ES2428405B1 - Vehiculization of antigenic molecules in recombinant elastin-like polymers - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un sistema basado en proteínas recombinantes similares a elastina capaces de autoensamblarse en condiciones fisiológicas para la administración de antígenos. Dicho sistema es capaz de generar el desarrollo de una respuesta inmune eficaz en ausencia de adyuvantes.The present invention relates to a system based on elastin-like recombinant proteins capable of self-assembling under physiological conditions for the administration of antigens. Said system is capable of generating the development of an effective immune response in the absence of adjuvants.

Description

Vehiculización de moléculas antigénicas en polímeros recombinantes similares a elastina Vehiculization of antigenic molecules in recombinant elastin-like polymers

CAMPO DE LA INVENCIÓN FIELD OF THE INVENTION

La presente invención se relaciona con el desarrollo de un sistema basado en proteínas recombinantes similares a elastina capaces de auto ensamblarse en condiciones fisiológicas para la administración de vacunas, en los que una o más moléculas antigénicas pueden ser incorporadas y expuestas. The present invention relates to the development of a system based on elastin-like recombinant proteins capable of self assembling under physiological conditions for the administration of vaccines, in which one or more antigenic molecules can be incorporated and exposed.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN BACKGROUND OF THE INVENTION

El impacto de la vacunación en la salud mundial es uno de los eventos más importantes en la historia de la medicina. Gracias a la vacunación muchas enfermedades están bajo control, erradicadas o, al menos, parcialmente controladas. La administración profiláctica de vacunas eficaces puede ser más efectiva que los tratamientos terapéuticos, más ecológica que el uso de agentes anti-microbianos y ofrece una mayor flexibilidad. The impact of vaccination on world health is one of the most important events in the history of medicine. Thanks to vaccination many diseases are under control, eradicated or, at least, partially controlled. Prophylactic administration of effective vaccines may be more effective than therapeutic treatments, more ecological than the use of anti-microbial agents and offers greater flexibility.

Entre las estrategias vacunales se encuentran las vacunas vivas, acelulares y las subunitarias o particuladas. Vaccine strategies include live, acellular and subunit or particulate vaccines.

Las vacunas vivas son las vacunas más potentes, pero deben estar previamente atenuadas o inactivadas ya que las respuestas celulares y la generación de anticuerpos que tiene lugar son muy intensas. Esto es debido a que en las vacunas vivas, que contienen el organismo completo, están presentes todos los antígenos del patógeno y además su capacidad para replicarse hace que se incremente la cantidad de antígeno disponible para el sistema inmune. Sin embargo las vacunas vivas se han asociado con inestabilidad genética y virulencia residual. Live vaccines are the most potent vaccines, but they must be previously attenuated or inactivated since the cellular responses and the generation of antibodies that take place are very intense. This is because in live vaccines, which contain the whole organism, all pathogen antigens are present and also their ability to replicate increases the amount of antigen available to the immune system. However, live vaccines have been associated with genetic instability and residual virulence.

Las vacunas acelulares, compuestas por organismos completos muertos o toxinas inactivadas, ofrecen una mayor seguridad porque mantienen sus propiedades antigénicas pero carecen de virulencia residual. Sin embargo, como no se pueden replicar en el hospedador, son menos efectivas e inducen respuestas inmunes más débiles, generando una protección durante menor tiempo y por tanto se requiere la administración de múltiples dosis de refuerzo. Acellular vaccines, composed of dead whole organisms or inactivated toxins, offer greater safety because they maintain their antigenic properties but lack residual virulence. However, since they cannot be replicated in the host, they are less effective and induce weaker immune responses, generating protection for a shorter time and therefore the administration of multiple booster doses is required.

Las vacunas subunitarias o particuladas, compuestas por antígenos aislados, se basan en preparaciones parcialmente purificadas de un organismo o proteínas recombinantes. Tienen efectos secundarios mínimos y es posible preparar grandes cantidades del antígeno mediante diversos métodos. Sin embargo, las vacunas subunitarias requieren del conocimiento de qué antígeno proporciona una respuesta inmune adecuada y solventar problemas como el plegamiento incorrecto o una mala presentación al sistema inmune, por lo que frecuentemente es necesario el uso de adyuvantes. El único adyuvante aprobado para su uso en humanos son las sales de aluminio, denominadas genéricamente como Alum; esta sustancia presenta un buen perfil de seguridad pero diversos estudios realizados con diferentes vacunas de naturaleza proteica demuestran que su capacidad adyuvante es bastante limitada y además es un hecho constatado que la respuesta inducida es fundamentalmente humoral, es decir Th2 (Gupta et al. 1998, Adv. Drug Del, Rev. 32: 155-172). Además el Alum no es efectivo en la inducción de una respuesta inmunológica a nivel de mucosas. Por último se ha observado que también puede inducir IgE, lo cual ha sido asociado con reacciones alérgicas. En algunos casos en los que es necesaria una respuesta celular basada en células T CD4 o CD8, el uso de Alum como adyuvante no es suficiente, por lo que es necesario el desarrollo de nuevos adyuvantes y formulaciones. Subunit or particulate vaccines, composed of isolated antigens, are based on partially purified preparations of an organism or recombinant proteins. They have minimal side effects and it is possible to prepare large amounts of the antigen by various methods. However, subunit vaccines require knowledge of which antigen provides an adequate immune response and solve problems such as incorrect folding or a poor presentation to the immune system, so the use of adjuvants is often necessary. The only adjuvant approved for use in humans is aluminum salts, generically referred to as Alum; This substance has a good safety profile but several studies conducted with different vaccines of a protein nature show that its adjuvant capacity is quite limited and it is also a fact that the induced response is fundamentally humoral, that is Th2 (Gupta et al. 1998, Adv. Drug Del, Rev. 32: 155-172). In addition, Alum is not effective in inducing an immune response at the mucosal level. Finally it has been observed that it can also induce IgE, which has been associated with allergic reactions. In some cases where a cellular response based on CD4 or CD8 T cells is necessary, the use of Alum as an adjuvant is not sufficient, so the development of new adjuvants and formulations is necessary.

La inducción de una respuesta inmune apropiada es esencial para una vacuna eficaz y depende de muchos factores, tales como la ruta de administración, la dosis, la duración, el número y la frecuencia de las inmunizaciones, el uso de adyuvantes, etc. The induction of an appropriate immune response is essential for an effective vaccine and depends on many factors, such as the route of administration, dose, duration, number and frequency of immunizations, the use of adjuvants, etc.

La etapa crucial de una respuesta inmune fisiológica comienza con la habilidad de las células presentadoras de antígeno de procesar los antígenos y presentarlos en su superficie. Parece que las células dendríticas juegan un papel importante regulando la cantidad, calidad y duración de la respuesta inmune adaptativa (Pulendran B. Cell 124 (2006) 849-863). The crucial stage of a physiological immune response begins with the ability of the antigen presenting cells to process the antigens and present them on their surface. It seems that dendritic cells play an important role in regulating the quantity, quality and duration of the adaptive immune response (Pulendran B. Cell 124 (2006) 849-863).

La activación apropiada de células T específicas de antígeno es crítica para la inducción de una respuesta inmune adaptativa eficaz y hay varios factores que pueden afectar este proceso. Entre ellos destacan la presencia de señales coestimuladoras y características de la partícula como el tamaño o la superficie, así como la densidad del epítopo y la ruta de administración. Proper activation of antigen-specific T cells is critical for the induction of an effective adaptive immune response and there are several factors that can affect this process. These include the presence of costimulatory signals and particle characteristics such as size or surface, as well as epitope density and administration route.

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El tamaño de las partículas juega un papel importante en la adyuvanticidad. Está ampliamente aceptado que las formulaciones para la administración basadas en vacunas particuladas son más inmunogénicas que los antígenos solubles in vivo (Kanchan V. et al, Biomaterials 28 (2007) 5344-5357) ya que pueden iniciar la captación apropiada y el procesamiento del antígeno por parte de las células presentadoras de antígeno o de las células dendríticas. Se han desarrollado una gran variedad de sistemas adyuvantes de liberación particulados basados en emulsiones lipídicas, nano y micro partículas biodegradables y biocompatibles, complejos inmunoestimuladores, virosomas y partículas similares a virus. Las formulaciones particuladas tienen un tamaño inferior a 0,5 μm y son internalizadas por las células presentadoras de antígeno por una combinación de vías endocíticas y las partículas mayores de 0,5 μm son internalizas por los macrófagos mediante fagocitosis. Esto está de acuerdo con las observaciones de que los sistemas nanoparticulados inducen una fuerte respuesta inmune tanto humoral como celular (Singh M. Pharmaceutical research 19 (2002) 717-728). The size of the particles plays an important role in the adjuvanticity. It is widely accepted that formulations for administration based on particulate vaccines are more immunogenic than soluble antigens in vivo (Kanchan V. et al, Biomaterials 28 (2007) 5344-5357) since they can initiate proper uptake and antigen processing by antigen presenting cells or dendritic cells. A wide variety of particulate release adjuvant systems based on biodegradable and biocompatible nanodegradable micro particles, immunostimulatory complexes, virosomes and virus-like particles have been developed. Particulate formulations are smaller than 0.5 μm in size and are internalized by antigen presenting cells by a combination of endocytic pathways and particles larger than 0.5 μm are internalized by macrophages by phagocytosis. This is in accordance with the observations that nanoparticulate systems induce a strong humoral and cellular immune response (Singh M. Pharmaceutical research 19 (2002) 717-728).

Los sistemas de liberación particulados, además de la capacidad de activar la inmunidad innata, incrementa la duración de la presencia del antígeno, lo que es importante para una respuesta de las células T (Antonio J. et al, Advanced drug delivery reviews 59 (2007) 478-490). La mayoría de estos sistemas de liberación actúan por dos mecanismos, creando un depósito de antígeno in vivo para la liberación del antígeno durante un periodo de tiempo largo e incrementando la captación fagocítica de la partícula cargada con el antígeno por las células presentadoras de antígeno. Tienen además otras ventajas, como la posibilidad de incorporar múltiples péptidos. Particulate release systems, in addition to the ability to activate innate immunity, increase the duration of the presence of the antigen, which is important for a T-cell response (Antonio J. et al, Advanced drug delivery reviews 59 (2007 ) 478-490). Most of these release systems act by two mechanisms, creating an in vivo antigen reservoir for antigen release over a long period of time and increasing phagocytic uptake of the particle loaded with the antigen by the antigen presenting cells. They also have other advantages, such as the possibility of incorporating multiple peptides.

Se han descrito diversos polímeros biodegradables para la liberación de antígenos, incluyendo ácido polisebácido (AP), propano 1,3 bis(p-carboxifenoxi) (PPC), ácido poliglicólico (AG), polisacáridos como quitosan, dextrano, polietilenglicol (PEG), etc... Además se han desarrollado una nueva clase de polímeros para su uso en vacunas, denominados dendrímeros, como los derivados de polipropilen imina (PPI), y poliamido amina (PAMAM) (Heeaard P. et al., Bioconjugate Chem 21 (2010) 405-418). Various biodegradable polymers for antigen release have been described, including polisebacid acid (AP), propane 1,3 bis (p-carboxyphenoxy) (PPC), polyglycolic acid (AG), polysaccharides such as chitosan, dextran, polyethylene glycol (PEG), etc ... In addition, a new class of polymers have been developed for use in vaccines, called dendrimers, such as polypropylene imine derivatives (PPI), and polyamide amine (PAMAM) (Heeaard P. et al., Bioconjugate Chem 21 ( 2010) 405-418).

Sin embargo, los sistemas de liberación conocidos presentan algunas limitaciones como el daño frecuente en el antígeno durante la microencapsulación, la baja eficacia de encapsulación y la liberación inicial mínima del antígeno atrapado. Además, los factores ambientales como pH, temperatura, alta presión, y agitación entre otros puede dañar las proteínas, reduciendo su actividad biológica (Derek T. Methods 40 (2006) 10-19). Estos problemas hacen que los sistemas poliméricos descritos hasta el momento hayan sido usados solamente en veterinaria y no sea posible emplearlos para uso humano. However, known release systems have some limitations such as frequent damage to the antigen during microencapsulation, low encapsulation efficiency and minimal initial release of the trapped antigen. In addition, environmental factors such as pH, temperature, high pressure, and agitation among others can damage proteins, reducing their biological activity (Derek T. Methods 40 (2006) 10-19). These problems mean that the polymer systems described so far have only been used in veterinary medicine and cannot be used for human use.

Floss D.M. et al., (J Biomed Biotechnol.; 2010: 274346) describe la expresión e inmunogenicidad de una proteína de fusión basada en un polímero similar a elastina (Elastin like Polymer ELP) junto a dos grandes antígenos (ESAT-6 y Ag85B) de la bacteria M. tuberculosis (TBAg 40.8kDa). El ELP utilizado contiene 100 repeticiones del pentapéptido VPGXG donde X indica Glicina, Valina o Alanina sin bloques definidos. Dicha proteína es producida en plantas, tratada mediante ciclado de transición inverso (ITC) y utilizada en ensayos de inmunogenicidad. Si bien los autores verifican que la inclusión de la parte ELP aumenta la tasa de expresión y acumulación del antígeno en planta, no demuestran que los polipéptidos resultantes (ELP desnudo y TBAg-ELP) estén puros antes de ser utilizados. Además, los polímeros ensayados no permiten una liberación eficaz del antígeno, por lo que es necesaria su formulación con sistemas liposomales adyuvantes como DDA/MPI y DOTAP. A pesar de ello, la respuesta inmune humoral generada es poco intensa y de corta duración. El nivel de anticuerpos frente al filtrado proteico de la micobacteria al inmunizar con el polipéptido TBAg-ELP sólo resultó eficaz con la dosis de 10 μg al aumentar 10 veces la sensibilidad de la técnica de detección, y perdió intensidad en la siguiente medida temporal, por lo que no induce la maduración de la respuesta humoral que se requiere en toda inmunización eficaz. También demuestra que los mejores resultados se encontraron exclusivamente cuando se inmunizó usando la mezcla de TBAg-ELP junto al antígeno libre ESAT-6, incluso al analizar los anticuerpos dirigidos frente al otro antígeno Ag85B. Esto implica que la incorporación del bloque de ELP es determinante en la producción de la proteína de fusión aunque no en su purificación y, además, no actúa eficazmente como vehículo inductor de la respuesta inmunológica a pesar de contar con un antígeno de grandes dimensiones como el utilizado. Floss D.M. et al., (J Biomed Biotechnol .; 2010: 274346) describes the expression and immunogenicity of a fusion protein based on an elastin-like polymer (Elastin like Polymer ELP) together with two large antigens (ESAT-6 and Ag85B) of M. tuberculosis bacteria (TBAg 40.8kDa). The ELP used contains 100 repetitions of the VPGXG pentapeptide where X indicates Glycine, Valine or Alanine without defined blocks. Said protein is produced in plants, treated by reverse transition cycling (ITC) and used in immunogenicity tests. Although the authors verify that the inclusion of the ELP part increases the expression and accumulation rate of the antigen in the plant, they do not demonstrate that the resulting polypeptides (naked ELP and TBAg-ELP) are pure before being used. In addition, the polymers tested do not allow efficient antigen release, so formulation with adjuvant liposomal systems such as DDA / MPI and DOTAP is necessary. Despite this, the humoral immune response generated is not very intense and of short duration. The level of antibodies against the mycobacterial protein filtrate when immunized with the TBAg-ELP polypeptide was only effective with the 10 μg dose by increasing the sensitivity of the detection technique 10 times, and lost intensity in the following temporal measure, due to which does not induce the maturation of the humoral response that is required in any effective immunization. It also demonstrates that the best results were found exclusively when immunized using the TBAg-ELP mixture together with the free ESAT-6 antigen, even when analyzing antibodies directed against the other Ag85B antigen. This implies that the incorporation of the ELP block is decisive in the production of the fusion protein but not in its purification and, in addition, it does not act effectively as an inducing vehicle of the immune response despite having a large antigen such as the used.

Sun G. et al. (Journal of Controlled Release, 2011, doi:10.1016/j.jconrel.2011.06010) describen la bioproducción y caracterización de una proteína de fusión con un fragmento de adenovirus (Knob) unido a un copolímero en bloque formado por dos pentapéptidos derivados de la elastina o polímeros similares a elastina (Elastin-like Polymers). Los bloques de ELP consisten en el (VPGSG) y el (VPGIG) ambos repetidos 48 veces. Los autores construyen diferentes alternativas usando los tres polipéptidos y concluyen que la formación de nanopartículas estables a 37ºC sólo se verifica cuando se calientan los polipéptidos que contienen ambos bloques de ELP, es decir, Knob-(VPGSG)48-(VPGIG)48 [Knob-S48I48] y la construcción que carece de la proteína vira l (VPGSG)48-(VPGIG)48 [S48I48]. La expresión en E. coli y posterior purificación mediante ciclado de transición inverso (ITC) produjo sendos polímeros con Sun G. et al. (Journal of Controlled Release, 2011, doi: 10.1016 / j.jconrel.2011.06010) describe the bioproduction and characterization of a fusion protein with an adenovirus fragment (Knob) attached to a block copolymer formed by two elastin derived pentapeptides or elastin-like polymers (Elastin-like Polymers). The ELP blocks consist of (VPGSG) and (VPGIG) both repeated 48 times. The authors construct different alternatives using all three polypeptides and conclude that the formation of stable nanoparticles at 37 ° C is only verified when polypeptides containing both ELP blocks are heated, ie Knob- (VPGSG) 48- (VPGIG) 48 [Knob -S48I48] and the construction lacking the viral protein l (VPGSG) 48- (VPGIG) 48 [S48I48]. Expression in E. coli and subsequent purification by reverse transition cycling (ITC) produced polymers with

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algunos contaminantes proteicos. Las construcciones preparadas mostraron capacidad de internalización en hepatocitos mediada por el fragmento Knob, por lo que sugieren que podría utilizarse como sistema de liberación controlada de fármacos intracelularmente que era el objetivo último del artículo. No se realiza ningún tipo de prueba de inmunogenicidad del fragmento incorporado ni a nivel in vitro ni in vivo por lo que no se extrae ninguna conclusión respecto a estos aspectos. Some protein contaminants. The prepared constructs showed capacity for internalization in hepatocytes mediated by the Knob fragment, so they suggest that it could be used as an intracellularly controlled drug delivery system that was the ultimate goal of the article. No type of immunogenicity test of the incorporated fragment is carried out either in vitro or in vivo, so no conclusion is drawn regarding these aspects.

Por tanto existe la necesidad de desarrollar unos sistemas de liberación que permitan la exposición de antígenos para generar una respuesta inmune eficaz en ausencia de otros sistemas adyuvantes. Therefore, there is a need to develop release systems that allow the exposure of antigens to generate an effective immune response in the absence of other adjuvant systems.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN SUMMARY OF THE INVENTION

En un aspecto la invención se relaciona con un conjugado que comprende In one aspect the invention relates to a conjugate comprising

(i) un polipéptido similar a elastina que comprende (i) an elastin-like polypeptide comprising

(a) (to)

al menos una región hidrofílica de secuencia [(X1PGX1G)2 X1PGX2G(X1PGX1G)2]n y at least one hydrophilic region of sequence [(X1PGX1G) 2 X1PGX2G (X1PGX1G) 2] n and

(b) (b)

al menos una región hidrofóbica de secuencia (X3X4IX5G)m en donde X1 y X3 son aminoácidos de cadena lateral hidrofóbica, X2 es un aminoácido de cadena lateral hidrofílica, X4 y X5 son G o P, , n es entre 5 y 10 y m es entre 10 y 100. at least one hydrophobic region of sequence (X3X4IX5G) m where X1 and X3 are hydrophobic side chain amino acids, X2 is a hydrophilic side chain amino acid, X4 and X5 are G or P, n is between 5 and 10 and m is between 10 and 100

y Y

(ii) al menos una molécula antigénica seleccionada del grupo formado por un péptido, un ácido nucleico o un polisacárido (ii) at least one antigenic molecule selected from the group consisting of a peptide, a nucleic acid or a polysaccharide

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con una nanopartícula formada por la asociación de dos o más conjugados de la invención. In a further aspect, the invention relates to a nanoparticle formed by the association of two or more conjugates of the invention.

En otro aspecto adicional, la invención se relaciona con el polinucleótido adecuado para la expresión de una proteína de fusión que comprende un polipéptido similar a elastina, con el vector que contiene dicho polinucleótido, o con las células que contienen el conjugado o el vector de la presente invención. In a further aspect, the invention relates to the polynucleotide suitable for the expression of a fusion protein comprising an elastin-like polypeptide, with the vector containing said polynucleotide, or with the cells containing the conjugate or the vector of the present invention

En otro aspecto, la invención se relaciona con el conjugado, la nanopartícula, el polinucleótido, el vector o célula de la presente invención para su uso como medicamento. In another aspect, the invention relates to the conjugate, the nanoparticle, the polynucleotide, the vector or cell of the present invention for use as a medicament.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el conjugado, la nanopartícula, el polinucleótido, el vector o la célula de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad para estimular y/o inducir la respuesta inmune de un individuo frente a la molécula antigénica. In another aspect, the invention relates to the conjugate, nanoparticle, polynucleotide, vector or cell of the invention for use in the treatment or prevention of a disease to stimulate and / or induce the immune response of an individual against to the antigenic molecule.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del conjugado, de la nanopartícula, del polinucleótido, del vector o de la célula de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad para estimular y/o inducir la respuesta inmune de un individuo frente a la molécula antigénica. In another aspect, the invention relates to the use of the conjugate, nanoparticle, polynucleotide, vector or cell of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of a disease to stimulate and / or induce the immune response of an individual against the antigenic molecule.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1. A) Patrón de electroforesis en gel de poliacrilamide desnaturalizante (SDS-PAGE) de ELPs E50I60 (1), Ag- E50I60 (2) y B) Patrón electroforético de ELP Ag- E50A60. Figure 1. A) Electrophoresis pattern in denaturing polyacrylamide gel (SDS-PAGE) of ELPs E50I60 (1), Ag-E50I60 (2) and B) ELP Ag-E50A60 electrophoretic pattern.

Figura 2. Espectos de MALDI-TOF de los polímeros E50I60 (A) y Ag-E50I60 (B) Figure 2. MALDI-TOF aspects of polymers E50I60 (A) and Ag-E50I60 (B)

Figura 3. Mediciones turbidimétricas de 25 μM Ag E50I60 y Ag-E50I60 (A), y Ag-E50I60 y Ag-E50A60 (B) para evaluar las transiciones de fase inversa a una densidad óptica de 350 nm (OD350), en un rango de 10ºC60ºC en un espectofotómetro UV-VIS con una cámara para la muestra termostatizada. Figure 3. Turbimetric measurements of 25 μM Ag E50I60 and Ag-E50I60 (A), and Ag-E50I60 and Ag-E50A60 (B) to evaluate reverse phase transitions at an optical density of 350 nm (OD350), in a range 10ºC60ºC in a UV-VIS spectrophotometer with a chamber for the thermostatted sample.

Figura 4. Gráfico en el que se muestra el perfil de intensidad dependiente de la temperatura (eje izquierdo vertical) y el tamaño (eje derecho vertical) de las soluciones filtradas de E50I60 y Ag-E50I60 a 1mg/ml en PBS frío (pH 7,4) en un rango de 10 ºC-50ºC, mediante medida por difusión dinámica de la luz medidas en un ángulo de dispersión de 90º. Las gráficas con cuadrados da idea de la estabilidad de la señal y los círculos se refieren al diámetro en nm de ambas partículas. Como se ve la señal de agregación se inicia a 14ºC pero se estabiliza a 20 ºC, y a partir de ahí se obtiene una partícula muy estable de unos 50nm de diámetro. Figure 4. Graph showing the temperature-dependent intensity profile (vertical left axis) and size (vertical right axis) of the filtered solutions of E50I60 and Ag-E50I60 at 1mg / ml in cold PBS (pH 7 , 4) in a range of 10ºC-50ºC, by means of dynamic diffusion of light measured at a dispersion angle of 90º. Graphs with squares give an idea of the stability of the signal and the circles refer to the diameter in nm of both particles. As you can see, the aggregation signal starts at 14 ° C but stabilizes at 20 ° C, and from there a very stable particle of about 50nm in diameter is obtained.

Figura 5 Gráfico en el que se muestra el perfil de intensidad dependiente de la temperatura (eje izquierdo vertical) y el tamaño (eje derecho vertical) de las soluciones filtradas de E50A60 y Ag-E50A60 a 1mg/ml en PBS frío (pH 7,4) en un rango de 10 ºC-50ºC, mediante medida por difusión dinámica de la luz medidas en un ángulo de dispersión de 90º. La señal se estabiliza (cuadrados) iniciándose a 37ºC y estabilizándose a 45ºC. El tipo de partícula que surge es superior a 100nm (círculos). La cercanía a 37ºC Figure 5 Graph showing the temperature-dependent intensity profile (vertical left axis) and size (vertical right axis) of the filtered solutions of E50A60 and Ag-E50A60 at 1mg / ml in cold PBS (pH 7, 4) in a range of 10ºC-50ºC, by means of dynamic diffusion of light measured at a dispersion angle of 90º. The signal is stabilized (squares) starting at 37 ° C and stabilizing at 45 ° C. The type of particle that arises is greater than 100nm (circles). The proximity to 37ºC

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de la formación y estabilización de la partícula hace que sea más peligroso usar esta composición que no nos asegura una partícula estable en condiciones fisiológicas. The formation and stabilization of the particle makes it more dangerous to use this composition that does not ensure a stable particle under physiological conditions.

