MÉTODO IN VITRO DE PRONÓSTICO DE CIRROSIS HEPÁTICA DESCRIPCiÓN 5 La presente invención se refiere a un método in vitro de pronóstico y/o diagnóstico de cirrosis para pacientes que padecen hepatitis C crónica, que se caracteriza por la determinación del genotipo en el polimorfismo genético rs368328 del gen HOACS, o cualquiera que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con él (r~,8). Adicionalmente puede incluir la determinación de al menos una variable clínica, preferentemente la determinación de la concentración de aspartato aminotransferasa (AST). 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ESTADO DE LA TECNICA La cirrosis hepática es una patología crónica del hígado que se caracteriza por la muerte progresiva del tejido hepático y su sustitución por tejido fibroso. La acumulación excesiva de matriz extracelular en el parénquima hepático, causada por la sustitución a tejido fibroso, conlleva una alteración estructural y funcional de este órgano. La cirrosis hepática es común en enfermedades crónicas del hígado como son la hepatitis causada por el virus de la hepatitis e (VHC), la hepatitis causada por el virus de la hepalitis B (VHB), la enfermedad de hígado graso no alcohólica y la enfermedad hepática alcohólica, la hemocromatosis, la enfermedad de Wilson o el déficit de ol-antitripsina. La infección por VHC es una de las principales causas mundiales de enfermedad hepática crónica, afectando aproximadamente a 170 millones de personas. La actual terapia antiviral consiste en interferon-pegilado más ribavirina; sin embargo, se observa una alta variabilidad en la tasa de respuesta obtenida con este tratamiento. Esta variabilidad se debe tanto a factores virales como factores del paciente. La erradicación del VHC es especialmente dificil en los pacientes infectados por genotipo viral 1, alcanzando una tasa de respuesta cercana al 50% de los pacientes tratados, mientras que los pacientes con genotipos virales 2 y 3 responden un 70% aproximadamente. El fracaso de la terapia tiene importantes repercusiones clínicas debido a que esta enfermedad evoluciona frecuentemente a fibrosis, cirrosis y hepatocarcinoma, complicaciones graves, de costoso manejo y que constituyen la principal causa de transplante hepático. Entre los factores del paciente que influyen en el resultado del tratamiento antiviral se encuentran el sexo, la edad o el indice de masa corporal. Además, se han descrito recientemente que distintos polimorfismos en el gen IL-28B, que codifica para el interferón ).3, influyen muy significativamente en la respuesta al tratamiento, confirmando la importancia del perfil genético del paciente en la respuesta a estos fármacos. De forma similar, la progresión y pronóstico de la hepatitis C crónica (HCC) es muy variable entre los distintos pacientes, indicando la relevancia de la variabilidad genética interindividual en la etiopatogenia de la HCC. El diagnóstico de la fibrosis hepática se ha basado tradicionalmente en el estudio anatomopatológico de la biopsia. Esta se clasifica siguiendo la escala METAVIA, según la cual existen 5 estadios: fibrosis ligera o ausente (hígado sin fibrosis o fibrosis portal sin septos lobares, FO y Fl), fibrosis moderada (fibrosis portal con pocos septos, F2), fibrosis grave (numerosos septos incompletos con distorsión de la arquitectura hepática, pero sin cirrosis, F3), y cirrosis (F4). Dependiendo del estadio el pronóstico del paciente es mejor o peor, siendo el estadio de cirrosis (F4) el más grave. Sin embargo, esta técnica es invasiva, limitada por problemas de variabilidad debidos al tamaño de la muestra, interpretación subjetiva y difícil repetición periódica. Por estos motivos, se necesitan tests de diagnóstico no invasivos que puedan reemplazar la biopsia hepática, basados en pruebas indirectas más seguras para el paciente y de menor coste socioeconÓmico. Se han descrito distintos modelos que combinan factores de riesgo sérico, como niveles de alanino aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), colesterol, % de plaquetas, bilirrubina, etc. Estas escalas (Fibrotest, Forns, APRI, FIB-4, Hepascore, entre otras) permiten la predicción de estadios graves de fibrosis. La determinación de estos marcadores es sencilla y barata, no obstante estos índices solo permiten determinar el estadio de fibrosis hepática en el momento de realizar el diagnóstico, pero no permiten identificar factores pronósticos de riesgo inherentes al paciente como son los polimorfismos genéticos. 2
5 10 15 20 25 30 35 40 En WQ201 0/125220 se ha descrito la combinación de marcadores séricos, concretamente la metaloproteinasa 2 (MMP2) Y AST, con el recuento de plaquetas de una muestra para el diagnóstico del estadio de fibrosis hepática. Según los autores, la cuantificación de estos tres parámetros permite asociar el aumento de la concentración de MMP2 y AST, junto con el descenso del número de plaquetas, a un estadio de fibrosis mayor o igual a F2 o a un estadio de cirrosis. Se han realizado distintos estudios genéticos de uno o varios genes candidatos identificándose distintos polimorfismos asociados a fibrosis; no obstante, no se han realizado suficientes réplicas de estos estudios. Recientemente, se ha descrito una región en el gen IFNGR2, que incluye distintos polimorfismos (rs9976971, rsl0600672, rs2284553 y rS17882748) asociados a estadios de fibrosis hepática 3 y 4 (frente a un grupo comparado de pacientes con estadios de librosis O y 1). No obstante, este método no analiza la influencia de otras coyariables de riesgo asodadas a fibrosis ni establece un modelo predictiyo y no tiene en cuenta a los pacientes en estadios intermedios (Fquot;,2) (Nalpas, B. y cols. Gut 201 O, 59:1120·1126). De forma interesante, Huang y cols. (Hepatology 2007, 46:297·306, US2010/0216154Al y US2011/0129831 Al) describieron una escala de riesgo de cirrosis para pacientes con infección crónica por el VHC basado en un algoritmo procedente de la evaluación de siete polimorfismos de nucle6tido simple (SNPs) en diversos genes candidatos (AZIN 1, TLR4, TRPM5, AQP2, Y otros tres polimorfismos en los cromosomas 1,3 Y 15), mostrando la combinación de