ES2446292T3

ES2446292T3 - Tratamiento del accidente cerebrovascular y otras enfermedades sin inhibir los canales de calcio de tipo N

Info

Publication number: ES2446292T3
Application number: ES08726313.3T
Authority: ES
Inventors: Michael P. Belmares; Jonathan David Garman; Peter S. Lu; Michael W. Salter; Michael Tymianski
Original assignee: NoNO Inc; Arbor Vita Corp
Current assignee: NoNO Inc; Arbor Vita Corp
Priority date: 2007-03-02
Filing date: 2008-02-29
Publication date: 2014-03-07
Anticipated expiration: 2028-02-29
Also published as: CA2679831A1; CN101678068A; CN101678068B; EP2120987B1; WO2008109010A1; AU2008223469B2; DK2120987T3; CA2679831C; US9061070B2; JP2010520209A; US20130172230A1; JP5631595B2; US20080274977A1; AU2008223469A1; EP2120987A1; EP2120987A4; US8288345B2

Abstract

Un péptido quimérico aislado, en donde el péptido quimérico comprende un péptido activo que inhibe la unión dePSD-95 a un receptor de NMDA y un péptido de internalización que promueve la absorción del péptido quimérico enlas células y tiene una capacidad reducida para unirse a un canal de calcio de tipo N con respecto al péptido tatYGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1), en donde el péptido activo tiene una secuencia de aminoácidos que comprende[T/S]-X[V/L] (SEQ ID NO: 14), opcionalmente, [E/D/N/Q]-[S/T]-[D/E/Q/N]-[V/L] (SEQ ID NO: 5) y el péptido deinternalización tiene una secuencia de aminoácidos que comprende XGRKKRRQRRR (SEC ID NO: 2), en donde Xes un aminoácido distinto de Y o nada.

Description

Tratamiento del accidente cerebrovascular y otras enfermedades sin inhibir los canales de calcio de tipo N

Antecedentes de la invención

Se prevé que el accidente cerebrovascular afectará a más de 600.000 personas al año en los Estados Unidos. En un informe de 1999, más de 167.000 personas murieron a causa de apoplejía, con una mortalidad total de 278.000. En 1998, se pagaron 3,6 millardos solo a los beneficiarios de Medicare que fueron dados de alta de los hospitales de corta estancia, sin incluir la atención a largo plazo para >1.000.000 personas, que al parecer tienen limitaciones funcionales o dificultad con las actividades de la vida diaria como resultado de un accidente cerebrovascular (Heart and Stroke Stadistical Update, American Heart Association, 2002). No se ha aprobado ningún agente terapéutico que reduzca el daño cerebral resultante de accidente cerebrovascular a través de la protección directa de la muerte de las neuronas.

El accidente cerebrovascular se caracteriza por la muerte de las células neuronales en zonas de isquemia, hemorragia cerebral y/o trauma. La muerte celular se desencadena por la sobreexcitación con glutamato de las neuronas, lo que lleva a un aumento de Ca2 intracelular y a un aumento del óxido nítrico debido a un aumento en la actividad de la nNOS (óxido nítrico sintasa neuronal).

El glutamato es el principal neurotransmisor excitador en el sistema nervioso central (SNC) y media la neurotransmisión a través de la mayoría de las sinapsis excitadoras. Tres clases de receptores de canales de iones regulados por glutamato (N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiónico (AMPA) y kainato) transducen la señal postsináptica. De estos, los receptores de NMDA (NMDAR) son responsables de una parte significativa de la excitotoxicidad del glutamato. Los receptores de NMDA son complejos que tiene una subunidad NR1 y una o más subunidades NR2 (2A, 2B, 2C o 2D) (véase, p. ej., McDain, C. y Caner, M. (1994) Physiol. Rev. 74:723-760), y con menos frecuencia, una subunidad NR3 (Chatterton et al. (2002) Nature 415:793798). Se ha demostrado que las subunidades NR1 se unen glicina, mientras que las subunidades NR2 se unen a glutamato. Se requiere la unión tanto a Glicina como a glutamato para abrir el canal iónico y permitir la entrada de calcio en la célula. Las cuatro subunidades del receptor NR2 parecen determinar la farmacología y las propiedades de los receptores de NMDA, con contribuciones adicionales de corte y empalme alternativo de la subunidad NR1 (Kornau et al. (1995) Science 269:1737-40). Mientras las subunidades NR1 y NR2A se expresan de forma ubicua en el cerebro, la expresión NR2B se limita al cerebro anterior, NR2C al cerebelo, y NR2D es rara en comparación con los otros tipos.

Debido al papel clave de los receptores de NMDA en la respuesta de excitotoxicidad, estos han sido considerados como dianas para agentes terapéuticos. Se han desarrollado compuestos que se dirigen al canal iónico (cetamina, la fenciclidina, PCP, MK801, amantadina), al canal exterior (magnesio), al sitio de unión a glicina de las subunidades NR1, al sitio de unión a glutamato de las subunidades NR2, y a sitios específicos de las subunidades NR2 (Zinc-NR2A; Ifenprodilo, traxoprodilo-NR2B). Entre éstos, los antagonistas no selectivos del receptor de NMDA han sido los agentes más neuroprotectores en modelos animales de accidente cerebrovascular. Sin embargo, las pruebas clínicas con estos fármacos en el accidente cerebrovascular y la lesión cerebral traumática han fracasado hasta ahora, en general, como resultado de graves efectos secundarios tales como alucinaciones e incluso coma.

Se ha informado de que la proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95) se acopla a los NMDAR en las rutas que median la excitotoxicidad y la lesión cerebral isquémica (Aarts et al., Science 298, 846-850 (2002)). Este acoplamiento se vio interrumpido por la transducción de las neuronas con péptidos del extremo C-terminal de NMDAR 2B que se unen a PSD-95 fusionada a un péptido de internalización tat convencional. Este tratamiento atenuó la señalización de NMDAR aguas abajo sin inhibir la actividad de NMDAR, protegió las neuronas corticales cultivadas de insultos excitotóxicos y redujo el volumen de infarto cerebral en ratas sometidas a isquemia cerebral focal transitoria.

Breve resumen de la invención

La invención proporciona un péptido quimérico aislado en donde el péptido quimérico comprende un péptido activo que inhibe la unión de PSD-95 a un receptor de NMDA y un péptido de internalización que promueve la absorción del péptido quimérico en las células y tiene una capacidad reducida para unirse a un canal de calcio de tipo N con respecto al péptido tat YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1), y en donde el péptido activo tiene una secuencia de aminoácidos que comprende [T/S] X [V/L] (SEQ ID NO: 14), opcionalmente, [E/D/N/Q] - [S/T] - [D/E/Q/N] - [V/L] (SEQ ID NO: 5) y el péptido de internalización tiene una secuencia de aminoácidos que comprende XGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2), en donde X es un aminoácido distinto de Y o nada . Opcionalmente, X es F (SEQ ID NO: 135). Opcionalmente, X es nada (SEQ ID NO: 136). Opcionalmente, el péptido de internalización consiste en GRKKRRQRRRP (SEC ID NO: 3). Opcionalmente, el péptido quimérico tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en GRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO: 4).

Opcionalmente, el péptido activo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de ESDV (SEQ ID NO: 6), ESEV (SEQ ID NO: 7), ETDV (SEQ ID NO: 8), ETEV (SEC ID NO: 9 ), DTDV (SEQ ID NO: 10), DTEV (SEQ ID NO: 11). Opcionalmente, el péptido activo tiene una secuencia de aminoácidos que comprende

KLSSIESDV (SEQ ID NO: 12). Opcionalmente, el péptido activo tiene una secuencia de aminoácidos que comprende KLSSIETDV (SEQ ID NO: 13). Opcionalmente, el péptido quimérico tiene una secuencia de aminoácidos que comprende FGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO: 19) o FGRKKRRQRRRKLSSIETDV (SEQ ID NO: 16). Opcionalmente, el péptido quimérico tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en FGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO: 19) o FGRKKRRQRRRKLSSIETDV (SEQ ID NO: 16).

La invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende un péptido quimérico aislado como se ha descrito anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención se puede utilizar en el tratamiento de los efectos dañinos del accidente cerebrovascular en un paciente que tiene o está en riesgo de tener un accidente cerebrovascular u otra lesión en el SNC, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un péptido quimérico o peptidomimético del mismo. El péptido quimérico comprende un péptido activo que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende T/SXV/L (SEQ ID NO: 14) y un péptido de internalización que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende XGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2), en donde X es un aminoácido distinto de Y. Opcionalmente, X es F (SEQ ID NO: 135). Opcionalmente, X es nada (SEQ ID NO: 136). Opcionalmente, el péptido de internalización consiste en GRKKRRQRRRPQ (SEQ ID NO: 15). Opcionalmente, el péptido quimérico tiene una secuencia de aminoácidos que comprende GRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO: 4). Opcionalmente, el péptido activo tiene una secuencia de aminoácidos que comprende [E/D/N/Q] -[S/T] - [D/E/Q/N] -[V/L) (SEC ID NO: 5). Opcionalmente, el péptido activo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de ESDV (SEQ ID NO: 6), ESEV (SEQ ID NO: 7), ETDV (SEQ ID NO: 8), ETEV (SEC ID NO: 9 ), DTDV (SEQ ID NO: 10), DTEV (SEQ ID NO: 11). Opcionalmente, el péptido activo tiene una secuencia de aminoácidos que comprende KLSSIESDV (SEQ ID NO: 12). Opcionalmente, el péptido activo tiene una secuencia de aminoácidos que comprende KLSSIETDV (SEQ ID NO: 13). Opcionalmente, el péptido quimérico tiene una secuencia de aminoácidos que comprende FGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO: 19) o FGRKKRRQRRRKLSSIETDV (SEQ ID NO: 16). Opcionalmente, el péptido quimérico tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en FGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO: 19) o FGRKKRRQRRRKLSSIETDV (SEQ ID NO: 16). Opcionalmente, la dosificación eficaz es una dosis única de 0,05 a 500 mg, opcionalmente de 0,1 a 100 mg, 0,5 a 50 mg, o 1-20 mg del péptido o peptidomimético. Opcionalmente, el paciente tiene un accidente cerebrovascular isquémico. Opcionalmente, el paciente tiene un accidente cerebrovascular hemorrágico.

Opcionalmente, el paciente tiene una susceptibilidad por encima de la normal a los efectos secundarios mediados por los canales de calcio de tipo N. Opcionalmente, el paciente tiene una presión arterial normal o por debajo de la normal. La invención proporciona adicionalmente un método de evaluación de los efectos secundarios potenciales de un péptido de internalización. El método implica proporcionar un péptido de internalización que promueve la absorción de un péptido activo que inhibe la unión de PSD-95 a un receptor de NMDA en una célula, y determinar la unión del péptido de internalización a un canal de calcio de tipo N. Siendo el grado de unión un indicador de los efectos secundarios potenciales en el uso clínico del péptido de internalización. Opcionalmente, el péptido de internalización se proporciona mediante el escrutinio de un péptido de ensayo para determinar si el péptido de ensayo promueve la absorción del péptido activo.

La invención proporciona adicionalmente un agente quimérico aislado que comprende un agente activo y un péptido de internalización que promueve la absorción del agente quimérico en las células. El péptido de internalización es una variante del péptido tat YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1) que tiene una capacidad reducida para unirse a un canal de calcio de tipo N con respecto al péptido TAT. Opcionalmente, el agente activo es un agente activo mostrado en la Tabla 5. Opcionalmente, el péptido de internalización tiene una secuencia de aminoácidos que comprende XGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2), en donde X es un aminoácido distinto de Y, o nada. Opcionalmente, X es F (SEQ ID NO: 135). Opcionalmente, X es nada (SEQ ID NO: 136). Opcionalmente, el péptido de internalización consiste en GRKKRRQRRRP (SEC ID NO: 3). Opcionalmente, el agente quimérico tiene una kD mayor de 10 nM para un canal de calcio de tipo N.

La invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende un agente quimérico aislado como se ha descrito anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona adicionalmente un péptido de internalización que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende XGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2), en donde X es F.

La invención se refiere adicionalmente al agente activo mostrado en la Tabla 5 conectado en la presente memoria al péptido variante de tat del SEQ ID NO: 2, en donde X es un aminoácido distinto de Y, o nada para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un paciente que tiene una susceptibilidad por encima de la normal a los efectos secundarios mediados por los canales de calcio de tipo N.

El documento WO 03/076561 (Artemis Pharmaceuticals GmbH) describe una proteína de fusión que comprende un dominio de ADN recombinasa de sitio específico tal como una recombinasa Cre, y un dominio que contiene una señal de localización nuclear modificada específica. La proteína de fusión puede comprender adicionalmente un dominio de transducción de proteína tal como el FGF hidrófobo y el péptido tat alcalino. La señal de localización nuclear específica sola, o junto con el dominio de transducción de proteína - se describe por promover la absorción

celular de la recombinasa. La proteína de fusión se describe como una herramienta para la manipulación genética eficaz de los genomas de mamífero. Se describen adicionalmente secuencias de ADN que codifican dicha proteína de fusión; los métodos para producir dicha proteína de fusión y su uso como un agente para inducir el redireccionamiento génico en un organismo vivo o en células cultivadas. En el documento no se describe la interacción entre el péptido de internalización tat y los canales de calcio de tipo N.

El documento WO 2005/035562 (Sumitomo Pharmaceuticals Co. Ltd.) describe un agente que promueve el crecimiento de células, en particular, células madre embrionarias y células madre somáticas. Mediante el uso de una proteína de fusión o una conjugación química que se caracteriza por que contiene un dominio de transferencia de proteína y la proteína ERas, se puede promover la proliferación de células, en particular, células madre embrionarias y células madre somáticas. Este promotor del crecimiento celular se puede preparar de forma reversible y, por lo tanto, es clínicamente aplicable a un alto nivel en comparación con el método de transferencia génica. De nuevo, no se describe la interacción entre el péptido de internalización tat y los canales de calcio de tipo N.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A, B, C: Resultados de un estudio de unión al receptor/inhibición que evalúa la capacidad del péptido YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO: 17) para inhibir la unión de diferentes ligandos radiomarcados a receptores celulares.

Figura 2: Efecto de la aplicación de los diversos péptidos sobre la amplitud de las corrientes de calcio de tipo N (superior) o las corrientes de la célula completa (inferior) en las DRG.

Las Fig. 3A y 3B muestran (A) El efecto de Tat-NR2B9c y F-Tat-NR2B9c sobre el volumen de infarto cerebral en ratas tratadas 1h después de la aparición de la isquemia permanente utilizando el modelo de oclusión de los vasos de la pía madre (10 ratas/grupo), y (B) las secciones seriadas de cerebro de una rata representante de cada grupo teñidas con cloruro de trifenil-tetrazolio (TTC).

Figura 4: Determinación de la CI50 para algunos de los péptidos para las corrientes de calcio tipo N en las neuronas DRG.

Figuras 5A y 5B: Selectividad de Tat-NR2B9c para las corrientes de calcio tipo N sobre corrientes de tipo L en las neuronas DRG. La Figura 5A muestra el efecto de Tat-NR2B9c (100 μM) y ω-conotoxina (1 μM) en la corriente de calcio en neuronas DGR cultivadas. La Figura 5B muestra la inhibición por nifedipina de la corriente de calcio en DRG en presencia de Tat-NR2B9c (100 μM intracelular).

Figura 6: Carencia de la dependencia de uso de la inhibición de corrientes de calcio de tipo N por Tat-NR2B9c. Las corrientes se registraron en una neurona DRG representativa por la diferente frecuencia (0,07, 10, 20, 50 Hz). Se aplicó Tat-NR2B9c (100 μM) como se indica. Las corrientes mostraron un fuerte deterioro dependiente de la frecuencia, y el aumento de la frecuencia no aumentó el efecto de inhibición de Tat-NR2B9c.

