ES2459743T3 - Sustained release preparation for tissue regeneration therapy - Google Patents

Abstract

Microesfera de accion prolongada de dos a cuatro semanas, que comprende acido ({5-[2-({[(1E)- fenil(piridin-3-il)metilen]amino}oxi)etil)-7,8-dihidronaftalen-1-11}oxi)acetico o su sal como farmaco y un copolimero de acido lactico/acido glicolico, en la que (i) una cantidad de copolimero de acid° lactico/acido glicolico en partes en peso del farmaco es de desde 3 hasta 10 partes en peso, (ii) la microesfera tiene un tamer) de particula promedio de desde 20 hasta 50 μm, y (iii) el copolimero de acido lactico/acido glicolico tiene un peso molecular promedio en peso de desde 10.000 hasta 50.000 y una razon de composición de acido lactico/acido glicólico de desde 75/25 hasta 50/50, y que satisface al menos una de las siguientes condiciones (1) a (2): (1) una razon restante del farmaco tras una hora en una prueba de liberación es de al menos el 90%; (2) una raz6n restante del farmaco tras un dia en una prueba de liberación es de al menos el 82%.Two to four week long acting microsphere, comprising ({5- [2 - ({[(1E) -phenyl (pyridin-3-yl) methylene) amino} oxy) ethyl) -7,8-dihydronaphthalen- 1-11} oxy) acetic or its salt as a drug and a copolymer of lactic acid / glycolic acid, in which (i) an amount of copolymer of lactic acid / glycolic acid in parts by weight of the drug is from 3 to 10 parts by weight, (ii) the microsphere has an average particle tamer) of from 20 to 50 μm, and (iii) the lactic acid / glycolic acid copolymer has a weight average molecular weight of from 10,000 to 50,000 and a composition ratio of lactic acid / glycolic acid from 75/25 to 50/50, and which satisfies at least one of the following conditions (1) to (2): (1) a remaining ratio of the drug after one hour in a release test is at least 90%; (2) a remaining reason for the drug after one day in a release test is at least 82%.

Description

Preparación de liberación sostenida para terapia de regeneración tisular Sustained release preparation for tissue regeneration therapy

Campo técnico Technical field

La presente invención se refiere a microesf~~ras que comprenden ácido ({5-[2-{{(1 E)-fenil(piridin-3iI)metilen]amino}oxQetiij-7,8-dihidronaftalen-1-il}oxi)acético '1 un copol lmero de copolfmero de ácido láctico/ácido glioolico. The present invention relates to microspheres comprising ({5- [2 - {{(1 E) -phenyl (pyridin-3iI) methylene] amino} oxQetiij-7,8-dihydronaphthalen-1-yl} oxy acid) ) acetic 1 a copolymer limeric copolymer / glycolic acid copolymer.

Antecedentes de la técnica Prior art

Hasta ahora se ha investigado el desarrollo de inyecciones de liberación lenta, a largo plazo, que pueden liberar de manera conlinua un fármaco con el objetivo de minimizar el numero de veces que se administra un medicamento y por tanto mejorar el cumplimiento con el fármaco. En particular, se han realizado numerosos estudios sobre métodos de liberaciÓn controlada que implican el uso de micrc,esferas de fármacos (algunas veces abreviadas como "ME") que usan un poUmero que tiene una escasa solubilideld en agua. Se emplea un polimero biodegradable como este pollmero de modo que, tras la liberación del fármaco, la base no queda en el sitio de administración. En particular, se usan polimeros de poli(ácido láctico) (algunas veces abreviados como "PLA") o copollmeros de ácido láctico/ácido glicólico (algunas veces abreviados como ' PLGAj, que tienen un registro establecido de uso, por ejemplo, en hilos para suturas quirúrgicas y pernos para anclajes óseos. Estos polímeros se emplean en inyecciones del derivado de LH-RH Leuplin (nombre comercial), que se venden comercialmente como inyecciones de liberación lenta, y en el derivado de somatostatina de aedón prolongada Sandostatin (nombre comercial) LAR. Until now, the development of long-term, slow-release injections that can release a drug with the objective of minimizing the number of times a drug is administered and therefore improving compliance with the drug has been investigated. In particular, numerous studies have been conducted on controlled release methods that involve the use of micrc, drug spheres (sometimes abbreviated as "ME") that use a polymer that has poor water solubility. A biodegradable polymer such as this polymer is used so that, after drug release, the base does not remain at the site of administration. In particular, poly (lactic acid) polymers (sometimes abbreviated as "PLA") or lactic acid / glycolic acid copolymers (sometimes abbreviated as' PLGAj) are used, which have an established record of use, for example, in threads for surgical sutures and bolts for bone anchors.These polymers are used in injections of the LH-RH Leuplin derivative (trade name), which are sold commercially as slow-release injections, and in the Sandostatin prolonged aedon somatostatin derivative (trade name ) LAR.

Los fármacos comúnmente encapsulados dentro de rnicroesferas incluyen péptidoS, protelnas y ácidos nudeicos, tales como péptidos fisiológicamente activos, diversos tipos de hormonas, factores de crecimiento, anticuerpos, genes y diversos factores de crecimiento/diferenciación celular. En la fabricación de microesferas, en general se sabe que cuando el fármaco que va a encapsularse tiene un peso molecular superior, puede fabricarse más fácilmente microesferes que tienen una ráfaga inicial baja y cuya liberación se controla fácilmente. Commonly encapsulated drugs within rhinosheroes include S-peptides, proteins and nude acids, such as physiologically active peptides, various types of hormones, growth factors, antibodies, genes and various cell growth / differentiation factors. In the manufacture of microspheres, it is generally known that when the drug to be encapsulated has a higher molecular weight, microspheres that have a low initial burst and whose release is easily controlled can be made more easily.

En cambio, por varios motivos, induyendo la gran ráfaga inicial, la difICUltad de liberación controlada y el bajo contenido de fármaco (razón de encapsulaclón), se ha encontrado una gran djficultad en los esfuerzos por preparar microesferas que contienen fármacos de bajo peso molecular; Hevar a cabo la liberaciÓfl estable de tales fármacos in vivo '1 controlar la tasa de liberación ha demostrado Sl!r extremadamente dificil. Como resultado, aunque hay casos en los que se han encapsulado compuestos de bajo peso molecular (véase el documento de patente 1), ninguno está comercialmente disponible como preparaciones f~mnacéuticas. On the other hand, for several reasons, inducing the large initial burst, the controlled release difficulty and the low drug content (encapsulation ratio), great difficulty has been found in efforts to prepare microspheres containing low molecular weight drugs; Carrying out the stable release of such drugs in vivo '1 controlling the release rate has proved Sl! R extremely difficult. As a result, although there are cases in which low molecular weight compounds have been encapsulated (see patent document 1), none are commercially available as pharmaceutical preparations.

Mientras lanto, el compuesto ácido ({5-[2-({[(1 E)-fenjl(piridin-3-il)metilenlamino}oxi)eti~-7,8-dihidronaflalen-1 il}oxi)acélico (abreviado a continuación como "el presente fármaco") es un compuesto de bajo peso molecular que tiene un esqueleto quimicamente estable distinto de prostaglandina (PG), una acción agonista de receptores de PGI2 (IP) Y una actividad de inhibición de tromboxano (TX) Aa. sintelasa. El presente fármaco, debido a que tiene una acci6n agonisla de PGI2, se conoce para usarse en la prevención y/o el tratamiento, por ejemplo, de trombosis, arteriosclerosis, cardiopatía isquémica, úlcera gástricas e hipertensión (documento de patente 2) . Meanwhile, the compound ({5- [2 - ({[(1 E) -fenjl (pyridin-3-yl) methylenelamino} oxy) eti ~ -7,8-dihydronaflalen-1-yl} oxy) acrylic (abbreviated) then as "the present drug") is a low molecular weight compound having a chemically stable skeleton other than prostaglandin (PG), an agonist action of PGI2 (IP) receptors and an inhibition activity of thromboxane (TX) Aa . synthesize The present drug, because it has an agonislative action of PGI2, is known to be used in the prevention and / or treatment, for example, of thrombosis, arteriosclerosis, ischemic heart disease, gastric ulcer and hypertension (patent document 2).

Sin embargo, las preocupaciones cuando se administra el presente fármaco por vla oral incluyen efectos secundarios tales como dolor en la parte superior dell~bdomen y diarrea. Cuando se administra por via intravenosa, efectos secundarios tales como una acción hipotensiva asociada con vasodilatación, sofocos y cefaleas, etc. son una preocupaciOn. En particular, cuando se emplea el presente fármaco, de las enfermedades mencionadas anteriormente, para enfermedades cardiovasculares tules como arteriosclerosis y cardiopatia lsquémica, etc. desde e! punto de vista de los efectos secundarios y del sistema terapéutico, para prevenir la exposici6n a una alla concentración de! fármaco en el tracto digestivo y un repentino aumento de la concentraciÓn en sangre del fármaco, para minimizar la carga sobre el paciente y para maximizar los efectos del fármaco, existe un gran deseo de preparaciones que puedan mantener de manera continua la concentraciOn de fánnaco con el menor número posible de administraciones, incluyendo formas farmacéuticas de un tipo que mantenga de manera continua la concentración del fármaco en el tejido en el sitio de en'fennedad o formas farmacéuticas de lipa de mantenimiento de la concentración en sangre tales romo infusiones intravenosas po!' goteo. However, concerns when the present drug is administered orally include side effects such as pain in the upper part of the abdomen and diarrhea. When administered intravenously, side effects such as a hypotensive action associated with vasodilation, hot flashes and headaches, etc. They are a concern. In particular, when the present drug is used, of the diseases mentioned above, for cardiovascular cardiovascular diseases such as arteriosclerosis and lschemic cardiopathy, etc. from e! point of view of the side effects and the therapeutic system, to prevent exposure to a high concentration of! drug in the digestive tract and a sudden increase in blood concentration of the drug, to minimize the burden on the patient and to maximize the effects of the drug, there is a great desire for preparations that can continuously maintain the concentration of the drug with the as few administrations as possible, including pharmaceutical forms of a type that continuously maintain the concentration of the drug in the tissue at the site of engenderment or pharmaceutical forms of lipa maintaining the blood concentration such blunt intravenous infusions po! ' drip.

Se ha investigado la administraciÓfl local de microesferas que contienen el presente fármaco como método para resolver lOS problemas anteriores, induyendo la aparición de efectos secundarios y un repentino aumento de la concentración en sangre del fármaco. Por ejemplo, el documento de patente 3 da a conocer una preparación de acción prolongada que contiene el presente fármaco y PLGA, '1 mendona que esta preparación fue eficaz cuando se administr6 localmente en un modelo de arteriosclerosis oblilerante (ASO) en rala. Sin embargo, dado que las microesferas descritas en el documento de patente 31 tenlan un bajo rontenido de fármaco, la dosis a las que se administran las propias mlcroesferas aumenta, dando lugar a un problema de acidez. Además, el periodo de liberación para el presente fármaco es corto y la tasa de liberación no es constante, como resultado de lo cual estas microesferas de la técnica anterior no han logrado mantener la concentración en sangre óptima para que su~an los efectos del fármaco a lo largo de un periodo de tiempo fijado. The local administration of microspheres containing the present drug has been investigated as a method to solve the above problems, inducing the appearance of side effects and a sudden increase in the blood concentration of the drug. For example, patent document 3 discloses a long-acting preparation containing the present drug and PLGA, '1 mendone that this preparation was effective when administered locally in a model of oblilent arteriosclerosis (ASO) in rala. However, since the microspheres described in patent document 31 had a low snore of drug, the dose at which the microspheres themselves are administered increases, resulting in an acidity problem. In addition, the release period for the present drug is short and the release rate is not constant, as a result of which these prior art microspheres have failed to maintain the optimal blood concentration so that they add the effects of the drug. over a fixed period of time.

Documento de patente 1: JP-9-263545 A Patent document 1: JP-9-263545 A

Documento de patente 2: JP'&-87811 A Patent document 2: JP '& - 87811 A

Documento de patente 3: WO 20041032965 Patent document 3: WO 20041032965

Descripción de la invención Description of the invention

Problemas que resuelve la invención Problems solved by the invention

El objelo de la invención es proporcionar microesferas seguras, fáciles de usar, que liberen de manera continua el presente fármaco a lo [argo de un periodo de liempo prolongado, puedan incluir un alto contenido del fármaco, liberen el fármaco a una tasa fijada y, durante el periodo de liberación, mantengan el fármaco en un intervalo de concentración en sangre óptimo para que se manifiesten los efectos del fármaCo. The object of the invention is to provide safe, easy-to-use microspheres that continuously release the present drug over a long period of time, may include a high content of the drug, release the drug at a fixed rate and, During the release period, keep the drug in an optimal blood concentration range so that the effects of the drug are manifested.

Medios para resolver los problemas Means to solve the problems

Los inventores han realizado investigaciones con el objetivo de resolver los problemas anteriores. Como resultado, han encontrado que, en microesferas que comprenden el presente fármaco y PLGA (microesferas que también se denominan a continuación "las microesferas de la invenciónl, una combinación especIfica de características tales como el peso molecular promedio en peso del PLGA, la razón de ácido láctico/ácido gliCÓlico en el PLGA, el tamano de partlcu[a promedio de las microesferas, la razón en peso del presente fármaco y el PLGA, o similares, tiene los efectos imprevistos de conferir la capacidad de liberar de manera continua el fármaco a lo largo de un periodo prolongado de una semana o más y permitir incluir el fármaco dentro de las microesferas en un contenido superior, permitiendo por lanto fijar la dosis de microesferas dHntro de un intervalo óptimo al que no surge un problema de acidez. Además, los inventores han descubierto que las microesferas del presenle fármaco pueden suprimir una refaga inicial (es decir, el porcentaje del fármaco que queda en una prueba de liberación puede mantenerse a, o por encima de, un valor fijado) y, durante el periodo de liberación, pueden mantener la concentración en sangre del fármaco en el intervalo óptimo para que se manifiesten los efectos del fármaco. The inventors have conducted research with the aim of solving the above problems. As a result, they have found that, in microspheres comprising the present drug and PLGA (microspheres that are also referred to below as "the microspheres of the invention, a specific combination of characteristics such as the weight average molecular weight of the PLGA, the ratio of lactic acid / glycolic acid in PLGA, the size of partlcu [on average of the microspheres, the weight ratio of the present drug and PLGA, or the like, has the unforeseen effects of conferring the ability to continuously release the drug to over a prolonged period of one week or more and allow the drug to be included in the microspheres at a higher content, allowing the dose of microspheres dHntro to be set at an optimum interval at which an acidity problem does not arise. inventors have discovered that the microspheres of the drug present can suppress an initial burst (i.e., the percentage of the drug remaining in a drug a release test can be maintained at, or above, a set value) and, during the release period, they can maintain the blood concentration of the drug in the optimum range for the effects of the drug to manifest.

Por consiguiente, los problemas de la invención se resuelven mediante: Consequently, the problems of the invention are solved by:

Una microesfera de acción prolongada de dos a cuatro semanas, que comprende ácido ({5-[2-({l(1E)-fenil(piridin-3iI)metilen]amino}oxi)etiI]-7,8-dihidronaftalen-1-il}oxi)acé,tico como fármaco y un copolimero de ácido láctico/ácido glicólico, en la que A long-acting microsphere of two to four weeks, comprising ({5- [2 - ({l (1E) -phenyl (pyridin-3iI) methylene] amino} oxy) etiI] -7,8-dihydronaphthalen-1 acid -il} oxy) acetic, as a drug and a copolymer of lactic acid / glycolic acid, in which

(i) (i)

una cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido glicólico en partes en peso del fármaco es de desde 3 hasta 10 partes en peso, an amount of copolymer of lactic acid / glycolic acid in parts by weight of the drug is from 3 to 10 parts by weight,

(ii) (ii)

la microesfera tiene un tamano de partícula promedio de desde 20 hasta SO Ilm, y (¡ji) e[ copolimero de ácido láctico/ácido glicólico tiene un peso molecular promedio en peso de desde 10.000 hasta the microsphere has an average particle size of from 20 to SO Ilm, and (¡Ji) e [lactic acid / glycolic acid copolymer has a weight average molecular weight of from 10,000 to

50.000 y una razón de composición de ácido láctico/ácido glicólico de desde 75/25 hasta SO/50, y que satisface al menos una de las siguientes condiciones (1) a (2): 50,000 and a ratio of lactic acid / glycolic acid composition from 75/25 to SO / 50, and that satisfies at least one of the following conditions (1) to (2):

(1) (one)

una razón restante del fármaco tras una hora en una prueba de liberación es de al menos el 90%; a remaining ratio of the drug after one hour in a release test is at least 90%;

(2) (2)

una razón restante del fármaco Iras un dia en una prueba de tiberación es de al menos el 82%. Las siguientes realizaciones describen la presente invE!Oción: La microesfera según la presente invención, en la que el contenido de copolimero de ácido láctico/ácido glioolico en One remaining reason for the drug You will go one day on a tiberation test is at least 82%. The following embodiments describe the present invention: The microsphere according to the present invention, in which the copolymer content of lactic acid / glycolic acid in

partes en peso del fármaco es de desde 4 hasta 8 partes en peso. parts by weight of the drug is from 4 to 8 parts by weight.

La microesfera segun la presente invención, en la qlJe la microesfera tiene un tamano de partlcula promedio de desde 25 hasta 35 Ilm. La microesfera segun la presente invención, en la qUE! la razón de copolimero de ácido láctico/ácido glicólico es de The microsphere according to the present invention, in which the microsphere has an average particle size of from 25 to 35 Ilm. The microsphere according to the present invention, in which! The ratio of lactic acid / glycolic acid copolymer is

50/50. 50/50

La microesfera segun la presente invención, en la que la concentración en sangre del fármaco es de desde 0,01 ng/ml hasta 150 ng/ml. Una microesfera de acción prolongada de dos semanas, que comprende ácido ({5-[2-({[( 1 E)-fenil(piridin-3-il)metilen1a mino}oxi)etil]-7 ,8-dihidronaftalen-1-il}oxi)acético como The microsphere according to the present invention, in which the blood concentration of the drug is from 0.01 ng / ml to 150 ng / ml. A two week long acting microsphere, comprising ({5- [2 - ({[(1 E) -phenyl (pyridin-3-yl) methylene1a mino} oxy) ethyl] -7,8-dihydronaphthalen-1-yl} oxy) acetic acid as

fármaco y un copollmero de ácido láctico/ácido glioolio:>, en la que drug and a copolymer of lactic acid / glycolium acid:>, in which

(i) una cantidad de copolimero de ácido lácticoJácido glicólico en partes en peso del fármaco es de desde 4 hasta (i) an amount of lactic acid copolymer Glycolic acid in parts by weight of the drug is from 4 to

S S

IS IS

8 partes en peso, 8 parts by weight,

(ii) la microesfera tiene un tamano de partícula promedio de desde 25 hasla 35 ~m, y (ii) the microsphere has an average particle size of from 25 to 35 ~ m, and

(iii) el copollmero de ácido láctico/ácido glicólico tiene un peso molecular promedio en peso de desde 10.000 hasta 30,000 y una razón de composiCión de ácido láctico/áddo gl1cólico de SO/SO, (iii) the lactic acid / glycolic acid copolymer has a weight average molecular weight of from 10,000 to 30,000 and a compositional ratio of lactic acid / glycolic acid of SO / SO,

y que satisface la siguiente condidÓfl (1): and that satisfies the following condidÓfl (1):

(1) una razón restante del fármaco tras una hora en una prueba de liberación es de al menos el 90%. (1) a remaining ratio of the drug after one hour in a release test is at least 90%.

Una microesfera de acción prolongada de cuatro semanas, que comprende ácido ({5-[2-({[(lE)-fenil(piridln-3il)metilen)amlno}oxi)elil}-7,8-dihidronaftalen-l-il}oxi)acélico como fármaco y un copolfmero de ácido láctico/ácido glic6lico, en la que A four-week long-acting microsphere, comprising ({5- [2 - ({[(lE) -phenyl (pyridin-3-yl) methylene) aml}} oxy) elyl} -7,8-dihydronaphthalen-1-yl oxy) acrylic as a drug and a copolymer of lactic acid / glycolic acid, in which

(1) (one)

una cantidad de copol1mero de ácido láctico/ácido glicóllco en partes en peso del fármaco es de desde 4 hasta 8 partes en peso, an amount of copolymer of lactic acid / glycol acid in parts by weight of the drug is from 4 to 8 parts by weight,

(ii) (ii)

la microesfera tiene un tamano de particula promedio de desde 25 hasta 35 ~m, y the microsphere has an average particle size of from 25 to 35 ~ m, and

(iii) el copollmero de ácido láctico/ácido glic61ico tiene un peso molecular promedio en peso de desde 30.000 hasta (iii) the lactic acid / glycolic acid copolymer has a weight average molecular weight of from 30,000 to

50.000 y una razón de composición de ácido láctico/ácido glic6lico de 50/50, y que satisface la siguiente coodici6rl (l): 50,000 and a composition ratio of lactic acid / glycolic acid of 50/50, and which satisfies the following co-diction (l):

(1) una razón restante del fármaco tras un día en una prueba de liberación es de al menos el 82%. Las realizaciones preferidas de la presente invención se exponen en las reivindicaciones dependientes. El fármaco usado en la presente invención es ácido ({5-(2-({[(1E)-fenil(piridin-3-iI)melilen]amino}oxi)etil}-7,8(1) a remaining ratio of the drug after one day in a release test is at least 82%. Preferred embodiments of the present invention are set forth in the dependent claims. The drug used in the present invention is ({5- (2 - ({[(1E) -phenyl (pyridin-3-iI) melylen] amino} oxy) ethyl} -7.8

dihidronaftalen-l-il}oxi)acético (n.o de registro CAS 176391-41-6) de fórmula (A). dihydronaftalen-l-yl} oxy) acetic (CAS No. 176391-41-6) of formula (A).

N N

v v

(A) (TO)

El presente fármaco se menCiona en el ejemplo 2(g) del documento JP-6-87811 A, Y puede prepararse según un método descrito en la misma publicaCión. Altemativarnente, puede usarse una sal del presente fármaco, tal como una sal de sodio o una sal de clorhidrato, en lugar del presente farmaco. The present drug is mentioned in example 2 (g) of JP-6-87811 A, and can be prepared according to a method described in the same publication. Alternatively, a salt of the present drug, such as a sodium salt or a hydrochloride salt, may be used instead of the present drug.

Tal como se usa en el presente documento, el término "microesferas· se refiere a microesferas que comprenden el presente farmaco y PLGA, As used herein, the term "microspheres" refers to microspheres comprising the present drug and PLGA,

El PLGA usado en la presente invención es un polímero blodegradable. Cuando se administran in vivo microesferas compuestas por PlGA, en primer lugar, las molecula:s de agua penetran rápidamenle en el pollmero e hidmt3n el PlGA, haciendo que se hinche y provocando que la hidrólisis avance por su totalidad, como resultado de lo cual el peso molecular del PlGA disminuye gradualmente. l os fluidos corporales (humedad) infiltran las microesferas en el plazo de aproximadamente 24 horas, conduciendo a un hinchamIento suficiente. A medida que avanza la disminución en el peso molecular del PlGA, la estructllra dominante se rompe y se debil~a, y el fármaco presente en la misma se difunde hacia el exteriOf enlre los enlaces de PLGA debilitados y se libera mediante disolución. la hidrólisis de PLGA se produce de manera tanto enzinlática como no enzlmática, comenzando con la infiltraciÓn de fluidos corporales (humedad), liberándose gradualmente el fármaco a medida que avanza la hidrólisis. The PLGA used in the present invention is a blodegradable polymer. When microspheres composed of PlGA are administered in vivo, first, the water molecules quickly penetrate the polymer and hydrate the PlGA, causing it to swell and causing the hydrolysis to progress completely, as a result of which the PlGA molecular weight gradually decreases. Body fluids (moisture) infiltrate the microspheres within approximately 24 hours, leading to sufficient swelling. As the decrease in the molecular weight of PlGA progresses, the dominant structure is broken and weakened, and the drug present in it spreads outward between the weakened PLGA bonds and is released by dissolution. PLGA hydrolysis occurs both enzymatically and non-enzymatically, starting with the infiltration of body fluids (moisture), gradually releasing the drug as hydrolysis progresses.

El PLGA usado en la presente invención puede produc:irse mediante un método bien conocido en si mismo, o puede adquirirse como producto comercial. los ejemplos i l~lstralivos del PlGA usado en la presente invención incluyen Pl GA-7510 (producido por Wako Pure Chemical Indu~tries, lid.; ácido Ol-Iáctico/ácido glic6lico = 75125; peso molecular promedio en peso, 10.0(0), PlGA-7515 (producido por Wako Pure Chemlcal Industries, lid.; ácido Dlláctico/ácido glicólico =75125; peso molecular promedio en peso, 15.000), PLGA-7520 (producido por Wako Pure Chemlcallndustries, lid.; ácido OL-Iáctico/ácido glicólico =75125; peso molecular promedio en peso, 20.000), PlGAThe PLGA used in the present invention can be produced by a method well known in itself, or it can be purchased as a commercial product. The illustrative examples of the PlGA used in the present invention include Pl GA-7510 (produced by Wako Pure Chemical Industrial, lid; Ol-Lactic acid / glycolic acid = 75125; weight average molecular weight, 10.0 (0) , PlGA-7515 (produced by Wako Pure Chemlcal Industries, lid .; Dlactic acid / glycolic acid = 75125; weight average molecular weight, 15,000), PLGA-7520 (produced by Wako Pure Chemlcallndustries, lid .; OL-Ictic acid / glycolic acid = 75125; weight average molecular weight, 20,000), PlGA

ss H.H

5010 (producido por Wako Pure Chemical Industries, LId.; ácido DL-Iáctico/ácido glicólico =50/50; peso molecular promedio en peso, 10.000), PlGA-5015 (producido por Wako Pure Chemicallndustries, Ud.; ácido Dl-Iáctico/ácido glicólico =50150; peso molecular promedio en peso, 15.000), PLGA-5020 (producido por Wako Pure Chemical Industries. LId.; ácido DL-Iáctico/ácido glicólico = 50l50; peso molecular promedio en peso, 20.000), PLGA5-50 (también denominado PLGAS-1 : producido por Milsui Chemicals, lne.; ácido DL-Iáctico/ácido glicólico = 50/50; peso molecular promedio en peso, 50.000), PLGA75-50 (producido por Mitsui Chemicals, lne.; ácido DL-Iáctioo/ácido glic6lico =75125; peso molecular promedio en peso, SO.OOO), H1702-2 (producido por Mitsui Chemicals, Inc.; ácido Dl-Iáeticolácido glicólico =50/50; peso molecular promedio en peso, 18.000), H1702-3 (producido por Mitsui Chemicals, Ine,; ácido OL-Iáctico/ácido glicólico = 50/50; peso molecular promedio en peso, 35.000) y H1702-4 (producido por Mitsui Chemicals, lne.; ácido Ol-Iáctico/ácido gliOOlico =S0/50; peso molecular promedio en peso, 46.000), etc. Algunos de estos PLGA tienen un bajo punto de corte de peso molecular (peso molecular promedio en peso de desde 1 hasta 3.000) o similar. 5010 (produced by Wako Pure Chemical Industries, LId .; DL-Lactic acid / glycolic acid = 50/50; weight average molecular weight, 10,000), PlGA-5015 (produced by Wako Pure Chemicallndustries, Ud .; Dl-Ictic acid / glycolic acid = 50150; weight average molecular weight, 15,000), PLGA-5020 (produced by Wako Pure Chemical Industries. LId .; DL-Lactic acid / glycolic acid = 50l50; weight average molecular weight, 20,000), PLGA5- 50 (also called PLGAS-1: produced by Milsui Chemicals, lne .; DL-Lactic acid / glycolic acid = 50/50; weight average molecular weight, 50,000), PLGA75-50 (produced by Mitsui Chemicals, lne .; acid DL-Ictio / glycolic acid = 75125; weight average molecular weight, SO.OOO), H1702-2 (produced by Mitsui Chemicals, Inc .; glycolic Dl-Iethacrylic acid = 50/50; weight average molecular weight, 18,000) , H1702-3 (produced by Mitsui Chemicals, Ine ;; OL-Lactic acid / glycolic acid = 50/50; weight average molecular weight , 35,000) and H1702-4 (produced by Mitsui Chemicals, lne .; Ol-Lactic acid / glycolic acid = S0 / 50; weight average molecular weight, 46,000), etc. Some of these PLGAs have a low molecular weight cut-off point (weight average molecular weight from 1 to 3,000) or the like.