Figura 6. Imágenes de Cryo-TEM de E50I60 (izquierda) y Ag-E50I60 (derecha), tras calentamiento a 37 ºC. La barra de escala es de 100 nm en la fotografía izquierda y de 50 nm en la fotografía derecha. Figure 6. Cryo-TEM images of E50I60 (left) and Ag-E50I60 (right), after heating at 37 ° C. The scale bar is 100 nm in the left photograph and 50 nm in the right photograph.

Figura 7. Análisis estadístico del tamaño de las partículas de las imágenes de Cryo-TEM analizado con el software Image J. La media del tamaño (en nm) ± desviación estándar a 4ºC y a 37 ºC son 15,1 ± 2,7 y 48,8 ± 13,5, respectivamente para E50I60 y 20,1 ± 7,5 y 55,4 ± 7,1 respectivamente para Ag-E50I60. Figure 7. Statistical analysis of the particle size of the Cryo-TEM images analyzed with the Image J software. The average size (in nm) ± standard deviation at 4 ° C and 37 ° C is 15.1 ± 2.7 and 48 , 8 ± 13.5, respectively for E50I60 and 20.1 ± 7.5 and 55.4 ± 7.1 respectively for Ag-E50I60.

Figura 8. Niveles de viabilidad celular en los distintos grupos de tratamiento (porcentaje de células negativas para anexina V y ioduro de propidio). AG: antígeno libre, ELP: Polímero similar a elastina (E50I60). AG+ELP Polímero similar a elastina con el antígeno (Ag-E50I60). Figure 8. Levels of cell viability in the different treatment groups (percentage of negative cells for annexin V and propidium iodide). AG: free antigen, ELP: Elastin-like polymer (E50I60). AG + ELP Polymer similar to elastin with the antigen (Ag-E50I60).

Figura 9. Ganancia media en el peso de los ratones a lo largo del experimento. Figure 9. Average gain in the weight of the mice throughout the experiment.

Figura 10. Niveles de citoquinas IL-1� (panel superior) y IL-5 (panel inferior) en los días 1 y 29 de inmunización respectivamente mostrando diferencias significativas entre los grupos 1 y 2 y el resto de los grupos (* corresponde a P < 0.05). La IL-5 a día 30 mostró también una significación adicional entre las dosis 1 y 2 del Ag-E50I60 (° P<0.05). Figure 10. Levels of cytokines IL-1� (upper panel) and IL-5 (lower panel) on days 1 and 29 of immunization respectively showing significant differences between groups 1 and 2 and the rest of the groups (* corresponds to P <0.05). The IL-5 at day 30 also showed an additional significance between doses 1 and 2 of Ag-E50I60 (° P <0.05).

Figura 11. Niveles de inmunoglobulinas tipo IgM (paneles superiores) e IgG (paneles inferiores) en los sueros de los ratones inmunizados con las diferentes preparaciones vacunales y analizados con los cuatro diferentes tipos de revestimiento de la placa de ELISA: antígeno biotinilado (Ag), mezcla de proteínas de la micobacteria (CFP), antígeno unido al polímero de elastina (Ag-ELP) y polímero de elastina sin antígeno (ELP). Tiempo 0 días: Barras blancas; Tiempo 1 semana: Barras con diagonal creciente; Tiempo 3 semanas: Barras con aspas; Tiempo 5 semanas: Barras con diagonal decreciente. Figure 11. Levels of immunoglobulins type IgM (upper panels) and IgG (lower panels) in the sera of mice immunized with the different vaccine preparations and analyzed with the four different types of ELISA plate coating: biotinylated antigen (Ag) , mixture of mycobacterial proteins (CFP), elastin polymer bound antigen (Ag-ELP) and antigen-free elastin polymer (ELP). Time 0 days: White bars; Time 1 week: Bars with increasing diagonal; Time 3 weeks: Bars with blades; Time 5 weeks: Bars with decreasing diagonal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Los autores de la presente invención han desarrollado conjugados que comprenden un polipéptido que contienen un número variable de los dominios de elastina responsable de la capacidad de esta proteína de autoensamblarse. Estos conjugados, tal y como se muestra en el ejemplo 2 de la presente invención, son capaces de autoensamblarse formando nanopartículas en condiciones fisiológicas y de presentar un péptido fusionado a dicho polipéptido inmunogénico en su superficie. Si este péptido es un péptido inmunogénico, las nanopartículas pueden ser usadas para generar una respuesta inmune frente a dicho péptido inmunogénico mediante su administración a un animal. The authors of the present invention have developed conjugates comprising a polypeptide containing a variable number of elastin domains responsible for the ability of this protein to self assemble. These conjugates, as shown in example 2 of the present invention, are capable of self-assembling forming nanoparticles under physiological conditions and presenting a peptide fused to said immunogenic polypeptide on its surface. If this peptide is an immunogenic peptide, the nanoparticles can be used to generate an immune response against said immunogenic peptide by administration to an animal.

Conjugado de la invención Conjugate of the invention

Así, en un primer aspecto la invención se relaciona con un conjugado que comprende Thus, in a first aspect the invention relates to a conjugate comprising

(i) (i)

un polipéptido similar a elastina que comprende an elastin-like polypeptide comprising

(a) (to)

al menos una región hidrofílica de secuencia [(X1PGX1G)2 X1PGX2G(X1PGX1G)2]n y at least one hydrophilic region of sequence [(X1PGX1G) 2 X1PGX2G (X1PGX1G) 2] n and

(b) (b)

al menos una región hidrofóbica de secuencia (X3X4IX5G)m en donde X1 y X3 son aminoácidos de cadena lateral hidrofóbica, X2 es un aminoácido de cadena lateral hidrofílica, X4 y X5 son G o P, , n es entre 5 y 10 y m es entre 10 y 100. y at least one hydrophobic region of sequence (X3X4IX5G) m where X1 and X3 are hydrophobic side chain amino acids, X2 is a hydrophilic side chain amino acid, X4 and X5 are G or P, n is between 5 and 10 and m is between 10 and 100. and

(ii) (ii)

al menos una molécula antigénica seleccionada del grupo formado por un péptido, un ácido nucleico o un polisacárido at least one antigenic molecule selected from the group consisting of a peptide, a nucleic acid or a polysaccharide

El término “conjugado”, según se usa en la presente invención, se refiere a dos o más compuestos unidos covalentemente de manera que la función de cada compuesto se conserva en el conjugado. The term "conjugate," as used in the present invention, refers to two or more covalently bonded compounds such that the function of each compound is conserved in the conjugate.

El término “polipéptido”, según se usa en la presente invención, se refiere a la molécula compuesta por la unión de más de 10 aminoácidos. Dada la capacidad de los conjugados de la invención de autoensamblarse de forma parecida a como lo hace la elastina, los conjugados de acuerdo a la presente invención se denominan también de forma indistinta ELPs (elastin-like polymers). The term "polypeptide", as used in the present invention, refers to the molecule composed of the binding of more than 10 amino acids. Given the ability of the conjugates of the invention to self-assemble in a similar way as elastin does, the conjugates according to the present invention are also referred to interchangeably as ELPs (elastin-like polymers).

El término “aminoácido” se refiere a una molécula orgánica con un grupo amino y un grupo carboxílico. The term "amino acid" refers to an organic molecule with an amino group and a carboxylic group.

El componente (a) del polipéptido similar a elastina del conjugado de la invención es una región hidrofílica de secuencia [(X1PGX1G)2 X1PGX2G(X1PGX1G)2]n en donde X1 es un aminoácido de cadena lateral hidrofóbica The component (a) of the elastin-like polypeptide of the conjugate of the invention is a hydrophilic region of sequence [(X1PGX1G) 2 X1PGX2G (X1PGX1G) 2] n wherein X1 is a hydrophobic side chain amino acid

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X2 es un aminoácido de cadena lateral hidrofílica y n es un número entero que oscila entre 5 y 10. X2 is a hydrophilic side chain amino acid and n is an integer ranging from 5 to 10.

El término "aminoácido de cadena lateral hidrofóbica" se refiere a a-, �- y dehidro-aminoácidos en la serie: Leu, n-Leu, Ile, alo-lIe, Val, n-Val, Phe, hPhe, Tyr, Trp, 1-Nal, 2-Nal, h-1-Nal, h-2-Nal, Cha, Chg y Phg; aminoácidos naturales y no naturales, como se definió anteriormente, que contienen en la cadena lateral grupos hidroxi, amino o tio funcionalizados con alquilos, acilos, arilos o acilarilos que contienen de 1 a 11 átomos de carbono; aminoácidos naturales y no naturales, como se definió anteriormente, que contienen en la cadena lateral grupos carboxi-funcionalizados con aminas primarias o secundarias o alcoholes alifáticos o aromáticos que contienen hasta 11 átomos de carbono; fenilalaninas mono- y di-sustituidas en las posiciones orto, meta y para del anillo aromático con halógenos o con grupos alquilo, O-alquilo o Salquilo; �-2 y -3 tienilalanina, �-2 y �-3 furanilalanina; y derivados de ácido 2,3-diaminopropiónico y ácido 2,4-diaminobutirico funcionalizados con alquilos, acilos, arilos o acilarilos que contienen hasta 11 átomos de carbono. The term "hydrophobic side chain amino acid" refers to a-, �- and dehydro-amino acids in the series: Leu, n-Leu, Ile, alo-lIe, Val, n-Val, Phe, hPhe, Tyr, Trp , 1-Nal, 2-Nal, h-1-Nal, h-2-Nal, Cha, Chg and Phg; natural and unnatural amino acids, as defined above, which contain hydroxy, amino or thio groups functionalized with alkyl, acyl, aryl or acylaryl groups containing from 1 to 11 carbon atoms; natural and non-natural amino acids, as defined above, which contain carboxy-functionalized groups in the side chain with primary or secondary amines or aliphatic or aromatic alcohols containing up to 11 carbon atoms; mono- and di-substituted phenylalanines in the ortho, meta and para positions of the aromatic ring with halogens or with alkyl, O-alkyl or Salkyl groups; �-2 and -3 thienylalanine, �-2 and �-3 furanylalanine; and derivatives of 2,3-diaminopropionic acid and 2,4-diaminobutyric acid functionalized with alkyls, acyl, aryls or acylaryls containing up to 11 carbon atoms.

Preferiblemente, los aminoácidos de cadena lateral hidrofóbica son aminoácidos naturales seleccionados del grupo de Ala, Val, Leu e Ile. Los aminoácidos de cadena lateral hidrofóbica que aparecen en las posiciones 1 y 4 dentro de la secuencia (X1PGX1G) pueden ser iguales o distintos. De la misma forma, las secuencias de la primera y segunda repetición de la secuencia (X1PGX1G) pueden ser iguales o distintas. En una forma de realización preferida, los dos aminoácidos de cadena lateral hidrofóbica son iguales y las secuencias de la primera y segunda repetición de la secuencia (X1PGX1G) son iguales. En una forma de realización aún más preferida, los aminoácidos de cadena lateral hidrofóbica que aparecen en posiciones 1 y 4 en la secuencia (X1PGX1G) en el componente (a) del conjugado de la invención son valina, de forma que el componente (a) tiene la secuencia [(VPGVG)2VPGX2G (VPGVG)2]n. Preferably, the hydrophobic side chain amino acids are natural amino acids selected from the group of Ala, Val, Leu and Ile. The hydrophobic side chain amino acids that appear in positions 1 and 4 within the sequence (X1PGX1G) may be the same or different. In the same way, the sequences of the first and second repetition of the sequence (X1PGX1G) can be the same or different. In a preferred embodiment, the two hydrophobic side chain amino acids are the same and the sequences of the first and second sequence repeat (X1PGX1G) are the same. In an even more preferred embodiment, the hydrophobic side chain amino acids that appear in positions 1 and 4 in the sequence (X1PGX1G) in component (a) of the conjugate of the invention are valine, so that component (a) has the sequence [(VPGVG) 2VPGX2G (VPGVG) 2] n.

La expresión "aminoácido de cadena lateral hidrofílica" se usa en la presente invención para referirse a aminoácidos cuyas cadenas laterales contienen grupos capaces de atraer agua o que son solubles en agua o forman puentes de hidrógeno con las moléculas de agua. Este término incluye aminoácidos de cadena lateral cargada (positiva- o negativamente), tales como Lys, Arg o His (aminoácidos que muestran carga neta positiva al pH fisiológico), Asp o Glu (aminoácidos que muestran carga neta negativa al pH fisiológico) o aminoácidos de cadena lateral hidrofílica (Cys, Ser, Thr, Asn y Gln). The term "hydrophilic side chain amino acid" is used in the present invention to refer to amino acids whose side chains contain groups capable of attracting water or that are soluble in water or form hydrogen bonds with water molecules. This term includes charged side chain amino acids (positively or negatively), such as Lys, Arg or His (amino acids that show a positive net charge at physiological pH), Asp or Glu (amino acids that show a negative net charge at physiological pH) or amino acids hydrophilic side chain (Cys, Ser, Thr, Asn and Gln).

En una forma preferida de realización, el aminoácido X2 de cadena lateral hidrofílica que aparece en el componente (a) del polipéptido similar a elastina es Glu. En una forma de realización aún más preferida, el aminoácido de cadena lateral hidrofóbica que aparece en el componente (a) del polipéptido similar a elastina del conjugado de la invención es valina y el aminoácido de cadena lateral hidrofílica que aparece en el componente (a) del polipéptido similar a elastina del conjugado de la invención es Glu de forma que el componente (a) tiene la secuencia [(VPGVG)2VPGEG(VPGVG) 2]n. In a preferred embodiment, the hydrophilic side chain amino acid X2 that appears in component (a) of the elastin-like polypeptide is Glu. In an even more preferred embodiment, the hydrophobic side chain amino acid that appears in component (a) of the elastin-like polypeptide of the conjugate of the invention is valine and the hydrophilic side chain amino acid that appears in component (a) of the elastin-like polypeptide of the conjugate of the invention is Glu so that component (a) has the sequence [(VPGVG) 2VPGEG (VPGVG) 2] n.

En una forma preferida de realización, n toma el valor de 10, de forma que el componente (a) tiene la secuencia [(VPGVG)2VPGEG(VPGVG)2]10. In a preferred embodiment, n takes the value of 10, so that component (a) has the sequence [(VPGVG) 2VPGEG (VPGVG) 2] 10.

El componente (b) del polipéptido similar a elastina del conjugado de la invención es una región hidrofóbica de secuencia (X3X4IX5G)m en donde X3 es un aminoácido de cadena lateral hidrofóbica, X4 y X5 son P o G o P y m es un número entero que oscila entre 10 y 100. Component (b) of the elastin-like polypeptide of the conjugate of the invention is a sequence hydrophobic region (X3X4IX5G) m where X3 is a hydrophobic side chain amino acid, X4 and X5 are P or G or P and m is an integer It ranges between 10 and 100.

La expresión "aminoácido de cadena lateral hidrofóbica" se ha descrito anteriormente en relación con el primer componente del polipéptido similar a elastina del conjugado de la invención. No obstante, la invención contempla polipéptidos en los que los aminoácidos de cadena lateral hidrofóbica que aparecen en las distintas posiciones del segundo componente pueden ser los mismos o diferentes. Así, en una forma preferida de realización, el aminoácido de cadena lateral hidrofóbica en posición -2 con respecto al resto de Ile es Val, el aminoácido de cadena lateral hidrofóbica en posición -1 con respecto al resto de Ile es The term "hydrophobic side chain amino acid" has been described above in relation to the first component of the elastin-like polypeptide of the conjugate of the invention. However, the invention contemplates polypeptides in which the hydrophobic side chain amino acids that appear in the different positions of the second component may be the same or different. Thus, in a preferred embodiment, the hydrophobic side chain amino acid in position -2 with respect to the rest of Ile is Val, the hydrophobic side chain amino acid in position -1 with respect to the rest of Ile is

En una forma preferida de realización, X3 es V, de forma que el segundo componente tiene la secuencia (VX4IX5G)m. En una forma de realización más preferida, X4 es G de forma que el segundo componente tiene la secuencia (VGIX5G)m. En otra forma de realización aún más preferida, X5 es P de forma que el segundo componente tiene la secuencia (VGIPG)m. In a preferred embodiment, X3 is V, so that the second component has the sequence (VX4IX5G) m. In a more preferred embodiment, X4 is G so that the second component has the sequence (VGIX5G) m. In another even more preferred embodiment, X5 is P so that the second component has the sequence (VGIPG) m.

En otra forma preferida de realización, m toma el valor de 60 en cuyo caso el componente (b) del polipéptido similar a elastina del conjugado de la invención es una región hidrofóbica de secuencia In another preferred embodiment, m takes the value of 60 in which case component (b) of the elastin-like polypeptide of the conjugate of the invention is a hydrophobic sequence region

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(X3X4IX5G)60. En otra forma preferida de realización, X3 es V, X5 es G y X5 es P de forma que el segundo componente tiene la secuencia (VGIPG)60. (X3X4IX5G) 60. In another preferred embodiment, X3 is V, X5 is G and X5 is P so that the second component has the sequence (VGIPG) 60.

En una forma preferida de realización, X1 es V; X2 es E; X3 es V; X4 es G; X5 es P;, n es 10 y m es 60 de forma que la secuencia formada por los componentes (a) y (b) de la invención es la SEQ ID NO: 28 In a preferred embodiment, X1 is V; X2 is E; X3 is V; X4 is G; X5 is P ;, n is 10 and m is 60 so that the sequence formed by components (a) and (b) of the invention is SEQ ID NO: 28

1 VPGVGVPGVG VPGEGVPGVG VPGVGVPGVG VPGVGVPGEG VPGVGVPGVG VPGVGVPGVG 1 VPGVGVPGVG VPGEGVPGVG VPGVGVPGVG VPGVGVPGEG VPGVGVPGVG VPGVGVPGVG

61 VPGEGVPGVG VPGVGVPGVG VPGVGVPGEG VPGVGVPGVG VPGVGVPGVG VPGEGVPGVG 61 VPGEGVPGVG VPGVGVPGVG VPGVGVPGEG VPGVGVPGVG VPGVGVPGVG VPGEGVPGVG

121 VPGVGVPGVG VPGVGVPGEG VPGVGVPGVG VPGVGVPGVG VPGEGVPGVG VPGVGVPGVG 121 VPGVGVPGVG VPGVGVPGEG VPGVGVPGVG VPGVGVPGVG VPGEGVPGVG VPGVGVPGVG

181 VPGVGVPGEG VPGVGVPGVG VPGVGVPGVG VPGEGVPGVG VPGVGVPGVG VPGVGVPGEG 181 VPGVGVPGEG VPGVGVPGVG VPGVGVPGVG VPGEGVPGVG VPGVGVPGVG VPGVGVPGEG

241 VPGVGVPGVG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG 241 VPGVGVPGVG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG

301 VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG 301 VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG

361 VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG 361 VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG

421 VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG 421 VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG

481 VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG 481 VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG VGIPGVGIPG

541 VGIPGVGIPG 541 VGIPGVGIPG

que se puede representar de forma abreviada como: which can be represented in abbreviated form as:

[(VPGVG)2 VPGEG (VPGVG)2]10-(VGIPG)60 [(VPGVG) 2 VPGEG (VPGVG) 2] 10- (VGIPG) 60

En una forma preferida de realización, el polipéptido similar a elastina del conjugado de la invención comprende adicionalmente una región polipeptídica que permite la translocación de dicho polipéptido a través de membranas biológicas. In a preferred embodiment, the elastin-like polypeptide of the conjugate of the invention further comprises a polypeptide region that allows translocation of said polypeptide through biological membranes.

Estas secuencias son conocidas de forma genérica como dominios de traducción de proteína (Proteintransducing domains o PTDs). PTDs adecuados para su uso en la presente incluyen, sin limitación, polipéptidos que comprenden la región mínima de la proteína TAT de HIV formada por la secuencia de aminoácidos RKKRRQRR (TAT49-57) (SEQ ID NO: 24), variantes sintéticas de dicha secuencia tales como YARKARRQARR (SEQ ID NO:25); YARAARRAARR (SEQ ID NO:26); YARAARRAARA (SEQ ID NO:27); YARAAARQARA (SEQ ID NO: 2), la proteína VP22 de HSV-1, polipéptidos que comprenden la secuencia RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO: 1), derivada de la tercera hélice del homeodominio de la proteína Antennapedia (), homeodominios derivados de las proteínas Fushi tarazu (Ftz) y Engrailed (En), polilisina, poliarginina (por ejemplo, Arg9), secuencias formadas por lisina y arginina, Transportan, MAP, MTS, o PEP-1. These sequences are generically known as protein translation domains (Proteintransducing domains or PTDs). PTDs suitable for use herein include, without limitation, polypeptides comprising the minimum region of the HIV TAT protein formed by the amino acid sequence RKKRRQRR (TAT49-57) (SEQ ID NO: 24), synthetic variants of said sequence such as YARKARRQARR (SEQ ID NO: 25); YARAARRAARR (SEQ ID NO: 26); YARAARRAARA (SEQ ID NO: 27); YARAAARQARA (SEQ ID NO: 2), the VP22 protein of HSV-1, polypeptides comprising the sequence RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1), derived from the third helix of the homeodomain of the Antennapedia () protein, homeodomains derived from the proteins Fushi tarazu (Ftz) and Engrailed (En), polylysine, polyarginine (for example, Arg9), sequences formed by lysine and arginine, Transport, MAP, MTS, or PEP-1.

En una forma preferida de realización, el polipéptido similar a elastina del conjugado de la invención comprende adicionalmente una secuencia de adhesión celular. In a preferred embodiment, the elastin-like polypeptide of the conjugate of the invention further comprises a cell adhesion sequence.

Por “secuencia de adhesión celular” tal y como se usa en la presente invención se refiere a una secuencia que permite la unión de una proteína a una célula o a un componente de la matriz extracelular. By "cell adhesion sequence" as used in the present invention it refers to a sequence that allows the binding of a protein to a cell or to an extracellular matrix component.

Secuencias de adhesión celular útiles en la presente invención, sin que sirvan para limitar la invención, son entre otras la secuencia RGD presente en las proteínas de matriz extracelular fibronectina, vitronectina, laminina colágeno, fibronectina, trombospondina, factor con Willebrtand´s, entactina y tenascina; secuencias de laminina como YIGSR (SEQ ID NO:15), IKVAV (SEQ ID NO:16), LRE, LGTIPG (SEQ ID NO:17), PDSGR (SEQ ID NO:18) y RNIAEIIKDA (SEQ ID NO:19); secuencia REDV(SEQ ID NO:20) de fibronectina; la secuencia DGEA (SEQ ID NO:21) de colágeno, la secuencia VTXG (SEQ ID NO:22) de trombospondina y la secuencia VGVAPG(SEQ ID NO:23) de elastina. Cell adhesion sequences useful in the present invention, without serving to limit the invention, are among others the RGD sequence present in the extracellular matrix proteins fibronectin, vitronectin, collagen laminin, fibronectin, thrombospondin, Willebrtand's factor, entactin and tenascin; laminin sequences such as YIGSR (SEQ ID NO: 15), IKVAV (SEQ ID NO: 16), LRE, LGTIPG (SEQ ID NO: 17), PDSGR (SEQ ID NO: 18) and RNIAEIIKDA (SEQ ID NO: 19) ; REDV sequence (SEQ ID NO: 20) of fibronectin; the DGEA sequence (SEQ ID NO: 21) of collagen, the VTXG sequence (SEQ ID NO: 22) of thrombospondin and the VGVAPG sequence (SEQ ID NO: 23) of elastin.

Métodos para analizar la capacidad de adhesión celular de una molécula, y por tanto si una secuencia favorece la adhesión celular se resumen en Humphries MJ. Methods Mol Biol. 2009;522:203-10. Además, existen comercialmente distintos kits para analizar la capacidad de adhesión. Methods to analyze the cell adhesion capacity of a molecule, and therefore if a sequence favors cell adhesion are summarized in Humphries MJ. Methods Mol Biol. 2009; 522: 203-10. In addition, there are commercially different kits to analyze adhesion capacity.

En otra forma de realización, el polipéptido similar a elastina del conjugado de la invención comprende adicionalmente un péptido de inicio de la traducción. In another embodiment, the elastin-like polypeptide of the conjugate of the invention further comprises a translation initiation peptide.