Figura 7: Carencia de inhibición dependiente del voltaje por Tat-NR2B9c de corrientes de calcio de tipo N. Relaciones IV de la corriente de Ca2+ en neuronas DRG cultivadas. Se aplicó Tat-NR2B9c (10, 100 μM) en presencia

o ausencia de nifedipina 10 pM. Las corrientes se indujeron utilizando etapas de fijación de voltaje de 50 ms de -40 a +50 mV a partir del potencial de mantenimiento de -60 mV.

Figura 8: Evaluación de la neuroprotección observada utilizando secuencias C-terminales alternativas en el modelo de oclusión de la pía madre de isquemia permanente en ratas.

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

Un "péptido quimérico" significa un péptido que tiene dos péptidos componentes no asociados naturalmente entre sí unidos entre ellos como una proteína de fusión o por medio de un enlace químico.

Un "polipéptido de fusión" se refiere a un polipéptido compuesto, es decir, una secuencia de aminoácidos contigua única, formada por dos (o más) polipéptidos heterólogos diferentes, que normalmente no están fusionados entre sí en una única secuencia de aminoácidos.

El término "dominio PDZ" se refiere a un dominio de proteína modular de aproximadamente 90 aminoácidos, caracterizado por una identidad de secuencia significativa (por ejemplo, al menos 60%) con la proteína sináptica del cerebro PSD-95, la proteína de unión septada de Drosophila Discos Grandes (DLG), y la proteína de unión estrecha epitelial ZO1 (ZO1). Los dominios PDZ también son conocidos como repeticiones de homología de Discos Grandes ("DHRS") y repeticiones GLGF. Los dominios PDZ parecen generalmente mantener una secuencia consenso central (Doyle, DA, 1996, Cell 85: 1067-1076). Las proteínas que contienen el dominio PDZ ilustrativas y las secuencias del dominio PDZ se describen en la Solicitud de los Estados Unidos Núm. 10/714.537, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

El término "proteína PL" o "proteína del ligando PDZ " se refiere a una proteína de origen natural que forma un complejo molecular con un dominio PDZ, o a una proteína cuyo extremo carboxi, cuando es expresado por separado de la proteína completa (p. ej., como un fragmento peptídico de 3-25 residuos, p. ej., 3, 4, 5, 8, 9, 10, 12, 14 o 16 residuos), forma tal complejo molecular. El complejo molecular se puede observar in vitro utilizando el "análisis de A"

5 o "análisis de G" descritos, por ejemplo, en la Solicitud de los Estados Unidos Núm. 10/714.537, o in vivo.

El término "receptor de NMDA", o "NMDAR", se refiere a una proteína asociada a la membrana que se sabe que interactúa con NMDA. El término incluye de este modo las diversas formas de subunidades que se describen en la Sección Antecedentes. Tales receptores pueden ser humanos o no humanos (p. ej., ratón, rata, conejo, mono).

Un "motivo PL" se refiere a la secuencia de aminoácidos del extremo C de una proteína PL (p. ej., los 3, 4, 5, 6, 7, 8,

10 9, 10, 12, 14, 16, 20 o 25 residuos contiguos C-terminales) ("secuencia PL C-terminal") o a una secuencia interna que se sabe que se une al dominio PDZ ("secuencia PL interna").

Un "péptido PL" es un péptido que comprende o que consiste en, o se basa de otra manera en, un motivo PL que se une específicamente a un dominio PDZ.

Los términos "aislado" o "purificado" significan que la especie objeto (p. ej., un péptido) se ha purificada de los

15 contaminantes que se encuentran presentes en una muestra, tal como una muestra obtenida a partir de fuentes naturales que contienen la especie objeto. Si una especie objeto se aísla o purifica, ésta es la especie macromolecular predominante (p. ej., polipéptido) presente en la muestra (es decir, sobre una base molar ésta es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferiblemente la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies

20 macromoleculares presentes. Generalmente, una composición aislada, purificada o sustancialmente pura comprende más de 80 a 90 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. Lo más preferiblemente, la especie objeto se purifica hasta la homogeneidad esencial (es decir, las especies contaminantes no pueden ser detectadas en la composición mediante métodos de detección convencionales), en donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular. El término aislado o purificado no

25 necesariamente excluye la presencia de otros componentes destinados a actuar combinados con una especie aislada. Por ejemplo, un péptido de internalización puede ser descrito como aislado a pesar de que está ligado a un péptido activo.

Un "peptidomimético" se refiere a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de un péptido que consiste en aminoácidos naturales. El 30 peptidomimético puede contener análogos no naturales, totalmente sintéticos de aminoácidos, o puede ser una molécula quimérica de aminoácidos peptídicos pacialmente naturales y análogos aminoácidos parcialmente no naturales. El peptidomimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservativas de aminoácidos naturales, siempre y cuando tales sustituciones tampoco alteren sustancialmente la estructura y/o actividad inhibidora o de unión del mimético. Las composiciones de miméticos de polipéptídos pueden contener 35 cualquier combinación de componentes estructurales no naturales, que son típicamente de tres grupos estructurales: a) grupos de conexión de residuos distintos de las conexiones de enlace amida natural ("enlace peptídico"); b) residuos no naturales en lugar de residuos de aminoácidos de origen natural, o c) residuos que inducen mimetismo estructural secundario, es decir, inducen o estabilizan una estructura secundaria, p. ej., un giro beta, un giro gamma, una lámina beta, una conformación en hélice alfa, y similares. En un peptidomimético de un péptido quimérico que 40 comprende un péptido activo y un péptido de internalización, ya sea el radical activo ya sea radical de internalización

o ambos pueden ser un peptidomimético.

El término "unión específica" se refiere a la unión entre dos moléculas, por ejemplo, un ligando y un receptor, caracterizada por la capacidad de una molécula (ligando) para asociarse con otra molécula específica (receptor) incluso en presencia de muchas otras diversas moléculas, es decir, para mostrar una unión preferente de una

45 molécula por otra en una mezcla heterogénea de moléculas. La unión específica de un ligando a un receptor también se pone evidencia por la unión reducida de un ligando marcado de forma detectable al receptor en presencia de ligando no marcado en exceso (esto es, análisis de unión competitiva).

La excitotoxicidad es el proceso patológico por el cual las neuronas resultan dañadas y destruidas por la activación excesiva de los receptores para el neurotransmisor excitador glutamato, por ejemplo los receptores de NMDA, tales

50 como NMDAR 2B.

Un péptido de internalización tat convencional comprende la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1).

Una variante del péptido de internalización tat tiene al menos un aminoácido suprimido, sustituido, o insertado internamente con respecto a un péptido tat convencional.

55 Se utiliza un agente activo para describir un compuesto que tiene o puede tener una actividad farmacológica. Los agentes incluyen compuestos que son fármacos conocidos, compuestos para los que se ha identificado una actividad farmacológica pero que están sometidos a una evaluación terapéutica adicional, y compuestos que son miembros de colecciones y bibliotecas que tienen que ser escrutados para determinar su actividad farmacológica.

Un péptido activo es un agente activo que es un péptido. Un agente quimérico activo comprende un agente activo conectado a un péptido de internalización.

Una actividad "farmacológica" significa que un agente activo muestra una actividad en un sistema de escrutinio que indica que el agente activo es o puede ser útil en la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad. El sistema de escrutinio puede ser in vitro, celular, animal o humano. Se pueden describir agentes que tienen actividad farmacológica a pesar de que puede ser necesario un ensayo adicional para establecer la utilidad profiláctica o terapéutica real en el tratamiento de una enfermedad.

Estadísticamente significativo hace referencia a un valor de p que es <0,05, preferentemente <0,01 y lo más preferiblemente <0,001.

II. General

La invención proporciona péptidos quiméricos y peptidomiméticos de los mismos útiles para reducir los efectos perjudiciales de los accidentes cerebrovasculares y otras afecciones neurológicas mediadas al menos en parte por la excitotoxicidad de NMDAR. Los péptidos quiméricos tienen al menos dos componentes. El primer componente es un péptido activo que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se basa en el motivo PL de una subunidad del Receptor 2 de NMDA (p. ej., número de acceso GenBank 4099612 para NMDA NR2B) (es decir, un péptido PL). Aunque no es necesaria una comprensión de mecanismo para poner en práctica la invención, se cree que tal péptido actúa al menos en parte por medio de la inhibición de la interacción entre los NMDAR con la proteína de densidad postsináptica 95 (es decir, inhibidores de PSD-95).

Los péptidos activos también pueden inhibir las interacciones entre PSD-95 y nNOS y otros receptores de glutamato (por ejemplo, receptores de kainita o receptores AMPA). A diferencia de los antagonistas de glutamato que han fracasado previamente en pruebas clínicas, tales péptidos pueden alterar la señalización neurotóxica durante la isquemia sin incurrir en las consecuencias negativas de la pérdida de otras funciones de los NMDAR. El segundo componente del péptido quimérico es un péptido de internalización que representa una variante del péptido tat convencional fusionado a péptidos NMDAR 2B en el trabajo anterior.

El uso de un péptido tat variante se basa en parte en los resultados descritos en la presente solicitud de que un péptido tat convencional, concretamente cuando se une a un péptido NMDAR KLSSIESDV (SEQ ID NO: 12), se une a los canales de calcio de tipo N e inhibe su actividad. Los canales de calcio de tipo N localizados sobre los terminales nerviosos presinápticos regulan la liberación de neurotransmisores, incluyendo la de las terminaciones espinales de los nocioceptores aferentes primarios. Los efectos farmacológicos de la unión a los canales de tipo N han sido bien caracterizados en relación con el fármaco ziconotida (o Prialt, una forma sintética del precursor del péptido de caracol cono omega-conotoxina M-VII-A). La unión a canales de calcio de tipo N se ha asociado con numerosas actividades, algunas o todas los cuales pueden ser no deseables en pacientes con accidente cerebrovascular. Estas actividades incluyen analgesia mucho más fuerte que la inducida por la morfina, hipotensión, disminución de los niveles de conciencia, depresión, deterioro cognitivo, alucinación, elevación de los niveles de creatina quinasa, y retención de orina (véanse, p. ej., Brose et al., Clin J Pain 13: 256-259, (1997); Mathur et al., Semin Anesthesia Perioperative Med Pain 19: 67-75, 2000, Staats et al., JAMA 291: 63-70, 2004, McGuire et al., J Cardiovasc Pharmacol 30: 400-403, 1997. La clínica Mayo enumera los siguientes efectos secundarios observados después del tratamiento con Prialt, que es altamente selectivo para los canales de calcio de tipo N.

Tabla 1 (continuación)

Gravedad: Incidencia Fenotipos

Grave: Común Ver, escuchar o sentir cosas que no están allí; pensamientos de suicidio.

Menos común: Dolor en el pecho; escalofríos; confusión; convulsiones; tos; orina de color oscuro; mareos; somnolencia; desmayos; ritmo cardíaco acelerado; fiebre; malestar general; vahídos leves; espasmos musculares o espasmos de todas las extremidades; rigidez muscular; respiración rápida y superficial; falta de aliento; estornudos; dolor de garganta; rigidez en el cuello o la espalda; opresión en el pecho; dificultad para respirar; dificultad para concentrarse; dificultad para dormir; cansancio o debilidad inusuales; sibilancias.

Gravedad: Incidencia Fenotipos

: Sobredosis Disminución de la conciencia o la capacidad de respuesta; somnolencia severa; temblores y andar inestable; temblor u otros problemas con el control o coordinación muscular; movimientos oculares incontrolados; inestabilidad.

Moderado: Común Ardor; cambio en la marcha y el equilibrio; torpeza o inestabilidad; confusión; sensación de hormigueo; diarrea; mareos; tono muscular excesivo, tensión muscular u opresión; miedo; sensación de movimiento constante de uno mismo o de su entorno; fiebre; dolor de cabeza; picor; falta o pérdida de fuerza; vahídos leves; pérdida de apetito; náuseas; nerviosismo; entumecimiento; problemas con el lenguaje o el habla; sensación de movimiento; temblor; u otros problemas con el control o la coordinación muscular; movimientos oculares incontrolados; retención de orina; vómitos; pérdida de peso.

Menos: Acidez o malestar estomacal; dolor de espalda; (post)sabor malo, inusual o desagradable;

: común eructos; dolor de vejiga; orina con sangre o turbia; hematomas; líquido cefalorraquídeo anormal; cambio de gusto; congestión; estreñimiento; timbre o zumbido continuado u otros ruidos inexplicables en los oídos; lloro; disminución de la conciencia o la capacidad de respuesta; deshidratación; despersonalización; depresión; dificultad, ardor o dolor al orinar; dificultad de movimiento; dificultad para ver de noche; visión doble; boca seca; piel seca; sequedad o dolor de garganta; disforia; euforia; desmayo; pulso cardiaco rápido o irregular; sensación de que los demás pueden escuchar sus pensamientos, le están observando, o pueden controlar su comportamiento; necesidad frecuente de orinar; pérdida de la audición; acidez gástrica; ronquera; hostilidad; mayor sensibilidad de los ojos a la luz del sol; aumento de la sensibilidad al dolor o al tacto; indigestión; pérdida de control de la vejiga; pérdida de memoria o problemas con la memoria; trastornos pulmonares; dolor de cuello; dolor nervioso; dolor en las articulaciones; piel pálida; latidos en los oídos; rapidez para reaccionar o reaccionar de forma exagerada emocionalmente; cambio rápido de humor; zonas de la piel enrojecidas, escamosas, hinchadas o desprendidas; enrojecimiento o dolor en la zona del catéter; goteo nasal; rigidez muscular severa; insomnio; pulso cardiaco lento o rápido; molestia, alteración o dolor de estómago; sudoración; hinchazón o enrojecimiento en las articulaciones; glándulas del cuello sensibles, hinchadas; dificultad para tragar; sangrado o magulladuras inusuales; cansancio o debilidad inusuales; cambios en la voz; calor en la piel; debilidad o pesadez en las piernas.

Los presentes péptidos quiméricos y peptidomiméticos han reducido o eliminado la unión a y la inhibición de los canales de calcio de tipo N en comparación con Tat-NR2B9c y por lo tanto evitan el gran número de efectos

5 secundarios observados con los inhibidores altamente específicos del canal de calcio de tipo N, incluyendo los efectos secundarios psiquiátricos graves. La reducción en los efectos secundarios da como resultado un incremento del índice terapéutico para el tratamiento de seres humanos de los presentes péptidos quiméricos y peptidomiméticos con respecto a Tat-NR2B9c.

Los autores de la presente invención han encontrado adicionalmente que la unión a los canales de calcio de tipo N

10 se puede evitar mediante el uso de variantes de la secuencia tat convencional. La combinación de una variante tat y un péptido activo basado en o que incluye el extremo C de NMDAR 2B u otro subtipo permite el tratamiento de los accidentes cerebrovasculares con efectos secundarios reducidos debido a la inhibición de los canales de calcio de tipo N.

