ES2434116T3

ES2434116T3 - Una nueva y eficaz diana farmacológica para el tratamiento de la tuberculosis

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Publication number: ES2434116T3
Application number: ES08707698T
Authority: ES
Inventors: Giovanna Riccardi; Giulia Manina; Maria Rosalia Pasca
Original assignee: Sentinel CH SpA
Current assignee: Sentinel CH SpA
Priority date: 2008-02-13
Filing date: 2008-02-13
Publication date: 2013-12-13
Anticipated expiration: 2028-02-13
Also published as: US9128088B2; EP2240777B1; EP2240777A1; BRPI0822292A2; US20110262361A1; RU2010137820A; WO2009100731A1; CN101971031A; RU2474621C2

Abstract

Método para el cribado in vitro de fármacos candidatos para el tratamiento de la tuberculosis por interferencia con la biosíntesis de arabinogalactano, en que dicho método comprende una etapa de puesta en contacto de un cultivo celular de Mycobacterium tuberculosis que expresa en exceso una proteína que lleva a cabo la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-P-arabinosa y que está codificada por el gen rv3790 u homólogos del mismo o cualquier marco de lectura abierto artificial cuyo producto génico sea idéntico u homólogo a la proteína Rv3790 con un fármaco candidato y la posterior evaluación del porcentaje de inhibición causado por el fármaco candidato frente a un control en una prueba de ensayo.

Description

Una nueva y eficaz diana farmacológica para el tratamiento de la tuberculosis.

Campo de la invención

La presente invención permite un método de cribado para la identificación de nuevos fármacos para el tratamiento de la tuberculosis, así como un método de diagnóstico para identificar cepas clínicas resistentes a estos nuevos fármacos.

Técnica anterior

La tuberculosis (TB) sigue siendo la principal causa de mortalidad debida a un solo agente infeccioso, Mycobacterium tuberculosis. Este patógeno ha infectado latentemente a un tercio de la población mundial. Actualmente, la quimioterapia para la TB se compone de un cóctel de fármacos de primera y segunda línea. El tratamiento actual de la TB requiere de seis a nueve meses, lo que conlleva una toxicidad significativa, así como resistencia a los fármacos. Desde el momento de la introducción de los fármacos contra la TB, se han encontrado frecuentemente cepas de M. tuberculosis resistentes a los mismos. De hecho, las micobacterias presentan resistencia natural frente a la mayoría de los antibióticos de uso común, debido a su poco corriente pared celular. Además, se consideran cambios genéticos responsables de la resistencia adquirida a los fármacos. Las cepas de M. tuberculosis resistentes a un número creciente de fármacos de segunda línea usados para el tratamiento de la tuberculosis resistente a múltiples fármacos (MDR-TB) se están convirtiendo en una amenaza para la salud pública mundial (1). En consecuencia, existe una necesidad urgente de nuevos fármacos para el tratamiento de la tuberculosis. En particular, se necesitan nuevos fármacos con nuevos mecanismos de acción que sean activos contra cepas resistentes a los fármacos. Por consiguiente, también existe una necesidad acuciante de identificar nuevas dianas farmacológicas (2). El documento WO 2007/134625 desvela derivados de benzotiazina y su uso como agentes antibacterianos en enfermedades infecciosas causadas por bacterias, especialmente tuberculosis (TB) y lepra, causadas por micobacterias.

Brennan, Patrick J. y col. desvelan el núcleo de la pared celular de M. tuberculosis en el contexto del descubrimiento de fármacos, así como la ruta de biosíntesis del arabinogalactano micobacteriano.

El documento US 2002/151008 A1 describe un método de cribado para la identificación de fármacos contra M. tuberculosis que implica el uso del gen iniB como diana para el cribado.

El documento WO 01/35317 desvela una proteína idéntica a Rv3790 como potencial diana farmacológica en M. tuberculosis.

El documento US 2003/013090 A1 desvela un método de cribado para identificar si un paciente es portador de una cepa de M. tuberculosis resistente a etionamida mediante la determinación de la presencia de una mutación en el gen etaA.

Seidel Mathias y col. describen una nueva arabinofuranosil-transferasa AftB implicada en una etapa terminal de la biosíntesis del arabinano de la pared celular en M. tuberculosis.

Alderwick, Luke J. y col., desvelan la transferasa AftA que también podría representar una diana farmacológica atractiva.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la proteína Rv3790 de Mycobacterium tuberculosis, cuya secuencia de ADN puede obtenerse en http://genolist.pasteur.fr/TubercuList (TubercuList WorldWide Web Server; coordenadas del gen de Rv3790: de 4162306 a 4163718), es la diana para fármacos de benzotiazinona, una nueva clase de moléculas que parecen ser muy prometedoras en el tratamiento de la tuberculosis ("New thiazinone

derivatives, their preparations and their use as antibacterials”, solicitud de patente n° PCT/EP 2006/004942, a

nombre del Instituto Leibniz para la Investigación de Productos Naturales y la Biología de la Infección, e. V., Instituto Hans Knöll (HKI).

Se ha demostrado que las proteínas Rv3790 y Rv3791 trabajan concertadamente y están implicadas en la biosíntesis de arabinogalactano (3). El arabinogalactano es un componente fundamental de la pared celular micobacteriana que une covalentemente la capa exterior de ácidos micólicos al peptidoglucano. En particular, ambas proteínas Rv3790 y Rv3791 son importantes para llevar a cabo la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-P-arabinosa (3). El descubrimiento sugiere que los fármacos de benzotiazinona interfieren con la biosíntesis de la pared celular micobacteriana. Es de señalar que ambos genes rv3790 y rv3791 han sido descritos como esenciales por mutagénesis con el transposón Himar-1 en la cepa H37Rv (4).