Por “péptido de inicio de la traducción” se refiere a un péptido que resulta de la traducción de una región iniciadora de la traducción en el ARNm que codifica el polipéptido de la invención. Típicamente, dicho péptido resulta de la traducción de una región en el ARNm correspondiente que comprende la secuencia en posición 5’ RTG/RUG que da lugar a un resto de metionina. En un aspecto particular adicional, el péptido de inicio de la traducción es MESLLP (SEQ ID NO: 3 By "translation initiation peptide" refers to a peptide that results from the translation of a translation initiating region in the mRNA encoding the polypeptide of the invention. Typically, said peptide results from the translation of a region in the corresponding mRNA comprising the sequence in position 5 ′ RTG / RUG that results in a methionine residue. In a further particular aspect, the translation start peptide is MESLLP (SEQ ID NO: 3

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En otra forma de realización, el polipéptido similar a elastina del conjugado de la invención comprende adicionalmente un péptido con capacidad de unir ácidos nucleico formado por una región rica en aminoácidos básicos, como por ejemplo, oligo-Lys, oligo-Arg o oligo-Lys/Arg. Esta región puede encontrarse en la región N- o C-terminal del polipéptido similar a elastina de forma que la unión al ácido nucleico no interfiera con la formación de las nanopartículas. In another embodiment, the elastin-like polypeptide of the conjugate of the invention further comprises a peptide capable of binding nucleic acids formed by a region rich in basic amino acids, such as oligo-Lys, oligo-Arg or oligo-Lys / Arg. This region can be found in the N- or C-terminal region of the elastin-like polypeptide so that nucleic acid binding does not interfere with the formation of nanoparticles.

El componente (ii) del conjugado de la invención es al menos una molécula antigénica seleccionada del grupo formado por un péptido, un ácido nucleico o un polisacárido antigénico. Component (ii) of the conjugate of the invention is at least one antigenic molecule selected from the group consisting of a peptide, a nucleic acid or an antigenic polysaccharide.

Por “molécula antigénica”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de naturaleza peptídica, un ácido nucleico o un polisacárido que comprenden uno o más epítopos capaces de estimular el sistema inmune de un organismo para generar una respuesta humoral o celular específica del antígeno. Como resultado de la puesta en contacto de la molécula antigénica con las células apropiadas en un sujeto, el antígeno genera un estado de sensibilidad o capacidad de respuesta inmune en dicho sujeto de forma que tanto anticuerpos como células inmunes obtenidas a partir de dicho sujeto son capaces de reaccionar de forma específica con el antígeno. By "antigenic molecule," as used herein, it refers to a peptide-type molecule, a nucleic acid or a polysaccharide that comprises one or more epitopes capable of stimulating an organism's immune system to generate a response. humoral or antigen specific cell. As a result of the contact of the antigenic molecule with the appropriate cells in a subject, the antigen generates a state of sensitivity or immune response capacity in said subject so that both antibodies and immune cells obtained from said subject are capable to react specifically with the antigen.

Diversos métodos son conocidos por el experto en la materia para determinar los péptidos antigénicos de una proteína. Por ejemplo, el método descrito en Kolaskar As. et al, 1990 FEBS Lett. Dec 10; 276(12):172-4 se basa en que las regiones más probables de contener sitios antigénicos son aquellos en los que los residuos cisteína, leucina y valina se encuentran en la superficie de una proteína; Liang S. et al, BMC Bioinformatics. 2010 Jul 16;11:381 describe dos aplicaciones para la determinación de epítopos discontinuos. Otros métodos se describen en Yang X. et al, Rev Med Virol 2009, 19:77-96 y Larsen JE. et al, Immunome Res 2006, 2:2 entre otros. Various methods are known to those skilled in the art for determining the antigenic peptides of a protein. For example, the method described in Kolaskar As. Et al, 1990 FEBS Lett. Dec 10; 276 (12): 172-4 is based on the fact that the most likely regions to contain antigenic sites are those in which cysteine, leucine and valine residues are found on the surface of a protein; Liang S. et al, BMC Bioinformatics. 2010 Jul 16; 11: 381 describes two applications for the determination of discontinuous epitopes. Other methods are described in Yang X. et al, Rev Med Virol 2009, 19: 77-96 and Larsen JE. et al, Immunome Res 2006, 2: 2 among others.

El término “péptido”, según se usa en la presente invención, se refiere a un compuesto formado por dos o más aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. The term "peptide", as used in the present invention, refers to a compound formed by two or more amino acids linked by peptide bonds.

El término “ácido nucleico”, según se usa en la presente invención, se refiere a polímeros formados por la repetición de monómeros llamados nucleótidos, unidos mediante enlaces fosfodiéster. The term "nucleic acid," as used in the present invention, refers to polymers formed by the repetition of monomers called nucleotides, linked by phosphodiester bonds.

El término “polisacárido”, según se usa en la presente invención, se refiere a polímeros cuyos monómeros constituyentes son monosacáridos, los cuales se unen repetitivamente mediante enlaces glucosídicos. The term "polysaccharide," as used in the present invention, refers to polymers whose constituent monomers are monosaccharides, which are repeatedly linked by glycosidic bonds.

Por el término “antígeno” se refiere a cualquier sustancia capaz de ser reconocida por el sistema inmune de un sujeto y/o capaz de inducir en un sujeto una respuesta inmune humoral o una respuesta inmune celular que conduce a la activación de linfocitos B y/o T cuando se introduce en un sujeto; a modo ilustrativo, dicho término incluye cualquier producto inmunogénico, nativo o recombinante, obtenido de un organismo superior o de un microorganismo, por ejemplo, una bacteria, un virus, un parásito, un protozoo, un hongo, etc.., que contiene uno o más determinantes antigénicos, por ejemplo, componentes estructurales de dichos organismos; toxinas, por ejemplo, exotoxinas, etc. Prácticamente cualquier antígeno puede ser utilizado en la elaboración del conjugado de la invención incluyendo proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos y lípidos entre otros. By the term "antigen" refers to any substance capable of being recognized by the immune system of a subject and / or capable of inducing in a subject a humoral immune response or a cellular immune response that leads to the activation of B lymphocytes and / or T when introduced into a subject; by way of illustration, said term includes any immunogenic, native or recombinant product, obtained from a higher organism or from a microorganism, for example, a bacterium, a virus, a parasite, a protozoan, a fungus, etc., which contains one or more antigenic determinants, for example, structural components of said organisms; toxins, for example, exotoxins, etc. Virtually any antigen can be used in the preparation of the conjugate of the invention including proteins, polysaccharides, nucleic acids and lipids among others.

Ejemplos de péptidos y proteínas inmunológicamente activos/activas, antigénicos, sin que sirvan para limitar la invención, incluyen: Examples of antigenically immunologically active / active peptides and proteins, without serving to limit the invention, include:

• Péptidos o proteínas capaces de (apropiados o diseñados para) inducir una respuesta inmune frente a una enfermedad infecciosa, tal como una enfermedad infecciosa en animales causada por microorganismos patógenos de animales, incluyendo al ser humano, por ejemplo, virus, bacterias, hongos y parásitos infecciosos, relevantes en sanidad humana o animal. • Peptides or proteins capable of (appropriate or designed to) induce an immune response against an infectious disease, such as an infectious disease in animals caused by pathogenic microorganisms of animals, including humans, for example, viruses, bacteria, fungi and infectious parasites, relevant in human or animal health.

Las proteínas o péptidos capaces de inducir una respuesta inmune pueden ser proteínas o péptidos recombinantes, idénticos o similares a los antígenos naturales de un microorganismo específico. The proteins or peptides capable of inducing an immune response may be recombinant proteins or peptides, identical or similar to the natural antigens of a specific microorganism.

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de virus infecciosos incluyen virus de las familias: Arteriviridae, Retroviridae, Picornaviridae, Calciviridae, Togaviridae, Flaviridae, Coronoviridae, Rhabdoviradae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bungaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Hepadnaviridae, Parvoviridae (parvovirus), Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Iridoviridae, etc. Ejemplos de antígenos que se pueden emplear según la presente invención incluyen, aunque no se limita a, antígenos de HIV, antígeno gp120, antígeno de superficie de la hepatitis B, antígenos de rotavirus como VP4 y VP7, antígenos del virus de la influenza como la hemaglutinina o la nucleoproteína, antígeno del herpes simplex timidina kinasa, etc. Nonlimiting infectious virus Illustrative examples include virus of the families: Arteriviridae, Retroviridae, Picornaviridae, Calciviridae, Togaviridae, Flaviridae, Coronoviridae, Rhabdoviradae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bungaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Hepadnaviridae, Parvoviridae (parvovirus ), Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Iridoviridae, etc. Examples of antigens that can be employed according to the present invention include, but are not limited to, HIV antigens, gp120 antigen, hepatitis B surface antigen, rotavirus antigens such as VP4 and VP7, influenza virus antigens such as hemagglutinin or nucleoprotein, herpes simplex thymidine kinase antigen, etc.

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Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de bacterias incluyen tanto bacterias Gram positivas, e.g., Pasteurella sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp., etc., como bacterias Gram negativas, e.g., Escherichia coli, Pseudomonas sp., Salmonella sp., etc. Ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen: Helicobacter pylori, Borrelia burgdorferi, Legionella pneumoplailia, Mycobacteria sp. (e.g., M. tuberculosis, Illustrative, non-limiting examples of bacteria include both Gram positive bacteria, eg, Pasteurella sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Etc., and Gram negative bacteria, eg, Escherichia coli, Pseudomonas sp., Salmonella sp., Etc. . Specific examples of infectious bacteria include: Helicobacter pylori, Borrelia burgdorferi, Legionella pneumoplailia, Mycobacteria sp. (e.g., M. tuberculosis,

M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogefaes (Grupo A de Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Grupo B de Streptococcus), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (especies anaeróbicas), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus aratracis, Corynebacteriumdiphtlzeriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pyzeunaoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, Actinornyces israelli, Chlamydia, etc. M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogefaes (Group A of Streptococcus), Streptococcus agalactiarecoccus (Group B of Stcustococcus (Group B of Stcustococcus) (Group B of Stcustococcus (Group B of Stcustococcus) viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobic species), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus aratracis, Corynebacteriumdiphtlzeriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pyzeunaoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, Actinornyces israelli, Chlamydia, etc.

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de hongos infecciosos incluyen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis y Candida albicans. Illustrative, non-limiting examples of infectious fungi include Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis and Candida albicans.

Entre los parásitos infecciosos se incluyen, a modo ilustrativo, no limitativo, protozoos, tales como Plasmodium sp., causantes de la malaria, e.g. P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, etc., Leishmania sp., causantes de leishmaniasis, e.g., L. major, L. donovani, L. infantum, L. braziliensis, L. panamensis, L. mexicana, etc., Toxoplasma gondii, Schistosoma sp., etc., así como nematodos parásitos, tales como Dirofilaria immitis, etc. Ejemplos de antígenos para estos parásitos incluyen el antígeno circumsporozoito de Plasmodium spp.; el antígeno de superficie merozoito de Plasmodium spp.; el antígeno SPf66 de P. falciparum; el antígeno S-3, molécula que incluye cuatro epitopos correspondientes a diferentes estadios del ciclo de vida de P. falciparum; el gp63 de Leishmania spp., etc. Infectious parasites include, by way of illustration, not limitation, protozoa, such as Plasmodium sp., Causing malaria, e.g. P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, etc., Leishmania sp., Causing leishmaniasis, eg, L. major, L. donovani, L. infantum, L. braziliensis, L. panamensis, L Mexican, etc., Toxoplasma gondii, Schistosoma sp., etc., as well as parasitic nematodes, such as Dirofilaria immitis, etc. Examples of antigens for these parasites include the circumsporozoite antigen of Plasmodium spp .; the merozoite surface antigen of Plasmodium spp .; SPf66 antigen from P. falciparum; the S-3 antigen, a molecule that includes four epitopes corresponding to different stages of the life cycle of P. falciparum; the gp63 of Leishmania spp., etc.

• Péptidos o proteínas asociados a tumores o cánceres (“marcadores tumorales”) capaces de (apropiados o diseñados para) inducir una respuesta inmune frente a una célula tumoral o cancerosa, por lo que el péptido o proteína puede ser utilizado en el tratamiento de cánceres mediante la estimulación de una respuesta inmune específica de antígeno frente a un antígeno tumoral. • Peptides or proteins associated with tumors or cancers (“tumor markers”) capable of (appropriate or designed to) induce an immune response against a tumor or cancerous cell, so that the peptide or protein can be used in the treatment of cancers by stimulating an antigen specific immune response against a tumor antigen.

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de cánceres que podrían ser potencialmente tratados de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención incluyen cáncer del tracto biliar, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer cervical, coriocarcinoma, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de estómago, neoplasmas intraepiteliales, linfomas, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (e.g., cáncer de pulmón de células pequeñas y de células no pequeñas), melanoma, neuroblastomas, cáncer de boca, cáncer de ovarios, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de recto, sarcomas, cáncer de piel, cáncer de testículos, cáncer de tiroides y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas. Illustrative, non-limiting examples of cancers that could potentially be treated in accordance with the teachings of the present invention include biliary tract cancer, brain cancer, breast cancer, cervical cancer, choriocarcinoma, colon cancer, endometrial cancer, cancer esophagus, stomach cancer, intraepithelial neoplasms, lymphomas, liver cancer, lung cancer (eg, small cell and non-small cell lung cancer), melanoma, neuroblastomas, mouth cancer, ovarian cancer, pancreas cancer, Prostate cancer, rectal cancer, sarcomas, skin cancer, testicular cancer, thyroid cancer and kidney cancer, as well as other carcinomas and sarcomas.

La selección de antígenos tumorales o determinantes antigénicos para el tratamiento de cánceres puede ser realizada por un experto en la materia a la vista del estado de la técnica (Renkvist et al. 2001, Cancer Immunol. Immunother. 50: 3-15), estando dichos antígenos y determinantes antigénicos incluidos dentro del ámbito de la presente invención. Ejemplos representativos de dichos antígenos o determinantes antigénicos incluyen: Her2 (cáncer de mama); GD2 (neuroblastoma); EGF-R (glioblastoma maligno); CEA (cáncer de tiroide medular); CD52 (leucemia); proteína gp100 de melanoma humano; proteína melanA/MART-1 de melanoma humano; tirosinasa; proteína NA17-A nt; proteína MAGE-3; proteína p53; proteína HPV16E7; y fragmentos antigénicos de dichos péptidos o proteínas. The selection of tumor antigens or antigenic determinants for the treatment of cancers can be carried out by a person skilled in the art in view of the state of the art (Renkvist et al. 2001, Cancer Immunol. Immunother. 50: 3-15), being said antigens and antigenic determinants included within the scope of the present invention. Representative examples of such antigens or antigenic determinants include: Her2 (breast cancer); GD2 (neuroblastoma); EGF-R (malignant glioblastoma); CEA (medullary thyroid cancer); CD52 (leukemia); human melanoma gp100 protein; melanoma / MART-1 human melanoma protein; tyrosinase; NA17-A nt protein; MAGE-3 protein; p53 protein; HPV16E7 protein; and antigenic fragments of said peptides or proteins.

• Péptidos o proteínas capaces de (apropiados o diseñado para) inducir una respuesta inmune frente a un alergeno. • Peptides or proteins capable of (appropriate or designed to) induce an immune response against an allergen.

Tal como se utiliza en esta descripción, el término “alergeno” se refiere a un péptido o proteína a la que un sujeto es sensible y provoca una reacción inmunitaria, por ejemplo, extractos alergénicos de pólenes, extractos alergénicos de insectos, extractos alergénicos de alimentos o productos alimenticios, componentes presentes en saliva, pinzas o aguijones de insectos que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, componentes presentes en plantas que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de alergenos incluyen extractos proteicos de pólenes, e.g., de Lolium perenne, Poa pratense, Phleum pratense, Cynodon dactylon, Festuca pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, Triticum sativa, Artemisia vulgaris, Chenopodium album, Plantago lanceolata, Taraxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica, Olea europea, Platanus sp., Cupressus sp., etc.; extractos proteicos de insectos, e.g., de Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Acarus siro, Blomia tropicalis, Euroglyphus As used in this description, the term "allergen" refers to a peptide or protein to which a subject is sensitive and causes an immune reaction, for example, allergenic extracts of pollens, allergenic extracts of insects, allergenic extracts of food. or food products, components present in saliva, tweezers or stingers of insects that induce a sensitivity reaction in a subject, components present in plants that induce a sensitivity reaction in a subject, etc. Illustrative, non-limiting examples of allergens include protein extracts from pollens, eg, from Lolium perenne, Poa pratense, Phleum pratense, Cynodon dactylon, Festuca pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, Triticum sativa, Chemismispopodium album, Plantago lanceolata, Taraxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica, Olea Europea, Platanus sp., Cupressus sp., etc .; Protein extracts of insects, e.g., from Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Acarus siro, Blomia tropicalis, Euroglyphus

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maynei, Glyciphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae, etc.; extractos proteicos de hongos o de epitelios animales, e.g., Penicillium sp., Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, epitelio de perro, epitelio de gato, epitelio de caballo, etc.; extractos proteicos de alimentos o productos alimenticios, etc. maynei, Glyciphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae, etc .; Protein extracts from fungi or animal epithelia, e.g., Penicillium sp., Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, dog epithelium, cat epithelium, horse epithelium, etc .; Protein extracts of food or food products, etc.

• Péptidos o proteínas capaces de (apropiados o diseñados para) inducir una respuesta mejorada frente a un auto-antígeno. El término “auto-antígeno”, tal como aquí se utiliza, se refiere a péptidos o proteínas codificados por el ADN del sujeto y productos generados por proteínas o ARN codificado por el ADN del sujeto. Ejemplos de auto-antígenos se describen en WO 02/56905. • Peptides or proteins capable of (appropriate or designed to) induce an improved response to a self-antigen. The term "auto-antigen", as used herein, refers to peptides or proteins encoded by the subject's DNA and products generated by proteins or RNA encoded by the subject's DNA. Examples of auto-antigens are described in WO 02/56905.

Polisacáridos antigénicos, sin que sirvan para limitar la invención, incluyen por ejemplo polisacáridos capsulares como N-acetilmanosamina derivados de Haemophilus influenza, neumococo, estreptococo �hemolítico y E. coli, entre otros. Antigenic polysaccharides, without serving to limit the invention, include, for example, capsular polysaccharides such as N-acetylmanosamine derived from Haemophilus influenza, pneumococcus, hemolytic streptococcus and E. coli, among others.

En una realización particular el componente (ii) del conjugado de la invención es un péptido antigénico. In a particular embodiment component (ii) of the conjugate of the invention is an antigenic peptide.

En otra realización adicional, la molécula antigénica comprendida en el conjugado de la invención es un péptido antigénico de M. tuberculosis. In another additional embodiment, the antigenic molecule comprised in the conjugate of the invention is an antigenic peptide of M. tuberculosis.

Por “Mycobacterium tuberculosis” según se emplea en la presente invención se refiere a una bacteria gram positiva, alcohol-ácida resistente, aeróbica estricta y que pertenece al género Mycobacterium. By "Mycobacterium tuberculosis" as used in the present invention it refers to a gram-positive, alcohol-resistant acidic, strict aerobic bacterium belonging to the genus Mycobacterium.

En una realización particular el péptido antigénico de M. tuberculosis es un péptido de la proteína Hsp In a particular embodiment the antigenic peptide of M. tuberculosis is a peptide of the Hsp protein

16.3 (SEQ ID NO:4). 16.3 (SEQ ID NO: 4).

Por “proteína Hsp 16.3” se entiende la proteína de M. tuberculosis con número de acceso P0A5B7 de la base de datos Uniprot y que actúa como chaperona y tiene capacidad para suprimir la desnaturalización termal de la alcohol deshidrogenasa. By "Hsp 16.3 protein" is meant M. tuberculosis protein with accession number P0A5B7 from the Uniprot database and which acts as chaperone and has the capacity to suppress thermal denaturation of alcohol dehydrogenase.

En otra realización particular adicional el péptido de la proteína Hsp 16.3 es el péptido comprendido entre las posiciones 91 a 110 con la secuencia descrita en SEQ ID NO: 5. In another additional particular embodiment the Hsp 16.3 protein peptide is the peptide between positions 91 to 110 with the sequence described in SEQ ID NO: 5.

Estructura de los conjugados de la invención Structure of the conjugates of the invention

En aquellas formas de realización en donde el componente (ii) es de naturaleza peptítida, es preferible que este se encuentre formando parte junto con los componentes (a) y (b) de una única cadena polipéptidica. Así, en una forma preferida de realización, el conjugado de la invención es una proteína de fusión que comprende los componentes (a), (b) y (ii) siendo el componente (ii) de naturaleza peptídica. In those embodiments where component (ii) is of a peptidic nature, it is preferable that it is being part together with components (a) and (b) of a single polypeptide chain. Thus, in a preferred embodiment, the conjugate of the invention is a fusion protein comprising components (a), (b) and (ii) being component (ii) of a peptide nature.

En el caso particular de que los componentes (i) y (ii) del conjugado de la invención estén formando una única cadena polipeptídica, el experto apreciará que el ordenamiento de los componentes (i) y (ii) en la cadena polipeptídica puede ser cualquiera siempre que dé lugar a la formación de nanopartículas capaces de vehiculizar el péptido inmunogénico al sistema inmune. In the particular case that the components (i) and (ii) of the conjugate of the invention are forming a single polypeptide chain, the expert will appreciate that the ordering of the components (i) and (ii) in the polypeptide chain can be any provided that it results in the formation of nanoparticles capable of vehiculizing the immunogenic peptide to the immune system.

En una forma preferida de realización, el péptido antigénico se encuentra en posición N-terminal con respecto al componente (i) que, a su vez, se encuentra en posición N-terminal con respecto al componente (ii). En ese caso, se obtienen nanopartículas que presentan el péptido inmunogénico al exterior. En otra forma preferida de realización, el péptido antigénico se encuentra en posición C-terminal de manera que dicho péptido quedará expuesto tras su procesamiento y exposición por parte de las células presentadoras de antígenos. En este caso, el conjugado de la invención puede contener adicionalmente una secuencia adicional capaz de permitir la translocación del polipéptido (o de las partículas formadas por dichos polipéptidos) a través de membranas biológicas. In a preferred embodiment, the antigenic peptide is in an N-terminal position with respect to component (i) which, in turn, is in an N-terminal position with respect to component (ii). In that case, nanoparticles are obtained that present the immunogenic peptide abroad. In another preferred embodiment, the antigenic peptide is in the C-terminal position so that said peptide will be exposed after processing and exposure by the antigen presenting cells. In this case, the conjugate of the invention may additionally contain an additional sequence capable of allowing translocation of the polypeptide (or of the particles formed by said polypeptides) through biological membranes.

El término “secuencia que permite la traslocación de dicho polipéptido a través de membranas biológicas” ha sido definido anteriormente. The term "sequence that allows the translocation of said polypeptide through biological membranes" has been defined above.

En el caso particular de que los componentes (i), (ii) y la secuencia de adhesión celular del conjugado de la invención estén formando una única cadena polipeptídica, el experto apreciará que el ordenamiento de los componentes (i), (ii) y la secuencia de adhesión celular en la cadena polipeptídica puede ser cualquiera siempre que dé lugar a la formación de nanopartículas capaces de presentar el péptido inmunogénico al exterior y de conseguir una adhesión celular adecuada. En una forma preferida de In the particular case that the components (i), (ii) and the cell adhesion sequence of the conjugate of the invention are forming a single polypeptide chain, the expert will appreciate that the ordering of the components (i), (ii) and The sequence of cell adhesion in the polypeptide chain can be any as long as it results in the formation of nanoparticles capable of presenting the immunogenic peptide to the outside and achieving adequate cell adhesion. In a preferred form of

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realización, secuencia de adhesión celular se encuentra en posición N-terminal con respecto al componente (i) que, a su vez, se encuentra en posición N-terminal con respecto al componente (ii). embodiment, cell adhesion sequence is in N-terminal position with respect to component (i) which, in turn, is in N-terminal position with respect to component (ii).

El término “secuencia de adhesión celular” ha sido definido anteriormente. The term "cell adhesion sequence" has been defined above.

En los casos en los que los componentes (i) y (ii) formen una única cadena polipéptidica, cadena polipeptídica o polipéptido de la invención, y que dicha cadena polipeptídica comience por la secuencia (i) In cases where components (i) and (ii) form a single polypeptide chain, polypeptide chain or polypeptide of the invention, and said polypeptide chain begins with the sequence (i)

o (ii) y debido a la ausencia en posición N-terminal de dichas secuencias de restos de metionina, es necesario modificar el polinucleótido que codifica la cadena polipeptídica de la invención de forma que incorpore un sitio de iniciación de la traducción en el ARNm resultante. La incorporación de dicha región en el polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención da lugar a la aparición en posición Nterminal de dicho polipéptido de una región extra que se denomina en la presente invención como péptido de inicio de la traducción. Así, en una realización particular, el polipéptido similar a elastina del conjugado de la invención comprende un péptido de inicio de la traducción. or (ii) and due to the absence in the N-terminal position of said methionine residue sequences, it is necessary to modify the polynucleotide encoding the polypeptide chain of the invention so as to incorporate a translation initiation site into the resulting mRNA . The incorporation of said region into the polynucleotide encoding the polypeptide of the invention results in the N-terminal appearance of said polypeptide from an extra region that is referred to herein as the translation initiation peptide. Thus, in a particular embodiment, the elastin-like polypeptide of the conjugate of the invention comprises a translation initiation peptide.