III. Péptidos activos

15 Los péptidos activos útiles en la invención inhiben la interacción entre los dominios PDZ 1 y 2 de la proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95) (secuencia de aminoácidos humana proporcionada por Stathakism, Genomics 44 (1) :71-82 (1997)) y la secuencia PL C-terminal de una o más subunidades del receptor 2 de NMDA incluyendo la subunidad NR2B del receptor de N-metil-D-aspartato neuronal (Mandich et al., Genomics 22, 216-8 (1994)). NMDAR2B tiene el ID GenBank 4099612, un FNGSSNGHVYEKLSSIESDV de 20 aminoácidos C-terminal (SEQ ID

20 NO: 24) y un motivo ESDV de PL (SEC ID NO: 6). Los péptidos activos inhiben preferentemente las formas humanas de PSD-95 y los receptores de NMDAR humanos. Sin embargo, la inhibición también se puede mostrar a partir de variantes de especie de las proteínas. Una lista de los receptores de NMDA y de glutamato que se pueden utilizar aparece a continuación:

Tabla 2: Receptores de NMDA con secuencias PL 5

Nombre: Núm. GI o Acc Secuencia C-terminal de 20 unidades Secuencia C-terminal de 4 unidades PL? ID PL interna

NMDAR1: 307302 STVV (SEC ID NO: 39) X AA216

NMDAR1-1: 292282 STVV (SEC ID NO: 39) X AA216

NMDAR1-4: 472845 STVV (SEC ID NO: 39) X AA216

NMDAR1-3b: 2343286 STVV (SEC ID NO: 39) X AA216

NMDAR1-4b: 2343288 STVV (SEC ID NO: 39) X AA216

NMDAR1-2: 11038634 HRES (SEC ID NO: 40)

NMDAR1-3: 11038636 HRES (SEC ID NO: 40)

NMDAR2C: 6006004 ESEV (SEC ID NO: 7) X AA 180

NMDAR3: 560546 ESDV (SEC ID NO: 6) X AA34.1

NMDAR3A: 17530176 (ECT SEC ID NO: 41)

NMDAR2B: 4099612 ESDV (SEC ID NO: 6) X

NMDAR2A: 558748 ESDV (SEC ID NO: 6) X AA34.2

NMDAR2D: 4504130 ESEV (SEC ID NO: 7) X

Receptor de glutamato Delta 2: AF009014 QPTPTLGLNLGNDPDRGTSI (SEQ ID NO: 31) GTSI (SEC ID NO: 42) X

Receptor de glutamato 1: 128953 MQSIPCMSHSSGMPLGATGL (SEQ ID NO: 32) ATGL (SEQ ID NO: 43) X

Receptor de glutamato 2: L20814 QNFATYKEGYNVYGIESVKI (SEQ ID NO: 33) SVKI (SEQ ID NO: 44) X

Receptor de glutamato 3: AF167332 QNYATYREGYNVYGTESVKI (SEQ ID NO: 34) SVKI (SEQ ID NO: 44) X

Nombre: Núm. GI Acc o Secuencia C-terminal de 20 unidades Secuencia C-terminal de 4 unidades PL? ID PL interna

glutamato 3: ID NO: 34)

Receptor de glutamato 4: U16129 HTGTAIRQSSGLAVIASDLP (SEQ ID NO: 35) PLSD (SEC ID NO: 45)

Receptor de glutamato 5: U16125 SFTSILTCHQRRTQRKETVA (SEQ ID NO: 36) ETVA (SEQ ID NO: 46) X

Receptor de glutamato 6: U16126 EVINMHTFNDRRLPGKETMA (SEQ ID NO: 37) ETMA (SEQ ID NO: 47) X

Receptor de glutamato 7: U 16127 RRLPGKDSMACSTSLAPVFP (SEQ ID NO: 38) PVFP (SEQ ID NO: 48)

La evidencia del papel de los diferentes subtipos de receptor de NMDA en la excitotoxicidad es proporcionada, por ejemplo, por Lynch, J. Pharm. Exp. Therapeutics 300, 717-723 (2002); Kemp, Nature Neurosci. suplemento, Vol. 5 (2002). Algunos péptidos activos inhiben las interacciones entre PSD-95 y múltiples subunidades de NMDAR. En tales casos, el uso del péptido no requiere necesariamente una comprensión de las contribuciones respectivas de los diferentes NMDAR a la excitotoxicidad. Otros péptidos activos son específicos para un solo NMDAR.

Los péptidos activos incluyen o se basan en un motivo PL del extremo C de cualquiera de las subunidades anteriores y tienen una secuencia de aminoácidos que comprende [S/T]-X-[V/L] (SEQ ID NO: 14). Esta secuencia aparece preferiblemente en el extremo C de los péptidos de la invención. Los péptidos preferidos tienen una secuencia de aminoácidos que comprende [E/D/N/Q] - [S/T] - [D/E/Q/N] - [V/L] (SEQ ID NO: 5) en su extremo C. Los péptidos ilustrativos comprenden: ESDV (SEQ ID NO: 6), ESEV (SEC ID NO:. 7), ETDV (SEQ ID NO: 8), ETEV (SEQ ID NO: 9), DTDV (SEQ ID NO: 10), y DTEV (SEC ID NO: 11) como aminoácidos C-terminales. Dos péptidos particularmente preferidos son KLSSIESDV (SEQ ID NO: 12), y KLSSIETDV (SEQ ID NO: 13). Los péptidos de la invención sin un péptido de internalización tienen por lo general 3-25 aminoácidos, longitudes de péptidos (también sin un péptido de internalización) de 5-10 aminoácidos, y particularmente se prefieren 9 aminoácidos. En algunos de tales péptidos activos, todos los aminoácidos son del extremo C de un receptor de NMDA.

Otros péptidos activos incluyen el dominio PDZ 1 y/o 2 de PSD-95 o un subfragmento de cualquiera de éstos que inhibe las interacciones entre PSD-95 y un receptor de NMDA, tal como NMDA 2B. Tales péptidos activos comprenden al menos 50, 60, 70, 80 o 90 aminoácidos del dominio PDZ 1 y/o del dominio PDZ 2 de PSD-95, que aparecen dentro de aproximadamente los aminoácidos 65-248 de PSD-95 proporcionado por Stathakism, Genomics 44(1):71-82 (1997) (Secuencia humana) o NP_031890.1, GI: 6681195 (secuencia de ratón) o las correspondientes regiones de otras variantes de especies.

III. Péptidos de internalización

Cualquiera de los péptidos activos de la invención puede estar conectado, preferiblemente en su extremo N, a un péptido de internalización que facilita la translocación a través de la membrana plasmática de una célula. Los péptidos de internalización comprenden una variante de una secuencia tat convencional YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1). Aunque la práctica de la invención no depende de la comprensión del mecanismo, se cree que tanto la capacidad de atravesar las membranas como la unión a los canales de calcio de tipo N son conferidas por la existencia inusualmente alta de residuos de carga positiva Y, R y K en el péptido. Los péptidos variantes para uso en la invención deben conservar la capacidad para facilitar la captación en las células, pero tienen una capacidad reducida para unirse a los canales de calcio de tipo N. Algunos péptidos de internalización adecuados comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos XGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2), en la que X es un aminoácido distinto de Y (p. ej., cualquiera de los otros 19 aminoácidos naturales) o nada (en cuyo caso G es un residuo Nterminal libre). Una variante de tat preferida tiene el residuo Y N-terminal sustituido por F. De este modo, se prefiere una variante de tat que comprende o que consiste en FGRKKRRQRRR (SEC ID NO: 49). Otro péptido de internalización tat variante preferido consiste en GRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 50). Si los residuos adicionales que flanquean XGRKKRRQRRR (SEC ID NO: 2) están presentes (al lado del péptido activo) los residuos pueden ser, por ejemplo, aminoácidos naturales que flanquean este segmento de una proteína tat, aminoácidos espaciadores o conectores de una clase utilizada típicamente para unir dos dominios de péptidos, p. ej., Gly (Ser)4 (SEQ ID NO: 134), TGEKP (SEQ ID NO: 51), GGRRGGGS (SEQ ID NO: 52), o LRQRDGERP (SEQ ID NO: 53) (véanse, p. ej., Tang et al. (1996), J. Biol.. Chem. 271, 15682-15686; Hennecke et al. (1998), Protein Eng. 11, 405-410)), o puede ser cualquier otro aminoácido que no reduzca de forma detectable la capacidad de conferir la absorción de la variante sin los residuos flanqueantes y no aumente significativamente la inhibición los canales de calcio de tipo N con respecto a la variante sin los residuos flanqueantes. Preferiblemente, el número de aminoácidos flanqueantes distintos de un péptido activo no excede de diez a cada lado de XGRKKRRQRRR (SEC ID NO: 2). Preferiblemente, están presente aminoácidos no flanqueantes, y el péptido de internalización está ligado en su extremo C

5 directamente a un péptido activo.

Otros péptidos de internalización de la invención que se pueden utilizar para permitir la absorción de cualquiera de los péptidos activos de la invención para la inhibición de las interacciones con PSD-95 sin inhibir los canales de calcio de tipo N incluyen los presentados en la siguiente Tabla 3. Se recomienda escrutar estos péptidos de internalización para confirmar la absorción deseada y la falta de inhibición de los canales de calcio de tipo N, como

10 se describe en los Ejemplos.

Los datos presentados en los ejemplos demuestran que la mutación del residuo de tirosina N-terminal (Y) de Tat-NR2B9c a fenilalanina (F) es suficiente para anular la inhibición del canal de calcio de tipo N sin reducir la capacidad del resto del péptido para localizar el sitio de acción de este fármaco en el cerebro y reducir el daño después del accidente cerebrovascular inducido en modelos animales de isquemia permanente. Adicionalmente, los 15 experimentos demuestran que TAT solo (YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1)) es suficiente para inducir la inhibición observada del canal de calcio de tipo N, y que los diferentes péptidos añadidos al extremo C tienen solo un efecto leve sobre la inhibición cuando están anclados a Tat. Por lo tanto, es probable que el cambio o la eliminación de la tirosina en el extremo N de la secuencia de Tat sean importantes para la reducción de la unión. La mutación de residuos de aminoácidos alcalinos próximos a esta tirosina también puede dar como resultado una reducción de la

20 unión a y la inhibición de los canales de calcio de tipo N. En la presente memoria se pronostica que las secuencias ilustrativas de la siguiente tabla mantienen la capacidad de transporte sin inhibir los canales de calcio de tipo N y de este modo permiten un mayor índice terapéutico para el tratamiento del accidente cerebrovascular o el trauma neurológico.

Tabla 3 5

X-FGRKKRRQRRRKLSSIESDV (F-TatNR2B9c): SEQ ID NOS: 19, 77, 78, 79

X-GKKKKKQKKKKLSSIESDV: SEC ID NO: 54, 80, 81, 82

X-RKKRRQRRRKLSSIESDV: SEC ID NO: 55, 83, 84, 85

X-GAKKRRQRRRKLSSIESDV: SEC ID NO: 56, 86, 87, 88

X-AKKRRQRRRKLSSIESDV: SEC ID NO: 57, 89, 90, 91

X-GRKARRQRRRKLSSIESDV: SEC ID NO: 58, 92, 93, 94

X-RKARRQRRRKLSSIESDV: SEC ID NO: 59, 95, 96, 97

X-GRKKARQRRRKLSSIESDV: SEC ID NO: 60, 98, 99, 100

X-RKKARQRRRKLSSIESDV: SEC ID NO: 61, 101, 102, 103

X-GRKKRRQARRKLSSIESDV: SEC ID NO: 62, 104, 105, 106

X-RKKRRQARRKLSSIESDV: SEC ID NO: 63, 107, 108, 109

X-GRKKRRQRARKLSSIESDV: SEC ID NO: 64, 110, 111, 112

X-RKKRRQRARKLSSIESDV: SEC ID NO: 65, 113, 114, 115

X-RRPRRPRRPRRKLSSIESDV: SEC ID NO: 66, 116, 117, 118

X-RRARRARRARRKLSSIESDV: SEC ID NO: 67, 119, 120, 121

X-RRRARRRARRKLSSIESDV: SEC ID NO: 68, 122, 123, 124

X-RRRPRRRPRRKLSSIESDV: SEC ID NO: 69, 125, 126, 127

X-RRPRRPRRKLSSIESDV: SEC ID NO: 70, 128, 129, 130

X-RRARRARRKLSSIESDV: SEC ID NO: 71, 131, 132, 133

X puede representar un extremo amino libre, una molécula de biotina u otro radical de protección terminal incluyendo, pero no limitado a, H, acetilo, benzoilo, grupo alquilo (alifático), piroglutamato, grupo alquilo con un grupo cicloalquilo en el extremo, biotina con espaciador de alquilo, (5,6)-FAM. El acoplamiento químico del grupo de protección terminal al péptido N-terminal puede ser por medio de la química de amidas, la química de sulfamidas, la química de sulfonas, la química de alquilación. Además, X también puede ser un aminoácido distinto de tirosina.

Los péptidos de internalización están conectados normalmente a péptidos activos como péptidos de fusión, pero también pueden estar unidos por un enlace químico. El acoplamiento de los dos constituyentes se puede realizar a través de un agente de acoplamiento o conjugación. Se encuentran disponibles en el mercado multitud de tales agentes y son revisados por S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991). Algunos ejemplos de los reactivos de entrecruzamiento incluyen 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) o N,N'-(1,3-fenilen)bismaleimida; N,N'-etilen-bis-(yodoacetamida) u otro de tales reactivos que tiene puentes de metileno de 6 a 11 carbonos (que son relativamente específicos para los grupos sulfhidrilo); y 1,5-difluoro-2,4dinitrobenceno (que forma enlaces irreversibles con grupos amino y tirosina). Otros reactivos de entrecruzamiento incluyen p,p'-difluoro-m,m'-dinitrodifenilsulfona (que forma entrecruzamiento irreversibles con grupos amino y fenólicos); adipimidato de dimetilo (que es específico para grupos amino); cloruro de fenol-1,4-disulfonilo (que reacciona principalmente con grupos amino); diisocianato o diisotiocianato de hexametileno, o p-diisocianato de azofenilo (que reacciona principalmente con grupos amino); glutaraldehído (que reacciona con varias cadenas laterales diferentes) y disdiazobenzidina (que reacciona principalmente con tirosina e histidina).

Péptidos tales como los que se acaban de describir pueden ser derivatizados opcionalmente (p. ej., acetilados, fosforilados y/o glicosilados) para mejorar la afinidad de unión del inhibidor, para mejorar la capacidad del inhibidor para ser transportados a través de una membrana celular o para mejorar la estabilidad. Como ejemplo específico, para los inhibidores en los que el tercer residuo desde el extremo C es S o T, este residuo puede ser fosforilado antes del uso del péptido.

Los péptidos de la invención, opcionalmente fusionados a los dominios de internalización, se pueden sintetizar mediante síntesis en fase sólida o métodos recombinantes. Los peptidomiméticos pueden ser sintetizados utilizando una variedad de procedimientos y metodologías descritos en la bibliografía científica y de patentes, p. ej., Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119; Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17-27; Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234.

V Canales de calcio de tipo N

Los canales de calcio de tipo N son complejos hetero-oligoméricos que consisten en subunidades α1B (Cav2.2), β-, y α2δ y a veces subunidades γ. La subunidad α1B forma el canal principal y está codificada por un solo gen. Existen cuatro genes de subunidades α2δ (α2δ-1-α2δ-4) (Snutch et al., Molecular properties of voltage-gated calcium channels. En: Voltage-gated calcium (Zamponi G, ed), págs. 61-94. Nueva York: Landes Bioscience, 2005. Catterall, Biochemical Studies of Ca2+ Channels. En: Voltage-Gated Calcium (Zamponi G, ed), págs. 48-60. Nueva York: Landes Bioscience, 2005). Existe una estrecha conservación de los canales de calcio de tipo N a través de especies. Por lo tanto se pueden escrutar las variantes de tat para determinar la carencia de unión utilizando canales de calcio de tipo N de seres humanos o de otras especies, tales como ratas.

