucleico específico en el ADN genómico en el que diferentes secuencias alternativas (alelos) existen en individuos normales en algunas poblaciones donde el alelo menos frecuente tiene una abundancia del 1% o mayor; o 0,8% o mayor; o 0,5% o mayor; o 0,4% o mayor; o 0,3% o mayor; o 0,2% o mayor; o 0,1% o mayor. En algunos modos de realización, un SNP de interés es conocido por alguien especialista en la técnica, por ejemplo, un SNP particular se publica en una revista científica, como aquellas accesibles a través de Pubmed (disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) como Science, Nature, PNAS y NEJM. En algunos modos de realización, un SNP puede encontrarse en una base de datos de polimorfismos como aquellas que se encuentran en Entrez SNP (disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=snp) o una base de datos de SNP humano (disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). En algunos modos de realización, una población incluye a todos los humanos en conjunto o a un subconjunto de humanos, como un grupo de gente de una raza, nacionalidad, región geográfica, linaje de familia, religión, géner o edad en particular o de un periodo de tiempo o era en particular.

[0045] Según se utiliza aquí, la expresión “sitio de polimorfismo de nucleótido simple”, “sitio SNP” o “posición SNP” hace referencia a una posición de ácido nucleico donde se sabe que ocurre un SNP.

[0046] Según se utiliza aquí, la expresión “extremo” con respecto a un polinucleótido (preferiblemente un oligonucleótido) hace referencia a los nucleótidos en el extremo 3’ o 5’ de un polinucleótido. Preferiblemente el

extremo de un polinucleótido incluye los nucleótidos de extremo 6, más preferiblemente los nucleótidos de extremo 5, más preferiblemente los nucleótidos de extremo 4, más preferiblemente los nucleótidos de extremo 3, más preferiblemente los nucleótidos de extremo 2, o más preferiblemente el nucleótido extremo.

[0047] Según se utiliza aquí, la expresión “marca” o “marca detectable” hace referencia a cualquier compuesto o combinación de compuestos que puede unirse o asociarse de otra manera con una molécula para que la molécula pueda detectarse directa o indirectamente detectando la marca. Una marca detectable puede ser un

213 15

radioisótopo (p.ej., carbono, fósforo, yodo, indio, sulfuro, tritio, etc.), una masa de isotopo (p.ej., H, Co N), un tinte o fluoróforo (p.ej., cianina, fluoresceína o rodamina), un hapteno (p.ej., biotin) o cualquier otro agente que pueda detectarse directa o indirectamente. Tras la incorporación de un NTP marcado en un amplicón u otro producto de polimerización, puede detectarse la marca.

[0048] Según se utiliza aquí, la expresión “hibridar” o hibridar específicamente” hace referencia a un proceso donde dos hebras de ácido nucleico complementario se recocen entre ellas bajo condiciones apropiadamente severas. Las hibridaciones de los ácidos nucleicos diana se conducen común y preferiblemente con moléculas de ácido nucleico de longitud de sonda, preferiblemente de 20 a 100 nucleótidos de longitud. Las técnicas de hibridación de ácido nucleico son muy conocidas en el ámbito. Véase, p.ej., Sambrook, et al." Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.(1989); Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N.J. (1994).

[0049] Según se utiliza aquí, la expresión “condiciones severas de hibridación” hace referencia a las condiciones de hibridación que no permiten la hibridación de dos ácidos nucleicos que no son totalmente complementarios.

[0050] Según se utiliza aquí, la expresión “muestra” o “prueba de muestra” hace referencia a cualquier líquido o material sólido que incluya el ácido nucleico de interés. Una prueba de muestra puede obtenerse a partir de cualquier fuente biológica (es decir, una muestra biológica), como las células en un cultivo o una muestra de tejido o sintéticamente producidas incluyendo un molde sintetizado de forma química.

[0051] Según se utiliza aquí, la expresión “complemento”, “complementario” o “complementaridad” en el contexto de un oligonuleótido o polinucleótido (es decir, una secuencia de nucleótidos como un cebador oligonucleótido o un ácido nucleico diana) hace referencia a las reglas estándar del par de bases Watson/Crick. Una secuencia complemento también puede ser una secuencia de ADN o ARN complementario a la secuencia de ADN o su secuencia complemento y también puede ser ADNc. Por ejemplo, la secuencia “5’-A-G-T-C-3”’ es complementaria a la secuencia “3’-T-C-A-G-5’”. Ciertos nucleótidos no descubiertos comúnmente en ácidos nucleótidos naturales o químicamente sintetizados pueden incluirse en los ácidos nucleicos aquí descritos; estos incluyen pero no se limitan a nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados base y de azúcar, como la inosina, 7-deazaguanosina, 2’-O-metilguanosina, 2’-fluoro-2’-desoxicitidina, ácidos nucléicos bloqueados (ANB), y ácidos nucleicos peptídicos (ANP) y combinaciones de los mismos. La complementaridad no necesita ser perfecta; las dobles hélices estables pueden contener pares de bases mal emparejados, degenerativos, o nucleótidos mal emparejados. Aquellos especialistas en la técnica de la tecnología de ácido nucleico pueden determinar la estabilidad de las dobles hélices de manera empírica considerando una cantidad de variables que incluyen, por ejemplo, la longitud del oligonucleótido, la composición y secuencia base del oligonucleótido, la incidencia de pares de bases mal emparejados, la fuerza iónica, otros componentes y condiciones del tampón de hibridación.

[0052] La complementariedad puede ser parcial ya que sólo algunas de las bases nucleótidas de dos hebras de ácido nucleico son emparejadas de acuerdo con las reglas de par de bases. La complementariedad puede ser completa o total donde todas las bases nucleótidas de dos hebras de ácido nucleico son emparejadas de acuerdo con las reglas de pares de bases. La complementariedad puede estar ausente donde ninguna de las bases nucleótidas de dos hebras de ácido nucleico son emparejadas de acuerdo con las reglas de pares de bases. El grado de complementariedad entre las hebras de ácido nucleico tiene efectos significativos en la eficacia y dureza de hibridación entre hebras de ácido nucleico. Esto es de particular importancia en las reacciones de ligadura y amplificación, así como en métodos de detección que dependen de la ligadura entre los ácidos nucleicos. Los términos también pueden utilizarse en referencia a nucleótidos individuales, especialmente dentro del contexto de los polinucleótidos. Por ejemplo, un nucleótido particular dentro de un olinucleótido puede destacar por su complementariedad, o la falta de esta, con un nucleótido dentro de otra hebra de ácido nucleico, en contraste o comparación con la complementariedad entre el resto del oligonucleótido y la hebra de ácido nucleico.

[0053] Según se utiliza aquí, la expresión “sustancialmente complementario” hace referencia a dos secuencias que hibridan bajo condiciones casi severas de hibridación. La persona especializada entenderá que las secuencias sustancialmente complementarias no necesitan hibridar a lo largo de toda su longitud. En particular, las secuencias sustancialmente complementarias comprenden una secuencia adyacente de bases que no hibrida

en una secuencia diana, situada en 3’ o 5’ con una secuencia adyacente de bases que hibrida bajo condiciones severas de hibridación en una secuencia diana.

[0054] Según se utiliza aquí, un polinucleótido, oligonucleótido, cebador o sonda es “específico” para un ácido nucleico si la secuencia de hibridación del cebador polinucleotido u oligonucleótido del un cebador polinucleotido u oligonucleótido tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con una parte del ácido nucleico cuando el cebador polinucleótido u oligonucleótido y el ácido nucleico se alinean. Un cebador polinucleótido u oligonicleótido que es específico para un ácido nucleico es uno que, bajo la hibridación apropiada o condiciones de limpieza, es capaz de hibridar en la diana de interés y no hibrida sustancialmente en secuencias de ácidos nucleicos que no son de interés. Los niveles más altos de identidad de secuencia son preferidos e incluyen al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 99% y más preferiblemente al menos un 100% de identidad de secuencia.

[0055] Según se utiliza aquí, la expresión “nucleósido” incluye todos los nucleósidos que ocurren de manera natural, incluyendo todas las formas de bases nucleósidas y furanósidos descubiertos en ácidos nucleicos naturales. Los anillos base más comúnmente descubiertos en nucleósidos que ocurren de manera natural son anillos de purina y de pirimidina. Los anillos de purina que ocurren naturalmente incluyen, por ejemplo, adenina, guanina y N6-metiladenina. Los anillos de pirimidina que ocurren de manera natural incluyen, por ejemplo, citosina, timina y 5-metilcitosina. Los nucleósidos que ocurren de manera natural por ejemplo incluyen, sin carácter limitativo, derivados de 2’desoxirribo y rribo de adenosina, guanosina, citidina, timidina, uridina, inosina, 7-deaza-guanosina, 7-metilguanosina. Los nucleósidos que ocurren de manera natural también incluyen modificaciones al azúcar ribosa, según se ve para 2’-O-metiluridina.

[0056] Según se utiliza aquí, los términos “análogos nucleósidos”, “nucleósidos modificados” o “derivados nucleósidos” incluyen nucleósidos sintéticos según se describen aquí. Los derivados nucleósidos también incluyen tener una base modificada y/o fracciones de azúcar, con o sin grupos de protección. Dichos análogos incluyen, por ejemplo, 2’-deoxi-2’-fluorouridina y similares. Los compuestos y métodos aquí proporcionados incluyen dichos anillos base y análogos sintéticos de los mismos, así como heterociclo no natural sustituido por azúcares base, e incluso acíclicos sustituidos por azúcares base. Además, los derivados nucleósidos incluyen otros derivados de purina y pirimidina, por ejemplo, purinas de halógeno sustituido (p.ej., 6-fluoropurina), pirimidinas de halógeno sustituido, N6-etiladenina, N4-(alquil)-citosinas, 5-etilcitosina y similares. Los derivados y análogos nucleósidos abarcan una amplia variedad de modificaciones, como aquellas descritas en la patente estadounidense núm. 6.762.298.

[0057] Según se utiliza aquí, los términos “base universal”, “base degenerada”, “base análoga universal” y “base análoga degenerada” incluyen, por ejemplo, un análogo con una base artificial que es preferiblemente reconocible mediante ácido nucleico ligasa como un sustituto para cualquier base nitrogenada específica de un nucleosido como dA, A, dT, dU, U, dC, C, dG, G y otras bases nitrogenadas específicas. Los nucleósidos que contienen bases universales o bases degeneradas también pueden utilizarse y pueden encontrarse ejemplos en Loakes, D., 29 Nucleic Acids Res. 2437-2447 (2001); Crey-Desbiolles, C., et. al., 33 Nucleic Acids Res. 15321543 (2005); Kincaid, K., et. al., 33 Nucleic Acids Res. 2620-2628

[0058] (2005); Preparata, FP, Oliver, JS, 11 J. Comput. Biol. 753-765 (2004); y Hill, F., et. al., 95 Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 4258-4263 (1998).

[0059] Según se utilize aquí, el término “enlace entre nucleótidos” hace referencia al enlace o las uniones que conectan dos nucleósidos de un cebador oligonucleótido o ácido nucleico y puede ser un enlace de fosfodiester natural o un enlace modificado.

[0060] Según se utiliza aquí, la expresión “acil” denota el grupo –C(O)Ra, donde Ra es hidrógeno, alquil inferior, cicloalquil, heterociclil, aril, heteroaril y similares.

[0061] Según se utiliza aquí, la expresión “acil sustituido” denota el grupo –C(O)Ra’, donde Ra’ es alquil inferior sustituido, cicloalquil sustituido, heterociclil sustituido, aril sustituido, heteroaril sustituido y similares.

[0062] Según se utiliza aquí, la expresión “aciloxi” denota el grupo –OC(O)Rb, donde Rb es hidrógeno, alquil inferior, alquil inferior sustituido, clicloalquil, cicloalquil sustituido, heterociclil, heterociclil sustituido, aril, aril sustituido, heteroaril, heteroaril sustituido y similares.

[0063] Según se utiliza aquí, la expresión “alcano” hace referencia a un compuesto orgánico que incluye átomos de carbono y átomos de hidrógeno e incluye enlaces C-H y adicionalmente incluye enlaces únicos C-C en alcanos que no sean metano. El término “alcano” incluye alcanos de cadena lineal como alcanos que tienen de 1 a 20 átomos de carbono. En algunos modos de realización, los alcanos incluyen alcanos de cadena lineal como

alcanos que tienen de 1 a 8 átomos de carbono como el metano, etano, propano, butano, pentano, hexano, heptano y octano. El término “alcano” también incluye alcanos de cadena ramificada como por ejemplo, sin carácter limitativo, los alcanos de cadena ramificada que tienen de 1 a 20, y en algunos modos de realización de 1 a 8 átomos de carbono, como por ejemplo, sin carácter limitativo, 2-metilpropano, 2,2-dimetilpropano, 25 metilbutano, 2,3-dimetilbutano, 2,2-dimetilbutano, 2-metilpentano, 3-metilpentano, 2,3-dimetilpentano, 2,4dimetilpentano, 2,2-dimetilpentano, 3,3-dimetilpentano, 2-metilhexano, 3-metilhexano, 2,2-dimetilhexano, 2,3dimetilhexano, 2,4-dimetilhexano, 2,5-dimetilhexano, 3,3-dimetilhexano, 3,4-dimetilhexano, 2-metilheptano, 3metilheptano, 4-metilheptano, 3-etilpentano, 3-etil-2-metilpentano, 3-etilhexano y similares. Un enlace C-C o C-H de un alcano puede reemplazarse con un enlace a otro grupo como un grupo hidroxilo, un halógeno como F, CI,

10 Br o I, un grupo sulfhidrilo, o un grupo amino. Los alcanos reemplazados por dichos grupos pueden llamarse respectivamente hidroxialcanos, haloalcanos como fluoroalcanos, cloroalcanos, bromoalcanos, yodoalcanos, mercaptoalcanos y aminoalcanos.

[0064] Según se utiliza aquí, la expresión “alquenil” hace referencia a una cadena lineal o una cadena ramificada de hidrocarbilo, que tiene uno o más enlaces dobles y, a no ser que se especifique lo contrario, contiene entre 2

15 y aproximadamente 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 2 y aproximadamente 10 átomos, más preferiblemente entre 2 y aproximadamente 8 átomos de carbono, y más preferiblemente entre 2 y 6 átomos de carbono. Los ejemplos de radicales de alquenilo incluyen vinilo, alilo, 1-4-butadienilo; isopropenilo y similares.

[0065] Según se utiliza aquí, la expresión “alquenilarilo” hace referencia a alquenilo sustituido con grupos arilo y “alquenilarilo sustituido” hace referencia a grupos de alquenilarilo que contienen además uno o más sustituyentes

20 según se expone aquí.

[0066] Según se utiliza aquí, la expresión “alquenileno” hace referencia a la cadena ramificada o lineal divalente de grupos hidrocarbilo con al menos un enlace doble carbono-carbono y típicamente conteniendo 2-20 átomos de carbono, preferiblemente 2-12 átomos de carbono, preferiblemente 2-8 átomos de carbono y el “alquinileno sustituido” hace referencia a grupos alquinileno que contienen además uno o más sustituyentes según se expone

25 aquí.

[0067] Según se utiliza aquí, la expresión “alquil” hace referencia a una cadena de enlace única de hidrocarburos que oscilan comúnmente entre 1y 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 1 y 8 átomos de carbono, los ejemplos incluyen metil, etil, propil, isopropil, y similares. Los ejemplos de dichos radicales alquilo incluyen metil, etil, propil, isopropil, n-butil, sec-butil, isobutil, tert-butil, pentil, isoamil, hexil, octil, dodecanil y similares.