El término “péptido de inicio de la traducción” ha sido definido anteriormente. The term "translation start peptide" has been defined above.

En los casos en los que los componentes (i) y (ii) formen una única cadena polipéptidica, dicho polipéptido puede contener adicionalmente una región con capacidad de unir ácidos nucleicos. Secuencias adecuadas para unir ácidos nucleicos están formadas habitualmente por una región rica en aminoácidos básicos, como por ejemplo, oligo-Lys, oligo-Arg o oligo-Lys/Arg. In cases where components (i) and (ii) form a single polypeptide chain, said polypeptide may additionally contain a region capable of binding nucleic acids. Suitable sequences for binding nucleic acids are usually formed by a region rich in basic amino acids, such as oligo-Lys, oligo-Arg or oligo-Lys / Arg.

En una realización particular, el polipéptido similar a elastina del conjugado de la invención comprende adicionalmente la secuencia de inicio de la traducción (preferiblemente la secuencia SEQ ID NO:3), en posición N-terminal, seguida de la secuencia del péptido antigénico (preferiblemente la secuencia SEQ ID NO:4) seguida del componente (a) (preferiblemente de secuencia [(X1PGX1G)2 X1PGX2G(X1PGX1G)2]n en donde X1 y n toman los valores definidos anteriormente) y seguida del componente (b) ((X3X4IX5G)m en donde X3 X4, X5 y m toman los valores indicados anteriormente). En una forma de realización aún más preferida, el conjugado de la invención comprende la secuencia SEQ ID NO: 29: In a particular embodiment, the elastin-like polypeptide of the conjugate of the invention further comprises the translation initiation sequence (preferably the sequence SEQ ID NO: 3), in the N-terminal position, followed by the antigenic peptide sequence (preferably the sequence SEQ ID NO: 4) followed by component (a) (preferably from sequence [(X1PGX1G) 2 X1PGX2G (X1PGX1G) 2] n where X1 and n take the values defined above) and followed by component (b) ((X3X4IX5G ) m where X3 X4, X5 and m take the values indicated above). In an even more preferred embodiment, the conjugate of the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 29:

1 MESLLPVSEF AYGSFVRTVS LPVGADEVPG VGVPGVGVPG EGVPGVGVPG VGVPGVGVPG 1 MESLLPVSEF AYGSFVRTVS LPVGADEVPG VGVPGVGVPG EGVPGVGVPG VGVPGVGVPG

61 VGVPGEGVPG VGVPGVGVPG VGVPGVGVPG EGVPGVGVPG VGVPGVGVPG VGVPGEGVPG 61 VGVPGEGVPG VGVPGVGVPG VGVPGVGVPG EGVPGVGVPG VGVPGVGVPG VGVPGEGVPG

121 VGVPGVGVPG VGVPGVGVPG EGVPGVGVPG VGVPGVGVPG VGVPGEGVPG VGVPGVGVPG 121 VGVPGVGVPG VGVPGVGVPG EGVPGVGVPG VGVPGVGVPG VGVPGEGVPG VGVPGVGVPG

181 VGVPGVGVPG EGVPGVGVPG VGVPGVGVPG VGVPGEGVPG VGVPGVGVPG VGVPGVGVPG 181 VGVPGVGVPG EGVPGVGVPG VGVPGVGVPG VGVPGEGVPG VGVPGVGVPG VGVPGVGVPG

241 EGVPGVGVPG VGVPGVGVPG VGVPGEGVPG VGVPGVGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI 241 EGVPGVGVPG VGVPGVGVPG VGVPGEGVPG VGVPGVGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI

301 PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI 301 PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI

361 PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI 361 PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI

421 PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI 421 PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI

481 PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI 481 PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI

541 PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPG 541 PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPGVGI PGVGIPG

que se puede representar de forma abreviada como: which can be represented in abbreviated form as:

MESLLP-VSEFAYGSFVRTVSLPVGADE-[VPGVG)2 VPGEG (VPGVG)2]10-(VGIPG)60 MESLLP-VSEFAYGSFVRTVSLPVGADE- [VPGVG) 2 VPGEG (VPGVG) 2] 10- (VGIPG) 60

Preparación de los conjugados de la invención Preparation of the conjugates of the invention

El experto en la material apreciará que existen distintos métodos para obtener los conjugados de acuerdo a la presente invención, siendo todos ellos aplicables. Por ejemplo, los conjugados de acuerdo a la invención se pueden obtener mediante síntesis química (véase L Andersson et. al., Biopolymers 55(3), 227-50 (2000)), mediante técnicas de ADN recombinante (J. Cappello, Genetically Engineered Protein Polymers, Handbook of Biodegradable Polymers, Domb, A. J.; Kost, J.; Wiseman, D. (Eds.), Harvard Academic Publishers, Amsterdam; pages 387-414) y mediante síntesis mediada por enzimas (for example, C. H. Wong and K. T. Wang, New Developments in Enzymatic Peptide Synthesis, Experientia 47(11-12), 1123-9 (1991)). Por ejemplo, los conjugados de acuerdo a la invención se pueden obtener usando los métodos descritos en US5243038 y US6355776, cuyos contenidos se incorporan por referencia en el presente documento. Alternativamente, los conjugados de la invención se pueden obtener usando una sintasa de péptidos no ribosomal tal y como ha sido descrito por H. V. Dohren, et al. (Chem.Rev., 1997, 97: 2675-2705). The person skilled in the art will appreciate that there are different methods for obtaining the conjugates according to the present invention, all of which are applicable. For example, the conjugates according to the invention can be obtained by chemical synthesis (see L Andersson et. Al., Biopolymers 55 (3), 227-50 (2000)), by recombinant DNA techniques (J. Cappello, Genetically Engineered Protein Polymers, Handbook of Biodegradable Polymers, Domb, AJ; Kost, J .; Wiseman, D. (Eds.), Harvard Academic Publishers, Amsterdam; pages 387-414) and by enzyme-mediated synthesis (for example, CH Wong and KT Wang, New Developments in Enzymatic Peptide Synthesis, Experientia 47 (11-12), 1123-9 (1991)). For example, the conjugates according to the invention can be obtained using the methods described in US5243038 and US6355776, the contents of which are incorporated by reference herein. Alternatively, the conjugates of the invention can be obtained using a non-ribosomal peptide synthase as described by H. V. Dohren, et al. (Chem.Rev., 1997, 97: 2675-2705).

En una forma preferida de realización, los ELPs de acuerdo a la presente invención se obtienen mediante técnicas de ADN recombinante usando una célula hospedadora adecuada transformada con un ácido nucleico que codifica el polímero de acuerdo a la invención. La generación de los ELP mediante técnicas de ADN recombinante tiene distintas ventajas con respecto a la síntesis química. En primer lugar, la síntesis mediante expresión recombinante permite obtener polímeros de longitud exacta mientras que la In a preferred embodiment, the ELPs according to the present invention are obtained by recombinant DNA techniques using a suitable host cell transformed with a nucleic acid encoding the polymer according to the invention. The generation of ELPs by recombinant DNA techniques has different advantages over chemical synthesis. First, synthesis by recombinant expression allows polymers of exact length to be obtained while the

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síntesis química da lugar habitualmente a una distribución de polímeros de distinta longitud. En segundo lugar, la síntesis mediante expresión recombinante permite seleccionar de forma muy precisa el punto de inserción de la molécula antigénica. En tercer lugar, el polímero puede ensamblarse de forma espontanea en complejos proteicos en la propia célula en la que se sintetiza. Por último, los polímeros comprenden aminoácidos presentes en el organismo, dando lugar a polímeros biodegradables, biocompatibles y tolerados por el sistema inmune. Chemical synthesis usually results in a distribution of polymers of different lengths. Secondly, the synthesis by recombinant expression allows to select very precisely the insertion point of the antigenic molecule. Thirdly, the polymer can be spontaneously assembled into protein complexes in the cell in which it is synthesized. Finally, polymers comprise amino acids present in the body, giving rise to biodegradable, biocompatible and tolerated polymers by the immune system.

Cuando los conjugados de la invención se obtienen a partir de una célula hospedadora adecuada transformada con un ácido nucleico que codifica el polímero de acuerdo a la invención, es necesario purificar dicho conjugado del resto de conjugados que aparecen en el sistema de expresión seleccionado. When the conjugates of the invention are obtained from a suitable host cell transformed with a nucleic acid encoding the polymer according to the invention, it is necessary to purify said conjugate from the rest of conjugates that appear in the selected expression system.

Sistemas adecuados para la purificación de un polipéptido obtenido de forma recombinante a partir de un hospedador de elección incluyen, sin limitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión molecular, purificación por solubilidad diferencial o cualquier otro método estándar para la purificación de proteínas. En el caso particular de que la purificación del polipéptido se lleve a cabo mediante cromatografía de afinidad, la invención contempla el que el polipéptido de la invención contenga una región adicional que pueda ayudar a su purificación del medio de cultivo o del extracto celular. Para ello, el polipéptido puede estar modificado mediante la introducción de una cualquier péptido o secuencia peptídica que permita el reconocimiento del péptido o proteína de fusión por un anticuerpo. Ejemplos de dichas secuencias son, por ejemplo, péptidos etiqueta tales como c-myc, HA, E, FLAG y, en general, cualquier otra secuencia reconocida por un anticuerpo. Alternativamente, el conjugado de la invención puede estar modificado por una secuencia de polihistidina, lo que permite la purificación de dicho conjugado modificado mediante el uso de matrices en las que se ha inmovilizado un metal que es capaz de unirse de forma específica al resto de polihistidinas. Suitable systems for purification of a recombinantly obtained polypeptide from a host of choice include, without limitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, molecular exclusion chromatography, differential solubility purification or any other standard method for purification of proteins In the particular case that the purification of the polypeptide is carried out by affinity chromatography, the invention contemplates that the polypeptide of the invention contains an additional region that can aid in its purification of the culture medium or cell extract. For this, the polypeptide may be modified by the introduction of any any peptide or peptide sequence that allows recognition of the peptide or fusion protein by an antibody. Examples of such sequences are, for example, tag peptides such as c-myc, HA, E, FLAG and, in general, any other sequence recognized by an antibody. Alternatively, the conjugate of the invention may be modified by a polyhistidine sequence, which allows the purification of said modified conjugate through the use of matrices in which a metal has been immobilized that is capable of specifically binding to the rest of polyhistidines. .

Los conjugados de la invención de sufrir una transición reversible en función de la temperatura y/o del pH del medio desde un estado en el que forman cadenas elongadas muy solubles a agregados con distinta estructura y grado de solubilidad. Esta propiedad de los conjugados de la invención puede ser aplicada para la separación de dichos conjugados de otros compuestos presentes en la muestra mediante la realización de uno o varios ciclos de transición térmica o de cambios del pH térmica con la consiguiente formación de nanopartículas que pueden ser separadas del resto de componentes mediante centrifugación diferencial seguido de un nuevo cambio de temperatura o pH por debajo del valor de transición de forma que se obtengan de nuevo los polipéptidos en forma de estructuras elongadas. Por tanto, en una forma preferida de realización, el polipéptido de la invención se obtiene en forma purificada mediante la aplicación de sucesivos ciclos de transición mediados por cambios en las características fisicoquímicas del medio. The conjugates of the invention undergo a reversible transition depending on the temperature and / or pH of the medium from a state in which they form very soluble elongated chains to aggregates with different structure and degree of solubility. This property of the conjugates of the invention can be applied for the separation of said conjugates from other compounds present in the sample by performing one or several cycles of thermal transition or changes in thermal pH with the consequent formation of nanoparticles that can be separated from the other components by differential centrifugation followed by a new change in temperature or pH below the transition value so that the polypeptides are obtained again in the form of elongated structures. Therefore, in a preferred embodiment, the polypeptide of the invention is obtained in purified form by the application of successive transition cycles mediated by changes in the physicochemical characteristics of the medium.

Así, dependiendo de la presencia en el ELP de bloques sensibles a temperatura o sensibles a pH, y de las condiciones de pH y temperatura, los ELPs sufren una transición reversible desde un estado en el que forman cadenas elongadas muy solubles a agregados con distinta estructura y grado de solubilidad. En el caso de los ELPs de acuerdo a la presente invención, los bloques formados por el componente (i) de secuencia general [(X1PGX1G)2 X1PGX2G(X1PGX1G)2]n en donde X1 es un aminoácido de cadena lateral hidrofóbica, X2 es un aminoácido de cadena lateral hidrofílica y n es de 5 a 10 son sensibles a cambios de pH, mientras que los bloques de secuencia (X3X4IX5G)m en donde X3 es un aminoácido de cadena lateral hidrofóbica, X4 y X5 son G o P y m es entre 10 y 100 son sensibles a cambios de temperatura. Thus, depending on the presence in the ELP of temperature-sensitive or pH-sensitive blocks, and the conditions of pH and temperature, the ELPs undergo a reversible transition from a state in which they form very soluble elongated chains to aggregates with different structure and degree of solubility. In the case of ELPs according to the present invention, the blocks formed by the general sequence component (i) [(X1PGX1G) 2 X1PGX2G (X1PGX1G) 2] n where X1 is a hydrophobic side chain amino acid, X2 is a hydrophilic side chain amino acid and n is 5 to 10 are sensitive to pH changes, while the sequence blocks (X3X4IX5G) m where X3 is a hydrophobic side chain amino acid, X4 and X5 are G or P and m is between 10 and 100 are sensitive to temperature changes.

Así, un ELP se puede definir por la temperatura media a la que tiene lugar la transición de fase. Así, los ELPs de la invención tienen una temperatura mediana de transición de fase de en torno a 5ºC, en torno a 10ºC, en torno a 15ºC, en torno a 20ºC, en torno a 25ºC, en torno a 30ºC, en torno a 35ºC, en torno a 37ºC, de en torno a 38ºC, de en torno a 39ºC, de en torno a 40ºC, de en torno a 41ºC, de en torno a 42ºC, de en torno a 43ºC, de en torno a 44ºC, de en torno a 45ºC, de en torno a 46ºC o más. Alternativamente, los ELPs de acuerdo a la invención se definen en base al rango de temperatura en el que se produce la transición de fases. Por ejemplo, la transición puede ocurrir en un rango de 5ºC, de 4ºC, de 3ºC, de 2ºC, de 1ºC o de menos. Thus, an ELP can be defined by the average temperature at which the phase transition takes place. Thus, the ELPs of the invention have a median phase transition temperature of around 5 ° C, around 10 ° C, around 15 ° C, around 20 ° C, around 25 ° C, around 30 ° C, around 35 ° C , around 37ºC, around 38ºC, around 39ºC, around 40ºC, around 41ºC, around 42ºC, around 43ºC, around 43ºC, around 44ºC, in around 45 ° C, around 46 ° C or more. Alternatively, the ELPs according to the invention are defined based on the temperature range in which the phase transition occurs. For example, the transition may occur in a range of 5 ° C, 4 ° C, 3 ° C, 2 ° C, 1 ° C or less.

Se entenderá que la temperatura de transición de un ELP se puede modificar a voluntad variando el número de repeticiones de bloques hidrofóbicos e hidrofílicos. Típicamente, es posible aumentar la temperatura de transición disminuyendo el número de bloques hidrofóbicos. It will be understood that the transition temperature of an ELP can be modified at will by varying the number of repetitions of hydrophobic and hydrophilic blocks. Typically, it is possible to increase the transition temperature by decreasing the number of hydrophobic blocks.

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Nanopartículas de la invención Nanoparticles of the invention

Los conjugados de la invención se caracterizan por sufrir un cambio conformacional en función de la temperatura y en función del pH pasando de formar cadenas elongadas de alta solubilidad a agregados con distinta estructura y grado de solubilidad. Los ELPs de acuerdo a la presente invención sufren una transición danto lugar a nanopartículas de hasta 200 nm de diámetro con una baja polidispersidad y a partir de concentraciones de μM (0.02%) en cuestión de segundos y en condiciones fisiológicas. The conjugates of the invention are characterized by undergoing a conformational change as a function of temperature and as a function of pH, from forming elongated chains of high solubility to aggregates with different structure and degree of solubility. The ELPs according to the present invention undergo a transition to nanoparticles of up to 200 nm in diameter with low polydispersity and from concentrations of μM (0.02%) in a matter of seconds and under physiological conditions.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una nanopartícula que comprende dos o más conjugados de la invención. Therefore, in another aspect, the invention relates to a nanoparticle comprising two or more conjugates of the invention.

En una realización particular la nanopartícula de la invención comprende al menos 100 conjugados de la invención, preferiblemente al menos 150 conjugados de la invención, más preferiblemente al menos 200 conjugados de la invención, más preferiblemente al menos 250 conjugados de la invención. En otra realización particular adicional la nanopartícula de la invención comprende entre 200 y 240 conjugados de la invención. En otra realización particular adicional la nanopartícula de la invención comprende entre 250 y 290 conjugados de la invención. In a particular embodiment the nanoparticle of the invention comprises at least 100 conjugates of the invention, preferably at least 150 conjugates of the invention, more preferably at least 200 conjugates of the invention, more preferably at least 250 conjugates of the invention. In another additional particular embodiment the nanoparticle of the invention comprises between 200 and 240 conjugates of the invention. In another additional particular embodiment the nanoparticle of the invention comprises between 250 and 290 conjugates of the invention.

El término “nanopartícula”, según se usa en la presente invención, se entiende como una partícula microscópica cuyo tamaño es menor de en torno a 1000 nm, preferiblemente de 1 a 100 nm. El tamaño de la nanopartícula puede oscilar de acuerdo a distintas formas de realización de la invención, entre 1 y 200 nm, entre 1 y 150 nm, entre 1 y 100 nm, entre 1 y 10 nm. The term "nanoparticle", as used in the present invention, is understood as a microscopic particle whose size is smaller than about 1000 nm, preferably 1 to 100 nm. The nanoparticle size may vary according to different embodiments of the invention, between 1 and 200 nm, between 1 and 150 nm, between 1 and 100 nm, between 1 and 10 nm.

El término “polidispersidad” o “índice de polidispersidad”, según se usa en la presente invención para referirse a los polímeros, es un parámetro que indica el grado de variación o amplitud de una campana gausiana que representa los pesos moleculares de un polímero. Se determina por la división del peso molecular promedio en masa y el peso molecular promedio en número (Mw/Mn). En una forma preferida de realización, los complejos de la invención tienen una polidispersidad de en torno a 1. En otra forma preferida de la invención los complejos de la invención tienen una polidispersidad menor o igual de 0,1. The term "polydispersity" or "polydispersity index", as used in the present invention to refer to polymers, is a parameter that indicates the degree of variation or amplitude of a Gaussian bell representing the molecular weights of a polymer. It is determined by the division of the mass average molecular weight and the number average molecular weight (Mw / Mn). In a preferred embodiment, the complexes of the invention have a polydispersity of about 1. In another preferred form of the invention the complexes of the invention have a polydispersity of less than or equal to 0.1.

Las condiciones de temperatura necesarias para que se formen las nanopatículas dependen del número de repeticiones de bloques hidrofóbicos e hidrofílicos. En una forma preferida de realización, las nanopartículas de la invención se obtienen de forma espontanea en condiciones fisiológicas. La expresión “condiciones fisiológicas”, según se usa en la presente invención, indica condiciones de temperatura, tonicidad y pH que aparecen de forma típica en el interior de una célula viva. Condiciones adecuadas para la formación de las nanopartículas de la invención incluyen un pH de en torno a 7,5, una temperatura de en torno a 37ºC y una tonicidad de en torno 290 miliosmoles (mOsm)/kg. The temperature conditions necessary for the nanopaticles to form depend on the number of repetitions of hydrophobic and hydrophilic blocks. In a preferred embodiment, the nanoparticles of the invention are obtained spontaneously under physiological conditions. The term "physiological conditions", as used in the present invention, indicates conditions of temperature, tonicity and pH that typically appear inside a living cell. Suitable conditions for the formation of the nanoparticles of the invention include a pH of about 7.5, a temperature of about 37 ° C and a tonicity of about 290 milliosmoles (mOsm) / kg.

Las nanopartículas obtenidas a partir de los conjugados de la invención se pueden caracterizar en cuanto a su temperatura de transición mediante calorimetría diferencial de barrido, en cuanto a su tamaño mediante microscopía electrónica de transmisión a temperatura criogénica (Cryo-TEM), mediante difusión dinámica de luz (DLS) o mediante espectroscopía de correlación de fotones; en cuanto al grado de polidispersidad. The nanoparticles obtained from the conjugates of the invention can be characterized in terms of their transition temperature by differential scanning calorimetry, in terms of their size by cryogenic temperature transmission electron microscopy (Cryo-TEM), by dynamic diffusion of light (DLS) or by photon correlation spectroscopy; as for the degree of polydispersity.

Polinucleótido, vector y célula hospedadora de la invención Polynucleotide, vector and host cell of the invention

En una realización adicional, la invención se relaciona con un polinucleótido que codifica para el polipéptido de la invención (en adelante primer polinucleótido de la invención en el que los componentes del conjugado de la invención forman una única cadena polipeptídica). In a further embodiment, the invention relates to a polynucleotide encoding the polypeptide of the invention (hereinafter the first polynucleotide of the invention in which the components of the conjugate of the invention form a single polypeptide chain).

Por “polinucleótido” según se emplea aquí, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud y formada por ribonucleótidos y/o deoxiribonucleótidos. El término incluye tanto polinucleótidos de cadena sencilla como de cadena doble, así como polinucleótidos modificados (metilados, protegidos y similares). By "polynucleotide" as used herein, it refers to a polymeric form of nucleotides of any length and formed by ribonucleotides and / or deoxyribonucleotides. The term includes both single chain and double chain polynucleotides, as well as modified polynucleotides (methylated, protected and the like).

Preferiblemente, las secuencias de nucleótidos que forman el primer polinucleótido están en el mismo marco de lectura correcto para su expresión. Preferably, the nucleotide sequences that form the first polynucleotide are in the same correct reading frame for expression.

En otra realización adicional, la invención se relaciona con un vector que contiene el polinucleótido de la invención. El experto en la materia apreciará que no existe limitación en cuanto al tipo de vector que puede ser utilizado ya que dicho vector puede ser un vector de clonaje adecuado para la propagación y para obtener los polinucleótidos o construcciones génicas adecuadas o vectores de expresión en distintos organismos heterólogos adecuados para la purificación de los conjugados. Así, vectores adecuados de acuerdo a la presente invención incluyen vectores de expresión en procariotas tales como pUC18, In another additional embodiment, the invention relates to a vector containing the polynucleotide of the invention. The person skilled in the art will appreciate that there is no limitation as to the type of vector that can be used since said vector can be a cloning vector suitable for propagation and to obtain suitable polynucleotides or gene constructs or expression vectors in different organisms. suitable heterologists for the purification of the conjugates. Thus, suitable vectors according to the present invention include prokaryotic expression vectors such as pUC18,

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pUC19, Bluescript y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIEl , pCRl , RP4, fagos y vectores “shuttle” tales como pSA3 and pAT28, vectores de expresión en levaduras tales como vectores del tipo de plásmidos de 2 micras, plásmidos de integración, vectores YEP, plásmidos centroméricos y similares, vectores de expresión en células de insectos tales como los vectores de la serie pAC y de la serie pVL, vectores de expresión en plantas tales como vectores de la serie pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y similares y vectores de expresión en células eucariotas superiores bien basados en vectores virales (adenovirus, virus asociados a los adenovirus así como retrovirus y lentivirus) así como vectores no virales tales como pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL and pKSV-10, pBPV-1, pML2d y pTDTl. pUC19, Bluescript and its derivatives, mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, phage and shuttle vectors such as pSA3 and pAT28, yeast expression vectors such as 2 micron plasmid type vectors, plasmids of integration, YEP vectors, centromeric plasmids and the like, expression vectors in insect cells such as pAC series and pVL series vectors, plant expression vectors such as pIBI series vectors, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA , pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE and the like and expression vectors in upper eukaryotic cells well based on viral vectors (adenoviruses, adenovirus-associated viruses as well as retroviruses and lentiviruses) as well as non-viral vectors such as pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1 / hyg pHCMV / Zeo, pCR3.1, pEFl / His, pIND / GS, pRc / HCMV2, pSV40 / Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6 / V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI , pSVL and pKSV-10, pBPV-1, pML2d and pTDTl.

El vector de la invención puede ser utilizado para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas The vector of the invention can be used to transform, transfect or infect cells capable of being transformed, transfected or infected by said vector. Such cells can be prokaryotes.

o eucariotas. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que (o en los que) se ha integrado. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia (Sambrook et al., 2001, “Molecular cloning, a Laboratory Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Vol 1-3 a). or eukaryotes. By way of example, the vector where said DNA sequence is introduced can be a plasmid or a vector that, when introduced into a host cell, is integrated into the genome of said cell and replicated together with the chromosome (or chromosomes) in which (or in which) it has been integrated. The obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art (Sambrook et al., 2001, "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY Vol 1-3 a ).