estos 7 marcadores un AUCROC (AUC, área bajo la curva; ROC, característica operativa del receptor) de 0,73, que se incrementaba hasta 0,76 si se incluían otras variables clínicas. Dicho método ha sido replicado posteriormente por otros autores para estimar la precisión predictiya de esos marcadores de progresión de la HCe a fibrosis hepática y cirrosis, tanto desde estadios leves como desde estadios moderados y graves. Sin embargo, en el primer estudio, solo se validaron estos resultados en varones con un AUCROC de 0,73, mientras que en el segundo estudio no observaron asociación predictiva de la escala basada en los marcadores descritos anteriormente con la eyolución clínica a cirrosis (Marcolongo, M. y cols. Hepatology 2009, 50(4):1038-44; Curio, T.M. y cols. Pharmacogenet Genomics 2011,21(12):851·60). En US2006/0024700 se describe un gran número de secuencias que corresponden a polimorfismos genéticos útiles en el pronóstico de la fibrosis hepática. Estos polimorfismos descritos son usados para asociarlos a un aumento o disminución del riesgo de sufrir fibrosis hepática. En W02008/076954 se describen compuestos heterociciicos inhibidores de la acetilación. Dichos compuestos realizan su función actuando sobre proteínas llamadas histona deacetilasas (HDAC), entre las que se incluye HDAC5. Por tanto, debido a la notable evolución de las enfermedades crónicas del hígado a cirrosis, sobretodo por infección del VHC, existe una clara necesidad de desarrollar métodos alternativos de diagnóstico y pronóstico no invasivos de cirrosis en pacientes con HCC y otras hepatopatías de distinta etiología con mayor capacidad predictiva. DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN En la presente invención se describe un método sencillo y preciso de pronóstico ylo diagnóstico de cirrosis en pacientes que padecen hepatitis C crónica (HCC). Dicho método requiere al menos un marcador genético y 45 puede incluir al menos una variable clínica, presentando altos niveles de AUCROC (AUC, área bajo la curva; ROe, característica operativa del receptor), sensibilidad y especificidad. El método de pronóstico y diagnóstico de cirrosis en pacientes que padecen HCC de la invención es altamente predictivo, no es invasivo y además, es independiente del estatus del paciente. El marcador genético empleado 50 para evaluar el pronóstico solo requiere una única determinación a lo largo de la vida del paciente. La presente invención se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para el pronóstico y/o diagnóstico de cirrosis, caracterizado por la detección del polimorfismo genético rs368328 del gen HDAC5 o cualquiera de los que se encuentren en desequilibrio de ligamiento con él (r2lt;!O,8), en una muestra biológica 55 aislada de un sujeto que padece HCC. La invención se refiere también a métodos para el pronóstico y/o diagnóstico de cirrosis en sujetos con HCC, que comprenden la detección de al menos uno de dichos polimorfismos y la asociación de un genotipo concreto de dicho polimorfismo con un pronóstico y/o diagnóstico de cirrosis. La inclusión en el método de la determinación de la concentración de aspartato aminotransferasa (AST) permitiría diagnosticar cirrosis (Fquot;,4) con mayor precisión. 60 3
En la presente invención se muestran datos de asociación independiente y significativa del genotipo AJA del polimorfismo genético rs368328 del gen HDAC5 con la probabilidad de desarrollar cirrosis en pacientes infectados con virus de la hepatitis C (VHC). La presente invención muestra la utilidad de la determinación del polimorfismo genético rs368328 del gen HDAC5 como marcador para el pronóstico y/o diagnóstico de cirrosis. 5 En la presente invención se muestran resultados de la utilidad de los métodos de la invención en el pronóstico y/o diagnóstico de cirrosis. El polimorfismo rs368328 del gen HDAC5, se asocia de manera independiente y significativa con la probabilidad de desarrollar cirrosis, en pacientes infectados con el VHC (regresión logistica, p=0,047). 10 El polimorfismo genético rs368328 del gen HDAC5, número de referencia de la Sociedad de Variaciones Genómicas Humanas (quot;Human Genome Variation SocietyH, HGVS) NC_000017.10:g.42170289Ggt;A, NM_001015053.1 :c.645-115Cgt; T o NM_005474.4:c.642-115Cgt; T, o también denominado rs368328 se refiere a un SNP situado en la posición 42170289 del cromosoma 17 de Homo sapiens (número de acceso al GenBank (base de datos NCBI, National Genter for Biotechnology Information) de la secuencia del cromosoma 17 de 15 Horno sapiens: NT_Ol0783.15). El polimorfismo rs368328 se sitúa en un intrón del gen HDAC5. Los genotipos puede ser homocigoto de adeninas (AJA), heterocigoto adeninalguanina (AJG) u homocigoto de guanina (GJG). En la presente invención la presencia de al menos un alelo G en el polimorfismo rs368328 es protector, mientras que portar el genotipo AlA incrementa el riesgo de cirrosis. El gen HDAC5 se refiere a la secuencia de 20 polinucleótidos que codifica para la proteína denominada histona deacetilasa 5 (HDAC5) (descrita en NCBI con referencia: NC000017.1 0, NM 001015053 o NM 005474.4). Dado que el polimorfismo rs368328 presenta utilidad en el pronóstico y/o diagnóstico de la cirrosis, cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con él (es decir que se hereda en conjunto con él), 25 presentaría la misma capacidad. El polimorfismo rs368328 del gen HDAC5 se encuentra en desequilibrio de ligamiento con los polimorfismos rS454192, rs189050, rs228746 y rs228749 con un valor de hO,8 en la población Caucásica. Por lo tanto, cualquiera de estos SNPs puede estar asociado a cirrosis, ya que se heredan en bloque junto con el polimorfismo rs368328 (Tabla 1). Los genotipos asociados al incremento del riesgo de cada uno de estos polimorfismos en desequilibrio de ligamiento con el genotipo AJA del polimorfismo rs368328 30 son: genotipo G/G del polimorfismo genético rs454192; genotipo G/G del polimorfismo genético rs189050; genotipo G/G del polimorfismo genético rs228746; genotipo C/C del polimorfismo genético rs228749. Por todos estos motivos, un primer aspecto de la invención se refiere a un método in vi/ro de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico de cirrosis hepática caracterizado porque comprende la determinación 35 del genotipo de al menos un polimorfismo genético del gen HDAC5 seleccionado de la lista que comprende: rs368328, rs454192, rs189050, rs228746 y rs228749, en una muestra biológica aislada de un sujeto que padece HCC. En adelante nos referiremos a este método como el método primero de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención el polimorfismo es rs368328. 