30 [0068] Según se utiliza aquí, la expresión “alquil inferior” hace referencia a una cadena lineal o a una cadena ramificada de hidrocarburos que oscilan normalmente entre 1 y 6 átomos de carbono, preferiblemente entre 2 y 5 átomos de carbono. Los ejemplos incluyen etil, propil, isopropil y similares.

[0069] Según se utiliza aquí, la expresión “alquileno” hace referencia a un hidrocarbilo divalente que contiene entre 1 y 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 1 y 15 átomos de carbono, cadena lineal o ramificada, de

35 los que dos átomos de hidrógeno se toman a partir del mismo átomo de carbono o de diferentes átomos de carbono. Los ejemplos de alquileno incluyen, sin carácter limitativo, metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2-) y similares.

[0069] Según se utiliza aquí, la expresión “alquileno” hace referencia a un hidrocarbilo divalente conteniendo entre 1 y 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 1 y 15 átomos de carbono, de cadena lineal o ramificada,

40 de los que dos átomos de hidrógeno se toman del mismo átomo de carbono o de diferentes átomos de carbono. Los ejemplos de alquileno incluyen, sin carácter limitativo, metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2-), y similares.

[0070] Según se utiliza aquí, la expresión “alquinil” hace referencia a un hidrocarbilo de cadena lineal o de cadena ramificada, que tiene una o más uniones triples y contiene entre 2 y 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 2 y 10 átomos de carbono, más preferiblemente entre 2 y 8 átomos de carbono y más

45 preferiblemente entre 2 y 6 átomos de carbono. Los ejemplos de radicales de alquinil incluyen etinil, propinil (propargil), butinil y similares.

[0071] Según se utiliza aquí, la expresión “alquinilaril” hace referencia a alquinil sustituido por grupos arilo y “alquinilaril sustituido” hace referencia a grupos alquinilaril que contiene además uno o más sustituyentes según se expone aquí.

50 [0072] Según se utiliza aquí, la expresión “alcoxi” designa al grupo –ORc, donde Rc es un alquil inferior, alquil inferior sustituido, aril, aril sustituido, aralquil, aralquil sustituido, heteroalquil, heteroalquil, cicloalquil, cicloalquil sustituido, cicloheteroalquil, o cicloheteroalquil sustituido según se define.

[0073] Según se utiliza aquí, la expresión “alcoxi inferior” designa el grupo –ORd, donde Rd es un alquil inferior.

[0074] Según se utiliza aquí, la expresión “alquilaril” hace referencia a alquil sustiuido por grupos aril y “alquilaril sustituido” hace referencia a grupos alquilaril que contienen además uno o más sustituyentes según se expone aquí.

[0075] Según se utiliza aquí, la expresión “alquilcarbonilamino” designa el grupo –NReC(O)Rf, donde Re es opcionalmente alquil sustituido y Rf es hidrógeno o alquil.

[0076] Según se utiliza aquí, la expresión “alquilsulfinil” designa el grupo –S(O)Rg, donde Rg es opcionalmente alquil sustituido.

[0077] Según se utiliza aquí, la expresión “alquilsulfonil” designa el grupo –S(O)2Rg, donde Rg es opcionalmente alquil sustituido.

[0078] Según se utiliza aquí, la expresión “alquilsulfonilamino” designa el grupo –NReS(O)2Rf, donde Re es opcionalmente alquil sustituido y Rf es hidrógeno o alquil.

[0079] Según se utiliza aquí, la expresión “alquiltio” hace referencia al grupo –S-Rh, donde Rh es alquil.

[0080] Según se utiliza aquí, la expresión “alquiltio sustituido” hace referencia al grupo –S-Ri, donde Ri es alquil sustituido.

[0081] Según se utiliza aquí, la expresión “alquinileno” hace referencia a grupos hidrocarbilo de cadena ramificada o lineal divalente con al menos un enlace triple carbono-carbono y típicamente tiene entre 2 y 12 átomos de carbono, preferiblemente aproximadamente entre 2 y 8 átomos de carbono y “alquinileno sustituido” hace referencia a grupos de alquinileno que contienen además uno o más sustituyentes según se expone aquí.

ii’ii’

[0082] Según se utiliza aquí, la expresión “amido” designa el grupo –C(O)NRR, donde Ry Rpueden ser independientemente hidrógeno, alquil inferior, alquil inferior sustituido, alquil sustituido, aril, aril sustituido, heteroaril, o heteroaril sustituido.

kk’kk’

[0083] Según se utiliza aquí, la expresión “amido sustituido” designa el grupo –C(O)NRR, donde Ry Rpueden ser independientemente hidrógeno, alquil inferior, alquil inferior sustituido, aril, aril sustituido, heteroaril o

k kk’

heteroaril sustituido, no obstante, siempre que, al menos uno de entre Ry Rk’ no sea hidrógeno. RRen combinación con el nitrógeno puede formar opcionalmente un anillo heterocíclico o heteroaril sustituido.

mm’m’’mm’ m’’

[0084] Según se utiliza aquí, la expresión “amidino” designa el grupo –C(=NR)NRR, donde R, Ry Rson independientemente hidrógeno u opcionalmente alquil, aril o heteroaril sustituido.

nn’nn’

[0085] Según se utiliza aquí, la expresión “amino” o “amina” designa el grupo –NRR, donde Ry Rpueden ser independientemente hidrógeno, alquil inferior, alquil inferior sustituido, alquil, alquil sustituido, aril, aril sustituido, heteroaril, o heteroaril sustituido según se define aquí. Una “amina divalente” designa el grupo –NH-. Una “amina divalente sustituida” designa el grupo –NR-donde R es un alquil inferior, alquil inferior sustituido, alquil, alquil sustituido, aril, aril sustituido, heteroaril o heteroaril sustituido.

[0086] Según se utiliza aquí, la expresión “amino sustituido” o “amina sustituida” designa el grupo –NRpRp’, donde Rp y Rp’ son independientemente hidrógeno, alquil inferior, alquil inferior sustituido, alquil, alquil sustituido, aril, aril sustituido, heteroaril, heteroaril sustituido, no obstante, siempre que al menos uno de entre Rp y Rp’ no sea hidrógeno. RpRp’ en combinación con el nitrógeno puede formar un anillo heteroaril o hetercíclico opcionalmente sustituido.

[0087] Según se utiliza aquí, la expresión “arilalquinil” hace referencia a grupos alquinil de aril sustituido y “arilalquinil sustituido” hace referencia a grupos arilalquinil que contienen además uno o más sustituyentes según se establece aquí.

[0088] Según se utiliza aquí, la expresión “aralquil” hace referencia al alquil según se define aquí, donde un átomo de hidrógeno alquilo se reemplaza por un arilo según se define aquí. Los ejemplos de radicales de aralquil incluyen benzil, fenetil, 1-fenilpropil, 2-fenilpropil, 3-fenilpropil, 1-naftilpropil, 2-naftilpropil, 3-naftilpropil, 3-naftilbutil y similares.

[0089] Según se utiliza aquí, la expresión “aroil” hace referencia a especies de aril-carbonil como benzoil y “aroil sustituido” hace referencia a grupos aroil que contienen además uno o más sustituyentes según se establece aquí.

[0090] Según se utiliza aquí, la expresión “arilalquil” hace referencia a aril sustituido por grupos alquilo y “arilalquil sustituido” hace referencia a grupos arilalquil que contienen además uno o más sustituyentes según se establece aquí.

[0091] Según se utiliza aquí, la expresión “aril” sólo o en combinación hace referencia a fenil, naftil o heterocíclico aromático fundido opcionalmente con un cicloalquil de preferiblemente 5-7, más preferiblemente 5-6 miembros de anillo y/u opcionalmente sustituido con entre 1 y 3 grupos de sustituyentes de halo, hidroxi, alcoxi, alquiltio, alquilsulfinil, alquilsulfonil, aciloxi, ariloxi, heteroariloxi, amino opcionalmente mono-or di-sustituido con grupos alquil, aril o heteroaril, amidino, urea opcionalmente sustituido con grupos alquil, aril, heteroaril o heterociclil, aminosulfonil opcionalmente N-mono-o N,N-di-sustituido con grupos alquil, aril o heteroaril, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, heteroarilsulfonilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, o similares.

[0092] Según se utiliza aquí, la expresión “arilcarbonilamino” designa el grupo –NRqC(O)Rr, donde Rq es hidrógeno o alquil inferior o alquil y Rr es opcionalmente aril sustituido.

[0093] Según se utiliza aquí, la expresión “arileno” hace referencia a grupos aromáticos divalentes típicamente con entre 6 y hasta 14 átomos de carbono y “arileno sustituido” hace referencia a grupos arileno que contienen además uno o más sustituyentes según se establece aquí.

[0094] Según se utiliza aquí, la expresión “ariloxi” designa el grupo –Oar, donde Ar es un aril, o un grupo aril sustituido.

[0095] Según se utiliza aquí, la expresión “arilsulfonilamino” designa el grupo -NRqS(O)2Rr, donde Rq es hidrógeno o alquil inferior o alquil y Rr es opcionalmente aril sustituido.

[0096] Según se utiliza aquí, la expresión “un grupo carbamato” designa el grupo –O-C(O)-NR2, donde cada R es independientemente H, alquil, alquil sustituido, aril o aril sustituido según se expone aquí.

[0097] Según se utiliza aquí, la expresión “grupo ditiocarbamato” designa el grupo –S-C(S)-NR2, donde cada R es independientemente H, alquil, alquil sustituido, aril o aril sustituido según se establece aquí.

[0098] Según se utiliza aquí, la expresión “carbociclo” hace referencia a un grupo saturado, insaturado o aromático con un único anillo o múltiples anillos condensados compuestos de átomos de carbono unidos. El anillo o anillos puede(n) opcionalmente sustituirse o no con, p.ej., halógeno, alquil inferior, alcoxi, alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxil, hidroxil, aril, ariloxi, heterociclo, hetaril, hetaril sustituido, nitro, ciano, tiol, sulfamido y similares.

[0099] Según se utiliza aquí, la expresión “ciclialquenil” hace referencia a grupos que contienen anillo cíclico con un intervalo de 3-20 átomos de carbono y con al menos un enlace doble carbono-carbono y “ciclialquenil sustituido” hace referencia a grupos cicloalquenil que contienen uno o más sustituyentes según se establece aquí.

[0100] Según se utiliza aquí, la expresión “cicloalquil” hace referencia a un grupo monocíclico o policíclico que contiene de 3 a 15 átomos de carbono y “cicloalquil sustituido” hace referencia a grupos cicloalquil que contienen además uno o más sustituyentes según se establece aquí.

[0101] Según se utiliza aquí, la expresión “cicloalquileno” hace referencia a grupos que contienen anillo divalente con un intervalo de 3 a 12 átomos de carbono y “cicloalquileno sustituido” hace referencia a grupos cicloalquileno que contienen además uno o más sustituyentes según se establece aquí.

[0102] Según se utiliza aquí, la expresión “guanidinil” designa el grupo –N=C(NH2)2 y “guanidinil sustituido” designa el grupo –N=C(NR2)2, donde cada R es independientemente H, alquil, alquil sustituido, aril, o aril sustituido según se establece aquí.

[0103] Según se utiliza aquí, la expresión “halo” o “halógeno” hace referencia a todos los halógenos, es decir, cloro (CI), fluoro (F), bromo (Br) y yodo (I).

[0104] Según se utiliza aquí, la expresión “heteroaril” hace referencia a una estructura de anillo aromático monocíclico conteniendo 5 o 6 átomos de anillo, o un grupo aromático bicíclico con entre 8 y 10 átomos, conteniendo uno o más, preferiblemente de 1 a 4, más preferiblemente de 1 a 3 y aún más preferiblemente de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente del grupo O, S y N y opcionamente sistuido con entre 1 y 3 5 grupos o sustituyentes de halo, hidroxi, alcoxi, alquiltio, alquilsulfinil, alquilsulfonil, aciloxi, ariloxi, heteroariloxi, amino opcionalmente mono o di-sustituido con alquil, aril o grupos heteroaril, amidino, urea opcionalmente sustituido con grupos alquil, aril, heteroaril, o grupos heterociclil, aminosulfonil opcionalmente N-mono-o N,N-disustituido con grupos alquil, aril o heteroaril, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, heteroarilsulfonilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, o similares. El heteroaril también pretende incluir 10 S o N oxidado, como sulfinil, sulfonil y N-oxido de un anillo de nitrógeno terciario. Un átomo de carbono o nitrógeno es el punto de enlace de la estructura de anillo heteroaril para que un anillo aromático estable se retenga. Los ejemplos de grupos heteroarilo son ftalimida, piridinil, piridazinil, pirazinil, quinazolinil, purinil, indolil, quinolinil, pirimidinil, pirrolil, oxazolil, tiazolil, tienil, isoxazolil, oxatiadiazolil, isotiazolil, tetrazolil, imidazolil, triazinil, furanil, benzofuril, indolil y similares. Un heteroaril sustituido contiene un sustituyente unido a un carbono o

15 nitrógeno disponible para producir un compuesto estable.

[0105] Según se utiliza aquí, la expresión “heteroaril sustituido” hace referencia a un heterociclo opcionalmente mono o poli sustituido con uno o más grupos funcionales, p.ej., halógeno, alquil inferior, alcoxi inferior, alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxil, hidroxil, aril, ariloxi, heterociclo, heterociclo sustituido, hetaril, hetaril sustituido, nitro, ciano, tiol, sulfamido y similares.

20 [0106] Según se utiliza aquí, la expresión “heteroarilcarbonilamino” designa el grupo –NRqC(O)Rr , donde Rq es hidrógeno o alquil inferior y Rr es opcionalmente aril sustituido.

[0107] Según se utiliza aquí, la expresión “heteroariloxi” designa el grupo –OHet, donde Het es un grupo heteroaril opcionalmente sustituido.

[0108] Según se utiliza aquí, la expresión “heteroarilsulfonilamino” designa el grupo –NRqS(O)2Rs, donde Rq es 25 hidrógeno o alquil inferior y Rs es opcionalmente heteroaril sustituido.

[0109] Según se utiliza aquí, la expresión “heterociclo” hace referencia a un grupo saturado, insaturado o aromático con un único anillo (p.ej., morfolino, piridil o furil) o múltiples anillos condensados (p.ej., naftpiridil, quinoxalil, quinolinil, indolizinil or benzo[b]tienil) con átomos de carbono y al menos un átomo hetero, como N, O

o S, con el anillo, que opcionalmente puede sustituirse o no con, p.ej., halógeno, alquil inferior, alcoxi inferior,

30 alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxil, hidroxil, aril, ariloxi, heterociclo, hetaril, hetaril sustituido, nitro, ciano, tiol, sulfamido y similares.