Preferiblemente, el vector comprende el polinucleótido de la invención operativamente unido a secuencias reguladoras de la expresión del polinucleótido de la invención. Las secuencias reguladoras de utilidad para la presente invención pueden ser promotores nucleares o, alternativamente, secuencias potenciadoras (“enhancer”) y/o otras secuencias reguladoras que aumentan la expresión de la secuencia heteróloga de ácido nucleico. En principio, cualquier promotor puede ser utilizado en la presente invención siempre que dicho promotor sea compatible con las células en las que se desea expresar el polinucleótido. Así, promotores adecuados para la realización de la presente invención incluyen, sin estar necesariamente limitados, promotores constitutivos tales como los derivados de los genomas de virus eucariotas tales como el virus del polioma, adenovirus, SV40, CMV, virus del sarcoma aviar, virus de la hepatitis B, el promotor del gen de la metalotioneina, el promotor del gen de la timidina kinasa del virus del herpes simplex, regiones LTR de los retrovirus, el promotor del gen de la inmunoglobuina, el promotor del gen de la actina, el promotor del gen EF-1alpha así como promotores inducibles en los que la expresión de la proteína depende de la adición de una molécula o de una señal exógena, tales como el sistema tetraciclina, el sistema NFKB/luz UV, el sistema Cre/Lox y el promotor de los genes de choque térmico, los promotores regulables de la ARN polimerasa II descritos en WO/2006/135436 así como promotores específicos de tejido. Preferably, the vector comprises the polynucleotide of the invention operably linked to sequences regulating the expression of the polynucleotide of the invention. The regulatory sequences useful for the present invention may be nuclear promoters or, alternatively, enhancer sequences and / or other regulatory sequences that increase the expression of the heterologous nucleic acid sequence. In principle, any promoter can be used in the present invention as long as said promoter is compatible with the cells in which it is desired to express the polynucleotide. Thus, suitable promoters for the realization of the present invention include, without necessarily being limited, constitutive promoters such as those derived from eukaryotic virus genomes such as polyomavirus, adenovirus, SV40, CMV, avian sarcoma virus, virus hepatitis B, the metallothionein gene promoter, the herpes simplex virus thymidine kinase gene promoter, retrovirus LTR regions, the immunoglobuin gene promoter, the actin gene promoter, the promoter of the EF-1alpha gene as well as inducible promoters in which protein expression depends on the addition of a molecule or an exogenous signal, such as the tetracycline system, the NFKB / UV light system, the Cre / Lox system and the heat shock gene promoter, the adjustable RNA polymerase II promoters described in WO / 2006/135436 as well as tissue specific promoters.

En otra realización adicional, la invención se relaciona con una célula que contiene el conjugado, la nanopartícula, el polipéptido o el vector de la invención. Dicha célula ha podido ser transformada, transfectada o infectada con una construcción o vector proporcionado por esta invención. Células transformadas, transfectadas o infectadas pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (Sambrok et al., 2001, citado supra). In another additional embodiment, the invention relates to a cell containing the conjugate, the nanoparticle, the polypeptide or the vector of the invention. Said cell has been able to be transformed, transfected or infected with a construct or vector provided by this invention. Transformed, transfected or infected cells can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art (Sambrok et al., 2001, cited supra).

Células adecuadas para llevar a cabo la invención, incluyen, sin limitación, células de mamíferos, plantas, insectos, de hongos y de bacterias. Células bacterianas incluyen, sin estar limitado, células de bacterias Gram positivas tales como especies del género Bacillus, Streptomyces y Staphylococcus y células de bacterias Gram negativas tales como células del género Escherichia y Pseudomonas. Células de hongos incluyen, preferiblemente, células de levaduras tales como Saccharomyces, Pichia pastoris y Hansenula polymorpha. Células de insectos incluyen, sin limitación, células de Drosophila y células Sf9. Células de plantas incluyen, entre otros, células de plantas de cultivos tales como cereales, plantas medicinales, ornamentales o de bulbos. Células de mamíferos adecuadas para en la presente invención incluyen líneas celulares epiteliales (porcinas, etc.), líneas celulares de osteosarcoma (humanas, etc.), líneas celulares de neuroblastoma (humanas, etc.), carcinomas epiteliales (humanos, etc.), células gliales (murinas, etc.), líneas celulares hepáticas (de mono, etc.). células CHO (Chinese Hamster Ovary), células COS, células BHK, células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 o PER.C6, celulas ECCs humana NTERA-2, células D3 de la línea de mESCs, células troncales embrionarias humanas tales como HS293 y BGV01, SHEF1, SHEF2 y HS181, células NIH3T3, 293T, REH y MCF-7 y células hMSCs. Suitable cells for carrying out the invention, include, without limitation, cells of mammals, plants, insects, fungi and bacteria. Bacterial cells include, but are not limited to, Gram positive bacteria cells such as species of the genus Bacillus, Streptomyces and Staphylococcus and Gram negative bacteria cells such as cells of the genus Escherichia and Pseudomonas. Fungal cells preferably include yeast cells such as Saccharomyces, Pichia pastoris and Hansenula polymorpha. Insect cells include, without limitation, Drosophila cells and Sf9 cells. Plant cells include, among others, crop plant cells such as cereals, medicinal, ornamental or bulb plants. Mammalian cells suitable for the present invention include epithelial cell lines (pigs, etc.), osteosarcoma cell lines (human, etc.), neuroblastoma cell lines (human, etc.), epithelial carcinomas (human, etc.). , glial cells (murine, etc.), liver cell lines (mono, etc.). CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, COS cells, BHK cells, HeLa cells, 911, AT1080, A549, 293 or PER.C6, human ECCs NTERA-2 cells, D3 cells of the mESCs line, human embryonic stem cells such as HS293 and BGV01, SHEF1, SHEF2 and HS181, NIH3T3, 293T, REH and MCF-7 cells and hMSCs cells.

Usos médicos del conjugado, nanopartícula, polinucleótido, vector y célula de la invención Medical uses of the conjugate, nanoparticle, polynucleotide, vector and cell of the invention

En otra realización adicional, la invención se relaciona con el conjugado, la nanopartícula, el polinucleótido, el vector o la célula de la invención para su uso como medicamento. In another additional embodiment, the invention relates to the conjugate, the nanoparticle, the polynucleotide, the vector or the cell of the invention for use as a medicament.

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Para uso como medicamento, la composición farmacéutica de la invención comprende el conjugado o nanopartícula de la invención bien de forma aislada o bien en combinación con agentes activos adicionales. El conjugado o nanopartícula de la invención puede ser formulado conjuntamente con un excipiente que sea aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Excipientes preferidos para su uso en la presente invención incluyen azúcares, almidones, celulosas, gomas y proteínas. En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se formulará en una forma farmacéutica de administración sólida (por ejemplo comprimidos, cápsulas, grageas, gránulos, supositorios, sólidos estériles cristalinos o amorfos que pueden reconstituirse para proporcionar formas líquidas etc.), líquida (por ejemplo soluciones, suspensiones, emulsiones, elixires, lociones, ungüentos etc.) o semisólida (geles, pomadas, cremas y similares). Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas por cualquier ruta, incluyendo, sin ser limitante, oral, intravenosa, intramuscular, intrarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutanea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual o rectal. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993 y en Remington´s Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 20ª edición, Williams & Wilkins PA, USA (2000). Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son conocidos en el estado de la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones aceite/agua, diferentes tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos se pueden formular por procedimientos convencionales conocidos en el estado de la técnica. For use as a medicament, the pharmaceutical composition of the invention comprises the conjugate or nanoparticle of the invention either in isolation or in combination with additional active agents. The conjugate or nanoparticle of the invention can be formulated together with an excipient that is pharmaceutically acceptable. Preferred excipients for use in the present invention include sugars, starches, celluloses, gums and proteins. In a particular embodiment, the pharmaceutical composition of the invention will be formulated in a solid dosage pharmaceutical form (for example tablets, capsules, dragees, granules, suppositories, sterile crystalline or amorphous solids that can be reconstituted to provide liquid forms etc.), liquid (for example solutions, suspensions, emulsions, elixirs, lotions, ointments etc.) or semi-solid (gels, ointments, creams and the like). The pharmaceutical compositions of the invention can be administered by any route, including, without limitation, oral, intravenous, intramuscular, intrarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteric, topical, sublingual or rectal. A review of the various forms of administration of active ingredients, of the excipients to be used and their manufacturing procedures can be found in the Treaty of Farmacia Galenica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. of Editions, 1993 and in Remington´s Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 20th edition, Williams & Wilkins PA, USA (2000). Examples of pharmaceutically acceptable carriers are known in the state of the art and include phosphate buffered saline solutions, water, emulsions, such as oil / water emulsions, different types of wetting agents, sterile solutions, etc. Compositions comprising said vehicles can be formulated by conventional procedures known in the state of the art.

En otro aspecto adicional, la presente invención se relaciona con el conjugado, la nanopartícula, el polinucleótido, el vector o la célula de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad para estimular y/o inducir la respuesta inmune de un individuo frente a la molécula antigénica. In a further aspect, the present invention relates to the conjugate, nanoparticle, polynucleotide, vector or cell of the invention for use in the treatment or prevention of a disease to stimulate and / or induce the immune response of a individual versus the antigenic molecule.

Por “estimular o inducir la respuesta inmune” se refiere a producir un incremento de la respuesta humoral (desarrollo de inmunoglobulinas frente a un antígeno) o celular (mediada por linfocitos T). By "stimulating or inducing the immune response" refers to producing an increase in humoral response (development of immunoglobulins against an antigen) or cellular (mediated by T lymphocytes).

Métodos para determinar si un conjugado o nanopartícula es capaz de estimular o inducir la respuesta inmune, se incluyen entre otros la determinación de anticuerpos específicos frente a dicho/s conjugado o nanopartícula, así como la liberación de citoquinas en respuesta al antígeno. Methods to determine if a conjugate or nanoparticle is capable of stimulating or inducing the immune response, including among others the determination of specific antibodies against said conjugate / nanoparticle, as well as the release of cytokines in response to the antigen.

Para identificar los anticuerpos con la especificidad deseada pueden usarse ensayos inmunoquímicos, tales como ensayos de inmunofluorescencia, citometría de flujo, inmunotransferencias Western, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos, inmunoprecipitaciones u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en la materia. To identify antibodies with the desired specificity, immunochemical assays such as immunofluorescence assays, flow cytometry, Western blots, ELISA, radioimmunoassays, immunohistochemical assays, immunoprecipitations or other immunochemical assays known in the art can be used.

Entre las citoquinas que pueden analizarse para determinar la estimulación de la respuesta inmune destacan entre otras IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, TGF beta, IFN gamma, TNF-alpha. La cuantificación de los niveles de citoquinas puede llevarse a cabo por ELISA. Among the cytokines that can be analyzed to determine the stimulation of the immune response stand out among others IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL -13, IL-15, IL-18, TGF beta, IFN gamma, TNF-alpha. The quantification of cytokine levels can be carried out by ELISA.

Enfermedades causadas por infecciones virales que pueden ser tratadas con el polipéptido o nanopartícula de la invención incluyen, sin limitación, enfermedades causadas por infecciones por el virus VIH-1 (SIDA), por el herpesvirus humano tales como el virus del herpes simple (herpes simple, herpes genital), citomegalovirus (mononucleosis, retitinis, hepatitis), el virus de Epstein Barr (mononucleosis infecciosa, el linfoma de Burkitt y el carcinoma nasofaríngeo) y el virus de la varicela zóster (varicela, herpes zóster); por los virus de la hepatitis tales como virus de la hepatitis B o virus de la hepatitis C, por paramixovirus tales como virus respiratorio sincitial, virus parainfluenza virus de la rubeola, virus del sarampión, virus de las paperas, virus del papiloma humano; flavivirus tales como el virus de la fiebre amarilla, el virus del dengue, el virus de la encefalitis transmitido por garrapatas o el virus de la encefalitis japonesa) y rotavirus. Otro tipo de infecciones virales que pueden ser tratadas con los polipéptidos y complejos proteicos de la presente invención se describen en detalle en Fundamental Virology, segunda edición, eds. Fields, B. N. y Knipe, D. M. (Raven Press, Nueva York, 1991). Diseases caused by viral infections that can be treated with the polypeptide or nanoparticle of the invention include, without limitation, diseases caused by HIV-1 virus infections (AIDS), by human herpesviruses such as herpes simplex virus (herpes simplex). , genital herpes), cytomegalovirus (mononucleosis, retinitis, hepatitis), Epstein Barr virus (infectious mononucleosis, Burkitt lymphoma and nasopharyngeal carcinoma) and varicella zoster virus (chickenpox, shingles); for hepatitis viruses such as hepatitis B virus or hepatitis C virus, for paramyxovirus such as respiratory syncytial virus, parainfluenza virus, rubella virus, measles virus, mumps virus, human papillomavirus; flaviviruses such as yellow fever virus, dengue virus, tick-borne encephalitis virus or Japanese encephalitis virus) and rotavirus. Other types of viral infections that can be treated with the polypeptides and protein complexes of the present invention are described in detail in Fundamental Virology, second edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991).

Enfermedades causadas por infecciones bacterianas que pueden ser tratadas con los compuestos de la invención incluyen, sin limitación, enfermedades causadas por microorganismos del género Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Listeria, Aerobacter, Helicobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus, Chlamydia, Mycoplasma, Pneumococcus, Neisseria, Clostridium, Bacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Campylobacter, Vibrio, Serratia, Providencia, Chromobacterium, Brucella, Yersinia, Haemophilus o Bordetella. Diseases caused by bacterial infections that can be treated with the compounds of the invention include, without limitation, diseases caused by microorganisms of the genus Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Listeria, Aerobacter, Helicobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus, Chlamydia, Mycoplasma, Pneumococcus, Neisseria, Clostridium, Bacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Campylobacter, Vibrio, Serratia, Providence, Chromobacterium, Brucella, Yersinia, Haemophilus or Bordetella.

Enfermedades causadas por infecciones fúngicas que pueden ser tratadas con los polipéptidos y complejos proteicos de la invención incluyen, sin limitación, candidiasis, aspergilosis, histoplasmosis, meningitis criptocócica y similares. Diseases caused by fungal infections that can be treated with the polypeptides and protein complexes of the invention include, without limitation, candidiasis, aspergillosis, histoplasmosis, cryptococcal meningitis and the like.

ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al

Infestaciones parasitaras que pueden ser tratadas con los compuestos y combinaciones de la invención incluyen, sin limitación, paludismo, infección por Pneumocystis jiroveci, neumonía, enfermedad del sueño, leishmaniosis, criptosporidiosis, toxoplasmosis y tripanosoma. Parasitic infestations that can be treated with the compounds and combinations of the invention include, without limitation, malaria, Pneumocystis jiroveci infection, pneumonia, sleep sickness, leishmaniosis, cryptosporidiosis, toxoplasmosis and trypanosome.

Trastornos de tipo alérgico que pueden ser tratados con los compuestos y composiciones de la invención incluyen, sin limitación, alergias causadas por exposición al polen (alérgenos del polen de árboles, hierba, maleza y césped), alergias causadas por exposición a alérgenos de insectos (alérgenos inhalables, de la saliva y del veneno), a alérgenos de la caspa y del pelo de animales y a alérgenos de la comida. Allergic type disorders that can be treated with the compounds and compositions of the invention include, without limitation, allergies caused by pollen exposure (tree, grass, weed and grass pollen allergens), allergies caused by exposure to insect allergens ( inhalable, saliva and venom allergens), allergens from animal dander and hair and food allergens.

En una realización particular, la invención se refiere al uso del conjugado, de la nanopartícula, del polinucleótido, del vector o de la célula de la invención para estimular y/o inducir una respuesta inmune frente a tuberculosis. In a particular embodiment, the invention relates to the use of the conjugate, nanoparticle, polynucleotide, vector or cell of the invention to stimulate and / or induce an immune response against tuberculosis.

En otra realización adicional, la invención se relaciona con el uso del conjugado, de la nanopartícula, del polinucleótido, del vector o de la célula de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad para estimular y/o inducir la respuesta inmune de un individuo frente a la molécula antigénica. In another additional embodiment, the invention relates to the use of the conjugate, nanoparticle, polynucleotide, vector or cell of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of a disease to stimulate and / or induce an individual's immune response against the antigenic molecule.

En una realización particular, la invención se refiere al uso del polipéptido, de la nanopartícula, del vector In a particular embodiment, the invention relates to the use of the polypeptide, of the nanoparticle, of the vector

o de la célula de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de tuberculosis. or of the cell of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of tuberculosis.

En una realización particular, el conjugado, la nanopartícula, el polinucleótido, el vector o la célula de la invención es administrada por vía mucosa o tópica. In a particular embodiment, the conjugate, the nanoparticle, the polynucleotide, the vector or the cell of the invention is administered mucosally or topically.

CONSTRUCCIONES Y VECTORES DE USO GENERAL DE LA INVENCIÓN CONSTRUCTIONS AND VECTOR OF GENERAL USE OF THE INVENTION

El experto en la materia apreciará que los polímeros similares a elastina de acuerdo a la presente invención pueden fusionarse a cualquier polipéptido frente al que se desee generar una respuesta inmune en un sujeto. Para ello, es conveniente disponer de polinucléotidos que comprenden la secuencia codificante de dicho polímeros similares a elastina. Estos polinucleótidos pueden ser modificados a voluntad mediante la inserción de polinucleótidos que codifican en polipéptido antigénico. The person skilled in the art will appreciate that elastin-like polymers according to the present invention can be fused to any polypeptide against which it is desired to generate an immune response in a subject. For this, it is convenient to have polynucleotides comprising the coding sequence of said elastin-like polymers. These polynucleotides can be modified at will by inserting polynucleotides encoding antigenic polypeptide.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido (en adelante segundo polinucleótido de la invención) adecuado para la expresión de una proteína de fusión formada por un polipéptido similar a elastina y un polipéptido antigénico de interés que comprende una secuencia que codifica dicho polipéptido similar a elastina en donde dicho polipéptido similar a elastina comprende: Thus, in another aspect, the invention relates to a polynucleotide (hereinafter second polynucleotide of the invention) suitable for the expression of a fusion protein formed by an elastin-like polypeptide and an antigenic polypeptide of interest comprising a sequence encoding said elastin-like polypeptide wherein said elastin-like polypeptide comprises:

(i) (i)

una región hidrofílica de secuencia [(X1PGX1G)2 X1PGX2G(X1PGX1G)2]n en donde X1 es un aminoácido de cadena lateral hidrofóbica, X2 es un aminoácido de cadena lateral hidrofílica, y n es un número entero entre 5 y 10 y a hydrophilic region of sequence [(X1PGX1G) 2 X1PGX2G (X1PGX1G) 2] n where X1 is a hydrophobic side chain amino acid, X2 is a hydrophilic side chain amino acid, and n is an integer between 5 and 10 and

(ii) (ii)

una región hidrofóbica de secuencia (X3X4IX5G)m en donde X3 es un aminoácido de cadena lateral hidrofóbica, X4, X5 son G o P y m es entre 10 y 100. a hydrophobic sequence region (X3X4IX5G) m where X3 is a hydrophobic side chain amino acid, X4, X5 are G or P and m is between 10 and 100.

Los términos “polinucleótido”, “polipéptido antigénico”, “región hidrofílica”, “aminoácido de cadena lateral hidrofóbica”, “aminoácido de cadena lateral hidrofílica” han sido explicados en detalle con anterioridad. En formas preferidas de realización, n es 10, en donde X1 es V y/o en donde X2 es E. En una forma de realización aún más preferida, la región hidrofílica tiene la secuencia [(VPGVG)2VPGEG(VPGVG)]10. En otras formas preferidas de realización, m es 60, en donde X3 es V, en donde X4 es G y/o en donde X5 es The terms "polynucleotide", "antigenic polypeptide", "hydrophilic region", "hydrophobic side chain amino acid", "hydrophilic side chain amino acid" have been explained in detail previously. In preferred embodiments, n is 10, where X1 is V and / or where X2 is E. In an even more preferred embodiment, the hydrophilic region has the sequence [(VPGVG) 2VPGEG (VPGVG)] 10. In other preferred embodiments, m is 60, where X3 is V, where X4 is G and / or where X5 is

P. En una forma preferida de realización, la región hidrofóbica tiene la secuencia (VGIPG)60. Q. In a preferred embodiment, the hydrophobic region has the sequence (VGIPG) 60.

En una forma preferida de realización, el segundo polinucleótido de la invención comprende adicionalmente una secuencia iniciadora de la traducción. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia iniciadora de la traducción codifica un péptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO:3. In a preferred embodiment, the second polynucleotide of the invention further comprises a translation initiator sequence. In an even more preferred embodiment, the translation initiator sequence encodes a peptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 3.

El segundo polinucleótido de la invención puede comprender, preferiblemente, uno o varios sitios que permitan insertar un polinucleótido de interés en dicho polinucleótido de forma que la expresión de dicho polinucleótido de lugar a una proteína de fusión formada por el polipéptido similar a elastina y el polipéptido codificado por el polinucleótido de interés. Preferiblemente, los sitios de clonaje se encuentran agrupados formando un sitio de clonaje múltiple tal y como aparece frecuentemente en vectores de clonaje. Así, el término “sitio de clonaje múltiple”, tal y como se usa en la presente invención, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una serie de dos o más secuencias diana para endonucleasas de restricción próximas entre sí. Sitios de clonaje múltiple incluyen dianas para endonucleasas de restricción que permite la inserción de fragmentos que muestran extremos romos, The second polynucleotide of the invention may preferably comprise one or more sites that allow inserting a polynucleotide of interest into said polynucleotide so that the expression of said polynucleotide results in a fusion protein formed by the elastin-like polypeptide and the polypeptide encoded by the polynucleotide of interest. Preferably, the cloning sites are grouped together forming a multiple cloning site as it frequently appears in cloning vectors. Thus, the term "multiple cloning site", as used in the present invention, refers to a nucleic acid sequence comprising a series of two or more target sequences for restriction endonucleases close to each other. Multiple cloning sites include targets for restriction endonucleases that allow the insertion of fragments that show blunt ends,

ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al

extremos 5’ protuberantes o extremos 3’ protuberantes. La inserción de polinucleótidos de interés se lleva a cabo usando métodos estándar de biología molecular tal y como se describen, por ejemplo, por Sambrook et al (supra.) 5 ’protruding ends or 3’ protruding ends. The insertion of polynucleotides of interest is carried out using standard molecular biology methods as described, for example, by Sambrook et al (supra.)

El segundo polinucleótido de la invención puede aportarse de forma aislada o, preferiblemente, puede aportarse formando parte de un vector para facilitar su propagación y manipulación. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo a la invención. The second polynucleotide of the invention may be provided in isolation or, preferably, may be provided as part of a vector to facilitate its propagation and manipulation. Therefore, in another aspect, the invention relates to an expression vector comprising a polynucleotide according to the invention.

La invención se ilustra a continuación en base a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención. The invention is illustrated below based on the following examples that are provided by way of illustration and not limiting the scope of the invention.

EJEMPLO 1 EXAMPLE 1

Producción de polímeros ELPs ELP Polymer Production

En la presente invención, se empleó un péptido de 20 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de la proteína de 16 kDa Hsp 16.3 de Mycobacterium tuberculosis, como un antígeno inmunodominante para el desarrollo de vacunas subunitarias basadas en secuencias similares a elastina. In the present invention, a 20 amino acid peptide (SEQ ID NO: 5) of the 16 kDa Hsp 16.3 protein of Mycobacterium tuberculosis was used as an immunodominant antigen for the development of subunit vaccines based on elastin-like sequences.

La proteína Hsp 16.3 de 144 aminoácidos (SEQ ID NO:4) es el mayor constituyente de la membrana de Hsp 16.3 protein of 144 amino acids (SEQ ID NO: 4) is the largest constituent of the membrane of

M. tuberculosis. Puede inducir in vivo respuestas proliferativas de células T así como reacciones retardadas de hipersensibilidad en ratones y cobayas. El estudio de las respuestas de las células T con células de nódulos linfáticos murinas sugieren que el péptido 91-110 SEQ ID NO: 5, que también es estimulatorio para las células humanas de sangre periférica en pacientes sanos sensibilizados con derivados de la proteína purificada (Bosze S. et al. Biopolymers (Peptide Science), 76 (2004) 467–476), contiene un epítopo de células T. M. tuberculosis. It can induce in vivo proliferative responses of T cells as well as delayed hypersensitivity reactions in mice and guinea pigs. The study of T-cell responses with murine lymph node cells suggests that peptide 91-110 SEQ ID NO: 5, which is also stimulatory for human peripheral blood cells in healthy patients sensitized with purified protein derivatives ( Bosze S. et al. Biopolymers (Peptide Science), 76 (2004) 467-476), contains a T-cell epitope.