En la presente memoria descriptiva, el peso molecul ar promedio en peso de PLGA se refiere al peso molecular promedio equivalente de poliestireno medido mediante cromatografla de penneación en gel (CPG). In the present specification, the average molecular weight by weight of PLGA refers to the equivalent average molecular weight of polystyrene measured by gel penetration chromatography (CPG).

Pueden usarse ácido L-Iáctico, ácido O-láctico o ácido OL-Iáctico como ácido láctico en el PLGA. Se prefiere ácido OL-Iáetico. L-Lactic acid, O-lactic acid or OL-Lactic acid can be used as lactic acid in the PLGA. OL-Iáetic acid is preferred.

Cuando se usan las microesferas de la invención para prevenir y/o tratar, de las indicaciones mencionadas a continuación, arteriosclerosis obliterante, ictus, fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, asma, diabetes y complicaciones de la misma, angina, infarto de miocardio, insuficiencia renal, osteoartritis, artritis reumatoide u osteoporosis, el periodo de liberación lenta es preferibl4~mente de desde dos hasta cuatro semanas. When the microspheres of the invention are used to prevent and / or treat, from the indications mentioned below, obliterating arteriosclerosis, stroke, pulmonary fibrosis, pulmonary hypertension, asthma, diabetes and complications thereof, angina, myocardial infarction, renal failure , osteoarthritis, rheumatoid arthritis or osteoporosis, the slow release period is preferably from two to four weeks.

En las mieroesferas de la invenciÓn, el peso molecular promedio en peso del PlGA puede seleccionarse de la siguiente manera segun el periodo de liberación lenta seleccionado como diana. Por ejemplo, en el caso de un periodo de liberación lenta de dos a cuatro semanas, se prefiere un peso molecular promedio de desde aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 50,000. De este intervalo, cuando se selecciona como diana un periodO de liberación lenta de dos semanas, el peso molecular promedio en peso del PlGA es preferiblemente de desde aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 30.000, más preferiblemente desde aproximadamente In the microspheres of the invention, the weight average molecular weight of the PlGA can be selected as follows according to the slow release period selected as the target. For example, in the case of a slow release period of two to four weeks, an average molecular weight of from about 10,000 to about 50,000 is preferred. From this range, when a two week slow release period is selected as the target, the weight average molecular weight of the PlGA is preferably from about 10,000 to about 30,000, more preferably from about

10.000 hasta aproximadamente 20.000 y lo más preferiblemente desde aproximadamente 20.000. Cuando se selecciona como diana un periodo de liberación lenta de cuatro semanas, el PLGA peso molecular promedio en peso es preferiblemente de desde aproximadamente ,30.000 hasta aproximadamente 50.000, más preferiblemente desde aproximadamente 40,000 hasta aproximadam4~nte 50.000 y lo más preferiblemente de aproximadamente 10,000 to about 20,000 and most preferably from about 20,000. When a four week slow release period is selected as target, the PLGA weight average molecular weight is preferably from about 30,000 to about 50,000, more preferably from about 40,000 to about 50,000 and most preferably about

50.000. 50,000

La razón de ácido láctico/ácido gliOOlico en el PlGA puede seleccionarse de la siguiente manera segun el periodo de liberación lenta seleccionado como diana. Por ejemplo, cuando se selecciona como diana un periodo de liberación de dos a cuatro semanas, la razón es preferiblemente de desde 75125 hasta 25175 (plp), más preferiblemente desde 75125 hasta 50/50 (p/p) Y lo más preferiblemente de 50.150 (plp). The ratio of lactic acid / glycolic acid in the PlGA can be selected as follows according to the slow release period selected as the target. For example, when a release period of two to four weeks is selected as the target, the ratio is preferably from 75125 to 25175 (plp), more preferably from 75125 to 50/50 (w / w) and most preferably 50,150 (plp).

En mieroesferas preparadas usando PLGA, la tasa de liberaciÓn se ralentiza a un tamaño de partlcula promedio mayor. Sin embargo, en casos en los que las microesferas se administran por vla subcutánea, intramuscular o local dentro del Órgano enfenno, a un tamaño de partlcula promedio de 10 ¡..1m o menos, cuando las microesferas fluyen hacia fuera al interior del sistema vascular, pueden circular a través de todo el organismo, detenerse en sitios no diana tales como los pulmones, el higado o los riñones, y liberar el fármaco en esos sillos, como resultado de lo cual puede que no logren aparecer los efectos del fármaco. Por otro lado, a un tamaño de partícula de 70 ¡.tm o más, el paso a través de la jeringa (que tiene un calibre de 25iG a 27G) usada durante la administración empeora, además de eso, cuando tales microesferas fluyen al interior del sistema vascular, pueden obstruir los capilares, desencadenando un estado isquémico. In microspheres prepared using PLGA, the release rate slows down to a larger average particle size. However, in cases where the microspheres are administered subcutaneously, intramuscularly or locally within the Organ organ, at an average particle size of 10 ... 1m or less, when the microspheres flow out into the vascular system They can circulate throughout the body, stop at non-target sites such as the lungs, liver or kidneys, and release the drug in those chairs, as a result of which the effects of the drug may not appear. On the other hand, at a particle size of 70 µm or more, the passage through the syringe (which has a caliper of 25iG to 27G) used during administration worsens, in addition to that, when such microspheres flow inside of the vascular system, they can clog the capillaries, triggering an ischemic state.

Por tanto, el tamaño de partícula promedio de las microesferas de la invención puede ajustarse de manera adecuada para evitar los prOblemas anteriores y según el periodo de liberación lenta seleccionado como diana. Por ejemplo, en casos en los que el periodo de liberación lenta es de desde dos hasta cuatro semanas, el tamaño de partlcula promedio es preferiblemente de desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 ¡..1m y más preferiblemente desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 !-1m. Therefore, the average particle size of the microspheres of the invention can be adjusted appropriately to avoid the above problems and according to the slow release period selected as the target. For example, in cases where the slow release period is from two to four weeks, the average particle size is preferably from about 20 to about 50 ... 1m and more preferably from about 25 to about 35! - 1m

En la presente invenciÓn. el tamai'lo de particula promedio de las microesferas puede ajustarse en combinación adecuada con el tipo de homogeneizador de emul,si6n usado durante la prodUCCión de PlGA (por ejemplo, Physcotron (producido por Nichion Irika Kikai Seisakusho), Homo Mixer (producido por Primix Corporation), Uní Mixer (Primix Corporation), TK Robomix (Primix Corporalion) etc.) y la velocidad de rotación durante la agitación. In the present invention. The average particle size of the microspheres can be adjusted in suitable combination with the type of emul homogenizer, if used during the production of PlGA (for example, Physcotron (produced by Nichion Irika Kikai Seisakusho), Homo Mixer (produced by Primix Corporation), Uní Mixer (Primix Corporation), TK Robomix (Primix Corporalion) etc.) and the rotation speed during agitation.

Tal como se usa en el presente documento, "tamaño de partícula promedio de las microesferas de la invención~ se refiere al tamaño de partlcula promedio (diámetro medio ponderadO) de partlculas principales de las mismas, y puede medirse, por ejemplo, con un analizador de la distribución de tamaño de partícula de tipo por difracción de láser comúnmente usado (por ejemplo, SALO-2100 (fabricado por Shimadzu Corporation) O un contador Coulter (Multisizer3, fabricado por Beckman Coulter, Ine.). los tamaños de partlcula promedios de microesferas menCionados en esta memoria descriptiva son valores medidos mediante el métOdo del contador Coulter. As used herein, "average particle size of the microspheres of the invention" refers to the average particle size (weighted average diameter) of main particles thereof, and can be measured, for example, with an analyzer of the commonly used laser diffraction type particle size distribution (eg SALO-2100 (manufactured by Shimadzu Corporation) OR a Coulter counter (Multisizer3, manufactured by Beckman Coulter, Ine.). the average particle sizes of microspheres mentioned in this specification are values measured by the Coulter counter method.

En la presente invención, la razón en peso del presenl:e fármaco y el PLGA en las microesferas, expresada como el número de partes en peso de PLGA por partes en peso del fármaco, es preferiblemente de desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10, más preferiblemente desde aproximadamente 3,5 hasta aproximadamente 9 y lo más preferiblemente desde aproximadamente 4 hasta apro)fimadamente 8. In the present invention, the weight ratio of the presenl: e drug and PLGA in the microspheres, expressed as the number of parts by weight of PLGA per parts by weight of the drug, is preferably from about 3 to about 10, more preferably from about 3.5 to about 9 and most preferably from about 4 to about 8.

Cuando la razón de encapsulaciOn del presente fármaco incluido en el PlGA (la "razón de encapsulaci6n" puede convertirse en el contenido correspondiente del presente férmaco) es baja. la dosis de PlGA aumenta. Con respecto a la seguridad del propio PLGA. en desarrollo para su uso, por ejemplo, en inyeociones Leuplin e inyecciones intramusculares Sandostatin LAR, se ha confirmado que PLGA está libre de toxicidad. Se sabe que cuando se administra una gran cantidad, las concentraciones de ácido láctico y/o ácido glic6lico hldrolizados aumentan en el sitio de administración, provocando un problema de acidez. Por tanto, es deseable reducir lo mas posible la cantidad de PLGA en el momento de la administraciÓn; para ello, existe la necesidad de aumentar la razÓn de encapsulaciÓn del presente fármaco. Por otro lado, cuando se aumenta la razón de encapsulaci6n del presente fármaco, la estructura de superficie de las partlculas de microesferas se tensa, como resultado de lo cual aumenta la ráfaga inidal. Por tanto, la raz6n de encapsulad6n es preferiblemente de desde aproximadamente el 9% hasta aproximadamente el 25% Qo que oorresponde a un alOtenido de fármaco en el que la cantidad de PLGA en partes en peso del fármaco es de desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 partes en peso), más preferiblemente desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 22% (lo que corresponde a un contenido de fármaco en el que la cantidad de PLGA en partes en peso del fármaco es de desde aproximadamente 3,5 hasta aproximadamente 9 partes en peso) y lo más preferiblemente desde aproximadamente el 11% hasta aproximadamente el 20".4 (lo que corresponde a un a>ntenido de fármaco en el que la cant!dad de PLGA en partes en peso del fármaco es de desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 partes en peSO). When the encapsulation ratio of the present drug included in the PlGA (the "encapsulation ratio" may become the corresponding content of the present drug) is low. The dose of PlGA increases. With respect to the safety of the PLGA itself. In development for use, for example, in Leuplin injections and intramuscular injections Sandostatin LAR, it has been confirmed that PLGA is free of toxicity. It is known that when a large amount is administered, the concentrations of hydrolyzed lactic acid and / or glycolic acid increase at the site of administration, causing an acidity problem. Therefore, it is desirable to reduce as much as possible the amount of PLGA at the time of administration; for this, there is a need to increase the reason for encapsulation of the present drug. On the other hand, when the encapsulation ratio of the present drug is increased, the surface structure of the microsphere particles tenses, as a result of which the inidal burst increases. Therefore, the encapsulation ratio is preferably from about 9% to about 25%, which corresponds to a drug content in which the amount of PLGA in parts by weight of the drug is from about 3 to about 10 parts. by weight), more preferably from about 10% to about 22% (which corresponds to a drug content in which the amount of PLGA in parts by weight of the drug is from about 3.5 to about 9 parts in weight) and most preferably from about 11% to about 20 ".4 (which corresponds to a drug content in which the amount of PLGA in parts by weight of the drug is from about 4 to approximately 8 parts in peSO).

En las microesferas de la invenci6n, el contenido, O lel razón de encapsulaci6n, del presente fármaco incluido en el PLGA se expresa mediante la siguiente f6rmula. In the microspheres of the invention, the content, or the reason for encapsulation, of the present drug included in the PLGA is expressed by the following formula.

Raz6n de encapsulación (%) '" (contenido nledido de fármaco/cantidad de microesferas) X 100 Encapsulation reason (%) '"(drug content / quantity of microspheres) X 100

La raz6n de encapsulad6n puede medirse mediante el método descrito a continuaci6n en los ejemplos de realización. The encapsulation ratio can be measured by the method described below in the embodiments.

En la presente invención, microesferas "de acción prolongada de dos a cuatro semenas· se refiere a microesferas que tienen la capacidad de liberar de manera continua el fármaco encapsulado en las microesferas de la invenci6n durante un periodo de desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente cuatro semanas tras la administración. Microesferas "de acción prolongada di;! dos semanas" o "de acción prolongada de cuatro semanas· se refieren a la capacidad de liberar de manera continua una dosis eficaz del fármaco encapsulado en las microesferas de la Invendón durante un periodo de aproximadamente dos semanas o de aproximadamente cuatro semanas tras la administración. Además, en la preserlte memoria descriptiva, tanto la expresión "acción prolongada de dos semanas" como la expresión "que tiene un periodo de liberación lenta de dos semanas' tienen el mismo significado, y tanto la expresión "acción prolongada dEl cuatro semanas" como la expresión "que tiene un periodo de liberación lenta de cuatro semanas· tienen el mismo significado. In the present invention, "long-acting microspheres" of two to four weeks · refers to microspheres that have the ability to continuously release the drug encapsulated in the microspheres of the invention over a period of from about two weeks to about four weeks after administration. Long-acting microspheres say; Two weeks "or" long-acting four weeks · refer to the ability to continuously release an effective dose of the drug encapsulated in the Invendon microspheres for a period of approximately two weeks or approximately four weeks after administration. In addition, in the present descriptive report, both the expression "two week long action" and the expression "having a slow release period of two weeks' have the same meaning, and both the expression" four week long action "and the expression "which has a slow release period of four weeks · has the same meaning.

En la presente invención, la expresión "liberar el fármaco a una tasa fijada durante aproximadamente cuatro semanas tras la administración" significa que el presente fármaco encapsulado dentro de las miCtoesferas de la invendón se libera de manera continua y a una tasa fijada, es decir, de manera constante, durante aproximadamente cuatro semanas tras la administración. En este caso, el método de confirmar que el presente fármaco se libera a una lasa fijada, tal como resultará evidente para los expertos en la técnica, implica confirmar que, en la prueba de liberación in vitro descrita a continuación. la razón restante del presente fármaco cambia linealmente con el tiempo; es decir, experimenta lJOa liberaci6n de orden cero. Mediante esta capacidad, la concentración eficaz del presente fármaco en la sangre o la concentración eficaz del presenle fármaco en el sitio de enfermedad pueden mantenerse de manera contlrlua y constante dentro del periodo de liberación indicado anteriormente. Tal como se indicó anteriormente, el periodo de liberación preferido es de dos semanas o de cuatro semanas. In the present invention, the expression "release the drug at a fixed rate for approximately four weeks after administration" means that the present drug encapsulated within the microspheres of the invention is released continuously and at a fixed rate, that is, from steadily, for approximately four weeks after administration. In this case, the method of confirming that the present drug is released to a fixed slab, as will be apparent to those skilled in the art, implies confirming that, in the in vitro release test described below. the remaining ratio of the present drug changes linearly with time; that is, it experiences zero order release. By this ability, the effective concentration of the present drug in the blood or the effective concentration of the drug present at the disease site can be maintained continuously and consistently within the release period indicated above. As indicated above, the preferred release period is two weeks or four weeks.

Las concentraciones en sangre del fármaco en ratas que se obtuvieron en los ejemplos de realización descritos a continuación son concentraciones adecuadas para evitar efectos secundarios (por ejemplo, pérdida de peso, diarrea, efectos hipotens;vos) en la rata o similar y para manifElstar los efectos del fármaco. Tal como resultará evidente para los expertos en la técnica, esta concentración en sangre puede extrapolarse a la concentración en sangre del fármaco en seres humanos. Blood concentrations of the drug in rats that were obtained in the embodiments described below are adequate concentrations to avoid side effects (eg, weight loss, diarrhea, hypotensive effects) in the rat or the like and to manifest the drug effects. As will be apparent to those skilled in the art, this blood concentration can be extrapolated to the blood concentration of the drug in humans.

Cuando la concentración en sangre del presente fármaco en seres humanos supera aproximadamente 150 ng/ml, además de un efecto de inhibIción de la agregación pl:¡¡,quetaria, existe una preocupación de que aparecerán sofocos faciales, pesadez de cabeza y un efecto hipotenslvo transitorio. Por otro lado, cuando la concentración en sangre y/o la concentración local en tejidO con enfermedad del presente fármaco está por debajO de aproximadamente 0,01 ng/ml, existe la posibilidad de que los efectos del fánnaco no aparecerán completamente. When the blood concentration of the present drug in humans exceeds approximately 150 ng / ml, in addition to an effect of inhibition of aggregation pl: ¡¡, wanted, there is a concern that facial hot flashes, heaviness of the head and a hypotensive effect will appear transient. On the other hand, when the concentration in blood and / or the local concentration in tissue with disease of the present drug is due to approximately 0.01 ng / ml, there is a possibility that the effects of the drug will not appear completely.

Dado que los resultados de concentración en sangre obtenidos de ratas generalmente se extrapolan a seres humanos usando valores numéricos que oscilan entre aproximadamente 1/100 y aproximadamente 100 veces la concentración en sangre obtenida en ratas, se conjetura que la concentración en sangre del fármaco adecuada para manifestar efectos del fármaco en seres humanos es de desde aproximadamente 0,01 ng/ml hasta aproximadamente 150 ng/ml. Since the blood concentration results obtained from rats are generally extrapolated to humans using numerical values ranging from about 1/100 to about 100 times the blood concentration obtained in rats, it is conjectured that the blood concentration of the drug suitable for manifesting effects of the drug in humans is from about 0.01 ng / ml to about 150 ng / ml.

En la presente invención, la expresión ~mantener la concentradón en sangre del fármaco~ significa, cuando se administran sistémicamente las miaoesferas de la invención, mantener la concentraciÓfl en sangre del presente fármaco en un intervalo adecuado para evitar efectos secundarios y manifestar los efectos del ftmnaco en seres humanos. Tal intervalo es preferiblemente de des.de aproximadamente 0,01 ng/ml hasta aproximadamente 150 ng/ml y más preferiblemente desde aproximadamente 0,1 ng/ml hasta aproximadamente 60 ng/ml. En casos en los que las microesferas del presente fármaco se administran al sitio de enfermedad con el fin de mantener la concentradón local de manera continua a una alta concentración, la concentración en sangre del presente fármaco que fluye hacia fuera a la sangre, aunque también depende del sitio del órgano, etc, al que se administran las microesferas, es normalmente de desde aproximadamente l /lO hasta aproximadamente 1/100 del intervalo de In the present invention, the expression ~ maintaining the drug's blood concentration ~ means, when the myospheres of the invention are administered systemically, maintaining the blood concentration of the present drug in a suitable range to avoid side effects and manifesting the effects of the drug. in humans. Such range is preferably from about 0.01 ng / ml to about 150 ng / ml and more preferably from about 0.1 ng / ml to about 60 ng / ml. In cases where the microspheres of the present drug are administered to the disease site in order to maintain the local concentration continuously at a high concentration, the blood concentration of the present drug flowing out to the blood, although it also depends from the site of the organ, etc., to which the microspheres are administered, is usually from about 1/10 to about 1/100 of the range of

desde aproximadamente 0,01 ng/ml hasta aproximadamente 150 ng/ml, from about 0.01 ng / ml to about 150 ng / ml,

l a forma de administración de las microesferas de la invención se muestra a modo de ejemplo mediante inyecciones subcutáneas, intradérmicas, intramusculares e intrava~iculares, inyecciones al órgano local de enfermedad, tal como inyecciones en el sistema nervioso central o el miocardio, etc.; agentes de inclusión mezclados con cemento óseo, un material de prótesis ósea artificial (j3-TCP; fosfato de tricalcio) o un hidrogel de gelatina. etc.; endoprótesis de elución de fánnaco (DES); agentes que se administran por vla transmucosa, tales como en el recto, la cavidad uterina o bucal. etc.; agentes orales. supositorios. gotas nasales. inhalantes, colirios; y administración a las cavidades de las articulaciones o al sitio focal. etc. tales como un tumor, etc. o similares. The administration of the microspheres of the invention is shown by way of example by subcutaneous, intradermal, intramuscular and intravacular injections, injections to the local organ of disease, such as injections into the central nervous system or myocardium, etc .; inclusion agents mixed with bone cement, an artificial bone prosthesis material (j3-TCP; tricalcium phosphate) or a gelatin hydrogel. etc.; Flank Elution Stent (DES); agents that are administered by the transmucosa, such as in the rectum, the uterine or oral cavity. etc.; oral agents suppositories. nasal drops. inhalants, eye drops; and administration to joint cavities or focal site. etc. such as a tumor, etc. or similar.

Manteniendo la razón restante del presente fármaco tras una hora a al menos aproximadamente el 90% en microesferas que tienen un periodo de liberación lenta de dos semanas, o manteniendo la razón restante del presente fármaco tras un dia a al menos aproximadamente el 82% en miaoesferas que tienen un periodo de liberación lenta de cuatro semanas, puede suprimirse una ráfaga Inicial. En otras palabras, es posible suprimir la cantidad del presente fármaco inicialmente liberada, suprimir un aumento transitorio de la concentración en sangre del fármaco y suprimir un efecto hipotensivo, etc. qUE! acompar'la a un aumento transitorio de la concentración en sangre del fármaco. Maintaining the remaining ratio of the present drug after one hour to at least about 90% in microspheres that have a slow release period of two weeks, or maintaining the remaining ratio of the present drug after one day at at least about 82% in myospheres having a slow release period of four weeks, an initial burst can be suppressed. In other words, it is possible to suppress the amount of the present drug initially released, suppress a transient increase in the blood concentration of the drug and suppress a hypotensive effect, etc. that! accompanies a temporary increase in the blood concentration of the drug.

En la presente invención, el método de evaluar el grado de ráfaga inicial no está sujeto a ninguna limitación particular. Un ejemplo de un método de este tipo es la prueba de liberación in vitro descrita en los siguientes ejemplos de realización. En la presente invendón, en una prueba de liberación in vitre, se determinó que la ráfaga inicial se suprimla en microesferas que tienen un periodo de liberación lenta de dos semanas manteniendo la razón restante del presente fármaco tras una hora a al menCls aproximadamente el 90%. y en microesferas que tienen un periodo de liberación lenta de cuatro semanas manteniendo la razón restante del presente fármaco tras un dia a al menos aproximadamente el 82%. In the present invention, the method of assessing the initial burst degree is not subject to any particular limitation. An example of such a method is the in vitro release test described in the following embodiments. In the present invention, in an in vitro release test, it was determined that the initial burst is suppressed in microspheres that have a slow release period of two weeks maintaining the remaining ratio of the present drug after about an hour at about 90% . and in microspheres that have a slow release period of four weeks maintaining the remaining ratio of the present drug after one day at at least about 82%.

En la presente invención, pueden incluirse aditivos con el fin de aumentar el efecto de supresión de la ráfaga inicial. los ejemplos preferidos incluyen sustancias que aumHntan la viscosidad de la fase acuosa interna o se endurecen bajo los efectos de la temperatura o la adición de iones, sustancias que tienen residuos básicos que llevan una carga eléctrica positiva, y sustancias que interaccionan con poUmeros macromolerulares y aumentan la viscosidad de emulsiones oJw o w/olw. los ejemplos ilustrativos induyen gelatina, agar, ácido alglnico. poli(alcohol vinllico), polietilengliCOl (PEO) o é.Odo algínico, un aminoácido basico tel como I¡sine, etc., polipéptidos que contienen un aminoácido básico, bases orgánicas tales como N-rnetilglucamlna, etc., o maaomoléculas básicas naturales o sintéticas (induyendo quitosanos tales como un hidroxipropiltrimonio-quitosano, etc.) o similares (a concentraciones en la fase acuosa intema de desde aproximadamente el 0,05% hasta aproximadamente el 80%). In the present invention, additives may be included in order to increase the suppression effect of the initial burst. Preferred examples include substances that increase the viscosity of the internal aqueous phase or harden under the effects of temperature or the addition of ions, substances that have basic residues that carry a positive electrical charge, and substances that interact with macromolerular polymers and increase the viscosity of emulsions oJw ow / olw. The illustrative examples induce gelatin, agar, alginic acid. polyvinyl alcohol, polyethylene glycol (PEO) or alginic acid, a basic amino acid tel such as I¡sine, etc., polypeptides containing a basic amino acid, organic bases such as N-rnetylglucamlna, etc., or natural basic macromolecules or synthetic (inducing chitosans such as a hydroxypropyltrimonium-chitosan, etc.) or the like (at concentrations in the internal aqueous phase from about 0.05% to about 80%).

Además, en la presente invención, para aumentar el efecto supresor de la ráfaga inicial. pueden excluirse PlGA que tienen un bajo peso molecular de aproximadamente 3.000 o menos presentes en el momento de la producción de microesferas. In addition, in the present invention, to increase the suppressive effect of the initial burst. PlGAs having a low molecular weight of approximately 3,000 or less present at the time of microsphere production can be excluded.

los métodos para producir las microesferas de la invEmción se muestran a modo de ejemplo mediante métodos de secado en agua (por ejemplo. métodos de olw, métodos de w/o, métodos de w/olw, etc.), métodos de separación de fases, métodos de secado por pulverización. métod()s de granuladón usando fluidos supercríticos. métodos en general segun OJalquiera de los anteriores y métodos descritos en los ejemplos de realización en el presente documento o similares. the methods for producing the microspheres of the invEmtion are shown by way of example by means of water drying methods (eg olw methods, w / o methods, w / olw methods, etc.), phase separation methods , spray drying methods. granulation methods using supercritical fluids. methods in general according to any of the foregoing and methods described in the exemplary embodiments herein or the like.

A continuación se describen en detalle métodos de producción para un método de secado en agua (método de olw) y un método de secado por pulverización. Production methods for a water drying method (olw method) and a spray drying method are described in detail below.

(1) Método de secado en agua (método de olw) (1) Water drying method (olw method)

En este método, en primer lugar se prepara una disolución en disolvente orgánico de PlGA o una disolución mixta en disolvente orgániCO/disolvente de tipo alcohol de PLGA. El disolvente orgánico tiene preferiblemente un punto de ebullición de 1200C o menos. Los ejemplos ilustrativo~;; del disolvente orgánico incluyen hidrocarburos halogenados (por ejemplo, diclorometano, cloroformo, etc.), ésteres alifáticos (por ejemplo. acetato de etilo, etc.), éteres, hidrocarburos aromáticos, cetonas (por ejemplo. acetona, etc.), alcoholes (por ejemplo, metanol, etanol, etc.), ácidos carboxilicos alifáticos (por ejemplo, ácido acético, etc.), dimetilsulfóxido (DMSO) y dimetilformamida (DMF), etc. Alternativamente, pueden mezclarse dos o más de estos en razones adecuadas y usarse juntos. El disolvente orgánico es preferiblemente diclorometano o acetona. Los ejemplos del disolvente de tipo alcohol incluyen metanol, elanol y propanol, etc. Se prefiere metanol o etanol. La razón volumétrica (vlv) del disolvente orgánico/disolvente de tipo alcohol es preferiblemente de desde aproximadamente 1/1 hasta aproximadamente 20/1 y más preferiblemente desde aproximadamente 2/1 hasta aproximadamente 10/1. In this method, first a solution in organic solvent of PlGA or a mixed solution in organic solvent / alcohol solvent of PLGA is prepared. The organic solvent preferably has a boiling point of 1200C or less. The illustrative examples ~ ;; of the organic solvent include halogenated hydrocarbons (for example, dichloromethane, chloroform, etc.), aliphatic esters (for example, ethyl acetate, etc.), ethers, aromatic hydrocarbons, ketones (for example, acetone, etc.), alcohols ( for example, methanol, ethanol, etc.), aliphatic carboxylic acids (for example, acetic acid, etc.), dimethylsulfoxide (DMSO) and dimethylformamide (DMF), etc. Alternatively, two or more of these may be mixed in suitable reasons and used together. The organic solvent is preferably dichloromethane or acetone. Examples of the alcohol type solvent include methanol, elanol and propanol, etc. Methanol or ethanol is preferred. The volumetric ratio (vlv) of the organic solvent / alcohol type solvent is preferably from about 1/1 to about 20/1 and more preferably from about 2/1 to about 10/1.