[0110] Según se utiliza aquí, la expresión “heterociclo sustituido” hace referencia a heterociclo sustituido con 1 o más, p.ej., 1, 2 o 3, sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquil opcionalmente sustituido, alquenil opcionalmente sustituido, alquinil opcionalmente sustituido, halo, hidroxi, aloxi, alquiltio, alquilsulfinil, 35 alquilsulfonil, aciloxi, aril, aril sustituido, ariloxi, heteroariloxi, amino, amido, amidino, urea opcionalmente sustituido con grupos alquil, aril, heteroaril o heterociclil, aminosulfonil opcionalmente N-mono-o N,N-di-sustituido con grupos alquil, aril o heteroaril, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, heteroarilsulfonilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, acil, carboxil, heterociclo, heterociclo sustituido, hetaril, hetaril sustituido, nitro, ciano, tiol, sulfonamido, y oxo, unido a cualquier punto disponible para producir un

40 compuesto estable.

[0111] Según se utiliza aquí, la expresión “hidrocarbil” hace referencia a cualquier radical orgánico donde la cadena central del mismo comprende carbono e hidrógeno únicamente. Por lo tanto, el hidrocarbil abarca alquil, cicloalquil, alquenil, cicloalquenil, alquinil, aril, alquilaril, arilalquil, arilalquenil, alquenilaril, arilalquinil, alquinilaril y similares.

45 [0112] Según se utiliza aquí, la expresión “hidrocarbil sustituido” hace referencia a cualquiera de los grupos de hidrocarbil arriba mencionados que contienen además uno o más sustituyentes seleccionados de entre hidroxi, hidrocarbiloxi, hidrocarbiloxi sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, amino, alquilamino, alquilamino sustituido, carboxi, -C(S)SR, -C(O)SR, -C(S)NR2, donde cada R es independientemente hidrógeno, alquil o alquil sustituido, nitro, ciano, halo, -SO3M o –OSO3M, donde M es H, Na, K, Zn, Ca o meglumina,

50 guanidinil, guanidinil sustituido, hidrocarbil, hidrocarbil sustituido, hidrocarbilcarbonil, hidrocarbilcarbonil sustituido, hidrocarbiloxicarbonil, hidrocarbiloxicarbonil sustituido, hidrocarbilcarboniloxi, hidrocarbilcarboniloxi sustituido, acil, aciloxi, heterocíclico, heterocíclico sustituido, heteroaril, heteroaril sustituido, heteroarilcarbonil, heteroarilcarbonil sustituido, carbamoil, monoalquilcarbamoil, dialquilcarbamoil, arilcarbamoil, un grupo carbamato, un grupo ditiocarbamato, aroil, aroil sustituido, organosulfonil, organosulfonil sustituido, organosulfinil,

55 alquilsulfinil sustituido, alquilsulfonilamino, alquilsulfonilamino sustituido, arilsulfonilamino, arilsulfonilamino sustituido, un grupo sulfonamida, sulfuril, y similares, incluyendo dos o más de los grupos arriba mencionados

unidos a la fracción de hidrocarbil mediante las fracciones de enlace/espaciador como -O-, -S-, -NR-, donde R es hidrógeno, alquil o alquil sustituido, -C(O)-, -C(S)-, -C(=NR’)-, -C(=CR’2)-, donde R’ es alquil o alquil sustituido, OC(O)-, -O-C(O)-O-, -O-C(O)-NR-(or -NR-C(O)-O-), -NR-C(O)-, -NR-C(O)-NR-, -S-C(O)-, -S-C(O)-O-, -S-C(O)-NR-, -OS(O)2-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-NR-, -O-S(O)-, -O-S(O)-O-, -O-S(O)-NR-, -O-NR-C(O)-, -O-NR-C(O)-O-, -O-NRC(O)-NR-, -NR-O-C(O)-, -NR-O-C(O)-O-, -NR-O-C(O)-NR-, -O-NR-C(S)-, -O-NR-C(S)-O-, -O-NR-C(S)-NR-, -NR-OC(S)-, -NR-O-C(S)-O-, -NR-O-C(S)-NR-, -O-C(S)-, -O-C(S)-O-, -O-C(S)-NR-(or -NR-C(S)-O-), -NR-C(S)-, NRC(S)-NR-, -S-S(O)2-, -S-S(O)2-O-, -S-S(O)2-NR-, -NR-O-S(O)-, -NR-O-S(O)-O-, -NR-O-S(O)-NR-, -NR-OS(O)2-, -NRO-S(O)2-O-, -NR-O-S(O)2-NR-, -O-NR-S(O)-, -O-NR-S(O)-O-, -O-NR-S(O)-NR-, -O-NR-S(O)2-O-, -O-NR-S(O)2-NR-, -O-NR-S(O)2-, -O-P(O)R2-, -S-P(O)R2-, o -NR-P(O)R2-, donde cada R es independientemente hidrógeno, alquil o alquil sustituido y similares.

[0113] Según se utiliza aquí, la expresión “hidrocarbiloxi” designa grupos –O-hidrocarbil que contienen de 2 a 20 átomos de carbono e “hidrocarbiloxi sustituido” hace referencia a grupos de hidrocarbiloxi que contienen además uno o más sustituyentes según se establece aquí.

[0114] Según se utiliza aquí, la expresión “hidrocarbilcarbonil” hace referencia a grupos –C(O)-hidrocarbil que contienen de 2 a 20 átomos de carbono e “hidrocarbilcarbonil sustituido” hace referencia a grupos de hidrocarbilcarbonil que contienen además uno o más sustituyentes según se establece aquí.

[0115] Según se utiliza aquí, la expresión “hidrocarbiloxicarbonil” hace referencia a –C(O)-O-hidrocarbil conteniendo de 2 a 20 átomos de carbono e “hidrocarbiloxicarbonil sustituido” hace referencia a grupos hidrocarbiloxicarbonil que contienen además uno o más sustituyentes según se expone aquí.

[0116] Según se utiliza aquí, la expresión “hidrocarbilcarboniloxi” hace referencia a grupos –O-C(O)-hidrocarbil de 2 a 20 átomos de carbono e “hidrocarbilcarboniloxi sustituido” hace referencia a grupos hidrocarbilcarboniloxi que contienen además uno o más sustituyentes según se expone aquí.

[0117] Según se utiliza aquí, la expresión “hidrocarbileno” hace referencia a cualquier radical orgánico donde la cadena central del mismo comprende carbono e hidrógeno únicamente. Así, el hidrocarbileno abarca alquileno, cicloalquileno, alquenileno, cicloalquenileno, alquinileno, arileno, alquilarileno, arilalquileno, arilalquenileno, alquenilarileno, arilalquinileno, alquinilarileno y similares e “hidrocarbileno sustituido” hace referencia a cualquiera de los grupos hidrocarbileno arriba mencionados sosteniendo además uno o más sustituyentes según se expone aquí.

[0118] Según se utiliza aquí, la expresión “hidroxil” o “hidroxi” hace referencia al grupo –OH.

[0119] Según se utiliza aquí, la expresión “organosulfinil” designa el grupo –S(O)-órgano, donde órgano abarca fracciones alquil-, alcoxi-, alquilamino-y aril, así como fracciones de alquil-, alcoxi-, alquilamino-y aril sustituido.

[0120] Según se utiliza aquí, la expresión “organosulfonil” designa el grupo –S(O)2-órgano, donde órgano abarca fracciones alquil-, alcoxi-y alquilamino-, así como fracciones alquil-, alcoxi-o alquilamino-sustituido.

[0121] Según se utiliza aquí, la expresión “oxo” hace referencia a un sustituyente de oxígeno doble unido al carbono adherido.

[0122] Según se utiliza aquí, la expresión “sulfinil” designa el grupo –S(O)-.

[0123] Según se utiliza aquí, la expresión “sulfinil sustituido” designa el grupo –S(O)Rt, donde Rt es un alquil inferior, alquil inferior sustituido, cicloalquil, cicloalquil sustituido, cicloalquilalquil, cicloalquilalquil sustituido, heterociclil, heterociclil sustituido, heterociclilalquil, heterociclilalquil sustituido, aril, aril sustituido, heteroaril, heteroaril sustituido, heteroaralquil, heteroaralquil sustituido, aralquil o aralquil sustituido.

[0124] Según se utiliza aquí, la expresión “sulfonil” designa el grupo –S(O)2-.

[0125] Según se utiliza aquí, la expresión “sulfonil sustituido” designa el grupo –S(O)2Rt, donde Rt es alquil inferior, alquil inferior sustituido, cicloalquil, cicloalquil sustituido, cicloalquilalquil, cicloalquilalquil sustituido, heterociclil, heterociclil sustituido, heterociclilalquil, heterociclilalquil sustituido, aril, aril sustituido, heteroaril, heteroaril sustituido, heteroalquil, heteroaralquil sustituido, aralquil o aralquil sustituido.

[0126] Según se utiliza aquí, la expresión “sulfonilamino” designa el grupo –NRqS(O)2-donde Rq es hidrógeno o alquil inferior.

[0127[ Según se utiliza aquí, la expresión “sulfonilamino sustituido” designa el grupo –NRqS(O)2Ru, donde Rq es hidrógeno o alquil inferior y Ru es alquil inferior, alquil inferior sustituido, cicloalquil, cicloalquil sustituido,

heterociclil, heterociclil sustituido, aril, aril sustituido, heteroaril, heteroaril sustituido, heteroaralquil, heteroaralquil sustituido, aralquil o aralquil sustituido.

[0128] Según se utiliza aquí, la expresión “sulfuril” designa el grupo –S(O)2-.

[0129] Según se utiliza aquí en conexión con los valores numéricos, el término “aproximadamente” o “alrededor de” significa 10% del valor indicado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0130]

La figura 1 es una representación esquemática del mecanismo de la formación de enlace fosfodiéster mediante ADNligasas dependientes de ATP y dependientes de NAD+.

La figura 2 muestra resultados de gel PAGE de las reacciones de ligadura en ausencia de ligasa (vía 2), en ausencia de ATP (vía 3), en ausencia del molde de ácido nucleico (vía 4) y un control positivo (dador, aceptor, cofactor ATP, ligasa y molde) (vía 5).

Las figuras 3A-3C muestran resultados de un experimento PCR a tiempo real para detectar el producto de ligadura. La figura 3A representa curvas de amplificación de una serie de seis diluciones de un producto de ligadura, incluyendo un control (NTC) a partir de una ligadura elaborada en ausencia del molde. La figura 3B representa una curva de disociación a partir de las reacciones elaboradas en la Figura 3A. La figura 3C muestra una curva estándar en la que los valores Ct extraídos de la curva estándar se trazaron frente al factor de dilución.

La figura 4 muestra resultados de gel PAGE a partir de reacciones de ligadura con los siguientes cofactores modificados: 7-deaza-ATP, N1-metil-ATP, 2-amino-ATP, 2’-amino-2’-deoxi-ATP, 3’-amino-2’,3’-dideoxi-ATP comparados con las reacciones de ligadura utilizando ATP con pares de bases emparejados (T-A) y mal emparejados (C-A) en el extremo 3’ de la hebra aceptor.

La figura 5 es una serie de diagramas de dispersión que evalúan 10 cofactores ATP modificados por la producción de ligadura relativa en presencia de un par de bases emparejado en el extremo 3’ de la hebra del aceptor (T-A) con la producción relativa de tres pares de bases modelo diferentes mal emparejados en el extremo 3’ de la hebra aceptor (C-A, G-A y A-A). Preferiblemente, un cofactor modificado con una especificidad mejorada relativo a un cofactor sin modificar tiene una producción de ligadura similar a un emparejamiento T-A (valor cerca de 1 en el eje y) y una producción de ligadura mal emparejada (C-A, G-A y A-A) cercana a cero en el eje x.

La figura 6 es una serie de diagramas de dispersión evaluando aceptores modificados por la producción de ligadura relativa en presencia de un par de bases emparejado en el extremo 3’ de la hebra aceptor (T-A) con la producción relativa con tres pares de bases diferentes mal emparejados en el extremo 3’ de la hebra aceptor (T-G, T-C y T-T), según se describe en el ejemplo 1. Los aceptores modificados estudiados contenían un único grupo de sustitución: PS (X1) indica S en la posición X1, PS (X2) indica S en la posición X2, PMe (X1) indica Me en la posición X1, PMe (X2) indica Me en la posición X2, 2’-OMe (Y1) indica OCH3 en la posición Y1, 2’-OMe (Y2) indica OCH3 en la posición Y2, 2’-OMe (Y3) indica OCH3 en la posición Y3, 2’-F (Y1) indica F en la posición Y1, 2’-F (Y2) indica F en la posición Y2 y 2’-F (Y3) indica F en la posición Y3, según se define en la fórmula II. Preferiblemente, un candidato aceptor modificado con una especificidad mejorada relativa a un aceptor sin modificar tendrá una producción de ligadura similar a un emparejamiento T-A (valor cerca de 1 en el eje y) y una producción de ligadura de mal emparejamiento (C-A, G-A y A-A) cerca de cero en elejex.

La figura 7 es una serie de diagramas de dispersión evaluando los dadores modificados para la producción de ligadura relativa en presencia de un par de bases emparejado en el extremo 3’ de la hebra aceptor (T-A) con la producción relativo con dos pares de bases mal emparejados diferentes en el extremo 3’ de la hebra aceptor (T-C, y C-A) según se describe en el ejemplo 1. Los dadores modificados contenían un único grupo de sustitución: PMe (X1) indica Me en la posición X1, PMe (X2) indica Me en la posición X2, 2’-Ome (Y1) indica OCH3 en la posición Y1, 2’-Ome (Y2) indica OCH3 en la posición Y2 y 2’-Ome (Y3) indica OCH3 en la posición Y3, según se define en la fórmula III. Preferiblemente, un dador modificado con una especificidad mejorada relativa a un dador sin modificar tiene una producción de ligadura similar a la producción de ligadura de emparejamiento T-A (valor cercano a 1 en el eje y) y una producción de ligadura de mal emparejamiento (C-A, G-A y A-A) cercano a cero en el eje x.

La figura 8 muestra tablas de producciones de ligadura relativas utilizando hebras de aceptor modificado de cadena central y de azúcar en combinación con diferentes cofactores ATP modificados. Estos valores son

relativos a las producciones de ligadura utilizando hebras de aceptor natural y ATP con pares de bases emparejados (T-A) y mal emparejados (T-C) en el extremo 3’ de la hebra aceptor, según se describe en el ejemplo 1. En el caso emparejado (T-A), los valores en las celdas sombreadas con puntos representan una producción de ligadura relativa mayor a 0,85, los valores en las celdas sin sombrear representan una producción de ligadura relativa de 0,70-0,85 y los valores en las celdas sombreadas en gris representan una producción de ligadura relativa de 0-0,70. En el caso mal emparejado (T-C), los valores en las celdas sombreadas con puntos representan una producción de ligadura relativa de 0,0-0,01, los valores de celdas sin sombrear representan una producción de ligadura relativa de 0,01-0,10 y los valores en celdas sombreadas en gris representan una producción de ligadura relativa de 0,10-1,00. Las combinaciones con criterios de rendimiento preferidos tienen una producción relativa mayor a 0,85 en el caso emparejado (T-A) (p.ej., las celdas sombreadas con puntos en la Figura 8, gráfico superior) y menor a 0,01 en presencia de un molde mal emparejado (T-C) (p.ej., las celdas sombreadas con puntos en la figura 8, gráfico inferior).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0131] Una reacción de ligadura de ácido nucleico incluye (a) adenilación de la enzima ligasa, (b) hibridación de los polinucleótidos dador y aceptor en un ácido nucleico diana seguido por (c) transferencia del adenilato a la hebra dador y la ligadura para formar una copia unida complementaria de la secuencia de ácido nucleico mediante un ácido nucleico ligasa. Sin embargo, la ligadura de dadores y aceptores puede ocurrir 1) cuando el dador o aceptor están mal emparejados (no son complementario) en relación con el molde de ácido nucleico o 2) en ausencia de un molde de ácido nucleico.

