ES2421459B1 - Cebadores especiales para la reacción en cadena de la polimerasa - Google Patents

Abstract

Cebadores especiales para la reacción en cadena de la polimerasa.#La presente invención pertenece al campo de las técnicas de biología molecular, en particular al campo de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Más específicamente, se refiere a cebadores diseñados especialmente para la PCR y a la detección directa de una secuencia diana. Esto se consigue debido a su diseño especial y, más específicamente, a la presencia en el producto de amplificación obtenido, con el uso de dichos cebadores, de colas de cadena sencilla. Estas colas permiten la captura del producto de amplificación a un sustrato funcionalizado con sondas de captura y/o su detección sencilla con sondas informadoras.

Description

CEBADORES ESPECIALES PARA LA REACCiÓN EN CADENA DE LA POLlMERASA

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención pertenece al campo de las técnicas de biología molecular, en particular al campo de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Más específicamente, se refiere a cebadores diseñados especialmente para la PCR para la detección directa de secuencias diana amplificadas. Esto se consigue debido a su diseño especial y más específicamente a la presencia en los productos de amplificación obtenidos, con el uso de dichos cebadores, de colas de cadena sencilla. Estas colas permiten la captura del producto de amplificación a un sustrato funcionalizado con sondas de captura y/o su detección sencilla con sondas informadoras marcadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biologia molecular para amplificar una o varias copias de un segmento de ADN en varios órdenes de magnitud, generando miles de millones de copias de una secuencia de ADN particular.

Desarrollada en 1983 por Kary Mullis, la PCR es en la actualidad una técnica habitual y a menudo indispensable, usada en laboratorios de investigación médica y biológica para una variedad de aplicaciones. Éstas incluyen la clonación de AON para su secuenciación, filogenia basada en AON, o el análisis funcional de genes; el diagnóstico de enfermedades hereditarias; la identificación de huellas genéticas (usadas en ciencia forense y en pruebas de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.

El procedimiento se basa en ciclos térmicos, que consisten en ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento de la reacción para la desnaturalización del ADN y el procesamiento enzimático del ADN. Los cebadores (fragmentos cortos de AON), que contienen secuencias complementarias a la región diana, junto con una AON-polimerasa son componentes claves para permitir una amplificación selectiva y repetida. A medida que la PCR progresa, el propio AON generado se usa como molde para su replicación, poniendo en marcha una reacción en cadena en la que el molde de AON se amplifica exponencialmente. La PCR se puede modificar exhaustivamente para llevar a cabo una amplia variedad de manipulaciones genéticas. Casi todas las aplicaciones de la PCR emplean una AON-polimerasa térmicamente estable, tal como la Taq polimerasa. Esta AON-polimerasa ensambla enzimáticamente una nueva cadena de ADN a partir de bloques de construcción de ADN, los nucleótidos, usando ADN de cadena sencilla como molde y cebadores de AON, que son necesarios para la iniciación de la síntesis del ADN. La amplia mayoría de procedimientos de PCR usan ciclos térmicos, es decir, el calentamiento y enfriamiento alternado de la muestra de PCR hasta una serie de pasos de temperatura definidos. Estos pasos de los ciclos térmicos son necesarios, en primer lugar, para separar físicamente las dos cadenas de una doble hélice de ADN a una temperatura elevada en un proceso denominado desnaturalización del ADN. A continuación, a una temperatura más baja, mediante la ADN-polimerasa cada cadena se usa como molde en la síntesis del ADN para amplificar selectivamente el ADN diana. La selectividad de la PCR proviene del uso de cebadores que son complementarios a la región de ADN elegida para su amplificación en condiciones de ciclos térmicos específicos.

Se han desarrollado muchas variantes de la PCR realizando pequeñas modificaciones del protocolo de PCR estándar, o ajustando o variando diferentes elementos de la PCR tales como, por ejemplo, el tipo de polimerasa usada.

Además, diferentes variantes de la PCR resultan de la variación de los cebadores para la amplificación. Por ejemplo, una de dichas variantes conocidas consiste en la inclusión de colas en el extremo 5' del cebador. Normalmente, los cebadores son totalmente complementarios al extremo 3' de la secuencia diana. No obstante, la polimerasa es tolerante a desapareamientos más allá del extremo 3'. Los cebadores con cola incluyen secuencias no complementarias en sus extremos 5'. Un procedimiento habitual es colocar sitios de restricción en los extremos de estas colas, facilitando su posterior inserción en vectores de clonación.

La presencia de colas en el producto de amplificación de la PCR también puede ser interesante puesto que permite la captura directa mediante la hibridación del producto a un sustrato o superficie que tenga sondas complementarias en él. También permite la unión de sondas complementarias marcadas para una fácil detección del producto de amplificación.

El documento US 2004/0038194 describe un procedimiento para la amplificación por PCR en el que los cebadores contienen un agente de captura. El documento menciona que, entre otros, el agente de captura puede ser un grupo sulfhidrilo, biotina, un dominio de unión a celulosa o una secuencia de nucleótidos específica. Sin embargo, el documento no proporciona muchas indicaciones sobre el modo en el que se puede usar una secuencia de nucleótidos específica como agente de captura.

El documento US 2003/0215926 proporciona una idea general de un procedimiento para la obtención de AON de doble cadena con colas de cadena sencilla que comprende el uso de cebadores híbridos formados por AON en el extremo 3' y por ARN en el extremo 5'. El extremo de ADN en 3' es complementario a la secuencia diana y sirve como cebador para la amplificación. Una vez realizada la PCR con estos cebadores se obtiene un dúplex híbrido de AON-ARN que posteriormente se somete a digestión con ARNasa. De esta digestión resulta un dúplex de AON con una cola de cadena sencilla en cada extremo que se puede detectar inmovilizado con sondas adecuadas. En el documento US 2009/0203531 también se describe un enfoque similar.

Hayashi G. Y col. (Nucleic Acids Symposium Series, 2005, No 49: 261-262; ChemBio Chem, 2007, 8: 169-171; y Journal of Biotechnology (2008) 135: 157-160) sigue un enfoque completamente diferente que se basa en el uso de las propiedades especiales del ADN-L. Hayashi G. usa como cebador una quimera de ADN-D y ADN-L. El cebador comprende ADN-D en el extremo 3' y ADN-L en el extremo 5'. Durante la peR, la polimerasa detiene su amplificación en el límite entre el ADN-D y ADN-L, dejando al ADN-L en forma de cadenas sencillas en el producto de amplificación. A continuación el ADN-L se puede hibridar a sondas de ADN-L complementarias previamente inmovilizadas.