Hemos encontrado que mutaciones en el extremo C de la proteína Rv3790, así como su expresión en exceso confieren un alto grado de resistencia a fármacos derivados de benzotiazinona en Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis BCG y Mycobacterium smegmatis. Los genes rv3790 naturales y mutados, así como rv3791 han sido clonados y expresados en exceso en Escherichia coli.

Se han encontrado proteínas ortólogas de Rv3790 sensibles a los derivados de benzotiazinona en los géneros siguientes: Nocardia, Rhodococcus y Corynebacterium.

Puede formularse la hipótesis de que los excelentes resultados obtenidos en la evaluación de laboratorio con los derivados de benzotiazinona se correlacionan con la acción inhibitoria de Rv3790 que se ha descubierto. Esta evidencia puede poner en marcha nuevas investigaciones sobre fármacos que actúen contra la proteína Rv3790. Por lo tanto, la proteína Rv3790 y proteínas homólogas relacionadas y especialmente ortólogas no solo son dianas óptimas para fármacos pertenecientes a la clase de las benzotiazinonas, sino también prometedoras dianas para el descubrimiento de nuevos fármacos para utilizar en la lucha contra infecciones causadas por Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Nocardia, Rhodococcus y Corynebacterium.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para el cribado de fármacos candidatos para el tratamiento de la tuberculosis por interferencia con la biosíntesis de arabinogalactano, en que dicho método comprende una etapa de puesta en contacto de un cultivo celular de Mycobacterium tuberculosis que expresa en exceso una proteína que lleva a cabo la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-Parabinosa y que está codificada por el gen rv3790 u homólogos del mismo o cualquier marco de lectura abierto artificial cuyo producto génico sea idéntico u homólogo a la proteína Rv3790 con un fármaco candidato y la posterior evaluación del porcentaje de inhibición causado por el fármaco candidato frente a un control (M. tuberculosis transformado solo con el vector pSODIT-2) en una prueba de ensayo.

Preferentemente, la prueba de ensayo es una prueba de ensayo in vitro de la actividad antibacteriana o una prueba enzimática.

Otro objeto de la presente invención es una preparación de un cultivo celular de cepas mutantes de Mycobacterium tuberculosis con el aminoácido cisteína de la posición 387 sustituido por una serina o una glicina para uso como herramienta de control en el método de la presente invención.

El descubrimiento de que proteínas del tipo de Rv3790 codificadas por genes mutados son responsables de la resistencia a los fármacos que interfieren con la biosíntesis de arabinogalactano, como los fármacos de benzotiazinona, tendrá importantes implicaciones en el diagnóstico y el tratamiento de cepas micobacterianas resistentes a los fármacos.

Por lo tanto, otro objeto de la presente invención es proporcionar un método de diagnóstico rápido de cepas micobacterianas resistentes a los fármacos que implica la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (5) de una región interna que solapa con el codón 387 del gen rv3790 de una cepa de Mycobacterium tuberculosis aislada de un paciente de TB y el análisis de la secuencia de ADN para detectar la presencia de las mutaciones identificadas como responsables de la resistencia a los fármacos que interfieren con la biosíntesis de arabinogalactano, como las benzotiazinonas.

En el contexto de la presente invención, el término “fármaco que interfiere con la biosíntesis de arabinogalactano”

indica una molécula que impide la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-P-arabinosa al bloquear o silenciar una proteína que lleva a cabo la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-P-arabinosa y que está codificada por el gen rv3790 u homólogos del mismo o por cualquier marco de lectura abierto artificial cuyo producto génico es idéntico u homólogo a la proteína Rv3790.

Otro objeto de la presente invención son inhibidores de la proteína Rv3790 obtenidos por el método de cribado de la invención según las reivindicaciones 18 a 20.

El uso de SEQ ID NO. 1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la tuberculosis según la reivindicación 22 es otro objeto de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un análisis de alineamiento múltiple con proteínas ortólogas de Rv3790 de varios géneros pertenecientes a las actinobacterias. La figura 2 muestra la secuencia de ADN del gen rv3790.

Descripción detallada de la invención

Un primer objeto de la presente invención es un método para el cribado de fármacos candidatos para el tratamiento de la tuberculosis por interferencia con la biosíntesis de arabinogalactano, en que dicho método comprende una etapa de puesta en contacto de cultivos celulares de Mycobacterium tuberculosis (transformados con pSODIT2/Rv3790) que expresan en exceso una proteína que lleva a cabo la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-P-arabinosa y que está codificada por el gen rv3790 u homólogos del mismo o por cualquier marco de lectura abierto artificial cuyo producto génico es idéntico u homólogo a la proteína Rv3790 con un fármaco candidato y la posterior evaluación del porcentaje de inhibición causado por el fármaco candidato frente a un control en una prueba de ensayo.

Preferentemente, dicha prueba de ensayo es una prueba in vitro de la actividad antibacteriana o una prueba enzimática.

En la prueba antibacteriana, la evaluación del porcentaje de inhibición se efectúa preferentemente mediante la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM). La CIM se define como la concentración mínima de un agente antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de una incubación adecuada.

Todos los fármacos candidatos se prueban también en un cultivo celular de M. tuberculosis transformado solo con el vector pSODIT-2.

Como control, puede usarse isoniazida, que es el fármaco de referencia en el tratamiento de la tuberculosis.

Alternativa o adicionalmente, puede llevarse a cabo un experimento de control diferente, en el que no se efectúa ningún tratamiento con un fármaco candidato, de modo que se tiene una inhibición del 0%. Se evalúa el % de inhibición obtenido con el fármaco candidato con respecto a dicho control.

Dicha etapa de puesta en contacto de un cultivo celular de Mycobacterium tuberculosis con un fármaco candidato puede llevarse a cabo poniendo la preparación de células en una o más disoluciones del fármaco candidato con diferentes concentraciones del fármaco en un medio adecuado.