[0132] Los métodos y composiciones proporcionan aquí métodos y composiciones mejorados para una ligadura de ácido nucleico. En aspectos particulares, los métodos y composiciones se dirigen al uso de componentes de ligadura modificados en reacciones de ligadura enzimática. En otros aspectos, el proceso de ligadura de ácido nucleico emplea uno o más cofactores modificados, dador modificado y/o aceptor modificado, la presencia de los cuales afecta la formación de productos de ligadura no deseados en ausencia de molde o en presencia de malos emparejamientos.

Cofactores de ligasa modificados

[0133] Ciertos aspectos y modos de realización de las composiciones y métodos aquí proporcionados incluyen al menos un cofactor de ligasa modificado. En modos de realización preferidos, el cofactor de ligasa modificado es un ATP modificado con uno o más grupos de sustitución.

[0134] En modos de realización de los aspectos aquí presentados, los ATPs modificados y derivados de los mismos de acuerdo con la invención proporcionan compuestos de Fórmula IA:

donde:

123 4 1+1

W, W, Wy Westán independientemente seleccionados del grupo que consiste en N, CRy NR;

cada R1 está seleccionado de manera independiente del grupo que consiste en H, F, CI, Br, I, OR2, SR2, SeR2, NR2R3, N3, C(Y)R4, alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido, donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

1 22222322223

ZseseleccionadelgrupoqueconsisteenH,F,R,OR,SR,SeR,NRR,NROR,NR-NRR,CN, N3, (BH3)-M+ y C(Y)R4;

M+ es un catión; cada R2 y cada R3 está seleccionados independientemente del grupo que consiste en H o alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido.

donde cualquier sustituyente puede contenter opcionalmente uno o más heteroátomos;

4 222232

cada Rse selecciona del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR, SR, SeR, NRR, C(Y)Ry alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido, donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

11 11234

cada Y se selecciona del grupo que consiste en O, S, Se, CRRy NR; y X, X, Xy Xse selecciona

5 cada uno de manera independiente del grupo que consiste en R, NROR, NR-NRR, CN, N3, NO, NO2, NCO, NCS, OCN, SCN, and SSR2.

[0135] Los modos de realización preferidos de ATP modificado tienen la estructura:

donde:

1234 ++

10 W, W, Wy Wse seleccionan de manera independiente del grupo que consiste en N, N-CH3, N-CH2CH3, N+-CH2CH2CH3, N+-CH2CH2CH2CH3, N+-CH(CH3)2, CH, C-CH3, C-CH2CH3, C-CH2CH2CH3, C-CH2CH2CH2CH3, C-CH(CH3)2, C-NH2, C-NHCH3, C-N(CH3)2, C-N3 yC-OH;

Z1 se selecciona del grupo que consiste en H, F, CH3, fenil, OCH3, OCH2CH3, OCH2CH2CH3, OCH2CH2CH2CH3, OCH(CH3)2, SH, SCH3, SCH2CH3, SCH2CH2CH3, SCH2CH2CH2CH3, SCH(CH3)2, SeH,

15 SeCH3, SeCH2CH3, SeCH2CH2CH3, SeCH2CH2CH2CH3, SeCH(CH3)2, NH2, NHCH3, NCH3CH3, NHOCH3, NCH3OCH3,NH-NH2, NH-NHCH3, NH-NCH3CH3, NCH3-NH2, NCH3-NHCH3, NCH3-NCH3CH3" CN, N3 y (BH3)-M+;

M+ es un catión;

X1 se selecciona del grupo que consiste en H, NH2, OH, NHCH3 y N(CH3)2;

20 X2 se selecciona del grupo que consiste en H, Cl, OH, NH2, NHCH3 y N(CH3)2; X3 se selecciona del grupo que consiste en H, F, CH3, OH, SH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2 y N3; y X4 se selecciona del grupo que consiste en H, F, OH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2, y N3. [0136] Los modos de realización preferidos de ATP modificado tienen la estructura:

25 donde:

123 4 1+1

W, W, Wy Wse seleccionan independientemente del grupo que consiste en N, CRy NR; y

1 222

cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OR, SR, SeR, NR2R3, N3, C(Y)R4, y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

30 cada R2 y cada R3 está seleccionado independientemente del grupo que consiste en H o alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede opcionalmente contener uno o más heteroátomos;

4 222232

cada Rse selecciona del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR, SR, SeR, NRR, C(Y)Ry alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede opcionalmente contener uno o más heteroátomos; y cada Y se 5 selecciona del grupo que consiste en O, S, Se, CR1R1 y NR1.

[0137] Los modos de realización preferidos de ATP modificado tienen la estructura:

donde:

1234 +

W, W, Wy Wse seleccionan independientemente del grupo que consiste en N, N-CH3, N+-CH2CH3, N+-CH2CH2CH3, N+-CH2CH2CH2CH3, N+-CH(CH3)2, CH, C-CH3, C-CH2CH3, C-CH2CH2CH3, C-CH2CH2CH2CH3, C-CH(CH3)2, C-NH2, C-NHCH3, C-N(CH3)2, C-N3 y C-OH.

[0138] Los modos de realización preferidos de ATP modificado tienen la estructura:

donde:

1 11111211111

15 ZseseleccionadelgrupoqueconsisteenH,F,R,OR,SR,SeR,NRR,NROR,NR-NRR,CN, N3, (BH3)-M+ y C(Y)R2;

M+ es un catión; cada R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H o alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

20 donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o mas heteroátomos;

2 111111

cada Rse selecciona del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR, SR, SeR, NRR, C(Y)Ry alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; y cada Y se selecciona del grupo que consiste en O, S, Se, CR1R1 y NR1.

25 [0139] Los modos de realización preferidos de ATP modificado tienen la estructura:

donde:

Z1 se selecciona del grupo que consiste en H, F, CH3, fenil, OCH3, OCH2CH3, OCH2CH2CH3, OCH2CH2CH2CH3, OCH(CH3)2, SH, SCH3, SCH2CH3, SCH2CH2CH3, SCH2CH2CH2CH3, SCH(CH3)2, SeH, SeCH3, SeCH2CH3, SeCH2CH2CH3, SeCH2CH2CH2CH3, SeCH(CH3)2, NH2, NHCH3, NCH3CH3, NHOCH3,

5 NCH3OCH3,NH-NH2, NH-NHCH3, NH-NCH3CH3, NCH3-NH2, NCH3-NHCH3, NCH3-NCH3CH3,CN, N3 y (BH3)-M+;

M+ es un catión

[0140] Los modos de realización preferidos de ATP modificado tienen la estructura:

10 donde:

123 4 123222

X, X, Xy Xse seleccionan independientemente del grupo que consiste en R, NRR, NROR, NR -NR2R3, CN, N3, NO, NO2, NCO, NCS, OCN, SCN y SSR2;

1 222

cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OR, SR, SeR, NR2R3, C(Y)R4 y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

15 donde cualquier sustituyente puede cada uno contener opcionalmente uno o más heteroátomos; cada R2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H o alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede cada uno contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

4 222232

each Rse selecciona del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR, SR, SeR, NRR, C(Y)Ry alquenil, 20 alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede cada uno contener opcionalmente uno o más heteroátomos; y cada Y se selecciona del grupo que consiste en O, S, Se, CR1R1 y NR1.

[0141] Los modos de realización preferidos de ATP modificado tienen la estructura:

25 donde: X1 se selecciona del grupo que consiste en H, NH2, OH, NHCH3 y N(CH3)2; X2 se selecciona del grupo que consiste en H, Cl, OH, NH2, NH(CH3) y N(CH3)2; X3 se selecciona del grupo que consiste en H, F, CH3, OH, SH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2 y N3; y X4 se selecciona del grupo que consiste en H, F, OH, SH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2 y N3.

30 [0142] Los modos de realización preferidos de ATP modificado tienen la estructura:

donde:

123 1222

X, Xy Xse selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en R, NROR, NR-NR2R3, CN, N3, NO, NO2, NCO, NCS, OCN, SCN y SSR2;

1 222

5 cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OR, SR, SeR, NR2R3, N3, C(Y)R4, y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; cada R2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H o alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

10 donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

4 222

cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR, SR, SeR, NR2R3, C(Y)R2 y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido, donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; cada Y se selecciona del grupo que consiste en O, S, Se, CR1R1 y NR1. 15 [0143] Los modos de realización preferidos de ATP modificado tienen la estructura:

donde: X1 se selecciona del grupo que consiste en H, NH2, OH, NHCH3, y N(CH3)2; X2 se selecciona del grupo que consiste en H, F, CH3, OH, SH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2 y N3; y X3 se selecciona del grupo que consiste en H, F, OH, SH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2 y N3.

[0144] Los modos de realización preferidos de ATP modificado tienen la estructura:

donde:

12 122223

Xy Xse selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en R, NROR, NR-NRR, 25 CN, N3, NO, NO2, NCO, NCS, OCN, SCN y SSR2;

cada R1 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OR2, SR2, SeR2, NR2R3, N3, C(Y)R4, alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido, donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; cada R2 y cada R3 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en H o alquenil, 5 alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; cada R4 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR2, SR2, SeR2, NR2R3, C(Y)R2 y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; 10 cada Y se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en O, S, Se, CR1R1 y NR1. [0145] Los modos de realización preferidos de ATP modificado tienen la estructura:

donde:

X1 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en H, F, CH3, OH, SH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2, y N3; y X2 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en H, F, OH, SH, OCH3, NH2,

NHCH3, N(CH3)2, y N3. [0146] Los modos de realización preferidos de ATP modificado tienen la estructura:

20 donde:

12 1+1

Wy Wse selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en N, CR, y NR; y

1 222

cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OR, SR, SeR, NR2R3, N3, C(Y)R4 y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido, donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; 25 cada R2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H o alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido, donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

4 222

cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR, SR, SeR, NR2R3, C(Y)R2 y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

30 donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, Se, CR1R1 y NR1. [0147] Los modos de realización de ATP modificado tienen la estructura:

donde:

12 ++

5 Wy Wse selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en N, N-CH3, N-CH2CH3, N+-CH2 CH2CH3, N+-CH2CH2CH2CH3, N+-CH(CH3)2, CH, C-N3, C-CH3, C-CH2CH3, C-CH2 CH2CH3, C-CH2CH2CH2CH3, C-CH(CH3)2, C-NH2, C-NHCH3, C-N(CH3)2, and C-OH.

[0148] Ciertos modos de realización de ATP modificado son los siguientes:

3’-amino-3’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato

3’-amino-2’, 3’-dideoxi-adenosina-5’-trifosfato 2’-amino-2’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato 2’-amino-2’,3’-dideoxi-adenosina-5’-trifosfato

3’-azido-3’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato

3’-azido-2’, 3’-dideoxi-adenosina-5’-trifosfato 2’-azido-2’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato 2’-azido-2’, 3’-dideoxi-adenosina-5’-trifosfato

3’-fluoro-3’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato

3’-fluoro-2’, 3’-dideoxi-adenosina-5’-trifosfato 2’-fluoro-2’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato 2’-fluoro-2’, 3’-dideoxi-adenosina-5’-trifosfato

2’-dideoxi-adenosina-5’-trifosfato

3’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato 2’, 3’-dideoxi-adenosina-5’-trifosfato 2’-ara-adenosina-5’-trifosfato

3’-metil-3’deoxiadenosina-5’-trifosfato

3’-metil-2’,3’dideoxiadenosina-5’-trifosfato 3’-tio-3’-deoxiadenosina-5’-trifosfato 3’-tio-2’, 3’-dideoxiadenosina-5’-trifosfato

3’-metilamino-3’deoxiadenosina-5’-trifosfato

3’-metilamino-2’, 3’dideoxiadenosina 3’-metoxi-3’-deoxi-2-amino-adenosina 3’-metoxi-2’,3’-dideoxi-2-amino-adenosina

5’-trifosfato

5’-trifosfato

5’-trifosfato

2’-metoxi-2’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato

2’-metoxi-2’,3’-dideoxi-adenosina 3’-metoxi-3’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato 3’-metoxi-2’,3’-dideoxi-adenosina-5’

5’-trifosfato

trifosfato

2’-metoxi-2’-deoxi-2-amino-adenosina

2’-metoxi-2’,3’-dideoxi-2-amino-adenosina

5’-trifosfato

5’-trifosfato

[0149] Ciertos aspectos y modos de realización de las composiciones y métodos aquí proporcionados incluyen al menos un cofactor de ligasa modificado. En modos de realización preferidos, el cofactor de ligasa modificado es un NAD+ modificado con uno o más grupos de sustitución.

[0150] En modos de realización de los aspectos aquí presentados, los NAD+ modificados y derivados de los mismos de acuerdo con la invención proporcionan compuestos de la Fórmula IB:

donde:

123 4 1+1

W, W, Wy Wse selecciona independientemente del grupo que consiste en N, CRy NR;

1 222

10 cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OR, SR, SeR, NR2R3, C(Y)R, y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; cada R2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H o alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

15 donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

4 222

cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR, SR, SeR, NR2R3, C(Y)R2, y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

11 123

cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, Se, C(R)2, y NR; y X, X, X,

4 122

5 y Xse selecciona independientemente del grupo que consiste en R, NROR, NR2-NR2R3, CN, N3, NO, NO2, NCO, NCS, OCN, SCN y SSR2. [0151] Los modos de realización preferidos de NAD+ modificado tienen la estructura:

donde:

1234 ++

10 W, W, Wy W, se seleccionan independientemente del grupo que consiste en N, N-CH3, N-CH2CH3, N+-CH2CH2CH3, N+-CH2CH2CH2CH3, N+-CH(CH3)2, CH, C-CH3, C-CH2CH3, C-CH2 CH2CH3, C-CH2CH2CH2CH3, C-CH(CH3)2, C-NH2, C-NHCH3, C-N(CH3)2, C-N3 y C-OH;

X1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, NH2, OH, NHCH3 y N(CH3)2; X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, Cl, OH, NH2, NH(CH3) y N(CH3)2;

15 X3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, CH3, OH, SH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2 y N3; y X4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, OH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2 y

N3. [0152] Los modos de realización preferidos de NAD+ modificado tienen la estructura:

donde:

123 4 1+1

W, W, Wy Wse selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en N, CRy NR; y

1 222

cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OR, SR, SeR, NR2R3, N3, C(Y)R4, y o alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido, donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; cada R2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H o alquenil, alquinil, aril, 5 aralquil y alquil sustituido o no sustituido, donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

4 222

cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR, SR, SeR, NR2R3, C(Y)R2 y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; y cada Y se 10 selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, Se, CR1R1 y NR1.

[0153] Los modos de realización preferidos de NAD+ modificado tienen la estructura:

donde:

2345 ++

W, W, W, y Wse selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en N, N-CH3, N-CH2CH3, N+-CH2CH2CH3, N+-CH2CH2CH2CH3, N+-CH(CH3)2, CH, C-CH3, C-CH2CH3, C-CH2 CH2CH3, C-CH2CH2CH2CH3, C-CH(CH3)2, C-NH2, C-NHCH3, C-N(CH3)2, C-N3 y C-OH.