La subunidad α1B del canal de calcio de tipo N es descrita por Williams et al., 1992 (Science 257 (5068), 389-395 (1992), Núm. Acc. Genbank Q00975 Especie: Homo Sapiens) y Coppola et al., 1994 (FEBS Lett. 338 (1), 1-5 (1994), Núm. Acc. Genbank 055017, Especie: Mus Musculus) y Dubel et al., 1992 (Proc. Natl. Acad. Sci. US.A. 89 (11), 5058-5062 (1992) Núm. Acc. Genbank Q02294, Especie: Rattus norvegicus), que incluyen variantes de empalme y fragmentos de las mismas que tienen una actividad de los canales de calcio similar a la proteína intacta es preferida para el escrutinio. También se pueden utilizar Las variantes alélicas y las variantes de especie que tienen al menos 90% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias anteriores. Opcionalmente, la subunidad α1B se puede utilizar combinada con una subunidad alfa2(AE)/delta, beta1-4, y/o gamma.

VI. Métodos de escrutinio

1.: Medición de la unión a canales de calcio de tipo N

Se pueden escrutar los péptidos de internalización para determinar la unión a canales de calcio de tipo N por medio de un análisis de unión competitiva utilizando un péptido marcado que sabe que se une a tales canales (p. ej., ziconotida). El canal de calcio de tipo N se puede proporcionar en una forma purificada o expresado naturalmente o recombinantemente a partir de células. Si se proporciona en forma purificada, el canal de calcio de tipo N se puede inmovilizar sobre cuentas o en un pocillo de microtitulación. La cantidad de marca unida al canal de calcio después de la incubación con el péptido marcado y el péptido de internalización a prueba es inversamente proporcional a la capacidad del péptido de internalización a prueba para unirse al canal de calcio. El análisis se puede realizar sobre una base de alto rendimiento en los pocillos de una placa de microtitulación. También se pueden incluir controles positivos y negativos. Un control negativo puede ser un vehículo. Un control positivo puede ser una forma no marcada del péptido que se sabe que se une a los canales de calcio de tipo N. Preferiblemente un péptido de internalización tiene una Kd mayor de 10 nM, preferiblemente mayor de 100 nM para un canal de calcio de tipo N.

2.: Medición de la inhibición de los canales de calcio de tipo N

Los péptidos de internalización y los agentes quiméricos que comprenden un péptido de internalización conectado a un agente activo, tal como un péptido activo se pueden escrutar para determinar su capacidad para inhibir las corrientes iónicas mediadas por los canales de calcio de tipo N. La inhibición significa una reducción estadísticamente significativa en la corriente iónica medida transportada por los canales de calcio de tipo N. Esta reducción debe ser mayor que una reducción de 20% de la corriente medida, preferiblemente una reducción mayor de 30%, y más preferiblemente de reducción mayor de 40%. La inhibición se puede determinar llevando a cabo registros de pinzamiento zonal de células completas en las neuronas ganglionares de la raíz dorsal, en donde se expresan las corrientes de calcio de tipo N. Los cultivos de ganglios de la raíz dorsal (DRG) se prepararon a partir de ratones Swiss a los 13-14 días de gestación. En resumen, los DRG se diseccionaron y se sometieron a digestión con tripsina durante 20 min a 37°C, se disociaron mecánicamente y se cultivaron en placa sobre cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina. Se hiceron crecer en MEM libre de suero (Neurobasal MEM, B-27 -Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después de 3-5 días, se añadió una solución FUDR 10 μM para inhibir la proliferación glial. Los cultivos se mantuvieron a 37°C en una atmósfera con 5% de CO2 humidificada y se alimentaron dos veces por semana. El registro de células completas se llevó a cabo a la temperatura ambiente 10-14 días después del cultivo en placa. Registros Electrofisiológicos: Se llevan a cabo registros de células completas con un amplificador Axopatch-1B (Axon Instruments, Foster City, CA) en el modo de fijación de voltaje. Los electrodos de registro, con resistencias de 3-5 MΩ, se construyen a partir de vidrio de borosilicato de paredes delgadas (1,5 mm de diámetro; World Precision Instruments, Sarasota, FL) utilizando un extractor de dos etapas (PP83; Narishige, Tokio, Japón). Los datos se digitalizan, se filtran (2 kHz) y, se adquieren en línea a través de los programas de ordenador pClamp 9 (Axon Instruments). Las pipetas se cargan con una disolución que contiene (mM): CsCl 110, MgCl2 3, EGTA 10, HEPES 10, MgATP 3, GTP 0,6. El pH se ajusta a 7,2 con CsOH. La disolución de baño contiene (mM): CaCl2 1, BaCl2 10, HEPES 10, TEA-Cl 160, Glucosa 10, TTX 0,0002 a pH (NaOH) 7,4. Se inducen corrientes de células completas utilizando pulsos despolarizantes de 40 ms a +20 mV a partir de un potencial de mantenimiento de -60 mV, aplicados cada 15 s. Para someter a ensayo la inhibición dependiente del uso, se inducen corrientes utilizando pulsos despolarizantes de 10 ms a +20 mV a partir de un potencial de mantenimiento de -60 mV, aplicados cada 0,02 s (50 Hz), 0,05 s (20 Hz), 0,1 (10 Hz) o 15 s (0,07 Hz), respectivamente.

3.: Medición de la actividad de internalización

Las variantes del péptido de internalización tat se pueden someter a ensayo para determina la actividad de transporte en un animal. Los péptidos de internalización se pueden someter a ensayo solos o cuando están ligados a un agente activo, tal como un péptido activo, por ejemplo, KLSSIESDV (SEQ ID NO: 12). El péptido de internalización, opcionalmente unido a un agente activo, tal como un péptido, se marca, preferiblemente con una marca fluorescente, tal como cloruro de dansilo. A continuación el péptido de internalización se inyecta periféricamente en un animal, tal como un ratón. Es adecuada la inyección intraperitoneal o intravenosa, por ejemplo. Aproximadamente una hora después de la inyección, los ratones se sacrifican, se perfunden con solución de fijación (paraformaldehído al 3%, glutaraldehído al 0,25%, sacarosa al 10%, 10 U/ml de heparina en solución salina). A continuación se retiran los cerebros, se congelan y se seccionan. Las secciones se analizaron para determinar la fluorescencia utilizando un microscopio confocal. La actividad de internalización se determina a partir de la fluorescencia, opcionalmente con respecto a controles positivos y negativos. Un control positivo adecuado es el péptido tat patrón conectado al mismo péptido activo (si estuviera presente) que el péptido de internalización a prueba. Un control negativo adecuado es un péptido activo marcado fluorescentemente que no está unido a un péptido de internalización. También se puede utilizar como control negativo un vehículo no marcado.

Se pueden llevar a cabo experimentos similares en cultivos de células para someter a ensayo las variantes de tat (véase el documento US20030050243). Un péptido tat variante marcado con fluorescencia, opcionalmente unido a un péptido activo se aplica a un cultivo de neuronas corticales. Se determina la absorción utilizando microscopía de fluorescencia durante varios minutos después de la aplicación. Se puede determinar el aumento de absorción con

respecto a los controles positivos y negativos como se describe para los experimentos sobre la absorción en animales.

4. Medición de la actividad en el tratamiento del accidente cerebrovascular

Se puede someter a ensayo la actividad de los péptidos quiméricos que comprenden un péptido de internalización unido a un péptido activo (o un peptidomimético de semejante péptido quimérico) en diferentes modelos animales de accidente cerebrovascular. En uno de tales modelos, ratas macho adultas Sprague-Dawley se someten a la oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAO) durante 90 minutos mediante el método de sutura intraluminal (36,37). Los animales se mantienen en ayunas durante la noche y se les inyecta sulfato de atropina (0,5 mg/kg IP). Después de 10 minutos se induce la anestesia. Las ratas se intuban oralmente, se someten a ventilación mecánica, y se paralizan con el bromuro de pancuronio (0,6 mg/kg IV). La temperatura corporal se mantiene a 36,5-37,5°C con una lámpara de calentamiento. Se utilizan catéteres de polietileno en la arteria y la vena femoral para registrar continuamente la presión arterial y para tomar muestras de sangre para las mediciones de gases y pH. La MCAO transitoria se logra durante 90 min mediante la introducción de una sutura de nylon de monofilamento 3-0 recubierta con poli-L-lisina (Harvard Apparatus) en el círculo de Willis a través de la arteria carótida interna, ocluyendo de manera eficaz la arteria cerebral media. Esto produce un infarto extenso que abarca la corteza cerebral y los ganglios basales. Los animales se tratan o bien con un péptido quimérico a prueba o bien con un control negativo o positivo. El tratamiento puede ser antes o hasta una hora después de la inducción de la isquemia. Un control negativo puede ser vehículo. Un control positivo puede ser el péptido Tat-NR2B9c, YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO: 17), que se había demostrado previamente que era eficaz. El péptido quimérico se libera por medio de una sola inyección intravenosa de bolo 45 min antes de la MCAO (3 nmoles/g). Después de la administración de los compuestos a los animales, se determinan el volumen de infarto y/o el índice de discapacidad. Los volúmenes de infarto se determinan por lo general 24 horas después del tratamiento, pero se pueden determinar en un momento posterior, tal como 3,7,14 o 60 días. El índice de discapacidad se puede controlar a través del tiempo, p. ej., a las 2 horas después del tratamiento, 24 horas después del tratamiento, una semana y un mes después del tratamiento. Los péptidos quiméricos que muestran una reducción estadísticamente significativa en el volumen de infarto y/o el índice de discapacidad con respecto a los animales de control no tratados con los compuestos se identifican por tener una actividad útil para poner en práctica los métodos de la invención.

Se pueden realizar experimentos similares en animales sometidos a isquemia permanente. La isquemia permanente del vaso de la pía madre de la arteria cerebral media se puede llevar a cabo como describen Forder et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 288: H-1989 H 1996 (2005). En resumen, se canula la ECA derecha con tubo de polietileno PE 10. El cráneo se expone a través de una incisión en la línea media, y se realiza una ventana craneal de 6 a 8 mm sobre la corteza somatosensorial derecha (2 mm caudal y 5 mm lateral al bregma). Las arterias de la pia madre se visualizan mediante la inyección de bolos pequeños (10-20 μl) del colorante vital azul violeta patente (10 mmol/l, Sigma) en solución salina normal, en la ECA. Las mismas tres ramas de la MCA arteriolares de la pia madre se cauterizan eléctricamente y las inyecciones de colorante se repiten para asegurar la interrupción del flujo a través de las arteriolas cauterizadas. A continuación se cierra la incisión y el animal se devuelve a su jaula y se le deja acceso libre a alimento y agua. Este modelo de isquemia permanente produce un pequeño infarto altamente reproducible limitado a la corteza subyacente en las arterias de la pia madre terminales coaguladas.

La arteria cerebral media izquierda puede ser ocluida por medio del método de sutura intraluminal descrito por Longa, Stroke 20, 84-91 (1989). En resumen, la arteria carótida común izquierda (CCA) se expone a través de una incisión de la línea media del cuello y se diseca sin de los nervios circundantes y la fascia, desde su bifurcación a la base del cráneo. Las ramas de la arteria occipital de la arteria carótida externa (ECA) se aislan a continuación, y estas ramas se disecan y se coagulan. La ECA se diseca adicionalmente de manera distal y se coagula junto con las ramas de las arterias lingual terminal y maxilar, que después se dividen. La arteria carótida interna (ICA) se aísla y separa del nervio vago adyacente, y la arteria pterigopalatina se liga cerca a su origen. Se redondea la punta de una longitud de 4 cm de una sutura de nylon de monofilamento 3-0 (Harvard Apparatus) quemándola para lograr un diámetro de la punta de 0,33-0,36 mm y una longitud de la punta de 0,5-0,6 mm y se recubre con poli-L-lisina (Belayev et al., 1996). La sutura se introduce a través de la CCA y se hace avanzar dentro de la ICA y de allí al círculo de Willis (aproximadamente 18-20mm desde la bifurcación de la carótida), ocluyendo eficazmente la arteria cerebral media. La sutura de seda en torno a la CCA se ajusta alrededor de la sutura de nailon intraluminal para asegurarla y ocluir de forma permanente la arteria cerebral media.

5. Escrutinio basado en células de péptidos activos

Opcionalmente, los péptidos activos o los peptidomiméticos de los mismos también se pueden escrutar para determinar la capacidad de inhibir las interacciones entre PSD-95 y NMDAR 2B utilizando los análisis descritos, por ejemplo, en el documento US 20050059597. Los péptidos útiles típicamente tienen valores de CI50 de menos de 50 μM, 25 μM, 10 μM, 0,1 μM o 0,01 μM en semejante análisis. Los péptidos preferidos tienen típicamente un valor de CI50 entre 0,001-1 μM, y más preferiblemente 0,05-0,5 o 0,05 a 0,1 mM.

VI. Accidente cerebrovascular y afecciones relacionadas

Un accidente cerebrovascular es una afección resultante del deterioro del flujo sanguíneo en el SNC sin importar la causa. Las causas potenciales incluyen embolia, hemorragia y trombosis. Algunas células neuronales mueren inmediatamente como resultado del deterioro del flujo sanguíneo. Estas células liberan sus moléculas componentes incluyendo el glutamato, que a su vez activa los receptores de NMDA, que elevan los niveles de calcio intracelulares, y los niveles de enzimas intracelulares que conducen a una mayor muerte celular neuronal (cascada de la excitotoxicidad). La muerte de tejido del SNC se conoce como infarto. El volumen del infarto (es decir, el volumen de células neuronales muertas resultantes de accidentes cerebrovasculares en el cerebro) se puede utilizar como un indicador de la magnitud de los daños patológicos que resultan de un accidente cerebrovascular. El efecto sintomático depende tanto del volumen del infarto como de en qué lugar del cerebro está localizado. El índice de discapacidad se puede utilizar como una medida del daño sintomático, tal como la escala de valoración de accidentes cerebrovasculares de Rankin (Rankin, Scott J Med; 2:200-15 (1957)) y el índice de Barthel. La escala de Rankin se basa en la evaluación directa de las condiciones globales de un paciente de la siguiente manera.

Tabla 4

0: No hay síntomas en absoluto

1: Sin discapacidad significativa a pesar de los síntomas; capaz de llevar a cabo todas las tareas y actividades habituales.

2: Ligera discapacidad; incapaz de llevar a cabo todas las actividades anteriores, pero capaz de cuidar de sí mismo sin ayuda.

3: Discapacidad moderada que requiere un poco de ayuda, pero capaz de caminar sin ayuda

4: Discapacidad de moderada a grave, no puede caminar sin ayuda y no puede atender sus propias necesidades corporales sin ayuda.

5: Discapacidad severa; postrado en cama, incontinencia, y requieren cuidados de enfermería y atención constantes.

El Índice de Barthel se basa en una serie de preguntas acerca de la capacidad del paciente para llevar a cabo 10 actividades básicas de la vida diaria que da como resultado una puntuación entre 0 y 100, indicando una puntuación menor una mayor discapacidad (Mahoney et al., Maryland State Medical Journal 14:56-61 (1965)).

Alternativamente la gravedad/consecuencias del accidente cerebrovascular se pueden medir mediante la escala de accidentes cerebrovasulares NIH, disponible en la red ninds.nih.gov web/doctors/NIH_Stroke_Scale_Booklet.pdf.

La escala se basa en la capacidad de un paciente para llevar a cabo 11 grupos de funciones que incluyen evaluaciones del nivel de conciencia, las funciones motoras, sensoriales y de lenguaje del paciente.