40 El término quot;in vitroquot; se refiere a que el método de la invención se realiza fuera del cuerpo del sujeto. El término ·diagnóst¡co~ en la presente invención se refiere al procedimiento por el cual se identifica si un sujeto, al que se le aplica el método de la invención, padece cirrosis. El término '·diagnósticoquot; también se refiere a la capacidad de determinar si sujetos previamente diagnosticados de fibrosis hepática han sufrido un 45 empeoramiento de la enfermedad, es decir, si dichos sujetos han desarrollado cirrosis a partir de un estadio de fibrosis ligera o moderada. En la presente invención se entiende por ·pronósticoquot; la capacidad de detectar pacientes o sujetos asintomáticos que presentan una alta probabilidad de desarrollar cirrosis, aún cuando en el momento del estudio no presenten 50 dicha patología. El término ·pronósticoquot; también se refiere a la capacidad de detectar sujetos previamente diagnosticados de fibrosis en estadios de fibrosis ligera o moderada con alta probabilidad de sufrir un empeoramiento de la enfermedad, es decir, de desarrollar cirrosis. Un modelo se considera predictivo cuando la AUCROC es mayor de 0,7. El AUCAOC se define como la 55 probabilidad de clasificar correctamente un par de individuos caso y control, seleccionados al azar de la población, mediante los resultados obtenidos al aplicarles el modelo matemático (combinación de variables asociadas independientemente a cirrosis). El AUCROC por convenio está comprendido entre 0,5 y 1: valores entre 0,5 y 0,7 indican una baja precisión del modelo, mientras que valores de AUCROC superiores a 0,7 se consideran altamente predictivos, más precisos cuanto más cercanos al valor 1. La sensibilidad de la prueba 60 diagnóstica es la probabilidad de obtener un resultado positivo cuando el individuo tiene la enfermedad. Mide su capacidad para detectar la característica estudiada cuando está presente. La especificidad de una prueba indica la probabilidad de obtener un resultado negativo cuando el individuo no tiene la enfermedad, en este caso cirrosis (Burgueño MJ et al. Med Clin (Barc) 1995, 104:661-670). 4
Se entiende por quot;fibrosis hepáticaquot; el acúmulo intrahepático de tejido conectivo fibroso que se origina a consecuencia de un proceso reparativo, reactivo o inflamatorio crónico del hígado, que conlleva la alteración estructural y funcional del parénquima hepático. 5 Los términos quot;cirrosis hepáticaquot; o quot;cirrosisquot; se refieren al acúmulo de fibras de matriz extracelular, por ejemplo colágeno, que sucede en las enfermedades hepáticas crónicas que provocan una alteración funcional y estructural en el hígado. Esta definición, en la presente invención corresponde al estadio F=4 según la escala METAVIR. La fibrosis hepática se clasifica siguiendo la escala METAVIR, según la cual existen 5 estadios: FO o fibrosis ausente, donde el hígado no presenta fibrosis; F1 o fibrosis ligera, se refiere a la fibrosis portal sin septos 10 lobares; F2 o fibrosis moderada, se refiere a la fibrosis portal con pocos septos; F3 o fibrosis grave, donde existen numerosos septos incompletos con distorsión de la arquitectura hepática pero sin cirrosis; y F4 fibrosis muy grave o cirrosis. Dependiendo del estadio el pronóstico del paciente es mejor o peor, siendo la cirrosis hepática (F4) el más grave. 15 En la presente invención quot;hepatitis C crónicaquot; (HCC) se refiere a la enfermedad hepática causada por infección del VHC que produce de forma general una inflamación crónica del hígado, que puede resultar en fibrosis hepática, cirrosis y carcinoma hepático (Yano, M. y cols. Hepat%gy 1996, 23:1334-1340. Brown, R.S. Nature 2005,436:973-978). 20 El término quot;polimorfismo genéticoquot; se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos de la cadena de ácido desoxirribonucleico (ADN) que tiene al menos una frecuencia del 1 % en los individuos de una población. Los polimorfismos genéticos pueden ser variaciones de uno o varios nucleótidos. Los polimorfismos de un solo nucleótido, quot;single nucleotide polymorphisnt o SNP, generalmente dan lugar a dos alelos. Los SNPs o polimorfismos pueden contener información sobre la variación de un solo polimorfismo o la información de un 25 haplotipo si son SNP etiquetas o quot;lagSNPquot;. 30 Haplotipo es una combinación de alelos de diferentes loci de un cromosoma que son trasmitidos juntos. Un haplotipo puede ser un locus, varios loci, o un cromosoma entero dependiendo del número de eventos de recombinación que han ocurrido entre un conjunto dado de loci. En la presente invención nos referimos a quot;haplotipo· como un conjunto de polimorfismos (SNPs) que se heredan en bloque con unas medidas de desequilibrio de ligamiento r'\0,8 y que se identifican mediante el genotipado de uno de los polimorfismos incluidos en dicho haplotipo. 35 quot;Desequilibrio del ligamiento· (LO del inglés quot;/inkage disequilibriumquot;) es la propiedad de algunos genes de no segregar de forma independiente, es decir, poseen una frecuencia de recombinación menor del 50%. Esto suele deberse a que los dos loci implicados se encuentran en el mismo cromosoma, lo que imposibilita su transferencia a la progenie de manera aleatoria con la separación de los cromosomas en anafase (Reich, D.E. y cols. Nature 2001,411 (6834):199-204). 40 quot;r2quot;es una medida del desequilibrio de ligamiento entre dos marcadores genéticos. Dos SNPs que no han sido separados por recombinación (LD total) muestran un f=l. En tal caso, genotipar ambos SNPs seria redundante (Pritchard, J.K. y Przeworski, M. Am J Hum Gene! 2001, 69(1):1-14). Por lo tanto, mediante los datos proporcionados por el Hapmap con un ,-22:0,8 seríamos capaces de ver prácticamente todos los SNPs de un 45 haplotipo mediante el genotipado de su tagSNP (de Bakker, P.1. y cols. Nalure Genetics 2005,37(11):1217-23). 