[0154] Los modos de realización preferidos de NAD+ modificado tienen la estructura:

donde:

1234 1222

20 X, X, X, y Xse selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en R, NROR, NR-NR2R3, CN, N3, NO, NO2, NCO, NCS, OCN, SCN y SSR2;

1 222

cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OR, SR, SeR, NR2R3, C(Y)R4, y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

cada R2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H o alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido, donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; cada R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR2, SR2, SeR2, 5 NR2R3, C(Y)R2 y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido, donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; y cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, Se, CR1R1, y NR1. [0155] Los modos de realización del NAD+ modificado tienen la estructura:

10 donde: X1 se selecciona del grupo que consiste en H, NH2, OH, NHCH3 y N(CH3)2; X2 se selecciona del grupo que consiste en H, Cl, OH, NH2, NH(CH3) y N(CH3)2; X3 se selecciona del grupo que consiste en H, F, CH3, OH, SH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2 y N3; y X4 se selecciona del grupo que consiste en H, F, OH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2 y N3.

15 [0156] Los modos de realización preferidos de NAD+ modificado tienen la estructura:

donde:

123 1222

X, Xy Xse selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en R, NROR, NR-NR2R3, CN, N3, NO, NO2, NCO, NCS, OCN, SCN y SSR2;

1 222

20 cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OR, SR, SeR, NR2R3, C(Y)R4, y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido, donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

cada R2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H o alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

4 222232

cada Rse selecciona del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR, SR, SeR, NRR, C(Y)R, y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido, donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; cada Y se selecciona del grupo que consiste en f O, S, Se, CR1R1 y NR1. [0157] Los modos de realización preferidos de NAD+ modificado tienen la estructura:

10 donde: X1 se selecciona del grupo que consiste en H, NH2, OH, NHCH3 y N(CH3)2; X2 se selecciona del grupo que consiste en H, F, CH3, OH, SH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2 y N3; y X3 se selecciona del grupo que consiste en H, F, OH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2 y N3.

[0158] Los modos de realización preferidos de NAD+ modificado tienen la estructura:

donde:

12 122223

Xy Xse selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en R, NROR, NR-NRR, CN, N3, NO, NO2, NCO, NCS, OCN, SCN y SSR2;

1 222

cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OR, SR, SeR, 20 NR2R3, C(Y)R4, y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

cada R2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H o alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

4 222

cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR, SR, SeR, NR2R3, C(Y)R2, y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; y cada Y se 5 selecciona del grupo que consiste en O, S, Se, CR1R1 y NR1.

[0159] Los modos de realización preferidos de NAD+ modificada tienen la estructura:

donde: X1 se selecciona del grupo que consiste en H, F, CH3, OH, SH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2 y N3; y X2 se selecciona del grupo que consiste en H, F, OH, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2 y N3.

[0160] Los modos de realización preferidos de NAD+ modificado tienen la estructura:

donde:

1 2 1+1

Wy Wse selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en N, CRy NR; y

1 222

15 cada Rse selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OR, SR, SeR, NR2R3, N3, C(Y)R4, y alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; cada R2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H o alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

20 donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

4 222232

cada Rse selecciona del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR, SR, SeR, NRR, C(Y)Ry alquenil, alquinil, aril, aralquil y alquil sustituido o no sustituido,

donde cualquier sustituyente puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos; y cada uno se selecciona del grupo que consiste en O, S, Se, CR1R1, and NR1.

[0161] Los modos de realización de NAD+ modificado tienen la estructura:

donde:

12 ++

Wy Wse selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en N, N-CH3, N-CH2CH3, N+-CH2CH2CH3, N+-CH2CH2CH2CH3, N+-CH(CH3)2, CH, C-N3, C-CH3, C-CH2CH3, C-CH2 CH2CH3, C-CH2CH2CH2CH3, C-CH(CH3)2, C-NH2, C-NHCH3, C-N(CH3)2 y C-OH.

[0162] Los modos de realización preferidos de NAD+ modificado tienen la estructura:

Aceptores modificados

[0163] Ciertos aspectos y modos de realización de las composiciones y métodos aquí proporcionados incluyen al menos un aceptor modificado. En modos de realización preferidos, el aceptor modificado tiene uno o más grupos de sustitución. En algunos modos de realización, los aceptores modificados adecuados para el uso con los 15 métodos y composiciones aquí descritas incluyen aquellos que se describen en la técnica, por ejemplo, sondas

quiméricas de APN-ADN en Egholm, M., et al., Patente Estadounidense Núm. 6,297,016) y sondas sustituidas 3’-NH2 (Fung, S., et al., Patente Estadounidense Núm. 5,593,826),

[0164] En modos de realización de los aspectos aquí presentados, los aceptores modificados y derivados de los mismos de acuerdo con la invención proporcionan compuestos de Fórmula II:

5 donde: B1, B2, y B3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en purina o pirimidina sustituida o no sustituida, cualquier aza o deaza derivada de las mismas y cualquier "base universal" o "base degenerada", que es preferiblemente reconocible por un ácido nucleico polimerasa o ligasa; 10 X1 y X2 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CH3 y OCH2CH3; Y1, Y2 e Y3 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en H, F, OH, y OCH3; y W se selecciona de H o un residuo oligonucleótido. [0165] Los modos de realización preferidos de aceptores modificados tienen la estructura:

15 donde: B1, B2, y B3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en purina o pirimidina sustituida o

no sustituida, cualquier aza o deaza derivada de las mismas y cualquier "base universal" o "base degenerada", que es preferiblemente reconocible por un ácido nucleico polimerasa o ligasa; X1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH, OCH2CH3 y CH3;

20 X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH, OCH2CH3 y CH3;

Y1, Y2 e Y3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y OCH3;

W se selecciona de H o de un residuo oligonucleótido.

Dadores modificados

[0166] Ciertos aspectos y modos de realización de las composiciones y métodos proporcionados aquí incluyen al

5 menos un dador modificado. En modos de realización preferidos, el dador modificado tiene uno o más grupos de sustitución. En algunos modos de realización, los aceptores modificados adecuados para su uso con los métodos y composiciones aquí descritos incluyen aquellos según se describen en la técnica, por ejemplo, el uso de 5’tiofosfatos en la hebra dador (5’-fosfato) (Bandaru, R., et al., Patentes Estadounidenses Núms. 6,811,986 y 6,635,425).

10 [0167] En los modos de realización de los aspectos aquí presentados, los dadores modificados y derivados de los mismos de acuerdo con la invención proporcionan compuestos de la Fórmula III:

donde: B1, B2, y B3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en purina o pirimidina sustituida o

15 no sustituida, cualquier aza o deaza derivada de las mismas y cualquier "base universal" o "base degenerada", que es preferiblemente reconocible por un ácido nucleico polimerasa o ligasa; X1 y X2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CH3 y OCH2CH3; Y1, Y2 e Y3 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en H, F, OH y OCH3; y W se selecciona de H o un residuo oligonucleótido.

20 [0168] Los modos de realización preferidos de dadores modificados tienen la estructura:

donde: B1, B2, y B3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en purina o pirimidina sustituida o no sustituida, cualquier aza o deaza derivada de las mismas y cualquier "base universal" o "base

5 degenerada", que es preferiblemente reconocible por un ácido nucleico polimerasa o ligasa; X1 y X2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en OH, SH, OCH2CH3 o CH3; Y1, Y2 e Y3 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en H y OCH3; W se selecciona de H o un residuo oligonucleótido.

Combinaciones de cofactores de ligasa modificados, aceptores modificados y dadores modificados

10 [0169] Ciertos aspectos y modos de realización de las composiciones y métodos aquí proporcionados incluyen el uso de combinaciones de cofactores de ligasa modificados, aceptores modificados y dadores modificados. Cualquier posible combinación de dos o más puede utilizarse. En algunos modos de realización, más de un tipo de cofactor ligasa, aceptor modificado o dador modificado puede utilizarse.

[0170] Las combinaciones de ejemplo incluyen combinaciones de dos o más cofactores ligasa modificados, 15 aceptores modificados y dadores modificados seleccionados de los grupos según sigue: Aceptores Modificados:

donde

B1, B2, y B3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en purina o pirimidina sustituida o no sustituida, cualquier aza o deaza derivada de las mismas y cualquier "base universal" o "base degenerada", que es preferiblemente reconocible por un ácido nucleico polimerasa o ligasa;

X1 y X2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CH3 y OCH2CH3; Y1, Y2 e Y3 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en H, F, OH y OCH3; y W se selecciona de H o un residuo oligonucleótido.

Dadores modificados:

[0171]

donde B1, B2, y B3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en purina o pirimidina sustituida o no sustituida, cualquier aza o deaza derivada de la misma y cualquier "base universal" o "base

10 degenerada", que es preferiblemente reconocible por un ácido nucleico polimerasa o ligasa; X1 y X2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CH3 y OCH2CH3; Y1, Y2 e Y3 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en H, F, OH y OCH3; y W se selecciona de H o un residuo oligonucleótido.

Cofactores modificados: 15 [0172]

7-deaza-adenosina-5’-trifosfato

7-deaza-2’-deoxiadenosina 7-metil-7-deaza-adenosina 7-metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina

5’-trifosfato

5’-trifosfato

5’-trifosfato

N1-metil-adenosina-5’-trifosfato

N1-metil-2’-deoxiadenosina 8-cloro-adenosina 8-cloro-2’-deoxi-adenosina

5’-trifosfato

5’-trifosfato

5’-trifosfato

8-aza-adenosina-5’-trifosfato

8-aza-2’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato 8-azido-adenosina-5’-trifosfato 8-azido-2’-deoxi-adenosina

5’-trifosfato

N6-metil-adenosina-5’-trifosfato

N6-metil-2’-deoxi-adenosina 2-Cloropurina-2’-deoxiribosida 2-aminopurina-2’-deoxiribosida

5’-trifosfato

5’-trifosfato

5’-trifosfato

inosina-5’-trifosfato

2’-deoxi-inosina-5’-trifosfato 2-amino-adenosina-5’-trifosfato 2-amino-2’-deoxiadenosina

5’-trifosfato

2-amino-3’-deoxiadenosina

2-amino-2’,3’-dideoxiadenosina

5’-trifosfato

5’-trifosfato

3’-amino-3’-deoxi-adenosina5’-trifosfato

3’-azido-3’-deoxi-adenosina5’-trifosfato

3’-fluoro-3’-deoxi-adenosina5’-trifosfato

2’-deoxi-adenosina5’-trifosfato

3’-metil-3’-deoxiadenosina5’-trifosfato

3’-metilamino-3’-deoxi

adenosina-5’-trifosfato

2’-metoxi-2’-deoxi-adenosina5’-trifosfato

2’-metoxi-2’-deoxi-2-amino-adenosina5’-trifosfato

3’-amino-2’,3’-dideoxi-adenosina5’-trifosfato

3’-azido-2’,3’-dideoxi-adenosina5’-trifosfato

3’-fluoro-2’,3’-dideoxi-adenosina5’-trifosfato

3’-deoxi-adenosina5’-trifosfato

3’-metil-2’,3’-dideoxiadenosina5’-trifosfato

3’-metilamino-2’,3’-dideoxiadenosina-5’-trifosfato

2’-metoxi-2’,3’-dideoxi-adenosina5’-trifosfato

2’-metoxi-2’,3’-dideoxi-2-amino-adenosina5’-trifosfato 2’-amino-2’-deoxi-adenosina5’-trifosfato

2’-azido-2’-deoxi-adenosina5’-trifosfato

2’-fluoro-2’-deoxi-adenosina5’-trifosfato

2’,3’-dideoxi-adenosina5’-trifosfato

3’-tio-3’-deoxiadenosina5’-trifosfato

3’-metoxi-3’-dideoxi-2-amino adenosina-5’-trifosfato

2’-metoxi-3’-deoxi-adenosina5’-trifosfato 2’-amino-2’,3’-dideoxi-adenosina5’-trifosfato

2’-azido-2’,3’-dideoxi-adenosina5’-trifosfato

2’-fluoro-2’,3’-dideoxi-adenosina5’-trifosfato

2’-ara-adenosina5’-trifosfato

3’-tio-2’,3’-dideoxiadenosina5’-trifosfato

3’-metoxi-2’,3’-dideoxi-2-amino adenosina-5’-trifosfato

2’-metoxi-2’,3’-dideoxi-adenosina5’-trifosfato

[0173] Las combinaciones particularmente preferidas de los componentes modificados de ligasa se seleccionan de los aceptores modificados, los dadores modificados y los cofactores modificados según sigue:

Aceptores modificados:

donde B1, B2, y B3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en purina o pirimidina sustituida o

no sustituida, cualquier aza o deaza derivada de las mismas y cualquier "base universal" o "base degenerada", que es preferiblemente reconocible por un ácido nucleico polimerasa o ligasa; X1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, OH, SH, OCH2CH3 y CH3; X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, OH, SH, OCH2CH3 y CH3; Y1, Y2 e Y3 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en H y OCH3; y

W se selecciona de H o un residuo oligonucleótido. Dadores Modificados:

[0174]

5 donde B1, B2, y B3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en purina o pirimidina sustituida o

no sustituida, cualquier aza o deaza derivada de la misma y cualquier "base universal" o "base degenerada", que es preferiblemente reconocible por un ácido nucleico polimerasa o ligasa; X1 y X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, OH, SH, OCH2CH3 y CH3;

10 Y1, Y2 e Y3 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en H y OCH3; y W se selecciona de H o un residuo oligonucleótido. Cofactores Modificados:

[0175]

15 [0176] En un aspecto, los métodos y composiciones aquí presentados proporcionan componentes de ligasa modificados. En algunos modos de realización, los componentes de ligasa modificados pueden tener sólo un grupo de sustitución. En otros modos de realización, los componentes de ligasa modificados pueden contener más de un grupo de sustitución como modificaciones en la base, la cadena de triosfato, azúcar, o combinaciones de los mismos. En otros modos de realización, los componentes de ligasa modificados pueden contener más de

20 un tipo de grupo de sustitución. Los componentes de ligasa modificados pueden tener la fórmula química de las Fórmulas I-III aquí descritas.

[0177] En otro aspecto, se proporcionan aquí métodos de síntesis de los componentes de ligasa modificados con una estructura química según se describe en las Fórmulas I-III descritas aquí más adelante. Los grupos de

sustitución pueden integrarse en un cofactor, aceptor o dador de ligasa, mediante el uso de métodos sintéticos o enzimáticos existentes. Los componentes de ligasa modificados de los métodos y composiciones aquí proporcionados pueden sintetizarse por cualquier método conocido en la técnica. Siguiendo a la síntesis y a la purificación de los componentes de ligasa modificados, varios procedimientos diferentes pueden utilizarse para 5 determinar la aceptabilidad de los componentes de ligasa modificados en términos de estructura y pureza. Los ejemplos de dichos procedimientos son espectroscopía de resonancia magnética nuclear, espectrometría de masas, espectroscopia de fluorescencia, espectroscopia ultravioleta, cromatografía líquida de alta eficacia. Estos procedimientos son reconocidos por aquellos especialistas en la técnica. Los métodos actuales empleados para la separación, purificación y análisis en la técnica son aplicables a los componentes de ligasa modificados

10 de los métodos y composiciones también proporcionados aquí.

[0178] Puede utilizarse cualquier grupo de sustitución que consiga los objetivos de los métodos y composiciones aquí proporcionados. El grupo de sustitución debería ser uno que reduzca o merme la formación de producto de ligadura indeseado bajo condiciones de reacción de ligadura en las que los componentes de ligasa modificados deben emplearse.