El fármaco candidato se prueba normalmente en una forma adecuada que permita un buen contacto entre la sustancia y el cultivo celular. Preferentemente, el fármaco candidato se utiliza en disolución o en suspensión. El fármaco candidato se usa en cantidades o concentraciones que dependen de varios factores, entre otros, el peso molecular de la sustancia, su solubilidad y demás.

Preferentemente, se usan dos o más concentraciones de los fármacos, con el fin de calcular la CIM (concentración inhibitoria mínima) para cada candidato.

Preferentemente, el medio adecuado es el medio sólido Middlebrook 7H11 (proveedor Difco). Con mayor preferencia, este medio se suministra con ácido oleico, albúmina de suero bovino, dextrosa y catalasa (OADC). Este medio es típico para las cepas micobacterianas.

La preparación de la proteína Rv3790 recombinante en las formas naturales y mutantes de células de Escherichia coli para el ensayo de la actividad enzimática se realiza de acuerdo con el método descrito en la referencia (3). La prueba de cribado enzimático de la invención puede llevarse a cabo con la enzima Rv3790 recombinante en una mezcla de reacción que contiene FAD, NAD+, NADPH y decaprenilfosforilrribosa (DPR) radiomarcada que, por medio de la reacción enzimática se transforma en decaprenilfosforil-D-Araf (DPA). Este es el experimento de control. Se lleva a cabo otro experimento en el que se repite el procedimiento en presencia del fármaco candidato. La cantidad de la DPA así formada se detecta y se calcula el % de inhibición de la reacción enzimática causado por el fármaco candidato. La formación de DPA se monitoriza de acuerdo con procedimientos estándar bien conocidos por el experto en la técnica, como los descritos en la referencia (3).

Las aplicaciones de la invención incluyen que el método de cribado de la invención puede usarse para una evaluación in vivo de la actividad de los fármacos candidatos que pasan la etapa de cribado in vitro. Esta evaluación in vivo puede realizarse según se describe a continuación, en particular, mediante la administración de regímenes de dosificación preseleccionados del fármaco candidato a ratones con diseminación hemática de una cepa de tuberculosis, en comparación con un fármaco de control y con un placebo.

El fármaco de control es preferentemente isoniazida.

Preferentemente se usa la línea BALB/c de ratones.

Preferentemente, la cepa de tuberculosis es un cultivo virulento de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, con mayor preferencia a una dosis de 5 x 106 UFC (unidades formadoras de colonias) en tampón salino.

La dosis del fármaco candidato para el cribado puede variar en un amplio intervalo de dosis dependiendo de varios factores, como la CIM calculada a partir de los resultados de la prueba in vitro anterior o la DL50 que puede determinarse para dicho compuesto. Generalmente, la dosis del fármaco candidato usada en dicho método de cribado in vivo será inferior a su DL50.

Preferentemente, los fármacos se introducen por vía oral como suspensión en un tampón adecuado.

Preferentemente, el tratamiento se administra diariamente, seis veces por semana.

Para determinar la eficacia de cada régimen de tratamiento, se registran los cambios macroscópicos en los órganos parenquimatosos del ratón, el crecimiento de micobacterias procedentes de material patológico en medio sólido, así como un índice bacterioscópico del daño orgánico. También se lleva a cabo un análisis cualitativo y cuantitativo de los cambios macroscópicos en el hígado, el bazo y los pulmones y se calcula un índice de daño (mediante una escala de cuatro puntos).

Como otro objeto más de la presente invención se proporciona también un método de diagnóstico de cepas micobacterianas resistentes a los fármacos. El método de diagnóstico implica la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (5) del gen rv3790 de una cepa de Mycobacterium tuberculosis aislada de un paciente de TB y el análisis de la secuencia de ADN para detectar la presencia de las mutaciones identificadas.

Preferentemente, el método comprende la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (5) de una región interna que solapa con el codón 387 del gen rv3790 de una cepa de Mycobacterium tuberculosis aislada de un paciente de TB y el análisis de la secuencia de ADN para detectar la presencia de las mutaciones identificadas (cisteína sustituida por glicina o cisteína sustituida por serina) como responsables de la resistencia a los fármacos que interfieren con la biosíntesis de arabinogalactano, como las benzotiazinonas.

Otro objeto de la presente invención son inhibidores de la proteína Rv3790 que pueden obtenerse por el método de cribado de la invención de acuerdo con las reivindicaciones 18 a 20.

Fármacos que interfieren con la biosíntesis de arabinogalactano

Los fármacos que pueden obtenerse por medio del método de cribado de la invención se seleccionan preferentemente entre anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína Rv3790 y secuencias no codificantes de ARNm del gen rv3790, en que dichos fármacos muestran un % de inhibición superior al 50% en la prueba de cribado in vitro y/o un % de inhibición superior al 50% en la prueba antibacteriana in vivo de la invención.

En la presente invención, dichos fármacos son anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína Rv3790. Tales anticuerpos pueden obtenerse de acuerdo con procedimientos convencionales descritos asimismo en la bibliografía (6, 7).

En otra realización de la presente invención, dichos fármacos son secuencias no codificantes del gen rv3790.

La presente invención, proporciona oligómeros no codificantes con una secuencia eficaz para inhibir o bloquear la expresión del gen o la secuencia de ARNm que codifican Rv3790. De acuerdo con la reivindicación 20, la secuencia para preparar las secuencias oligoméricas no codificantes de rv3790 es una secuencia de 25-mer de la secuencia de ARNm de rv3790: AUG UUG AGC GUG GGA GCU ACC ACU A. La secuencia completa del gen rv3790 está depositada en http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/, con el nombre de gen rv3790. La secuencia de ADN completa de rv3790 se expone en la figura 2. Tales secuencias codificantes preferidas se usan para la construcción de agentes oligonucleotídicos no codificantes (y los controles adecuados) para una comparación in vitro como inhibidores de la proteína Rv3790. Estos datos in vitro son predictivos de la utilidad clínica en humanos del uso de agentes no codificantes de un diseño comparable.