50 Los términos quot;polinucleótidoquot;, quot;secuencia nucleotídicaquot;, quot;secuencia de nucleótidosquot;, quot;ácido nucleicoquot; y quot;oligonucleótidoquot; se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquimicamente modificados. Los términos quot;secuencia de aminoácidosquot; o quot;proteínaquot; se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquimicamente modificados. El término quot;residuoquot; corresponde a un aminoácido. 55 La detección del polimorfismo se puede realizar por cualquier método conocido por el experto en la materia para tal fin. Por ejemplo se puede realizar mediante kits de genotipado, secuenciación o mediante amplificación por PCA (reacción en cadena de la polimerasa) y posterior análisis con enzimas de restricción o mediante PCR a tiempo real. Los kits de genotipado pueden contener oligonucleótidos marcados con fluoróforos y puede requerir la hibridación de estos con una muestra biológica aislada de un sujeto. 60 El término quot;secuenciaciónquot;, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la determinación de los nucleótidos de un ácido nucleico molde y de su orden. El término quot;amplificaciónquot;, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al aumento del número de 5
copias de un ácido nucleico molde, donde ésta puede ser realizada utilizando sondas fluorescentes. En una realización preferida, la amplificación tiene lugar mediante PCR a tiempo real. El término quot;ácido nucleico moldequot; o ~moldequot;, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una 5 molécula de ácido nuc1eico de cadena simple o de doble cadena que va a ser amplificada o secuenciada. El aumento del número de copias de un ácido nucleico molde se realiza por síntesis de ADN complementario mediante unas condiciones que lo permitan. 10 las condiciones que permitan la síntesis de ADN complementario se refiere a las condiciones en las que puede tener lugar la incorporación de los nucleótidos a un ADN naciente mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde. las condiciones en las cuáles se realiza la secuenciación o la amplificación generalmente incluyen (a) poner en 15 contacto un ácido nucleico molde con una polimerasa en una mezcla que además comprende un cebador, un catión bivalente, (por ejemplo, Mg2+), y nucleótidos, generalmente, dNTPs y, al menos, un ddNTP, y (b) someter dicha mezcla a una temperatura suficiente para que la polimerasa inicie la incorporación de los nucleótidos al cebador mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde, y de lugar a una población de moléculas de ADN complementarlo de diferente tamaño. la separación de dicha población de moléculas de ADN 20 complementario, generalmente, mediante electroforesis, permite determinar la secuencia de nucleótidos. 25 30 El término quot;cebadorquot;, como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN cuando hibrida con el ácido nucleico molde. Preferiblemente, el cebador es un oligonucleótido de desoxirribosa. los cebadores pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, la clonación y restricción de secuencias apropiadas y la síntesis quimica directa. los cebadores pueden diseñarse para hibridar con secuencias específicas de nucleótidos en el ácido nucleico molde (cebadores específicos) o pueden ser sintetizados al azar (cebadores arbitrarios). El término quot;cebador específicoquot;, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un cebador cuya secuencia es complementaria a una secuencia específica de nucleótidos en el ácido nucleico molde que se quiere amplificar o secuenciar. 35 El término ·cebador arbitrarioquot; se refiere a un cebador cuya secuencia es sintetizada al azar y que se usa para iniciar la síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ácido nuc1eico molde que se quiere amplificar o secuenciar. Con frecuencia se emplea una población de distintos cebadores arbitrarios. El término quot;cebadores arbitrariosquot; se refiere a un conjunto de cebadores cuya secuencía es sintetizada al azar y que se usa para iniciar la síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ácido nucleico molde que se quiere amplificar o secuenciar. 40 El término quot;hibridaciónquot;, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al apareamiento de dos moléculas de ADN de cadena simple complementarias para dar una molécula de doble cadena. Preferiblemente, la complementariedad es del 100%. Esto es, en la región de complementariedad cada nucleótido de una de las dos moléculas de ácido nucleico puede formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido presente en la otra 45 molécula de ácido nucleico. Sin embargo, aquéllos con una experiencia normal en el campo reconocerán que dos moléculas de ácido nucleico que posean una región con complementariedad menor al 100% también pueden hibridar. El término quot;nucleótidoquot;, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a un molécula orgánica formada 50 por la unión covalente de una pentosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato. El término nucleótido incluye desoxirribonucleósidos trifosfato como, por ejemplo, pero sin limitarse, dATP, dCTP, dlTP, dUTP, dGTP, dTTP, o derivados de los mismos. El término nucleótido incluye también dideoxirribonucleósidos trifosfato (ddNTPs), como por ejemplo, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddlTP, ddTIP o derivados de los mismos. 55 De acuerdo con la presente invención un quot;nucleótidoquot; o un ·cebadorquot; puede ser marcado o etiquetado mediante técnicas bien conocidas en el estado de la técnica. Etiquetas detectables incluyen, por ejemplo, isótopos radiactivos, etiquetas fluorescentes, etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes o etiquetas enzimátlcas. 60 El término quot;muestra biológicaquot; en la presente invención se refiere a cualquier muestra que permita obtener ADN del individuo del que se ha obtenido dicha muestra, e incluye, pero sin limitarnos, tejidos ylo fluidos biológicos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. la muestra biológica podría ser, por ejemplo, pero sin limitarse, un tejido o una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, mucosa oral, lavado broncoalveolar, linfa o fluido ascítico. Dentro de las muestras biológicas una 6