La concentración de PLGA en la disolución en disolvente orgilOico o en la disolución mixta en disolvente orgánico/disolvente de tipo alcohol varia según el peso molecular promedio en peso de PLGA, la clase del disolvente orgánico y el disolvente de tipo alcohol, o similares, pero se selecciona generalmente de desde aproximadamente el 0,01 % hasta aproximadamente el 800A. (p/v), preferiblemente desde aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 40% (p/V) Y más preferiblement~~ desde aproximadamente el 1 % hasta aproximadamente el The concentration of PLGA in the solution in organic solvent or in the mixed solution in organic solvent / alcohol type solvent varies according to the weight average molecular weight of PLGA, the class of the organic solvent and the alcohol type solvent, or the like, but it is generally selected from about 0.01% to about 800A. (w / v), preferably from about 0.1% to about 40% (w / V) And more preferably from about 1% to about

20% (pi,). 20% (pi,).

El presente fármaco se ai'lade y se disuelve en la disolución en disolvente orgánico o la disolución mixta en disolvente orgánico/disolvente de tipo alcohol de PLGA asl obtenida. La cantidad de este fármaco que se ai'lade varia con factores tales como periodo de liberación objetivo, etc. pero la concenlración de PLGA en la disolución en disolvente orgánico o la disolución mixta en disolvente orgánico/disolvente de tipo alcohol es generalmente de desde aproximadamente el 0,001 % hasta aproximadamente (!I 90% (plv), preferiblemente desde aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 50% (plv) Y más preferiblemente desde aproximadamente el 0,3% hasta aproximadamente el 30% (plv). Cuando sea necesario, pueden disolverse antioxidantes y/o aditivos, junto con el fármaco, en la disolución en disolvente orgánico o la disolución mixta en disolvente orgánico/disolvente de tipo alcohol de PLGA. The present drug is added and dissolved in the solution in organic solvent or the mixed solution in organic solvent / alcohol-type solvent of PLGA asl obtained. The amount of this drug that is added varies with factors such as target release period, etc. but the concentration of PLGA in the organic solvent solution or the mixed solution in organic solvent / alcohol type solvent is generally from about 0.001% to about (! 90% (plv), preferably from about 0.1% up to about 50% (plv) And more preferably from about 0.3% to about 30% (plv) When necessary, antioxidants and / or additives, together with the drug, can be dissolved in the organic solvent solution or the mixed solution in organic solvent / alcohol-type solvent of PLGA.

A continuación, se añade la disolución preparada tal como se describió anteriormente a una fase acuosa y se forma una emulsión de aceite en agua usando un agitador, ~~mulsificador o similar. El volumen de la fase acuosa en este momento es generalmente de desde aproximaclamente 1 vez hasta aproximadamente 10.000 veces, preferiblemente desde aproximadamente 2 veces hasta aproximadamente 5.000 veces y más preferiblemente desde aproximadamente 10 veces hasta aproximadamente 1.000 veces el volumen de la fase de aceite. Puede añadirse un agente emulsionante a la fase acuosa. El agente emulsionante puede ser generalmente cualquiera que pueda formar una emulsión de aceite en agua estable. L.os ejemplos ilustrativos del agente emulsionante incluyen tensioactivos aniónicos, tensioactivos no iónicos, del"ivados de polioxietileno-aceite de ricino, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), carboximelilcelulosa, lecilina y gelatina, etc. Estos pueden combinarse y usarse de manera adecuada. Un ejemplo preferido del agente emulsionante es poli(alcohol vinllico) (PVA). La concentración del agente emulsionante en la fase acuosa externa es de preferiblemente desde aproximadamente el 0,001 % hasta aproximadamente el 20% (pIv), más preferiblemente desde aproximadamente el 0,01% hasta aproximadamente el 10% (p/v) y lo más preferiblemente desde aproximadamente el 0,05% hasta aproximadamente el 5% (p/v). Next, the prepared solution as described above is added to an aqueous phase and an oil-in-water emulsion is formed using a stirrer, mulsifier or the like. The volume of the aqueous phase at this time is generally from about 1 time to about 10,000 times, preferably from about 2 times to about 5,000 times and more preferably from about 10 times to about 1,000 times the volume of the oil phase. An emulsifying agent may be added to the aqueous phase. The emulsifying agent can generally be any that can form an oil-in-water stable emulsion. L. Illustrative examples of the emulsifying agent include anionic surfactants, non-ionic surfactants, "polyoxyethylene-castor oil ivates, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, lecillin and gelatin, etc. These can be combined and used appropriately A preferred example of the emulsifying agent is polyvinyl alcohol (PVA) The concentration of the emulsifying agent in the external aqueous phase is preferably from about 0.001% to about 20% (pIv), more preferably from about 0 , 01% to about 10% (w / v) and most preferably from about 0.05% to about 5% (w / v).

Ajustando adecuadamente la velocidad de agitación durante la formación de la emulsión de aceite en agua, es posible ajustar el tamaño de partícula de las microesferas resultantes. Por ejemplo, a una velocidad de rotación rápida, el tamai'lo de partícula de las microesferas obtenidas será menor; a la inversa, a una velocidad de rotación más lenta, el tamaño de partícula será mayor. By properly adjusting the stirring speed during the formation of the oil-in-water emulsion, it is possible to adjust the particle size of the resulting microspheres. For example, at a fast rotation speed, the particle size of the obtained microspheres will be smaller; conversely, at a slower rotation speed, the particle size will be larger.

Se emplea un método comúnmente usado para eliminar por evaporación el disolvente de la fase de aceite. La evaporación del disolvente puede llevarse a cabo a presión normal o con reducción gradual de la presión mientras se agita, por ejemplo, con un agitador o un agitador magnético, etc., o puede llevarse a cabo usando un evaporador rotatorio, etc. mientras se ajusta el grado de vacio. Las microesferas asl obtenidas se recogen mediante separación por centrifugación o filtración, entonces se separan principio activo libre, agente emulsionante y similares que se adhieren a las superficies de las microesferas mediante lavado varias veces times con, por ejemplo, una disolución de tensioaclivo o alcohol, tras lo cual se dispersan de nuevo las microesferas en agua destilada (agua purificada) y se liofilizan. En el método de aceite en agua descrito nnteriormente, las microesferas pueden producirse, en vez de eso, mediante dispersión del fármaco en una disolución en disolvente orgánico de PLGA; es decir, mediante un método de s/oJw. Además, para potenciar la dispersibilidad de las microesferas producidas en una disolución inyectable, suprimir la aglomeración y así obtener una inyección de mlcroesferas de liberación lenta, estable, la liofilizaciOn puede llevarse a cabo después de ai'laclir en primer lugar dispersantes, conservantes, agentes de tonicidad, excipientes y antioxidantes. Añadir estos aditivos suprime la tendencia de las microesferas a aglomerarse mutuamente y potenCia la capacidad de suspensión, haciendo asl posible mejorar la capacidad para pasar a través de una aguja de jeringa. A commonly used method is used to evaporate the solvent from the oil phase. Evaporation of the solvent can be carried out at normal pressure or with gradual reduction of the pressure while stirring, for example, with a stirrer or magnetic stirrer, etc., or it can be carried out using a rotary evaporator, etc. while adjusting the degree of vacuum. The obtained microspheres obtained are collected by centrifugation or filtration separation, then free active principle, emulsifying agent and the like which adhere to the surfaces of the microspheres are separated by washing several times with, for example, a solution of surfactant or alcohol, after which the microspheres are dispersed again in distilled water (purified water) and lyophilized. In the oil-in-water method described above, the microspheres may instead be produced by dispersing the drug in a solution in organic solvent of PLGA; that is, by a method of s / oJw. In addition, in order to enhance the dispersibility of the microspheres produced in an injectable solution, suppress agglomeration and thus obtain an injection of slow, stable release microspheres, lyophilization can be carried out after ai'laclir first dispersants, preservatives, agents of tonicity, excipients and antioxidants. Adding these additives suppresses the tendency of the microspheres to agglomerate each other and enhances the suspension capacity, thus making it possible to improve the ability to pass through a syringe needle.

(2) En casos en los que las microesferas de la invención se producen mediante un procedimiento de secado por pulverización, se pulveriza un disolvente orgánico o I~mulsión en el que están disueltos el PLGA y los principios activos en la cámara de secado de un secador por plJlverización usando una boquilla, haciendo que el disolvente orgánico o el agua dentro de las gotitas de liquido finamente divididas se evapore en un tiempo muy corto, produciendo así mlcroesferas. La boquilla puede ser cualquiera de diversos tipos, incluyendo boquillas de dos (2) In cases where the microspheres of the invention are produced by a spray drying process, an organic solvent or imulsion is sprayed in which the PLGA and the active ingredients are dissolved in the drying chamber of a spray drying using a nozzle, causing the organic solvent or water within the finely divided liquid droplets to evaporate in a very short time, thus producing microspheres. The nozzle can be any of various types, including two nozzles

IIquidos, boquillas de cuatro liquldos, boquillas presuri:tadas y boquillas de disco giratorio, etc. En este momento, si se desea, para prevenir la aglomeración de las microesferas de manera simultanea con la pulverización de la emulsión de aceite en agua, es eficaz pulverizar un disolvente orgánico o una disolución acuosa de un antifloculanle (por ejemplo, manitol, lactosa, gelatina, etc.) desde otra boquilla. Si es necesario, para las microesferas asl obtenidas, la eliminación de humedad y disolvente dentro de las microesferas se lleva a cabo de manera más completa con calentamiento y a una presión reducida. II liquids, four-fluid nozzles, pressurized nozzles: rotating disk nozzles and sockets, etc. At this time, if desired, to prevent the agglomeration of the microspheres simultaneously with the spraying of the oil-in-water emulsion, it is effective to spray an organic solvent or an aqueous solution of an antifloculanle (e.g., mannitol, lactose, jelly, etc.) from another nozzle. If necessary, for the asl microspheres obtained, the removal of moisture and solvent within the microspheres is carried out more completely with heating and at a reduced pressure.

los ejemplos de dispersantes incluyen manilol. lactosa, glucosa, Tween 80 (nombre comercial), HC0-60 (nombre comercial), eMe-Na (nombre comercial), alginato de sodio, almidones (por ejemplo, almidón de maiz, etc.), glicina, fibrina y colágeno, etc. Examples of dispersants include manilol. lactose, glucose, Tween 80 (trade name), HC0-60 (trade name), eMe-Na (trade name), sodium alginate, starches (for example, corn starch, etc.), glycine, fibrin and collagen, etc.

Los ejemplos de conservantes Incluyen metilparabeno y propilparabeno, etc. Examples of preservatives include methylparaben and propylparaben, etc.

Los ejemplos de agentes de tonicidad incluyen cloruro de sodio, manitol, sorbitol y glucosa, etc. Examples of tonicity agents include sodium chloride, mannitol, sorbitol and glucose, etc.

Los ejemplos de excipientes Incluyen manitol, sorbllol, lactosa y glucosa, etc. Examples of excipients include mannitol, sorbllol, lactose and glucose, etc.

Los ejemplos de antioxidantes incluyen parabenos (por ejemplo, metilparabeno, etc.), ácido sórbico y sales del mismo, butilhidroxianisol (BHA), dibutilhidroxitolueno (BHT), a·tocoferol, palmitato de ácido asc6rbico, ácido nordihidroxiguaiarétlco, ésteres de guaiacol, 1,3-butilenglicol, deshidroacetato de sodio, galato de propilo, etc., sales que producen iones de metales trivalentes (por ejemplo, cloruro de aluminio, alumbre, alantolnato de aluminio). Examples of antioxidants include parabens (for example, methylparaben, etc.), sorbic acid and salts thereof, butylhydroxyanisole (BHA), dibutylhydroxytoluene (BHT), a · tocopherol, ascorbic acid palmitate, nordihydroxyiguaaryl ester, guaiacol esters , 3-butylene glycol, sodium dehydroacetate, propyl gallate, etc., salts that produce trivalent metal ions (for example, aluminum chloride, alum, aluminum allantolnate).

Dado que las mlcroesferas que contienen el presente fármaco y PLGA, descritas en el ejemplo de preparación 2 del documento de la publicaci6n de patente intemacional WO 2004/032965 tienen un contenido de fármaco muy bajo de aproximadamente el 5%, debe administrarse una gran cantidad para obtener efectos del fármaco suficientes. Como resultado, la cantidad del propio PLGA administrad,o también aumenta, lo que puede dar lugar, tal como se mencionó anteriormente a problemas de acidez tras la administración. En la presente Invención, se aumentó el contenido de fármaco (razón de encapsulación) con e-I fin de superar el prOblema anterior. Sin embargo, aumentar simplemente el contenido de fármaco conduce, tal como se indica en los siguientes ejemplos, a la aparición de una ráfaga inicial del fármaco. Por este motivo, ajustando también adecuadamente y combinando el peso molecular promedio en peso del PLGA, la razón de ácido láctico/ácido glic6lico en el PLGA, el tamano de partlcula promedio de las microesferas y la razón en peso del fármaco y el PLGA, se descubrieron microesferas que suprimen una ráfaga inicial del fármaco y pueden lograr la liberación del fármaco a una tasa fijada (liberación de orden cero) a lo largo de un periodo de desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente cuatro semanas Iras la administración. También se descubrió que las microesferas de la invención pueden, durante el periodo de liberación lenta, evitar efectos secundarios y mantener la concentración en sangre del fármaco dentro de un intervalo que es óptimo para que se manifiesten los efectos del fármaccl. Since the microspheres containing the present drug and PLGA, described in preparation example 2 of the document of the international patent publication WO 2004/032965 have a very low drug content of approximately 5%, a large amount must be administered for get enough drug effects. As a result, the amount of the PLGA itself administered, or also increases, which may lead, as mentioned above to acidity problems after administration. In the present invention, the drug content (encapsulation ratio) was increased in order to overcome the previous problem. However, simply increasing the drug content leads, as indicated in the following examples, to the appearance of an initial burst of the drug. For this reason, also adjusting properly and combining the average molecular weight by weight of the PLGA, the ratio of lactic acid / glycolic acid in the PLGA, the average particle size of the microspheres and the ratio in weight of the drug and the PLGA, They discovered microspheres that suppress an initial burst of the drug and can achieve drug release at a fixed rate (zero order release) over a period of about two weeks to about four weeks after administration. It was also discovered that the microspheres of the invention can, during the slow release period, avoid side effects and maintain the blood concentration of the drug within a range that is optimal for the effects of the drug to manifest.

En la presente invención, para producir microesferas que tienen un periodo de liberaci6n lenta de desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente cuatro semanas y que tienen las caracterlsticas descritas anteriormente, es preferible (1) fijar eltamai'lo de partlcula promediO de las microesferas a desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 tJm, (2) fijar la cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido glic61ico en partes en peso del fármaco a desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 partes en peso, y (3) fijar el peso molecular promedio en peso del copollmero de ácido láctico/ácido glicólico a desde aproximadamente 10.000 hasta aproXimadamente 50.000 y fijar la razón de ácido láctico/ácido glic61ico a desde aproximadamente 75125 hasta aproximadamente 50150; y es incluso más preferible (1) fijar el tamano de partlcula promedio de las microesferas a desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 jJm. (2) fijar la cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido glic61ico en partes en peso del fármaco a desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 partes en peso, y (3) fijar el peso molecular promedio en peso del copol1ml~ro de ácido láctico/ácido glicOlico a desde aproximadamente In the present invention, to produce microspheres that have a slow release period of from about two weeks to about four weeks and that have the characteristics described above, it is preferable (1) to set the average particle size of the microspheres to from about 20 to about 50 tJm, (2) set the amount of lactic acid / glycolic acid copolymer in parts by weight of the drug to from about 3 to about 10 parts by weight, and (3) set the average molecular weight by weight of the copolymer of lactic acid / glycolic acid at from about 10,000 to about 50,000 and set the ratio of lactic acid / glycine acid to from about 75125 to about 50150; and it is even more preferable (1) to set the average particle size of the microspheres at from about 25 to about 35 jJm. (2) set the amount of lactic acid / glycolic acid copolymer in parts by weight of the drug to from about 4 to about 8 parts by weight, and (3) set the weight average molecular weight of the copolymer of lactic acid / glycolic acid to from about

10.000 hasta aproximadamente 50.000 y fijar la razón de ácido láctico/ácido glic61ico a aproximadamente 50150. 10,000 to about 50,000 and set the ratio of lactic acid / glycine acid to about 50150.

De lo anterior, para producir microesferas que tienen un periodo de liberación lenta de dos semanas, (1) el lamai\o de partrcula promedio de ras mlcroesferas se fija a desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 jJrn, (2) la cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido glic6lico en partes en peso del fármaco se fija a desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 partes en peso, y (3) el peso molecular promedio en peso del copolimero de ácido láctico/ácido glic6lico se fija a de$de aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 20.000 y la razón de ácido láctico/ácido glic6lico se fija a aproximadamente 50150. Para producir miaoesferas que tienen un periodo de liberación lenta de cuatro semanas, (1) er tamano de partrcura promedio de las microesferas se fija a desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 tJm, (2) la cantidad de copolfmero de ácido láctico/ácido gJic6lico en partes en peso del fármaco se fija a de!;de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 partes en peso, y (3) el peso molecular promedio en peso del copolimero de ácido láctico/ácido glic6lico se fija a desde aproximadamente 50.000 y la razón de acido láctico/ácido glicólico se fija a aproximadamente 50150. Of the foregoing, to produce microspheres having a slow release period of two weeks, (1) the average particle size of the microsphere is set at from about 25 to about 35 jR, (2) the amount of copolymer of lactic acid / glycolic acid in parts by weight of the drug is set at from about 4 to about 8 parts by weight, and (3) the weight average molecular weight of the lactic acid / glycolic acid copolymer is set at about $ 10,000 up to about 20,000 and the ratio of lactic acid / glycolic acid is set to about 50150. To produce myospheres that have a slow release period of four weeks, (1) the average size of microspheres is set at about 25 to about 35 tJm, (2) the amount of lactic acid / glycolic acid copolymer in parts by weight of the drug is set at from;; from about 4 to about 8 parts by weight, and (3) the weight average molecular weight of the lactic acid / glycolic acid copolymer is set at from about 50,000 and the ratio of lactic acid / glycolic acid is set to about 50150.

Tal como se mencionO anteriormente con respecto a las microesferas de la invención en las que cada una de las condiciones constituyentes se han fijado dentro de los intervalos preferidos, en las pruebas de liberación In vitro descritas en los siguientes ejemplos, dado que las microesferas con un periodo de liberación lenta de dos semanas tienen una razón restante del fármaco tras una hora desde la administraciOn de al menos aproximadamente el 90% y As mentioned above with respect to the microspheres of the invention in which each of the constituent conditions have been set within the preferred ranges, in the in vitro release tests described in the following examples, since the microspheres with a Slow release period of two weeks have a remaining drug ratio after one hour from the administration of at least about 90% and

las microesferas con un periodo de liberación lenla de cuatro semanas tienen una razón restante del fármaco tras un dla desde la administraciOn de al menos aproximadamente el 82%. ambas suprimen una ráfaga inicial. Además, lal como se muestra en los siguientes ejemplos. las microesferas anteriores también tienen la capacidad de mantener una concentración eficaz en sangre durante los periodos de liberaciOn lenta respecti\los. microspheres with a release period of four weeks have a remaining ratio of the drug after one day since administration of at least about 82%. both suppress an initial burst. Also, as shown in the following examples. The above microspheres also have the ability to maintain an effective concentration in blood during the respective slow release periods.

(Aplicaciones como preparaciones farmacéuticas) (Applications as pharmaceutical preparations)

El presente fármaco liene una acciórl agonista de receptOfes de PGI2, una acciOn de inhibiciOn de la T~sintelasa, una acciOn de promoción de la producción de factor de reparación endógeno, una acción de inducción de la diferenciación de células madre y una acción de aceleración de la angiogénesis. elc., y por tanto, este fármaco y estas mlcroesferas que contienen este fármaco son útiles como agentes preventivos y/o terapéuticos para diversos tipos de trastornos de órganos, incluyendo enfermEtdades de los vasos sanguíneos y linfáticos (por ejemplo, arteriosclerosis obliterante (ASO), enfermedad de Buerger, enfermedad de Raynaud, arteriosclerosis, linfedema, etc.), cardiopatla (por ejemplo, infarto de miocardio, angina, taquiarritmla ventricular, insuficiencia cardiaca congestiva, arteriopalia coronaria, cardiomiopatla idiopática, cardiomiopatía dilatada, fibrilación auricular, miocarditis, etc,), enfermedades de degeneración de los nelVios (por ejemplo, encefalopatla Isquémica, accidentes cerebrovasculares, ictus (infarto cerebral, hemorragia cerebral, etc,), enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, neuropatla diabética, estenosis del conducto vertebral, demencia, enfermedad de moyamoya, lesiones de la médula espinal, esclerosis lateral amiotr6fica (ELA), aneurisma cerebral, etc,), enfermedades pulmonares (por ejemplo, neumonla aguda, fibrosis pulmonar, hipert4~nsión pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), slndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), lesión pulmonar aguda (LPA), sindrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), sarcoidosis, neumonia intersticial, neumonitis por hipersensibilidad, asma, etc.), enfermedad de los huesos/cartllagos (por ejemplo. osteoartritis (OA) de las vertebras o la rodilla, etc" artritis reumatoide (AR), osteoporosis, fractura ósea, osteonecrosis, lesión perióstica, terapia de regeneración del eslemón asociada con cirugía cardiopulmonar, etc.), enfermedades hepáticas (por ejemplo, hepatitiS fulminante, hepatitis aguda, Círrosis, hepatitis crónica, hígado graso, elc.), enfermedades renales (por ejemplo, insuficiencia renal aguda, trastomo renal isquémlco, slndrome de aplastamiento, insuficiencia renal necrótica, enfermedad glomerular, glomerulonefritis, nefroesdemsiS, glomerulonefritls proliferativa, enfermedad tubulointersticial, trastornos renovasculares, enfermedad renal quistica, nefropalla tóxica, anomallas en el transporte tubular, trastornos renales en pacientes sometidos a diálisis, nefropatla, etc.), enfermedades pancreáticas (por ejemplO, diabetes, pancreatitis crÓf"lica, pancreatitis aguda, etc.), enfermedades del tracto digestivo (por ejemplo, esofagitis, gastritis. úlcera gástrica, úlcera duodenal, enfermedad inflamatoria del intestino. colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn. etc.), trasplantes de 6rganosltejidos (trasplante de coraz6n, trasplante de hlgado, trasplante de riMn, trasplante de pulmón, trasplante de páncreas, trasplante de colgajo miocutáneo, trasplante de esófago, trasplante de piel, trasplante de vasos sangulneos/tinfáticos, traspl~lnte de células madre hematopoyéticas, trasplante de huesos/cartílagos, etc.), complicaciones diabéticas (por ejemplo, trastornos de los nelVios, úlceras cutáneas, nefropalla, etc.), trastornos de células endoteliales vBlsculares (por ejemplo, prevención de reestenosis tras ACTP (angioplastia coronaria transluminal percutánea, etc.), '!lnfermedades dentales (por eJemplo, enfennedad periodontal, heridas por extracción de dientes, heridas de la cavidad bucal, trastornos de tejido óseo periodontal, periodontitis, etc.), enfennedades de la piel (por ejemplo, úlceras de decúbito, enfermedad de alopecia, alopecia areata, úlceras cutáneas, etc.), enfennedades oftálmicas (por ejemplo, glaucoma, etc.), enfermedades de los oldos y de la nariz (por ejemplo, sordera, sordera neurosensorial, etc.), fallo multiorgánico (FMO), enfermedades alérgicas y enfermedad del colágeno, o similares. El presente fármaco y las microesferas que lo contienen son especialmente prometedores como agente para prevenir y/o tratar las siguientes enfermedades de los vasos sanguíneosllinfáticos: ASO, enfermedad de Buerger, linfedema y úlceras diabétiC;<ls; las siguientes cardiopatías: infarto de miocardio, angina e insuflclencla cardiaca; las siguientes enfermedades putmol'\8res: fibrosis pulmonar, hipertensi6n pulmonar, asma y EPOC; las siguientes enfennedades renales: insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica y nefropalla diabética; las siguientes enfermedades de los huesos/cartUagos: OA, AR, osteoporosis, fracturas óseas; las siguientes enfermedades de degeneración de los nervios: ictus, enfermedad de Parkinson, lesiones de la médula espinal y trastornos diabéticos de los nervios: y las siguientes enfermedades hepáticas: hepatitis aguda, hepat~is fulmInante, cirrosis y reestenosis tras ACTP. The present drug has an agonist action of PGI2 receptors, an action to inhibit T-synthelase, an action to promote the production of endogenous repair factor, an induction action of stem cell differentiation and an acceleration action. of angiogenesis. elc., and therefore, this drug and these microspheres containing this drug are useful as preventive and / or therapeutic agents for various types of organ disorders, including diseases of the blood and lymphatic vessels (eg, obliterating arteriosclerosis (ASO) , Buerger's disease, Raynaud's disease, arteriosclerosis, lymphedema, etc.), cardiopathy (for example, myocardial infarction, angina, ventricular tachyarrhythmla, congestive heart failure, coronary arteriopalia, idiopathic cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy, atrial fibrillation, myocarditis, etc ,), degeneration diseases of the nelVios (for example, Ischemic encephalopathy, strokes, stroke (cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc), Parkinson's disease, Alzheimer's disease, diabetic neuropathy, vertebral duct stenosis, dementia, disease of moyamoya, spinal cord injuries, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), to cerebral neurism, etc,), lung diseases (eg acute pneumonia, pulmonary fibrosis, pulmonary hypertion, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), systemic inflammatory response syndrome (SRIS), acute lung injury (APL), syndrome of acute respiratory distress (ARDS), sarcoidosis, interstitial pneumonia, hypersensitivity pneumonitis, asthma, etc.), bone / cartilage disease (for example. osteoarthritis (OA) of the vertebrae or knee, etc "rheumatoid arthritis (RA), osteoporosis, bone fracture, osteonecrosis, periodic injury, scallop regeneration therapy associated with cardiopulmonary surgery, etc.), liver diseases (for example, hepatitiS fulminant, acute hepatitis, Cirrhosis, chronic hepatitis, fatty liver, elc.), kidney diseases (e.g. acute renal failure, ischemic kidney disorder, crush syndrome, necrotic renal failure, glomerular disease, glomerulonephritis, nephrosdemsiS, glomerulonephritis, proliferative, disease tubulointerstitial, renovascular disorders, cystic kidney disease, toxic nephropalla, abnormalities in tubular transport, renal disorders in patients undergoing dialysis, nephropathy, etc.), pancreatic diseases (for example, diabetes, chronic chronic pancreatitis, acute pancreatitis, etc. ), diseases of the digestive tract (eg esophagitis, gastritis. gást ulcer rich, duodenal ulcer, inflammatory bowel disease. ulcerative colitis, Crohn's disease. etc.), 6-organ transplants (heart transplant, liver transplant, kidney transplant, lung transplant, pancreas transplant, myocutaneous flap transplant, esophageal transplant, skin transplant, blood vessel / lymphatic vessel transplantation, transplant before hematopoietic stem cells, bone / cartilage transplantation, etc.), diabetic complications (for example, nelVios disorders, skin ulcers, nephropalla, etc.), vBlscular endothelial cell disorders (for example, prevention of restenosis after ACTP (percutaneous transluminal coronary angioplasty, etc.), '! dental diseases (for example, periodontal disease, tooth extraction wounds, oral cavity wounds, periodontal bone tissue disorders, periodontitis, etc.), skin diseases ( for example, pressure sores, alopecia disease, alopecia areata, skin ulcers, etc.), ophthalmic diseases (for example, glaucoma, etc.), diseases of the elbows and nose (for example, deafness, sensorineural deafness, etc.), multi-organ failure (FMO), allergic diseases and collagen disease, or the like. The present drug and the microspheres that contain it are especially promising as an agent to prevent and / or treat the following diseases of the lymphatic blood vessels: ASO, Buerger's disease, lymphedema and diabetic ulcers; <ls; the following heart diseases: myocardial infarction, angina and heart failure; the following putmol '\ 8res diseases: pulmonary fibrosis, pulmonary hypertension, asthma and COPD; the following renal diseases: acute renal failure, chronic renal failure and diabetic nephropalla; the following diseases of the bones / cartouges: OA, RA, osteoporosis, bone fractures; the following diseases of degeneration of the nerves: stroke, Parkinson's disease, spinal cord injuries and diabetic disorders of the nerves: and the following liver diseases: acute hepatitis, liver disease, cirrhosis and restenosis after ACTP.