Un accidente cerebrovascular isquémico se refiere más específicamente a un tipo de accidente cerebrovascular que está causado por el bloqueo del flujo de sangre al cerebro. La afección subyacente de este tipo de bloqueo es muy comúnmente el desarrollo de depósitos grasos que recubren las paredes de los vasos. Esta afección se denomina aterosclerosis. Estos depósitos grasos pueden causar dos tipos de obstrucción. La trombosis cerebral hace referencia a un trombo (coágulo de sangre) que se desarrolla en la parte obstruida del vaso. "Embolia cerebral" hace referencia generalmente a un coágulo de sangre que se forma en otro lugar en el sistema circulatorio, por lo general el corazón y las arterias grandes de la parte superior del pecho y cuello. Una porción del coágulo de sangre se suelta a continuación, entra en el torrente sanguíneo y viaja a través de los vasos sanguíneos del cerebro hasta que llega a vasos demasiado pequeños como para dejarlo pasar. Una segunda causa importante de la embolia es un latido irregular del corazón, conocido como fibrilación arterial. Esto crea condiciones en las que se pueden formar coágulos en el corazón, desprender y viajar hasta el cerebro. Las causas potenciales adicionales del accidente cerebrovascular isquémico son hemorragia, trombosis, disección de una arteria o una vena, paro cardíaco, choque de cualquier causa, incluyendo hemorragia y causas iatrogénicas tales como lesión quirúrgica directa a los vasos sanguíneos del cerebro o vasos que van al cerebro o cirugía cardiaca. El accidente cerebrovascular isquémico representa aproximadamente 83% de todos los casos de accidente cerebrovascular.

Los ataques isquémicos transitorios (TIA) son accidentes cerebrovasculares menores o de advertencia. En un TIA, las condiciones indicativas de un accidente cerebrovascular isquémico están presentes y se desarrollan los signos de advertencia típicos del accidente cerebrovascular. Sin embargo, la obstrucción (coágulo de sangre) se produce durante un período de tiempo corto y tiende a resolverse por sí misma a través de los mecanismos normales.

El accidente cerebrovascular hemorrágico representa aproximadamente 17% de los casos de accidente cerebrovascular. Éste es el resultado de un vaso debilitado que se rompe y sangra en el cerebro circundante. La sangre se acumula y comprime el tejido cerebral circundante. Los dos tipos generales de accidentes cerebrovasculares hemorrágicos son la hemorragia intracerebral y la hemorragia subaracnoidea. El accidente cerebrovascular hemorrágico es el resultado de la rotura de un vaso sanguíneo debilitado que se rompe. Las posibles causas de la ruptura de un vaso sanguíneo debilitado incluyen una hemorragia hipertensiva, en la que la presión arterial alta causa una ruptura de un vaso sanguíneo u otra causa subyacente de los vasos sanguíneos debilitados, como una malformación vascular cerebral rota incluyendo un aneurisma cerebral, una malformación arteriovenosa ( AVM) o una malformación cavernosa. Los accidentes cerebrovasculares hemorrágicos también pueden surgir de una transformación hemorrágica de un accidente cerebrovascular isquémico que debilita los vasos sanguíneos en el infarto, o una hemorragia a partir de tumores primarios o metastáticos en el SNC que contienen vasos sanguíneos anormalmente débiles. El accidente cerebrovascular hemorrágico también puede deberse a causas iatrogénicas tales como lesión quirúrgica directa en un vaso sanguíneo del cerebro. Un aneurisma es una dilatación de una zona debilitada de un vaso sanguíneo. Si se deja sin tratar, el aneurisma continúa debilitándose hasta que se rompe y sangra dentro del cerebro. Una malformación arteriovenosa (AVM) es una agrupación de vasos sanguíneos formados anormalmente. Una malformación cavernosa es una anomalía venosa que puede causar una hemorragia de las estructuras venosas debilitadas. Cualquiera de estos vasos puede romperse, causando también una hemorragia en el cerebro. El accidente cerebrovascular hemorrágico puede también resultar de un trauma físico. El accidente cerebrovascular hemorrágico en una parte del cerebro puede provocar un accidente cerebrovascular isquémico en otra a través la escasez de sangre perdida en el accidente cerebrovascular hemorrágico.

Otros varios afecciones neurológicas también pueden causar la muerte neurológica a través de la excitotoxicidad mediada por NDMAR. Estas afecciones incluyen epilepsia, hipoxia, lesión traumática en el sistema nervioso central no asociada con accidente cerebrovascular tal como lesión cerebral traumática y lesión de la médula espinal, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson.

VII. Métodos de tratamiento

Los péptidos quiméricos descritos anteriormente o los peptidomiméticos de los mismos se utilizan para tratar a los pacientes con accidente cerebrovascular. El tratamiento se inicia tan pronto como sea posible después del inicio del accidente cerebrovascular. En ocasiones, el tratamiento se puede iniciar en o antes de la aparición del accidente cerebrovascular en pacientes que se sabe que están en alto riesgo. Los factores de riesgo incluyen hipertensión, diabetes, antecedentes familiares, tabaquismo, accidente cerebrovascular previo, y cirugía. Por lo general, el tratamiento se administra primero en el plazo de una a 24 horas después del inicio del accidente cerebrovascular. A menudo, es suficiente una dosis única de péptido quimérico de la invención. Sin embargo, también se pueden administrar múltiples dosis a intervalos de 6-24 horas o mayores.

El uso de péptidos variantes de tat que tienen capacidad reducida para unirse a e inhibir los canales de calcio de tipo N es particularmente útil en pacientes que tienen una susceptibilidad por encima de la normal a los efectos secundarios resultantes de la unión a estos canales. Estos incluyen pacientes que tienen una presión arterial normal (sistólica 120-129 mm Hg y diastólica de 80-84 mm Hg) o por debajo de la normal. La presión arterial por debajo de la normal se puede producir como resultado de la pérdida de sangre contemporáneamente al insulto al SNC (por ejemplo, en un paciente que sufre una lesión traumática en un accidente de coche, o en un paciente que incurre en pérdida de sangre a causa de una caída después del accidente cerebrovascular).

La respuesta del paciente a la administración de un péptido quimérico o peptidomimético de la invención se puede controlar mediante la determinación de volumen del infarto antes y en diferentes momentos después del tratamiento. La isquemia temprana es detectable utilizando la formación de imágenes por difusión de MRI. Las combinaciones de protocolos de MRI, incluyendo imágenes de perfusión, se pueden utilizar para determinar el tejido en riesgo y predecir el volumen del infarto. Los métodos logran preferiblemente una reducción en el volumen de infarto de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, o 50% con respecto al volumen medio del infarto en una población de pacientes comparables que no reciben tratamiento mediante los métodos de la invención. La respuesta del paciente también se puede medir a partir del índice de discapacidad determinado un día a una semana después del inicio del tratamiento. El paciente muestra preferiblemente una mejora (es decir, menos discapacidad) en índice de discapacidad de al menos 4, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, o 50% con respecto al índice de discapacidad medio en una población de pacientes comparables que no reciben tratamiento mediante los métodos de la invención. El paciente preferiblemente puntúa cero o uno en el índice de accidente cerebrovascular de Rankin o más de 75 en el índice de Barthel.

VIII. Composiciones farmacéuticas, dosis y rutas de administración

Los péptidos quiméricos o peptidomiméticos de la invención se pueden administrar en forma de una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas se fabrican bajo condiciones GMP. Las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar en una forma de dosificación unitaria (es decir, la dosificación para una única administración) que contiene cualquiera de las dosificaciones indicadas anteriormente. Las composiciones farmacéuticas se pueden fabricar por medio de procedimientos de mezcla, disolución, granulación, elaboración de

grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales. En particular, los péptidos quiméricos o peptidomiméticos liofilizados de la invención se pueden utilizar en las formulaciones y composiciones que se describen a continuación.

Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional utilizando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o coadyuvantes fisiológicamente aceptables que faciliten el procesamiento de los péptidos quiméricos o peptidomiméticos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la ruta de administración seleccionada.

La administración puede ser parenteral, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, tópica, intranasal o intramuscular. Se prefiere la administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral son preferiblemente estériles y sustancialmente isotónicas. Para los inyectables, los péptidos quiméricos se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o solución salina fisiológica o tampón de acetato (para reducir las molestias en el lugar de la inyección). La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes suspensores, estabilizantes y/o dispersantes.

Alternativamente, los péptidos quiméricos o peptidomiméticos pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.

Para la administración transmucosal, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que se vaya a traspasar. Esta ruta de administración puede ser utilizada para suministrar los compuestos en la cavidad nasal o para la administración sublingual.

Para la administración oral, los péptidos quiméricos o peptidomiméticos se pueden formular con portadores farmacéuticamente aceptables tales como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por un paciente que se vaya a tratar. Para las formulaciones sólidas orales tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos, los excipientes adecuados incluyen cargas tales como azúcares, tales como lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP); agentes de granulación; y agentes aglutinantes. Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona entrecruzada, agar, o ácido algínico o una sal de los mismos tal como alginato de sodio. Si se desea, las formas de dosificación sólidas pueden ser recubiertas con azúcar o ser recubiertas con recubrimiento entérico utilizando técnicas convencionales. Para las preparaciones líquidas orales tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, los portadores, excipientes o diluyentes adecuados incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes. Adicionalmente, se pueden añadir agentes aromatizantes, conservantes, agentes colorantes y similares.

Además de las formulaciones descritas previamente, los péptidos quiméricos o peptidomiméticos también se pueden formular como una preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación (por ejemplo subcutáneamente o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. De este modo, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo en forma de una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o en forma de derivados poco solubles, por ejemplo, una sal poco soluble.

Alternativamente, se pueden emplear otros sistemas de liberación farmacéutica. Los liposomas y las emulsiones se pueden utilizar para liberar los péptidos quiméricos. También se pueden emplear ciertos disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido, aunque normalmente a costa de una mayor toxicidad. Adicionalmente, los compuestos se pueden suministrar utilizando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros sólidos que contienen el agente terapéutico.

Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar los péptidos quiméricos durante unas pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se pueden emplear estrategias adicionales para la estabilización de proteínas.

Como los péptidos quiméricos o peptidomiméticos de la invención pueden contener cadenas laterales o extremos cargados, estos se pueden incluir en cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente en forma de ácidos o bases libres o en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables son aquellas sales que conservan sustancialmente la actividad biológica de las bases libres y que se preparan por reacción con ácidos inorgánicos. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre.

Los péptidos quiméricos o peptidomiméticos se utilizan en una cantidad eficaz para conseguir el objetivo pretendido

(p. ej., reducción de efecto del daño del accidente cerebrovascular perjudicial y afecciones relacionadas). Una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de péptido quimérico o peptidomimético suficiente para reducir significativamente el daño resultante del accidente cerebrovascular en una población de pacientes (o modelos animales) tratados con los péptidos quiméricos o peptidomiméticos de la invención con respecto al daño en

una población de control de pacientes con accidente cerebrovascular (o modelos animales) no tratados con los péptidos quiméricos o peptidomiméticos de la invención. La cantidad también se considera terapéuticamente eficaz si un paciente tratado individualmente logra un resultado más favorable que el resultado medio (determinado por el volumen de infarto o índice de discapacidad) en una población de control de pacientes comparables no tratados mediante los métodos de la invención. La cantidad también se considera terapéuticamente eficaz si un paciente tratado individualmente muestra una discapacidad de dos o menos en la escala de Rankin y 75 o más en la escala de Barthel. Una dosificación también se considera terapéuticamente eficaz si una población de pacientes tratados muestra una distribución significativamente mejorada (es decir, menor discapacidad) de las puntuaciones en una escala de discapacidad de una población comparable no tratada, véase Lees et al 1, N Engl J Med 2006; 354:588

600. Un régimen terapéuticamente eficaz significa una combinación de una dosis terapéuticamente eficaz y una frecuencia de administración necesarias para conseguir el objetivo pretendido como se ha descrito anteriormente. Por lo general, es suficiente una sola administración.

Los intervalos de dosificación preferidos incluyen de 0,001 a 20 μmol de péptido quimérico o peptidomimético por kg de peso corporal del paciente, opcionalmente de 0,03 a 3 mol péptido quimérico por kg de peso corporal del paciente con respecto a los μmol de péptido quimérico por kg de peso corporal del paciente en el plazo de 6 horas desde el accidente cerebrovascular. En algunos métodos, se administran 0,1-20 μmol de péptido quimérico o peptidomimético por kg de peso corporal del paciente en el plazo de 6 horas. En algunos métodos, se administran 0,1-10 μmol de péptido quimérico o peptidomimético por kg de peso corporal del paciente en el plazo de 6 horas, más preferiblemente aproximadamente 0,3 μmol de péptido quimérico por kg de peso corporal del paciente en el plazo de 6 horas. En otros casos, el intervalo de dosificación es de 0,005 a 0,5 μmol de péptido quimérico o peptidomimético por kg de peso corporal del paciente. La dosificación por kg de peso corporal se puede convertir de ratas a seres humanos mediante la división por 6,2 para compensar las diferentes proporciones de área de superficie con respecto a masa. Las dosificaciones se pueden convertir de unidades de moles a gramos multiplicando por el peso molar de un péptido quimérico o peptidomimético. Las dosificaciones adecuadas de los péptidos quiméricos o peptidomiméticos para su uso en seres humanos pueden incluir de 0,001 a 5 mg/kg de peso corporal del paciente, o más preferiblemente de 0,005 a 1 mg/kg de peso corporal del paciente o de 0,05 a 1 mg/kg, o de 0,09 a 0,9 mg/kg. En peso absoluto para un paciente de 75 kg, estas dosificaciones se traducen en 0,075 a 375 mg, 0,375 a 75 mg o 3,75 mg a 75 mg o 6,7 a 67 mg. Redondeando para abarcar variaciones, p. ej., en el peso del paciente, la dosificación se encuentra por lo general entre 0,05 y 500 mg, preferiblemente de 0,1 a 100 mg, de 0,5 a 50 mg, o 120 mg.

La cantidad de péptido quimérico o peptidomiméticos administrado depende del sujeto a tratar, del peso del sujeto, la gravedad de la aflicción, el modo de administración y el juicio del médico que prescribe. La terapia se puede repetir intermitentemente mientras los síntomas son detectables o incluso cuando no son detectables. La terapia se puede proporcionar sola o combinada con otros fármacos.

La dosis terapéuticamente eficaz de los presentes péptidos quiméricos o peptidomiméticos puede proporcionar un beneficio terapéutico sin causar toxicidad sustancial. La toxicidad de los péptidos quiméricos se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, p. ej., mediante la determinación de la DL50 (dosis letal para 50% de la población) o la DL100 (dosis letal para 100% de la población). La razón de dosis entre el efecto tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. Se prefieren los péptidos quiméricos o peptidomiméticos que exhiben altos índices terapéuticos (véase, p. ej., Fingl et al., 1975, En: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Cap. 1, pág. 1).

IX. Métodos de escrutinio

La invención proporciona adicionalmente métodos de escrutinio de otros péptidos de internalización para determinar si tales péptidos se unen a y/o inhiben los canales de calcio de tipo N. Los péptidos de ensayo se pueden evaluar para determinar tal unión o inhibición, ya sea solos o unidos a un agente activo, concretamente a un péptido activo, conocido a veces como péptido de carga. Otros péptidos de internalización que se pueden someter a ensayo incluyen el péptido internalización antenapedia (Bonfanti, Cancer Res. 57, 1442-6 (1997)) (y variantes del mismo), variantes de Tat, Penetratina, SynB1 y 3, Transportan, Anfipatic, gp41 NLS, polyArg, y otros descritos en las siguientes referencias (Temsamani, Drug Discovery Today, 9 (23):1012-1019, 2004; De Coupade, Biochem J., 390:407-418, 2005; Saalik Bioconjugate Chem. 15: 1246-1253, 2004; Zhao, Medicinal Research Reviews 24(1):1-12, 2004; Deshayes, Celular and Molecular Life Sciences 62:1839-49, 2005) (todas incorporadas como referencia).