5 de las que presenta mayor utilidad es mucosa oral ya que es de fácil obtención y no supone alteración alguna para el individuo. Por ello, preferentemente la muestra es sangre ylo mucosa oral, más preferentemente, sangre periférica ylo mucosa oral. Asimismo, la muestra biológica puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina. Se entiende por ·sujetoquot; aquel individuo susceptible de padecer cirrosis. Preferentemente el sujeto es un humano. Cualquiera de los métodos descritos en la presente invención, pueden comprender la determinación de otras 10 variables clínicas, como por ejemplo, aunque sin limitarse, edad, sexo, determinación de transaminasas como por ejemplo la aspartata aminotransferasa (AST, o también llamada transaminasa glutámico oxalacética (GOT), alanina aminotransferasa (ALT, o también denominada transaminasa glutámico pirúvica, GPT), recuento plaquetario, nivel de albumina, o la carga viral (preferentemente carga viral del VHC) en el caso de hepatopatías causadas por virus. 15 Una realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere al método donde además se determina la concentración de aspartato aminotransferasa (AST) en una muestra biológica aislada de un sujeto que padece HCC. 20 En la presente invención se ha observado que el valor predictivo del método de pronóstico ylo diagnóstico de fibrosis hepática caracterizado por la detección del polimorfismo rs368328 o cualquiera que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con él (,-2:lt;!;0,8), es mayor cuando se determina también la concentración de aspartato aminotransferasa (AST) en una muestra biológica del mismo sujeto al que se le realiza la determinación del genotipo del polimorfismo rs368328 o cualquiera que se encuentre en desequilibrio con él. 25 La aspartato aminotransferasa (AST), también llamada transaminasa glutámico oxalacética (GOT), es una enzima presente en el hígado así como en otros órganos como corazón y musculo esquelético (Numero de acceso al NCBI: NP _002070.1). 30 La detección de la AST se puede realizar por cualquier método conocido por el experto en la materia para tal fin, como por ejemplo mediante métodos validados (Bergmeyer, H.U. y cols. J Clin Chem Clin Biochem 1986, 24:497-510) o mediante análisis de sangre in vitro utilizando el kit Cobas® (Roche) acorde con la federación internacional de química clínica (IFCC). Brevemente, la técnica consiste en añadir a la muestra un tampón TRIS pH7,8, una enzima indicadora (malato deshidrogenasa o MOH), una coenzima (LOH) y alfa-cetoglutarato. La 35 enzima AST cataliza esta reacción de equilibrio: Ct-cetoglutarato + L-aspartato = L-glutamato + oxaloacetato La enzima AST cataliza esta reacción de equilibrio, el incremento de oxaloacetato se determina en la reacción 40 indicadora que es catalizada por la malalo-deshidrogenasa: oxaloacetato + NAOH + H' e:) L-malalo + NAO· NAOH se oxida a NAO'. La tasa de disminución de NAOH, que se mide fotométricamente, es directamente 45 proporcional a la tasa de formación de oxaloacetato y con ello, a la actividad de AST. En un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un mélodo in vitro para el diagnóstico ylo pronóstico de la cirrosis hepática de un sujeto que padece HCC que comprende las siguientes etapas: a. la determinación del genotipo en al menos un polimorfismo genético del gen HDAC5 seleccionado de la 50 lista que comprende: rs368328, rs454192, rs189050, rs228746 y rs228749, en una muestra biológica aislada de un sujeto que padece HCC, b. la asociación del genotipo AlA en el polimorfismo genético rs368328, del genotipo G/G en el polimorfismo genético rs454192, del genotipo G/G en el polimorfismo genético rs189050, del genotipo G/G en el polimorfismo genético rs228746, o del genotipo C/C en el polimorfismo genético rs228749, del 55 gen HOAC5 determinado en la etapa (a) a un diagnóstico ylo pronóstico de cirrosis hepática 60 Una realización preferida del segundo aspecto de la invención se refiere al método donde en el paso (b) el genotipo que se asocia a un diagnóstico ylo pronóstico de cirrosis hepática es el genotipo AJA del polimorfismo genético rs368328. Otra realización preferida del segundo aspecto de la invención se refiere al método que además comprende las siguientes etapas: c. la determinación de la concentración de AST en una muestra biológica aislada del mismo sujeto de la etapa (a), 7
d. la asociación de valores de concentración de AST superiores a 40 U/L a un diagnóstico y/o pronóstico de cirrosis hepática. Otra realización preferida del segundo aspecto de la invención se refiere al método donde la determinación de la 5 concentración de AST se realiza en la misma muestra biológica que la determinación del genotipo del polimorfismo del gen HOAC5. Preferiblemente la muestra biológica es sangre. Otra realización preferida del segundo aspecto de la invención se refiere al método donde la determinación de la concentración de AST se realiza en una muestra biológica distinta que la determinación del genotipo del 10 polimorfismo del gen HOAC5. Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al método donde la muestra biológica en la que se determina la concentración de AST es sangre y la muestra biológica en la que se determina el genotipo del polimorfismo del gen HOAC5 se selecciona de la lista que comprende un tejido o un fluido biológico. En una 15 realización aún más preferida, el tejido es mucosa oral. Otra realización preferida del segundo aspecto de la invención se refiere al método donde el fluido biológico se selecciona de entre sangre, plasma, suero y linfa. En una realización más preferida, el fluido biológico es sangre. 