El factor de reparación endógeno cuya producción induce, promueve o amplifica el presente fármaco varia dependiendo de las células de producción, y se sabe que incluye, por ejemplo: factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), diversos factores de crecimiento de fibroblastos (aIb FGF), factor de crecimiento de transfonnaciÓll afl3 (TGF-alP), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), angiopoyetina, factor de inducción de hipoxia (HIF), factor de crecimiento similar a insulina (IGF), protelna morfogenétlca ósea (BMP), factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF), factor de crecimiento epidérmiCO (EGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor necrotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotr6flco derivado de células de la gUa (GONF), factor de células madre (SCF), factor estimulante de colonias de granulocltos (G-CSF), factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF), factor estimulante de colonias de granu1ocitos y macrófago (GM-CSF), factor de crecimiento de quera1tinocitos (KGF), factor de crecimiento de condrocitos (GDF) y famillos relocionodos de foctores de crecimiento. I=:n el Iren$Curso de la$ presentes investigaciones, se ha descubierto una nueva acción de inducción de la prod.ucción de factor derivado de células del estroma (SDF-1). Se ha encontrado que SDF-1 es una citocina que no está limitada sólo a la hemopoyesis, sino que sirve como clave para la regulación de la cinética de células madre y células precursoras en el transcurso del desarrollo. Por ejemplo, el presente fánTI8CO induce la producción de VEGF-A , HGF, EGF Y SOF-1 a partir de fibroblastos. Otros fármacos que producen los factores de reparación endógenos mencionados anteriormente incluyen otros agonistas de receptores de prostaglandina (PG)lz (por ejemplo, beraprost. ¡Iaprast, NS-304, etc.), agonistas de receptor EP2 y EP4 (ambos de los cuales son receptores de PGE2) y mezclas de estos agonistas (por ejemplo, PGEI, PGE2• PGI2 Y derivados de los mismos, etc.). Para lograr los obje~tos de la presente invención, pueden usarse los fármacos mencionados anteriormente en lugar del presente fármaco. The endogenous repair factor whose production induces, promotes or amplifies the present drug varies depending on the production cells, and it is known to include, for example: vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), various fibroblast growth factors (aIb FGF), transfonnaciÓll afl3 growth factor (TGF-alP), platelet-derived growth factor (PDGF), angiopoietin, hypoxia induction factor (HIF), insulin-like growth factor (IGF), bone morphogenetic protein (BMP), connective tissue growth factor (CTGF), epidermal growth factor CO (EGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived necrotrophic factor (BDNF), neurotrophic factor derived from gUa cells (GONF), stem cell factor (SCF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), connective tissue growth factor (CTGF), colony stimulating factor of granulocytes and macrophages (GM-CSF), keracytocyte growth factor (KGF), chondrocyte growth factor (GDF) and relocated families of growth factors. I =: n the Iren $ Course of the $ present investigations, a new induction action of the production of stromal cell derived factor (SDF-1) has been discovered. It has been found that SDF-1 is a cytokine that is not limited only to hemopoiesis, but serves as a key to the regulation of the kinetics of stem cells and precursor cells in the course of development. For example, the present drug induces the production of VEGF-A, HGF, EGF and SOF-1 from fibroblasts. Other drugs that produce the aforementioned endogenous repair factors include other prostaglandin (PG) receptor agonists (e.g., beraprost. Iaprast, NS-304, etc.), EP2 and EP4 receptor agonists (both of which they are receptors of PGE2) and mixtures of these agonists (for example, PGEI, PGE2 • PGI2 and derivatives thereof, etc.). To achieve the objects of the present invention, the drugs mentioned above may be used in place of the present drug.

las rnicroesferas de la invención, cuando se adrninistran por via subcutánea, intramuscular y/o mediante implantación tisular, se liberan lentamente a lo largo de un periodo de tiempo prolongado, manteniendo asi la concentraci6n en tejido local y/o concentraci6n en sangre del fármaco. El fármaco cuya concentración se mantiene de ese modo aumenta el flujo sanguineo en los vasos sanguíneos restantes, por ejemplo, mediante efectos vasodilatadores y actividad de inhibici6n de la agregad6n plaquetaria, etc., debido a la inherente actividad agonista de receptores de PGI2 actividad de inhibici6n de la TEA2 sintetasa, etc. Además, dado que el presente fármaco promueve la producci6n de diversos factores de rElparaci6n end6genos, tiene un efecto de promoci6n de la regeneraci6n tisular debido, por ejemplo, a una actividad de promoci6n de la vascularizaci6n1regeneraci6n y una actividad de inducción de la diferenciación de células madre, y por tanto tiene efectos selectivos sobre una variedad de enfermedades. The ricrospheres of the invention, when administered subcutaneously, intramuscularly and / or by tissue implantation, are slowly released over a prolonged period of time, thus maintaining the concentration in local tissue and / or blood concentration of the drug. The drug whose concentration is maintained in this way increases blood flow in the remaining blood vessels, for example, by vasodilatory effects and inhibition activity of platelet aggregation, etc., due to the inherent agonist activity of PGI2 receptors inhibition activity. of the TEA2 synthetase, etc. In addition, since the present drug promotes the production of various endogenous repair factors, it has an effect of promoting tissue regeneration due, for example, to an activity of promoting vascularization regeneration and an induction activity of stem cell differentiation , and therefore has selective effects on a variety of diseases.

El periodo de liberaci6n y el método de administraci6n se seleccionan de manera adecuada según la enfermedad y el método de tratamiento de la misma al tiempo que se tienen en cuenta consideraciones tales como seguridad, conveniencia, baja invasividad, la carga sobre el paciente y el cumplimiento o similares. The release period and the method of administration are appropriately selected according to the disease and the method of treatment thereof while taking into account considerations such as safety, convenience, low invasiveness, the burden on the patient and compliance or similar.

Dado que las microesferas de la invenci6n tienen un periodo de liberación lenta de desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente cuatro semanas, de las enfermedades mencionadas anteriormente, son particularmente útiles para prevenir y/o tratar enfermedades de los vasos sangulneosllinfáticos (por ejemplo, ASO, enfermedad de Buerger, enfermedad de Raynaud, linfedema, prevención de reestenosis tras ACTP, etc.), cardiopatia (por ejemplo, infarto de miocardio, angina. insuficiencia cardiaca, cardiomiopalla dilatada, etc.), enfermedades renales (por ejemplo, insuficiencia renal aguda. insuficiencia renal crónica, nefropatla diabética, etc.), enfermedades de degeneración de los nervios (por ej,emplo, ictus, enfermedad de Par1<.inson, neuropatla diabética. lesiones de la médula espinal, etc.), enfermedade$ pulmonares (por ejemplo. hipertensi6n pulmonar, fibrosis pulmonar, asma, EPOC, etc.) y enfermedades de· los huesoslcartllagos (por ejemplo, osteoporosis, artritis reumatoide, osteoartritis, fractura 6seas, enfermedad periodontal, etc.). Since the microspheres of the invention have a slow release period of from about two weeks to about four weeks, of the above-mentioned diseases, they are particularly useful for preventing and / or treating diseases of the blood-brain vessels (eg ASO, disease of Buerger, Raynaud's disease, lymphedema, prevention of restenosis after ACTP, etc.), heart disease (for example, myocardial infarction, angina, heart failure, dilated cardiomyopalla, etc.), kidney diseases (for example, acute renal failure. chronic renal failure, diabetic nephropathy, etc.), degeneration diseases of the nerves (eg, emplo, stroke, Par1 disease <.inson, diabetic neuropathy. spinal cord injuries, etc.), $ lung disease (for eg, pulmonary hypertension, pulmonary fibrosis, asthma, COPD, etc.) and diseases of the bone cartilage (eg, osteoporosis, rheumatoid arthritis ide, osteoarthritis, bone fracture, periodontal disease, etc.).

Los métodos de administraci6n preferidos para el uso de las microesferas de la invención sobre estas enfermedades incluyen la administraci6n directa al sitio de enfermedad mediante técnicas que conllevan la inclusión en una inyección administrada por vía subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravascular o local en el tejido en el sitio de enfermedad, tal como el sistema nervioso cenlral o el músculo cardiaco; en un agente de inclusi6n mezclado con cemento 6seo, material de prótesis ósea artificial (P-TCP; fosfato de tricalcio), hidrogeles de gelatina o similares; yen hllos para suturas, pernos, películas o láminas; y métodos que implican recubrir sobre una endopr6tesis o similares. Además, la administraci6n puede llevarse a cabo en fOnTIa de un agente administrado por vía transmucosa en el recto, otero, cavidad bucal, etc.; como un agente oral, :supositorio, gotas nasales, inhalante, colirio; a una cavidad de las articulaciones; por via percutánea, como pomada () como parches cutáneos adhesivos; o al sitio de enfermedad tal como un tumor. Preferred methods of administration for the use of the microspheres of the invention on these diseases include direct administration to the disease site by techniques that involve inclusion in an injection administered subcutaneously, intradermally, intramuscularly, intravascularly or locally in the tissue in the site of disease, such as the central nervous system or the heart muscle; in an inclusion agent mixed with bone cement, artificial bone prosthesis material (P-TCP; tricalcium phosphate), gelatin hydrogels or the like; yen for sutures, bolts, films or sheets; and methods that involve coating on a stent or the like. In addition, administration can be carried out in the presence of an agent administered transmucosally in the rectum, other, oral cavity, etc .; As an oral agent, suppository, nasal drops, inhalant, eye drops; to a joint cavity; percutaneously, as an ointment () as adhesive skin patches; or to the site of disease such as a tumor.

[Toxicidad] [Toxicity]

El presente fármaco y las microesferas de la invención tienen una baja toxicidad y son suficientemente seguros para su uso como medicamentos. The present drug and the microspheres of the invention have a low toxicity and are sufficiently safe for use as medicaments.

Efecto de la invención Effect of the invention

El presente fármaco y las microesferas de la invención son útiles para prevenir y/o tratar cardiopatias, enfermedades de los vasos sanguineos/linfáticos, enfenTIedades pulmonares, enfermedades renales. enfermedades hepáticas, enfermedades pancreáticas. enfermedades de los huesos/cartílagos, atergias y enfermedades de degeneraci6n de los nervios. Dado que las microesferas de la invención liberan el presente fármaco a una tasa fijada a lo largo de un periOdO de desde aproximadamente dos semanas hasta aprOXimadamente cuatro semanas tras la administración, son particulanTIente útiles para prevenir y/o tratar ASO, infarto de miocardio, angina, ictus. diabetes y complicaciones de la misma, insuficiencia renal, fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, asma, CA, AR Y osteoporosis. Además, las microesferas de la invenci6n suprimen una ráfaga inicial del presente fármaco y, durante un periodo de desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente cuatro semanas tras la administración, pueden mantener la concentraci6n en sangre del fármaco en un intervalo que evita efectos secundarios y es adecuado para que se manifiesten los efectos del fármaco. The present drug and the microspheres of the invention are useful for preventing and / or treating heart disease, blood / lymphatic vessel diseases, lung diseases, kidney diseases. liver diseases, pancreatic diseases. bone / cartilage diseases, allergies and degeneration diseases of the nerves. Since the microspheres of the invention release the present drug at a fixed rate over a period of from about two weeks to about four weeks after administration, they are particularly useful for preventing and / or treating ASO, myocardial infarction, angina. stroke diabetes and its complications, renal failure, pulmonary fibrosis, pulmonary hypertension, asthma, CA, RA and osteoporosis. In addition, the microspheres of the invention suppress an initial burst of the present drug and, for a period of from about two weeks to about four weeks after administration, can maintain the blood concentration of the drug in a range that avoids side effects and is suitable. so that the effects of the drug are manifested.

Breve descripción de los dibujos Brief description of the drawings

La figura 1 muestra, en una prueba de liberación in vitro, el cambio a lo largo del tiempo de la razón restante del fármaco en las microesferas preparadas en el ejemplo de preparaci6n 1-4; Figure 1 shows, in an in vitro release test, the change over time of the remaining ratio of the drug in the microspheres prepared in the preparation example 1-4;

la figura 2 muestra, en una prueba de liberación in vitro, el cambio a lo largo del tiempo de la razón reslante del fármaco en las microesferas preparadas en el ejemplo de preparación 2-3; y Figure 2 shows, in an in vitro release test, the change over time of the drug's ratio in the microspheres prepared in preparation example 2-3; Y

la figura 3 muestra, en un modelo de 4-VQ en rata, la cinética en sangre del presente fármaco cuando se administraron las microesferas producidas en el ejemplo de preparación 2-2 una única vez (10 mglkg) por vis subcutánea. Figure 3 shows, in a rat 4-VQ model, the blood kinetics of the present drug when the microspheres produced in preparation example 2-2 were administered once (10 mglkg) per subcutaneous view.

Mejor modo de llevar a cabo la invención Best way to carry out the invention

la presente invención se ilustra más completamente a continuación en los ejemplos de preparación y ejemplos de realización. The present invention is illustrated more fully below in the preparation examples and embodiments.

Ejemplo de preparación 1. Preparación de microesfera:s (método de o/w) Preparation example 1. Microsphere preparation: s (o / w method)

Se disolvieron el presente férmaco y PLGA en diclorometano o una disolución mixta de diclorometano y metanol (o dimetilsulfóxido, ácido aCético). Se anadió la disolución resunante a desde 300 mi hasta 40.000 mi de una disolución acuosa (ajustada a pH 3,0 con ácido clorhldrlco 1 N) de poli(alcohol vinlllco) al 0,1% (producido por nacalai tesque) con agitación a desde 1.000 hasta 5.000 rpm usando IJn instrumento Physcotron (NS-60, fabricado por Nichion Irika Kikai Seisakusho), tras lo cual se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante un periodo de desde 30 segundos hasta 3 minutos para formar una emulsión de aceite en agua. Se agitó la emulsión de aceite en agua a temperatura ambiente durante 4 horas para evaporar el diclorometano y solidificar la fase de aceite, que entonces se centrifugó The present drug and PLGA were dissolved in dichloromethane or a mixed solution of dichloromethane and methanol (or dimethylsulfoxide, acetic acid). The resonant solution was added at 300 ml to 40,000 ml of an aqueous solution (adjusted to pH 3.0 with 1 N hydrochloric acid) of 0.1% polyvinyl alcohol (produced by nacalai tesque) with stirring to from 1,000 to 5,000 rpm using IJn Physcotron instrument (NS-60, manufactured by Nichion Irika Kikai Seisakusho), after which the mixture was stirred at room temperature for a period of 30 seconds to 3 minutes to form an oil-in-water emulsion. The oil emulsion in water was stirred at room temperature for 4 hours to evaporate the dichloromethane and solidify the oil phase, which was then centrifuged.

(3.000 rpm, 10 minutos) usando una centrifugadora (HIMAC-CR5B2, fabricada por Hitachi, Ud.). Se descartó el sobrenadante, se dispersO el residuo en agua purificMa (de 30 a 50 mI) y se centrifugó la dispersión (3.000 rpm, 10 minutos). Volvió a descartarse el sobrenadanle, se dispersO el residuo en una disolución de Tween al 0,2% (pIv) (de 30 a 50 mi) y se centrifugó la dispersión (3.000 rpm, 10 minutos). Se descartó el sobrenadante una vez mas, tras lo cual volvió a dispersarse el residuo con agua purificada (JO mi), se centrifugó la dispersión resultante (3.000 rpm , 10 minutos) y se descartó el sobrenadante. Se congeló el precipitado con nieve carbónica-metanol, después se seCó a presión reducida (12 horas), produciendo as1 microesferas del presente fánnaco. En el ejemplo de preparación 13, como PLGA se usó como PLGA-5010 del que se hablan cortado los componentes de bajo peso molecular (que tenlan pesos moleculares promedios en peso de 1 a 3.000) mediante un método conocido. (3,000 rpm, 10 minutes) using a centrifuge (HIMAC-CR5B2, manufactured by Hitachi, Ud.). The supernatant was discarded, the residue was dispersed in pure water (30 to 50 ml) and the dispersion was centrifuged (3,000 rpm, 10 minutes). The supernadanle was discarded again, the residue was dispersed in a 0.2% Tween solution (pIv) (30 to 50 ml) and the dispersion was centrifuged (3,000 rpm, 10 minutes). The supernatant was discarded once more, after which the residue was dispersed again with purified water (JO mi), the resulting dispersion was centrifuged (3,000 rpm, 10 minutes) and the supernatant discarded. The precipitate was frozen with carbonic snow-methanol, then dried under reduced pressure (12 hours), thus producing microspheres of the present drug. In preparation example 13, as PLGA it was used as PLGA-5010 of which the low molecular weight components (having average molecular weights by weight of 1 to 3,000) were used by a known method.

Se midió el !amano de partícula promedio de las microesferas resunantes usando un contador Coulter (Mullisizer3, fabricado por Beckman Coulter). The average particle amane of the resonant microspheres was measured using a Coulter counter (Mullisizer3, manufactured by Beckman Coulter).

Además, se midió el contenido del presente fánnaco (razón de encapsulación) en las microesferas resultantes mediante el siguiente método. In addition, the content of the present drug (encapsulation ratio) in the resulting microspheres was measured by the following method.

Se ai'iadieron las microesferas (aproximadamente 10 mg) producidas tal como se describió anterionnente a 50 mi de acelonitrilo y se llevó a cabo un tratamiento por unraS<lnldos durante 10 minutos, disolviendo as! las microesferas. A continuación, se añadieron 100 111 de una disolución A de patrón interno (IS) y 500 111 de una fase móvil (pH 3,0) a, y se mezclaron íntimamente con, 400 111 de la disolución preparada tal como se describió anterionnente. Se centrifugó la disolución mixta resultante (12.000 rpm, 3 minutos) y se midió el contenido del presente fármaco presente en 10 I1J del sobrenadanle resultante mediante cromatografía de liquidos de ana resolución (HPLC), basándose en lo cual se calculó la razón de encapsulación del fármaco en las microesferas. The microspheres (approximately 10 mg) produced were added as described before 50 ml of acelonitrile and a treatment was carried out for 10 minutes for 10 minutes, thus dissolving! the microspheres Next, 100 111 of an internal standard solution (IS) and 500 111 of a mobile phase (pH 3.0) were added to, and intimately mixed with, 400 111 of the prepared solution as described above. The resulting mixed solution was centrifuged (12,000 rpm, 3 minutes) and the content of the present drug present in 10 I1J of the resulting supernadanle was measured by anachromatic liquid chromatography (HPLC), based on which the encapsulation ratio of the drug in the microspheres.

Razón de encapsulación (%) = (contenido de fánnaco medido/cantidad de microesferas) X 100 Encapsulation ratio (%) = (measured drug content / amount of microspheres) X 100

Condiciones de HPLC HPLC conditions

Aparatos: Cromatógrafo (Shimadzu LC-10AT; fabricado por Shimadzu Corporation), detector UV (Shimadzu SPD10A: Shimadzu Corporation), analizador de datos (Shirnadzu C-R7A; Shimadzu Corporation). Apparatus: Chromatograph (Shimadzu LC-10AT; manufactured by Shimadzu Corporation), UV detector (Shimadzu SPD10A: Shimadzu Corporation), data analyzer (Shirnadzu C-R7A; Shimadzu Corporation).

Detección: UV -265 nm Detection: UV -265 nm

Columna: SHISEIDO CAPCELLPACK C18 UG120 (4,€1 mm de d.!. x 150 mm); fabricada por Shiseido Co., Ltd. Column: SHISEIDO CAPCELLPACK C18 UG120 (4, € 1 mm d.! X 150 mm); Manufactured by Shiseido Co., Ltd.

Temperatura de columna: temperatura constante próxima a 250C Column temperature: constant temperature close to 250C

Fase móvil: Acetonitrilo:agua:trietilamina = 1000:900:3 (se ajusta una disolución mixta de agua y trietilamina a pH 3 con ácido fosfórico) Mobile phase: Acetonitrile: water: triethylamine = 1000: 900: 3 (a mixed solution of water and triethylamine is adjusted to pH 3 with phosphoric acid)

Velocidad de flujo: 1,0 ml/min. Flow rate: 1.0 ml / min.

Patrón intemo (IS): n-propilparabeno Internal pattern (IS): n-propylparaben

Tiempo de elución dellarmaco: 7 minutos Ellarmaco elution time: 7 minutes

Tiempo de elución del IS: 4 minutos Método de preparación de la disolución A de IS IS elution time: 4 minutes Preparation method of IS solution A

En primer lugar, se pesaron 100 mg del patrón interne) y se llevaron a 100 mi con etanol. Entonces se llevaron diez mililitros de la disolución resultante a 100 mi con etanol. Se usó la disolución resultante como disolución A de IS. First, 100 mg of the internal standard was weighed and taken to 100 ml with ethanol. Then ten milliliters of the resulting solution was brought to 100 ml with ethanol. The resulting solution was used as IS solution A.

Los resultados de las preparaciones anteriores y las medidas se mueslran en las siguientes tablas 1 a 4. En las The results of the previous preparations and the measurements are shown in the following tables 1 to 4. In the

5 siguientes tablas, "PUGA" se refiere a la razón de poli(ácido láctico) (PL)/ácido glic6lico (GA) en el PLGA. La velocidad de rotación se refiere a la velocidad de rotación cuando se agita la disolución mixla que contiene el presente fármaco y PLGA Y la disolución acuosa de ¡>l:>li(alcohol vinllico) al 0,1% usando un instrumento Physcotron para producir una emulsión de aceite en agua. CH2Ch se refiere a diclorometano, MeOH se refiere a metanol y DMSO se refiere a dimelilsulfóxido. Following 5 tables, "PUGA" refers to the ratio of poly (lactic acid) (PL) / glycolic acid (GA) in the PLGA. The rotational speed refers to the rotational speed when the mixed solution containing the present drug and PLGA is stirred and the 0.1% aqueous solution of> 1:> li (vinyl alcohol) using a Physcotron instrument to produce An oil-in-water emulsion. CH2Ch refers to dichloromethane, MeOH refers to methanol and DMSO refers to dimelylsulfoxide.

10 Tabla 1 10 Table 1

Tabla 2 Table 2

Tabla 3 Table 3

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Tabla 4 Table 4

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~ !!8"O_c(\) :¡::QlS!¡¡¡"O~E" ~" o S ~<3. 8....J ~ ¡::o..B ~ Cantidades formuladas ... o <:( o .!!Ló g <':l "Ul gQ)Q)_J 15Q) 8 CoC!.. 0..0 c-o.E c..Q)~~ J!l~• o BQ)~ o~• g() '6 o o"O m ._ ,ga-gEIllt E :::1.E(\)e-~ Co Q. o Q):g ~. o-~ >Q ¡ilo~ ~ ~~ "'~o o ~ !! 8 "O_c (\): :: QlS!" O ~ E "~" or S ~ <3. 8 .... J ~ ¡:: o..B ~ Amounts formulated ... or <:( o. !! Ló g <': l "Ul gQ) Q) _J 15Q) 8 CoC! .. 0..0 c-o.E c..Q) ~~ J! L ~ • or BQ) ~ o ~ • g () '6 o o "O m ._, ga-gEIllt E ::: 1.E (\) e- ~ Co Q. or Q): g ~. o- ~> Q ¡ilo ~ ~ ~~ "'~ o o

2-1 2-2 2-1 2-2

20 mg 250 mg PLGA5-50 (100 mg) ~LGA5~~~1000 m 50.000 50.000 50150 SO/50 CH2~I(t mi)MeOH 05ml CH2CI~ \~O mi) MeOH 2ml 31 ,2 30,3 14,8 14,9 20 mg 250 mg PLGA5-50 (100 mg) ~ LGA5 ~~~ 1000 m 50,000 50,000 50150 SO / 50 CH2 ~ I (t mi) MeOH 05ml CH2CI ~ \ ~ O mi) MeOH 2ml 31, 2 30.3 14.8 14.9

2-3 2-4 2-3 2-4

3320 mg 44 mg r,LGA5-;g)13300 m ~~GA~~,O200m 50.000 50.000 50/50 50/50 CH2Cb l \~32, 9 ~;)MeOH 53 1 mi CH2Cb (2 mi) MeOH (1 mi 31 ,7 35,0 16,5 16,4 3320 mg 44 mg r, LGA5-; g) 13300 m ~~ GA ~~, O200m 50,000 50,000 50/50 50/50 CH2Cb l \ ~ 32, 9 ~;) MeOH 53 1 mi CH2Cb (2 mi) MeOH (1 mi 31, 7 35.0 16.5 16.4

2-5 2-5

35 mg PLGA5-50 (200 mal 50.000 50/50 CH2CI2 (2 mi) MeOH l1 mi 34,8 12,2 35 mg PLGA5-50 (200 bad 50,000 50/50 CH2CI2 (2 mi) MeOH l1 mi 34.8 12.2

Ejemplo 1 Prueba de liberaciÓn in vitro Example 1 In vitro release test

Se al'iadieron las microesferas producidas en el ejemplo de preparación 1 a un tampón fosfato 1115 M que contenía Tween 80 al 0,2% (p/v) (pH 7) de tal manera que se fijÓ la concentración del presente fármaco a 30 ~glml, después se dispersaron uniformemente mediante agitación con vórtex (10 segundos) y sonicación (20 segundos). Se dispensó la dispersión en porciones de 1 mi en recipinntes y se mantuvo en reposo en una incubadora a 3JOC. Se tomaron muestras de cada recipiente a lo largo del tiempo y se centrifugaron (12.000 rpm, 5 min.), se descartó el sobrenadante y se congeló el sedimento resultante o:m nieve carbónica-metanol y se secó a presión reducida. A continuación. se anadieron 500 111de acetonitrilo a e.stos sedimentos y se disolvieron las microesferas mediante tratamiento por ultrasonidos. A esta disolución se le al'iadieron y se mezclaron Intimamente 500 1.11 de disolución B de IS. A continuación, se pesaron 500 J.l1 de esta disolución mixta, se diluyeron con 500 J.l1de fase móvil (pH 3) Y se centrifugaron (12.000 rpm, 3 min .). tras lo cual se midió mediante HPLC la cantidad restante del fármaco presente dentro de las microesferas en 10 J.l1 del sobrenadante r,esuHante. The microspheres produced in preparation example 1 were added to a 1115 M phosphate buffer containing 0.2% Tween 80 (w / v) (pH 7) such that the concentration of the present drug was set at 30 ~ glml, then dispersed uniformly by vortexing (10 seconds) and sonication (20 seconds). The dispersion was dispensed in 1 ml portions in containers and kept at rest in a 3JOC incubator. Samples were taken from each vessel over time and centrifuged (12,000 rpm, 5 min.), The supernatant was discarded and the resulting sediment froze or: m carbonic snow-methanol and dried under reduced pressure. Then. 500 111 acetonitrile was added to these sediments and the microspheres were dissolved by ultrasonic treatment. This solution was added and 500 1.11 of IS solution B mixed intimately. Next, 500 J.l1 of this mixed solution was weighed, diluted with 500 J.l1 mobile phase (pH 3) and centrifuged (12,000 rpm, 3 min.). after which the remaining amount of the drug present within the microspheres was measured by HPLC at 10 J.l1 of the supernatant r, esuHante.