Método de tratamiento

Un método de tratamiento de un paciente que padece tuberculosis puede incluir la administración a dicho paciente de una cantidad con eficacia antibacteriana de un fármaco que interfiere con la biosíntesis de arabinogalactano mediante el bloqueo o el silenciamiento de una proteína que lleva a cabo la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-P-arabinosa.

Preferentemente, dicho fármaco es una molécula de benzotiazinona o anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína Rv3790 o secuencias no codificantes de ARNm del gen rv3790.

El método de tratamiento puede incluir además la administración de un fármaco antibacteriano contra Mycobacterium tuberculosis con un mecanismo de acción diferente, como isoniazida.

La dosis que se administra de dicho fármaco que interfiere con la síntesis de arabinogalactano puede variar en un amplio intervalo de dosis, dependiendo de la actividad del inhibidor, la gravedad de la enfermedad, las condiciones del paciente, su peso y edad, así como la vía de administración, según determinará el médico.

Generalmente, el fármaco puede usarse en dosis en el intervalo de 0,001 mg a 50 mg por kg de peso corporal, de una a cuatro veces al día.

El uso de SEQ ID NO. 1, que interfiere con la biosíntesis de arabinogalactano según se describe anteriormente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la tuberculosis también se reivindica según se expone en la reivindicación 22.

Parte experimental

Determinación de la actividad inhibitoria mínima (CIM) in vitro de un fármaco candidato contra micobacteria

Una colonia individual de una cepa de M. tuberculosis se usa para inocular el medio Middlebrook 7H9 enriquecido con OADC al 10% y Tween 80 (Difco) al 0,05%. Este medio es típico para cepas micobacterianas.

El cultivo se incuba a 37°C hasta alcanzar la fase de crecimiento exponencial (DO600 nm = 1 - ~108 UFC/ml). Se preparan diluciones de dicho cultivo y se usan para sembrar en placa ~105 UFC.

EVALUACIONES DE LA CIM EN MEDIO SÓLIDO

Se preparan placas de medio Middlebrook 7H11 (Difco) con OADC al 10% mediante la adición de cantidades crecientes de los fármacos. Preferentemente, se usan varias concentraciones de los fármacos con el fin de calcular la CIM para cada candidato. Se siembran diluciones de los cultivos en placas de medio y estas se incuban a 37°C durante 21 días. La inhibición del crecimiento se evalúa visualmente.

Determinación de la actividad inhibitoria in vivo de un fármaco candidato contra Mycobacterium tuberculosis en el modelo de TB murino

Para determinar la eficacia quimioterapéutica, puede usarse la línea BALB/c de ratones con tuberculosis experimental de diseminación hemática.

Los ratones se infectan con un cultivo virulento de dos semanas de Mycobacterium tuberculosis H37Rv por inyección intravenosa (en la vena de la cola) de la suspensión micobacteriana a una dosis de 5 x 106 UFC (unidades formadoras de colonias) en 0,5 ml de disolución salina. Todos los animales experimentales se dividen en grupos en función del régimen de tratamiento usado.

El tratamiento se inicia el día siguiente después de la infección. Los fármacos se introducen por vía oral como suspensión en carboximetilcelulosa/agua con una pequeña cantidad de PEG-400. La quimioterapia se administra diariamente, seis veces por semana.

Después, los animales se sacrifican. Para determinar la eficacia de cada régimen de tratamiento, se registran los cambios macroscópicos en los órganos parenquimatosos del ratón, el crecimiento de micobacterias procedentes de material patológico en medio sólido, así como un índice bacterioscópico del daño orgánico. También se lleva a cabo un análisis cualitativo y cuantitativo de los cambios macroscópicos en el hígado, el bazo y los pulmones y se calcula un índice de daño (mediante una escala de cuatro puntos).

La evaluación macroscópica de la eficacia de cada régimen de tratamiento se expresa en el índice de eficacia, calculado mediante la fórmula siguiente:

Índice de eficacia = 100% - Índice de daño del grupo estudiado / Índice de daño del grupo de control x 100

El examen microbiológico incluye un cultivo para la determinación de las UFC en los órganos parenquimatosos. Para este fin, se homogeneízan el pulmón derecho y el bazo separadamente con ácido sulfúrico al 6%, se centrifugan y se lavan con aguan y disolución salina. El producto (aproximadamente 0,5 ml) se diluye con 1,0 ml de disolución salina y se homogeneíza. Esta suspensión (0,5 ml) de los órganos de prueba se diluye 100 y 1.000 veces y se distribuye en medio sólido Finn-2. Los cultivos se incuban a 37°C durante un mes y se observan semanalmente, a partir del día 10. Después de 28 días se cuentan las UFC.

Preparación de Rv3790 recombinante

Con el fin de obtener la expresión de la proteína en E. coli, se probaron varias condiciones de crecimiento, con o sin isopropil-1-tiogalactósido (IPTG) como inductor, a concentraciones en el intervalo de 0,125 mM a 1 mM. Todos los cultivos se incubaron a 37°C durante dos horas, a 27°C durante dos y cuatro horas y a 20°C durante dos y 20 horas. Las células se recogieron por centrifugación y los extractos de proteína derivados se analizaron por SDS-PAGE. Las proteínas recombinantes se purificaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen).

Determinación de Rv3790 como diana para benzotiazinonas

Con el fin de identificar la diana molecular para las benzotiazinonas, se siguieron dos estrategias científicas/técnicas diferentes:

a) la transformación de un banco de cósmidos de Mycobacterium smegmatis en M. smegmatis y la selección de resistencia a benzotiazinonas;

5 b) mutagénesis convencional: búsqueda de mutaciones espontáneas mediante la siembra en placa de cultivos micobacterianos en medios con benzotiazinonas.