20 Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al método donde la determinación del genotipo se realiza mediante sondas de hibridación marcadas con fluoróforos. En la presente invención el término quot;sondasquot; se refiere a oligonucleótidos de un tamaño de entre 20 a 50 nucleótidos que hibridan con la secuencia de ADN que flanquea y/o contiene el polimorfismo de interés. Estas 25 sondas, suelen estar marcadas con algún fluoróforo que permita identificar el polimorfismo. La secuencia detectada en los ejemplos de la presente invención para la detección del polimorfismo genético 368328 es (SEO ID NO: 1) donde quot;rquot; en la posición 251 indica que puede ser [A/G], que es el polimorfismo rs368328 reconocido por sondas que hibridan por complementariedad de bases (TIC). En concreto para este 30 trabajo se han utilizado sondas del GoldenGate Genotyping Assay (1IIumina) en el que se utilizan para la detección de un polimorfismo de interés tres oligonucleótidos, dos de ellos (SEO ID NO:6 y SEO ID NO: 7) son especificos para cada uno de los posibles alelos del SNP (en este caso paso A ó G) e hibridan en sentido 5,' y el tercer oligonuc1eótido (SEO ID NO: 8) sirve como control de especificidad de locus e hibrida varias bases corriente abajo del polimorfismo (sentido 3'). Tras la hibridación se realiza una PCR que permite elongar la 35 secuencia deseada utilizando cebadores marcados con los fluoróforos Cy3 y Cy5. El producto de PCR se somete a una posterior hibridación en una matriz con soporte (placa) o array que permite la determinación del genotipo del sujeto. Otra alternativa es utilizar cebadores y sondas fluorescentes de hibridación en un termociclador a tiempo real 40 (por ejemplo LightCycler® de Roche). Estas sondas son oligonucleótidos que hibridan en la muestra de DNA, una marcada en su extremo 3' terminal (fluoróforo donador) y la otra marcada en su extremo 5' (fluoróforo aceptor) con el extremo 3'-hidroxilo bloqueado con un fosfato para evitar su extensión. Las sondas se localizan en la misma cadena sin solapar con los cebadores, cubriendo la secuencia en la que se encuentra la mutación. La detección de la mutación se produce por el fenómeno de transferencia de energía por resonancia de 45 fluorescencia (FRET), que se produce por la excitación de la fluoresceína cuya longitud de onda de emisión solapa con la de excitación del fluoróforo aceptor. Las curvas de disociación se basan en la aplicación de un gradiente de temperaturas creciente después de la peR para monitorizar la cinética de disociación de los fragmentos amplificados que han hibridado con las sondas. El híbrido formado entre sonda y ADN de tipo silvestre tendrá una estabilidad mayor que el formado entre la sonda y el ADN mutado, puesto que en este caso 50 la complementariedad no es absoluta. La mayor estabilidad de la unión entre la sonda y el AON silvestre se reflejará en una temperatura de disociación o quot;meltingquot; (Tm) superior. Las diferencias en la temperatura de disociación de los híbridos nos permitirá discriminar perfectamente entre el ADN de tipo silvestre y el de tipo mutado. 55 También se pueden utilizar sondas que utilizan la tecnologia Taqman. Este ensayo utiliza la actividad 5· nucleasa de la polimerasa junto con dos sondas (TaqMan) para discriminar entre los dos alelos de un SNP. Cada una de las sondas TaqMan son complementarias a los dos alelas de un SNP y cada una tiene un quot;quencherquot; en su extremo 3' y una molécula fluorescente en el extremo S'. Durante la fase de anillamiento-extensión de la PCR, la sonda se hibrida a los amplicones y la DNA polimerasa la rompe, lo que resulta en un incremento de la 60 fluorescencia debido a que el quot;quencherquot; ya no se encuentra en las proximidades. La fluorescencia se detecta utilizando el RealTime ASI PRISM® 7900 Sequence Detector. 8
Hay multitud de sistemas que permiten identificar SNPs mediante la utilización de sondas de hibridación acopladas a un fluoróforo que mediante una PCR a tiempo real permiten identificar los alelos de un SNP en la muestra de un paciente, como por ejemplo, aunque sin limitarse, LightSNP, Taqman, SnapShot o MLPA. 5 Otra realización preferida del segundo aspecto de la invención se refiere al método donde el sujeto es un humano. En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso de al menos un polimorfismo genético del gen HDAC5 seleccionado de la lista que comprende: rs368328, rs454192, rs189050, rs228746 y rs228749 como 10 marcador pronóstico de cirrosis hepática de un sujeto que padece HCC. En la presente invención, se entiende por quot;marcador pronósticoquot;, aquel polimorfismo que sirve como indicador de pronóstico de cirrosis. En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, el polimorfismo genético del gen HDAC5 es rs368328. En otra realización preferida del tercer aspecto de la invención, el polimorfismo se usa en combinación con la determinación de la concentración de AST. Preferiblemente, el sujeto que padece HCC es un humano. 15 20 Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de un kit que comprende sondas que permiten determinar el genotipo en al menos un polimorfismo genético del gen HDAC5 seleccionado de la lista que comprende: rs368328, rs454192, rs189050, rs228746 y rs228749 para la obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico de la cirrosis hepática en un sujeto que padece HCC. El polimorfismo rs454192 (AlG) del gen HDAC5 se localiza en la posición 251 de SEO ID NO: 2, y puede se A o G. El polimorfismo rs189050 [C/G] del gen HDAC5 se localiza en la posición 598 de SEa ID NO: 3, y puede se C o G. El polimorfismo rs228746 (AlG] del gen HDAC5 se localiza en la posición 861 de SEO ID NO: 4, y puede se A o G. El polimorfismo rs228749 (CIT) del gen HDAC5 se localiza en la posición 201 de SEa ID NO: 5, y puede 25 seAoG. En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, el kit comprende sondas que permiten determinar el polimorfismo genético rs368328 del gen HOAC5 para la obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico de la cirrosis hepática en un sujeto que padece HCC. Preferiblemente, el sujeto es un 30 humano. En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, el kit además comprende los elementos necesarios para determinar la concentración de AST. 35 En la presente descripción se entiende por ~elementos necesariosquot; para determinar la concentración de AST todos aquellos reactivos necesarios para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención descritos anteriormente en este documento (tampones, enzimas, coenzimas y sustratos). Por otro lado los kits pueden incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización (tubos de plásticos, placas, reactivos, etc). los kits pueden contener además otras moléculas, genes, proteínas o sondas de interés, 40 que sirvan como controles positivos y negativos. Preferiblemente, los kits comprenden además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. En general, el kit de la invención comprende todos aquellos reactivos necesarios para llevar a cabo el método de la invención como se ha descrito anteriormente. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, 45 tampones, enzimas, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, dNTPs, una sal magnésica, sondas, fluorocromos, agentes para prevenir la contaminación, etc. El kit puede contener además otras moléculas, genes, proteínas o sondas de interés, que sirvan como controles positivos y negativos; así como otrals parejals de cebadores para la amplificación de una o varias secuencias nucleotídicas control. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes 50 necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra quot;comprendequot; y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, 55 ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. 60 OESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1.-El polimorfismo rs368328 del gen HOAC5 se asocia con la cirrosis. Se muestran los resultados de 157 pacientes con HCC con fibrosis hepática leve, moderada o grave (FO-3, n=.143) y cirrosis (F:04, n:014). G, portadores de al menos un alelo G (guanina, n:084); AlA, portadores de los dos alelas A (adenina, n:073). 9
Figura 2.-AUROC de métodos pronóstico de cirrosis hepática. Se muestra la linea de referencia que representa el valor mínimo de AUCROC (0,5) y los resultados de la especificidad y sensibilidad de los métodos que incluyen la determinación de la concentración de AST y de la detección del polimorfismo genético rs368328 del gen HDAC5 por separado y en combinación. El poder predictivo de cada variable asociada significativamente 5 a AUCROC de cada una de las variables asociadas a cirrosis y de la combinación de variables asociadas a cirrosis de forma sinérgica. EJEMPLOS DE REALIZACiÓN 10 Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma. A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la utilidad del método de 15 la invención. Ejemplo 1: Métodos de diagnóstico y/o pronóstico de cirrosis. Pacientes: El grado de la fibrosis hepática se determinó mediante el estudio anatomopatológico del tejido 20 hepático (procedente de biopsia) y se clasificó el grado de fibrosis mediante la escala METAVIR. La biopsia se extrajo usando una aguja según la técnica de Menghini (HEPAFIX®). En la presente invención se dividió a los 185 pacientes estudiados en dos estadios: fibrosis moderada (F=0-3, n:165) y fibrosis grave (F:4, n:20). Materiales y métQdQs: la infección por VHC se confirmó mediante la detección de ARN viral en suero de los 25 pacientes, determinándose la carga viral y el genotipo viral usando el kit COBAS AMPLlCOR'Bgt; assay (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). El resto de parámetros clínicos analizados (AL T, AST y GGT) se determinaron en el laboratorio de rutina de nuestro centro como parte de la práctica clínica habitual del tratamiento y seguimiento de estos pacientes mediante métodos validados (Bergmeye~ H.U. y cols. J Clin Chem Clin Biochem 1986,24:497-510) para el diagnostico in vitro utilizando el kit Cobas (Roche) acorde con la 30 federación internacional de química clínica (IFCC). la detección de estos parámetros se realizó a partir de suero o plasma extraído de una muestra de sangre periférica. Se aisló una muestra de ADN, a partir de una muestra de sangre periférica recogida en un tubo de 10 mi anticoagulada con EDTA, utilizando el kit de extracción Magna Pure DNA Isolation kit'Bgt; (Roche Diagnosis, 35 Mannheim, Germany) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. la muestra de ADN se almacenó a -80gC hasta su uso. El genotipado de las muestras se realizó utilizando el kit IIlumina GoldenGate8 Genotyping Assay (1Ilumina Inc., San Diego, California, USA). En la presente invención se realizó un diseno del chip del ADN seleccionando 40 polimorfismos localizados en los 11 genes de las histonas deacetilasas_ Las secuencias de Jos genes que codifican para estas enzimas tienen los siguientes número de acceso (NCBI Reference Sequence): HDACl (NT_032977.9), HOAC2 (NT_025741.15), HDAC3 (NT_029289.11), HDAC4 (NT_022173.11), HOAC5 (NT_Ol0783.15), HDAC6 (NT_079573.4), HDAC7 (NT_029419.12), HOAC8 (NT_011669.17), HOAC9 (NT_007819.17), HDAC10 (NT_011526.7) y HDAC11 (NT_022517.18). los polimorfismos seleccionados para 45 este estudio eran en su mayoría taqSNPs (SNPs usados como marcadores de un haplotipo que incluyen en desequilibrio de ligamiento (LD) varios SNPs asociados, ~gt;0,8) que nos permiten analizar varios SNPs determinando un solo SNP, y que además presentaran una frecuencia del alelo minoritario superior al 5%. en la población caucásica. 50 En la Tabla 1 se recogen todos los SNPs que se encuentran en desequilibrio de ligamiento con un r2quot;'0,8 para el SNP rs368328 del gen HOAC5, descrito en el proyecto Hapmap para las distintas poblaciones (de Bakker, P.I. y cols. Nature Genetics 2005, 37(11 ):1217-23). Como se ha descrito arriba, el polimorfismo rs368328 del gen HDAC5 se localiza en la posición 251 de SEQ ID NO: 1; el polimorfismo rs454192 del gen HDAC5 se localiza en la posición 251 de SEO ID NO: 2; el polimorfismo rs189050 del gen HOAC5 se localiza en la posición 598 de 55 SEQ ID NO: 3; el polimorfismo rs228746 del gen HOAC5 se localiza en la posición 861 de SEO ID NO: 4; el polimorfismo rs228749 del gen HOAC5 se localiza en la posición 201 de SEQ ID NO: 5. 60 Tabla 1.-Listado de SNPs en desequilibrio de ligamiento (~gt;0.8) con el polimorfismo rs368328 del gen HDAC5 en la población Caucásica de referencia en el proyecto Hapmap. Todos están en intrones. 10