Se calcu ló la razón reslante (%) del presente fármaco tomando que la concentradón de fármaco cuando todo el fármaco habla eluido (30 J.lg/ml) era del 100%. The resistance ratio (%) of the present drug was calculated by taking the drug concentrate when the whole drug speaks eluted (30 J.lg / ml) was 100%.

Tal como se mencionó anteriormente, en microesferas que tienen un periodo de liberación lenta de dos semanas, se considera que se ha suprimido una ráfaga inicial si la razón reslante del fármaco tras una hora es de al menos el 90%. De manera similar, en microesferas que tienen un periodo de IiberaciOn lenta de cuatro semanas. se considera que se ha suprimido una ráfaga inicial si la razón restante del fármaco Iras un dia es de al menos el 82%. As mentioned above, in microspheres that have a slow release period of two weeks, it is considered that an initial burst has been suppressed if the drug's ratio after one hour is at least 90%. Similarly, in microspheres that have a slow Iiberation period of four weeks. It is considered that an initial burst has been suppressed if the remaining ratio of the drug Iras one day is at least 82%.

Condiciones de HPLC HPLC conditions

Aparatos: Cromatógrafo (Shimadzu LC-10AT; fabricado por Shimadzu Corporation), detector UV (Shimadzu SPD10A: Shimadzu Corpomtion), analizador de datos (Shimadzu C-R7A; Shimadzu Corporation). Apparatus: Chromatograph (Shimadzu LC-10AT; manufactured by Shimadzu Corporation), UV detector (Shimadzu SPD10A: Shimadzu Corpomtion), data analyzer (Shimadzu C-R7A; Shimadzu Corporation).

Detección: UV -265 nm Detection: UV -265 nm

Columna: SHISEIDO CAPCELLPACK C18 UG120 (4,6 mm de dj. x 150 mm); fabricada por Shiseido Co., Ud. Column: SHISEIDO CAPCELLPACK C18 UG120 (4.6 mm of dj. X 150 mm); manufactured by Shiseido Co., Ud.

Temperatura de columna: temperatura constante próxima a 25°C Column temperature: constant temperature close to 25 ° C

Fase mOvil: Acetonitrilo:agua:trietilamina = 1000:900:3 (se ajusta una disolución mixta de aguallrietilamina (900:3) a pH 3 con ácido fosfórico) Mobile phase: Acetonitrile: water: triethylamine = 1000: 900: 3 (a mixed solution of aguallriethylamine (900: 3) is adjusted to pH 3 with phosphoric acid)

Veloddad de flujo: 1,0 mUmin. Flow velocity: 1.0 mUmin.

S S

Patrón intemo (IS): n-propilparabeno Internal pattern (IS): n-propylparaben

MétOdo de preparación de la disolución B de IS Preparation Method of IS Solution B

10 10

En primer lugar, se pesaron 100 mg del patrón interno y se llevaron a 100 mi con etanol. Entonces se llevaron diez mililitros de la disolución resultante a 100 mi con etanol. Volvieron a llevarse diez mililitros de la última disolución a 100 mi con etanol. Se usó la disolución resultante como disolución B de IS. A continuación en las tablas 5 a 8 se muestran los resultados calculados. First, 100 mg of the internal standard was weighed and taken to 100 ml with ethanol. Then ten milliliters of the resulting solution was brought to 100 ml with ethanol. Ten milliliters of the last solution was taken back to 100 ml with ethanol. The resulting solution was used as IS solution B. Next, tables 5 to 8 show the calculated results.

Tabla 5 Table 5

Ejemplo de preparación Preparation Example

Razón restante % Reason Remaining%

comparativo comparative

1 hora 6 horas 1 dla 4dias 7dlas 10 dlas 14 días 17 dlas 1 hour 6 hours 1 day 4 days 7dlas 10 days 14 days 17 days

1-1 1-1

735 581 38,0 181 161 141 7,9 26 735 581 38.0 181 161 141 7.9 26

1-2 1-2

36,2 307 116 1.7 11 1,3 10 - 36.2 307 116 1.7 eleven 1.3 10 -

1-3 1-3

8,9 2,0 1,4 09 -- - - 8.9 2.0 1.4 09 - - -

1-4 1-4

45,2 417 47 8 - 45.2 417 47 8 -

1-5 1-5

52,8 40,5 46,9 - - -- 52.8 40.5 46.9 - - -

1-6 1-6

540 469 50,5 - - - 540 469 50.5 - - -

1-7 1-7

SO,3 44,7 46,8 - - SO, 3 44.7 46.8 - -

Tabla 6 Table 6

Ejemplo de preparación Preparation Example

RazÓn restante % Reason Remaining%

1 hora 1 hour

6 horas 6 hours

1 dla 1 day

7dlas 7dlas

14 dlas 14 days

17 dlas17 days

4 dlas 4 days

10 dlas 10 days

1-1 1-1

91 ,9 91, 9

88 ,6 88, 6

83,5 83.5

36,6 36.6

1-2 1-2

90,5 90.5

78 ,5 78, 5

75 1 75 1

1-3 1-3

71 ,771, 7

--

1-4 1-4

90,2 90.2

79,6 79.6

78 ,9 78, 9

62,5 62.5

A partir de los resultados en la tabla 5, dado que las microesferas obtenidas en los Ejemplos de preparación comparativos 1-1 a 1·7 tenlan un pequeño tamaño do partlcula promedio y/o una alta raz6n de encapsuladón, en 15 cada caso, la razón restante del fármaco tras una horél fue inferior al 90%, lo que indica que se había prOducido una ráfaga inicial. En cambio, a partir de los resultados de la tabla 6, las microesferas obtenidas en los ejemplos de preparaciOn 1-1 a 1-4 tenlan una razOn restante del presente fármaco tras una hora de al menos el 90%, lo que indica que se habla suprimido una ráfaga inicial. Además, las microesferas obtenidas en los ejemplos de preparación 1-1 a 1-4 alcanzaron una liberaciOn sO!itenida del presente fármaco durante aproximadamente dos From the results in Table 5, given that the microspheres obtained in Comparative Preparation Examples 1-1 to 1 · 7 had a small average particle size and / or a high encapsulation ratio, in each case, the Remaining ratio of the drug after a horél was less than 90%, indicating that an initial burst had been produced. On the other hand, from the results in Table 6, the microspheres obtained in the preparation examples 1-1 to 1-4 had a remaining ratio of the present drug after an hour of at least 90%, indicating that an initial burst has been suppressed. In addition, the microspheres obtained in preparation examples 1-1 to 1-4 achieved a solid release of the present drug for approximately two

20 semanas. Además, tal como puede observarse en la tigura 1, que muestra el transcurso a lo largo del tiempo de la razón restante del fármaco en el ejemplo de preparación 1-4, la razón restante del presente fármaco disminuye linealmente a lo largo del tiempo, lo que significa que se logra una liberación de orden cero. 20 weeks In addition, as can be seen in Figure 1, which shows the course over time of the remaining ratio of the drug in preparation example 1-4, the remaining ratio of the present drug decreases linearly over time, which means that a zero order release is achieved.

Tabla 7 Table 7

Ejemplo de preparación Preparation Example

RazOn restante % Reason Remaining%

comDarativo comdative

1 hora 1 hour

6 horas 6 hours

1 dia 1 day

7dlas 7dlas

14 dlas 14 days

21 días 21 days

28 días 28 days

35 días 35 days

2-1 2-1

60 4 60 4

37,7 37.7

2-2 2-2

43,243.2

81,5 81.5

--

--

2-3 2-3

59,2 59.2

45,5 45.5

--

--

2-4 2-4

40,6 40.6

47,647.6

53,8 53.8

--

--

2-5 2-5

--

--

--

2-6 2-6

43,343.3

--

2-7 2-7

41 ,341, 3

·495 495

--

--

--

2-8 2-8

41 ,341, 3

·495 495

--

Tabla 8 Table 8

78,2 66,0 SO,1 10,1 4,5 2-4 78.2 66.0 SO, 1 10.1 4.5 2-4

2-3 90,7 2-3 90.7

89:8 89: 8

2-5 935 2-5 935

A partir de los resultados en la tabla 7, dado que las microesferas obtenidas en los ejemplos de preparación comparativos 2-1 a 2-8 tenian un pequeno lamano d,e partícula promedio y/o una alta razón de encapsulación, la razón restante del presente fármaco tras un día fue inferior al 82% en cada caso, lo que indica que se habla producido una ráfaga inicial. En cambio, a partir de los resultados en la tabla 8, las microesferas obtenidas en los ejemplos de preparación 2-1 a 2-5 tenian una razón restante del presente fármaco Iras un día de al menos el 82%, lo que indica que se había suprimidO una ráfaga ¡nidal. Además, las microesferas obtenidas en los ejemplos de preparación 2-1 a 2-5 alcanzaron una liberación sostenida del presente fármaco durante aproximadamente cuatro semanas. Además, tal como puede observarse en la figura 2, que muestra el transcurso a lo largo del tiempo de la razón restante del fármaco en el ejemplo de prepamción 2-3, la razón restante del presente fármaco disminuye linealmente a lo largo del tiempo, lo que significa que se logra una liberación de orden cero. From the results in table 7, since the microspheres obtained in comparative preparation examples 2-1 to 2-8 had a small hand d, e average particle and / or a high encapsulation ratio, the remaining ratio of Present drug after one day was less than 82% in each case, indicating that there was an initial burst. On the other hand, from the results in Table 8, the microspheres obtained in preparation examples 2-1 to 2-5 had a remaining ratio of the present drug. You would go at least 82% a day, which indicates that I had suppressed a nesting gust. In addition, the microspheres obtained in preparation examples 2-1 to 2-5 achieved a sustained release of the present drug for approximately four weeks. In addition, as can be seen in Figure 2, which shows the course over time of the remaining ratio of the drug in preparation example 2-3, the remaining ratio of the present drug decreases linearly over time, which means that a zero order release is achieved.

Se encontró que las microesferas que tenian un periodo de liberación de dos semanas, al prepararse de modo que It was found that microspheres that had a two-week release period, when prepared so that

(1) las microesferas tenian un tamano de particula promedio de desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 ¡.lm, (2) la cantidad de copolimero de ácido lácticcrlácido glic6lico en partes en peso del fármaco era de desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 partes. en peso y (3) el copolimero de ácido láctico/ácido glic6lico tenia un peso molecular promedio en peso de desde~ aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 20.000 y una razón de áddo láctico/ácido glicólico de aproximadamente SO/50, podian liberar el presente farmaco a una tasa constante. Además, se encontró que las microesferaa que tenian un periodo de liberación de cuatro semanas, al prepararse de modo que (1 ) las microesferas tenlan un tamatlo de particula promedio de desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 ¡.lm, (2) la cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido glic6lico en partes en peso del farmaco era de desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 partes en peso y (3) el copolimero de ácido lactico/ácido gtic61ico tenia un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 50.000 y una razón de ácido láctico/ácido glicólico de aproximadamente SO/50, podlan liberar el presente fánnaco a una tasa constante. (1) the microspheres had an average particle size of from about 25 to about 35 µl, (2) the amount of copolymer of glycolic lactic acid lacrylic acid in parts by weight of the drug was from about 4 to about 8 parts. by weight and (3) the lactic acid / glycolic acid copolymer had a weight average molecular weight of from about ~ 10,000 to about 20,000 and a lactic acid / glycolic acid ratio of about SO / 50, could release the present drug at a constant rate In addition, it was found that microspheres that had a four-week release period, when prepared so that (1) the microspheres had an average particle size of from about 25 to about 35 µl, (2) the amount of lactic acid / glycolic acid copolymer in parts by weight of the drug was from about 4 to about 8 parts by weight and (3) the lactic acid / glytic acid copolymer had a weight average molecular weight of about 50,000 and a ratio of Lactic acid / glycolic acid of about SO / 50, may release the present drug at a constant rate.

Ejemplo 2 Prueba de medición de la concentración en :sangre Example 2 Test of concentration measurement in: blood

A ratas Crl:CO macho (Sprague-Oawley) (SPF; CharlE$ River Japan; 8 semanas de edad) se les administraron por vía subcutánea las diversas preparaciones (microesfmas) moslradas en la tabla 9 a continuación a una dosis de 5 mllkg en condiciones no en ayunas. Usando tres animales de cada grupo (6 animales de cada uno de los grupos de prueba 5 y 6), se extrajeron aproximadamente 0,5 mi de sangre heparinizada en condiciones sin anestesia de la arteria carótida de la rata en diversos puntos de extracción de muestras de sangre (3 horas, 8 horas, 24 horas (1 día), 3 días, 7 dlas, 10 días, 14 días, 17 dias, 21 ellas, 24 dlas, 28 dias tras la administración). Se centrifugó la sangre así obtenida a 12.000 rpm durante 2 minutos y se recogió el sobrenadante como plasma. Crl rats: male CO (Sprague-Oawley) (SPF; CharlE $ River Japan; 8 weeks old) were given subcutaneously the various preparations (microsphms) listed in Table 9 below at a dose of 5 mll in conditions not fasting. Using three animals from each group (6 animals from each of test groups 5 and 6), approximately 0.5 ml of heparinized blood was extracted under conditions without anesthesia of the rat's carotid artery at various sampling points of blood (3 hours, 8 hours, 24 hours (1 day), 3 days, 7 days, 10 days, 14 days, 17 days, 21 days, 24 days, 28 days after administration). The blood thus obtained was centrifuged at 12,000 rpm for 2 minutes and the supernatant was collected as plasma.

Se llevaron a cabo mediciones de la concentración en sangre del presente fármaco en el plasma resultante mediante un método de CUEMIEM. El pretratamien'to del plasma consistió en atladir una disolución de patrón interno al plasma y diluir con agua, después cargar en una columna de cartucho de extracción en fase sOlida (DOSB) Y desproteinización aclarando con agua, seguido por elución con metanol, concentradón y secado hasta sequedad. Se disolvió el residuo así obtenido ai'iadiendo el 0,1% de ácido acético acuosolacetonitrilo, y se vertió la disolución resultante en el aparato de CUEMIEM. Measurements of the blood concentration of the present drug in the resulting plasma were carried out by a CUEMIEM method. Plasma pretreatment consisted of drilling an internal standard solution to the plasma and diluting it with water, then loading it onto a column of solid phase extraction cartridge (DOSB) and deproteinization by rinsing with water, followed by elution with methanol, concentrate and dried to dryness. The residue thus obtained was dissolved by adding 0.1% aqueous acetonic acetonitrile acid, and the resulting solution was poured into the CUEMIEM apparatus.

Condiciones de HPLC HPLC conditions

HPlC: Shimadzu 10A HPlC: Shimadzu 10A

Columna: CAPCELlPAK C18MG120 (2,0 mm de d.i. X 150 mm; 5¡.lm; Shiseido) Column: CAPCELlPAK C18MG120 (2.0 mm ID x 150 mm; 5¡.lm; Shiseido)

Fase móvil: el 0,1% de ácido acético acuosolacetonitrilo (50:50, %en volumen) Mobile phase: 0.1% acetic acid acetonitrile (50:50,% by volume)

Velocidad de flujo: 0,2 ml/min. Flow rate: 0.2 ml / min.

Condiciones de EM/EM MS / MS conditions

EM/EM: API4000 MS / MS: API4000

Modo de ionización: ESI Ionization Mode: ESI

Modo de polaridad de iones: positivo Ion polarity mode: positive

Iones monitorizados: Ions monitored:

Presente fármaco (ión precursor (miz)": 429,2; ión de producto (miz)·: 79,2) Present drug (precursor ion (miz) ": 429.2; product ion (miz): 79.2)

Patrón interno (ión precursor (miz)": 445.4: ión de producto (miz)·: 168,1) Internal standard (precursor ion (miz) ": 445.4: product ion (miz): 168.1)

*: razón de masa con respecto a carga Tiempo de retención para el presente fármaco: 8,15 minutos Grupo de prueba 1: se administraron microesferas de la preparación de prueba 1 por vía subcutánea a una dosis del *: mass ratio with respect to load Retention time for the present drug: 8.15 minutes Test group 1: microspheres of test preparation 1 were administered subcutaneously at a dose of

presente fármaco de 10 mglkg. present drug of 10 mglkg.

Grupo de prueba 2: se administraron microesferas de la preparación de prueba 2 por vla subcutánea a una dosis del presente fármaco de 10 mg/kg. Grupo de prueba 3: administrado por vía subcutánea a una dosis del presente fármaco de 10 mglkg. Grupo de prueba 4: administrado por via oral a una dosis del presente fármaco de 10 mglkg. Se formularon las preparaciones de prueba usadas CCIO los grupos de dosis respectivos tal como se muestra en la Test group 2: Microspheres of test preparation 2 were administered subcutaneously at a dose of present drug of 10 mg / kg. Test group 3: administered subcutaneously at a dose of the present drug of 10 mglkg. Test group 4: administered orally at a dose of the present drug of 10 mglkg. The test preparations used CCIO were formulated the respective dose groups as shown in the

tabla 9. Se prepararon cada una de las preparaciones de prueba en general según el método descrito en el ejemplo de preparación 1. Tabla g Table 9. Each of the test preparations in general was prepared according to the method described in the example of preparation 1. G table

Cantidades formuladas Amounts formulated

e and

.8. 'OD ~~••~~ 00 ii:~ .8. 'OD ~~ •• ~~ 00 ii: ~

-g 281J_ C IV:¡:;<1I$lEC"1;)~ ...a o.$' <11 ce 'g~ ~ a9'E¡::a..J! (;¡.2 o ceo"S1J</lC:> ~~1tl~8.~ O-oeCQjEo.<1I1J .: (!):o O- o O1J J!! ._ ,g in.~ E IV 1:: E :f. EIVo~.~.t~ ·00 '0 ~ . e--o ª~N ~_ &' ~ e -g 281J_ C IV: ¡;; <1I $ lEC "1;) ~ ... a o. $ ' <11 ce 'g ~ ~ a9'E¡ :: a..J! (; ¡.2 o ceo "S1J </ lC:> ~~ 1tl ~ 8. ~ O-oeCQjEo. <1I1J .: (!): or O- or O1J J !! ._, g in. ~ E IV 1 :: E: f. EIVo ~. ~ .T ~ 00 '0 ~. e - o ª ~ N ~ _ & '~ e

o or

1 one

3320 mg tlGA5-!,13300 m 50.000 50150 31 ,7 16,5 3320 mg tlGA5 - !, 13300 m 50,000 50150 31, 7 16.5

2 2

110 mg PlGA5-SO 20.000 SO/SO 28,6 16,3 110 mg PlGA5-SO 20,000 SO / SO 28.6 16.3

(500 mal (500 bad

En las tablas 10 Y 11 a continuación se muestra el cambio a lo largo del tiempo de las concentraciones en sangre del presente fármaco en cada uno de los grupos de pruebél. Tables 10 and 11 below show the change over time of blood concentrations of the present drug in each of the test groups.

Tabla 10 Table 10

Grupo de Group of

Concentración en san re del resente fánnaco n mi San concentration re of resent fánnaco n me

prueba proof

3 horas 8 horas 1 dla 3dlas 7 días 10 días Three hours 8 hours 1 day 3dlas 7 days 10 days

1 one

27927 5791 011 2 SO 1 16 179 27927 5791 011 2 SO 1 16 179

2 2

27480 8049 S25 397 2687 2795 27480 8049 S25 397 2687 2795

14 dlas 14 days

17 días 21 dlas 24 días 28 dias 17 days 21 days 24 days 28 days

1 one

11 ,36 2183 089 20S 0,73 11, 36 2183 089 20S 0.73

2 2

S 41 22S () 26 010 005 S 41 22S () 26 010 005

Tabla 11 Table 11

Tal como resulta evidente a partir de los resultados anteriores, la administración subcutánea (grupo de prueba 3) y la administración oral (grupo de prueba 4) del presente ·ránnaco mostraron altas concentraciones en sangre desde 1 hora hasta 8 horas tras la administración; dos días tralS la administración, la concentración en sangre fue inferior a 0,2 ng/ml. En cambio, de las microesferas de la presente invención, en el grupo de prueba 1 que tenia un periodo de liberación lenta de cuatro semanas, la concentración en sangre del fánnaco se mantuvo de manera continua durante el periodo de desde 1 dla hasta 28 dlas tras la administración dentro de un intervalo de desde aproximadamente 0,7 ng/ml hasta aproximadamente 22 ng/ml. De mane'ra similar, en el grupo de prueba 2 que tenia un periOdO de liberación lenta de dos semanas, la concenlraciOn en sangre del fánnaco se mantuvo de manera continua durante el periOdO de desde 1 dla hasta 14 dias tras la administración dentro de un intervalo de desde aproximadamente 4 ng/ml hasta aproximadamente 30 ng/ml. Además, durante el periodo de medición, no se observó ningún signo indicativo de efectos secundarios (por ejemplo, diarrea, acción hipotensiva) en ninguno de los grupos de prueba. As is evident from the above results, subcutaneous administration (test group 3) and oral administration (test group 4) of the present · frog showed high blood concentrations from 1 hour to 8 hours after administration; Two days after administration, the blood concentration was less than 0.2 ng / ml. In contrast, of the microspheres of the present invention, in test group 1 which had a slow release period of four weeks, the blood concentration of the drug was continuously maintained during the period of from 1 day to 28 days after administration within a range of from about 0.7 ng / ml to about 22 ng / ml. Similarly, in test group 2 that had a slow-release period of two weeks, the blood concentration of the drug was continuously maintained for the period of from 1 day to 14 days after administration within one range from about 4 ng / ml to about 30 ng / ml. In addition, during the measurement period, no indicative sign of side effects (eg diarrhea, hypotensive action) was observed in any of the test groups.

Por tanto, de las microesferas mostradas en el ejempto 1 anterior, tanto las microesferas que tienen un periodo de liberación lenta de dos semanas como las microesfera!; que tienen un periodo de liberación lenta de cuatro semanas demostraron la capacidad de mantener de manera o:)Otinua una concentración en sangre suficiente para que se manifieste la acdón farmacológica del presente fármaco al tiempo que se evitan efectos secundarios. Therefore, of the microspheres shown in example 1 above, both microspheres having a slow release period of two weeks and microspheres !; that have a slow release period of four weeks demonstrated the ability to maintain in a way or:) Keep a sufficient blood concentration so that the pharmacological acdon of the present drug is manifested while avoiding side effects.

Ejemplo 3 Efectos de promoción de la producción de SOF-1 y EGF del presente fármaco Example 3 Promotional effects of the production of SOF-1 and EGF of the present drug

Se obtuvo y se usó un kit de angiogénesis (Kurabo Industries lid.) compuesto por células endoteliales de la vena umbilical humanas normales y fibroblastos cutáneos humanos normales. An angiogenesis kit (Kurabo Industries lid.) Composed of normal human umbilical vein endothelial cells and normal human skin fibroblasts was obtained and used.

MétOdo de creCimiento GROWTH METHOD

Usando una incubadora de dióxido de carbono (BNA-121 D) Y usando cultivo de angiogénesis 2 proporcionado con el kit de angiogénesis como cultivo liquido, se llevó a cabo el cultivo en un entamo húmedo a 3JOC con el 5% de dióxido de carbono/el 95% de aire. Using a carbon dioxide incubator (BNA-121 D) and using angiogenesis 2 culture provided with the angiogenesis kit as a liquid culture, the culture was carried out in a humid entanglement at 3JOC with 5% carbon dioxide / 95% air

Procedimiento de prueba Test procedure

Inmediatamente Iras recibirse el kit, se cultivaron las células durante 3 horas, tras lo cual se sustituyó el cultivo I1quido y se continuó el cultivo. Tres dlas después de iniciar el cultivo, volvió a suslituirse el cultivo liquido. Seis dlas después de inidar el cultivo, se llevó a cabo el tratamiento con el presente fármaco sustituyendo el cultivo liquido. Se fijó la concentración de tratamiento a 100 nmolll en cada caso. Se llevó a cabo el tratamiento con DMSQ corno control negativo. Seis, 24, 48 Y 72 horas tras el tratamiento con el presente fármaco, se recogió el sobrenadante de cultivo y se proporcionó para la medición de los factores de crecimiento. Los factores de crecimiento medidos fueron EGF y SDF-1 . Immediately after receiving the kit, the cells were cultured for 3 hours, after which the liquid culture was replaced and the culture was continued. Three days after starting the cultivation, the liquid culture was replaced again. Six days after starting the culture, treatment with the present drug was carried out replacing the liquid culture. The treatment concentration was set at 100 nmolll in each case. DMSQ treatment was carried out as a negative control. Six, 24, 48 and 72 hours after treatment with the present drug, the culture supernatant was collected and provided for the measurement of growth factors. The growth factors measured were EGF and SDF-1.

Se midió el sobrenadanle de cultivo con los siguientes kits de EUSA The culture supernadanle was measured with the following EUSA kits

Inmunoensayo de EGF humano (R&O Systems Inc., DEGOO) Human EGF Immunoassay (R&O Systems Inc., DEGOO)

Inmunoensayo de SOF-la humano (R&D Systems Inc., OSAOO) SOF-la human immunoassay (R&D Systems Inc., OSAOO)

En la tabla 12 a continuación se muestran los resulta.:los de medición 72 horas Iras el tratamiento con el presente fármaco. The results are shown in Table 12 below.: 72 hours of measurement You will be treated with this drug.

Tabla 12 Table 12

Fador de crecimiento Fador of growth

GnJ o control de disolvente Iml Gru o de fármaco /mI GnJ or solvent control Iml Group or drug /me

EGF EGF

3830±423 4995 ±442 3830 ± 423 4995 ± 442

SDF-1 SDF-1

304±242 383:t 36 O" 304 ± 242 383: t 36 O "

": P < 0,05 (prueba de la t de Student) ": P <0.05 (Student's t test)

Los resultados anteriores muestran que 72 horas tras el tratamiento con el presente fármaco, EGF y SDF-l hablan aumentado significativamente con respecto al grupo control de disolvente. The above results show that 72 hours after treatment with the present drug, EGF and SDF-1 have increased significantly with respect to the solvent control group.

Por tanto, el presente fármaco demostró una actividad angiogénica y una actividad de promoción de la regeneración tisular basándose en estos efectos de promoción de la producción de factores de crecimiento. Therefore, the present drug demonstrated an angiogenic activity and an activity of promoting tissue regeneration based on these effects of promoting the production of growth factors.