15 [0179] En algunos modos de realización, los componentes de ligadura modificados mejoran la especificidad de ligadura en comparación con el componente de ligasa sin modificar correspondiente. La mejora de ligadura hace referencia a la habilidad de la ligasa para discriminar entre ácido nucleico emparejado y ácido nucleico mal emparejado. Preferiblemente, la presencia del componente de ligasa modificado reduce o evita la ligadura cuando existe un mal emparejamiento en el dador y/o aceptor en comparación con el ácido nucleico diana (p.ej.,

20 el molde). En otros modos de realización, los componentes de ligadura modificados mejoran la especificidad de ligadura mediante una eficacia disminuida de la ligadura de ácidos nucleicos diana mal emparejados (no complementarios). En modos de realización preferidos, los componentes de ligadura modificados mejoran la especificidad de ligadura mediante la disminución de la eficacia de ligadura de ácidos nucleicos con al menos un par de bases mal emparejado comparado con el ácido nucleico emparejado. En modos de realización preferidos,

25 la ligadura con un componente de ligadura modificado mejora la especificidad de ligadura al menos un 0,1%, al menos un 0,2%, al menos un 0,5%, al menos un 1%, al menos un 2%, al menos un 3%, al menos un 4%, al menos un 5%, al menos un 6%, al menos un 7%, al menos un 8%, al menos un 9%, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 100%, al menos un 150%, al

30 menos un 200%, al menos un 300% o al menos un 400%.

[0180] En algunas reacciones de ligadura, no todas las moléculas de cofactores, aceptores y/o dadores de ligasa en la reacción de ligadura contendrán un grupo de sustitución. Preferiblemente, incluso una mezcla del cofactor de ligasa modificado y del cofactor de ligasa sin modificar mejora la eficacia y la especificidad de ligadura en una población mezclada, en comparación con no utilizar para nada los cofactores de ligasa modificados. 35 Preferiblemente, antes de la incubación a una temperatura inicial de desnaturalización, los cofactores de ligasa modificados recuperan al menos un 25% de las moléculas de cofactor de ligasa totales, preferiblemente al menos un 50% de las moléculas de cofactor de ligasa totales, preferiblemente al menos un 75% de las moléculas de cofactor de ligasa totales, preferiblemente al menos un 90% de las moléculas de cofactor de ligasa totales, preferiblemente al menos un 95% de las moléculas de cofactor de ligasa totales, preferiblemente al menos un

40 98% de las moléculas de cofactor de ligasa totales, más preferiblemente al menos un 99% de las moléculas de cofactor de ligasa totales y más preferiblemente al menos un 100% de las moléculas de cofactor de ligasa totales. En otro modos de realización, dos, tres, cuatro o más tipos de moléculas de cofactor de ligasa pueden emplearse en la reacción de ligadura.

[0181] En un modo de realización, sólo un tipo de cofactores de ligasa modificados está presente en la reacción

45 de ligadura. En otros modos de realización diferentes tipos de cofactor de ligasa modificado pueden estar presentes en la misma reacción de ligadura. En otro modo de realización dos o más tipos de cofactor de ligasa modificado pueden estar presentes en la misma reacción de ligadura. En otro modo de realización tres o más tipos de cofactor de ligasa modificado pueden estar presentes en la misma reacción de ligadura. En otro modo de realización cuatro o más tipos de cofactor de ligasa modificado pueden estar presentes en la misma reacción

50 de ligadura.

[0182] Los métodos de ligadura ejemplares adecuados para su uso con los componentes de ligasa modificados aquí proporcionados incluyen un ensayo de ligadura de oligonucleótidos (OLA) (Landegren, U., et al., 241 Science, 1077-1080 (1988)), reacción en cadena de ligasa (LCR) (Wiedmann, M., et al., 3 Genome Biol, S51-64 (1994)), PCR mediante ligasa (LM-PCR) (Mueller, P.R., et al., 246 Science, 780-786 (1989), Pfeifer, G.P., et al., 55 246 Science, 810-813 (1989)), reacción de detección de ligadura PCR (PCR-LDR) (Cheng, Y.W., et al., 16 Genome Res, 282-289 (2006)), sondas candado (Antson, D., et al., 28 Nucleic Acids Res, e58 (2000)), ensayo de ligadura de oligonucleótido PCR (PCR-OLA) (Delahunty, C., et al., 58 Am J Hum Genet, 1239-1246 (1996)), enfoque de gap LCR (Abravaya, K., et al., 23 Nucleic Acids Res, 675-682 (1995)), SNPlex (De la Vega, F.M., et al., 573 Mutat Res, 111-135 (2005), Livak, K.J. 14 Genet Anal, 143-149 (1999)), MLPA (amplificación de sondas 60 dependientes de ligaduras múltiples)(Schouten, J.P., et al., 30 Nucleic Acids Res, e57 (2002)), ensayo de

genotipado GoldenGate (Fan, J.B., et al., 68 Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 69-78 (2003), Oliphant, A., et al., Suppl Biotechniques, 56-58, 60-51 (2002), Shen, R., et al., 573 Mutat Res, 70-82 (2005)), y ensayos con sondas de inversión molecular (Fodor, S.P., et al., 251 Science, 767-773 (1991), Matsuzaki, H.S., et al., 1 Nat Methods, 109-111 (2004), Matsuzaki, H., et al., 14 Genome Res, 414-425 (2004), Pease, A.C., et al., 91 Proc

5 Natl Acad Sci U S A, 5022-5026 (1994)), ligadura de proximidad (Gustafsdottir, S., et al., 345 Anal Biochem, 2-9 (2005), Söderberg, O., et al., 28 Genet Eng (NY), 85-93 (2007)), y la secuenciación de la siguiente generación mediante ligadura.

[0183] Los enfoques de ejemplo basados en ligadura para la detección de secuencia adecuada para su uso con los componentes de ligasa modificados proporcionados aquí incluyen aquellos descritos en Barany, F., et al., 10 Patentes Estadounidenses Núms. 7,244,831; 6,312,892 y el uso de ligasas termoestables de alta fidelidad (Patente Estadounidense Núm. 6,949,370), acoplamiento LDR y PCR (Barany, F., et al., Patentes Estadounidenses Núms. 7,097,980; 6,797,470; 6,268,148 ; 6,027,889; 7,166,434), ligadura utilizando una endonucleasa (Barany, F., et al., Patentes Estadounidenses Núms. 7,198,894; 7,014,994), OLA/PCR (Eggerding, F., US Patent Nos. 5,912,148; 6,130,073), ligadura/amplificación (Lao, K.Q., US Patent No. 7,255,994), ligadura y 15 división gradual (Brenner, S., et al., US Patent Nos. 5,714,330; 5,552,278), ligadura de proximidad (Gustafsdottir, S., et al., 345 Anal Biochem, 2-9 (2005), Söderberg, O., et al., 28 Genet Eng (NY), 85-93 (2007), Fredriksson, S., et al., 20 Nat Biotechnol, 473 -477 (2002)), ligadura de proximidad para la detección de patógenos (Gustafsdottir, S.M., et al., 52 Clin Chem, 1152-1160 (2006)), deteción de citocinas (Gullberg, M., et al., 101 Proc Natl Acad Sci USA, 8420-8424 (2004)), detección de esporas (Pai, S., et al., 33 Nucleic Acids Res, e162 (2005)), detección de

20 biomarcadores de cáncer (Fredriksson, S., et al., 4 Nat Methods, 327-329 (2007)), y ligadura de proximidad para medir la fortaleza de las interacciones proteína-ADN (Gustafsdottir, S., et al., 345 Anal Biochem, 2-9 (2005), Schallmeiner, E., et al., 4 Nat Methods, 135-137 (2007)).

[0184] Los ensayos de diagnóstico basados en ligadura de ejemplo adecuados para el uso con los componentes de ligasa modificados aquí proporcionados incluye la detección de variedad de VIH resistente a los fármacos 25 (Lalonde, M., et al., 45 J Clin Microbiol, 2604-2615 (2007)) la detección multiplexada de productos específicos de alelo (Macdonald, S. J., et al., 6 Genome Biol, R105 (2005)), detección SNP mediante la ligadura incluyendo un ensayo de ligadura de oligonucleótido (OLA) (Landegren, U., et al., 241 Science, 1077-1080 (1988)), reacción en cadena de ligasa (LCR) (Wiedmann, M., et al., 3 Genome Biol, S51-64 (1994)), detección SNP utilizando combinaciones de ligadura y PCR incluyendo PCR mediante ligasa (LM-PCR) (Mueller, P.R., et al., 246 Science, 30 780-786 (1989), Pfeifer, G.P., et al., 246 Science, 810-813 (1989)), reacción de detección de ligadura PCR (PCR-LDR) (Cheng, Y.W., et al., 16 Genome Res, 282-289 (2006)), sondas candado (Antson, D., et al., 28 Nucleic Acids Res, e58 (2000)), ensayo de ligadura de oligonucleótido PCR (PCR-OLA) (Delahunty, C., et al., 58 Am J Hum Genet, 1239-1246 (1996)), y un enfoque gap LCR (Abravaya, K., et al., 23 Nucleic Acids Res, 675-682 (1995)), SNPlex (De la Vega, F.M., et al., 573 Mutat Res, 111-135 (2005), Livak, K.J. 14 Genet Anal, 143-149 35 (1999)), MLPA (amplificación de sondas dependiente de ligaduras múltiples) (Schouten, J.P., et al., 30 Nucleic Acids Res, e57 (2002)), ensayo de genotipo mediante Goldegate de Illumina (Fan, J.B., et al., 68 Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 69-78 (2003), Oliphant, A., et al., Supl Biotécnicas, 56-58, 60-51 (2002), Shen, R., et al., 573 Mutat Res, 70-82 (2005)) y un ensayo de sonda de inversión molecular sobre los ensayos de Affymetrix GeneChip (Fodor, S.P., et al., 251 Science, 767-773 (1991), Matsuzaki, H., et al., 1 Nat Methods, 109-111

40 (2004), Matsuzaki, H., et al., 14 Genome Res, 414-425 (2004), Pease, A.C., et al., 91 Proc Natl Acad Sci U S A, 5022-5026 (1994)).

[0185] Ensayos de ligadura ejemplares adicionales adecuados para el uso con componentes de ligasa modificados aquí proporcionados incluyen el tradicional método dideoxi de secuenciación de Sanger (Sanger, F., et al., 74 Proc Natl Acad Sci USA, 5463-5467 (1977) y el ensayo de secuenciación de la siguiente generación

45 como el Sistema de Secuenciación 454, el Analizador de Genoma Illumina, el servicio de secuenciación de genoma de Knome Knome-COMPLETE™ y la tecnología de secuenciación ABI SOLiD™ System y otros ensayos de secuenciación mediante ligadura (Ronaghi, M., 11 Genome Res, 3-11 (2001), Mirzabekov, A., 12 Trends Biotechnol, 27-32 (1994), Schmalzing, D., et al., 20 Electrophoresis, 3066-3077 (1999)).

[0186] Los métodos y composiciones aquí proporcionadas se describirán con mayor detalle mediante la 50 referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1

Detección de producción de ligadura utilizando un análisis PAGE

[0187] Los dadores y aceptores (LP3’T Aceptor c/ PBS y Com3F Dador c/ PBS, respectivamente) con secuencias de unión al cebador (“PBS”) se evaluaron por su habilidad de unirse a la T4 ADN ligasa en presencia 55 de un molde complementario (molde Alg). Cuatro escenarios experimentales se llevaron a cabo (Figura 2). Se estableció una primera mezcla de reacción de ligadura que incluía dador, aceptor, cofactor ATP, molde y no incluia ligasa. No se detectó ninguna ligadura. Una segunda mezcla de reacción de ligadura se estableció que incluía dador, aceptor, cofactor ATP, ligasa y no inclua molde. No se detectó ninguna ligadura. Una tercera

mezcla de reacción de ligadura se estableció que incluía dador, aceptor, ligasa, molde y no se añadió cofactor ATP. Se detectó una pequeña cantidad de producto ligado, que es probablemente debido a una pequeña cantidad de ligasa adenilada que se aisló durante el proceso de purificación. Una cuarta mezcla de reacción de ligadura se estableció que incluía dador, aceptor, cofactor ATP, ligasa y molde. Una mayoría de dador y aceptor

5 se consumieron, con una conversión eficiente al producto de ligadura unido.

[0188] Cada reacción de 20 µL se llevó a cabo en un tampón que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 25µg/ml albúmina del suero bovino. Se añadió 1 mM ATP al tampón de manera independiente. El dador (LP3’T c/PBS), aceptor (Com3F c/PBS), y molde (Alg) tenían 0,1 µM de cantidad equimolar. El aceptor, dador y molde se desnaturalizaron a 95ºC durante 3 minutos y se recocieron a 4ºC

10 durante 3 minutos. La ligadura se inició añadiendo 400 unidades de T4 ligasa (New England Biolabs) a cada reacción. La ligadura continuó a 16ºC durante 20 minutos. La ligadura se acabó calentando la reacción a 65ºC durante 10 minutos y añadiendo un volumen igual de tampón con 2x TBE-Urea (Invitrogen). Las muestras se realizaron con un 6% de geles TBE-Urea Novex (Invitrogen). Los geles se tintaron con tinte de ácido nucleico SYBR Gold (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

15 Tabla 1: Secuencias polinucleótidas del dador y el aceptor

Nombre de secuencia

Secuencia (5' → 3')

LP3'T For

TAGCGTCTTGATAGTCTCGTG

Com3F Rev

GTACCAGTCGCCTAGAATACT

LP3'T Aceptor c/ PBS

TAGCGTCTTGATAGTCTCGTGCCCTGTTCCAGCGTCGGTGTTGCGTT

LP3'G Aceptor c/ PBS

TAGCGTCTTGATAGTCTCGTGCCCTGTTCCAGCGTCGGTGTTGCGTG

LP3'C Aceptor c/ PBS

TAGCGTCTTGATAGTCTCGTGCCCTGTTCCAGCGTCGGTGTTGCGTC

LP3'A Aceptor c/ PBS

TAGCGTCTTGATAGTCTCGTGCCCTGTTCCAGCGTCGGTGTTGCGTA

Com3F Dador c/ PBS

Molde Alg

* La parte subrayada representa la secuencia de unión del cebador (PBS).