La concentración inhibitoria mínima (CIM) de diferentes benzotiazinonas para M. smegmatis mc2155, M. bovis BCG 10 y M. tuberculosis H37Rv se determinó, según se describe anteriormente, en medio Middlebrook 7H11 como medio sólido, enriquecido con ácido oleico, albúmina de suero bovino, dextrosa y catalasa (OADC).

La atención se centró en la benzotiazinona más activa: 10526038. La determinación de la CIM se llevó a cabo también para isoniazida como compuesto de control. Los valores de CIM de 10526038 e isoniazida se muestran en 15 la tabla 1.

Tabla 1. CIM de 10526038 e isoniazida para diferentes especies micobacterianas.

Cepas: Valores de CIM

10526038 [ng/ml]: Isoniazida [!g/ml]

M. smegmatis mc2155: 4 16

M. bovis BCG: 2 0,05

M. tuberculosis H37Rv: 0,75 0,05

Estrategia a)

20 Se construyó un banco genómico de M. smegmatis mc2155 con el cósmido vector pYUB18 y se transformó en M. smegmatis mc2155; los clones recombinantes se seleccionaron por siembra en placas con diferentes concentraciones de benzotiazinonas (en el intervalo de 16 ng/ml a 64 ng/ml). Se seleccionaron dos cósmidos responsables de la resistencia a las benzotiazinonas (8x CIM), que se secuenciaron parcialmente y se compararon

25 con la secuencia genómica de M. smegmatis mc2155 (www.tiger.org). Estos cósmidos mostraron un inserto solapante de 22 kb. Mediante experimentos de subclonación de la región genómica común, se identificó un gen responsable de la resistencia a 10526038. Este gen de 1.383 pb codifica una hipotética oxidorreductasa (MSMEG_6382) de gran homología con Rv3790 de M. tuberculosis (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/). Se ha demostrado que las proteínas Rv3790 y Rv3791 trabajan concertadamente y que están implicadas en la biosíntesis

30 de arabinogalactano, un componente fundamental de la pared celular micobacteriana. Ambas proteínas son importantes para llevar a cabo la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-P-arabinosa (3).

Es de señalar que los dos genes rv3790 y rv3791 han sido descritos como esenciales para la vida de M. tuberculosis por mutagénesis con el transposón Himar-1 en la cepa H37Rv (4). El gen rv3790 se clonó en el vector de expresión

35 pSODIT-2 y se transformó en las especies siguientes: M. smegmatis, M. bovis BCG y M. tuberculosis. Según se muestra en la tabla 2, la expresión en exceso de Rv3790 confiere un alto nivel de resistencia a 10526038 en las tres especies micobacterianas.

Tabla 2. CIM de 10526038 para diferentes especies micobacterianas que expresan Rv3790 en exceso.

Plásmido: CIM de 10526038 (nivel de resistencia)

M. smegmatis [ng/ml]: M. bovis BCG [ng/ml] M. tuberculosis [ng/ml]

pSODIT-2: 4 2 0,75

Rv3790/pSODIT-2: 256 (32x CIM) 32 (8x CIM) 500 (333x CIM)

Estrategia b)

Se aislaron mutantes resistentes espontáneos, respectivamente, en M. smegmatis, M. bovis BCG y M. tuberculosis.

45 Resultados obtenidos en M. smegmatis mc2155

Con el fin de identificar la diana celular para las benzotiatinonas, se aislaron mutantes de M. smegmatis mc2155 resistentes a la benzotiazinona 10526038 por mutación convencional espontánea mediante la siembra en placa de ~1010 células en medio sólido que contenía diferentes concentraciones del compuesto, en el intervalo de 10 a 30

50 veces la CIM para la cepa natural. Se aislaron mutantes resistentes con una frecuencia en el intervalo de 10-7 a 10-9. Los resultados de esta selección se muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Mutantes espontáneos de M. smegmatis resistentes a 10526038.

Mutantes de M. smegmatis: Concentración de 10526038 usada para el aislamiento Frecuencia de aislamiento Nivel de resistencia

MN47, 48: 30x CIM 5 · 10-9 500x CIM

MN81, 84: 30x CIM 5 · 10-9 ?4.000x CIM

El gen MSMEG_6382 y una región anterior de 200 pb se secuenciaron en los cuatro mutantes de M. smegmatis

5 (MN47, MN48 y MN81, MN84 con un nivel diferente de resistencia a 10526038 (500/>4.000x CIM). Esta región nucleotídica se comparó con la secuencia natural (www.tiger.org). En las secuencias nucleotídicas de las cepas resistentes de M. smegmatis se identificaron dos mutaciones puntuales. Las dos mutaciones se localizan en el mismo codón, pero en diferentes nucleótidos, de acuerdo con el distinto nivel de resistencia, según se muestra en la tabla 4.

10 Tabla 4. Mutaciones identificadas en cepas resistentes de M. smegmatis. Se subraya el nucleótido mutado.

Cepas de M. smegmatis: CIM (nivel de resistencia) Codón Aminoácido (394)

Natural: 4 ng/ml tgc Cisteína

Mutantes MN47, MN48: 4 !g/ml (500x CIM) ggc Glicina

Mutantes MN81, MN84: >16 !g/ml (?4.000x CIM) tcc Serina

Resultados obtenidos en M. bovis BCG Pasteur

15 Con el fin de identificar la diana celular para las benzotiazinonas, se aislaron mutantes de M. bovis BCG de gran resistencia mediante la siembra en placa de ~1010 células en medio sólido que contenía diferentes concentraciones de 10526038, en el intervalo de 5 a 40 veces la CIM para la cepa natural. Se obtuvieron mutantes resistentes con una frecuencia de 10-8. El resultado de esta selección se muestra en la tabla 5.