Ejemplo 4. Investigación de efedos en un modelo de oclusión-desobliteración de la arteria carótida común (4-VQ) Example 4. Investigation of ephedra in an occlusion-deobliteration model of the common carotid artery (4-VQ)

1) Preparación de animales para el modelo de odusión-desobliteración de la arteria carótida común (4-VQ) en rata 1) Preparation of animals for the common carotid artery (4-VQ) odusion-deobliteration model in rat

A rotos Crlj:MI m3cho de nueve semanas de edad SEl les administró por vla intraperitoneal pentobarbital sódico y, mientras estaban baja anestesia, se fijaron en la posición decúbito plono a un instrumento de eslereotaxia cerebral. Se realizó una incisión occipital en la piel y la capa muscular de la región del cueno, se expUSieron los foramenes pterigoideos izquierdo y derecho de la primera vértebra cervical y se termocoagularon las arterias vertebrales insertando la punta de un soldador en cada foramEtn pterigoideo, ocluyendo asl permanentemente las arterias vertebrales bilaterales. A continuación, se realizó una incisión central en la región anlerior del cuello, se expusieron y se desprendieron las arterias carótidas comunes a ambos lados, se hizo pasar un tubo de silicona bajo las arterias y se colocó de manera anular alrededor de las arterias, tras lo cual se cosió la piel de la región del cuello. En el dla tras la cauterización de las arterias vertebrales, !ie anestesiaron los animales con dietil éter, despuéS se inmovilizaron en la posición decúbito supino. Se expusieron ambas arterias carótidas comunes usando el tubo de silicona que se habla colocado en las arterias cnrótidas comunes en la reglón del cuello y se ocluyeron temporalmente durante 10 minutos con pinzas Sugita, despues volvieron a abrirse. Aparte de isquemia y desobliteración, también se llevó a cabo el mismo procedimiento en un grupo normal (grupo de prueba 1). A broken Crlj: MI m3cho of nine weeks of age SEl administered them by intraperitoneal sodium pentobarbital and, while under anesthesia, they were fixed in the pluto position to a cerebral sclereotaxy instrument. An occipital incision was made in the skin and muscle layer of the region of the cueno, the left and right pterygoid foramines of the first cervical vertebra were exposed and the vertebral arteries were thermocoagulated by inserting the tip of a welder into each pterygoid foramEtn, occluding asl permanently bilateral vertebral arteries. Next, a central incision was made in the anterior region of the neck, the common carotid arteries were exposed and detached on both sides, a silicone tube was passed under the arteries and placed annularly around the arteries, after which sewed the skin of the neck region. In the day after cauterization of the vertebral arteries, the animals were anesthetized with diethyl ether, then they were immobilized in the supine position. Both common carotid arteries were exposed using the spoken silicone tube placed in the common cnrotic arteries in the neck region and were temporarily occluded for 10 minutes with Sugita forceps, then opened again. Apart from ischemia and deobliteration, the same procedure was also performed in a normal group (test group 1).

2) Estudio histopatolOgico 2) Histopathological study

Tras la isquemia y desobliteraciOn de cuatro punt!>s de las ralas, se proporcionó un periOdO de dosificación eSpecifico ele 8 dlas o 42 dlas 1" un periodo libre de férmaco (de al menos 2 semanas). Entonces se anestesiaron 10$ animales con pentobarbital sódico, se sometieron a pertuslón y se fijaron, en orden, con solución salina fisiológica, paraformaldehido al 4% y disoluciOn de Bouin, y se extirparon los cerebros. Se cortó tejido cerca del bregma, 3,3 mm, a partir del cerebro fijado en disolución de Bouin. Tras la deshidratación y la eliminación de cera, se incrustó Following the ischemia and deoblasting of four points of the rales, a specific dosage period was provided on 8 days or 42 days 1 "a drug-free period (at least 2 weeks). Then $ 10 animals were anesthetized with Sodium pentobarbital, underwent pertusslon and fixed, in order, with physiological saline, 4% paraformaldehyde and Bouin solution, and brains were excised, tissue near the bregma, 3.3 mm, was cut from the brain fixed in Bouin solution. After dehydration and wax removal, it was embedded

la muestra en parafina. Se prepararon cuatro secciones de 10 !-1m de grosor a partir del sitio bregma, aproximadamente 3,3 mm. Se midió el número de neuronas en CA1 en una de las secciones usando tinción de Nissl. Se tiM otra de las secciones con PCNA (microglia) y se tiM una tercera sección con GFAP (gl1a). the sample in paraffin. Four sections 10 µm thick were prepared from the bregma site, approximately 3.3 mm. The number of neurons in CA1 in one of the sections was measured using Nissl staining. Another section with PCNA (microglia) was thrown and a third section with GFAP (gl1a) was thrown.

Prueba 1. Estudio sobre la administración subcutánea de prostaglandinas Test 1. Study on the subcutaneous administration of prostaglandins

Se investigaron los efectos de la administración subcutánea repetida de omoprostilo, PGE1.aCD y el presente fármaco, dos veces al dia durante 42 dlas tras la creación del modelo de 4-VO en rata (10 minutos de odusión y reperfusión), sobre el número de neuronas en la región de CA1 del hipocampo. The effects of repeated subcutaneous administration of omoprosthyl, PGE1.aCD and the present drug, twice daily for 42 days after the creation of the 4-VO model in rat (10 minutes of odusion and reperfusion), on the number were investigated. of neurons in the CA1 region of the hippocampus.

Los grupos consistieron en un grupo normal (grupo de prueba 1, evaluado tras recibir medio durante 42 dlas), grupos control (grupo de prueba 2, evaluado tras recibir disolvente durante 8 dias; grupo de prueba 3, evaluado tras recibir medio durante 42 días), presente fármaco (grupo de prueba 4, administrado repetidamente por vía subcutánea 10 mg/kg dos veces al dia durante 42 días), ornoprostilo (grupo de prueba 5, administrado repetidamente por via subcutánea 0,1 mglkg dos ve,ces al dla durante 42 dlas) y grupos de prostaglandina E1 (PGE1.aCD) (grupo de prueba 6, administrado repetid~lmente por via subcutánea 1,5 mg/kg dos veces al dia durante 42 días; grupo de prueba 7, administrado repetidamente por vía subcutánea 3 mg/kg dos veces al día durante 42 días). La dosis de PGE1.aCD es la dosis como PGE1. El presente fármaco y ornoprostilo se fijaron cada uno a la dosis máxima a la que no se muestra acción hipotensi\Ia. The groups consisted of a normal group (test group 1, evaluated after receiving medium for 42 days), control groups (test group 2, evaluated after receiving solvent for 8 days; test group 3, evaluated after receiving medium for 42 days ), present drug (test group 4, repeatedly administered subcutaneously 10 mg / kg twice daily for 42 days), ornoprosthyl (test group 5, repeatedly administered subcutaneously 0.1 mglkg two times, cease dla for 42 days) and prostaglandin E1 groups (PGE1.aCD) (test group 6, administered repeatedly subcutaneously 1.5 mg / kg twice daily for 42 days; test group 7, administered repeatedly via subcutaneous 3 mg / kg twice daily for 42 days). The dose of PGE1.aCD is the dose as PGE1. The present drug and ornoprosthyl were each fixed at the maximum dose at which no hypotensive action is shown.

Evaluación: Tras 8 dlas en el grupo de prueba 2, y tréls 42 dlas en los demás grupos de prueba, se sometieron los cerebros a perfusión y se fijaron, después Se til'leron con Nissl, se tiñeron con H-E o se ti"eron con GFAP, y se contó el número de neuronas en la región CA1 del hipocampo. (Se contó el número de neuronas en 10 lugares en cada una de las regiones CA1a, CA1 b Y CA 1 c, yen 20 lugares en los lados izquierdo y derecho fotografiando cada lugar y contando el número de neuronas maduras con un analizador de imágenes (Win ROOF V3,6; Mitani Corporatíon». Evaluation: After 8 days in test group 2, and three 42 days in the other test groups, the brains were perfused and fixed, then they were labeled with Nissl, stained with HE or stained with eron. with GFAP, and the number of neurons in the CA1 region of the hippocampus was counted. (The number of neurons in 10 places in each of the regions CA1a, CA1 b, and CA 1 c was counted, and in 20 places on the left and right photographing each place and counting the number of mature neurons with an image analyzer (Win ROOF V3.6; Mitani Corporation ».

A continuación en la tabla 13 se muestran los resultados obtenidos con la tindón con Nissl. Table 13 shows the results obtained with the tindón with Nissl.

Tabla 13 Table 13

Grupo de prueba Test group

Numero de neuronas por unidad de longitud recuento/mm) Number of neurons per unit length count / mm)

1 one

Iz uierda L 922±191 Derecha R 96,4±169 Left hand L 922 ± 191 Right R 96.4 ± 169

2 3 2. 3

432##±12,8 587## ±204 330##±132 547##±295 432 ## ± 12.8 587 ## ± 204 330 ## ± 132 547 ## ± 295

4 4

134-4*" ± 2.5 7 123,8*-± 30 9 134-4 * "± 2.5 7 123.8 * - ± 30 9

5 6 7 5 6 7

134,6"* ± 3·2 7 105,7±240 1462·· ± 3'09 6 1411*" ± 17 8 1147··±220 1276··±388 134.6 "* ± 3 · 2 7 105.7 ± 240 1462 ·· ± 3'09 6 1411 * "± 17 8 1147 ·· ± 220 1276 ·· ± 388

##: P < 0,01 frente al grupo de prueba 1 (prueba de DLlnnett) ##: P <0.01 versus test group 1 (DLlnnett test)

., **: P < 0,05, P < 0,01 frente al grupo de prueba 3 (prueba de Dunnett) ., **: P <0.05, P <0.01 versus test group 3 (Dunnett's test)

Se administraron el medio, el presente fármaco, PGE\.aCD y omoprostilo por vla subcutánea una vez inmediatamente tras la isquemia y reperfusión de 4-VO, y dos veces al dla desde el día 1 hasta el día 8 de la isquemia o desde el dia 1 hasta el dla 42 de la isquemia. The medium, the present drug, PGE.aCD and omoprosthyl were administered subcutaneously once immediately after ischemia and reperfusion of 4-VO, and twice a day from day 1 to day 8 of ischemia or from day 1 until day 42 of ischemia.

Tras 8 días o 42 días, se sometió el cerebro a perfusión y se fijó, tras lo cual se midieron los números de neuronas piramidales en la región CA1 del hipocampo izquierda y derecha por medio de tinción con Nissl. After 8 days or 42 days, the brain was perfused and fixed, after which the numbers of pyramidal neurons in the CA1 region of the left and right hippocampus were measured by staining with Nissl.

Como resultado, con respecto al grupo normal (grupo de prueba 1), en la isquemia y desobliteración (4-VO), las neuronas de la región CA1 del hipocampo mostraron una disminución significativa en el día 8 (grupo de prueba 2) y el número de células no aumentó incluso tras 42 días (grupo de prueba 3). En cambio, en el día 42 de la isquemia, As a result, with respect to the normal group (test group 1), in ischemia and deobliteration (4-VO), the neurons of the CA1 region of the hippocampus showed a significant decrease on day 8 (test group 2) and cell number did not increase even after 42 days (test group 3). Instead, on day 42 of ischemia,

las adminístraciones subcutáneas del presente fármaco, ornoprostilo y PGE1 .aCD (tanto a 1,5 mglkg como a 3 mg!kg) mostraron todas un aumento significativo en el número de neuronas piramidales de CA 1 del hipocampo con respecto al grupo al que se le administró el medio (grupo de prueba 3). Se confirmó que la administración de cada una de las sustancias de prueba tenia una acción de prevención de la neuropatla y/o una acción que promovla la regeneración de neuronas. the subcutaneous administrations of the present drug, ornoprosthyl and PGE1 .aCD (both at 1.5 mglkg and at 3 mg! kg) all showed a significant increase in the number of pyramidal neurons of CA 1 of the hippocampus with respect to the group to which administered the medium (test group 3). It was confirmed that the administration of each of the test substances had a neuropathic prevention action and / or an action that promotes the regeneration of neurons.

Prueba 2. Estudio de la administración oral repetida de·1 presente fármaco Test 2. Study of repeated oral administration of · 1 present drug

Se confirmó la acción de promoción de la regeneración de neuronas mediante la administración oral repetida dos veces al día del presente fármaco tras un trastorno. y se investigaron los efectos de tal administración sobre el deterioro en el aprendizaje del laberinto de agua. The promotion action of neuron regeneration was confirmed by repeated oral administration twice a day of the present drug after a disorder. and the effects of such administration on the deterioration in the learning of the water maze were investigated.

Grupos: Cada grupo consistía en n=12 animales Groups: Each group consisted of n = 12 animals

(1) EvaluaciOn del número de neuronas en la regiOn CA l del hipocampo cortada del cerebro (1) Evaluation of the number of neurons in the CA region of the brain's severed hippocampus

Grupo de prueba 1: 4.vO + medio, 8 días Test group 1: 4.vO + medium, 8 days

Grupo de prueba 2: 4-VO + presente fllnnaco, 10 mglkg, dos veces al dla, durante 8 días Test group 2: 4-VO + present fllnnaco, 10 mglkg, twice a day, for 8 days

Grupo de prueba 3: 4-VO + presente fánnaco, 1 mglkg, dos veces al dla, durante 42 dias (s610 evaluaciOn del número de neuronas) Test group 3: 4-VO + present drug, 1 mglkg, twice a day, for 42 days (only evaluation of the number of neurons)

(2) Evaluación del numero de neuronas en la región CA1 cortada del cerebro (grupos 4 a 7) Iras la medición de la capacidad de aprendizaje del laberinto de agua (grupol> " a 7) (2) Evaluation of the number of neurons in the CA1 region cut off from the brain (groups 4 to 7) You will measure the learning capacity of the water maze (grupol> "to 7)

Grupo de prueba 4: noOllal (grupo simulado) + medio, 42 dlas (control noOlla]) Test group 4: noOllal (simulated group) + medium, 42 days (noOlla control))

Grupo de prueba 5: 4NO + medio, 42 días (control de disOlvente) Test group 5: 4NO + medium, 42 days (solvent control)

Grupo de prueba 6: 4-VO + presente famaco, 10 mglk!~, dos veces al dla durante 42 días Test group 6: 4-VO + famaco present, 10 mglk! ~, Twice a day for 42 days

Grupo de prueba 7: 4-VO + disolvente durante 8 dias + presente fármaco, 10 mglkg, dos veces al día, durante 34 dlas (evaluaci6n de actividad regenerativa) Test group 7: 4-VO + solvent for 8 days + present drug, 10 mglkg, twice daily, for 34 days (evaluation of regenerative activity)

(3) (3)

Patologla: Se lIev6 a cabo la perfusi6n y la fljacl6n del cerebro en el dia 8 en los grupos de prueba 1 y 2, Y en el dla tras la prueba de capacidad de aprendizaje del laberinto de agua en los grupos 4 a 7. Entonces se cont6 el numero de neuronas mediante el mismo método que el descrito anteriormente en la prueba 1. En el grupo de prueba 3, tras detenerse la administración de fármaco, se fijaron los cerebros al mismo tiempo que en los grupos de prueba 4 a 7. Pathology: Perfusion and brain flow was carried out on day 8 in test groups 1 and 2, and on the day after the water maze learning ability test in groups 4 to 7. Then The number of neurons was counted by the same method as described above in test 1. In test group 3, after stopping drug administration, the brains were fixed at the same time as in test groups 4 to 7.

(4) (4)

Medici6n de la capacidad de aprendizaje del laberinto de agua Measuring the learning capacity of the water maze

Usando los grupos de prueba 3 a 7. se investigaron las funciones motrices con un laberinto de agua de Monis de tal manera que se evit6 el sesgo entre los grupos. Using test groups 3 to 7. motor functions were investigated with a maze of Monis water in such a way that bias between groups was avoided.

Aparato para someter a prueba la capacidad de aprendizaje del laberinto de agua Apparatus for testing the learning capacity of the water maze

Se usaron una plataforma acrilica transparente (aproximadamente 12 cm de diametro y aproximadamente 30 cm de altura) que no puede detectarse visualmente y una pIScina circular (aproximadamente 148 cm de diametro y aproximadamente 44 cm de allura) fabricada de clorurQ de vinilo gris y llena de agua (temperatura del agua, de 17 a 18°C) hasla una altura de aproximadamente 32 cm de 'modo que la plataforma quedaba oculta por el agua. A transparent acrylic platform was used (approximately 12 cm in diameter and approximately 30 cm in height) that cannot be detected visually and a circular pool (approximately 148 cm in diameter and approximately 44 cm in height) made of gray vinyl chloride and filled with water (water temperature, from 17 to 18 ° C) to a height of approximately 32 cm so that the platform was hidden by water.

Se dividi6 la piscina en cuatro cuadrantes, se c;01oc6 la plataforma en el centro del cuarto cuadrante (aproximadamente 36 cm desde el centro de la piscina) y se colocaron bombillas en el perlmetro de la piscina para proporcionar una referencia espacial. The pool was divided into four quadrants, the platform was placed in the center of the fourth quadrant (approximately 36 cm from the center of the pool) and light bulbs were placed on the perimeter of the pool to provide a spatial reference.

Medición de ensayos de adquisici6n de aprendizaje del laberinto de agua Measurement of water labyrinth learning acquisition trials

Tras la dosis de fármaco final, se proporcion6 un periodo libre de fármaco de al menos 2 semanas, tras lo cual se colocó la rata en la piscina desde uno de varios punto~i A a E con su cabeza dirigida a la pared de la piscina circular y se midi6 el tiempo que tardO en alcanzar la plataforma (latencia de Objetivo; segundos) con un cronOmetro (el tiempo de medici6n fue un máximo de 90 segundcIs). Cuando la rata alcanz6 la plataforma en un plazo de 90 segundos y permaneci6 sobre la plataforma durante 30 segundos, se consideró que era consciente de la ubicación de la plataforma y se termin6 la medidOn. A las ratas que no alcanzaron la plataforma se les asigno una lalencia de objetivo de 90 segundos. After the final drug dose, a drug-free period of at least 2 weeks was provided, after which the rat was placed in the pool from one of several points ~ i A to E with its head directed to the pool wall circulating and measuring the time it took to reach the platform (Objective latency; seconds) with a stopwatch (the measurement time was a maximum of 90 seconds). When the rat reached the platform within 90 seconds and remained on the platform for 30 seconds, it was considered to be aware of the location of the platform and the measurement was completed. Rats that did not reach the platform were assigned a target latitude of 90 seconds.

Se llevaron a cabo mediciones de latencia de objelivo dos veces al dia (una vez por la maflana y una vez por la tarde) en los dias 1 a 4. Se colOCO la rata en la piscina desde los diversos puntos A a E con su cabeza dirigida a la pared de la piscina drcular. Se registró el trayecto de nado de la rata con un monitor de TV con una cámara de vIdeo instalada sobre la piscina y se analizaron el tiempo de nado, la distanda reoonida y el numero de pases con un analizador de movimiento de imágenes de vídeo (SMART, Panlab). Además, se registraron los movimientos de nado usando un grabador de video en OVO. En las tablas 14 a 17 a continuaci6n se presentan los resultados. Objective latency measurements were carried out twice a day (once in the morning and once in the afternoon) on days 1 to 4. The rat was placed in the pool from various points A to E with its head directed to the wall of the drcular pool. The rat's swim path was recorded with a TV monitor with a video camera installed above the pool and the swim time, reoon distance and number of passes were analyzed with a video image motion analyzer (SMART , Panlab). In addition, swimming movements were recorded using an OVO video recorder. The results are presented in Tables 14 to 17 below.

1) Numero de neuronas en la regi6n CAl del hipocampo de 10$ grupos de prueba 1 '12 1) Number of neurons in the CAl region of the hippocampus of 10 $ test groups 1'12

Tabla 14 Table 14

Grupo de prueba Test group

Numero dH neuronas or unidad de Ion itud recuento/mm DH number neurons Ion itud unit count / mm

Iz uier.da l Left u l

Derecha R Right R

1 one

1103 ±601 2005±3900 1103 ± 601 2005 ± 3900

2 2

90,97"*:t 53 70 8970.... ±5189 90.97 "*: t 53 70 8970 .... ± 5189

H: P < 0,01 frente al grupo frente al grupo de prueba 1 (prueba de Dunnelt) H: P <0.01 versus the group versus test group 1 (Dunnelt test)

Tal como resulta evidente a partir de los resultados anteriores, la administración oral tras la isquemia y reperfusión en el grupo de prueba 2 ya mostró en el dia 8 una supresión significativa en la disminución del número de neuronas en la región CAl del hipocampo con respecto al grupo de prueba 1, confirmando por tanto la existencia de una actividad de prevención de neuropatla. As is evident from the previous results, oral administration after ischemia and reperfusion in test group 2 already showed a significant suppression on day 8 in the decrease in the number of neurons in the CAl region of the hippocampus with respect to test group 1, thus confirming the existence of a neuropathic prevention activity.

2) Número de neuronas en la región CA1 del hipocampo de los grupos de prueba 3 a 7 2) Number of neurons in the CA1 region of the hippocampus of test groups 3 to 7

Tabla 15 Table 15

H: P < 0,01 frente al grupo de prueba 4 (prueba de la t de Aspin-Welch o prueba de la t de Student) H: P <0.01 versus test group 4 (Aspin-Welch t test or Student t test)

#: P < 0,05 frente al grupo de prueba 5 (prueba de la t de Aspin-Welch) #: P <0.05 versus test group 5 (Aspin-Welch t test)

aa: P < 0,01 frente al grupo de prueba 5 (prueba de Dunnetl) aa: P <0.01 vs. test group 5 (Dunnetl test)

+: P < 0,1 frente al grupo de prueba 5 (prueba de la t de Student) +: P <0.1 versus test group 5 (Student t test)

El grupo al que se le administró el medio (grupo de prueba 5, tras 42 dlas en un modelo de 4-VO) mostró una disminución significativa del número de neuronas en CA1 del hipocampo con respecto al grupo normal (grupo de prueba 4). En cambio, la administración oral del preSE!nte farmaco a un nivel de 1 mglkg (grupo de prueba 3) y un nivel de 10 mglkg (grupo de prueba 6) mostraron auml~ntos significativos del número de neuronas en la región CA1 del hipocampo con respecto al grupo de prueba 4. AdBmas, se sabe que, en este sistema de evaluación, la muerte de neuronas en la región CA1 del hipocampo e~; completa tras aproximadamente 5 dlas de isquemia y desoblileraciÓn. Incluso cuando se administró medio hasta el dla 8 y se administraron repetidamente por vla oral 10 mglkg del presente farmaco durante 34 días comenzando en el dla 9 (grupo de prueba 7), se observó una tendencia de aumento en el número de neuronas en la región CAl del hipocampo, Por tanto, ademas de una actividad de protección de neuronas, se confirmó que el presente farmaco tenia una actividad de promoción de la regeneración de neuronas, The group to which the medium was administered (test group 5, after 42 days in a 4-VO model) showed a significant decrease in the number of CA1 neurons in the hippocampus with respect to the normal group (test group 4). In contrast, oral administration of the pre-drug drug at a level of 1 mglkg (test group 3) and a level of 10 mglkg (test group 6) showed significant increases in the number of neurons in the CA1 region of the hippocampus with respect to test group 4. AdBmas, it is known that, in this evaluation system, the death of neurons in the CA1 region of the hippocampus e ~; complete after approximately 5 days of ischemia and deobilization. Even when medium was administered until day 8 and 10 mglkg of the present drug were repeatedly administered orally for 34 days starting at day 9 (test group 7), a trend of increase in the number of neurons in the region was observed CAl of the hippocampus, Therefore, in addition to a neuron protection activity, it was confirmed that the present drug had a neuron regeneration promotion activity,

3) Medición de la capacidad de aprendizaje del laberinto de agua 3) Measurement of the learning capacity of the water maze

(1) Tiempo hasta que la rata alcanza la plataforma (latencia de Objetivo, segundos) (1) Time until the rat reaches the platform (Target latency, seconds)

Tabla 16 Table 16

Latencia de ob'etivo undos Ensa os de adquisición Objective Latency Unity Acquisition Tests

~ .r--------,----~~~~~~~,~~----,_------~ ~ .r --------, ---- ~~~~~~~, ~~ ----, _------ ~

0-" 0- "

.~ . ~

E 'c E 'c

~CII ~ IIC

276:1:241 276: 1: 241

425:1:123 2895:1:889 122,9:1:383425: 1: 123 2895: 1: 889 122.9: 1: 383

4 12 4 12

669:1:160 47,7:1:27,5 280:1:209 669: 1: 160 47.7: 1: 27.5 280: 1: 209

76,6±20,7 65,9±21,1 538±240 76.6 ± 20.7 65.9 ± 21.1 538 ± 240

376±223 376 ± 223

585±1624057###±1157 585 ± 1624057 ### ± 1157

176,8±505176.8 ± 505

5 16 5 16

1529±4271529 ± 427

6 12 6 12

718±183 588±221 413:1:288 718 ± 183 588 ± 221 413: 1: 288

339±232 339 ± 232

515±119 3583*±899 515 ± 119 3583 * ± 899

1469 ±40,5 73,8±152 554±296 417:1:267 1469 ± 40.5 73.8 ± 152 554 ± 296 417: 1: 267

258:1:152 258: 1: 152

492±10,1 3384"*±808492 ± 10.1 3384 "* ± 808

7 12 7 12

Los valores en la tabla indican la media ± desviación estandar, The values in the table indicate the mean ± standard deviation,

###: P < 0,01 frente al grupo 4 ###: P <0.01 versus group 4

., **: P < 0,1, P < 0,05 frente al grupo 5 (analisis de dO$ factores de la varianza (8 ensayos» ., **: P <0.1, P <0.05 versus group 5 (analysis of dO $ variance factors (8 trials »

(2) Distancia recorrida hasta que la rata alcanza la plataforma (2) Distance traveled until the rat reaches the platform

Tabla 17 Table 17

o o~Jl ~ o e-S S :Q :Q ti) :Qo o ~ Jl ~ o e-S S: Q: Q ti): Q

!lo o~ -¡ N'5 .-¡¡! o-~ -N'5. -¡¡

,2 o., -¡¡, 2 o., -¡¡

E--• o E-- • o

i5~ .::J ~ .. E -E ~l .. E il'.E i5 ~. :: J ~ .. E -E ~ l .. E il'.E

z 00 O o o ez 00 O o o e

°e °e w _ ° e ° e w _

~ ~ e e e ~ ~ ~ e e e ~

Los valores en la tabla Indican la media i desviación estándar. The values in the table indicate the mean and standard deviation.

###: P < 0,01 frente al grupo 4 ###: P <0.01 versus group 4

•• : P < 0,05 frente al grupo 5 (análisis de dos faclores ele la varianza (6 ensayos» ••: P <0.05 against group 5 (analysis of two factors of variance (6 trials »

El grupo control de disolvente (grupo de prueba 5) mostró una prolongación significativa en la latencia de objetivo (segundos) y la distancia recorrida con respecto al grupo normal (grupo de prueba 4) en los ensayos de capacidad de aprendizaje del laberinto de agua. Tanto el grupo él! que se le administraron por vla oral 10 mglkg, dos veces al dla, del presente fármaco (grupo de prueba 6) como 9'1 grupo al que se le administró el medio hasta el dla 8 '1 se le administraron por vla aralia rnglkg, dos veces al dla, del presente fármaco comenzando en el dla 9 (grupo de prueba 7) mostraron una reducción significativa de la latencia de objetivo (segundos) y la distancia recorrida en los ensayos de capacidad de aprendizaje del laberinto de agua con respecto al grupo control de disolvente (grupo de prueba 5) (prueba: análisis de dos factores de la varianza; 8 ensayos). The solvent control group (test group 5) showed a significant prolongation in the target latency (seconds) and the distance traveled with respect to the normal group (test group 4) in the water maze learning ability tests. Both the group him! which were administered orally 10 mglkg, twice a day, of the present drug (test group 6) as a 9'1 group to which the medium was administered until day 8'1 was administered by vla aralia rnglkg, Twice a day, the present drug starting on day 9 (test group 7) showed a significant reduction in target latency (seconds) and the distance traveled in the water maze learning ability tests with respect to the group solvent control (test group 5) (test: analysis of two variance factors; 8 tests).

Por tanto, se confirmó que el presente fármaco, al mostrar una actividad de protección de los nervios y una actividad de promoción de la regeneración de neuronas endógenas, no sólo aumenta el número de neuronas, sino que también ayuda en la recuperación de discapacidades en la función del aprendizaje asociadas con la neuropatla. Therefore, it was confirmed that the present drug, by showing a nerve protection activity and an activity promoting the regeneration of endogenous neurons, not only increases the number of neurons, but also helps in the recovery of disabilities in the Learning function associated with the neuropathy.

Prueba 3. Estudio de una única administración subcutánea de microesferas de la presente invención; estudio de la actividad de promoci6n de la regeneración de neurona:s y efectos sobre farmacologla del comportamiento Test 3. Study of a single subcutaneous administration of microspheres of the present invention; study of the promotion activity of neuron regeneration: s and effects on behavioral pharmacology

(1) Influencia sobre el número de neuronas en la región CAl del hipocampo (1) Influence on the number of neurons in the CAl region of the hippocampus

Este estudio se realizó de la misma manera que en la prueba 1 y se evaluaron los resultados basandose en el número de neuronas en CA 1 del hipocampo. This study was conducted in the same manner as in test 1 and the results were evaluated based on the number of neurons in CA 1 of the hippocampus.