X. Unión de variantes de tat a otros agentes activos

Las variantes de tat descritas anteriormente se pueden unir a cualquier otro agente activo para promover la absorción del agente a través de las membranas celulares y/o la barrera hematoencefálica. El uso de un agente de quimérico que comprende o que consiste en una variante de tat y agente activo en un método terapéutico mejora la biodisponibilidad en el sitio en el que se desea con respecto al uso del agente activo solo, y reduce los efectos secundarios a través de la unión a los canales de calcio de tipo N con respecto al uso del agente activo unido a un péptido tat convencional. Las variantes de tat son particularmente útiles para agentes activos con una diana intracelular y/o fármacos neuroactivos que necesitan cruzar la barrera hematoencefálica para ejercer la actividad. Algunos, pero no todos los agentes activos susceptibles de anclaje a variantes de tat son péptidos. El uso de variantes de tat es particularmente útil para fármacos existentes que tienen una escasa biodisponibilidad, dosificaciones altas o vidas medias cortas.

Algunas pautas para la selección de agentes activos, los métodos para los anclajes y el uso de los mismos son proporcionados por la bibliografía científica y de patentes en relación con los péptidos tat anteriores (véanse, p.

5 ej., los documentos US 6.316.003 y US 5.804.604). Toda la descripción anterior en relación con los péptidos quiméricos que comprende un péptido activo unido a una variante tat para el tratamiento de los accidentes cerebrovasculares y las enfermedades relacionadas se aplica mutatis mutandis a agentes quiméricos que comprenden una variante tat unida a un agente activo.

La siguiente tabla enumera los nombres de los agentes activos (algunos de los cuales son fármacos aprobados), los

10 trastornos cuyo tratamiento es útil, si la enfermedad es aguda o crónica, las rutas de administración de los fármacos (en la medida establecida) y los comentarios sobre los problemas con los medicamentos existentes que pueden ser superados en parte mediante el transporte mejorado a través de membranas conferido por un péptido variante de tat.

Los agentes quiméricos que comprenden un péptido variante de tat unido a un agente activo se pueden utilizar a la

15 misma o menor dosificación sobre una base molar que el agente activo solo, y se pueden administrar por la misma ruta que el agente activo solo, y para el tratamiento de la misma o las mismas enfermedades que el agente activo solo. Los métodos preferidos de administración para las descripciones de los productos conjungados de péptido:agente activo son intravenosa, intraarterial, intranasal/inhalación, intramusular, intraperitoneal, sub-lingual, por el recto, y tópica (para trastornos de la dermis o próximos a las células epiteliales).

20 Tabla 5

Agentes activos: Enfermedad Agudo/ cron Ruta de administración Comentario Referencia

Fenobarbital: Epilepsia IV/oral Dependencia, problemas Motamedi y Meador (2006)

(luminal: de tolerancia, Curr Neurol Neurosci Rep, 6

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Diazepam (Valium): Ansiedad IP/oral Dependencia, efectos secundarios, interacciones Beard, et al (2003) Health Technol Assess, 7 (40): iii, ix-x, 1-111. Drugs.com

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BHE, efectos secundarios,: Pharmacokinet, 45 (2): 109

vida media = 1,5 hrs: 36. USPTO.gov (patente

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Vacomicina: Antibiótico IP Péptido, baja absorción, vida media 4-6 horas de Hoog, et al (2004) Clin Pharmacokinet, 43 (7): 41740. Drugs.com

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AVR-118 (péptido): Paliativo del cáncer Subcutánea Eficacia desconocida, dosis desconocida Clinicaltrials.gov

Oxitocina (péptido): Trastornos del estado de ánimo IV/IM Interacciones, dosificación desconocida Swaab, et al (2005) Ageing Res. Rev, 4 (2): 141-94. Drugs.com

Pravastatina (Pravacol): MS Oral Eficacia desconocida, baja biodisponibilidad Hatanaka (2000) Clin Pharmacokinet, 39 (6): 397412. Clinicaltrials.gov

Remifentanilo: Dolor, quemaduras IV Vida media, 3.5 min metabolizado por esterasa desconocida Scott y Perry (2005) Drugs, 65 (13): 1793-1823. Clinicaltrials.gov

Neurotensina: Esquizofrenia Parkinson, adicción Péptido 13AA, degradado fácilmente, no puede cruzar la BHE Boules, et al., (2006) Peptides, 27 (10): 2523-33.

GDNF (factor neurotrófico derivado de la glía): Parkinson Crónico Intraparénquimal Péptido, no puede cruzar la BHE Grondin, et al (2003) Prog. Drug Res., 61: 101-23.

Inhibidores de proteasa: VIH Oral Todos los inhibidores de proteasa del VIH adolecen de la misma capacidad aguda del VIH para mutar, generando cepas de VIH -Oldfield y Plosker (2006) Drugs 66 (9): 1275-1299.

-Lopinavir

Agentes activos: Enfermedad Agudo/ cron Ruta de administración Comentario resistentes a los fármacos Referencia

-Ritonavir

-Saquinavir: -Porter y Charman (2001) Adv Drug Deliv Rev, 1 de octubre, 50 Suppl 1: S12747.

-Darunavir

-Atazanavir

-Amprenavir




: -Piacenti (2006) Pharmacotherapy 26 (8): 1111-1133.

Dihidroergotamina: Migraña IV, IM, sub-Q Las interacciones causan isquemia periférica, vida media de 9 horas Modi y Lowder (2006) Am Fam Physician 73(1): 72-8.

Sporamax (itaconazol): Antifúngico Oral Eventualmente desarrolla resistencia al fármaco, insuficiencia cardiaca congestiva en algunas poblaciones Wang y Remold (2006) Cardiol Rev 14(5): 223-6.

Inhibidores de la proteína quinasa C: Infarto de miocardio agudo, accidente cerebrovascular, isquemia, lesión por reperfusión Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Núms. 20050267030, 20060148702, 20060293237, 20050215483, 20040204364, 20040009922

AII-7: Cáncer, cáncer de mama Crónico Peptidomimético que bloquea el dominio intracelular Erbb2 y aumenta la sensibilidad al taxol Kunz et al., Mol Cancer Res. 2006; 4(12): 983-98

Péptido CRAMP: Infección por Salmonella Péptido antimicrobiano intracelular que reduce la replicación Salmonella Rosenberger, CM. PNAS | 24 de febrero 2004 | vol. 101 | núm. 8 | 2422-2427

Péptido del canal de sodio: Puede reducir los espasmos musculares (epilepsia, piernas inquietas, Parkinson, etc.) El péptido correspondiente al segmento intracelular corto entre los dominios transmembrana homólogos III y IV de la subunidad alfa del canal de sodio ralentizó la inactivación Vassilev, Science (1988) 241: 1658-6

Aptámero KDI1: Bloquea la señalización de EGF posible Buerger. J. Biol.. Chem., Vol. 278, número 39, 37610-37621, 26 de Septiembre 2003

: anticanceroso Septiembre 2003

ARN/ terapia génica: Se pueden utiliza péptidos transportadores para incorporar los ARN o ARNit/ARNi para el tratamiento Turner et al (2007) Blood Cells Mol Dis, 38(1): 1-7.

Ejemplo 1: Escrutinio de efectos secundarios de Tat-NR2B9c

Tat-NR2B9c es un péptido quimérico de un péptido tat convencional y KLSSIESDV (SEQ ID NO: 12) que se ha demostrado previamente que es eficaz en un modelo de rata de accidente cerebrovascular. En este ejemplo se escruta el péptido Tat-NR2B9c para determinar su capacidad de inhibir la unión de ligandos conocidos a aproximadamente 70 proteínas receptoras. Los ejemplos de receptores escrutados incluyeron glutamato, histamina H1, canales de potasio, Dopamina D1, canales de calcio (tipo L, tipo N).

Se encontró que Tat-NR2B9c inhibía la unión a dos de tales receptores, un canal de calcio de tipo N y una quimiocina CXCR2 (IL-8RB). El escrutinio se llevó a cabo en forma de un análisis unión competitiva en el que Tat-NR2B9c no marcado a una concentración 10 mM compitió con un ligando marcado con I125 por la unión a su receptor en presencia del ligando no marcado para aumentar la sensibilidad. A 10 mM, Tat-NR2B9c mostró una inhibición de 100% de la unión de la ω-Conotoxina GVIA radiomarcada a canales de Ca de tipo N. Tat-NR2B9c también mostró una inhibición de 80% de IL-8/IL-8RB a la misma concentración. Los resultados se muestran en las Figs. 1A, B, C.

Ejemplo 2: Mutagénesis de un péptido Tat convencional

Al igual que el inhibidor del canal de calcio de tipo N conocido Ziconotida, Tat-NR2B9c contiene numerosas cargas positivas. Las cargas positivas facilitan presumiblemente la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica y también pueden contribuir a la unión al canal de calcio de tipo N. La comparación directa de la secuencia muestra cierta similitud en las cargas positiva (R = Arginina, K = Lisina), así como el espaciamiento de estas cargas a lo largo de la cadena principal del péptido (véase el alineamiento de más abajo). Esto cartografía aproximadamente el epítopo de unión del canal de calcio de tipo N Tat-NR2B9c con respecto al epítopo de la región Tat (mostrado en cursiva) y un aminoácido del dominio NMDAR2B.

YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (Tat-NR2B9c) (SEC ID NO: 17)

CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKCG (ziconotida) (SEC ID NO: 72)

Los autores de la presente invención plantearon la hipótesis de que la mutación del residuo Y en la posición 1 de Tat-NR2B9c a F podría reducir la unión a los canales de calcio de tipo N sin deteriorar la captación celular del fármaco. Los autores de la presente invención también plantearon la hipótesis de que las modificaciones de un tramo de residuos alcalinos en el péptido tat convencional lograrían un resultado similar. Los péptidos se aplicaron cada uno a 100 μM. Se sometieron a ensayo los siguientes péptidos (la corriente de Ca2+ se muestra como un porcentaje después de cada péptido): 1990 TAT: YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1) (57 +/- 1,6% (n = 5)); 1991 2B9c: KLSSIESDV (SEQ ID NO: 12) (94 +/- 1,7% (n = 5)); 1992 Tat-NR2B9c-AA; YGRKKRRQRRRKLSSIEADA (SEQ ID NO: 18) (74 +/- 2,4% (n = 6)); 1993 F-Tat-NR2B9c: FGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO: 19) (91 +/- 1,6% (n = 5)); 1994 Tat-NR2B9c K a A: YGRKKRRQRRRALSSIESDV (SEQ ID NO: 20) (77 +/-1,8% (n = 7)); 1995 F-Tat-NR2B9c K a A: FGRKKRRQRRRALSSIESDV (SEQ ID NO: 21) (97 +/- 0,2% (n = 6)); 1976: YGRKKRRQRRRKLSSIESDX (SEQ ID NO: 22) en donde X = norvalina (66 +/-3,4% (n = 6)); 1977: YGRKKRRQRRRKLSSIESDX (SEQ ID NO: 23) en donde X = L-t-butil-glicina (65 +/-5,1% (n = 5)); 1987: isómero D de Tat-NR2B9c (82 +/- 2,2% (n = 6)). Tat-NR2B9c (68 +/- 1,7% (n = 7)). Los datos se representaron como media +/

e.t.m.

Los péptidos también se sometieron a ensayo en el siguiente análisis de pinzamiento zonal. Los péptidos de internalización y los péptidos quiméricos se escrutaron para determinar su capacidad para inhibir las corrientes iónicas mediadas por los canales de calcio de tipo N. Esto se llevó a cabo mediante la realización de registros de pinzamiento zonal de células completas en neuronas ganglionares de la raíz dorsal, en las que son expresadas las corrientes de calcio de tipo N. Los cultivos de ganglios de la raíz dorsal (DRG) se prepararon a partir de ratones Swiss a los 13-14 días de gestación. En resumen, los DRG se diseccionaron y se sometieron a digestión con tripsina durante 20 min a 37°C, se disociaron mecánicamente y se sembraron en placa sobre cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina. Se hicieron crecer en MEM libre de suero (Neurobasal MEM, B-27 - Gibco Invitrogen Corporation,

Carlsbad, CA). Después de 3-5 días, se añadió una solución FUDR 10 μM para inhibir la proliferación de la glía. Los cultivos se mantuvieron a 37°C en una atmósfera con 5% de CO2 humidificada y se alimentaron dos veces por semana. Los registros de las células completas se llevaron a cabo a temperatura ambiente 10-14 días después del cultivo en placa. Registros Electrofisiológicos: los registros de células completas se realizaron con un amplificador Axopatch-1B (Axon Instruments, Foster City, CA) en el modo de fijación de voltaje. Los electrodos de registro, con resistencias de 3-5 MΩ, se construyeron a partir de vidrio de borosilicato de paredes delgadas (1,5 mm de diámetro; World Precision Instruments, Sarasota, FL) utilizando un extractor de dos etapas (PP83; Narishige, Tokio, Japón). Los datos se digitalizaron, se filtraron (2 kHz) y se adquirieron en línea a través de los programas de ordenador pClamp 9 (Axon Instruments). Las pipetas se llenaron con una disolución que contenía (mM): CsCl 110, MgCl2 3, EGTA 10, HEPES 10, MgATP 3, GTP 0,6. El pH se ajustó a 7,2 con CsOH. La disolución de baño contenía (mM): CaCl2 1, BaCl2 10, HEPES 10, TEA-Cl 160, Glucosa 10, TTX 0,0002 a pH (NaOH) 7,4. Se indujeron corrientes de células completas utilizando pulsos despolarizantes de 40 ms a +20 mV a partir de un potencial de mantenimiento de -60 mV, aplicados cada 15 s. Para someter a ensayo la inhibición dependiente del uso, se indujeron corrientes utilizando pulsos despolarizantes de 10 ms a 20 mV a partir de un potencial de mantenimiento de -60 mV, aplicados cada 0,02 s (50 Hz), 0,05 s (20 Hz), 0,1 s (10 Hz) o 15 s (0,07 Hz), respectivamente.

Resultados: Los resultados se presentan en la Figura 2. La porción superior representa las medias +/- e.t.m. de la corriente de calcio en células completas en presencia del péptido indicado normalizado a la corriente de calcio de células completas en las mismas células antes de la aplicación del péptido. La porción inferior de la Fig. 2 muestra los rastros representativos de células enteras a partir de los que se obtuvieron las medias de la porción superior. En resumen, los datos muestran que la porción transportadora de TAT del péptido quimérico es predominantemente responsable de la inhibición de los canales de calcio de tipo N. La mutación de la tirosina N-terminal de Tat-NR2B9c anula casi completamente la capacidad de este péptido quimérico para inhibir los canales de calcio de tipo N. La porción C-terminal de Tat-NR2B9c (KLSSIESDV (SEC ID NO: 12)), F-Tat-Tat NR2B9c o 1994-NR2B9c K a A no mostró ninguna inhibición significativa de actividad de los canales de calcio de tipo N. Los péptidos 1992, 1994 y 1987 mostraron una mejora significativa en la actividad de los canales sobre tat solo aunque todavía mostraron cierta reducción en la cantidad de actividad de los canales de calcio de tipo N. Todos estos péptidos proporcionan una reducción de la unión a los canales de calcio de tipo N sobre Tat convencional solo que indica un mayor índice terapéutico de un fármaco que incluye una de estas secuencias variantes de Tat.

Ejemplo 3: Análisis adicional de la inhibición de las corrientes iónicas mediadas por el canal Ca2+ de tipo N por Tat-NR2B9c

Se llevaron a cabo experimentos adicionales como se representa en las Figuras 4-7. Su propósito fue caracterizar adicionalmente la inhibición de las corrientes iónicas mediadas por el canal Ca2+ de tipo N por Tat-NR2B9c. Adicionalmente, la Figura 4 caracteriza el grado de inhibición de la corriente de Ca2+ por Tat-NR2B9c (YGRKKRRQRRRKLSSIESDV, SEC ID 17) y esto se compara con las otras variantes: 1990 TAT (YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO: 1); 1992 Tat-NR2B9c AA (YGRKKRRQRRRKLSSIEADA, SEC ID 18); 1994 Tat-NR2B9c K a A (YGRKKRRQRRRALSSIESDV, SEC ID 20); 1987 D-Tat-NR2B9c (YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (todos Daminoácidos), SEQ ID); 1976 (YGRKKRRQRRRKLSSIESDX, donde X = norvalina, SEQ ID NO: 22); 1977 (YGRKKRRQRRRKLSSIESDX, donde X = L-t-butil Glicina, la SEQ ID NO: 23).