En la presente invención se ha desarrollado un sistema para desencadenar una respuesta inmune generando una única construcción, evitando los métodos de conjugación convencionales en un método de fabricación fácil, estandarizable y escalable con características consistentes de estabilidad, monodispersidad y económico. In the present invention, a system has been developed to trigger an immune response generating a single construction, avoiding conventional conjugation methods in an easy, standardizable and scalable manufacturing method with consistent stability, monodispersity and economic characteristics.

Las construcciones E50I60 (SEQ ID NO: 6), Ag E50I60 (SEQ ID NO: 7) y Ag E50A60 (SEQ ID NO: 8) se prepararon con la tecnología de ADN recombinante. Constructions E50I60 (SEQ ID NO: 6), Ag E50I60 (SEQ ID NO: 7) and Ag E50A60 (SEQ ID NO: 8) were prepared with recombinant DNA technology.

Las construcciones E50I60 y Ag E50I60 comprendían el bloque hidrofílico [(VPGVG)2 VPGEG(VPGVG)2]10 con secuencia (SEQ ID NO: 9) y el bloque hidrofóbico (VGIPG)60 con secuencia (SEQ ID NO:10). La construcción Ag E50A60 comprendía el bloque hidrofílico [(VPGVG)2 VPGEG (VPGVG)2]10 con secuencia (SEQ ID NO: 9) y el bloque hidrofóbico (VPAVG)60 con secuencia (SEQ ID NO:11) The E50I60 and Ag E50I60 constructs comprised the hydrophilic block [(VPGVG) 2 VPGEG (VPGVG) 2] 10 with sequence (SEQ ID NO: 9) and the hydrophobic block (VGIPG) 60 with sequence (SEQ ID NO: 10). The Ag E50A60 construct comprised the hydrophilic block [(VPGVG) 2 VPGEG (VPGVG) 2] 10 with sequence (SEQ ID NO: 9) and the hydrophobic block (VPAVG) 60 with sequence (SEQ ID NO: 11)

Dichas construcciones se transformaron y expresaron en E coli obteniendo las proteínas E50I60 (SEQ ID NO: 12), Ag E50I60 (SEQ ID NO: 13) y Ag E50A60 (SEQ ID NO:14). These constructs were transformed and expressed in E coli obtaining the proteins E50I60 (SEQ ID NO: 12), Ag E50I60 (SEQ ID NO: 13) and Ag E50A60 (SEQ ID NO: 14).

EJEMPLO 2 EXAMPLE 2

Purificación y caracterización de los polímeros ELPs y de sus partículas resultantes Purification and characterization of ELP polymers and their resulting particles

La producción de ELPs en E. coli como sistema de expresión implica que la proteína recombinante lleve incorporada los productos del sistema de expresión, incluyendo lípidos (como endotoxinas bacterianas) y proteínas del huésped. Estos productos pueden ser eliminados mediante el protocolo de purificación mediante ciclos de temperatura y un tratamiento adicional con hidróxido sódico. The production of ELPs in E. coli as an expression system implies that the recombinant protein incorporates the products of the expression system, including lipids (such as bacterial endotoxins) and host proteins. These products can be eliminated by means of the purification protocol by means of temperature cycles and an additional treatment with sodium hydroxide.

La purificación mediante ciclos térmicos consiste en la precipitación de los polímeros cuando se reducía el pH a 4 y se aumentaba la temperatura a 60 ºC, tras su separación por centrifugación se solubilizaba el precipitado en agua fría. Tras 3 ciclos de purificación, el precipitado de proteína se resuspendió en PBS estéril frío y a continuación se añadió hidróxido sódico estéril a una concentración final de 0,4 N y se mezcló manualmente. La mezcla se incubó en hielo durante 15 minutos y a continuación se añadió 5 M de cloruro sódico hasta una concentración final de 2 M. La proteína se precipitó a 25 ºC, se centrifugó a The purification by thermal cycles consists in the precipitation of the polymers when the pH is reduced to 4 and the temperature is increased to 60 ° C, after separation by centrifugation the precipitate is solubilized in cold water. After 3 cycles of purification, the protein precipitate was resuspended in cold sterile PBS and then sterile sodium hydroxide was added to a final concentration of 0.4 N and mixed manually. The mixture was incubated on ice for 15 minutes and then 5M of sodium chloride was added to a final concentration of 2M. The protein was precipitated at 25 ° C, centrifuged at

8.500 g durante 20 minutos a 25 ºC y se resuspendió en PBS frío. Este proceso se repitió tres veces. Tras el tercer tratamiento, se ajustó el pH de la solución que contenía la proteína a pH 6-8 para una siguiente desalación y liofilización. 8,500 g for 20 minutes at 25 ° C and resuspended in cold PBS. This process was repeated three times. After the third treatment, the pH of the solution containing the protein was adjusted to pH 6-8 for subsequent desalination and lyophilization.

ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al

Peso molecular estimado (Da) Estimated molecular weight (Da)

Peso molecular experimental (Media ± Des.est.) (Da) Error peso molecular (%) Producción (mg/L) Niveles de endotoxina (EU/mg) Experimental molecular weight (Mean ± Des.est.) (Da) Molecular Weight Error (%) Production (mg / L) Endotoxin levels (EU / mg)

E50I60 E50I60

46981 46999 ± 19.96 0.04 78.0 <0.1 46981 46999 ± 19.96 0.04 78.0 <0.1

Ag-E50I60 Ag-E50I60

49194 49149 ± 3.30 0.1 85.5 <0.1 49194 49149 ± 3.30 0.1 85.5 <0.1

Ag- E50A60 Ag- E50A60

49194 49255 ± 15.95 0.1 75.0 <0.1 49194 49255 ± 15.95 0.1 75.0 <0.1

Tabla 1: Correlación entre las masas esperadas y experimentales obtenidas para Ag-E50I60, E50I60 and Ag-E50A60 ELPs tras el análisis de espectrometría de masas MALDI-TOFF y el contenido de endotoxina tras los 3 ciclos de purificación y un segundo tratamiento con hidróxido sóldico para la eliminación de Table 1: Correlation between expected and experimental masses obtained for Ag-E50I60, E50I60 and Ag-E50A60 ELPs after MALDI-TOFF mass spectrometry analysis and endotoxin content after 3 cycles of purification and a second treatment with sodium hydroxide for the elimination of

5 endotoxinas. El nivel de endotoxinas se determinó mediante el kit Endpoint Chromogenic LAL Assay de Lonza. 5 endotoxins The endotoxin level was determined by the Lonza Chromogenic LAL Assay Endpoint kit.

El tamaño y la pureza de las ELP se analizaron mediante electroforesis en gel SDS-PAGE al 12 % y a continuación se realizó una tinción negativa con Cobre (Figura 1). La banda del gel se analizó mediante 10 espectrometría de masas MALDI-TOF (Figura 2), se identificó con exactitud la masa de los ELPs (Tabla 1) y las secuencias se confirmaron mediante análisis composicional de aminoácidos (Tabla 2). The size and purity of the ELPs were analyzed by 12% SDS-PAGE gel electrophoresis and then a negative staining was performed with Copper (Figure 1). The gel band was analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry (Figure 2), the mass of the ELPs was accurately identified (Table 1) and the sequences were confirmed by amino acid compositional analysis (Table 2).

Polímero Polymer

E50I60 Ag-E50I60 Ag-E50A60 E50I60  Ag-E50I60  Ag-E50A60

aa. aa.

Estimado Experimental Estimado Experimental Estimado Experimental Dear Experimental Dear Experimental Dear Experimental

asp asp

0 0.67 1 1.6 0 0 0 0.67 one 1.6 0 0

ser be

1 1.77 4 3.12 4 4.61 one 1.77 4 3.12  4 4.61

glu glu

11 12.41 13 12.79 13 14.97 eleven 12.41  13  12.79 13 14.97

gly gly

220 222.92 222 226.75 162 165.26 220  222.92 222 226.75 162 165.26

arg arg

0 0.5 1 1.54 1 1.44 0 0.5 one 1.54 one 1.44

thr thr

0 0.48 1 1.02 1 1.04 0 0.48 one 1.02  one 1.04

ala to

0 0.72 2 2.66 62 66.59 0 0.72 2 2.66 62 66.59

pro pro

111 110.27 112 111.94 112 108.40 111  110.27 112 111.94 112 108.40

tyr tyr

0 0.23 0 1.13 1 1.81 0 0.23 0 1.13  one 1.81

val val

151 146.75 155 150.83 215 208.16 151  146.75 155 150.83 215 208.16

met met

1 n.d. 1 0.96 1 1.32 one n.d. one 0.96 one 1.32

lys lys

0 0.44 0 0.25 0 0 0 0.44 0 0.25  0 0

ile ile

60 62.05 60 59.77 0 0 60 62.05  60  59.77 0 0

leu leu

2 2.47 3 3.66 3 3.88 2 2.47 3 3.66  3 3.88

phe phe

0 0.74 2 1.93 2 2.84 0 0.74 2 1.93  2 2.84

Tabla 2: Composición de aminoácidos esperada y experimental de Ag-E50I60, E50I60 and Ag-E50A60 ELPs, 15 basado en el método de separación cromatográfica HPLC. Table 2: Expected and experimental amino acid composition of Ag-E50I60, E50I60 and Ag-E50A60 ELPs, 15 based on the HPLC chromatographic separation method.

Brevemente, para analizar la composición de aminoácidos, cada muestra se disolvió en 400 μl de agua y Briefly, to analyze the amino acid composition, each sample was dissolved in 400 μl of water and

200 μl de esta disolución se hidrolizó tras añadir 60 μl de ácido a-aminobutírico 2,5 mM, como control 200 μl of this solution was hydrolyzed after adding 60 μl of 2.5 mM a-aminobutyric acid, as a control

interno, con 6 M HCl y 1% fenol durante 2,5 horas a 155 ºC. Tras la evaporación completa, el hidrolizado 20 fue resuspendido en 300 ml de 20 mM HCl y se preparó una nueva dilución 1/3. Los aminoácidos de esta internal, with 6 M HCl and 1% phenol for 2.5 hours at 155 ° C. After complete evaporation, hydrolyzate 20 was resuspended in 300 ml of 20 mM HCl and a new 1/3 dilution was prepared. The amino acids of this

ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al

solución se analizaron por HPLC con detector de UV empleando un sistema de gradiente de HPLC modelo 600 con detector Waters (Waters 2487). The solution was analyzed by HPLC with UV detector using a model 600 HPLC gradient system with Waters detector (Waters 2487).

La transición de temperatura inversa de cada polímero se determinó mediante mediciones turbidimétricas 5 a una densidad óptica de 350 nm y por calorimetría diferencial de barrido (DSC). The inverse temperature transition of each polymer was determined by turbidimetric measurements 5 at an optical density of 350 nm and by differential scanning calorimetry (DSC).

Se prepararon soluciones de 25 μM de E50I60 y Ag- E50I60 en PBS frío (pH 7,4) filtradas con filtros de PVDF de 0,1 μm. A continuación estas soluciones se emplearon para medir la densidad óptica a 350 nm en un rango de 10 ºC - 60 ºC en un espectofotómetro Varian Cary 50 UV-Vis con una cámara para la muestra Solutions of 25 μM of E50I60 and Ag-E50I60 in cold PBS (pH 7.4) filtered with 0.1 μm PVDF filters were prepared. These solutions were then used to measure the optical density at 350 nm in a range of 10 ° C - 60 ° C on a Varian Cary 50 UV-Vis spectrophotometer with a sample chamber

10 termostatizada (Figura 3). Se observa que prácticamente no hay diferencia entre los valores de la temperatura de transición entre los polímeros E50I60 y Ag-E50I60,(inician a 14ºC y se estabilizan a 20ºC (Figura 4) mientras que los valores de transición observados para Ag-E50I60 y Ag-E50A60 son claramente diferentes (el de Ag-E50A60 inicia a 37ºC y se estabiliza a 45ºC) (Figura 5). 10 thermostatted (Figure 3). It is observed that there is practically no difference between the transition temperature values between the polymers E50I60 and Ag-E50I60, (they start at 14 ° C and stabilize at 20 ° C (Figure 4) while the transition values observed for Ag-E50I60 and Ag -E50A60 are clearly different (Ag-E50A60 starts at 37 ° C and stabilizes at 45 ° C) (Figure 5).

15 La calorimetría diferencial de barrido (DSC) se realizó en un Mettler Toledo 822e con un enfriador de nitrógeno líquido. La calibración de la temperatura y entalpía se realizó con una muestra control de indio. A continuación 20 μl de una solución ELP de 50 mg/ml se colocó en un recipiente de aluminio de 40 μl, herméticamente sellada. El mismo volumen de PBS se colocó en el recipiente de referencia. Se realizaron 4,5 ciclos consecutivos de calentamiento- enfriamiento a 5 ºC /min desde 0 ºC a 40 ºC y de 40 ºC a 0 ºC, 15 Differential scanning calorimetry (DSC) was performed on a Mettler Toledo 822e with a liquid nitrogen cooler. The temperature and enthalpy calibration was performed with a control sample of indium. Then 20 μl of a 50 mg / ml ELP solution was placed in a tightly sealed 40 μl aluminum container. The same volume of PBS was placed in the reference vessel. 4.5 consecutive heating-cooling cycles were performed at 5 ° C / min from 0 ° C to 40 ° C and from 40 ° C to 0 ° C,

20 tras 5 minutos a 0 ºC (Tabla 3). 20 after 5 minutes at 0 ° C (Table 3).

Ciclos de calentamiento /enfriamiento Heating / cooling cycles

1er ciclo 2ºciclo 3º ciclo 4º ciclo 5º ciclo 1st cycle 2nd cycle 3rd cycle 4th cycle 5th cycle

Tt (ºC) tH (J·g-1) Tt (ºC) tH (J · g-1)

Tt-c tH-c Tt-e tH-e Tt-c tH-c Tt-e tH-e Tt-c tH-c Tt-e tH-e Tt-c tH-c Tt-e tH-e Tt-c tH-c Tt-e tH-e Tt-c tH-c Tt-e tH-e Tt-c tH-c Tt-e tH-e Tt-c tH-c Tt-e tH-e Tt-c tH-c Tt-e tH-e Tt-c tH-c Tt-e tH-e

E50I60 E50I60

14.34 -10.15 12.74 +10.18 14.43 -9.37 12.74 +11.68 14.43 -9.17 12.74 +10.16 14.34 -9.44 12.82 +9.83 14.43 -9.71 n.d. 14.34 -10.15 12.74 +10.18 14.43 -9.37 12.74 +11.68 14.43 -9.17 12.74 +10.16 14.34 -9.44 12.82 +9.83 14.43 -9.71 n.d.

Ag-E50I60 Ag-E50I60

14.25 -9.03 12.59 +8.99 14.42 -9.81 12.50 +9.43 14.42 -9.63 12.50 +9.19 14.42 -9.76 12.50 +9.74 14.42 -10.00 n.d. 14.25 -9.03 12.59 +8.99 14.42 -9.81 12.50 +9.43 14.42 -9.63 12.50 +9.19 14.42 -9.76 12.50 +9.74 14.42 -10.00 n.d.

Ag-E50A60 Ag-E50A60

32.81 -15.72 22.02 19.38 32.81 -16.80 22.11 19.27 32.81 -17.01 22.11 18.86 32.81 -16.84 22.02 18.84 32.81 -15.67 n.d. 32.81 -15.72 22.02 19.38 32.81 -16.80 22.11 19.27 32.81 -17.01 22.11 18.86 32.81 -16.84 22.02 18.84 32.81 -15.67 n.d.

Tabla 3: Picos de temperatura de transición (Tt) y valores de entalpía (LH) obtenidos tras los picos de 25 integración de cada ciclo de calentamiento-enfriamiento (c y e respectivamente) obtenido con los experimentos DSC con E50I60, Ag-E50I60 and Ag-E50A60 ELPs en PBS a pH 7.4. Table 3: Transition temperature peaks (Tt) and enthalpy values (LH) obtained after the integration peaks of each heating-cooling cycle (cye respectively) obtained with the DSC experiments with E50I60, Ag-E50I60 and Ag- E50A60 ELPs in PBS at pH 7.4.

Dado que la temperatura de estabilización de la transición del polímero Ag-E50A60 se aproxima a valores fisiológicos existe el riesgo de que, a 37º C la transición del polímero con alanina no haya concluido en las Since the transition stabilization temperature of the Ag-E50A60 polymer approximates physiological values, there is a risk that, at 37 ° C, the transition of the polymer with alanine has not concluded in the

30 condiciones que, a priori, son requeridas para su uso, dotándole de una mayor inestabilidad y, por ende, mayor variabilidad farmacocinética. Por este motivo, todas las caracterizaciones posteriores se concentraron en los polímeros basados en las secuencias de E50I60 que, garantizan una mayor reproducibilidad en los resultados. 30 conditions that, a priori, are required for its use, giving it greater instability and, therefore, greater pharmacokinetic variability. For this reason, all subsequent characterizations were concentrated in polymers based on the sequences of E50I60, which guarantee greater reproducibility in the results.

35 Los resultados de microscopia electrónica transmitida por temperatura criogénica (Cryo-TEM) y difusión dinámica de la luz (DLS) confirmaron el ensamblaje espontáneo de las nanopartículas E50I60 y Ag E50I60. Brevemente, los polímeros se disolvieron en PBS pH 7,4 a una concentración de 1 mg/ml y se filtraron en frío con filtros PVDF de 0,1 μm y se analizaron con un ángulo de dispersión de 90º en un instrumento Brookhaven Instrument Corp (Holtsville, NY) que consiste en un láser HE-Ne 35 mW (A: 632,8 nm), un 35 The results of cryogenic temperature-transmitted electron microscopy (Cryo-TEM) and dynamic light diffusion (DLS) confirmed the spontaneous assembly of nanoparticles E50I60 and Ag E50I60. Briefly, the polymers were dissolved in PBS pH 7.4 at a concentration of 1 mg / ml and cold filtered with 0.1 µm PVDF filters and analyzed at a dispersion angle of 90 ° in a Brookhaven Instrument Corp instrument ( Holtsville, NY) consisting of a 35 mW HE-Ne laser (A: 632.8 nm), a

40 goniómetro BI-200SM y el software 3.59. La escala de intensidad se equilibró con la dispersión del Tolueno. Los ELPs se analizaron en un rango de 10 ºC a 50 ºC. Las muestras se equilibraron durante 10 minutos antes de las mediciones con un baño termostático para el control de la temperatura. La duración de los experimentos fue de 3 minutos por cada temperatura. Los diámetros efectivos determinados por las funciones de correlación de DLS, se analizaron con el método Contin y la polidispersidad fue obtenida por 40 BI-200SM goniometer and 3.59 software. The intensity scale was balanced with the dispersion of Toluene. ELPs were analyzed in a range of 10 ° C to 50 ° C. The samples were equilibrated for 10 minutes before the measurements with a thermostatic bath for temperature control. The duration of the experiments was 3 minutes for each temperature. The effective diameters determined by the DLS correlation functions were analyzed with the Contin method and the polydispersity was obtained by

45 análisis cumulante (Figura 6 y Tabla 4). 45 cumulative analysis (Figure 6 and Table 4).

ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al

E50I60 E50I60

Ag-E50I60 Ag-E50I60

T (DC) T (DC)

Tamaño (nm) Índice de Polidispersidad (IPD) Tamaño (nm) Índice de Polidispersidad (IPD) Size (nm) Polydispersity Index (IPD) Size (nm) Polydispersity Index (IPD)

16 18 20 22 26 30 34 37 40 45 50 16 18 20 22 26 30 34 37 40 45 50

380 381,9 51,4 49.2 49.3 49.6 48.8 48.2 48.7 46.2 46.9 0,069 0,191 0,201 0.146 0.105 0.098 0.100 0.086 0.086 0.143 0.107 260 405,1 54 50.3 51.6 51.8 51.4 50.2 50.1 50.4 49.6 0,092 0,065 0,085 0.072 0.096 0.075 0.095 0.079 0.084 0.061 0.068 380 381.9 51.4 49.2 49.3 49.6 48.8 48.2 48.7 46.2 46.9 0.069 0.191 0.201 0.146 0.105 0.098 0.100 0.086 0.086 0.143 0.107 260 405.1 54 50.3 51.6 51.8 51.4 50.2 50.1 50.4 49.6 0.092 0.065 0.085 0.072 0.096 0.075 0.095 0.079 0.084 0.061 0.068

Tabla 4: Tamaño de las partículas e Índice de polidispersidad, a diferentes temperaturas, en el rango de 14-50 ºC, mediante mediciones de difusión dinámica de la luz (DLS), tras análisis Contin y cumulante, respectivamente. Table 4: Particle size and Polydispersity index, at different temperatures, in the range of 14-50 ° C, by means of dynamic light diffusion measurements (DLS), after Continuous and cumulative analysis, respectively.

5 Los análisis Cryo-TEM se realizaron en muestras vitrificadas, tras ser equilibradas a 37 ºC en un microscopio electrónico de transmisión de barrido JEOL Jem-2200FS con una Cámara digital y un filtro de energía en columna (Omega) (Figura 6). El tamaño de las partículas se analizó estadísticamente con el software Image J a partir de las imágenes Cryo TEM (Figura 7). 5 Cryo-TEM analyzes were performed on vitrified samples, after being equilibrated at 37 ° C in a JEOL Jem-2200FS scanning electron microscope with a digital camera and a column energy filter (Omega) (Figure 6). The particle size was statistically analyzed with the Image J software from the Cryo TEM images (Figure 7).

10 Para confirmar el tamaño medio de las partículas ELP se empleó la espectroscopía de correlación de fotones (PCS) con un Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments), así como para determinar el potencial Z y la movilidad electroforética de ELP disuelto en PBS, en dos temperaturas diferentes por encima y por debajo de la transición de temperatura (4ºC y 37ºC respectivamente) (Tabla 5). 10 To confirm the average size of the ELP particles, photon correlation spectroscopy (PCS) with a Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments) was used, as well as to determine the Z potential and electrophoretic mobility of ELP dissolved in PBS, in two different temperatures above and below the temperature transition (4 ° C and 37 ° C respectively) (Table 5).

Polímero (T DC) Polymer (T DC)

Tamaño (nm) Índice de polidispersidad (IPD) Potencial Zeta (mV) Movilidad electroforética (Imcm/Vs) Size (nm) Polydispersity Index (IPD) Zeta Potential (mV) Electrophoretic mobility (Imcm / Vs)

E50I60 (4 DC) E50I60 (4 DC)

n.d. 55.71n.d. 56.04 0.92 0.07 0.55 0.04 -10.2 -10,3 -11 -12,1 -0.477 -0.908 -0.465 -1.065 n.d. 55.71n.d. 56.04 0.92 0.07 0.55 0.04 -10.2 -10.3 -11 -12.1 -0.477 -0.908 -0.465 -1.065

E50I60 (37 DC) E50I60 (37 DC)

Ag-E50I60 (4 DC) Ag-E50I60 (4 DC)

Ag-E50I60 (37 DC) Ag-E50I60 (37 DC)

Tabla 5: Confirmación del tamaño medio de las partículas y el índice de polidispersidad (IPD), el potencial Z y la movilidad electroforética de las nanopartículas E50I60 and Ag-E50I60 in PBS a pH 7, medido por espectroscopía de correlación de fotones (PCS) en un Malvern Zatasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Table 5: Confirmation of average particle size and polydispersity index (IPD), Z potential and electrophoretic mobility of nanoparticles E50I60 and Ag-E50I60 in PBS at pH 7, measured by photon correlation spectroscopy (PCS) in a Malvern Zatasizer Nano ZS (Malvern Instruments).

20 El alto potencial zeta negativo es debido básicamente a la carga del grupo carboxilato del amino ácido glutámico del bloque hidrofílico y es importante para evitar que haya interacciones inespecíficas con la membrana plasmática de las células sanguíneas que también presentan externamente la misma carga. De esta forma, la intenalización de las nanopartículas se produce sólo de forma específica por las células The high negative zeta potential is basically due to the carboxylate group loading of the glutamic acid amino of the hydrophilic block and it is important to avoid non-specific interactions with the plasma membrane of blood cells that also externally have the same charge. In this way, the intentionalization of the nanoparticles occurs only specifically by the cells

25 encargadas de presentar los antígenos. 25 responsible for presenting the antigens.

EJEMPLO 3 EXAMPLE 3

Ensayos de citotoxicidad Cytotoxicity tests

30 La investigación de la actividad profiláctica de un compuesto requiere conocer previamente su nivel de citotoxicidad para la posterior implementación de un régimen de dosificación adecuado, garantizando de esta forma que la citotoxicidad no interferirá en los resultados de estudios posteriores. Con este propósito se llevó a cabo la determinación de la citotoxicidad in vitro de los preparados vacunales sobre células de bazo de ratón sin tratamiento previo. The investigation of the prophylactic activity of a compound requires prior knowledge of its level of cytotoxicity for the subsequent implementation of an adequate dosage regimen, thus guaranteeing that cytotoxicity will not interfere with the results of subsequent studies. For this purpose, the determination of the in vitro cytotoxicity of the vaccine preparations on mouse spleen cells without prior treatment was carried out.