En un modelo de 4-VO en rata, tras 10 minutos de odusión y reperfusi6n, se administraron por via subcutánea sólo uno vez las microesferas producidas en el ejemplo de preparación 2_2 y se evaluó la influencia sobre el número de neuronas en la región CAl del hipocampo 42 dias después. La dosis indica la cantidad del presente fármaco incluida en las mlcroesferas. Las dosis de PLGA.ME en los grupos de prueba 1 y 2 fueron las mismas que en los grupos de prueba 3, 5, 6 Y 7. In a rat 4-VO model, after 10 minutes of odusion and reperfusion, only microspheres produced in preparation example 2_2 were administered subcutaneously and the influence on the number of neurons in the CAl region of the hippocampus 42 days later. The dose indicates the amount of the present drug included in the microspheres. The doses of PLGA.ME in test groups 1 and 2 were the same as in test groups 3, 5, 6 and 7.

En la tabla 18 a continuación se muestran los grupos. The groups are shown in table 18 below.

Tabla 18 Table 18

7 7

Microesferas producidas en el 10 rnglkg (una única administración subcutánea 6 Microspheres produced in the 10 rnglkg (a single subcutaneous administration 6

ejemplo de preparación 2-2 (para e)medir ,. cinética en Preparation example 2-2 (for e) measure,. kinetics in

justo después de la isquemia y reperfusión) just after ischemia and reperfusion)

sangre blood

S S

Grupo de prueba 1: Grupo normal (grupo simulado); a ralas normales en las que se realizó una cirugía simulada se les administró una única administración subcutánea de PlGA.ME solo como control negativo. Test group 1: Normal group (simulated group); In normal cases in which simulated surgery was performed, a single subcutaneous administration of PlGA.ME was administered only as a negative control.

Grupo de prueba 2: Grupo control de disolvente; a ratas 4I-VO se les administrO una unica administración subcutánea de PLGAME solo como control negativo. Test group 2: Solvent control group; 4I-VO rats were administered a single subcutaneous administration of PLGAME only as a negative control.

Grupo de prueba 3: las mlcroesferas producidas en el ejemplo de preparación 2-2 se administraron por vla subcutánea una vez (10 mglkg) justo después de la isquemia y reperfusión 4-VO. Test group 3: the microspheres produced in preparation example 2-2 were administered subcutaneously once (10 mglkg) just after ischemia and 4-VO reperfusion.

Grupo de prueba 4: Las microesferas producidas e,n el ejemplo de preparación 2-2 se administraron por vla subcutánea una vez (30 mglkg) justo después de la isq¡uemia y reperfusión 4-VO. Test group 4: The microspheres produced in the preparation example 2-2 were administered subcutaneously once (30 mglkg) just after ischemia and 4-VO reperfusion.

Grupo de prueba 5: Las microesferas producidas en el ejemplo de preparaci6n 2-2 se administraron por vla subcutánea una vez (10 mglkg) 48 horas tras la isquemia y reperfusión 4-VO. Test group 5: The microspheres produced in preparation example 2-2 were administered subcutaneously once (10 mglkg) 48 hours after ischemia and 4-VO reperfusion.

Grupo de prueba 6; Las microesferas producidas en el ejemplo de preparaci6n 2-2 se administraron por via subcutánea una vez (10 mglkg) 7 dias Iras la isquemia y reperfusi6n 4-VQ. Test group 6; The microspheres produced in preparation example 2-2 were administered subcutaneously once (10 mglkg) 7 days after ischemia and 4-VQ reperfusion.

Grupo de prueba 7: (uso para medición de la concentración en sangre) Las microesferas producidas en el ejemplo de preparación 2-2 se administraron por via subcutánea una vez (10 mglkg) justo después de la isquemia y reperfusión 4-VO (como en el grupo de prueba 3). Test group 7: (use for blood concentration measurement) The microspheres produced in preparation example 2-2 were administered subcutaneously once (10 mglkg) just after ischemia and 4-VO reperfusion (as in test group 3).

Tras 42 dias, se sometieran los cerebros de rata a perfusi6n y se fijaron, tras lo cual se tiñeron con Nissl las neuronas piramidales de las regiones CA1 del hipOCélmpo izquierda y derecha y se determinaron los números de neuronas en las regiones CAl del hipocampo (se contó el número de neuronas en 10 lugares en cada una de las regiones CA1a, CA1b y CA1c y en 20 lugares en los lados izquierdo y derecho usando un analizador de imágenes). los resultados se muestran en la tabla 19. After 42 days, the brains of the rat were perfused and fixed, after which the pyramidal neurons of the CA1 regions of the left and right hippocampus were stained with Nissl and the numbers of neurons in the CAl regions of the hippocampus were determined ( counted the number of neurons in 10 places in each of the regions CA1a, CA1b and CA1c and in 20 places on the left and right sides using an image analyzer). The results are shown in Table 19.

Como resultado, el grupo control (grupo de prueba 2) mostró una disminución significativa en el número de neuronas piramidales en CA 1 del hipocampo con respecto al grupo normal (grupo de prueba 1) Y se encontró que todos los grupos a los que se les administraron por vla subcutánea las microesferas de la Invención (grupos de prueba 3 a 6) tenian un número significativamente aumentado de neuronas piramidales en CAl del hipocampo con respecto al grupo control (grupo de prueba 2). As a result, the control group (test group 2) showed a significant decrease in the number of pyramidal neurons in CA 1 of the hippocampus with respect to the normal group (test group 1) and it was found that all the groups were administered subcutaneously the microspheres of the Invention (test groups 3 to 6) had a significantly increased number of pyramidal neurons in CAl of the hippocampus with respect to the control group (test group 2).

Tabla 19 Table 19

Grupo de prueba Test group

Número de neuronas or unidad de Ion itud recuentolmm Number of neurons Ion itud unit recuentolmm

Izquierda (l Left (l

Derecha R Right R

1 one

1753:1: 14.0 1797:1:118 1753: 1: 14.0 1797: 1: 118

2 2

91##:1:32 91##:1:2,9 91 ##: 1:32 91 ##: 1: 2.9

3 3

25,6"" :1: 14,0 28,7**:1: 15 9 25.6 "": 1: 14.0 28.7 **: 1: 15 9

4 4

341**:1:167 311**:1:245 341 **: 1: 167 311 **: 1: 245

5 5

47.2 :t 33 2 48. :t 38.3 47.2 : t 33 2 48.: t 38.3

6 6

47,7 :1:416 517 :1:417 47.7 : 1: 416 517: 1: 417

los valores en la tabla indican la media:l: desviadón estándar. the values in the table indicate the mean: l: standard deviation.

##: p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Aspin-Welch) ##: p <0.01 versus group 1 (Aspin-Welch t test)

*, ..: p < O,OS, p < 0,01 frente al grupo 2 (prueba de Dunnetl) *, ..: p <O, OS, p <0.01 against group 2 (Dunnetl test)

+, ++; p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 2 (prueba de la t de Aspin-Welch) +, ++; p <0.05, p <0.01 versus group 2 (Aspin-Welch t test)

A partir de los resultados anteriores. se confirm6 que una única administración subcutánea de las microesferas de la invención (grupos de prueba 3 a 6) tenia una excelente actividad de prevención de neuropatia y/o actividad de promoción de la regeneración de neuronas. Además, induso con una única administración subcutánea tras 7 dlas en el grupo 6, et número de neuronas aument6 significativamente con respecto al grupo 2, demostrando la presencia de una acción de promoción de la regeneración de neuronas. From the previous results. It was confirmed that a single subcutaneous administration of the microspheres of the invention (test groups 3 to 6) had excellent neuropathy prevention activity and / or neuron regeneration promotion activity. In addition, he used a single subcutaneous administration after 7 days in group 6, and the number of neurons increased significantly with respect to group 2, demonstrating the presence of a neuron regeneration promotion action.

2) Prueba de respuesta a evitación pasiva 2) Passive avoidance response test

Se usó un aparato de respuesta de evitación pasiva dE! tipo de paso a través (SHOCK SCRAMBLER. Takei Sclentlfic Instruments Co., lid.). El aparato tenia, divididas por una puerta de guillotina central, una sala iluminada (260 0N) x 110 (D) x 290 (H» y una sala a oscuras (320 0N) x 320 (O) x 340 (H» que confiere un estimulo eléctrico desde una A passive avoidance response device dE! type of pass through (SHOCK SCRAMBLER. Takei Sclentlfic Instruments Co., lid.). The device had, divided by a central guillotine door, an illuminated room (260 0N) x 110 (D) x 290 (H »and a dark room (320 0N) x 320 (O) x 340 (H» that confers an electrical stimulus from a

rejilla en el suelo. Se colocó una rata en la sala iluminada, se abrió silenciosamente la puerta de guillotina y se midió el tiempo que transcurrió desde que la rala examinó la apertura hasta que entró en la sala a oscuras (latencia de respuesta). En ruanto la rala entró en la sala a oscuras, se cerró la puerta de guillotina y se aplicó un estímulo eléctrico (1 mA, 3 s, método alealorizado). Esto constituyó un ensayo de adquisición, Se llevó a cabo el ensayo de adquisición dos días antes de la extirpación del cerebro:). Se llevó a cabo un ensayo de retención un día después del ensayo de aprendizaje. Como en el ensayo de adquisición, se colocó la rala en una sala iluminada, se abrió silenciosamente la puerta de guillotina y se midió el tiempo que transcurrió desde que la rata examinó la apertura hasta que entró en la sala a oscuras (latencia de respuesta). Se fijó la latencia de respuesta del ensayo de retención a un máximo de 600 segundos. A continuación en la tabla 20 se muestran los resuHados. grid on the floor. A rat was placed in the lighted room, the sash door was silently opened and the time elapsed since the rala examined the opening until it entered the room in the dark (response latency) was measured. As soon as the rala entered the room in the dark, the guillotine door was closed and an electrical stimulus was applied (1 mA, 3 s, randomized method). This constituted an acquisition trial. The acquisition test was carried out two days before the brain was removed :). A retention test was carried out one day after the learning trial. As in the acquisition trial, the rala was placed in an illuminated room, the sash door was silently opened and the time that elapsed since the rat examined the opening until it entered the room in the dark was measured (response latency) . The response latency of the retention test was set to a maximum of 600 seconds. The results are shown in Table 20 below.

Tabla 20 Table 20

Los valores en la tabla indican la media ± desviación estándar. The values in the table indicate the mean ± standard deviation.

#: p < 0,05 frente al grupo 1 (prueba de Witcoxon) #: p <0.05 versus group 1 (Witcoxon test)

*: p < 0,05 frente al grupo 2 (prueba de Wilcoxon) *: p <0.05 versus group 2 (Wilcoxon test)

El grupo de prueba 2 tenia, con respecto al grupo de prueba 1, una latencia de respuesta en el ensayo de retención acortada, lo que indica que había surgido una discapacidad de la memoria/aprendizaje. Por otro lado, los grupos de prueba 3 a 6 mostraron, con respecto al grupo de prueba 2, una latencia de respuesta en el ensayo de retención prolongada. En particular, el grupo de prueba 5 mostró una prolongación significativa en [a latencia de respuesta. Test group 2 had, with respect to test group 1, a response latency in the shortened retention test, indicating that a memory / learning disability had arisen. On the other hand, test groups 3 to 6 showed, with respect to test group 2, a response latency in the prolonged retention test. In particular, test group 5 showed a significant prolongation in [response latency.

Por tanto, las microesferas de la presente invención demostraron una actividad de prevenCión de neuropatla y/o una actividad de promoción de la regeneración de neuronas, y por lanto se confirmó que ayudaban en la recuperación funcional de neuropatía. Therefore, the microspheres of the present invention demonstrated a neuropathic prevention activity and / or a neuron regeneration promotion activity, and it was therefore confirmed that they helped in the functional recovery of neuropathy.

A partir de los resultados anteriores, con respecto a la administración subcutánea repetida del presente fármaco (prueba 1) Y a ta administración oral repetida del presente fármaco (prueba 2), se encontró que una única administración subcutánea de las microesferas de la invención (grupos de prueba 3 a 6) tenia, en cuanto a eficacia, seguridad, dosificación acumulativa del presente fármaco y cumplimiento con la dosis, excelentes actividades de prevención de neuropaUa y de promoción de la regen,eración de neuronas, y se confirmó la recuperación funcional de trastornos de la memoria y del aprendizaje. From the above results, regarding repeated subcutaneous administration of the present drug (test 1) And at repeated oral administration of the present drug (test 2), it was found that a single subcutaneous administration of the microspheres of the invention (groups Test 3 to 6) had, in terms of efficacy, safety, cumulative dosage of the present drug and dose compliance, excellent prevention activities of neuropaUa and promotion of the regen, eration of neurons, and the functional recovery of memory and learning disorders

3) Medición de la concentración en sangre 3) Blood concentration measurement

Usando muestras del grupo de prueba 7, la figura a muestra resultados que ilustran la cinética en sangre del presente fármaco. El procedimiento fue el mismo que el usado en el ejemplo 2. Using samples from test group 7, Figure a shows results illustrating the blood kinetics of the present drug. The procedure was the same as that used in example 2.

A partir de lo anterior se confirmó, en ratas 4-VO, que la concentración en sangre del presente fármaco se mantiene de manera continua en un intervalo de desde 0,1 hasta 10 ng/ml durante un periodO de cuatro semanas comenzando 24 horas tras una única administración subcutánea de las microesferas de la presente invención. From the above it was confirmed, in 4-VO rats, that the blood concentration of the present drug is maintained continuously in a range of from 0.1 to 10 ng / ml for a period of four weeks starting 24 hours after a single subcutaneous administration of the microspheres of the present invention.

lo anterior sugiere que las microesferas de la invención, dado que tienen una actividad de promoción de la regeneración de neuronas, son útiles para prevenir y/o tratar enfermedades de degeneración de los nervios, y particularmente ictus. The foregoing suggests that the microspheres of the invention, since they have a neuron regeneration promotion activity, are useful for preventing and / or treating degeneration diseases of the nerves, and particularly strokes.

Ejemplo 5 Influencia sobre la velocidad de conducción nerviosa en un modelo de diabetes inducida por STZ Example 5 Influence on nerve conduction velocity in a STZ-induced diabetes model

1) Preparación de animales para modelo de diabetes inducida por 8TZ 1) Preparation of animals for 8TZ-induced diabetes model

A ratas Sprague-Dawley hembra (de 8 a 11 semanas de edad; Japan SlC, Inc.) se les administraron por via intraperitoneal 40 mglkg de un tampón citrato (pH, aproximadamente 4,5) de estreptozotocina (8TZ; Sigma). A un grupo control normal sólo se le administró por vla intraperitoneal el tampOn citrato. Female Sprague-Dawley rats (8 to 11 weeks old; Japan SlC, Inc.) were given intraperitoneally 40 mglkg of a citrate buffer (pH, approximately 4.5) of streptozotocin (8TZ; Sigma). A normal control group was only administered intraperitoneally with the citrate buffer.

2) Medición de la glucemia 2) Blood glucose measurement

Dos semanas tras la administración de STZ, se midiemn la glucemia, la velocidad de conducción nerviosa y el peso corporal, se dividieron los animales en grupos de manera uniforme para estas propiedades, y se comenzó la administración de la sustancia de prueba. Para determinar el cambio a lo largo del tiempo en la glucemia, se midió el Two weeks after administration of STZ, blood glucose, nerve conduction velocity and body weight were measured, the animals were divided into groups evenly for these properties, and administration of the test substance was started. To determine the change over time in blood glucose, the

nivel de glucemia 4, 8 Y 12 semanas tras el inicio de la administración de la disolución de prueba (en el dia antes de la medición de la velocidad de conducción nerviosa). Se midió el nivel de glucemia de sangre extralda de la vena caudal usando un analizador de glucemia (Anlsense 11; Bayer-Sankyo). Tras la medición de la glucemia 12 semanas después, se privaron los animales de alimentos durante al menos 16 horas y se midieron el azucar y la insulina en sangre en ayunas. Ademas, se llevó a cabo una prueba de tolerancia a 2 9 de glucosa en la que se extrajo sangre de manera similar 30, 60 Y 120 minutos tras la carga con azúcar y se midieron los valores de azúcar e insulina en sangre. Blood glucose level 4, 8 and 12 weeks after the start of the administration of the test solution (on the day before the measurement of nerve conduction velocity). The level of blood glucose extracted from the caudal vein was measured using a blood glucose analyzer (Anlsense 11; Bayer-Sankyo). After the blood glucose measurement 12 weeks later, the animals were deprived of food for at least 16 hours and the fasting blood sugar and insulin were measured. In addition, a glucose tolerance test was carried out at 2 9 in which blood was similarly drawn 30, 60 and 120 minutes after loading with sugar and blood sugar and insulin values were measured.

3) Medición de la velocidad de conducción nerviosa 3) Nerve conduction velocity measurement

Dos semanas tras la administración de STZ, y 4, 6 Y 12 semanas tras el inicio de la administración de la disolución de prueba, se anestesiaron los animales medlanlo la administración intrapentoneal de 30 a 45 mglkg de pentobarbital. Se retiró pelo de la región dorsolumbar de la rata y se inmovilizó el animal en la posición deaJbilo prono, Iras lo cual se insertó un electrodo de aguja para la estimulación distal (NEC Medical Systems) cerca del nervio ciético, se insertó un electrodo de aguja para la estimulación proximal cerca del tendón de Aquiles en el mismo lado y se insertó un electrodo de aguja de registro (NEC Medical Systems) en el músculo plantar en el mismo lado. Tras comprobar que la temperatura corporal estaba en un intervalo 37 a 38°C, se aplicó una estimulación con ondas cuadradas (0,5 Hz, 0,1 mseg, tensión inferior a la méxima) a los electrodos de estimulación distal y proximal usando un estimulador eléctrico (SEN-3301; Nihon Kohden Corporation). Se condujo hacia fuera el potencial provocado a través de un electrodo de medición, se introdujo a través de un amplificador bioeléctrico (AB-621G, Nihon Kohden Corporatlon) a un programa de calculo del promedio de electromiograma provocado (MTS50061 C, Medical Try System) y se calculó el promedio diez veces, y se calculó la velocidad de conducción nerviosa a partir de los tiempos de conducción distal y proximal respectivos y las distancias de intervalos entre electrodos. Se llevó a cabo la medición en la pala izquierda (lado tratado) y 101 pata derecha (lado no tratado) en cada grupo de prueba y se usaron los valores promedio respectivos de las mismas como datos. Two weeks after the administration of STZ, and 4, 6 and 12 weeks after the start of the administration of the test solution, the animals were anesthetized while the intrapentoneal administration of 30 to 45 mglkg of pentobarbital was anesthetized. Hair was removed from the dorsolumbar region of the rat and the animal was immobilized in the prone right position, where a needle electrode for distal stimulation (NEC Medical Systems) was inserted near the sciatic nerve, a needle electrode was inserted for proximal stimulation near the Achilles tendon on the same side and a recording needle electrode (NEC Medical Systems) was inserted into the plantar muscle on the same side. After verifying that the body temperature was in a range 37 to 38 ° C, a stimulation with square waves (0.5 Hz, 0.1 msec, voltage below the maximum) was applied to the distal and proximal stimulation electrodes using a electric stimulator (SEN-3301; Nihon Kohden Corporation). The potential caused through a measuring electrode was conducted, introduced through a bioelectric amplifier (AB-621G, Nihon Kohden Corporatlon) to a calculation program of the average electromyogram caused (MTS50061 C, Medical Try System) and the average was calculated ten times, and the nerve conduction velocity was calculated from the respective distal and proximal conduction times and the interval distances between electrodes. Measurement was carried out on the left blade (treated side) and 101 right leg (untreated side) in each test group and their respective average values were used as data.

4) Método de agrupamiento 4) Clustering method

En los grupos 2 a 5, se midió el nivel de glucemia con alimentación dos semanas tras la administración de STZ. De las ratas con niveles de glucemia superiores a 300 mgldl, se excluyeron las ratas con diabetes intensa de las mismas y se usaron las ratas restantes como animales de modelo de diabetes. Se formaron grupos de tal manera que se prepararon los grupos respectivos de manera uniforme con respecto a la velocidad de conducción nerviosa, el nivel de glucemia y el peso corporal. In groups 2 to 5, the blood glucose level was measured with feeding two weeks after administration of STZ. Of rats with blood glucose levels greater than 300 mgldl, rats with severe diabetes were excluded from them and the remaining rats were used as diabetes model animals. Groups were formed in such a way that the respective groups were prepared uniformly with respect to nerve conduction velocity, blood glucose level and body weight.

5) Método de administración 5) Method of administration

Se llevó a cabo la administración segUn la vla prevista de administración para su uso dlnico. En el grupo de prueba 3, se llevó a cabo la administración forzada por via oral usando un cilindro de jeringa desechable y una sonda géSlrica para ratas. En el grupo de prueba 4, se nevó.3 cabo la administración intramuscular de manera uniforme en cuatro lugares dentro del músculo a lo largo del nervio ciétlco en la parte femoral de la pata izquierda. Para la administración subcuténea en el grupo de prueba 5, se anestesiaron los animales con éter y se llevó a cabo la administración subcutánea en la región dorsal usando un cilindro de jeringa desechable y una aguja de jeringa 25G desechable. Se calculó el volumen de disolución administrado baséndose en el Último peso corporal. The administration was carried out according to the planned administration route for its sole use. In test group 3, forced administration was carried out orally using a disposable syringe cylinder and a rat gastric probe. In test group 4, it was snowed.3 intramuscular administration was carried out uniformly in four places within the muscle along the cetthal nerve in the femoral part of the left leg. For subcutaneous administration in test group 5, the animals were anesthetized with ether and subcutaneous administration in the dorsal region was carried out using a disposable syringe barrel and a disposable 25G syringe needle. The volume of solution administered was calculated based on the Last body weight.

6) Grupos 6) Groups

A continuación en la tabla 21 se muestra la composición de los grupos. The composition of the groups is shown in Table 21 below.

Tabla 21 Table 21

Gru ode rueba 1 2 3 4 5 Gru ode rueba 1 2 3 4 5

Sustancia administrada normal (medio) Control de disolvente Presente fármaco Mlcroesferas producidas en el ejemplo de preparación 2-2 Microesferas producidas en el ejemplo de oreoaración 2·2 Dosis/método de administración O rnglkg (administración intramuscular Intermitente administr~~ una vez cada 3 semanas O rnglkg (administración intramuscular intermitente administrada una vez cada 3 semanaS} . 3 mglkg (administración ~~I repetida dos veces al dla 10 mglkg (administradón intramuscular intermitente administrada una vez cada 3 semanas) 10 mglkg (administración subcutánea Intermitente administrada una vez cada 3 semanas) Número de animales 10 10 10 10 10 Normal administered substance (medium) Solvent control Present drug Mlcropheres produced in the preparation example 2-2 Microspheres produced in the oreoaration example 2 · 2 Dosage / method of administration OR rnglkg (Intermittent intramuscular administration administered ~~ once every 3 weeks OR rnglkg (intermittent intramuscular administration administered once every 3 weeks)} 3 mglkg (administration ~~ I repeated twice a day 10 mglkg (intramuscular administration Intermittent administered once every 3 weeks) 10 mglkg (Intermittent subcutaneous administration administered once every 3 weeks) Number of animals 10 10 10 10 10

la cantidad de microesferas administrada indica la cantidad del presente férmaco ind uida. la cantidad de the amount of microspheres administered indicates the amount of the present drug induced. the amount of

microesferas que no contienen el presente fármaco en el grupo de prueba 2 fue la misma que la cantidad de microesferas administradas a los animales en los grupos de prueba 4 y 5. microspheres that do not contain the present drug in test group 2 was the same as the amount of microspheres administered to animals in test groups 4 and 5.

7) Transcurso en el tiempo del nivel de glucemia A continuación en la tabla 22 se muestra el cambio a lo largo del tiempo del nivel de gtucemia en cada grupo de prueba. 7) Time course of the blood glucose level Table 22 shows the change over time of the level of gtucemia in each test group.

Tabla 22 Table 22

lOA partir de los resultados en la tabla 22, el grupo de prueba 4 mostró una disminución significativa de la glucemia 10 Based on the results in table 22, test group 4 showed a significant decrease in blood glucose.

Los valores en la tabla indican la media ± desviación e:stándar. # , ##: p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Welch) ., •• : p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 2 (prueba de la t de Student) The values in the table indicate the mean ± standard deviation: standard. #, ##: p <0.05, p <0.01 against group 1 (Welch t test)., ••: p <0.05, p <0.01 against group 2 (test Student's t)

tras cuatro semanas con respecto al grupo de prueba 2. De manera similar, los grupos de prueba 4 y 5 mostraron disminuciones significativas de la glucemia tras 8 semanas y 12 semanas con respecto al grupo de prueba 2. No se observó una disminución significativa de la glucemia en ninguno de los momentos en el grupo de prueba 3. after four weeks with respect to test group 2. Similarly, test groups 4 and 5 showed significant decreases in blood glucose after 8 weeks and 12 weeks with respect to test group 2. There was no significant decrease in blood glucose at any time in the test group 3.

8) Velocidad de conducción nerviosa en el lado izquierdo (lado tratado con fármaco) 8) Nerve conduction velocity on the left side (drug treated side)

La tabla 23 a continuación muestra el transcurso a lo largo del tiempo para la velocidad de conducción nerviosa en la pata izquierda (lado tratado con fármaco en cuatro grupos) en los grupos de prueba respectivos. Table 23 below shows the course over time for the nerve conduction velocity in the left leg (drug treated side in four groups) in the respective test groups.

Tabla 23 Table 23

Grupo de prueba Test group

Velocidad de conducción nerviosa mis) Mis nerve conduction velocity

1 2 1 2

°semanas 42 3±53 37,B ±51 4-semanas 424± 39 387#± 32 B semanas 426±37 38 6## ± 3,0 12 semanas 493±29 412#±1,B ° weeks 42 3 ± 53 37, B ± 51 4-week 424 ± 39 387 # ± 32 B weeks 426 ± 37 38 6 ## ± 3.0 12 weeks 493 ± 29 412 # ± 1, B

3 4 3. 4

375±8,0 37,1 ± 5,4 :378±38 :~9 8 ± 3,6 40,8±34 43,4.... ± 3 6 431*±19 46,2** ± 2,2 375 ± 8.0 37.1 ± 5.4 : 378 ± 38: ~ 9 8 ± 3.6 40.8 ± 34 43.4 ... ± 3 6 431 * ± 19 46.2 ** ± 2.2

5 5

353±4,5 :379±27 417*±2 7 442*" ±2 1 353 ± 4.5 : 379 ± 27 417 * ± 2 7 442 * "± 2 1

Los valores en la tabla indican la media ± desviación e:stándar. The values in the table indicate the mean ± standard deviation: standard.

#, ##: p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Student) #, ##: p <0.05, p <0.01 versus group 1 (Student's t test)

., .*: p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 2 (prueba de la t de Student) .,. *: p <0.05, p <0.01 versus group 2 (Student's t test)

A partir de los resultados en la tabla 23, el grupo de prueba 2 mostró una disminución significativa de la velocidad de conducción nerviosa tras 4 semanas, B semanas y 12. semanas con respecto al grupo de prueba 1, confirmando la aparición de neuropaUa diabética. En cambio, los grupos de prueba 4 y 5 mostraron aumentos significativos en la velocidad de conducción nerviosa tras 8 semanas con respecto al grupo de prueba 2, y los 9rUPOS de prueba 3, 4 Y 5 mostraron aumentos significativos de la velocidad de conducción nerviosa tras 12 semanas con respecto al grupo de prueba 2, aunque este ültimo efecto fue mejor en los grupos de prueba 4 y 5 que en el grupo de prueba 3. Estos resultados demuestran la utilidad del efecto de mantenimiento de la concentración de fármaco en sangre. Tras 8 semanas y 12 semanas, el efecto de aumento de la velocidad de conducción nerviosa en el grupo de prueba 4 fue mejor que en el grupo de prueba 5, confirmando que la administración local en el sitio de enfermedad es más ülil que la administración sistémica. From the results in table 23, test group 2 showed a significant decrease in nerve conduction velocity after 4 weeks, B weeks and 12. weeks with respect to test group 1, confirming the occurrence of diabetic neuropaa. In contrast, test groups 4 and 5 showed significant increases in nerve conduction velocity after 8 weeks with respect to test group 2, and test groups 3, 4 and 5 showed significant increases in nerve conduction velocity after 12 weeks with respect to test group 2, although this last effect was better in test groups 4 and 5 than in test group 3. These results demonstrate the usefulness of the maintenance effect of blood drug concentration. After 8 weeks and 12 weeks, the effect of increased nerve conduction velocity in test group 4 was better than in test group 5, confirming that local administration at the disease site is more useful than systemic administration. .