EJEMPO 2

Detección de la producción de ligadura utilizando un análisis PCR a tiempo real

[0189] El producto de ligadura entre los polinucleótidos dador y aceptor (LP3’T Aceptor c/ PBS y Com3F Dador

20 c/PBS, respectivamente) se eliminaron utilizando un PCR cuantitativo a tiempo real. Las reacciones de ligadura se llevaron a cabo con T4 ADN ligasa en la presencia de un molde complementario (molde Alg) y se detectó utilizando PCR a tiempo real. Las diluciones en serie del producto a partir de las reacciones de ligadura (104 a 109 diluciones del producto de ligadura) se utilizaron como molde en las reacciones PCR posteriores. La mezcla de reacción consistía en un tampón de 1X PCR (20 mM Tris (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2), los cebadores

25 PCR específicos para los sitios de enlace del cebador se diseñaron en el extremo 5’ del aceptor (LP3’T) y en el extremo 3’ del dador (Com3FRev) (0,1 µM cada uno), Taq ADN polimerasa (5U/ul) (Invitrogen), un tinte de ácido nucleico SYBR Green I (dilución 1:60,000) (Invitrogen), un tinte de referencia ROX (dilución 1:30,000) (Stratagene) en una reacción de 25 µl. Las condiciones de termociclaje fueron 95ºC durante 10 minutos de desnaturalización inicial, seguidos por 40 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 56ºC durante 30 segundos, 72ºC

30 durante 1 minuto y acabó con un paso final de extensión a 72ºC durante 7 minutos. Las reacciones se llevaron a cabo en el instrumento Stratagene Mx3005P® QPCR System. Según se ve en la Figura 3, cada una de las seis diluciones se detectaron utilizando funciones de amplificación (Figura 3A), con el NTC (ligadura realizada en la ausencia de molde) teniendo una curva de amplificación con un Ct significativamente retrasado. La curva de disociación (Figura 3B) reveló que todas las ligaduras realizadas en presencia del molde tuvieron la misma

35 temperatura de fusión, con el NTC teniendo una temperatura de fusión inferior, que es probablemente debida a la extensión del Com 3F Rev a lo largo del Com3F Dador c/ PBS. Finalmente, los valores Ct se extrajeron de la curva estándar y todas las diluciones de la reacción de ligadura podrían haberse detectado con una buena linealidad (Figura 3C). Debido a su habilidad para cuantificar el ácido nucleico diana este ensayo será de gran

importancia para sacar las diferencias sutiles en la eficacia de un componente de ligadura modificado, en este ejemplo, un cofactor de ligasa modificado.

EJEMPLO 3

Evaluar la discriminación de cofactores modificados entre modelos emparejados y mal emparejados 5 utilizando un análisis PAGE

[0190] Los análogos de ATP se compararon con el cofactor ATP natural correspondiente por su habilidad para unir moldes emparejados y mal emparejados (Figura 4). Los análogos de ATP se evaluaron por la producción de ligadura relativa en presencia de un molde emparejado (LP3’T Aceptor c/ PBS y molde Alg; par de bases T-A emparejado en el extremo 3’ de la hebra del aceptor) con el rendimiento relativo cuando se utilizó un molde mal 10 emparejado (LP3’C Aceptor c/ PBS y molde Alg; par de bases C-A mal emparejado del extremo 3’ de la hebra del aceptor). Las reacciones se llevaron a cabo según se describe para el Ejemplo 1, con un cofactor de interés incluido en la reacción con una concentración de 1 mM. El sustrato ATP natural se comparó con los siguientes cofactores modificados: 7-deaza-ATP (7-deaza-adenosina-5’-trifosfato), N1-metil-ATP (N1-metil-adenosina-5’trifosfato), 2-amino-ATP (2-amino-adenosina-5’-trifosfato), 2’-amino-2’-deoxi-ATP (2’-amino-2’-deoxiadenosina-5’15 trifosfato), 3’-amino-2’,3’-dideoxi-ATP (3’-amino-2’,3’-dideoxi-adenosina-5’-trifosfato)(Figura 4). Todos los cofactores modificados contenían una ligadura con eficacia similar al ATP natural cuando se empleaba un molde emparejado. Sin embargo, cuando se empleaba un molde mal emparejado, el uso de los cofactores modificados daba como resultado una disminución significativa en producción de ligadura en comparación con el ATP natural.

EJEMPLO 4

20 Determinación de número de especificidad

[0191] Un método para determinar el rendimiento de ligadura de un componente de ligadura de interés (p.ej., cofactores de ligasa modificados, dadores modificados o aceptores modificados) se da asignando un número de especificidad. Los números de especificidad pueden determinarse por ejemplo, dividiendo la producción de ligadura de un caso emparejado entre la producción de ligadura de un caso mal emparejado donde un único par 25 de bases difiere en relación con el caso emparejado. Las producciones de ligadura se determinaron primero mediante pruebas de densitometría de los geles PAGE según se demuestra en el Ejemplo 1. Las producciones se normalizan entonces con las lecturas del molde en la misma reacción, con la posterior normalización de la producción de ligadura incluyendo el cofactor natural (ATP), donde ATP tiene una producción normalizada de 1,0. Por ejemplo, en el caso de 2’-deoxi-ATP (2’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato; Figura 4), la producción de 30 ligadura en el caso emparejado (LP3’T Aceptor c/ PBS y molde Alg; par de bases T-A emparejado en el extremo 3’ de la hebra del aceptor) fue 1,34. En el caso mal emparejado (LP3’C Aceptor c/ PBS y molde Alg; el par de bases C-A mal emparejado en el extremo 2’ de la hebra del aceptor) fue 0,18. Por consiguiente, el número de especificidad asignado a 2’-deoxi-ATP en un caso de mal emparejamiento C-A fue 1,34 ÷ 0,18 o 7,44. Un valor mayor a este es indicativo de una especificidad de ligadura mejorada. Un valor inferior a este es indicativo de una

35 especificidad de ligadura reducida.

EJEMPLO 5

Evaluación de matriz para identificar la discriminación de un cofactor modificado entre moldes emparejados y mal emparejados

[0192] Los análogos de ATP se compararon con el cofactor ATP natural por su habilidad de unir moldes

40 emparejados y mal emparejados para la producción de ligadura relativa en presencia de un molde emparejado (LP3’T Aceptor c/ PBS y molde Alg; par de bases T-A emparejado en el extremo 3’ de la hebra de aceptor) en relación con la producción de moldes que contenían un par de bases mal emparejado en el extremo 3’ del aceptor: 1) LP3’C Aceptor c/ PBS y molde Alg; C-A mal emparejado, 2) LP3’G Aceptor c/ PBS y molde Alg; G-A mal emparejado, y 3) LP3’A Aceptor c/ PBS y mole Alg; A-A mal emparejado (Figura 5). Las reacciones se

45 llevaron a cabo según se describe para el Ejemplo 1, con un cofactor de interés incluido en la reacción de 1 mM de concentración. El cofactor ATP natural se comparó con los siguientes diez cofactores modificados: 5’-alfa-tioadenosina-5’-trifosfato (1-tio-ATP), 2’ amino-2’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato (2’-amino-2’-deoxi-ATP), 2-Amino-2’deoxiadenosina-5’-trifosfato (2-amino-2’-deoxi-ATP), 2’-fluoro-2’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato (2’-fluoro-2’-deoxi-ATP), 3’-amino-2’,3’-dideoxi-adenosina-5’-trifosfato (3’-amino-2’,3’-dideoxi-ATP), 3’-deoxi-adenosina-5’

50 trifosfato (3’-deoxi-ATP), 7-deaza-adenosina-5’-trifosfato (7-deaza-ATP), 2’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato (2’deoxi-ATP), L-isomero-2’-deoxi-aderiosina-5’-trifosfato (L-isomero de 2’-deoxi-ATP), y N1-metil-adenosina-5’trifosfato (N1-metil-ATP). Los resultados de la integración a partir del análisis PAGE de los rendimientos de ligadura para los cuatro pares de bases diferentes de interés: T-A, G-A, C-A, y A-A, se mostraron en una serie de gráficas de dispersión. Cada gráfica de dispersión compara la producción normalizada para un molde

55 emparejado (T-A) con la producción normalizada para cada uno de los tres moldes diferentes mal emparejados (C-A, G-A y A-A) (Figura 5). Las modificaciones principales de interés tendrán una producción de ligadura

comparable a un ATP natural en el caso emparejado (T-A), con una baja producción de ligadura en presencia de un molde mal emparejado (C-A, G-A y A-A). A partir de este panel de análogos, 5’-alfa-tio-adenosina-5’-trifosfato, 2’-deoxi-adenosina-5’-trifosfato y 3’-amino-2’,3’-dideoxi-adenosina-5’-trifosfato se identificaron como modificaciones principales de interés.

EJEMPLO 6

Evaluación de matriz para identificar la discriminación de un aceptor modificado entre los moldes emparejados y mal emparejados

[0193] Varias hebras de aceptor modificado de cadena principal y de azúcar se compararon con la hebra de aceptor natural sin modificar por su habilidad de unir moldes emparejados y mal emparejados. Las hebras de aceptor modificado se evaluaron por la producción de ligadura relativa en presencia del molde emparejado (LP3’T Aceptor c/PBS y molde Alg; par de bases T-A emparejado en el extremo 3’ del aceptor) relativo a la producción de moldes que contenían un par de bases mal emparejado en el extremo 3’ del molde: 1) LP3’T Aceptor c/ PBS y molde Glg; T-G mal emparejado, 2) LP3’T Aceptor c/ PBS y molde Clg; T-C mal emparejado, y 3) LP3’T Aceptor c/ PBS y molde Tlg; T-T mal emparejado. Las reacciones se llevaron a cabo según se describe en el Ejempo 1 utilizando T4 ADN ligasa y con la hebra de aceptor de interés incluida en la reacción en una concentración 1 µM. Se llevaron a cabo experimentos adicionales con E. coli ligasa, una ligasa que depende de NAD (no mostrada) en la que el resultado de la hebra de aceptor natural se comparó con diez aceptores modificados con la fórmula que se muestra abajo:

donde:

X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en OH, SH, y CH3, y

Y1, Y2 y Y3 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, F y OCH3; y

W es un residuo oligonucleótido.

12 123

[0194] En el aceptor natural, Xy Xson OH e Y, Ye Yson H (Figura 6, sin modificación). Cada uno de los

diez aceptores modificados tiene una modificación en uno de los sitios X, X, Y, Y, o Yrelativa al aceptor natural para que X1 sea SH o CH3 (Figura 6, PS (X1) y PMe (X1), respectivamente), X2 sea SH o CH3 (Figura 6, PS (X2) y PMe (X2), respectivamente), Y1 sea F o OCH3 (Figura 6, 2'-F (Y1) o 2'-OMe (Y1), respectivamente), Y2 sea F o OCH3 (Figura 6, 2'-F (Y2) o 2'-OMe (Y2), respectivamente), y Y3 sea F o OCH3 (Figura 6, 2'-F (Y3) o 2'-OMe (Y3), respectivamente).

[0195] Las producciones de ligadura, determinadas por el análisis de gel PAGE, para los cuatro pares de bases diferentes de interés: T-A, T-G, T-C, and T-T, se mostraron en una serie de tres gráficas de dispersión. Cada gráfica de dispersión comparaba la producción normalizada para un molde emparejado (T-A) con la producción normalizada de cada uno de los tres moldes diferentes mal emparejados (T-G, T-C, and T-T) (Figura 6). Las modificaciones principales de interés tendrán una producción de ligadura comparable con un ATP en el caso emparejado (T-A), con una producción de ligadura baja en presencia de un molde mal emparejado (T-G, T-C y T-T). A partir de este panel, los aceptores modificados, la modificación CH3 en la posición X1 (Figura 6, PMe (X1)) y la modificación OCH3 en la posición Y2 (Figura 6, 2’-OMe (Y2)) se identificaron como las modificaciones de aceptor principal de interés.

EJEMPLO 7

Evaluación de matriz para identificar la discriminación de un dador modificado entre los moldes emparejados y mal emparejados

[0196] Varias hebras de dador modificado de cadena principal y de azúcar se compararon con la hebra de dador

5 natural por su habilidad para unir los modelos emparejados y mal emparejados. Las hebras de dador modificado se evaluaron por la producción de ligadura relativa en presencia del molde emparejado (Com3F Dador c/PBS, LP3’T Aceptor c/PBS y molde Alg; T-A par de bases emparejado en el extremo 3’ de la hebra de aceptor) en relación con la producción de moldes que contienen un par de bases mal emparejado en el extremo 3’ del molde: 1) Com3F Dador c/ PBS, LP3’T Aceptor c/PBS, y modelo Clg; T-C mal emparejado y 2) Com3F c/PBS, LP3’C

10 c/PBS, y Alg; C-A mal emparejado. Las reacciones se elaboraron según se describe en el ejemplo 1 con T4 ADN ligasa y la hebra del dador de interés incluida en cada reacción con una concentración de 1 µM. Se realizaron otros experimentos con E. coli ligasa, una ligasa dependiende de NAD (no mostrada). La hebra de dador natural se comparó con los siguientes cinco dadores modificados:

12 123

15 donde Xy Xse sustituyen independientemente con OH o CH3, e Y, Y, e Yse sustituyen independientemente con H o OCH3.

12 123

[0197] En el dador natural, Xy Xson OH e Y, Y, e Yson H (Figura 7, sin modificación). Cada uno de los

cinco dadores modificados tiene una modificación en uno de los sitios X, X, Y, Y, o Yrelativos al dador

12 1

natural como Xes CH3 (Figura 7,PMe (X1)), Xes CH3 (Figura 7, PMe (X2)), Yes OCH3 (Figura 7, 2’-OMe 20 (Y1)), Y2 es OCH3 (Figura 7,2’-OMe (Y2)), o Y3 es OCH3 (Figura 7,2’-OMe (Y3)).

[0198] Las producciones de ligadura normalizadas se determinaron a partir del análisis de gel PAGE para tres

pares de bases diferentes de interés: TA, T-C y C-A, se mostraron en una serie de tres gráficas de dispersión.

Cada gráfica de dispersión comparaba un molde emparejado (T-A) con cada uno de los tres modelos diferentes

mal emparejados (T-C y C-A) (Figura 7). Las modificaciones principales de interés tendrán una producción de 25 ligadura comparable con el ATP en el caso emparejado (T-A) con una producción de ligadura baja en presencia

de un caso mal emparejado (T-C y C-A). A partir de este panel de aceptores modificados, la modificación CH3 en

1 12 2

las posiciones X(PMe X) y X(PMe X) se identificaron como las modificaciones principales de dador de interés.

EJEMPLO 8

30 Evaluación para identificar un aceptor modificado en combinación con un cofactor ATP modificado que discrimina mejor entre moldes emparejados y mal emparejados

[0199] Continuando con los estudios mostrados en los ejemplos 1, 3, 4 y 5, un número de hebras de aceptor

modificado de cadena principal y de azúcar en combinación con varios cofactores ATP modificados se

compararon con la hebra de aceptor natural y ATP por habilidad por su habilidad para unir moldes emparejados 35 en comparación con moldes mal emparejados. Estos estudios evaluaron la combinación de hebras de aceptor

modificado con cofactores ATP modificados para el rendimiento de ligadura relativo en presencia de un molde

emparejado (Com3F Dador c/PBS, LP3’T Aceptor c/PBS y molde Alg; par de bases T-A emparejado en el

extremo 3’ de la hebra del aceptor) con el rendimiento relativo cuando se empleaba un molde único que contenía un par de bases mal emparejado en el extremo 3’ de la hebra del molde: 1) Com3F Dador c/ PBS, LP3’T Aceptor c/PBS, y molde Clg; T-C mal emparejado. Las reacciones se llevaron a cabo según se describió en el Ejemplo 1 con la hebra del aceptor de interés incluida en cada reacción con una concentración 1 µM y el cofactor ATP en una concentración de 1 mM. En estos estudios, la realización de la hebra de aceptor natural se comparó con los siguientes cinco aceptores modificados:

donde X1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH y CH3, y X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH y CH3, e Y1 e Y2 se seleccionan cada uno

10 independientemente del grupo que consiste en H y OCH3.