5 10 Secuencia Posición en Alelas NCBI cromosoma SNP (hebra +) 17 NT010783.15 42170289 rs368328 AlG NT010783.15 42171206 rs454192 AlG NT010783.15 42173252 rs189050 C/G NT010783.15 42173752 rs228746 AlG NT010783.15 42174570 rs228749 crr Alelos (hebra -) TIC TIC G/C TIC G/A Secuencia circundante SEO ID NO: 1 SEO ID NO: 2 SEO ID NO: 3 SEO ID NO: 4 SEO ID NO: 5 Tras el estudio de 27 polimorfismos genéticos localizados en 11 genes de las histonas deacetilasas (HOACs) hemos desarrollado un método basado en el valor predictivo del pOlimorfismo rs368328 de la variante genética del gen HDAC5, la cual se encuentra asociada significativamente al estadio de cirrosis (F:4) en 157 pacientes de HCC (tabla 2). Se han comparado con otros polimorfismos del mismo gen y otros genes de las HDACs, y los resultados indican que solo el genotipo AJA de este polimorfismo se asocia de forma independiente y significativa con la probabilidad de presentar cirrosis (F:4) en estos pacientes. El método es de alto valor predictivo cuando se combina la detección de este polimorfismo con la variable clínica AST. En la tabla 3 se recogen las variables clínicas analizadas en esta invención y su asociación estadística a estadio cirrótico. Tabla 2.-Análisis de regresión logística para HDAC. 11
rs2530223 G/G 59 (36,4%) IVG 76 (46,9%) IVA 27 (16,7%) HOAC4 rs485201 () G/G 66 (41%) IVG 77 (47,8%) IVA 18 (11,2%) rs895808 IVA 62 (39%) IVC 69 (43,4%) C/C 28 (17,6%) HOAC5 rs850857 G/G 48 (30,2%) IVG 73 (45,9%) IVA 38 (23,9%) rs368328 AlG-G/G 80 (55,9%) IVA 63 (44,1%) HOAC6 rs2075840W IVA 2(3,4%) IVG 18 (31,0%) G/G 38 (65,6%) rs2075840M IVA 14 (13,7'%) G/G 88 (86,3%) HOAC7 rs2408874 G/G 75 (52,1%) IVG 58 (40,3%) IVA 11 (7,6%) rs11831940 G/G 73 (45,1%) IVG 74 (45,7%) IVA 15 (9,3%) rs13632 G/G 83 {51 ,9%) IVG 64 (40%) IVA 13 (8,1%) HOAC8 rs1475091W IVA 33 (55%) IVG 23 (38,3'%) G/G 4 (6,7%) rs1475091 M IVA 75 (74,2%) G/G 26 (25,4%) rs5912136W C/G 23 (40,3%) G/G 34 (59,7%) rs5912136M G/G 104 rs3012653W IVA 16 (27,1%) IVC 25 (42,4%) 6 (31,6%) 13 (68,4%) ° ¡O%} 10 (52,6%) 8 (42,1%) 1 {5,3%) 12 (63,2%) 5 (26,3%) 2 (10,5%) 4 (20%) 8 (40%) 8(40%) 4 (28,6%) 10 (71,4%) O 1 (14,3%) 6 (85,7%) 3 (25%) 9 (75%) 10 (58,8%) 5 (29,4%) 2(11,8%) 7 (35%) 12 (60%) 1 (5%) 11 (57,9%) 6 (31,6%) 2 (10,5%) 5 (71,4%) 2 (28,6'%) O 9 (81,8%) 2 (18,2%) 2 (28,6%) 5(71,4%) 11 3 (37,5%) 4 (50%) 12 1 1,68 (0,60-4,69) 0,00 (O,OO-NA) 1 0,69 (0,26-1,84) 0,37 (0,04-3,06) 1 0,37 (0,12-1,12) 0,37 (0,08-1,76) 1 1,32 (0,38-4,61) 2,53 (0,71-9,03) 1 3,12 (0,95-11,1) 1 0,47 (0,06-3,75) 1,57 (0,41-6,04) 1 0,56 (O,12-2,73) 1 0,65 (0,21-2,00) 1,36 (0,26-7,06) 1 1,69 (0,63-4,54) 0,70 (0,08-6,08) 1 0,71 (0,25-2,02) 1,16 (0,23-5,84) 0,62 (0,13-2,89) 0,51 (0,11-2,39) 1 0,78 (0,35-1,76) 1,69 (0,30-9,47) NA 1,05 0,47 0,57 0,13 0,3 0,047 0,57 OA7 0,63 0,45 0,76 0,63 0,55 0,55 NA 0,66
5 10 15 c/c 18 (30,5%) rs3012653M AJA 55 (53,4%) C/C 48 (46,6%) HOAC9 rs801524 G/G 107 (65,6%) AJG 48 (29,4%) AJA 8 (4,9%) HOAC10 rs4838866 G/G 118 (73,3%) AJG 39 (24,2%) AJA 4 (2,5%) rs1555048 G/G 82 (51,2%) AJG 70 (43,8%) AJA 8(5%) rs34402301 G/G 136 (86,1%) AJG 21 (13,3%) AJA 1 (0,6%) rs2341111 G/G 80 (52,3%) G/e 65 (42,5%) C/C 8 (5,2%) HOAC11 rs2655217 G/G 54 (34,4%) AJG 73 (46,5%) AJA 30 (19,1%) rs1116048 G/G 103 (64%) AJG 51 (31,7%) AJA 7 (4,3%) rs2655218 G/G 50 (32,5%) AJG 73 (47,4%) AJA 31 (20,1%) , (12,5%) 7 (58.3%) 5(41,7%) 12 (60%) 7 (35%) 1 (5%) 14 (73,7%) 5 (26,3%) 0(0%) 7 (38,9%) 11 (61,1%) 0(0%) 16 (88,9%) 2 (11,1%) 0(0%) 7 (36,8%) 12 (63,2%) 0(0%) 5 (31,2%) 7 (43,8%) 4 (25%) 13 (68,4%) 5 (26.3%) 1 (5,3%) 5 (26,3%) 9 (47,4%) 5 (26,3%) (0,30-3,64) 0.65 (0,22-1,8?} 1 0,90 (0,49-1,66) 1 1,30 (0,48-3,51) 1 ,11 (0,13-9,69) 1 1,08 (0,37-3,19) 0,00 (O,OO-NA) 1,84 (0,68-5,00) 0,00 (O,OO-NA) 1 0,81 (0.17-3,78) 0,00 (O,OO-NA) 1 2,11 (0,79-5.67) 0,00 ¡O,OO-NA} 1 1,04 (0,31-3,44) 1,44 (0,36-5,77) 1 0,78 (0,26-2,30) 1,13 (0,13-9,95) 1 1,23 (0.39-3.90) 1,61 (0,43-6,03) 0,74 0,88 0,63 0.2 0,86 0,12 0,86 0,88 0,78 El polimorfismo rs368328 de la HOAC5 muestra asociación significativa con el estadio de cirrosis, tanto en el análisis univariante (Tabla 2 y Figura 1) como cuando se ajusta el análisis por otras variables clínicas (análisis multivariante tabla 3). El análisis de la regresión logística demostró que el genotipo NA del rs368328 (pquot;,O,05) estaba asodado a estadios de cirrosis (F=4). El análisis de regresión logística multivariante reflejó la asociación de la variable clínica AST con el riesgo de padecer cirrosis en HCC (Tabla 3). Para determinar el poder predictivo de cada variable independiente y su influencia (Figura 1) realizamos los siguientes modelos de regresión logística obteniendo sus correspondientes AUCROC, especificidad y sensibilidad (Tabla 4). Como se puede observar (Figura 2), el modelo que incluye las dos variables (AST y rs368328 del gen HOAC5) asociados independientemente a cirrosis (F=4), es el que muestra un valor predictivo (AUC=0,770) con una alta sensibilidad y especificidad (71% y 77% respectivamente). Tabla 3.-Análisis de regresión logística multivariante de los factores asociados a cirrosis. 13
5 Factores clinicos F:S3 F=4 OR (95%CI) P OR (95%CI) P GV1 125 (74%) 18 (90%) No 1 39 (26%) 2 (10%) 0,35 (0,08-1,60) 0,18 ns ns Edad s40 59 (36%) 8 (40%) (años) gt;40 105 (64%) 12 (60%) 0,84 (0,33-2,18) 0,72 ns ns Carga s600000 40 (24,3%9 7 (35%) viral basal gt;600000 124 13 (65%) 0,60 (0,22-1,60) 0,3 (75,7%) ns ns (IUfml) ALT s40 31 (18,7%) 4 (17,4%) basal 134 (U/L) gt;40 (81,3%) 19 (82,6%) 4,39 (0,57-34,10) 0,15 ns ns AST s40 72 (43,6%) 8 (40%) basal 10,75 (U/L) gt;40 93 (56,4%) 12 (60%) 6,96 (1 ,56-31 ,00) 0,01 (1,36-85,26) 0,025 GGT s30 57 (34,9%) 8 (40%) basal 106 (U/L) gt;30 (65,1%) 12 (60%) 4,84 (1,08-21,60) 0,039 ns ns HOAC5 NG-G/G 80 (55,9%) 4 (28,6%) 1 1 rs368328 3,12 3,38 AlA 63 (44,1%) 10(71,4%) (0,95-11,1) 0,047 (1,01-11,6) 0,05 Tabla 4.-Área bajo la curva de los distintos modelos de regresión logística. Variables AUC ICa195% Sensibilidad (%) Especificidad (%) AST 0,685 0,565-,0805 93 44 HDAC5 0,637 0,490-0,784 71 56 HDAC5 + AST 0,770 0,643-0,896 71 77 14