20 Tabla 5. Mutantes espontáneos de M. bovis resistentes a 10526038.

Mutantes de M. bovis: Concentración de 10526038 utilizada para el aislamiento Frecuencia de aislamiento Nivel de resistencia

BN1-8: 40x CIM 1,8 · 10-8 ?8.000x CIM

En los ocho mutantes de M. bovis se llevó a cabo la secuenciación del gen homólogo de rv3790. Se identificó una mutación puntual en el codón mutado correspondiente en M. smegmatis. En los ocho mutantes estaba mutado el segundo nucleótido, lo que causa un cambio de la cisteína natural a serina, según se muestra en la tabla 6.

Tabla 6. Mutaciones identificadas en cepas resistentes de M. bovis. Se subraya el nucleótido mutado.

Cepas de M. bovis: CIM (nivel de resistencia) Codón Aminoácido (387)

Natural: 2 ng/ml tgc Cisteína

Mutantes BN1-8: >16 !g/ml (?8.000x CIM) tcc Serina

Resultados obtenidos en M. tuberculosis H37Rv

30 Con el fin de encontrar la diana para las benzotiazinonas en M. tuberculosis (Mtb) se aislaron algunos mutantes resistentes espontáneos de Mtb. El valor de la CIM de 10526038 para Mtb es muy bajo, 1,5 ng/ml (frente a 0,05 !g/ml de isoniazida).

El aislamiento de los mutantes resistentes se llevó a cabo en el medio 7H11 (típico para micobacteria) con la adición

35 del fármaco 10526038 en diferentes concentraciones. Se usaron cuatro cultivos independientes de Mtb, a una DO600 = 1. Se sembraron en placa alícuotas (250 !l) de los cuatro cultivos en las siguientes concentraciones del fármaco: 10x CIM, 40x CIM, 70x CIM, 150x CIM y 300x CIM. Se obtuvieron mutantes resistentes espontáneos de Mtb para todas las concentraciones del fármaco, con la excepción de 10x CIM. En la tabla 7 se muestran los mutantes aislados, la frecuencia y los valores de la CIM.

40 Tabla 7. Mutantes espontáneos de Mtb resistentes a 10526038.

Mutantes de Mtb: Concentración de 10526038 utilizada para el aislamiento Frecuencia de aislamiento Nivel de resistencia

NTB1: 150x CIM 6,6 · 10-7 2.000x CIM

NTB2: 300x CIM 2 · 10-8 2.000x CIM

NTB3: 300x CIM 2 · 10-8 2.000x CIM

NTB4: 300x CIM 2 · 10-8 2.000x CIM

NTB5: 300x CIM 2 · 10-8 2.000x CIM

NTB6: 300x CIM 2 · 10-8 2.000x CIM

NTB7: 300x CIM 2 · 10-8 2.000x CIM

NTB8: 40x CIM 3,3 · 10-7 2.000x CIM

NTB9: 70x CIM 3,3 · 10-7 166x CIM

NTB10: 150x CIM 6,6 · 10-7 2.000x CIM

Es importante subrayar que los mutantes se aislaron solo en altas concentraciones del fármaco y que los mutantes aislados mostraron dos niveles de resistencia. En particular, el mutante NTB9 es menos resistente y crece muy lentamente.

Para encontrar la mutación responsable de la resistencia, se secuenció el gen rv3790 en todos los mutantes. Se encontraron dos mutaciones de aminoácido puntuales localizadas en el mismo codón del gen rv3790 (tabla 8).

Tabla 8. Mutaciones identificadas en el gen rv3790 de cepas resistentes de Mtb. Se subraya el nucleótido mutado.

Cepas de Mtb: Valores de la CIM Codón Aminoácido (posición 387)

Mtb natural: 1,5 ng/ml tgc Cisteína

Mutantes NTB1-8, NTB10: 2.000x CIM tcc Serina

Mutante NTB9: 166x CIM ggc Glicina

10 Los resultados anteriores señalan la proteína Rv3790 como diana para los fármacos de benzotiazinona.

Dado que dos mecanismos comunes de resistencia a antibióticos incluyen la amplificación de la diana o la modificación de la diana, con el primer método se aislaron cepas micobacterianas resistentes a las benzotiazinonas 15 por medio del mecanismo de amplificación, mientras que con el segundo método se aislaron cepas micobacterianas resistentes a las benzotiazinonas a través de mutaciones en un codón específico del gen rv3790. Este codón está presente en la porción C-terminal de la proteína Rv3790; una cisteína en la proteína Rv3790 natural cambia a una glicina en M. tuberculosis y M. smegmatis (véanse los mutantes NTB9, MN47 y MN48) o una serina en M. tuberculosis, M. bovis BCG y M. smegmatis (véanse los mutantes NTB1-8, NTB10, BN1-8 y MN81 y MN84), lo que

20 causa distintos niveles de resistencia. El mayor nivel de resistencia se observó con la sustitución por serina.

Ya que todas las mutaciones están presentes en el mismo codón, la cisteína podría ser el sitio activo para la unión del fármaco.

25 Por lo tanto, los mutantes seleccionados in vitro sugieren firmemente que los fármacos de benzotiazinona reconocen como diana la proteína Rv3790 y, de este modo, afectan a la síntesis de arabinogalactano.

Proteínas ortólogas de Rv3790

30 Por medio del programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi?organism=microb) se investigó la presencia de genes ortólogos de rv3790 en microorganismos relacionados pertenecientes a la familia de los actinomicetos: Mycobacterium avium, Mycobacterium aurum, Mycobacterium leprae, otras especies micobacterianas, Nocardia spp., Rhodococcus spp. y Corynebacterium spp. Dado que la secuencia de ADN de rv3790 no estaba disponible para algunos microorganismos, como Mycobacterium aurum, en nuestro laboratorio se

35 clonó y secuenció el gen correspondiente. La proteína Rv3790 está bien conservada en todos los microorganismos examinados, según demuestra el análisis de alineamiento múltiple con el programa ClustaIW (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html).