Los autores de la presente invención proporcionan cebadores diseñados especialmente, que contienen elementos diferentes unidos operativamente que permiten la generación de un producto de amplificación de la PCR de doble cadena con colas de cadena sencilla en uno o en ambos extremos del dúplex.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Esquema que representa un posible diseño del par de cebadores según la invención que comprenden tanto una secuencia de pesca como colas de captura e informadoras, respectivamente.

Figura 2: Esquema del ensayo de detección propuesto usando los pares de cebadores diseñados específicamente y detección electroquímica y/o espectrofotométrica.

Figura 3: A) Electroforesis en gel de la amplificación de una muestra positiva con los cebadores diseñados especiales en la que 1, 2, 3 Y 4 son el producto de la amplificación

de una muestra positiva usando el par de cebadores L 1 Y L2 Y el Control NT es el producto de la amplificación en ausencia de la muestra (molde). B) Electroforesis en gel de la muestra extraída y su comparación con el Marcador de pesos moleculares 200. El producto amplificado tiene una longitud de 240 pb que es consistente con lo esperado.

Figura 4: Prueba de concepto de la detección de AONds,dt (AON de doble cadena y doble cola) mediante ensayo ELONA. Control: Respuesta asociada a adsorción ¡nespecífica de la sonda informadora enzimática; Producto extraído de la PCR: Respuesta obtenida para el ADNds,dt extraído del producto de la PCR usando el kit de extracción PureLink Quick Gel Extraction Kit. ; Producto no extraído de la PCR: Respuesta obtenida para el mismo producto de la PCR antes de la extracción del ADNds,dt. Muestra de partida de la PCR diluida a 1 en 50.

Figura 5: Esquema de uno de los posibles enfoques contemplados para la limpieza de la muestra mediante la eliminación del cebador en exceso sin reaccionar usando perlas magnéticas.

Figura 6: Prueba de concepto de la viabilidad de la eliminación del cebador mediante pesca con perlas magnéticas. Control: Respuesta asociada a la adsorción inespecífica de la sonda informadora marcada enzimáticamente; PCR + imanes: Respuesta obtenida usando producto no purificado de la PCR después de su puesta en contacto con perlas magnéticas de estreptavidina no funcionalizadas; PCR sin pesca: Respuesta obtenida en presencia de cebadores en exceso; PCR + pesca: Respuesta obtenida usando el producto de la PCR después de la "pesca del cebador" mediante la pesca de perlas magnéticas de estreptavidina funcional izadas con la sonda (pesca realizada durante 60 minutos). En ambos experimentos se usó una concentración de 3330 I-lg/ml de perlas magnéticas. El AON se aisló de otros componentes de la PCR usando precipitación con etanol. El producto de la PCR se diluyó a 1 en 10 antes de la pesca; la muestra se diluyó adicionalmente a 1 en 6 antes de la detección.

Figura 7: Evaluación de los componentes de la PCR en cuanto a la eficiencia de la "pesca del cebador" . Control: Respuesta asociada a la adsorción inespecífica de la sonda informadora marcada enzimáticamente; PCR purificada: Respuesta obtenida en el producto de la PCR después de la purificación con etanol y antes de la "pesca del cebador". "Pesca" purificada: Respuesta obtenida en el producto de la PCR después de la purificación con etanol y de la "pesca del cebador". PCR no purificada: Respuesta obtenida en el producto de la PCR sin la purificación en etanol y antes de la "pesca del

cebador"; "Pesca" no purificada: Respuesta obtenida en el producto de la PCR sin la purificación en etanol y la "pesca" del cebador. La concentración de perlas magnéticas usadas en estos experimentos fue de 3330 I-Ig/ml y la "pesca del cebador" se llevó a cabo durante 60 minutos. El producto de la PCR se diluyó a 1 en 10 antes de la pesca; la muestra se diluyó adicionalmente a 1 en 6 antes de la detección.

Figura 8: Prueba de concepto de la detección electroquímica del producto real de AONds,dt de la PCR. La PCR se diluyó a 1 en 6 antes de la "pesca" con perlas magnéticas modificadas (200 I-Ig/ml).

Figura 9: Prueba de la especificidad de las secuencias de captura sobre la superficie.

Figura 10: Prueba de amplificación multiplex usando cebadores modificados y detección electroquímica directa.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

En aras de la claridad a continuación se definen algunos términos usados en el contexto de la invención:

El término "Cebador" es el elemento capaz de unirse a un extremo de la secuencia que se pretende amplificar, y que sirve como punto de partida para que la polimerasa comience la reacción amplificación. Un cebador con características especiales es el objeto principal de la invención. En este sentido, en el contexto de la invención, el cebador no sólo es el fragmento de ADN complementario a la secuencia diana y que permite el comienzo de la peR, sino que en su sentido más amplio también se refiere al cebador de la invención especialmente diseñado y que comprende una secuencia de acceso operativamente unida, opcionalmente una secuencia de pesca, un terminador de la amplificación de la PCR y una cola de captura informadora. El cebador de la invención tiene múltiples funciones debido a su diseño especial.

"PCR" significa reacción en cadena de la polimerasa.

"Operativamente unido" significa que los diferentes elementos que conforman el cebador especial de la invención están unidos en dirección 3'-5' en la secuencia específica reivindicada, a saber, secuencia de acceso/secuencia de pesca/terminador de la amplificación de la PCR/colas, para así ser operativos y desempeñar correctamente su función.

"Secuencia diana" es la secuencia que se pretende amplificar dentro de la muestra.

"Secuencia de acceso" es un elemento del cebador de la invención. Es la secuencia del cebador capaz de reconocer la secuencia diana y actuar como tal cebador para la reacción de PCR. Preferentemente es una secuencia de ADN.

"Oligonucleótido" es una secuencia de nucleótidos que tiene una longitud variable.

"Nucleótidos" son las unidades estructurales que forman el ADN y el ARN. Estas unidades estructurales están formadas por una base nitrogenada como adenina, guanina, cilosina, uracilo o timina, un monosacárido de cinco carbonos (ribosa o 2'-desoxirribosa), y un grupo fosfato.

"Secuencia de pesca" es otro elemento del cebador de la invención. Es una cadena corta de oligonucleótidos de al menos dos nucleótidos incluida dentro del cebador de la invención. Está destinada a eliminar el cebador en exceso (si fuese necesario) del medio de reacción mediante la hibridación a una sonda de pesca complementaria a la secuencia de pesca. Preferentemente es una secuencia de ADN.