Cultivo de tejidos: Se prepararon cultivos de ganglios de la raíz dorsal (DRG) a partir de ratones Swiss a los 13-14 días de gestación. En resumen, los DRG se disecados y se sometieron a digestión con tripsina durante 20 min a 37°C, se disociaron mecánicamente y se cultivaron en placa sobre cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina. Se hicieron crecer en MEM libre de suero (Neurobasal MEM, B-27 -Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después de 3-5 días, se añadió una disolución de FUDR 10 μM para inhibir la proliferación de la glía. Los cultivos se mantuvieron a 37°C en una atmósfera con 5% de CO2 humidificada y se alimentaron dos veces por semana. Los registros de las células completas se llevaron a cabo a temperatura ambiente 10-14 días después del cultivo en placa.

Registros electrofisiológicos: Los registros de células completas se llevaron a cabo con un amplificador Axopatch-1B (Axon Instruments, Foster City, CA) en el modo de fijación de voltaje. Los electrodos de registro, con resistencias de 3-5 MΩ, se construyeron a partir de vidrio de borosilicato de paredes delgadas (1,5 mm de diámetro; World Precision Instruments, Sarasota, FL) utilizando un extractor de dos etapas (PP83; Narishige, Tokio, Japón). Los datos se digitalizaron, se filtraron (2 kHz) y se adquirieron en línea a través de los programas de pClamp 9 (Axon Instruments). Las pipetas se cargaron con una disolución que contenía (mM): CsCl 110, MgCl2 3, EGTA 10, HEPES 10, MgATP 3, GTP 0,6. El pH se ajustó a 7,2 con CsOH. La disolución de baño contenía (mM): CaCl2 1, BaCl2 10, HEPES 10, TEA-Cl 160, Glucosa 10, TTX 0,0002 a pH (NaOH) 7,4. Las corrientes de células completas se indujeron utilizando pulsos despolarizantes de 40 ms a +20 mV a partir de un potencial de mantenimiento de -60 mV, aplicados cada 15 s. Para someter a ensayo la inhibición dependiente del uso, las corrientes se indujeron utilizando pulsos despolarizante de 10 ms a +20 mV a partir de un potencial de mantenimiento de -60 mV, aplicado cada 0,02 s (50 Hz), 0,05 s (20 Hz), 0,1 s (10 Hz) o 15 s (0,07 Hz), respectivamente. Análisis de los datos: Los datos se representaron como la media +/- e.t.m.

La Figura 4 demuestra que concentraciones crecientes de todos los péptidos que contenían una secuencia Tat intacta (YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1)) inhibían significativamente las corrientes Ca2+ en neuronas de los

ganglios de la raíz dorsal (que expresan predominantemente canales Ca2+ de tipo N). Esto sugiere que la propiedad de inhibición de las corrientes del canal la Ca2 + de tipo N reside en la secuencia Tat.

Las Figs. 5A y B demuestran que la inhibición de la corriente de Ca2+ por Tat-NR2B9c es específica para los canales de Ca2+ de tipo N. La ω-conotoxina (1 M), un bloqueador del canal de Ca2+ de tipo N selectivo inhibe la corriente de Ca2+, y o se proporciona ninguna inhibición adicional más por Tat-NR2B9c (100 μM) una vez que los canales de N están bloqueados (Fig. 5A, izquierda). Del mismo modo, no se observa ninguna inhibición adicional de la corriente cuando se añade conotoxina después de la inhibición de la corriente iónica por Tat-NR2B9c (Fig. 5A, derecha). Asimismo, el bloqueador del canal de Ca2+ de tipo L selectivo, la nifedipina, no afecta de manera significativa al tamaño de la corriente de Ca2+ registrada en presencia (intracelular 100 μM), o ausencia de, Tat-NR2B9c como se muestra en la Fig. 5B. La porción izquierda de la Fig. 5B muestra las medias +/- e.t.m. de las corrientes de calcio, mientras que a la derecha se encuentran los rastros representativos de las corrientes de células completas de un solo experimento.

La Figura 6 demuestra que el bloqueo de las corrientes de Ca2+ por Tat-NR2B9c no es dependiente de la frecuencia. Se utilizó Tat-NR2B9c 100 μM para someter a ensayo su efecto dependiente del uso. Las corrientes inducidas por pulsos despolarizantes de +20 mV mostraron un fuerte debilitamiento dependiente de la frecuencia. Sin embargo, el aumento de la frecuencia (0,07, 10, 20, 50 Hz) no aumentó el efecto de inhibición de Tat-NR2B9c sobre esta corriente. La figura muestra corrientes de Ca2+ registradas en una neurona de DRG representativa a diferentes frecuencias. Estas corrientes tienen una tendencia natural debilitarse después de unos pocos minutos, y el aumento de la frecuencia no tuvo ningún efecto sobre la inhibición de la corriente por Tat-NR2B9c (representativo de n = 4).

La Figura 7 demuestra que Tat-NR2B9c inhibe la corriente de Ca2+ las neuronas de DRG en una manera que es independiente del voltaje, y que esta inhibición es específica para los canales de Ca2+ de tipo N, debido a que esta no se ve afectada por la nifedipina, un bloqueador de las canales de Ca2+ de tipo L. Las corrientes se indujeron utilizando etapas de fijación de voltaje de 50 ms desde -40 a +50 mV a partir del potencial de mantenimiento de -60 mV.

En conclusión, las Figuras 4-7 muestran que la inhibición de las corrientes de Ca2+ por Tat-NR2B92 es específica para los canales de Ca2+ de tipo N, y es similar a una propiedad de otros péptidos que portan el radical Tat. Los datos muestran también que esta inhibición es específica para los canales de Ca2+ de tipo N, y es independiente de la frecuencia y del voltaje.

Ejemplo 3: F-Tat-NR2B9c es igualmente eficaz en un modelo de accidente cerebrovascular

Se comparó F-Tat-NR2B9c con Tat-NR2B9c a una único dosis de 3 nmol/g de peso en el modelo de isquemia permanente por oclusión de la pía madre de rata descrito anteriormente y adicionalmente en el Ejemplo 4. En ambos casos, el péptido quimérico se administró una hora después de iniciar la isquemia. F-Tat-NR2B9c y Tat-NR2B9c fueron igualmente eficaces en la reducción de tamaño del infarto, como se muestra en la Fig. 3.

Ejemplo 4

Propósito:

1.: Someter a ensayo la eficacia neuroprotectora del péptido Tat-NR2B9c en ratas macho y hembra utilizando el modelo de accidente cerebrovascular oclusión del vaso 3 de la pía madre (P3VO) in vivo.

2.: Averiguar el mecanismo de acción sometiendo a ensayo 6 variaciones del péptido Tat-NR2B9c en ratas macho.

Antecedentes:

El péptido conocido como Tat-NR2B9c ha sido desarrollado y sometido a ensayo previamente en el modelo de MCAO de accidente cerebrovascular en rata. Se ha demostrado que este péptido es neuroprotector como se observa por una reducción del tamaño del infarto. Sin embargo, el modelo MCAO de accidente cerebrovascular da como resultado un gran infarto con amplios déficits neurológicos y acortamiento de la vida. El modelo P3VO de accidente cerebrovascular da como resultado un infarto cortical mucho más pequeño con déficit neurológico mínimo y una duración de vida normal.

Se sometieron a ensayo seis péptidos adicionales que contenían la misma secuencia de aminoácidos que Tat-NR2B9c excepto por los 3 aminoácidos terminales. Mediante la variación de estos aminoácidos y, sometiendo a ensayo a continuación la eficacia neuroprotectora de los péptidos en el modelo P3VO de accidente cerebrovascular, se puede averiguar adicionalmente el mecanismo de acción.

35 La estructura de aminoácidos de Tat-NR2B9c y los 6 péptidos son los siguientes:

Secuencia:: Nombre:

YGRKKRRQRRRKLSSIESDV: Tat-NR2B9c (SEQ ID NO: 17)

YGRKKRRQRRRKLSSIESDX: X= 3-fluoro-DL-Valina 1974 (SEQ ID NO: 73)

YGRKKRRQRRRKLSSIETDX: X = norvalina 1975 (SEQ ID NO: 74)

YGRKKRRQRRRKLSSIESDX: X = norvalina 1976 (SEQ ID NO: 22)

YGRKKRRQRRRKLSSIESDX: X= L-t-butil-glicina 1977 (SEQ ID NO: 23)

YGRKKRRQRRRKLSSIEXDV: X= ácido L-2-amino-3-ureidopropiónico 1978 (SEQ ID NO: 75)

YGRKKRRQRRRKLSSIETAL: 1980 (SEQ ID NO: 76)

Métodos:

Animales

Se mantuvieron en ayunas ratas Sprague Dawley adultas (10-12 semanas de edad) (machos 300 g, hembras 250 g) (Figura 8) durante 12-18 antes de ser sometidas a oclusión permanente de los vasos de la pia madre de 3 ramas terminales de la Arteria Cerebral Media sobre la Corteza Barril de Bigote (P3VO). Cada uno de los 7 péptidos se sometió a ensayo en ratas macho más un grupo de control con solución salina (n=8 en cada grupo). Se sometieron a ensayo el grupo con péptido Tat-NR2B9c y el de control con solución salina en ratas hembra (n=8 en cada grupo). El investigador fue ciego para el grupo de tratamiento durante el momento de la cirugía hasta el análisis del tamaño del infarto.

Procedimiento general

Las ratas se anestesiaron con 0,5 ml/kg de inyección intramuscular de cetamina (100 mg/kg), acepromazina (2 mg/kg), y xilazina (5 mg/kg), con un suplemento de un tercio de la dosis inicial según fue necesario. Se insertó una sonda de temperatura anal y el animal se colocó sobre una almohadilla de calentamiento mantenida a 37°C. La arteria carótida externa derecha (ECA) se canuló con tubo de polietileno PE 10 para las inyecciones de colorante. El cráneo se expuso por medio de una incisión en la línea media, se rascó para liberarlo de tejido y se desconectó el músculo temporal del cráneo en el lado derecho. Utilizando un microscopio de disección y un taladro dental neumático, se realizó una ventana craneal de 6x4 mm sobre el córtex somatosensorial derecho (2 mm caudal and 5 mm lateral con respecto al bregma) taladrando un rectángulo a través del cráneo levantando la pieza del cráneo mientras se mantiene la dura intacta. Después de haber sido bañado con fluido cefalorraquídeo artificial, se inyectaron pequeños bolos (10 a 20 μL) de colorante vital azul violeta patente (10 mmol/L; Sigma) en solución salina normal, en la arteria carótida externa derecha para demostrar el tránsito a través de los vasos superficiales del córtex. Se seleccionaron tres ramas arteriolares críticas de la MCA entorno al córtex barril y se cauterizaron eléctricamente a través de la dura. Después de las cauterizaciones, se repitieron las inyecciones de bolo y los tránsitos de colorante para asegurarse de que los tránsitos a través de las arteriolas cauterizadas se habían bloqueado. El rectángulo del cráneo se recolocó sobre la ventana y se suturó el cuero cabelludo. Se retiró el catéter de la ECA, se ligó la ECA, y se suturó la parte anterior del cuello. Una hora después del inicio de la oclusión focal , se infundieron, 0,3 ml de fármaco (3 nMol/g de peso corporal) o control de solución salina a través de la vena de la cola a una velocidad de 0,06 ml/min. Cada rata se devolvió a su jaula individual bajo una lámpara de calentamiento para mantener la temperatura corporal hasta que la rata se recuperó completamente. Se suministraron alimento y agua ad libitum.

Recolección de tejido cerebral

Veinticuatro horas después de la cirugía, los animales se volvieron a anestesiar con 1mL de pentobarbital y el cerebro se recogió rápidamente. Se tomó una porción coronal a través de la región del infarto y se incubó en cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) al 2% durante 15 minutos a 37°C. Las imágenes se escanearon y las porciones de cerebro se almacenaron -80°C.

Análisis

Se midió el tamaño del infarto como un porcentaje del hemisferio de cada rata en el estudio. Después de obtener las mediciones del tamaño del infarto, los animales se separaron en sus respectivos grupos. Las comparaciones se realizaron entre los grupos de tratamiento como las medias ± ET.

5 Resultados:

De los seis péptidos novedosos sometidos a ensayo, Tat-NR2B9c, 1976 y 1977 dieron como resultado una disminución significativa del tamaño de los infartos y 1975 y 1978 presentaron una cierta reducción del tamaño del infarto (Figura 8).

Todas las publicaciones, y archivos de patente citados en esta memoria descriptiva se incorporan como referencia a

10 la presente memoria como si cada publicación individual y patente estuviera específicamente e individualmente indicada para incorporarla como referencia. Los registros de Genbank referenciados mediante identificación de Genbank (GID) o número de acceso, concretamente cualquier secuencia de polipéptido, secuencia de polinucleótido

o anotación de la misma, se incorporan como referencia a la presente memoria. Si se ha asociado más de una versión de una secuencia al mismo número de acceso en diferentes momentos, se debe considerar que la referencia

15 a un número de depósito se aplica a la versión existente en la fecha de presentación efectiva que se remonta a una solicitud de prioridad si el depósito también es referenciado en la solicitud de prioridad. Se pueden realizar diferentes cambios y los equivalentes se pueden sustituir sin apartarse del espíritu y del alcance de la invención. A menos que resulte evidente de otro modo a partir del contexto, se puede utilizar cualquier rasgo, etapa o realización combinado con cualquier otro rasgo, etapa o realización.