Es de señalar la conservación de la cisteína crítica en los microorganismos examinados. De hecho, se encontró una

40 gran conservación de la cisteína en estos microorganismos, con la excepción de Mycobacterium avium, Mycobacterium avium paratuberculosis y Mycobacterium aurum, en que la cisteína se sustituye por alanina y serina, respectivamente (figura 1).

Para verificar si la ausencia de la cisteína confiere resistencia a la benzotiazinona 10526038, se llevaron a cabo evaluaciones de la CIM para los microorganismos siguientes: Mycobacterium avium, Mycobacterium aurum, Nocardia, spp., Rhodococcus spp y Corynebacterium spp.

5 Para las especies micobacterianas, el experimento se llevó a cabo en el medio 7H11 con diferentes concentraciones del fármaco. Las CIM se determinaron con una dilución del cultivo de 0,5 unidades de McFarland.

Para los otros actinomicetos, Nocardia spp, Rhodococcus spp. y Corynebacterium spp., las diluciones de 0,5 unidades de McFarland se sembraron en agar de Mueller-Hinton con sangre y la adición de diferentes

10 concentraciones del fármaco.

Según se muestra en la tabla 9, la benzotiazinona 10526038 es más activa contra las especies de actinomicetos. Sólo M. avium y M. aurum parecen ser naturalmente resistentes a benzotiazinonas; por lo tanto, se confirma nuestra hipótesis de que la cisteína desempeña un papel clave en la sensibilidad a la benzotiazinona 10526038.

15 Tabla 9. Evaluaciones de la CMI de la benzotiazinona 10526038 para especies de actinomicetos.

Microorganismos: Valor de la CIM de N386

Mycobacterium tuberculosis: 0,75 ng/ml

Mycobacterium bovis BCG: 1,5 ng/ml

Mycobacterium smegmatis: 4 ng/ml

Mycobacterium aurum DSM43999: > 50 !g/ml

Mycobacterium aurum DSM43536: > 50 !g/ml

Mycobacterium aurum SB66, aislamiento clínico: > 50 !g/ml

Mycobacterium vaccae: 0,75 ng/ml

Mycobacterium avium, aislamiento clínico: > 25 !g/ml

Nocardia spp., aislamiento clínico: 12 ng/ml

Rhodococcus spp., aislamiento clínico: 6 ng/ml

Corynebacterium spp., aislamiento clínico: entre 200-500 ng/ml

Expresión heteróloga de Rv3790

20 Dado que la proteína Rv3790 trabaja concertadamente con Rv3791 (3), se construyeron los clones recombinantes siguientes:

1) La enzima Rv3790 natural se produjo en Escherichia coli BL21(DE3)pLysS mediante el vector pET32.

25 2) La enzima Rv3791 natural se produjo en Escherichia coli BL21(DE3)pLysS mediante el vector pET15.

3) La enzima Rv3790 mutada (Cys-Gly: de un mutante resistente de M. tuberculosis) se produjo en E. coli BL21(DE3)pLysS mediante el vector pET32.

30 4) La enzima Rv3790 mutada (Cys-Ser: de un mutante resistente de M. tuberculosis) se produjo en E. coli BL21(DE3)pLysS mediante el vector pET32.

Los genes rv3790 y rv3791 de cepas naturales y resistentes (NTB1 y NTB9) de M. tuberculosis se amplificaron a partir del genoma de M. tuberculosis por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se clonaron en diferentes 35 vectores de expresión. Las construcciones recombinantes se transformaron en células de E. coli BL21DE3/pLysS por electroporación. Con el fin de obtener la expresión de las proteínas en E. coli, se probaron varias condiciones de crecimiento, con o sin isopropil-1-tiogalactósido (IPTG) como inductor, a concentraciones en el intervalo de 0,125 mM a 1 mM. Todos los cultivos se incubaron a 37°C durante dos horas, a 27°C durante dos y cuatro horas y a 20°C durante dos y 20 horas. Las células se recogieron por centrifugación y los extractos de proteína derivados se

40 analizaron por SDS-PAGE.

Referencias

1. Shah NS, Wright A, Bai GH y col. Worldwide emergence of extensively drug-resistant tuberculosis. Emerg. Infect. 45 Dis. 2007, 13: 380-387.

2.: Williams KJ, Duncan K. Current strategies for identifying and validating targets for new treatment-shortening drugs for TB. Curr. Mol. Med. 2007, 7: 297-307

3.: Mikusova K y col. Decaprenylphosphoryl arabinofuranose, the donor of the D-arabinofuranosyl residues of mycobacterial arabinan, is formed via a two-step epimerization of decaprenylphosphoryl ribose. J. Bacteriol. 2005,

187: 8020-8025.

4.: Sassetti CM y col. Genetic requirements for mycobacterial survival during infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100: 12989-12994.

5.: Mullis K y col. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986, 51: 263-73.

6.: Andersen P y col. Recall of long-lived immunity to Mycobacterium tuberculosis infection in mice. J. Immunol. 1995,

154: 3359-3372.

7. Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975,

256: 495-497.

Listado de secuencias

<110> UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PAVIA

<120> UNA NUEVA Y EFICAZ DIANA FARMACOLÓGICA PARA EL TRATAMIENTO DE LA TUBERCULOSIS

<130> E068907-GL

<160> 19

<170> PatentIn, versión 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> ARN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 1 auguugagcg ugggagcuac cacua 25

<210> 2

<211> 1.386

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 2

<210> 3

<211> 60

<212> Proteína

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 3

<210> 4

<211> 60

<212> Proteína

<213> Mycobacterium bovis BCG

<400> 4

<210> 5

<211> 60

<212> Proteína

<213> Mycobacterium bovis 10 <400> 5

<210> 6

<211> 60

<212> Proteína 15 <213> Mycobacterium leprae

<400> 6

<210> 7

<211> 60 20 <212> Proteína

<213> Mycobacterium avium

<400> 7

<210> 8

<211> 60

<212> Proteína

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 8

<210> 9 10 <211> 60

<212> Proteína

<213> Mycobacterium smegmatis

<400> 9

15 <210> 10

<211> 60

<212> Proteína

<213> Mycobacterium aurum

<400> 10

<210> 11

<211> 60

<212> Proteína

<213> Mycobacterium gilvum

<400> 11

<210> 12

<211> 60 10 <212> Proteína

<213> Mycobacterium vanbalenii

<400> 12

<210> 13 15 <211> 60

<212> Proteína

<213> Mycobacterium ulcerans

<400> 13

<210> 14

<211> 60

<212> Proteína

<213> Rhodococcus spp.