"Sustrato" representa cualquier tipo de superficie sobre la cual se pueda inmovilizar una sonda, tal como una sonda de pesca o una sonda de captura. Por ejemplo, en el caso de una sonda de pesca el sustrato puede ser perlas magnéticas o cualquier otro elemento similar como cilindros, partículas, cables o superficies metálicas, inorgánicas o poliméricas de diferentes tamaños y geometrías. En el caso de una sonda de captura, el sustrato puede ser una placa de ELlSA o la superficie de un electrodo o cualquier otra superficie en la que se pueda llevar a cabo la detección directa.

"Terminador de la amplificación de la PCR" es otro de los elementos del cebador de la invención. Su función es bloquear la reacción de amplificación. La polimerasa detiene la reacción cuando llega al terminador. El terminador puede ser un terminador orgánico como cadenas hidrocarbonadas de entre 3 y 18 átomos de carbono, una cadena de hexaetilenglicol, trietilenglicol, polietilenglicol, propilo, 1',2'-didesoxirribosa o bases o ácidos nucleicos no naturales que no son reconocidos por la polimerasa tales como PNA, LNA, oligas Morfolina o ARN.

"Cola capturadora o de captura" es otro elemento del cebador de la invención. Está unida operativamente en 5' al terminador de la PCR y después de la reacción de PCR permanece como cadena sencilla de ácidos nucleicos que es capaz de hibridarse a una sonda de captura inmovilizada. Puede ser parte del cebador directo o inverso dentro del par de cebadores usados en la reacción de PCR.

"Cola informadora" es un elemento del cebador de la invención análogo a la cola de captura. Al igual que la cola de captura está unida operativamente al terminador de la PCR y después de la reacción de PCR permanece como cadena sencilla de ácidos nucleicos que es capaz de hibridarse a una sonda informadora. Puede ser parte del cebador directo o inverso dentro del par de cebadores usados en la reacción de peRo

"Producto de amplificación" es el producto obtenido en la reacción de PCR usando el cebador o el par de cebadores de la invención. Consta de un dúplex de ADN de doble cadena con una cola de cadena sencilla en un extremo (producto de amplificación de AONds,st) en caso de que sólo se use un único cebador de la invención en la reacción de PCR, o de un dúplex de ADN de doble cadena con una cola de cadena sencilla en ambos extremos (producto de amplificación de ADNds,dt) en el caso en el que se usen dos cebadores de la invención.

"Ácido nucleico" incluye tanto ácidos nucleicos naturales, como el ADN o el ARN, como ácidos nucleicos artificiales tales como PNA, GNA, LNA, BNA, TNA o ácidos nucleicos Morfolino.

"Cebador directo" es el cebador que se extiende en la PCR desde el codón de iniciación hacia el codón de detención del ADN molde.

"Cebador inverso" es el cebador que se extiende desde el codón de detención hacia el codón de iniciación del AON molde.

"Sonda de pesca" es una sonda de ácidos nucleicos diseñada para ser complementaria a la secuencia de pesca del cebador de la invención. Está previsto que se hibride a la secuencia de pesca para así separar el cebador en exceso sin reaccionar del producto de amplificación.

"Sonda de captura o capturadora" es una sonda de ácidos nucleicos diseñada para ser complementaria a la cola de captura del cebador de la invención. Está previsto que se hibride a la cola de captura para así inmovilizar (capturar) el producto de amplificación a un sustrato.

"Sonda informadora" es una sonda de ácidos nucleicos diseñada para ser complementaria a la cola informadora del cebador de la invención. Está previsto que se hibride a la cola informadora. La sonda informadora está marcada con cualquier medio que proporcione una señal detectable di recta o indirectamente a través de una reacción intermedia. El posible marcaje de la sonda informadora incluye, pero no está limitado a,

moléculas electroquímicas redox, enzimas capaces de producir una reacción detectable, fluoróforos, moléculas capaces de producir electroquimioluminiscencia, cambios en el color, quimioluminiscencia o fluorescencia, liposomas, partículas/cilindros metálicos, partículas/cilindros inorgánicos, partículas/cilindros poliméricos , partículas/cilindros

5 magnéticos, puntos cuánticos, dendrímeros, marcadores radiactivos.

Un primer aspecto de la invención se refiere a un cebador para la amplificación por PCR que comprende operativamente unidos en dirección 3'-5':

a. Una secuencia de acceso que consta de un oligonucleótido de 10-35

nucleótidos capaz de hibridarse específicamente al extremo 3' de la 10 secuencia que se pretende amplificar (secuencia diana),

b. Opcionalmente, una secuencia de pesca para la eliminación del cebador en exceso después de la reacción de PC R que consta de al menos 2 nucleótidos, la secuencia que está diseñada para hibridarse a una sonda (sonda de pesca), opcionalmente inmovilizada a un sustrato y que no

15 interacciona con la secuencia diana,

c.

Un terminador de la amplificación de la PCR,

d.

Una cola de captura o informadora para la hibridación del producto de amplificación resultante a una sonda opcionalmente inmovilizada sobre un sustrato o una sonda marcada, respectivamente (sonda de captura y sonda

20 informadora, respectivamente), que consta de un ácido nucleico con una secuencia con una longitud de al menos dos bases diseñado para su hibridación a dicha sonda opcionalmente inmovilizada sobre un sustrato o dicha sonda marcada.

El cebador de la invención está especialmente diseñado de manera que, una vez usado

25 en una amplificación por PCR de una secuencia diana, se obtiene un dúplex de ADN como producto de amplificación que comprende una cola de cadena sencilla (en el caso en el que se usa en la reacción un único cebador según la invención) o dos colas de cadena sencilla en cada extremo del dúplex (en el caso en el que se usa un par de cebadores que comprende dos cebadores según la invención). La presencia de estas

30 colas permite la captura del producto de la PCR sobre un sustrato tal como una placa de ELlSA, un biochip o un electrodo funcionalizado con secuencias homólogas (inversas y complementarias) a una de las colas (cola de captura) , y/o el marcaje de dicho dúplex de

ADN por hibridación de una sonda homóloga marcada (inversa y complementaria) a la segunda cola (cola informadora). La presencia de las colas de captura tiene la ventaja de que permite la captura directa mediante la hibridación del producto de amplificación sin necesidad de ninguna modificación y/o funcionalización. De manera similar, la cola informadora permite la detección directa del producto de amplificación sin un procesamiento complicado de la muestra.