20 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> ArborVita Corporation NoNO, Inc. Belmares, Michael

25 Garman,, David Lu, Peter Salter, Michael Tymianski, Michael

30 <120> TRATAMIENTO DEL ACCIDENTE CEREBROVASCULAR Y OTRAS ENFERMEDADES SIN INHIBIR LOS CANALES DE CALCIO DE TIPO N

<130> 026373-000510PC

35 <140> WO 00/000000

<141>

<150> US 60/904.507

<151> 40

<160> 136

<170> PatentIn versión 3.4

45 <210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

50 <220>

<223> Péptido tat sintético

<400> 1

<210> 2

<211> 11

<212> PRT 60 <213> Artificial <220>

<223> Péptido de internalización sintético

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es cualquier aminoácido distinto de Tyr o ausente

<400> 2

<210> 3

<211> 11 15 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido de internalización sintético

<400> 3

25 <210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido quimérico sintético

<400> 4

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido activo sintético

45 <220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = Glu, Asp, Asn o Gln

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = Ser o Thr

55 <220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = Asp, Glu, Gln o Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = Val o Leu

<400> 5

<210> 6

<211> 4 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido activo sintético 15

<400> 6

20 <210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Péptido activo sintético

<400> 7

<210> 8

<211> 4

<212> PRT 35 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido activo sintético

40 <400> 8

<210> 9 45 <211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 50 <223> Péptido activo sintético

<400> 9

55

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

60

<220>

<223> Péptido activo sintético

<400> 10

5

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

10

<220>

<223> Péptido activo sintético

<400> 11

15

<210> 12

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido activo sintético - 1991 2B9c 25

<400> 12

30 <210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

35 <220>

<223> Péptido activo sintético

<400> 13

<210> 14

<211> 3

<212> PRT 45 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido activo sintético

50 <220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es Thr o Ser

55 <220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

60 <220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Xaa es Val o Leu

<400> 14

5

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

10

<220>

<223> Péptido de internalización sintético

<400> 15

15

<210> 16

<211> 20 20 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido quimérico sintético 25

<400> 16

30 <210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

35 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 17

<210> 18

<211> 20

<212> PRT 45 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético - 1992 Tat-NR2B9c-AA

50 <400> 18 <210> 20

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

5

<220>

<223> Péptido sintético - 1993 F-Tat-NR2B9c

<400> 19

10

<211> 20 15 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético - 1994 Tat-NR2B9c κ to A 20

<400> 20

25 <210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

30 <220>

<223> Péptido sintético - 1995 F-Tat-NR2B9c κ to A

<400> 21 <210> 23

<210> 22

<211> 20

40: <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Variante de péptido sintético -1976

45

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> Xaa es Nva

50

<400> 22

<211> 20

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético – 1977

10 <220>

<221> MOD RES

<222> (20)..(20)

<223> Xaa es L-t-butil-glicina

15 <400> 23

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 25 <223> Péptido sintético

<400> 24

<210> 25

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial 35

<220>

<223> Péptido sintético – Secuencia 20mer C-terminal

<210> 26

<211> 20 45 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético - Secuencia 20mer C-terminal 50

<400> 26 <210> 27

<211> 20 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético -Secuencia 20mer C-terminal 10

<400> 27

15 <210> 28

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> Péptido sintético - Secuencia 20mer C-terminal

<400> 28

<210> 29

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial 30

<220>

<223> Péptido sintético - Secuencia 20mer C-terminal

<210> 30

<211> 20 40 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético - Secuencia 20mer C-terminal 45

<400> 30 <210> 31

<211> 20 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético - Secuencia 20mer C-terminal 10

<400> 31

<210> 32

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial 20

<220>

<223> Péptido sintético - Secuencia 20mer C-terminal

<210> 33

<211> 20 30 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético - Secuencia 20mer C-terminal 35

<400> 33

40 <210> 34

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

45 <220>

<223> Péptido sintético -Secuencia 20mer C-terminal

<400> 34

<210> 35

<211> 20 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético - Secuencia 20mer C-terminal 10

<400> 35

15 <210> 36

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> Péptido sintético - Secuencia 20mer C-terminal

<400> 36

<210> 37

<211> 20

<212> PRT 30 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético - Secuencia 20mer C-terminal

35 <400> 37

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 45 <223> Péptido sintético - Secuencia 20mer C-terminal

<400> 38 <210> 39

<211> 4 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético -Secuencia 4mer C-terminal 10

<400> 39

15 <210> 40

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> Péptido sintético - Secuencia 4mer C-terminal

<400> 40

<210> 41

<211> 4

<212> PRT 30 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético - Secuencia 4mer C-terminal

35 <400> 41

<210> 42 40 <211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 45 <223> Péptido sintético -Secuencia 4mer C-terminal

<400> 42

<210> 43

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial 55

<220>

<223> Péptido sintético -Secuencia 4mer C-terminal

<400> 43 60

<210> 44

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético -Secuencia 4mer C-terminal

<400> 44

<210> 45

<211> 4 15 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético -Secuencia 4mer C-terminal

<400> 45

25 <210> 46

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético -Secuencia 4mer C-terminal

<400> 46

<210> 47

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético -Secuencia 4mer C-terminal

45 <400> 47

<210> 48

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 55 <223> Péptido sintético -Secuencia 4mer C-terminal

<400> 48

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido variante tat de internalización sintético

<400> 49

<210> 50

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial 15

<220>

<223> Péptido variante tat de internalización sintético

<400> 50 20

<210> 51

<211> 5 25 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 30

<400> 51

35 <210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

40 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 52

<210> 53

<211> 9

<212> PRT 50 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

55 <400> 53

<210>: 54 60 <211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 54

<210>: 55 10 <211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 15 <223> Péptido sintético

<400> 55

20

<210> 56

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

25

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 56

30

<210> 57

<211> 18 35 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 40

<400> 57

45 <210> 58

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

50 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 58

<210> 59 5 <211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 10 <223> Péptido sintético

<400> 59

15

<210> 60

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

20

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 60

25

<210> 61

<211> 18 30 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 35

<400> 61

40 <210> 62

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

45 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 62

<210> 63

<211> 18 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 10

<400> 63

15 <210> 64

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 64

<210> 65

<211> 18

<212> PRT 30 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

35 <400> 65

<210> 66 40 <211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 45 <223> Péptido sintético

<400> 66

<210> 67

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 67

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 68

25: <210> 69 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial

<220> <223> Péptido sintético

35: <400> 69

<210> 70

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 70

<210> 71

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 71

10 <210> 72

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial

15 <220>

<223> Inhibidor del canal de calico tipo N – Ziconotida

<400> 72

<210> 73

<211> 20

<212> PRT 25 <213> Artificial

<220>

<223> Variante de péptido sintético1974

30 <220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> Xaa es 3-fluoro-L-Valina

35 <400> 73

40 <210> 74

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

45 <220>

<223> Variante de péptido sintético1975

<220>

<221> MOD RES 50 <222> (20)..(20)

<223> Xaa es Nva

<400> 74

<210> 75

<211> 20

5: <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Variante de péptido sintético1978

10

<220>

<221> MOD RES

<222> (18)..(18)

<223> Xaa es ácido L-2-amino-3-ureidopropiónico

15

<400> 75

20 <210> 76

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Variante de péptido sintético1980

<400> 76

<210> 77

<211> 20 35 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 40

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un Phe modificado con una molécula de biotina u otro resto capador que incluye, pero no se limita a,

45 H, acetilo, bezoilo, grupo alquilo (alifático), grupo alquilo con grupo cicloalquilo en el extremo, espaciador alquilo co biotina, (5,6)-FAM

<400> 77

<210> 78

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

<400> 78

<210> 79

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220> 25 <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es Un aminoácido distinto de Tyr

<400> 79

<210> 80

<211> 19 35 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es una Gly modificada con una molécula de biotina u otro resto capador que incluye, pero no se limita a,

<400> 80

<210> 81

<211> 20

<212> PRT 55 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

<400> 81

15 <210> 82

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 25 <222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

<400> 82

<210> 83

<211> 18

<212> PRT 35 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es una Arg modificada con una molécula de biotina u otro resto capador que incluye, pero no se limita a,

H, acetilo, bezoilo, grupo alquilo (alifático), grupo alquilo con grupo cicloalquilo en el extremo, espaciador alquilo co 45 biotina, (5,6)-FAM

<400> 83

<210> 84

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

<400> 84

10 15: <210> 85 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético

20: <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(1) <223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

25: <400> 85

<210> 86

<211> 19 30 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 35

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

40 H, acetilo, bezoilo, grupo alquilo (alifático), grupo alquilo con grupo cicloalquilo en el extremo, espaciador alquilo co biotina, (5,6)-FAM

<400> 86

<210> 87

<211> 20

<212> PRT 50 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

55 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

<400> 87

<210> 88

<211> 20

10: <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

15

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de tirosina

20

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

25

<400> 88

30 <210> 89

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

35 <220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 40 <222> (1)..(1)

<223> Xaa es una Ala modificada con una molécula de biotina u otro resto capador que incluye, pero no se limita a, H, acetilo, bezoilo, grupo alquilo (alifático), grupo alquilo con grupo cicloalquilo en el extremo, espaciador alquilo co biotina, (5,6)-FAM

45 <400> 89

<210> 90 50 <211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 55 <223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

<400> 90

10 15: <210> 91 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético

25: <400> 91

<210> 92

<211> 19 30 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 35

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

40 H, acetilo, bezoilo, grupo alquilo (alifático), grupo alquilo con grupo cicloalquilo en el extremo, espaciador alquilo co biotina, (5,6)-FAM.

<400> 92

<210> 93

<211> 20

<212> PRT 50 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

55 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

<400> 93

<210> 94

<211> 20 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 15

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1) 20 <223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

<400> 94

<210> 95

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial 30

<220>

<223> Péptido sintético

<220> 35 <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es una Arg modificada con una molécula de biotina u otro resto capador que incluye, pero no se limita a, H, acetilo, bezoilo, grupo alquilo (alifático), grupo alquilo con grupo cicloalquilo en el extremo, espaciador alquilo co biotina, (5,6)-FAM.

<400> 95

45 <210> 96

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

50 <220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 55 <222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

<400> 96

<210> 97

<211> 19

<212> PRT 10 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

15 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

20 <400> 97

<210> 98 25 <211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 30 <223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

35 <223> Xaa es una Gly modificada con una molécula de biotina u otro resto capador que incluye, pero no se limita a, H, acetilo, bezoilo, grupo alquilo (alifático), grupo alquilo con grupo cicloalquilo en el extremo, espaciador alquilo co biotina, (5,6)-FAM.

<210> 99

<211> 20

45: <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

50

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

55

<400> 99

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 10 <223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1) 15 <223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

<400> 100

<210> 101

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial 25

<220>

<223> Péptido sintético

<220> 30 <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<400> 101

40 <210> 102

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

45 <220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 50 <222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

<400> 102 20 <210> 104

<210> 103

<211> 19

5: <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

10

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

15

<400> 103

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 30 <222> (1)..(1)

<223> Xaa es una Gly modificada con una molécula de biotina u otro resto capador que incluye, pero no se limita a, H, acetilo, bezoilo, grupo alquilo (alifático), grupo alquilo con grupo cicloalquilo en el extremo, espaciador alquilo co biotina, (5,6)-FAM.

35 <400> 104

<210> 105 40 <211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 45 <223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1) 50 <223> Xaa es piroglutamato

<400> 105 20 <210> 107

<210> 106

<211> 20

5: <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

10

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

15

<400> 106

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 30 <222> (1)..(1)

35 <400> 107

<210> 108 40 <211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 45 <223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1) 50 <223> Xaa es piroglutamato

<400> 108 20

<210> 109

<211> 19

5: <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

10

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

15

<400> 109

<210> 110

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial 25

<220>

<223> Péptido sintético

<220> 30 <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<400> 110

40 <210> 111

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

45 <220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 50 <222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

<400> 111

<210> 112

<211> 20

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

15 <400> 112

<210> 113

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 25 <223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<210> 114

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

<400> 114

55 <210> 115

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

<400> 115

<210> 116

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

25 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<400> 116

<210> 117

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220> 45 <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

<400> 117

<210> 118

<211> 21 55 <212> PRT 15 <210> 119

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

5

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

10

<400> 118

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 25 <222> (1)..(1)

30 <400> 119

<210> 120

<211> 21

35: <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

40

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

45

<400> 120

50 <210> 121

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

<400> 121

<210> 122

<211> 19 15 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

25 H, acetilo, bezoilo, grupo alquilo (alifático), grupo alquilo con grupo cicloalquilo en el extremo, espaciador alquilo co biotina, (5,6)-FAM.

<400> 122

<210> 123

<211> 20

<212> PRT 35 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

45 <400> 123

<210> 124

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 55 <223> Péptido sintético <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

<400> 124

<210> 125

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial 15

<220>

<223> Péptido sintético

<220> 20 <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<400> 125

30 <210> 126

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

35 <220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 40 <222> (1)..(1)

<223> Xaa es piroglutamato

<400> 126

<210> 127

<211> 20

<212> PRT 50 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

55 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

<400> 127

10 <210> 128

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

15 <220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 20 <222> (1)..(1)

25 <400> 128

<210> 129 30 <211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 35 <223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1) 40 <223> Xaa es piroglutamato

<400> 129

45

<210> 130

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

50

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

55: <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

<400> 130

5 <210> 131

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

10 <220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 15 <222> (1)..(1)

20 <400> 131

<210> 132 25 <211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 30 <223> Péptido sintético

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1) 35 <223> Xaa es piroglutamato

<400> 132

<210> 133

<211> 18

<212> PRT 45 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

50 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es un aminoácido distinto de Tyr

55 <400> 133 <210> 134

<211> 5 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 10

<400> 134

15 <210> 135

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> Péptido de internalización sintético

<400> 135

<210> 136

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido de internalización sintético

35 <400> 136

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un péptido quimérico aislado, en donde el péptido quimérico comprende un péptido activo que inhibe la unión de PSD-95 a un receptor de NMDA y un péptido de internalización que promueve la absorción del péptido quimérico en las células y tiene una capacidad reducida para unirse a un canal de calcio de tipo N con respecto al péptido tat YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1), en donde el péptido activo tiene una secuencia de aminoácidos que comprende [T/S]-X[V/L] (SEQ ID NO: 14), opcionalmente, [E/D/N/Q]-[S/T]-[D/E/Q/N]-[V/L] (SEQ ID NO: 5) y el péptido de internalización tiene una secuencia de aminoácidos que comprende XGRKKRRQRRR (SEC ID NO: 2), en donde X es un aminoácido distinto de Y o nada.
2.

El péptido quimérico aislado de la reivindicación 1, en donde X es F (SEQ ID NO: 135).
3.

El péptido quimérico aislado de la reivindicación 1, en donde el péptido de internalización consiste en GRKKRRQRRRP (SEC ID NO: 3).
4.

El péptido quimérico aislado de la reivindicación 1, en donde el péptido activo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de ESDV (SEQ ID NO: 6), ESEV (SEQ ID NO: 7), ETDV (SEQ ID NO: 8), ETEV (SEC ID NO: 9), DTDV (SEQ ID NO: 10), DTEV (SEQ ID NO: 11), preferiblemente, KLSSIESDV (SEQ ID NO: 12) o KLSSIETDV (SEQ ID NO: 13).
5.

El péptido quimérico aislado de la reivindicación 1, en donde el péptido quimérico tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en FGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO: 19) o FGRKKRRQRRRKLSSIETDV (SEQ ID NO: 16).
6.

Una composición farmacéutica que comprende el péptido quimérico aislado de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
7.

Un péptido quimérico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para uso en el tratamiento de los efectos dañinos del accidente cerebrovascular en un paciente que tiene o está en riesgo de accidente cerebrovascular u otra lesión en el SNC.
8.

El péptido quimérico de la reivindicación 7, en donde la dosis eficaz es una única dosis de 0,05 a 500 mg, opcionalmente de 0,1 a 100 mg, 0,5 a 50 mg, o 1-20 mg del péptido.
9.

El péptido quimérico de la reivindicación 7, en donde el paciente tiene accidente cerebrovascular isquémico, accidente cerebrovascular hemorrágico, una susceptibilidad por encima de la normal a los efectos secundarios mediados por los canales de calcio de tipo N, o el paciente tiene una presión arterial normal o por debajo de la normal.
10.

Un agente quimérico aislado, en donde el agente quimérico comprende un agente activo y un péptido de internalización que promueve la absorción del agente quimérico en las células, en donde el péptido de internalización es una variante del péptido tat YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1) en el que la Y N-terminal está sustituida por F y que tiene una capacidad reducida para unirse a un canal de calcio de tipo N con respecto al péptido TAT, en donde el agente activo es un agente activo mostrado en la Tabla 5.
11.

Un péptido de internalización aislado que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende XGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2), en donde X es F.
12.

Un agente activo mostrado en la Tabla 5 que tiene una actividad intracelular eficaz para tratar una enfermedad ligada a un péptido variante de tat que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende XGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2), en donde X es un aminoácido distinto de Y, o nada y el péptido tat tiene una capacidad reducida para unirse a un canal de calcio de tipo N con respecto al péptido tat YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1) para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un paciente que tiene una susceptibilidad por encima de la normal a los efectos secundarios mediados por los canales de calcio de tipo N.
13.

El agente activo de acuerdo con la reivindicación 12 ligado al péptido variante de tat de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento de una enfermedad de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el paciente tiene una presión arterial por debajo de la normal.