<400> 14

<210> 15

<211> 60 10 <212> Proteína

<213> Nocardia farcinica

<400> 15

<210> 16 15 <211> 60

<212> Proteína

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 16

<210> 17

<211> 60

<212> Proteína

<213> Corynebacterium diphtheriae

<400> 17

<210> 18

<211> 60 10 <212> Proteína

<213> Corynebacterium efficiens

<400> 18

<210> 19 15 <211> 60

<212> Proteína

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 19

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Método para el cribado in vitro de fármacos candidatos para el tratamiento de la tuberculosis por interferencia con la biosíntesis de arabinogalactano, en que dicho método comprende una etapa de puesta en contacto de un cultivo celular de Mycobacterium tuberculosis que expresa en exceso una proteína que lleva a cabo la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-P-arabinosa y que está codificada por el gen rv3790 u homólogos del mismo o cualquier marco de lectura abierto artificial cuyo producto génico sea idéntico u homólogo a la proteína Rv3790 con un fármaco candidato y la posterior evaluación del porcentaje de inhibición causado por el fármaco candidato frente a un control en una prueba de ensayo.
2.

Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha prueba de ensayo es una prueba antibacteriana in vitro o una prueba enzimática.
3.

Método de cribado de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el cultivo celular de Mycobacterium tuberculosis que expresa Rv3790 en exceso se obtiene por transformación de un cultivo celular de Mycobacterium tuberculosis con pSODIT-2/Rv3790.
4.

Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la evaluación del porcentaje de inhibición se realiza mediante la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) del fármaco candidato.
5.

Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 4, en el que se usan dos o más concentraciones de los fármacos con el fin de calcular dicha CIM para cada fármaco candidato.
6.

Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que cada fármaco candidato se prueba también en un cultivo celular de M. tuberculosis transformado solo con el vector pSODIT-2.
7.

Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que dicho control es isoniazida.
8.

Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se lleva a cabo un experimento de control adicional en que no se administra ningún tratamiento con un fármaco candidato de modo que se tiene un 0% de inhibición y en el que el % de inhibición obtenido con el fármaco candidato se evalúa con respecto a tal control adicional.
9.

Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha etapa de puesta en contacto de un cultivo celular de Mycobacterium tuberculosis que expresa Rv3790 en exceso con un fármaco candidato puede llevarse a cabo por siembra en placa de la preparación celular en un medio adecuado que contiene diferentes concentraciones del fármaco candidato.
10.

Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho medio es el medio sólido Middlebrook 7H11 (proveedor Difco).
11.

Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho medio se suministra con ácido oleico, albúmina de suero bovino, dextrosa y catalasa (OADC).
12.

Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicha prueba de ensayo es una prueba enzimática que comprende una etapa de puesta en contacto de un fármaco candidato con una enzima Rv3790 recombinante en una mezcla de reacción que contiene FAD, NAD+, NADPH y decaprenilfosforilrribosa (DPR) radiomarcada y la posterior evaluación, frente a un control, del porcentaje de inhibición de la reacción enzimática para obtener decaprenilfosforil-D-Araf (DPA) causado por el fármaco candidato.
13.

Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende además una evaluación por cribado in vivo de los fármacos candidatos que pasan la prueba in vitro, en que dicha evaluación in vivo comprende la administración de regímenes de dosificación preseleccionados del fármaco candidato a ratones con diseminación hemática de una cepa de tuberculosis, en comparación con un fármaco de control y con un placebo.
14.

Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el fármaco de control es isoniazida.
15.

Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14, en el que se usan ratones BALB/C.
16.

Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la cepa de tuberculosis es un cultivo virulento de Mycobacterium tuberculosis H37Rv.
17.

Método de diagnóstico para la identificación de cepas micobacterianas resistentes a los fármacos en un

paciente, en que el método implica la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa del gen rv3790 de una cepa de Mycobacterium tuberculosis aislada de un paciente de TB y el análisis de la secuencia de ADN para detectar la presencia de un cambio de cisteína a glicina o de cisteína a serina en el codón 387 como responsable de la resistencia a las benzotiazinonas.
18. Fármacos inhibidores de la proteína Rv3790 que pueden obtenerse por el método de cribado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en los que dichos fármacos inhibidores se seleccionan entre anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína Rv3790 y secuencias no codificantes de ARN del gen rv3790.

10 19. Inhibidores de acuerdo con la reivindicación 18, en los que dichos inhibidores son secuencias no codificantes de ARN que pueden obtenerse a partir de una secuencia de 25-mer de la secuencia de ARNm del gen rv3790.
20. Inhibidores de acuerdo con la reivindicación 19, en los que dicha secuencia es SEQ ID NO. 1: AUG UUG AGC

GUG GGA GCU ACC ACU A. 15
21. Preparación de cultivos celulares de cepas mutantes de Mycobacterium tuberculosis con el aminoácido cisteína de la posición 387 del gen rv3790 sustituido por serina o glicina como herramienta de control.
22. Uso de SEQ ID NO. 1: AUG UUG AGC GUG GGA GCU ACC ACU A para la preparación de un medicamento 20 para el tratamiento de la tuberculosis.