El cebador de la invención comprende, operativamente unidos en la dirección 3'-5', una secuencia de acceso, una secuencia de pesca, un terminador de la amplificación de la PCR y una cola capturadora/informadora dependiendo de si la cola está destinada a ser capturada mediante la hibridación a un sustrato o si se usará para informar del producto resultante.

La secuencia de acceso es la parte del cebador capaz de reconocer e hibridarse al extremo 3' de la secuencia que se pretende amplificar, es decir, la secuencia diana. La secuencia de acceso es el elemento en donde la polimerasa comienza la amplificación usando la secuencia diana como molde. Es la parte activa del cebador como tal. La secuencia de acceso es un oligonucleótido de ADN de 10 a 35 nucleótidos.

La secuencia de pesca es una secuencia predeterminada de al menos 2 nucleótidos, y preferentemente de no menos de 15 nucleótidos, que tiene la función de permitir la eliminación del cebador sin reaccionar del medio de reacción después de que haya tenido lugar la amplificación de la PCR. La presencia de cebador en exceso en el producto de amplificación puede interferir en el resultado de la etapa de detección como se demuestra en los ejemplos (véase Figura 4). Así, puede ser deseable eliminarlo antes de llevar a cabo la detección. Puesto que la secuencia de pesca también se amplifica en la reacción de PCR, es fácil eliminar los cebadores no amplificados (es decir, los cebadores en exceso) y separarlos del producto de amplificación en el medio de reacción por hibridación a una sonda de pesca que puede estar inmovilizada sobre un sustrato tal como, por ejemplo, perlas magnéticas. Para la etapa de pesca se puede usar cualquier otro medio usado habitualmente por la persona experta en la materia. La secuencia de pesca es una secuencia opcional dentro de los cebadores de la invención, pero en formas de realización preferidas la secuencia de pesca está presente. En una forma de realización particular, la secuencia de pesca es una secuencia de ADN.

El terminador de la PCR es un elemento capaz de detener la actividad de la polimerasa. El terminador también actúa como espaciador entre parte del cebador que está sometido

a amplificación y su cola. En el contexto de la invención se puede usar cualquier elemento capaz de detener la reacción de la PCR, tal como, por ejemplo, hexaetilenglicol, trietilenglicol, propilo, 1',2'-didesoxirribosa o bases o ácidos nucleicos no naturales que no son reconocidos por la polimerasa, tales como PNA, LNA, oligos Morfolino o ARN. En una forma de realización preferida, el terminador de la PCR comprende cadenas hidrocarbonadas de 3 a 18 átomos de carbono (e3-e1S).

La parte final del cebador de la invención es la cola que, después de la amplificación, permanece como cadena sencilla en el extremo del dúplex de ADN que resulta de la reacción de PCR. La cola puede ser una cola de captura o una cola informadora dependiendo de si está destinada a la inmovilización (captura) del producto de amplificación de la PCR a un sustrato como una placa de ELlSA, un biochip o un electrodo o si está destinada a unirse a una sonda informadora homóloga para su detección. Las colas de captura e informadora se pueden conformar a partir de cualquier ácido nucleico ya sean ácidos nucleicos de origen natural tales como el ADN o el ARN o ácidos nucleicos artificiales tales como PNA, GNA, LNA, BNA, TNA o ácidos nucleicos Morfolino.

El cebador de la invención puede estar diseñado como cebador directo o inverso. Se puede usar en una reacción de PCR como un único cebador a utilizar en combinación con un cebador normal o se puede usar como par de cebadores que comprenden dos cebadores de la invención.

Este es, de hecho, el siguiente aspecto de la invención, a saber, un par de cebadores para la amplificación por PCR que consta de un cebador directo y un cebador inverso en donde uno o los dos son cebadores según la invención.

En una forma de realización particular de la invención, el cebador directo es un cebador según la presente invención y el cebador inverso es un cebador normal.

En otra forma de realización particular, el cebador inverso es un cebador según la invención y el cebador directo es un cebador normal.

En otra forma de realización particular adicional, y preferida, tanto el cebador directo como inverso para la amplificación por PCR son cebadores según la invención. En esta forma de realización, el cebador directo comprende una cola de captura y el cebador inverso comprende una cola informadora, o viceversa, el cebador directo comprende una cola informadora y el cebador inverso comprende una cola de captura.

Otro aspecto de la invención es el uso del cebador o par de cebadores según la invención. El cebador y/o el par de cebadores de la invención se usan para las reacciones de amplificación de la PCR. En una forma de realización particular, después del uso de los cebadores en la peR, el exceso de cebadores sin reaccionar se elimina y se separa del producto de amplificación mediante hibridación a una sonda de pesca, opcionalmente inmovilizada a un sustrato tal como perlas magnéticas, que comprende una secuencia capaz de hibridarse específicamente a la secuencia de pesca.

Un aspecto adicional de la invención es un producto de amplificación de la PCR que se puede obtener mediante el uso de al menos un cebador según la invención. El producto de amplificación de la PC R comprende un dúplex de AON con una cola de cadena sencilla correspondiente a la cola de captura o informadora presente en el cebador según la invención.

Otro aspecto relacionado de la invención es un producto de amplificación de la PCR que se puede obtener mediante el uso de un par de cebadores según la invención. La forma de realización preferida de la invención se refiere al producto de amplificación de la PCR obtenido mediante el uso de un par de cebadores compuesto de dos cebadores según la invención, este producto que comprende un dúplex de AON con dos colas de cadena sencilla, uno en cada extremo del dúplex, correspondientes a una cola de captura e informadora.

Un aspecto adicional de la invención es un grupo de dos o más pares de cebadores según la invención para una PCR multiplex. En una forma de realización particular, en el grupo de pares de cebadores, las colas de captura de cada uno de los pares de cebadores son diferentes entre sí y están diseñadas para ser individuales para cada secuencia de acceso, y las colas informadoras de cada uno de los pares de cebadores están diseñadas para ser comunes entre sí o individuales para cada secuencia de acceso.