35 El día en el que se sacrificaron los ratones, se extrajo el bazo y fue procesado para obtener células, de manera que se homogenizó, filtro y purificó mediante gradiente de Ficoll. Finalmente se recogieron las 35 On the day the mice were sacrificed, the spleen was removed and processed to obtain cells, so that it was homogenized, filtered and purified by means of a Ficoll gradient. Finally the

ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al

células y a continuación se sembraron en una placa. Se aislaron 1,6 millones de células mononucleares y se establecieron 7 grupos comparativos: cells and then seeded on a plate. 1.6 million mononuclear cells were isolated and 7 comparative groups were established:

Grupo 1: células control sin tratar. Grupo 2: células pulsadas con 2μg/ml de antígeno desnudo. Grupo 3: células pulsadas con 1μg/ml de antígeno desnudo. Grupo 4: células pulsadas con el antígeno vehiculizado en el polímero de elastina (Ag-E50I60) equivalente a 2μg/ml de antígeno desnudo. Grupo 5: células pulsadas con el b-péptido vehiculizado en el polímero de elastina (Ag-E50I60) equivalente a 1μg/ml de antígeno desnudo. Grupo 6: células únicamente tratadas con el polímero sin antígeno (E50I60) equivalente al grupo 4. Grupo 7: células tratadas con el polímero sin antígeno (E50I60) equivalente al grupo 5. Group 1: untreated control cells. Group 2: pulsed cells with 2μg / ml of naked antigen. Group 3: pulsed cells with 1μg / ml naked antigen. Group 4: cells pulsed with the antigen vehiculized in the elastin polymer (Ag-E50I60) equivalent at 2μg / ml naked antigen. Group 5: cells pulsed with the b-peptide vehiculized in the elastin polymer (Ag-E50I60) equivalent at 1μg / ml naked antigen. Group 6: cells only treated with the polymer without antigen (E50I60) equivalent to group 4. Group 7: cells treated with the polymer without antigen (E50I60) equivalent to group 5.

A las 24 horas se recogieron los precipitados celulares y los sobrenadantes. Los precipitados de células se utilizaron para determinar la viabilidad celular determinando la presencia de fenómenos de apoptosis y necrosis gracias a la doble tinción de anexina-V y Ioduro de propidio, por citometría de flujo. Tras analizar estadísticamente los resultados de viabilidad celular obtenidos por citometría se observó que era similar en cada uno de los grupos. Además no había toxicidad apreciable en ninguno de los tratamientos (Figura 8). At 24 hours the cell precipitates and supernatants were collected. The precipitates of cells were used to determine cell viability by determining the presence of apoptosis phenomena and necrosis thanks to the double staining of annexin-V and propidium iodide, by flow cytometry. After analyzing Statistically, the cell viability results obtained by cytometry were found to be similar in each of the groups. In addition there was no appreciable toxicity in any of the treatments (Figure 8).

EJEMPLO 4 EXAMPLE 4

Ensayos inmunológicos. Immunological tests

Para evaluar la utilidad de los polímeros de elastina como vehículos para el desarrollo de vacunas para prevenir la infección por M. tuberculosis se utilizaron 5 grupos de 8 ratones hembras de entre 6-10 semanas de la raza BALB/cByJ. Estos ratones fueron marcados el día en el que se inició el tratamiento y pesados a lo largo de todo el experimento. Los ratones crecieron normalmente sin signo alguno de enfermedad ni se observó pérdida de peso a lo largo del experimento (Fig. 9). La ganancia media de peso fue de 440 mg por semana y no se encontraron diferencias significativas entre los diferentes grupos. Al final del experimento se sacrificaron los ratones por dislocación cervical. To evaluate the usefulness of elastin polymers as vehicles for the development of vaccines to prevent infection with M. tuberculosis, 5 groups of 8 female mice between 6-10 weeks of the BALB / cByJ breed were used. These mice were marked on the day the treatment was started and weighed throughout the entire experiment. The mice grew normally without any sign of disease nor was weight loss observed throughout the experiment (Fig. 9). The average weight gain was 440 mg per week and no significant differences were found between the different groups. At the end of the experiment the mice were sacrificed by cervical dislocation.

El esquema general de trabajo fue el siguiente: se inyectaron subcutáneamente 3 dosis de 200μl a intervalos de 2 semanas (días 0, 14 y 28) con los siguientes contenidos: 50 μg de Ag-E50I60 (equivalente a 1,97 μg de antígeno desnudo) en PBS en el primer grupo (dosis 1); 100 μg de Ag-E50I60 (equivalente a 3,94 μg de antígeno desnudo) en PBS en el segundo grupo (dosis 2); 95,5 μg de E50I60 (equivalente a 100 μg de Ag-E50I60) en PBS en el tercer grupo; 3,94 μg de antígeno desnudo en PBS en el cuarto grupo y PBS al quinto grupo de ratones. Las dosis se habían calentado previamente a 37ºC durante 30 min para permitir que se formaran las nanopartículas y no contenían ningún agente adyuvante. A intervalos regulares se extrajeron 0,5 ml de sangre por la vena de la cola mediante Microvette® CB 300 K2E (SARSTEDT, Toronto, Canada). La sangre se mantenía a temperatura ambiente y se centrifugaba a 2500 rpm durante 10 min. Se recogía el plasma resultante y se congelaba a -80ºC hasta su uso. The general scheme of work was as follows: 3 doses of 200μl were injected subcutaneously at 2-week intervals (days 0, 14 and 28) with the following contents: 50 μg of Ag-E50I60 (equivalent to 1.97 μg of naked antigen ) in PBS in the first group (dose 1); 100 μg of Ag-E50I60 (equivalent to 3.94 μg of naked antigen) in PBS in the second group (dose 2); 95.5 μg of E50I60 (equivalent to 100 μg of Ag-E50I60) in PBS in the third group; 3.94 μg of naked antigen in PBS in the fourth group and PBS in the fifth group of mice. The doses had been previously heated at 37 ° C for 30 min to allow nanoparticles to form and did not contain any adjuvant agents. At regular intervals 0.5 ml of blood was drawn through the tail vein using Microvette® CB 300 K2E (SARSTEDT, Toronto, Canada). The blood was kept at room temperature and centrifuged at 2500 rpm for 10 min. The resulting plasma was collected and frozen at -80 ° C until use.

Se evaluó el nivel de citoquinas en el plasma de los días 1, 15 y 29 mediante el ensayo Biorad© 8 plex assay (Hercules, CA, USA), los días 1, 15 y 29. Este sistema permite la cuantificación de 8 diferentes citoquinas Th1/Th2 con los siguientes límites de detección (pg/ml): IL-1� (2,46), IL-2 (3,89), IL-4 (6,78), IL-5 (2,76), IL-10 (1,3), GM-CSF (2,13), IFN- Y (3,35), TNF-a (3,46). Los niveles resultantes de citoquinas fueron comparados por el test de Mann Whitney U para grupos no relacionados y por el test del signo de rangos Wilcoxon para muestras pareadas. Todos los valores de p son bilaterales y se consideró P < 0.05 como estadísticamente significativo y P < 0.01 como altamente significativo. The level of cytokines in the plasma on days 1, 15 and 29 was evaluated by the Biorad © 8 plex assay (Hercules, CA, USA), on days 1, 15 and 29. This system allows the quantification of 8 different cytokines Th1 / Th2 with the following detection limits (pg / ml): IL-1� (2.46), IL-2 (3.89), IL-4 (6.78), IL-5 (2.76 ), IL-10 (1.3), GM-CSF (2.13), IFN-Y (3.35), TNF-a (3.46). The resulting cytokine levels were compared by the Mann Whitney U test for unrelated groups and by the Wilcoxon range sign test for paired samples. All p values are bilateral and P <0.05 was considered statistically significant and P <0.01 as highly significant.

Los resultados del nivel de citoquinas se exponen en la Tabla 6. The results of the cytokine level are shown in Table 6.

ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al

Grupo Group

Citoquina Día 1 Día 15 Día 29 Cytokine Day 1 Day 15 Day 29

1 Ag-E50I60 Dosis 1 1 Ag-E50I60 Dose 1

IL-11 93.9 [92.6] 51.9 [20.3] 73.1 [39.9] IL-11 93.9 [92.6] 51.9 [20.3] 73.1 [39.9]

IL-5 IL-5

11.7 [10.9] 9.5 [4.3] 87.4 [125.5] 11.7 [10.9] 9.5 [4.3] 87.4  [125.5]

IL-10 IL-10

29.2 [17.9] 19.1 [9.3] 16.7 [11.7] 29.2 [17.9] 19.1 [9.3] 16.7 [11.7]

GM-CSF GM-CSF

31.1 [12.7] 21.8 [14.9] 20.9 [14.6] 31.1 [12.7] 21.8 [14.9] 20.9 [14.6]

INF-y INF-Y

71.1 [18.8] 60.2 [19.3] 51.9 [20.3] 71.1 [18.8] 60.2 [19.3] 51.9 [20.3]

TNF-a TNF-a

127.8 [60.2] 88.8 [18.0] 89.5 [29.5] 127.8 [60.2] 88.8 [18.0] 89.5 [29.5]

2 Ag-E50I60 Dosis 2 2 Ag-E50I60 Dose 2

IL-11 51.7 [17.4] 33.7 [30.8] 43.7 [42.3] IL-11 51.7 [17.4] 33.7 [30.8] 43.7 [42.3]

IL-5 IL-5

9.3 [14.4] 7.8 [8.8] 158.4 [290.0] 9.3 [14.4] 7.8 [8.8] 158.4  [290.0]

IL-10 IL-10

22.5 [13.9] 9.2 [9.5] 12.3 [10.5] 22.5 [13.9] 9.2 [9.5] 12.3 [10.5]

GM-CSF GM-CSF

18.6 [13.4] 5.4 [6.1] 12.8 [13.4] 18.6 [13.4] 5.4 [6.1] 12.8 [13.4]

INF-y INF-Y

55.6 [21.2] 34.6 [30.1] 24.8 [21.2] 55.6 [21.2] 34.6 [30.1] 24.8 [21.2]

TNF-a TNF-a

81.7 [30.4] 62.0 [30.6] 52.6 [25.2] 81.7 [30.4] 62.0 [30.6] 52.6 [25.2]

3 E50I60 3 E50I60

IL-11 19.7 [21.3] 20.4 [19.5] 28.9 [38.2] IL-11 19.7 [21.3] 20.4 [19.5] 28.9 [38.2]

IL-5 IL-5

4.3 [3.4] 3.9 [2.2] 11.7 [20.4] 4.3 [3.4] 3.9 [2.2] 11.7 [20.4]

IL-10 IL-10

5.4 [4.8] 3.1 [2.6] 5.9 [7.2] 5.4 [4.8] 3.1 [2.6] 5.9 [7.2]

GM-CSF GM-CSF

2.9 [2.3] 2.3 [2.3] 6.1 [8.1] 2.9 [2.3] 2.3 [2.3] 6.1 [8.1]

INF-y INF-Y

26.4 [19.2] 20.3 [11.9] 29.8 [28.5] 26.4 [19.2] 20.3 [11.9] 29.8 [28.5]

TNF-a TNF-a

47.3 [19.4] 52.9 [25.6] 84.3 [101.6] 47.3 [19.4] 52.9 [25.6] 84.3 [101.6]

4 Ag 4 Ag

IL-11 22.4 [13.8] 29.1 [20.9] 32.4 [16.8] IL-11 22.4 [13.8] 29.1 [20.9] 32.4 [16.8]

IL-5 IL-5

4.8 [2.6] 8.0 [3.2] 7.8 [3.7] 4.8 [2.6] 8.0 [3.2] 7.8 [3.7]

IL-10 IL-10

29.5 [14.9] 23.4 [16.3] 25.2 [13.7] 29.5 [14.9] 23.4 [16.3] 25.2 [13.7]

GM-CSF GM-CSF

16.9 [26.0] 27.4 [20.6] 29.2 [24.2] 16.9 [26.0] 27.4 [20.6] 29.2 [24.2]

INF-y INF-Y

49.0 [14.6] 63.5 [25.8] 58.9 [36.2] 49.0 [14.6] 63.5 [25.8] 58.9 [36.2]

TNF-a TNF-a

101.0 [38.3] 110.8 [35.9] 111.7 [45.7] 101.0 [38.3] 110.8 [35.9] 111.7 [45.7]

5 PBS 5 PBS

IL-11 29.5 [18.2] 15.0 [15.5] 17.6 [17.7] IL-11 29.5 [18.2] 15.0 [15.5] 17.6 [17.7]

IL-5 IL-5

6.3 [2.9] 6.0 [2.1] 4.5 [2.7] 6.3 [2.9] 6.0 [2.1] 4.5 [2.7]

IL-10 IL-10

34.6 [17.3] 20.6 [11.9] 16.2 [12.2] 34.6 [17.3] 20.6 [11.9] 16.2 [12.2]

GM-CSF GM-CSF

24.1 [18.3] 17.7 [14.5] 10.2 [12.6] 24.1 [18.3] 17.7 [14.5] 10.2 [12.6]

INF-y INF-Y

54.0 [17.6] 48.9 [16.6] 41.0 [14.7] 54.0 [17.6] 48.9 [16.6] 41.0 [14.7]

TNF-a TNF-a

124.3 [121.1] 99.3 [23.4] 77.8 [31.7] 124.3 [121.1] 99.3 [23.4] 77.8 [31.7]

Tabla 6: Niveles de citoquinas en las diferentes muestras de plasma. Los datos se presentan como la media y entre corchetes el rango intercuartil. Table 6: Cytokine levels in the different plasma samples. The data is presented as the mean and in square brackets the interquartile range.

5 En el primer día de extracción los ratones expuestos a ambas dosis del polímero Ag-E50I60 mostraron niveles superiores de IL-1� que el resto de grupos aunque no mostraron diferencias significativas a lo largo del tiempo (Figura 10). Los datos de los mismos grupos (1 y 2) sí mostraron un aumento significativo con el tiempo en los niveles de IL-5 en plasma (aumento de 7.5 veces para la dosis 1 desde el día 1 al 29 y de 17 veces para la dosis 2 con P < 0.05 en ambos casos). Por el contrario, el grupo 3 que recibió el 5 On the first day of extraction the mice exposed to both doses of the Ag-E50I60 polymer showed higher levels of IL-1� than the rest of the groups although they did not show significant differences over time (Figure 10). Data from the same groups (1 and 2) did show a significant increase over time in plasma IL-5 levels (7.5 times increase for dose 1 from day 1 to 29 and 17 times for dose 2 with P <0.05 in both cases). On the contrary, the group 3 that received the

10 vehículo libre E50I60 no indujo la elevación en los niveles de ninguna de las citoquinas analizadas salvo un ligero incremento progresivo en los niveles de TNF-a que, en ningún caso superaron los alcanzados por el grupo control. No se encontraron niveles detectables del IL-2 y IL-4 en ningún caso. The free vehicle E50I60 did not induce the elevation in the levels of any of the cytokines analyzed except for a slight progressive increase in the levels of TNF-a, which in no case exceeded those achieved by the control group. No detectable levels of IL-2 and IL-4 were found in any case.

Al final del periodo de inmunización (día 29) y, a diferencia de los niveles de IL-1� ,que tendieron a At the end of the immunization period (day 29) and, unlike IL-1 levels, which tended to

15 disminuir ligeramente, IL-5 presentó valores significativamente superiores en los grupos vacunados con Ag-E50I60 (Figura 10). 15 decrease slightly, IL-5 presented significantly higher values in the groups vaccinated with Ag-E50I60 (Figure 10).

Además se evaluó la presencia de inmunoglobulinas específicas en los plasmas extraídos los días 7, 21 y 35 desde el inicio del experimento. Se utilizó la técnica de ELISA incubando el plasma sobre placas 20 previamente recubiertas con los respectivos agentes inyectados (Ag-E50I60, E50I60), mientras que se usó una placa recubierta con Streptavidin para capturar eficazmente el antígeno desnudo marcado con biotina. También se realizaron los ensayos de ELISA sobre placas recubiertas con un filtrado proteico de cultivo de M. tuberculosis (CFP). El plasma se diluyó en PBS y se analizó por triplicado para cada animal, usando diluciones 1:25000 del anticuerpo policlonal de cabra anti-Ig M de ratón (A8786) y 1:10000 del 25 anticuerpo policlonal de cabra anti-Ig G de ratón (A3673), ambos de Sigma (St. Quentin, France) para detectar la presencia de las correspondientes inmunoglobulinas específicas. Los dos anticuerpos secundarios estaban marcados con Peroxidasa para poder cuantificar su presencia mediante el reactivo In addition, the presence of specific immunoglobulins in the plasmas extracted on days 7, 21 and 35 from the beginning of the experiment was evaluated. The ELISA technique was used by incubating the plasma on plates previously coated with the respective injected agents (Ag-E50I60, E50I60), while a plate coated with Streptavidin was used to effectively capture the biotin-labeled naked antigen. ELISA assays were also performed on plates coated with a M. tuberculosis culture protein filtrate (CFP). The plasma was diluted in PBS and analyzed in triplicate for each animal, using 1: 25000 dilutions of the goat anti-mouse IgM polyclonal antibody (A8786) and 1: 10000 of the goat goat anti-IgG polyclonal antibody. (A3673), both from Sigma (St. Quentin, France) to detect the presence of the corresponding specific immunoglobulins. The two secondary antibodies were labeled with Peroxidase to be able to quantify their presence by means of the reagent

ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al

3,3´,5,5´ Tetramethylbenzidine y la lectura de la correspondiente absorbancia a 370 nm. Los datos se estudiaron por análisis de varianza usando el programa GraphPad Prism versión 4 en combinación con el método de Bonferroni. Se consideró P < 0.05 como un resultado estadísticamente significativo y P < 0.001 como altamente significativo. 3,3´, 5,5´ Tetramethylbenzidine and the reading of the corresponding absorbance at 370 nm. The data was studied by analysis of variance using the GraphPad Prism version 4 program in combination with the Bonferroni method. P <0.05 was considered as a statistically significant result and P <0.001 as highly significant.

En la Figura 11 se observan las absorbancias resultantes de la detección de los anticuerpos IgM e IgG específicos presentes en las diferentes muestras de plasma analizadas (muestra preinmune: semana 0; y muestras inmunizadas: semanas 1, 3 y 5). Al analizar la generación de ambos tipos de anticuerpos (IgM e IgG) se observa que las muestras sanguíneas procedentes del grupo 5 tratados con PBS mostraron una baja reactividad y variabilidad cuando se incubaron sobre cualquiera de los 4 recubrimientos (Ag-E50I60, E50I60, Antígeno biotinilado y CFP). También destaca la baja respuesta general obtenida en el grupo 4 inmunizado con el antígeno desnudo y que en todos los test analizados resultó idéntica sino inferior al obtenido con el placebo. Esto demuestra la baja capacidad inmunogénica que induce per se el antígeno de M. tuberculosis utilizado en el ensayo tanto en la generación de IgMs como en IgGs cuando no se utiliza ningún tipo de adyuvante o vehículo. El resto de grupos dieron resultados variables dependiendo del grupo probado, del anticuerpo detectado y del tiempo analizado. Figure 11 shows the absorbances resulting from the detection of the specific IgM and IgG antibodies present in the different plasma samples analyzed (preimmune sample: week 0; and immunized samples: weeks 1, 3 and 5). When analyzing the generation of both types of antibodies (IgM and IgG), it is observed that blood samples from group 5 treated with PBS showed low reactivity and variability when incubated on any of the 4 coatings (Ag-E50I60, E50I60, Antigen biotinylated and CFP). It also highlights the low overall response obtained in group 4 immunized with the naked antigen and that in all the tests analyzed was identical but lower than that obtained with placebo. This demonstrates the low immunogenic capacity that per se induces the M. tuberculosis antigen used in the assay both in the generation of IgMs and in IgGs when no adjuvant or vehicle is used. The rest of the groups gave variable results depending on the group tested, the antibody detected and the time analyzed.

Las muestras procedentes de los grupos 1 y 2 inmunizados con Ag-E50I60 mostraron los niveles más altos de anticuerpos IgM específicos para todos los recubrimientos excepto el realizado con E50I60 donde resultaron semejantes. Los niveles de IgMs anti-Ag-E50I60 fueron muy superiores a los generados por el antígeno desnudo (P < 0.01 para la dosis 1 y P < 0.05 para la 2), aunque en el caso del revestimiento hecho con la mezcla de proteínas bacterianas (CFP) el aumento altamente significativo (P < 0.001) se obtuvo sólo con la dosis más alta de Ag-E50I60 (grupo 2), esto posiblemente se deba también al bajo nivel del antígeno presente en la mezcla proteica CFP. La respuesta de IgMs frente al Ag se mantiene significativamente alta y prácticamente constante con el tiempo mientras que aumenta cuando se analiza frente al CFP y decrece cuando se compara con los recubrimientos que contienen el ELP. Es decir, la generación de IgMs frente a la parte de ELP es inicialmente fuerte (semana 1) y posteriormente se va reduciendo paulatinamente en concomitancia con una maduración de la señal específica frente al Ag de Samples from groups 1 and 2 immunized with Ag-E50I60 showed the highest levels of specific IgM antibodies for all coatings except that made with E50I60 where they were similar. The levels of anti-Ag-E50I60 IgMs were much higher than those generated by the naked antigen (P <0.01 for doses 1 and P <0.05 for 2), although in the case of the coating made with the mixture of bacterial proteins ( CFP) the highly significant increase (P <0.001) was obtained only with the highest dose of Ag-E50I60 (group 2), this is possibly also due to the low level of the antigen present in the CFP protein mixture. The response of IgMs to Ag remains significantly high and practically constant over time while it increases when analyzed against CFP and decreases when compared to coatings containing ELP. That is, the generation of IgMs against the part of ELP is initially strong (week 1) and subsequently gradually reduced in concomitance with a maturation of the specific signal against the Ag of

M. tuberculosis (señal creciente en CFP y mantenimiento frente al Ag) lo cual indica que el vehículo ELP provoca una fuerte respuesta inicial en IgMs tanto hacia la parte ELP (E50I60) como frente al Ag que transporta, pero mientras que la primera decrece con el tiempo la segunda madura y es dosisdependiente con el Ag limitante. M. tuberculosis (increasing signal in CFP and maintenance against Ag) which indicates that the ELP vehicle causes a strong initial response in IgMs both to the ELP part (E50I60) and to the Ag transporting, but while the first decreases with the second time matures and is dose dependent with the limiting Ag.

La memoria inmunológica que, de forma ideal, se genera tras la administración repetida de un antígeno lleva una respuesta inmune secundaria que promueve un aumento mucho más rápido, más intenso y duradero en la producción de IgG específica frente a dicho antígeno Los niveles de IgGs específicos en los diferentes grupos a estudio de nuevo mostraron que los grupos que recibieron PBS y antígeno desnudo no daban señal apreciable ni diferenciadora, confirmándose de nuevo la inocuidad de la técnica profiláctica aplicada y la baja capacidad inmunogénica del péptido utilizado cuando se inyecta sin ningún vehículo ni adjuvante. Por el contrario, se observó una intensa señal en los dos grupos inmunizados con Ag-E50I60 significativamente superior a la desarrollada por el grupo 3 (inmunizado con E50I60) tanto en IgGs anti- E50I60 como anti- Ag-E50I60. A diferencia de la respuesta de IgMs, las IgGs se desarrollaron a partir de la semana 3 (tras sendas inmunizaciones en las semanas 0 y 2) con una tendencia creciente entre las semanas 3 y 5 en el caso exclusivo de los grupos 1 y 2, y estabilizándose o reduciéndose en el caso del grupo 3 (E50I60). Esto corrobora la curva típica de una respuesta humoral exitosa demostrando que tan sólo la quimera Ag-E50I60 es capaz de madurar significativamente la afinidad de sus anticuerpos (P<0.001 entre los grupos 1 y 2 y el grupo 3). La baja respuesta inducida por el E50I60 indica que es necesaria la presencia de un antígeno procedente de un patógeno para producir la buscada maduración en las IgGs. Esta sinergia también queda patente en el hecho de que una dosis inferior de inmunógeno (50 μg de Ag-E50I60 en el grupo 1) produzca una reacción que duplica (semana 3) y triplica (semana 5) la señal provocada por el vehículo ELP desnudo (95,5 μg de E50I60 en grupo 3) (P<0.001 en semanas 3 y 5 sobre Ag-E50I60). La falta de respuesta cuando el plasma de los grupos 1 y 2 se analizaron buscando IgGs específicas anti-Ag puede ser entendida porque el Antígeno biotinilado que recubre las placas de Streptavidin no se presenta adecuadamente en la forma natural reconocida por las IgGs, o también porque el Antígeno no es lo suficientemente grande para madurar una respuesta exclusiva que los IgMs si demuestran. Por ello, se puede inferir que los IgGs generados reconocen mayoritariamente epítopos con presencia de aminoácidos del Ag y del bloque ELP demostrando la importancia de éste como vehículo de presentación de antígenos de baja inmunogenicidad. The immunological memory that, ideally, is generated after repeated administration of an antigen carries a secondary immune response that promotes a much faster, more intense and lasting increase in the production of specific IgG against said antigen. Specific IgG levels in the different groups studied again they showed that the groups that received PBS and naked antigen did not give an appreciable or differentiating signal, confirming again the safety of the applied prophylactic technique and the low immunogenic capacity of the peptide used when injected without any vehicle or adjuvant On the contrary, an intense signal was observed in the two groups immunized with Ag-E50I60 significantly higher than that developed by group 3 (immunized with E50I60) in both anti-E50I60 and anti-Ag-E50I60 IgGs. Unlike the response of IgMs, IgGs developed from week 3 (after immunizations at weeks 0 and 2) with an increasing trend between weeks 3 and 5 in the exclusive case of groups 1 and 2, and stabilizing or reducing in the case of group 3 (E50I60). This corroborates the typical curve of a successful humoral response demonstrating that only the Ag-E50I60 chimera is able to significantly mature the affinity of its antibodies (P <0.001 between groups 1 and 2 and group 3). The low response induced by E50I60 indicates that the presence of an antigen from a pathogen is necessary to produce the sought maturation in IgGs. This synergy is also evident in the fact that a lower dose of immunogen (50 μg of Ag-E50I60 in group 1) produces a reaction that doubles (week 3) and triples (week 5) the signal caused by the naked ELP vehicle (95.5 μg of E50I60 in group 3) (P <0.001 in weeks 3 and 5 on Ag-E50I60). The lack of response when the plasma of groups 1 and 2 were analyzed for specific anti-Ag IgGs can be understood because the biotinylated Antigen that covers the Streptavidin plates does not present properly in the natural form recognized by the IgGs, or also because The Antigen is not large enough to mature an exclusive response that IgMs do demonstrate. Therefore, it can be inferred that the IgGs generated mostly recognize epitopes with the presence of amino acids from the Ag and the ELP block, demonstrating the importance of this as a vehicle for presenting low immunogenicity antigens.