12 12

[0200] En el aceptor natural (Figura 8, sin modificación), Xy Xson OH e Ye Yson H. Cada uno de los cinco aceptores modificados tiene una modificación en uno de los sitios X1, X2, Y1, o Y2 relativo al aceptor natural para

11 2 1

que Xsea SH (Figura 8, PS (X1)), Xsea CH3 (Figura 8, PMe (X1)), Xsea CH3 (Figura 8, PMe (X2)), Ysea OCH3 (Figura 8, 2'-OMe (Y1)) o Y2 sea OCH3 (Figura 8, 2'-OMe (Y2)).

15 [0201] Estas cinco hebras de aceptor modificado se analizaron en combinación con seis análogos ATP modificados incluyendo: 2'-deoxi-ATP (2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato), 1-tio-ATP (5'-alfa-tio-adenosina-5'trifosfato), 2'-amino-2'-deoxi-ATP (2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato), 2-amino-ATP (2-amino-adenosina-5'trifosfato), 3'-amino-2', 3'-dideoxi-ATP(3'-amino-2',3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato) y 2-amino-2'-deoxi-ATP (2amino-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato). Se probaron todas las combinaciones posibles de análogos ATP y hebras

20 de aceptor modificado.

[0202] Las producciones de ligadura (normalizadas a ATP), determinadas a partir del análisis de gel PAGE, para dos pares de bases diferentes de interés: T-A y T-C, se registraron en una gráfica (figura 8). Las gráficas incluyen producciones de ligadura relativa utilizando hebras de cadena principal y de azúcar del aceptor modificado en combinación con diferentes cofactores ATP modificados. Estos valores son relativos a las 25 producciones de ligadura utilizando hebras de aceptor natural y ATP con pares de bases emparejados (T-A) y mal emparejados (T-C) en el extremo 3’ de la hebra del aceptor, según se describe en el ejemplo 1. En el caso emparejado (T-A), los valores en celdas sombreadas con puntos representan una producción de ligadura relativa mayor a 0,85, los valores en las celdas sin sombrear representan una producción de ligadura relativa entre 0,700,85 y los valores en las celdas sombreadas en gris representan una producción de ligadura relativa entre 0-0,70. 30 En el caso mal emparejado (T-C), las celdas sombreadas con puntos representan una producción de ligadura relativa entre 0-0,1, las celdas sin sombrear representan una producción de ligadura relativa entre 0,01-0,1 y las celdas grises representan una producción relativa de ligadura entre 0,10-1,00. Todas las producciones presentadas se normalizaron en la combinación ATP con una hebra de aceptor sin modificar. Las combinaciones con criterios de elaboración preferidos tienen una producción relativa mayor a 0,85 en el caso emparejado (T-A) 35 (p.ej., las celdas sombreadas con puntos en la Figura 8, gráfica superior) y una producción de ligadura relativa menor a 0,01 en presencia de un molde mal emparejado (T-C) (p.ej., las celdas sombreadas con puntos en la Figura 8, gráfico inferior). A partir de estas posibles combinaciones, una modificación CH3 en la posición X1 (Figura 8, PMe (X1)) con 3’-amino-2’,3’-dideoxi-ATP (3’-amino-2’,3’-dideoxi-adenosina-5’-trifosfato) se identificó como el cofactor modificado principal y la combinación de aceptor modificado de interés, con una producción de

40 emparejamientos de 1,22 y una producción de malos emparejamientos de 0,00.

[0203] A no ser que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por alguien con un conocimiento general de la técnica a la que esta invención hace referencia.

Claims (17)

1. Reivindicaciones

   1. Un método para detectar una mutación en un ácido nucleico diana, dicho método comprendiendo: incubar dicho ácido nucleico diana en una mezcla de reacción comprendiendo una ligasa de ácido nucleico dependiente de un cofactor, un cofactor de ligasa ATP modificado, un polinucleótido dador y un

   5 polinucleótido aceptor, en el que uno o más de dichos cofactores de ligasa ATP, polinucleótido dador y polinucleótido aceptor están modificados; y supervisar la ligadura de los polinucleótidos dador y aceptor, donde la cantidad de ligadura es indicativa de la presencia o la ausencia de la mutación y donde la presencia del cofactor de ligasa ATP modificado mejora la especificidad de ligadura en relación con el cofactor de ligasa ATP no modificado correspondiente.
2. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polinucleótido dador tiene la fórmula 5'-fosfato-X(n1)-Y(n2)-Z(n3)-3' y el polinucleótido aceptor tiene la fórmula 5'-D(n4)-E(n5)-F(n6)-hidroxi-3', donde (n2), (n3), (n4) y (n5) son cada uno independientemente 0 o cualquier entero positivo, donde (n1) y (n6) son cada uno independientemente 0, 1, 2, 3 o 4, donde X, Z, D y F son posiciones de nucleótidos

   15 complementarios al ácido nucleico diana, donde al menos uno de entre Y o E es una posición de nucleótido de interés.
3. 3. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, donde la presencia de un cofactor de ligasa ATP

   modificado reduce o inhibe la ligadura del ácido nucleico no complementario en relación con la ligadura 20 del ácido nucleico complementario.
4. 4. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde la presencia de un cofactor de ligasa ATP modificado, un aceptor modificado o un dador modificado aumenta la especificidad de ligadura cuando tanto el extremo 3’ del aceptor como el extremo 5’ de dador están emparejados al ácido

   25 nucleico diana en comparación con cuando el extremo 3’ del aceptor o el extremo 5’ del dador comprende un nucleótido mal emparejado en relación con el ácido nucleico diana.
5. 5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, donde la presencia de un cofactor de ligasa ATP modificado, un aceptor modificado o un dador modificado inhibe o reduce la

   30 ligadura de un ácido nucleico mal emparejado; y tiene al menos aproximadamente la misma eficacia de ligadura del ácido nucleico emparejado en comparación con un cofactor, aceptor o dador no modificado.
6. 6. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde existe al menos un par de bases

   mal emparejado en 10 bases en cada lado de la unión de ligadura. 35

7. 7.

   Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde la ligasa es una ADN ligasa o una ARN ligasa dependiente de un molde.

8. 8.

   Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde la ligadura comprende uno o

   40 más métodos de ligadura enzimática seleccionados del grupo que consiste en: ensayo por ligadura de oligonucleótidos (OLA), reacción en cadena por ligasa (LCR), PCR mediada por ligasa (LM-PCR), reacción PCR de detección de ligadura (PCR-LDR), sondas candado (Padlock), ensayo de ligadura de oligonicleótidos PCR (PCR-OLA), técnica LCR tipo Gap, SNPlex, MLPA (amplificación múltiple de sonda dependiente de las ligaduras), ensayo de genotipado GoldenGate y ensayo por sonda de inversión

   45 molecular, ligadura de proximidad y secuenciación de nueva generación mediante ligadura.
9. 9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al menos un cofactor de ligasa ATP modificado tiene la estructura de la fórmula IA:

   123 4

   donde: W, W, Wy Wse selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en N, CR1, y N+R1;

   cada R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OR2, SR2, SeR2 , NR2R3, N3, C(Y)R4, alquil, alquenil, alquinil, aril y aralquil sustituidos o no sustituidos, donde cualquier

   sustituyente puede cada uno contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

   5

   Z1 se selecciona del grupo que consiste en H, F, R2, OR2, SR2, SeR2, NR2R3, NR2OR2, NR2-NR2R3 , CN, N3, (BH3) -M+ y C(Y)R4 ;

   M+ es un catión;

   10

   cada R2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H o alquil, alquenil,

   alquinil, aril y aralquil sustituidos o no sustituidos, donde cualquier sustituyente puede cada uno

   contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

   cada R4 se selecciona del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR2, SR2, SeR2, NR2R3, C(Y)R2 y

   15

   alquil, alquenil, alquinil, aril y aralquil sustituidos o no sustituidos, donde cualquier sustituyente puede

   cada uno contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

   cada Y se selecciona del grupo que consiste en O, S, Se, CR1R1 y NR1 ; y

   20

   X1, X2, X3 y X4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en R1, NR2OR2, NR2 -NR2R3, CN, N3, NO, NO2, NCO, NCS, OCN, SCN y SSR2 .

10. 10.

    Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el cofactor de ligasa ATP

    modificado se selecciona del grupo que consiste en 7-deaza-adenosina-5'-trifosfato, 7-deaza-2'

    25

    deoxiadenosina-5'-trifosfato, 7-metil-7-deaza-adenosina-5'-trifosfato, 7-metil-7-deaza-2'-deoxiadenosina

    5'-trifosfato, N1-metil-adenosina-5'-trifosfato, N1-metil-2'-deoxiadenosina-5'-trifosfato, 8-cloro-adenosina

    5'-trifosfato, 8-cloro-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 8-aza-adenosina-5'-trifosfato, 8-aza-2'-deoxi

    adenosina-5'-trifosfato, 8-azido-adenosina-5'-trifosfato, 8-azido-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, N6-metil

    adenosina-5'-trifosfato, N6-metil-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2-Cloropurina-2'-deoxiribosida-5'

    30

    trifosfato, 2-aminopurine-2'-deoxiribosida-5'-trifosfato, inosina-5'-trifosfato, 2'-deoxi-inosina-5'-trifosfato,

    2-amino-adenosina-5'-trifosfato, 2-amino-2'-deoxiadenosina-5'-trifosfato, 2-amino-3'-deoxiadenosina-5%

    trifosfato, 2-amino-2',3'-dideoxiadenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-thio-adenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-thio-2'

    deoxiadenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-thio-3'-deoxiadenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-thio-2',3'

    dideoxiadenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-[P-borano]-adenosina-5'-trifosfato, y 5'-alfa-[P-borano]-2'

    35

    deoxiadenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-[P-borano]-3'-deoxiadenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-[P-borano]-2',3'

    dideoxiadenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-metilfosfonate-adenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-metilfosfonate-2'

    deoxiadenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-metilfosfonate-3'-deoxiadenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-metilfosfonate

    2',3'-dideoxiadenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-fenilfosfonato-adenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-fenilfosfonato-2'

    deoxiadenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-fenilfosfonato-3'-deoxiadenosina-5'-trifosfato, 5'-alfa-fenilfosfonato

    40

    2',3'-dideoxiadenosina-5'-trifosfato, 3'-amino-3'-deoxi-adeuosine-5'-trifosfato, 3'-amino-2',3'-dideoxi

    adenosina-5'-trifosfato, 2-amino-2-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2'-amino-2',3'-dideoxi-adenosina-5'

    trifosfato, 3'-azido-3'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 3-azido-2',3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2-azido

    2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2'-azido-2',3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato, 3'-fluoro-3-deoxi

    adenosina-5'-trifosfato, 3'-fluoro-2',3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2'-fluoro-2-deoxi-adenosina-5'

    45

    trifosfato, 2'-uoro-2',3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 3'-deoxi

    adenosina-5'-trifosfato, 2',3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2-ara-adenosina-5'-trifosfato, 3'-metil-3'

    deoxiadenosina-5'-trifosfato, 3'-metil-2',3'-dideoxiadenosina-5'-trifosfato, 3'-thio-3'-deoxiadenosina-5'

    trifosfato, 3'-thio-2',3'-dideoxiadenosina-5'-trifosfato, 3'-metilamino-3'-deoxi adenosina-5'-trifosfato, 3'

    metilamino-2',3'-dideoxi adenosina-5'-trifosfato, 3-metoxi-3'-deoxi-2-amino-adenosina-5'-trifosfato, 3'

    50

    metoxi-2',3'-dideoxi-2'-amino-adenosina-5'-trifosfato, 2-metoxi-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2'-metoxi

    2',3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato, 3'-metoxi-3'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 3'-metoxi-2',3'-dideoxi

    adenosina-5'-trifosfato, 2'-metoxi-2'-deoxi-2-amino-adenosina-5'-trifosfato, y 2'-metoxi-2',3'-dideoxi-2

    amino-adenosina-5'-trifosfato.

    55

    11. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, comprendiendo además al menos un

    aceptor modificado añadido a la reacción de ligadura.

11. 12.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, para la detección de una mutación en un ácido

    nucleico diana, dicho método comprendiendo: incubar dicho ácido nucleico diana en un mezcla de

    60

    reacción comprendiendo una ligasa de ácido nucleico dependiente de un cofactor, un cofactor de ligasa

    ATP, un polinucleótido dador y un polinucleótido aceptor modificado, donde el al menos un aceptor

    modificado tiene la estructura de la Fórmula II:

    donde: cada B1, B2 y B3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en una purina o una pirimidina sustituida o no sustituida, cualquier derivado aza o deaza de las mismas y cualquier “base

    5 universal” o “base degenerada”, que es preferiblemente reconocible por una polimerasa o ligasa de ácido nucleico;

    cada X1 y X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CH3 y OCH2CH3;

    10 cada Y1, Y2 e Y3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, OH, and OCH3; y W se selecciona de H o un residuo oligonucleótido,

    y supervisar la ligadura de los polinucleótidos dador y aceptor, donde la cantidad de ligadura es indicativa de la presencia o ausencia de la mutación. 15

12. 13.

    Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, comprendiendo además al menos un dador modificado añadido a la reacción de ligadura.

13. 14.

    Un método de acuerdo con la reivindicación 11, para detectar una mutación en un ácido nucleico diana,

    20 dicho método comprendiendo incubar dicho ácido nucleico diana en una mezcla de reacción comprendiendo una ligasa de ácido nucleico dependiente de un cofactor, un cofactor de ATP ligasa, un polinucleótido dador modificado y un polinucleótido aceptor, donde el al menos un dador modificado tiene la estructura de la Fórmula III:

    25 donde:

    12 3

    cada B, By Bse selecciona independientemente del grupo que consiste en purina o pirimidina sustituida o no sustituida, cualquier derivado aza o deaza de las mismas y cualquier “base universal” o

    “base degenerada”, que es preferiblemente reconocible mediante una polimerasa o ligasa de ácido nucleico;

    cada X1 y X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CH3 y OCH2CH3; 5 cada Y1, Y2 e Y3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, OH y OCH3; y

    W se selecciona de H o un residuo oligonucleótido,

    10 y supervisar la ligadura de los polinucleótidos dador y aceptor, donde la cantidad de ligadura es indicativa de la presencia o ausencia de la mutación.
14. 15. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, comprendiendo además al menos un dador modificado

    añadido a la reacción de ligadura. 15

15. 16.

    Un método de acuerdo con la reivindicación 14, comprendiendo además al menos un dador modificado añadido a la reacción de ligadura.

16. 17.

    Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el cofactor de ATP ligasa

    20 modificado se selecciona del grupo que consiste en 2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 3'-deoxi-adenosina-5'trifosfato, 2'-metoxi-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2'-amino-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2'-azido-2'deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2'-fluoro-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2'-metoxi-2'-deoxi-2-aminoadenosina-5'-trifosfato, 2',3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2-amino-2'-deoxiadenosina-5'-trifosfato, 8chloro-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, N6-metil-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 7-deaza-2'

    25 deoxiadenosina-5'-trifosfato, 2-Chloropurine-2'-deoxiribosida-5'-trifosfato y 2-aminopurine-2'-deoxiribosida5'-trifosfato.
17. 18. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el cofactor de ATP ligasa modificado se selecciona del grupo que consiste en 3'-amino-2',3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato, 3'-azido

    30 3'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 3'-fluoro-3'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 3'-fluoro-2',3'-dideoxi-adenosina5'-trifosfato, 3'-metoxi-3'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato and 2'-amino-2',3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato.

    Dibujos