Un aspecto final de la invención se refiere a un procedimiento para la detección de la presencia de una secuencia diana en una muestra biológica que comprende:

a) preparar sondas de captura capaces de hibridarse a la cola de captura del cebador según la invención o del par de cebadores según la invención, y/o sondas informadoras capaces de hibridarse a la cola informadora del cebador según la invención o del par de cebadores según la invención,

b) realización una amplificación por PCR con al menos un cebador según la invención o con un par de cebadores según la invención para obtener un producto de amplificación,

e) opcionalmente eliminar el cebador en exceso que permanece después de la amplificación por PCR de la etapa b) por hibridación a una sonda de pesca, opcionalmente inmovilizada a un sustrato, que comprende una secuencia capaz de hibridarse específicamente a la secuencia de pesca,

d) permitir la hibridación entre las sondas de captura y/o las sondas informadoras de la etapa a) con las colas de captura y/o las colas informadoras del producto de amplificación ,

e) delectar la presencia de hibridación entre las sondas de captura y/o las sondas informadoras de la etapa a) con las colas de captura y/o las colas informadoras del producto de amplificación, donde la presencia de dicha hibridación implica la presencia de la secuencia diana en la muestra y la no hibridación implica la ausencia de dicha secuencia diana en la muestra.

El proceso de la invención se puede implementar como un proceso continuo de amplificación y detección en un sistema que comprende operaciones unitarias de amplificación por PCR, separación/eliminación de cebadores en exceso mediante la hibridación de secuencias de pesca con sondas de pesca inmovilizadas y la detección mediante la hibridación de las colas de captura a sensores/biochips/substratos funcionalizados con sondas de captura y de colas informadoras a sondas informadoras marcadas.

En una forma de realización particular, el procedimiento de detección de la invención comprende las sondas de captura inmovilizadas a un sustrato que incluye placas de microtitulación, substratos de vidrio/polímero/silicio, biochips o electrodos.

En otra forma de realización particular, el procedimiento de detección de la invención comprende una sonda informadora con un marcador que incluye moléculas electroquímicas redox, enzimas capaces de producir una reacción detectable, f1uoróforos, moléculas capaces de producir electroquimioluminiscencia, quimioluminiscencia o fluorescencia, liposomas, partículas metálicas, partículas inorgánicas, puntos cuánticos, dendrímeros o marcadores radiactivos.

En el procedimiento de la invención, la naturaleza de las sondas de captura e informadora puede ser la de un ácido nucleico natural o sintético tal como AON, ARN, PNA, GNA, LNA, BNA, TNA o ácidos nucleicos Morfolino y mezclas de estos ácidos nucleicos.

En el procedimiento de la invención, la detección de la hibridación se lleva a cabo mediante cualquier medio adecuado para la detección, tal como por ejemplo, métodos electroquímicos, ópticos, gravimétricos, termométricos, magnéticos, micromecánicos, electroforesis y cromatografía de afinidad, entre otros.

Una forma de realización particular del procedimiento de la invención comprende una PCR mulliplex con un grupo de cebadores o pares de cebadores según la invención.

Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren la invención, pero no están destinados a limitarla.

EJEMPLOS

1. Los objetivos:

El objetivo de este trabajo es el desarrollo de un par de cebadores diseñados específicamente que permitirá la generación de AONds que porten, en cada extremo, una cola de AONss (AONds,dt) como se representa en la Figura 1.

Estas colas permitirán la captura/detección del AONds,dt según la aplicación deseada. En este trabajo de prueba de concepto las colas de ADNss se usarán para capturar el producto AONds,dt sobre placas de ELlSA y/o electrodos, seguido por la introducción de un marcador informador (en este caso específico una secuencia de AON complementaria a la de las colas de AONss unida a un marcador enzimático) y su detección; el ensayo completo se puede resumir como se observa en la Figura 2. El hecho de que se hayan usado ELlSA y detecciones electroquímicas en este trabajo de prueba de concepto no limita la aplicabilidad del procedimiento de amplificación propuesto a estos enfoques de detección, como será evidente para una persona experta. Esto se pOdría acoplar a cualquier tipo de plataforma de detección que suponga la captura del amplicón de AON sobre la superficie mediante la hibridación a una sonda inmovilizada sobre una superficie y, eventualmente, el marcaje del amplicón como por ejemplo; detección por resonancias de plasmones de superficie, detección basada en florescencia, detección basada en electroquimioluminiscencia o luminiscencia, biochips de AON, etc.

2. Resultados experimentales

2.1 Amplificación:

Descripción del par de cebadores

En la etapa de amplificación se ha usado el siguiente par de cebadores:

Cebador directo (L1): S'·cola de captura superficial/CS/Secuencia de pesca (18 bases de longitud)-Cebador (dtq-3-1) (21 bases de longitud) 3':

S' -GTTTTCCCAGTCACGA C-espaciador C8-CAGGAAACAGCTA TGACC-CGT GCGTCTCGTGAGCAGAAG-3' (SEQ ID NO 1)

Cebador inverso especial (L2): 5'-Cola informadora/CS/Cebador dtq-3-2 (19 bases de longitud)-3':

S'-TGTAAA ACGACGGCCAGT-espaciador C8-TGCAAGGTCGTGCGGAGCT-3' (SEQ ID NO 2)

En la que:

-

la cola de captura superficial y la cola informadora son las secuencias para las dos colas de AON usadas para facilitar la captura sobre la superficie del AONds,dt y la captura del marcador informador (en este ejemplo específico, una enzima) respectivamente.

-

ca es una modificación interna que contiene ocho grupos (CH2) que tiene la función de detener la reacción de la polimerasa.

-

La secuencia de pesca es la secuencia usada para capturar los cebadores directos sin reaccionar. La ausencia de una secuencia similar en el cebador inverso es debida al hecho de que, para la aplicación específica propuesta en este trabajo de prueba de concepto, el cebador inverso no generó ningún tipo de interferencia.

El par de cebadores usados en este trabajo de prueba de concepto se diseñó para amplificar los alelas 0081*02:01-*02:06 (lista de alelas basada en la publicación 3.3.0 de la base de datos de las secuencias del IMGT/HLA) de la región del MHC del cromosoma 6 involucrada en la predisposición a la enfermedad celiaca.