La mayoría de las respuestas inmunes de las células TH muestran una combinación de rasgos TH1 y TH2; sin embargo, después de una inmunización prolongada, la respuesta puede resultar dominante como TH1 Most TH cell immune responses show a combination of TH1 and TH2 traits; however, after prolonged immunization, the response may be dominant as TH1

o TH2. El perfil de citoquinas (tabla 6) evidencia la existencia de un modelo de secreción bifásico caracterizado por la elevación temprana de IL-1� (una citoquina característicamente TH1) junto con un or TH2. The cytokine profile (table 6) evidences the existence of a biphasic secretion model characterized by the early elevation of IL-1� (a characteristically TH1 cytokine) together with a

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incremento dosis-dependiente de los niveles plasmáticos de IL-5 (típicamente TH2) en las fases más tardías. Por lo tanto, el patrón de inmunización definido por la secreción de citoquinas y las funciones inmunes determinan claramente una respuesta tipo Th-2 según revela la producción de IL-5 en las etapas finales de la inmunización y en la activación de la expresión de IgMs e IgGs. dose-dependent increase in plasma levels of IL-5 (typically TH2) in the later stages. Therefore, the immunization pattern defined by cytokine secretion and immune functions clearly determines a Th-2 response as revealed by the production of IL-5 in the final stages of immunization and in the activation of IgM expression. and IgGs.

El aumento de los niveles séricos de la citoquina IL-1� es un indicador diagnóstico de la fase inflamatoria, que hace sospechar una relación en la interacción precoz entre las células T y las APC. Dado que la mayor fuente celular de IL-1� son los macrófagos pero también los neutrófilos, células epiteliales y endoteliales, su claro aumento podría ser interpretado como un síntoma de la activación de estas líneas celulares en presencia de la quimera Ag-E50I60, que no sucede con el resto de preparaciones. The increase in serum levels of the cytokine IL-1� is a diagnostic indicator of the inflammatory phase, which suggests a relationship in the early interaction between T cells and APCs. Since the greatest cellular source of IL-1� is macrophages but also neutrophils, epithelial and endothelial cells, their clear increase could be interpreted as a symptom of the activation of these cell lines in the presence of the Ag-E50I60 chimera, which It does not happen with the rest of the preparations.

De esta manera, IL-1� estaría promoviendo el desarrollo de una respuesta inicial pro-celular necesaria para el desarrollo ulterior de la respuesta humoral de tipo TH2 (Spellberg B et al, Clin Infect Dis. 32(1):76102 (2001)). De hecho, la IL-1� se ha utilizado para proporcionar una actividad adyuvante para la inducción de respuestas de anticuerpos en suero en los ratones vacunados (Gwinn et al, Vaccine. 28(42):6901-14 (2010); Staats HF et al, J Immunol 162(10):6141–7 (1999); Bradney et al, J Virol 76(2):517–24 (2002). A su vez, IL-5 se ha asociado a la inducción de los perfiles de memoria Th2 en respuesta a la vacunación en los niños (White OJ et al, Vaccine. 28(14):2648-52 (2010)). Thus, IL-1� would be promoting the development of an initial pro-cellular response necessary for the further development of the humoral response of type TH2 (Spellberg B et al, Clin Infect Dis. 32 (1): 76102 (2001) ). In fact, IL-1� has been used to provide an adjuvant activity for the induction of serum antibody responses in vaccinated mice (Gwinn et al, Vaccine. 28 (42): 6901-14 (2010); Staats HF et al, J Immunol 162 (10): 6141–7 (1999); Bradney et al, J Virol 76 (2): 517–24 (2002) In turn, IL-5 has been associated with induction of Th2 memory profiles in response to vaccination in children (White OJ et al, Vaccine. 28 (14): 2648-52 (2010)).

La respuesta inmune humoral está especializada de forma que la exposición a diferentes antígenos inducen cambios en los linfocitos B para producir los diferentes isotipos de inmunoglobulinas más adecuadas para combatir la amenaza. La IgM es la primera inmunoglobulina sintetizadas por las células plasmáticas en respuesta al inmunógeno. El principal estímulo para el cambio de isotipo durante la activación de las células B es la síntesis de citoquinas por las células T colaboradoras. IL-5, es una citocinas Th2 clave para en el desarrollo de anticuerpos específicos contra dichos antígenos inmunogénicos de forma que, en ausencia de señales inductoras, las células B sintetizan IgM. Mientras que cuando las células B se activan por las señales de las células T colaboradoras (por ejemplo con la IL5) se producen la maduración isotípica. La inducción de IL-5 y la posterior secreción de IgG específica fue un fenómeno cooperativo, ya que sólo se observó en presencia de la construcción del antígeno con el polímero. Por el contrario, ELP, sin el antígeno no indujo la producción de anticuerpos IgG específicos ni tampoco variaciones significativas en los perfiles de citoquinas, lo que indica una ausencia de impacto biológico del polímero desprovisto de secuencia antigénica. Estos resultados refuerzan la propuesta para el empleo de los ELPs como vehículos antigénicos en el desarrollo de vacunas más eficaces. The humoral immune response is specialized so that exposure to different antigens induces changes in B lymphocytes to produce the most appropriate immunoglobulin isotypes to combat the threat. IgM is the first immunoglobulin synthesized by plasma cells in response to the immunogen. The main stimulus for the change of isotype during the activation of B cells is the synthesis of cytokines by the collaborating T cells. IL-5 is a key Th2 cytokine in the development of specific antibodies against said immunogenic antigens so that, in the absence of inducing signals, B cells synthesize IgM. Whereas when the B cells are activated by the signals of the collaborating T cells (for example with IL5), isotypic maturation occurs. The induction of IL-5 and the subsequent secretion of specific IgG was a cooperative phenomenon, since it was only observed in the presence of the construction of the antigen with the polymer. On the contrary, ELP, without the antigen, did not induce the production of specific IgG antibodies nor significant variations in cytokine profiles, indicating an absence of biological impact of the polymer devoid of antigenic sequence. These results reinforce the proposal for the use of ELPs as antigenic vehicles in the development of more effective vaccines.

La naturaleza pentamérica de la IgM contribuye probablemente a amplificar la señal detectada contra los diferentes recubrimientos antigénicos y permite apreciar mejor las diferencias entre los grupos de ratones ensayados. La serología de IgM de los ratones inmunizados con el Ag-E50I60 mostró una tendencia opuesta al ser comparada entre los diferentes revestimientos analizados. Así, los niveles séricos tendían a aumentar con el tiempo cuando se analizaron sobre el Ag desnudo y frente a la mezcla de proteínas de la micobacteria (CFP), mientras que tendían a disminuir frente a los pocillos revestidos con los polipéptidos que contenían el polímero tipo elastina (Ag-E50I60 y E50I60). Esta tendencia contrasta con los niveles de IgG detectados en el mismo grupo y con los mismos recubrimientos en los que se detecta un aumento progresivo de los niveles de IgG frente a Ag-E50I60 y E50I60 mientras que no se detecta señal contra el antígeno desnudo. The pentameric nature of IgM probably contributes to amplify the signal detected against the different antigen coatings and allows us to better appreciate the differences between the groups of mice tested. The IgM serology of mice immunized with Ag-E50I60 showed an opposite trend when compared between the different coatings analyzed. Thus, serum levels tended to increase over time when analyzed on naked Ag and against the mycobacterial protein mixture (CFP), while they tended to decrease against wells coated with polypeptides containing the type polymer elastin (Ag-E50I60 and E50I60). This trend contrasts with the levels of IgG detected in the same group and with the same coatings in which a progressive increase in IgG levels against Ag-E50I60 and E50I60 is detected while no signal against the naked antigen is detected.

La hipótesis de la selección clonal predice sólo que una pequeña proporción de cada linfocito individual es específico para cada antígeno partícular. La naturaleza momérica de la inmunoglobulina IgG unido a la menor sensibilidad del ELISA con el Ag biotinilado podría ser las responsables de la ausencia de anticuerpos IgG contra el Ag desnudo en los grupos 1 y 2 (inmunizados con Ag-E50I60). Sin embargo, otra posible explicación para tal ausencia podría basarse en que la configuración espacial de los diferentes epítopos de la molécula proteica puede influenciar la unión de los anticuerpos de diferentes formas. Por ello, el sistema inmune reconoce el antígeno presentado por el soporte de ELP como un determinante conformacional nuevo con mayor intensidad que el antígeno aislado, como sugiere también el hecho de que no hay maduración de la afinidad de los IgG en los ratones inmunizados con el E50I60 sin antígeno bacteriano. The clonal selection hypothesis predicts only that a small proportion of each individual lymphocyte is specific for each particular antigen. The mimeric nature of IgG immunoglobulin linked to the lower sensitivity of ELISA with biotinylated Ag could be responsible for the absence of IgG antibodies against naked Ag in groups 1 and 2 (immunized with Ag-E50I60). However, another possible explanation for such absence could be based on the fact that the spatial configuration of the different epitopes of the protein molecule can influence the binding of antibodies in different ways. Therefore, the immune system recognizes the antigen presented by the ELP support as a new conformational determinant with greater intensity than the isolated antigen, as also suggests the fact that there is no maturation of IgG affinity in mice immunized with the E50I60 without bacterial antigen.

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Claims (39)

REIVINDICACIONES 1. Un conjugado que comprende 1. A conjugate comprising (i) un polipéptido similar a elastina que comprende (i) an elastin-like polypeptide comprising

(a) (to)

al menos una región hidrofílica de secuencia [(X1PGX1G)2 X1PGX2G(X1PGX1G)2]n y at least one hydrophilic region of sequence [(X1PGX1G) 2 X1PGX2G (X1PGX1G) 2] n and

(b) (b)

al menos una región hidrofóbica de secuencia (X3X4IX5G)m en donde X1 y X3 son aminoácidos de cadena lateral hidrofóbica, X2 es un aminoácido de cadena lateral hidrofílica, X4 y X5 son G o P, , n es entre 5 y 10 y m es entre 10 y 100. at least one hydrophobic region of sequence (X3X4IX5G) m where X1 and X3 are hydrophobic side chain amino acids, X2 is a hydrophilic side chain amino acid, X4 and X5 are G or P, n is between 5 and 10 and m is between 10 and 100

y Y (ii) al menos una molécula antigénica seleccionada del grupo formado por un péptido, un ácido nucleico o un polisacárido (ii) at least one antigenic molecule selected from the group consisting of a peptide, a nucleic acid or a polysaccharide

2. 2.

Conjugado según la reivindicación 1 en donde n es 10. Conjugate according to claim 1 wherein n is 10.

3. 3.

Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en donde X1 es V. Conjugated according to any one of claims 1 to 2 wherein X1 is V.

4. Four.

Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde X2 es E. Conjugated according to any one of claims 1 to 3 wherein X2 is E.

5. 5.

Conjugado según la reivindicación 4 en donde el componente (a) tiene la secuencia [(VPGVG)2VPGEG(VPGVG)]10. Conjugated according to claim 4 wherein the component (a) has the sequence [(VPGVG) 2VPGEG (VPGVG)] 10.

6. 6.

Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde m es 60. Conjugate according to any one of claims 1 to 5 wherein m is 60.

7. 7.

Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde X3 es V. Conjugated according to any one of claims 1 to 6 wherein X3 is V.

8. 8.

Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde X4 es G. Conjugated according to any one of claims 1 to 7 wherein X4 is G.

9. 9.

Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en donde X5 es P. Conjugated according to any one of claims 1 to 8 wherein X5 is P.

10. 10.

Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde el componente (b) tiene la secuencia (VGIPG)60. Conjugated according to any one of claims 1 to 9 wherein the component (b) has the sequence (VGIPG) 60.

11. eleven.

Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde el polipéptido similar a elastina comprende adicionalmente una región polipeptídica que permite la traslocación de dicho polipéptido a través de membranas biológicas. Conjugate according to any of claims 1 to 10 wherein the elastin-like polypeptide further comprises a polypeptide region that allows translocation of said polypeptide through biological membranes.

12. 12.

Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en donde el polipéptido similar a elastina comprende adicionalmente al menos una secuencia de adhesión celular. Conjugate according to any one of claims 1 to 11 wherein the elastin-like polypeptide additionally comprises at least one cell adhesion sequence.

13. 13.

Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en donde el polipéptido similar a elastina comprende adicionalmente al menos una secuencia con capacidad de unir ácidos nucleicos. Conjugate according to any one of claims 1 to 12 wherein the elastin-like polypeptide additionally comprises at least one sequence capable of binding nucleic acids.

14. 14.

Conjugado según la reivindicación 13 en donde la secuencia con capacidad de unir ácidos nucleicos es una región rica en aminoácidos básicos. Conjugate according to claim 13 wherein the sequence capable of binding nucleic acids is a region rich in basic amino acids.

15. fifteen.

Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en donde el polipéptido similar a elastina comprende adicionalmente un péptido de inicio de la traducción. Conjugate according to any one of claims 1 to 14 wherein the elastin-like polypeptide further comprises a translation initiation peptide.

16. 16.

Conjugado según la reivindicación 15 en donde el péptido de inicio de la traducción es la secuencia descrita en SEQ ID NO:3. Conjugated according to claim 15 wherein the translation start peptide is the sequence described in SEQ ID NO: 3.

17. 17.

Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en donde el componente (ii) es un péptido antigénico. Conjugate according to any one of claims 1 to 16 wherein component (ii) is an antigenic peptide.

18. 18.

Conjugado según la reivindicación 18 en donde el péptido antigénico es un péptido antigénico de Conjugate according to claim 18 wherein the antigenic peptide is an antigenic peptide of

M. tuberculosis. M. tuberculosis.

19. 19.

Conjugado según la reivindicación 18 en donde el péptido antigénico de M. tuberculosis es un péptido de la proteína Hsp 16.3 (SEQ ID NO: 4). Conjugate according to claim 18 wherein the M. tuberculosis antigenic peptide is a peptide of the Hsp 16.3 protein (SEQ ID NO: 4).

20. twenty.

Conjugado según la reivindicación 19 en donde el péptido antigénico de la proteína Hsp 16.3 de M. tuberculosis es el péptido con secuencia SEQ ID NO: 5. Conjugate according to claim 19 wherein the antigenic peptide of the M. tuberculosis Hsp 16.3 protein is the peptide with sequence SEQ ID NO: 5.

21. twenty-one.

Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 en donde los componentes (i) y (ii) forman una única cadena polipeptídica. Conjugated according to any of claims 17 to 20 wherein the components (i) and (ii) form a single polypeptide chain.

22. 22

Conjugado según la reivindicación 21 en donde el componente (ii) se encuentra en posición Cterminal con respecto al componente (i). Conjugate according to claim 21 wherein the component (ii) is in the Cterminal position with respect to the component (i).

23. 2. 3.

Conjugado según la reivindicación 21 en donde el componente (ii) se encuentra en posición Nterminal con respecto al componente (i). Conjugated according to claim 21 wherein the component (ii) is in the N-terminal position with respect to the component (i).

24. 24.

Conjugado según la reivindicación 23 que comprende adicionalmente una región que promueve la traslocación a través de membranas biológicas en posición N-terminal con respecto al componente (i). Conjugate according to claim 23 further comprising a region that promotes translocation through biological membranes in the N-terminal position with respect to component (i).

25. 25.

Nanopartícula formada por la asociación de dos o más conjugados según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24. Nanoparticle formed by the association of two or more conjugates according to any of claims 1 to 24.

26. 26.

Nanopartícula según la reivindicación 25 en donde dicha nanopartícula tiene un diámetro inferior a 200 nm. Nanoparticle according to claim 25 wherein said nanoparticle has a diameter of less than 200 nm.

27. 27.

Polinucleótido que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24. Polynucleotide encoding a polypeptide according to any one of claims 21 to 24.

28. 28.

Vector que contiene un polinucleótido según la reivindicación 27. Vector containing a polynucleotide according to claim 27.

29. 29.

Célula que contiene el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, la nanopartícula según la reivindicación 25 o 26, el polinucleótido según la reivindicación 26 o el vector según la reivindicación 27. Cell containing the conjugate according to any one of claims 1 to 24, the nanoparticle according to claim 25 or 26, the polynucleotide according to claim 26 or the vector according to claim 27.

30. 30

Uso de un conjugado según las reivindicaciones 1 a 24, de una nanopartícula según las reivindicaciones 25 o 26, de un polinucleótido según la reivindicación 27, de un vector según la reivindicación 28 o de célula según la reivindicación 29 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad para estimular y/o inducir la respuesta inmune de un individuo frente a la molécula antigénica. Use of a conjugate according to claims 1 to 24, of a nanoparticle according to claims 25 or 26, of a polynucleotide according to claim 27, of a vector according to claim 28 or of cell according to claim 29 for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a disease to stimulate and / or induce an individual's immune response to the antigenic molecule.

31. 31.

Uso según la reivindicación 30 en donde el componente (ii) es un antígeno de M.tuberculosis y en donde la respuesta inmune de un individuo frente a la molécula antigénica es una respuesta inmune frente a tuberculosis. Use according to claim 30 wherein component (ii) is an M. tuberculosis antigen and wherein the immune response of an individual against the antigenic molecule is an immune response against tuberculosis.

32. 32

Uso según la reivindicación 30 o 31 en donde el polipéptido, la nanopartícula, el polinucleótido, el vector o la célula es administrada por vía mucosa o tópica. Use according to claim 30 or 31 wherein the polypeptide, nanoparticle, polynucleotide, vector or cell is administered by mucosal or topical route.

33. 33.

Polinucleótido adecuado para la expresión de una proteína de fusión formada por un polipéptido similar a elastina y un polipéptido antigénico de interés que comprende una secuencia que codifica dicho polipéptido similar a elastina en donde dicho polipéptido similar a elastina comprende: Polynucleotide suitable for the expression of a fusion protein formed by an elastin-like polypeptide and an antigenic polypeptide of interest comprising a sequence encoding said elastin-like polypeptide wherein said elastin-like polypeptide comprises:

(a) (to)

una región hidrofílica de secuencia [(X1PGX1G)2 X1PGX2G(X1PGX1G)2]n en donde X1 es un aminoácido de cadena lateral hidrofóbica, X2 es un aminoácido de cadena lateral hidrofílica, y n es un número entero entre 5 y 10 y a hydrophilic region of sequence [(X1PGX1G) 2 X1PGX2G (X1PGX1G) 2] n where X1 is a hydrophobic side chain amino acid, X2 is a hydrophilic side chain amino acid, and n is an integer between 5 and 10 and

(b) (b)

una región hidrofóbica de secuencia (X3X4IX5G)m en donde X3 es un aminoácido de cadena lateral hidrofóbica, X4 y X5 son G o P y m es entre 10 y 100. a hydrophobic sequence region (X3X4IX5G) m where X3 is a hydrophobic side chain amino acid, X4 and X5 are G or P and m is between 10 and 100.

34. 3. 4.

Polinucleótido según la reivindicación 33 en donde n es 10, en donde X1 es V y/o en donde X2 es Polynucleotide according to claim 33 wherein n is 10, wherein X1 is V and / or where X2 is

E. AND.

35. 35

Polinucleótido según la reivindicación 34 en donde la región hidrofílica codificada por la primera secuencia tiene la secuencia [(VPGVG)2VPGEG(VPGVG)]10. Polynucleotide according to claim 34 wherein the hydrophilic region encoded by the first sequence has the sequence [(VPGVG) 2VPGEG (VPGVG)] 10.

36. 36.

Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35 en donde m es 60, en donde X3 es V, en donde X4 es G y/o en donde X5 es P. Polynucleotide according to any one of claims 33 to 35 wherein m is 60, wherein X3 is V, wherein X4 is G and / or where X5 is P.

37. 37.

Polinucleótido según la reivindicación 33 en donde la región hidrofóbica codificada por la segunda secuencia tiene la secuencia (VGIPG)60. Polynucleotide according to claim 33 wherein the hydrophobic region encoded by the second sequence has the sequence (VGIPG) 60.

38. 38.

Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37 que comprende adicionalmente una secuencia iniciadora de la traducción. Polynucleotide according to any of claims 33 to 37 further comprising a translation initiator sequence.

39. 39.

Polinucleótido según la reivindicación 38 en donde la secuencia iniciadora de la traducción codifica un péptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO:3. Polynucleotide according to claim 38 wherein the translation initiator sequence encodes a peptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 3.

ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al 5 40. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39 que comprende adicionalmente uno varios sitios de clonaje que permita insertar un polinucleótido de interés en dicho polinucleótido de forma que la expresión de dicho polinucleótido de lugar a una proteína de fusión formada por el polipéptido similar a elastina y el polipéptido codificado por el polinucleótido de interés. 40. A polynucleotide according to any one of claims 33 to 39, further comprising one of several cloning sites that allow a polynucleotide of interest to be inserted into said polynucleotide such that the expression of said polynucleotide results in a fusion protein formed by the similar polypeptide to elastin and the polypeptide encoded by the polynucleotide of interest. 10 41. Vector de expresión que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 40. 41. Expression vector comprising a polynucleotide according to any one of claims 33 to 40. ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al Fig. 1 Fig. 1 ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al Fig. 2 Fig 2 ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al A TO 0,25 0.25 0,20 0.20 0,15 0.15 Abs (OD350) Abs (OD350) 0,10 0.10 0,05 0.05 0,00 0.00 B B 0,5 0.5 0,4 0.4 0,3 0.3 0,2 0.2 0,1 0.1 0,0 0.0 Abs (OD350) Abs (OD350) T (ºC) T (ºC) Fig. 3 Fig. 3 ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al Fig. 4 Fig. 4 ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al Fig. 5 Fig. 5 ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al Fig. 6 Fig. 6 33 33 ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al Fig. 7 Fig. 7 34 3. 4 ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al Fig. 8 Fig. 8 35 35 ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al Fig. 9 Fig. 9 36 36 ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al Fig. 10 Fig. 10 ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al anti Ag anti CFP  anti Ag anti CFP   Absorbancia a 370nmAbsorbance at 370nm Absorbancia a 370nmAbsorbance at 370nm 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 Ig M  Ig M Ig G Ig G Ag-ELP Ag-ELP Ag-ELP Ag-ELP Dosis 1 Dosis 2 ELP Ag Control Dosis 1 Dosis 2 ELP Ag Control Ag-ELP Ag-ELP Ag-ELP Ag-ELP Dose 1 Dose 2 ELP Ag Control Dose 1 Dose 2 ELP Ag Control Fig. 11 Fig. 11 38 38 ES 2 428 405 Al ES 2 428 405 Al anti Ag-ELP anti ELP  anti Ag-ELP anti ELP Ag-ELP Ag-ELP Ag-ELP Ag-ELP Dosis 1 Dosis 2 ELP Ag Control Dosis 1 Dosis 2 ELP Ag Control Ag-ELP Ag-ELP Ag-ELP Ag-ELP Dose 1 Dose 2 ELP Ag Control Dose 1 Dose 2 ELP Ag Control Fig. 11 (cont.) Fig. 11 (cont.) 39 39