9) Velocidad de conducción nerviosa en el lado derecho ~ado no tratado con fármaco) 9) Nerve conduction velocity on the right side ~ not treated with drug)

la tabla 24 a continuación muestra el transcurso a lo largo del tiempo para la velocidad de conducción nerviosa en la pala derecha (lado no tratado con fármaco) en los grupos de prueba respeclivos. Table 24 below shows the course over time for the nerve conduction velocity in the right blade (side not treated with drug) in the respective test groups.

Tabla 24 Table 24

Grupo de prueba VeloGidad de conducción nerviosa (mIs) Nerve conduction velocity test group (mIs)

1 one

o semanas 43,2±46 4 semanas 46,5±78 8 semanas 429±29 12 semanas 480±29 or weeks 43.2 ± 46 4 weeks 46.5 ± 78 8 weeks 429 ± 29 12 weeks 480 ± 29

2 3 2. 3

382#±45 38,7 ± 5,0 394# ± 3,0 ~!9 O± 2,3 377##±30 399±2,2 405#±3,1 413±2,1 382 # ± 45 38.7 ± 5.0 394 # ± 3.0 ~! 9 O ± 2.3 377 ## ± 30 399 ± 2.2 405 # ± 3.1 413 ± 2.1

4 5 Four. Five

386±63 36,5 ± 3,8 ~!94±37 ~!9,3± 4,3 408·±31 41,0· ± 3,1 417±3,2 438-±1,9 386 ± 63 36.5 ± 3.8 ~! 94 ± 37 ~! 9.3 ± 4.3 408 ± 31 41.0 ± 3.1 417 ± 3.2 438- ± 1.9

lOA partir de estos resultados, la administración intermitente de las microesferas de la invención proporcionó una From these results, intermittent administration of the microspheres of the invention provided a

los valores en la tabla indican la media ± desviación estándar. the values in the table indicate the mean ± standard deviation.

#, ##: p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Student) #, ##: p <0.05, p <0.01 versus group 1 (Student's t test)

--

: p < 0,05 frente al grupo 2 (prueba de la t de Student) : p <0.05 versus group 2 (Student's t test)

A partir de los resultados en la tabla 24, el grupo de prueba 2 mostró una disminución significativa de la velocidad de conducción nerviosa tras O semanas, 4 semanas, 8 ~;emanas y 12 semanas con respecto al grupo de prueba 1, confirmando la apariCión de neuropalla diabética. En cambio, los grupos de prueba 4 y 5 mostraron tendenCias de aumento significativas de la velocidad de conducción nerviosa tras 8 semanas y 12 semanas con respecto al grupo de prueba 2, siendo los efectos sustancialmente iguélles en ambos (grupos 4 y 5). No se confirmó un efecto de prolongación significativo en ninguno de los momentos en el grupo de prueba 3. From the results in table 24, test group 2 showed a significant decrease in nerve conduction velocity after O weeks, 4 weeks, 8 ~; weeks and 12 weeks with respect to test group 1, confirming the appearance of diabetic neuropalla. In contrast, test groups 4 and 5 showed significant increases in nerve conduction velocity after 8 weeks and 12 weeks with respect to test group 2, the effects being substantially equal in both (groups 4 and 5). No significant prolongation effect was confirmed at any time in test group 3.

cinética en sangre continua con respecto a la administración oral repetida dos veces al día en el grupo de prueba 3, y por tanto se confirmó que era útil en cuanto a eficacia, seguridad, dosificación total y cumplimiento con la dosis. Además, en la administración intermitente de las microesferas de la invención, dado que la inyección intramuscular en el sitio de enfermedad (grupo de prueba 4) era más eficaz que la administración sistémica por vla subcutánea en la región dorsal (grupo de prueba 5). se confirmó lél utilidad de mantener una alta concentración del presente fármaco en el sitio de enfermedad. Continuous blood kinetics with respect to repeated oral administration twice a day in test group 3, and therefore it was confirmed to be useful in terms of efficacy, safety, total dosage and dose compliance. In addition, in intermittent administration of the microspheres of the invention, since intramuscular injection at the disease site (test group 4) was more effective than systemic administration by subcutaneous use in the dorsal region (test group 5). The utility of maintaining a high concentration of the present drug at the disease site was confirmed.

10) Acción de mejora de la nefropatía 10) Nephropathy improvement action

En la semana 12 desde el inicio de la administración de la sustancia de prueba, se transfirieron las ratas a una jaula metabólica, se les administró agua a voluntad y se recogió la orina durante 24 horas. Tras la medición de la descarga urinaria, se centrifugó la orina (1500 rpm, 25°C, 10 minutos) con una centrifugadora y se recogió el sobrenadante. Usando el analizador clínico 7170 (Hita.chi, Lid.), se midieron las proteínas urinarias totales (método de rojo de pirogalol), creatinina (método de creatinasa/F-DAOS) y azúcar en orina. La tabla 25 a continuación muestra la descarga urinaria total, la creatinina en orina total, las protelnas totales y la excreción de glucosa calculada a partir de los resultados medidos (concentra.ciones). In week 12 from the start of the administration of the test substance, the rats were transferred to a metabolic cage, water was administered at will and urine was collected for 24 hours. After measuring the urinary discharge, the urine was centrifuged (1500 rpm, 25 ° C, 10 minutes) with a centrifuge and the supernatant was collected. Using the 7170 clinical analyzer (Hita.chi, Lid.), Total urinary proteins (pyrogallol red method), creatinine (creatinase / F-DAOS method) and urine sugar were measured. Table 25 below shows the total urinary discharge, creatinine in total urine, total proteins and glucose excretion calculated from the measured results (concentrations).

Tabla 25 Table 25

Grupo total Total group

Excreción total (mg!24 h) Total excretion (mg! 24 h)

Glucosa Glucose

Creatinina Protelnas totales Creatinine Total proteins

1 one

32±28 8031 ±5765 26,5 ± 26 7 32 ± 28 8031 ± 5765 26.5 ± 26 7

2 2

139397## ± 86550 14705## ± 137 74 2169#±3706 139397 ## ± 86550 14705 ## ± 137 74 2169 # ± 3706

3 3

111174 ± 40497 11676 ±5815 2457±2319 111174 ± 40497 11676 ± 5815 2457 ± 2319

4 4

114850 ± 54081 9926±4991 104 O ±40 7 114850 ± 54081 9926 ± 4991 104 O ± 40 7

5 5

124280 ± 50604 156,92 ± 135,34 169,6 ± 150,2 124280 ± 50604 156.92 ± 135.34 169.6 ± 150.2

los valores en la tabla indican la media ± desviación estándar. the values in the table indicate the mean ± standard deviation.

#, ##: p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Aspin-Welch) #, ##: p <0.05, p <0.01 versus group 1 (Aspin-Welch t test)

A partir de los resullados en la labia 25, la glucosa en orina, la creatinina y las proteínas tolales aumentaron en el grupo de prueba 2 con respecto al grupo de prueba '1, 10 que indica la apariCión de nefropaUa diabética. Por otro lado, en los grupos de prueba 4 y 5, se observaron tendencias de disminución en la creatinina en orina total, azUcar y excreción de proteínas totales con respecto al grupo de prueba 2, lo que indica una tendencia de mejora en la función renal. From those found in labia 25, urine glucose, creatinine and tolar proteins increased in test group 2 with respect to test group '1, 10 which indicates the appearance of diabetic nephropathy. On the other hand, in test groups 4 and 5, trends of decrease in total urine creatinine, sugar and total protein excretion with respect to test group 2 were observed, indicating a trend of improvement in renal function .

11) Prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) 11) Oral glucose tolerance test (OGTT)

Trece semanas tras el inicio de la administración de la sustancia de prueba, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGIT) con ratas sometidas a ayunas durante 18 horas. Tras extraer sangre de la vena caudal de las ratas en ayunas, se alimentaron a fuerza por via oral 2 g1kg de glucosa. Se extrajeron de manera similar aproximadamente 500 ~I de sangre de la vena caudal :30. 60 y 120 minutos tras la administración de glucosa. de los cuales aproximadamente 400 j.ll se trataron con EDTA··2Na, después se centrifugaron (3.000 rpm, 4°C, 10 min.) con una centrifugadora. De este modo se recogió el plasma y se midió la glucemia usando un analizador dinico 7170 (Hitachi, Lid.). Se centrifugaron los aproximadamente 'IDO ~I restantes de sangre (3.000 rpm, 4°C, 10 min.) con una Thirteen weeks after the start of the administration of the test substance, an oral glucose tolerance test (OGIT) was performed with fasting rats for 18 hours. After extracting blood from the caudal vein of the fasting rats, 2 g1kg of glucose was force fed orally. Approximately 500 ~ I of blood was drawn from the caudal vein: 30. 60 and 120 minutes after glucose administration. of which approximately 400 j.ll were treated with EDTA ·· 2Na, then centrifuged (3,000 rpm, 4 ° C, 10 min.) with a centrifuge. In this way the plasma was collected and the blood glucose measured using a 7170 dynamic analyzer (Hitachi, Lid.). The remaining 'IDO ~ I of blood (3,000 rpm, 4 ° C, 10 min.) Was centrifuged with a

centrifugadora, se recogió el suero y se midió el nivel de insulina (método de ElISA; kit de insulina de Levis (Shibayagi Ca., lid)). La tabla 26 a continuación muestra los resultados de la medición de insulina. centrifuge, serum was collected and insulin level was measured (ElISA method; Levis insulin kit (Shibayagi Ca., lid)). Table 26 below shows the results of insulin measurement.

Tabla 26 Table 26

Los valores en la tabla indican la media ± desviación e$tándar. ##: p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Student) +: p < 0,1 frente al grupo 2 (prueba de la t de Student) A partir de los resuhados en la tabla 26, el grupo de prueba 2 mostró una disminución significativa del nivel de The values in the table indicate the mean ± deviation e $ tandar. ##: p <0.01 versus group 1 (Student's t test) +: p <0.1 versus group 2 (Student's t test) From the results in table 26, test group 2 showed a significant decrease in the level of

insulina con respecto al grupo de prueba 1. Por otro lado, el grupo de prueba 4 mostró una tendencia de aumento significativa en el nivel de insulina con respecto al grupo de prueba 2, lo que confirma un efecto de promoción de la slntesis y secreción de insulina. insulin with respect to test group 1. On the other hand, test group 4 showed a trend of significant increase in insulin level with respect to test group 2, which confirms an effect of promoting the synthesis and secretion of insulin.

12) Influencia sobre el peso corporal Se midieron los pesos corporales de las ratas antes de la administración de la sustancia de prueba y 14 semanas 12) Influence on body weight Rats body weights were measured before administration of the test substance and 14 weeks

tras el inicio de la administración de la sustancia de prueba. A continuación en la tabla 27 se muestran los resuhados. Tabla 27 after the start of the administration of the test substance. The table below shows the results. Table 27

Grupo de prueba 1 2 3 4 5 Test group 1 2 3 4 5

O semanas 238,2 ± ·15,3 2312±·142 2191 ± ·12,2 2297±92 230,4 ± ·11,5 Peso ca ,., 14 semanas 307,3 ± 19 7 2521## ± 24 9 2247" ± 27,8 2435±253 252,8 ± 27 7 O weeks 238.2 ± · 15.3 2312 ± · 142 2191 ± · 12.2 2297 ± 92 230.4 ± · 11.5 Ca weight ,., 14 weeks 307.3 ± 19 7 2521 ## ± 24 9 2247 "± 27.8 2435 ± 253 252.8 ± 27 7

Los valores en la tabla indican la media ± desviación e:stándar. The values in the table indicate the mean ± standard deviation: standard.

##: p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Student) ##: p <0.01 versus group 1 (Student's t test)

": p < 0,05 frente al grupo 2 (prueba de la t de Student) ": p <0.05 versus group 2 (Student's t test)

A partir de los resultados en la tabla 27, en la semana 14 tras el inicio de la administración, el peso corporal en el grupo de prueba 2 mostró una disminución significativ~1 con respecto al grupo de prueba 1. Por otro lado, el grupo de prueba 3 muestra una disminución de peso significativa con respecto al grupo de prueba 2, pero dado que los grupos de prueba 4 y 5 fueron aproximadamente iguales al grupo de prueba 2, se confirmó que las microesferas de la invención no tenlan ninguna influencia sobre el peso corporal. From the results in table 27, at week 14 after the start of administration, body weight in test group 2 showed a significant decrease ~ 1 with respect to test group 1. On the other hand, the group of test 3 shows a significant decrease in weight with respect to test group 2, but since test groups 4 and 5 were approximately equal to test group 2, it was confirmed that the microspheres of the invention have no influence on the body weight.

Los resultados anteriores demuestran que las microesferas de la presente invención no tienen ninguna influencia sobre el peso corporal y, en la administración intramuscular intermitente y la administraciOn subcutánea en la regiOn dorsal una vez cada tres semanas, muestran una di$minuciÓll del nivel de glucemia durante la alimentaciÓll y un efecto de elevación de la bioslntesis/secreción de insulina, debido a una acciÓn de promoción de la regeneración de The above results demonstrate that the microspheres of the present invention have no influence on body weight and, in intermittent intramuscular administration and subcutaneous administration in the dorsal region once every three weeks, show a di- minution of the blood glucose level during the feeding and an effect of elevation of insulin biosynthesis / secretion, due to an action promoting the regeneration of

células ~ pancreáticas, durante la carga con glucosa. Además, en la administración subcutánea y por inyección intramuscular de las microesferas de la presente invEmción, se observó una acción de mejora de la velocidad de conducción nerviosa significativa. Se encontró que la administración intramuscular en el sitio de enfermedad era más eficaz, y se confirmó que era eficaz frente a neuropatia diabética. Además, se mostró que las microesferas de la presente invención eran eficaces frente a nefropatia diabética reduciendo la creatinina en orina y la excreción de protelnas totales. Las disminuciones de los niveles dE1 glucemia observadas en estos resultados fueron efectos de un grado que no muestran acciones de mejora de la nefropatla o mejora de la velocidad de conducción nerviosa significativas. ~ pancreatic cells, during loading with glucose. In addition, in the subcutaneous and intramuscular injection of the microspheres of the present invention, a significant nerve conduction velocity improvement action was observed. Intramuscular administration at the disease site was found to be more effective, and it was confirmed to be effective against diabetic neuropathy. In addition, it was shown that the microspheres of the present invention were effective against diabetic nephropathy by reducing creatinine in urine and excretion of total proteins. The decreases in blood glucose levels observed in these results were effects of a degree that show no actions to improve nephropathy or improve nerve conduction velocity.

Aplicabilidad industrial Industrial applicability

Dado que las microesferas de la presente invención tienen un periodo de liberación lenta de aproximadamente dos semanas a aproximadamente cuatro semanas Iras la administración, permiten que se incluya un contenido del presente fármaco superior, suprimen una ráfaga inicial del presente fármaco y permiten que la concentración en sangre de este fármaco se mantenga en un intervalo adecuado para que se manifiesten los efectos del fármaco, estas microesferas son útiles para la prevención y/o el tratamiento de ASO, infarto de miocardio, angina, ictus, diabetes y complicaciones de la misma, insuficiencia n~al, fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, asma, OA, AR Y osteoporosis, elc. Since the microspheres of the present invention have a slow release period of about two weeks to about four weeks after administration, they allow a higher content of the present drug to be included, suppress an initial burst of the present drug and allow the concentration in blood of this drug is maintained in an adequate range for the effects of the drug to manifest, these microspheres are useful for the prevention and / or treatment of ASO, myocardial infarction, angina, stroke, diabetes and complications thereof, insufficiency n ~ al, pulmonary fibrosis, pulmonary hypertension, asthma, OA, RA and osteoporosis, elc.

Claims (12)

REIVINDICACIONES ,. . 2. 2. 3. 3.

4. Four.

5. 5.

6. 6. 7. 7. Microesfera de acción prolongada de dos a cualro semanas, que comprende ácido ({5-[2-{{[{1E)fenil(piridin-3-il)metilen]amino}oxi)etil)-7,8-dihidronaflalen-1-il}oxi)acético o su sal como fármaco y un copollmero de ácido láctico/ácido glic6lico, en la que Two-week long-acting microsphere comprising ({5- [2 - {{[{1E) phenyl (pyridin-3-yl) methylene] amino} oxy) ethyl) -7,8-dihydronaflalen-1 acid -il} oxy) acetic acid or its salt as a drug and a copolymer of lactic acid / glycolic acid, in which

(i) (i)

una cantidad de copolimero de ácido láctio::l/ácido glicólico en partes en peso del fármaco es de desde 3 hasta 10 partes en peso, an amount of lactic acid :: l / glycolic acid copolymer in parts by weight of the drug is from 3 to 10 parts by weight,

(ii) (ii)

la microesfera tiene un tamaño de particula promedio de desde 20 hasta 50 ~m, y (jji) el copolimero de ácido láctico/ácido glic:ólico tiene un peso molecular promedio en peso de desde the microsphere has an average particle size of from 20 to 50 ~ m, and (jji) the lactic acid / glycol acid copolymer: acrylic has a weight average molecular weight of from

10.000 hasta SO.OOO y una razón de composición de ácido láctico/ácido gliOOlico de desde 75125 hasta 50/SO, 10,000 to SO.OOO and a composition ratio of lactic acid / glycolic acid from 75125 to 50 / SO, y que satisface al menos una de las siguienteB condiciones (1) a (2): and that satisfies at least one of the following B conditions (1) to (2):

(1) (one)

una razón reslante del fármaco tras una hora en una prueba de liberación es de al menos el 90%; a drug reason after one hour in a release test is at least 90%;

(2) (2)

una razón reslante del fármaco tras un dia en una prueba de liberación es de al menos el 82%. A drug reason after a day on a release test is at least 82%.

Microesfera según la reivindicación 1, en la que el contenido de copollmem de ácido láctico/ácido glicólico en partes en peso del fármaco es de desde 4 hasta 8 partes en peso. Microesfera según la reivindicación 1, en la que la microesfera tiene un tamaño de partlcula promedio de Microsphere according to claim 1, wherein the lactic acid / glycolic acid copollmem content in parts by weight of the drug is from 4 to 8 parts by weight. Microsphere according to claim 1, wherein the microsphere has an average particle size of desde 25 hasta 35 ~m. from 25 to 35 ~ m. Microesfera según la reivindicación 1, en la Que la razón de copollmero de ácido láctico/ácido glic6lico es de 50/SO. Microesfera según la reivindicación 1, en la que la concentración en sangre del fármaco es de desde Microsphere according to claim 1, wherein the ratio of copolymer of lactic acid / glycolic acid is 50 / SO. Microsphere according to claim 1, wherein the blood concentration of the drug is from 0,01 ng/ml hasta 150 ng/ml. Microesfera de acción prolongada de dos semanas según la reivindicación 1, en la Que 0.01 ng / ml to 150 ng / ml. Two week long acting microsphere according to claim 1, in which

(l) (l)

una cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido gliOOlioo en partes en peso del fármaco es de desde 4 hasta 8 partes en peso, an amount of copolymer of lactic acid / gliOOlioo acid in parts by weight of the drug is from 4 to 8 parts by weight,

(ii) (ii)

la microesfera tiene un tamaño de partfculEI promedio de desde 25 hasta 35 ~m, y The microsphere has an average particle size of from 25 to 35 ~ m, and

(iii) el copolímero de ácido láctico/ácido glicólico tiene un peso molecular promedio en peso de desde (iii) the lactic acid / glycolic acid copolymer has a weight average molecular weight of from 10.000 hasta 30.000 y una razón de composición de ácido láctico/ácido gliOOlico de SO/SO, y Que satisface la siguiente condición (1): 10,000 to 30,000 and a composition ratio of lactic acid / glycolic acid of SO / SO, and that satisfies the following condition (1):

(1) (one)

una razón restante del fármaco tras una hc)ra en una prueba de liberación es de al menos el 90%. Microesfera de acción prolongada de cuatro sl~manas según la reivindicación 1, en la que A remaining ratio of the drug after one hc) ra in a release test is at least 90%. Long-acting microsphere of four slides according to claim 1, in which

(i) (i)

una cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido glic6lico en partes en peso del fármaco es de desde 4 hasta 8 partes en peso, an amount of lactic acid / glycolic acid copolymer in parts by weight of the drug is from 4 to 8 parts by weight,

(li) (li)

la microesfera tiene un tamaño de partlcula promedio de desde 25 hasta 35 ~m, y the microsphere has an average particle size of from 25 to 35 ~ m, and

(iii) el copolímero de ácido láctico/ácido glicólico tiene un peso molecular promedio en peso de desde (iii) the lactic acid / glycolic acid copolymer has a weight average molecular weight of from 30.000 hasta SO.OOO y una razón de composic.ión de ácido láctioolácido glioolioo de 50/50, y Que satisface la siguiente condición (1): 30,000 to SO.OOO and a composition ratio of lactoiolacid acid glyoolioo of 50/50, and which satisfies the following condition (1): (1) una razón restante del fármaco tras un dia en una prueba de liberación es de al menos el 82%. (1) a remaining ratio of the drug after one day in a release test is at least 82%. Agente Que comprende la microesfera segC¡n la reivindicación 1 para su uso en la prevención y/o el Agent comprising the microsphere according to claim 1 for use in prevention and / or tratamiento de arteriosclerosis oblilerante (ASO), enfermedad de Buerger, enfermedad de Raynaud, arteriosclerosis, linfedema, infarto de miocardio, angina, taquiarritmia ventricular, insuficiencia cardiaca congestiva, arteriopatla coronaria, cardiomiol)8!ia idiopática, cardiomiopalla dilatada, fibrilación auricular, miocarditis, encefalopalia isquémica, accide.ntes cerebrovasculares, lctus, infarto cerebral, hemorragia treatment of oblique arteriosclerosis (ASO), Buerger's disease, Raynaud's disease, arteriosclerosis, lymphedema, myocardial infarction, angina, ventricular tachyarrhythmia, congestive heart failure, coronary arteriopathy, cardiomyol) 8! idiopathic, dilated cardiomyopalla, atrial fibrillation, myocardial Ischemic encephalopalia, cerebrovascular accidents, lctus, cerebral infarction, hemorrhage 8. 8. cerebral. enfermedad de Par1tinson, enfermedad de Alzheimer, neuropatia diabética, estenosis del conduclo vertebral, demencia, enfermedad de moyamoya, lesiones de la médula espinal, esclerosis lateral amiolrófica (ELA), aneurisma cerebral, neurnonia aguda, fibrasis pulmonar. hipertensión pulmonar, enfermedad pulmonar obslructiva crOnica (EPOC), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), s lesión pulmonar aguda (LPA), síndrome de dificultad respiratoria aguda (SORA), sarcoidosis, neumonla intersticial, neumonitis por hipersensibilidad, asma, osleoartritis (OA) de las vertebras o fa rodilla, artritis reumatoide (ARl, osteoporosis. fractura ósea, osteonecrosis, lesión perióslica. terapia de regeneración del esternón asociada con cirugía cardiopulmonar, hepatitis fulminante, hepatitis aguda. cirrosis, hepatitis crónica, hlgado graso, insuficiencia renal aguda, trastomo renal isquémlco, slndrome de aplastamIento, 10 insuficiencia renal cr6nica. enfermedad glomerular, glomerulonefritis, nefroesderosis, glomerulonefritis proliferativa, enfermedad tubulointersticial, trastornos renovasculares. enfermedad renal quistica. nefropatla tóxica, anomatras en el transporte tubular, trastornos renales en pacientes sometidos a diálisis, nefropatla, diabetes. panereatilis crónica, panereat;tis Elguda, esofagitis, gastritis, ulcera gástrica, úlcera duodenal, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, trasplante de corazÓn, IS trasplante de hlgado, trasplante de riMn, trasplante de pulmón, trasplante de páncreas, trasplante de colgajo miocutáneo, trasplante de es6fago, 1rasplante de piel, trasplante de vasos sanguíneoslfinfátlcos, trasplante de células madre hemalopoyética~s, trasplante de huesos/cartflagos , trastomos de los nervios, nefropalJa. reeslenosis tras ACTP (angioplastia coronaria transluminal percutánea), enfermedad periodontal, heridas por extracción de dientes, heridas de la cavidad bucal. trastornos de tejido 6seo cerebral. Par1tinson's disease, Alzheimer's disease, diabetic neuropathy, vertebral duct stenosis, dementia, moyamoya disease, spinal cord injuries, amylophrophic lateral sclerosis (ALS), cerebral aneurysm, acute neurononia, pulmonary fibersis. pulmonary hypertension, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), systemic inflammatory response syndrome (SRIS), acute lung injury (APL), acute respiratory distress syndrome (SORA), sarcoidosis, interstitial pneumonia, hypersensitivity pneumonitis, asthma, osleoarthritis ( OA) of the vertebrae or knee, rheumatoid arthritis (ARl, osteoporosis. Bone fracture, osteonecrosis, periodical injury. Sternum regeneration therapy associated with cardiopulmonary surgery, fulminant hepatitis, acute hepatitis. Cirrhosis, chronic hepatitis, fatty liver, renal failure acute, ischemic renal disorder, crush syndrome, 10 chronic renal failure, glomerular disease, glomerulonephritis, nephrosderosis, proliferative glomerulonephritis, tubulointerstitial disease, renovascular disorders, cystic kidney disease, toxic nephropathy, anomatras in tubular transport, renal disorders in patients undergoing dialysis, nephropathy, diabetes, chronic panereatilis, panereat; tis Elguda, esophagitis, gastritis, gastric ulcer, duodenal ulcer, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, Crohn's disease, heart transplant, IS liver transplant, kidney transplant, lung transplant, transplant of pancreas, myocutaneous flap transplant, esophageal transplant, 1 skin transplant, blood vessel transplantation, lymph nodes, hemalopoietic stem cell transplantation, bone / cartilage transplantation, nerve disorders, nephropalJa. re-lelenosis after PTCA (percutaneous transluminal coronary angioplasty), periodontal disease, tooth extraction wounds, oral cavity wounds. 6seo tissue disorders 20 periodontal. periodontitis, úlceras de decúbno, enfermedad de alopecia. alopecia areata, úlceras cutáneas, glaucoma, sordera, sordera neurosensorial, fallo multiorgánico (FMO), enfermedades alérgicas o enfermedad del colágeno. 20 periodontal. periodontitis, decubal ulcers, alopecia disease. alopecia areata, skin ulcers, glaucoma, deafness, sensorineural deafness, multiorganic failure (FMO), allergic diseases or collagen disease. 9. Agente según la reivindicación 8. para su uso en la prevención y/o el tratamiento de infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, cardíomiopatia dilatadEI. miocarditis, hipertensi6n pulmonar, asma, insuficiencia renal 9. Agent according to claim 8. for use in the prevention and / or treatment of myocardial infarction, heart failure, dilated cardiomyopathy. myocarditis, pulmonary hypertension, asthma, renal failure 2S crónica, trasplante de corazón, trasplante dl~ vasos sanguíneosJlinfálicos o trasplante de células madre hematopoyéticas. Chronic 2S, heart transplant, liver transplant, lymphatic blood vessels or hematopoietic stem cell transplantation.