Protocolo de amplificación

La PCR se llevó a cabo usando un termociclador comercial (iCycler, Biorad) utilizando un

protocolo de 3 temperaturas y una subida de temperatura de 1 "C/segundo: -96"C 2 min -10 X 96<>C 15 segundos, 65<>C 60 segundos -20 x 96"C 15 segundos, 61 "C 50 segundos, 72"C 30 segundos -10"C 10 minutos. La amplificación de una muestra positiva (que contiene el DQ81*02:01-*02:06), utilizando

el par de cebadores diseñados específicamente, se llevó a cabo según el protocolo de PCR anteriormente mencionado y usando la siguiente composición de mezcla de la PCR -Cebador -L 1 400nM -Cebador -l2 400nM -"Ready PCR" (de Innotrain) 30 ~I -Axi Taq (de Innotrain) 0,8 ~I -Muestra 25-100 ng/pocillo

-ddH,O hasta 100 1-11 La eficacia de la amplificación se comprobó usando electroforesis en gel. La electroforesis en gel de la Figura 3A indicaba claramente que la presencia del terminador de la PCR y de las diferentes colas no evitaba que se produjese la amplificación. Además, el hecho de que, en el caso del control NT, no se registró ninguna amplificación, también demostraba que el nuevo grupo de cebadores mantenía su especificidad.

El tamaño esperado de la PCR era de 240 pb; con el fin de confirmar la identidad del amplicón, éste se extrajo del gel de la electroforesis usando el kit "PureLink Quick Gel Extraction Kit" (Invitrogens). El gel representado en la Figura 38 muestra claramente que los tamaños de los amplicones extraídos eran consistentes con los esperados.

2.2 Uso de AONds di en e/ ensavo de ELONA

Con el fin de confirmar la presencia de las dos colas en el producto de amplificación obtenido y de simular el enfoque de detección previsto (Figura 2) se usaron algunos productos de la PCR antes y después de la extracción (como en la sección 2.2) para realizar un "Ensayo de oligonucleótidos ligado a enzimas" (ELONA).

Preparación de las placas de ELONA:

Placas de ELlSA modificadas con maleimida se modificaron con una cadena corta de oligonucleótidos de 17 bases (sonda de captura) complementarias e inversas a la cola de captura superficial y modificada en su extremo 3' con un grupo TEG-SH que permite su inmovilización sobre las placas de ELONA

La secuencia informadora para el ensayo de sándwich final consistía en una cadena corta de oligonucleólidos de 18 bases (sonda informadora) complementarias e inversas de la cola de captura marcadora y modificada en su extremo 3' con una enzima peroxidasa de rábano (HRP) para permitir su detección calorimétrica.

Funcionalización de la placa y ensayo de ELONA:

1.

Inmovilización de la sonda de AON: la sonda de captura se inmovilizó a 3rC durante 2 horas en una disolución 250 nM en Na2HP04 100 mM, NaCI 150 mM y EDTA 10 mM a pH 7,2.

2.

Los pocillos se lavaron 3 veces con agua ultra pura para eliminar las sondas en exceso.

3.

Bloqueo: Se añadió mercaptohexanol (MCH) 10 mM en agua a cada pocillo y se incubó a 37"C durante 1 hora.

4.

Los pocillos se lavaron 3 veces con agua ultra pura.

5.

Hibridación: Las dianas de AONds,dt (muestra de PCR diluida a 1 en 50) en Tris 10 mM + NaCI1 M (pH 7,4) se incubaron durante 1 hora a 3r C.

6.

Los pocillo se lavaron 3 veces con tampón PBS Tween (Sigma Aldrich) para eliminar el exceso de ADN diana.

7.

Hibridación en sándwich: Se añadió la secuencia informadora marcada con enzima (sonda informadora) a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a 37"C.

8.

Los pocillos se lavaron 3 veces con tampón PBS Tween para eliminar el exceso de sonda informadora marcada con enzima.

9.

Se añadieron 100 ~I de sustrato TMB ELlSA a cada pocillo y se dejó reaccionar durante 15 minutos.

10.

A continuación se añadieron 50 ~I de H2S04 1 M a cada pocillo para

detener la reacción enzimática.

11. La señal se midió leyendo la absorbancia de la disolución en cada pocillo a 420 nm utilizando un lector de placas comercial.

En la Figura 4 se presentan los resultados obtenidos para este grupo de experimentos. De la Figura 4 es claro que el producto de amplificación obtenido (AONds,dt) utilizando el par de cebadores propuesto contiene las dos colas de ADNss que permiten su captura específica sobre la superficie y el marcaje que facilita su detección calorimétrica (ensayo de ELONA). La especificidad de la detección se confirma por la intensidad registrada para el experimento control (aproximadamente 10 veces inferior que la respuesta específica). En el ejemplo específico usado como prueba de concepto preliminar, la alta concentración de cebadores usada, junto con la baja eficiencia de la amplificación produjo un producto de la PCR con una gran cantidad de cebadores sin reaccionar que parecen competir con la cola durante el ensayo, haciendo necesaria la eliminación de estos cebadores en exceso antes de la detección del ADNds,dt.

Sin embargo, en una amplificación más eficiente (véase sección 2.5) no hubo necesidad de eliminar los cebadores sin reaccionar.

2.3 Eliminación de cebadores sin reaccionar (pesca de cebadores) usando perlas magnéticas (óptima)

Como ejemplo de escenario en el que es necesario eliminar el exceso de cebadores sin reaccionar, se llevó a cabo una amplificación, según un protocolo no optimizado y en presencia de una alta concentración de cebadores. Posteriormente, se diseñó un protocolo para la eliminación de los cebadores en exceso presentes en el producto de la PCR y se llevó a cabo capturando el exceso de cebadores sin reaccionar mediante su hibridación a sondas (sondas de pesca) inmovilizadas sobre perlas magnéticas modificadas con estreptavidina. Con el fin de conseguir esto, se incorporó una secuencia de pesca a los cebadores; las sondas de captura inmovilizadas sobre las perlas magnéticas eran oligonucleótidos de cadena corta (18 bases) inversas y complementarias al segmento de la secuencia de pesca de L 1. Es importante indicar que en el AONds,dt, esta secuencia es parte de la secuencia que forma parte del dúplex, y por tanto no es viable para la hibridación a las sondas inmovilizadas sobre las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Nos referimos a esta eliminación de los cebadores en exceso sin reaccionar como "pesca de cebadores".

En la Figura 5, se representa el enfoque propuesto para la purificación del producto de la PCR mediante la pesca de cebadores.

Las perlas usadas en este trabajo eran las Dynabeads Myone (Invitrogen), que se funcional izaron con la secuencia de pesca según el siguiente protocolo:

1.

Preparación de las perlas: Se lavaron 50 1-11 de perlas (concentración de partida: 10 mg/ml) tres veces con agua ultra pura.

2.

Modificación de las perlas: Se añadieron 100 !JI de sonda de pesca modificada con biotina (1 !-1M en Tris 10 mM pH 7,4 + NaCI 1 M + EDTA 1 mM) a las perlas magnéticas y se incubó durante 30 minutos con agitación suave.

3.

Las perlas magnéticas se recogieron mediante un campo magnético y se lavaron 3 veces con Tris 10 mM pH 7,4 + NaCI1 M + EDTA 1 mM.

La eliminación del exceso de cebadores sin reaccionar del producto de la PCR se llevó a cabo según el siguiente protocolo:

1.

Pesca: Las perlas modificadas con el oligonucleótido se mezclaron con 150 ¡..JI de producto de la PCR (100 nM aproximadamente) y se incubó durante 1 hora con agitación suave.

2.

Recolección del producto de la PCR: Las perlas con el exceso de cebadores sin reaccionar capturados se separaron usando un imán y se recogió el producto de la PCR sobrenadante y se usó para su análisis.

En este grupo de experimentos se implementó un segundo experimento control, junto con la evaluación de la adsorción inespecífica de la secuencia informadora marcada con enzima, que consistía en la repetición del protocolo de pesca pero con el uso de perlas magnéticas sin modificar.

Se evaluó el efecto de la pesca de cebadores sobre la detección por ELONA del producto de la PCR ADNds,dt según el protocolo del ensayo de ELONA descrito anteriormente (Figura 6). Como se puede observar en la Figura 6, la "pesca de cebadores" redujo eficazmente la interferencia de los cebadores sin reaccionar, que produjo una mejora significativa de la detección del ADNds,dt (PCR + pesca frente a PCR sin pesca).

Con el fin de evaluar la eficacia del "protocolo de pesca" descrito anteriormente en la limpieza del producto de la PCR real, se llevó a cabo la "pesca de cebadores" sobre alícuotas sin tratar y precipitadas en etanol del mismo producto de la PCR y se compararon los resultados del ELONA.

Como se puede observar en la Figura 7, la respuesta obtenida con el producto de la PCR y las muestras precipitadas con etanol fueron muy similares, lo que demuestra que los componentes del producto de la peR, por ejemplo, Taq, dNTPS, etc. no interfieren con la "pesca de cebadores" usando una sonda funcionalizada con perlas de estreptavidina.

2.4-Prueba de concepto usando defección electroquímica

Con el fin de demostrar la flexibilidad del protocolo de amplificación propuesto con estrategias de detección diferentes, se llevó a cabo la detección directa del ADNds,dt usando un proceso electroquímico en lugar de transducción óptica.

Se limpió una matriz de electrodos y se funcionalizó con sondas de ADN tioladas. Las sondas inmovilizadas sobre la superficie y las sondas informadoras eran análogas a las descritas previamente para los experimentos de ELON A.

Se diluyó el ADNds,dt (pescado usando 200 J.lg/ml de perlas magnéticas modificadas con oligonucleótidos) a 1 en 6 con PBS Tween, se puso en contacto con los electrodos y se dejó hibridar durante 90 minutos, y a continuación se lavó con PBS Tween. Posteriormente los electrodos se pusieron en contacto con una disolución 10 nM de la secuencia informadora marcada con enzima y se dejó hibridar durante 1 hora, y se volvió a lavar.

Por último se añadió el sustrato TMB y se dejó reaccionar durante 10 segundos aproximadamente, y se midió la respuesta usando un amperómetro de pulsos rápidos (Figura 8), y como se puede observar el ADNds,dt se detectó fácilmente usando transducción electroquímica.

2.5-Amplificación multiplexada usando cebadores modificados v detección

Se diseñaron cuatro pares de cebadores diferentes (tres pares para la identificación de los alelas deseados -la región DO del cromosoma 6 y un cuarto par para el control interno) según el enfoque del cebador específico de secuencia (CES).

Par de cebadores 3b: (específico para 00B1*02:01, *02:02, *02:04, *02:05, *02:06)

5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-espacíador C3-CGTGCGTCTCGTGAGCAGAAG-3' Dírecto (dlq-3-1) (SEQ ID NO 3)

5'-TGT AAAACGACGGCCAGT-espaciador C3-GGCTGTTCCAGTACTCGGCGG-3' Inverso (dtq-4-2) (SEQ ID NO 4)

Sonda específica 3b:

5'-GTCGTGACTGGGAAAAC-TEG-SH 3' (SEQ ID NO 5)

Par de cebadores 4y (especifico para: DQB1'02:01, '02:02, '02:04, '02:05, '02:06, '03:02, '03:07, '03:08, '03:11 , '03:18, '03:32, '06:29)

5'-AGCGGATAACAA TTTCACACAGGA-espaciador C3-AACGGGACGGAGCGCG TGCG TCT-3' Directo (dtq-4-3) (SEQ ID NO 6)

5'-TGT AAAACGACGGCCAGT-espaciador C3-GGCTGTTCCAGTACTCGGCGG-3' Inverso (dtq-4-2) (SEQ ID NO 7)

Sonda específica 4y:

5'-TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT-TEG-SH 3' (SEQ ID NO 8)

Par de cebadores 52: (específico para: DQA1*05:01 , "'05:05, ·05:08, *05:09)

5'-TGT AAAACGACGGCCAGT-espaciador C3-CACTGGGTCAGCCCAACA T-3' Directo (qa-5-3) (SEO ID NO 9)

5' -GTGTCCGACTTATGCCC-espaciador C3-TTGCAGTCA T AACTCTCCTCAGC-3' Inverso (qa-5-4) (SEQ ID NO 10)

Sonda específica 5z:

5' GGGCATAAGTCGGACAC-TEG-SH 3' (SEO ID NO 11)

Par de cebadores HGH: (control interno)

5'-TGT AAAACGACGGCCAGT-espaciador C3-GGGAGAGGCAGCGACCTGTA-3' Directo (HGH-F2) (SEQ ID NO 12)

5' -AGGCAGAA TCGACTCACCGCTA-espaciador C3-GGAGAGCAAGAGGCCAGCAC-3' Inverso (HGH-R2) (SEO ID NO 13)

Sonda específica HGH:

5' TAGCGGTGAGTCGATTCTGCC-TEG-SH 3' (SEQ ID NO 14)

Elemento de marcaje genérico:

5' ACTGGCCGTCGTTTTACA -HRP 3' (SEQ ID NO 15) Donde: La cola de marcaie genérica es la cola de AONss usada para la hibridación a la

secuencia informadora marcada con enzima y común para todos los pares de cebadores.

5 Las secuencias, específicas para cada amplicón, para la captura sobre la superficie de los productos de AONds,dt están en cursiva. En esta evaluación, la amplificación de las diferentes muestras se llevó a cabo según un

protocolo de termociclación optimizado.

-

Desnaturalización inicial: 1 minuto a 96°C 10 35 ciclos

-

Desnaturalización: 15 segundos a 96°C

-

Hibridación + Elongación: 50 segundos a 61 °C.

Las concentraciones de los cebadores y de otros componentes de la mezcla de

amplificación se listan en la tabla siguiente.

Oligo

Conc. final en la PCR*

dlq-3-1

1000 nM

dlq-4-2

1000 nM

dlq-4-3

300 nM

qa-5-3

400 nM

qa-5-4

400 nM

HGH-F2

150 nM

HGH-R2

150 nM

Componente de

Volumen/concentración

amplificación

usado

ddH,O

Añadir hasta 10 ~t

3x3 "ready PCR"

3 ~t

(Tampón para

PCR de tNNO-

TRAIN)

Molde de ADN

25-100 ng/pocillo

AxiT ag (T aq

0,08 ~I

polimerasa de

INNO-TRAIN)

La detección electroquímica se realizó de manera similar a la metodología presentada en

la sección previa, donde los oligonucleótidos cortos de trabajo, complementarios e

inversos a las cuatro colas de captura diferentes, se inmovilizaron sobre la superficie de

5 los electrodos de una matriz de electrodos.

En primer lugar, se llevó a cabo una demostración de la especificidad de las colas de captura sobre una superficie diseñadas con la detección electroquímica de los productos de AONds,dt obtenidos amplificando una muestra totalmente positiva con 4 pares de cebadores diferentes en un formato uniplex (Figura 9).

10 Por último, se demostró la posibilidad de obtener y detectar los diferentes productos de ADNds,dt necesarios en el formato de detección propuesto en un formato multiplex con la amplificación y el tipado de una serie de muestras reales y la comparación de los resultados del tipado con los obtenidos usando la técnica de tipado convencional (Figura 10)

15 En la tabla siguiente se presentan los resultados del tipado electroquímico usando el enfoque propuesto y su comparación con los resultados obtenidos en el enfoque de tipado convencional.

Muestra

TIPADO ELECTROQUIMICO TIPADO DE REFERENCIA

3b

4y 5z HGH 3b 4y 5z HGH

8087

+/ + + + + + + +

8092

- - - + - - - +

FRCBS 25

- + - +

FRCBS12

+ + - + + + - +

FRCBS 20

+ + + + + + + +

FRCBS31

- - - + - - - +

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1.-El cebador para la amplificación por PCR que comprende operativamente unidos en dirección 3'-5':

   a.

   Una secuencia de acceso que consta de un oligonucleótido de 10 a 35

   nucleótidos

   capaz de hibridarse específi cam ente al extremo 3' de la

   secuencia que se pretende amplificar,

   b.

   Opcionalmente, una secuencia de pesca para la eliminación del cebador en exceso después de la reacción de peR que consta de al menos 2 nucleólidos, la secuencia que está diseñada para hibridarse a una sonda, opcionalmente inmovilizada a un sustrato y que no interacciona con la secuencia diana,

   c.

   Un terminador de la amplificación de la PCR,

   d.

   Una cola de captura o informadora para la hibridación del producto de amplificación resultante a una sonda opcionalmente inmovilizada sobre un sustrato o una sonda marcada respectivamente, que consta de un ácido nucleico con una secuencia con una longitud de al menos dos bases diseñado para su hibridación a dicha sonda opcionalmente inmovilizada sobre un sustrato o dicha sonda marcada.

2. 2.-El cebador según la reivindicación 1, en el que la secuencia de acceso y la secuencia de pesca son dos secuencias de AON.
3. 3.-El cebador según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de pesca tiene no menos de 15 nucleótidos.
4. 4.-El cebador según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el terminador de la amplificación por PCR puede ser un terminador inorgánico como hexaetilenglicol, trietilenglicol, propilo, 1',2'-didesoxirribosa o bases o ácidos nucleicos no naturales que no son reconocidos por la polimerasa tales como PNA, LNA, oligos Morfolino o ARN.
5. 5.-El cebador según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cola de captura o informadora comprende un ácido nucleico seleccionado entre AON, PNA, oligos Morfolino o LNA y mezclas de estos ácidos nucleicos.
6. 6.-El cebador según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cebador

   es un cebador directo o inverso.
7. 7.-Par de cebadores para la amplificación por PCR que consta de un cebador directo y un cebador inverso, en el que uno o los dos son según las reivindicaciones 1 a 6.
8. 8.-Par de cebadores según la reivindicación 7, en el que el cebador directo comprende una cola de captura y el cebador inverso comprende una cola informadora o en el que el cebador directo comprende una cola informadora y el cebador inverso comprende una cola de captura.
9. 9.-Uso de un cebador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de un par de cebadores según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8 para llevar a cabo una amplificación por PCR.
10. 10.-Uso según la reivindicación 9, en el que, después de la reacción por PCR, los cebadores en exceso se eliminan y se separan del producto de amplificación mediante hibridación a una sonda de pesca, opcionalmente inmovilizada a un sustrato, que comprende una secuencia capaz de hibridarse específicamente a la secuencia de pesca.
11. 11.-Producto de la PCR que se puede obtener mediante el uso de al menos un cebador según la reivindicación 1 que consiste en un dúplex de AON con una cola de cadena sencilla correspondiente a la cola de captura o informadora presente en el cebador según la reivindicación 1.
12. 12.-Producto de la PCR que se puede obtener mediante el uso de un par de cebadores según la reivindicación 8, que comprende un dúplex de AON con dos colas de cadena sencilla en cada extremo del dúplex, correspondientes a la cola de captura y/o informadora del par de cebadores según la rei vindicación 8.
13. 13.-Un grupo de dos o más pares de cebadores según cualquiera de las reivindicaciones 7-8 para una PCR multiplex, en el que las colas de captura de cada uno de los pares de cebadores son diferentes entre sí y es tán diseñadas para ser individuales para cada secuencia de acceso, y en el que las colas informadoras de cada uno de los pares de cebadores están diseñadas para ser comunes entre si o individuales para cada secuencia de acceso.
14. 14.-Un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia diana en una muestra biológica que comprende:

    a) preparar sondas de captura capaces de hibridarse a la cola de captura del

    cebador según cualquiera <le las reivindicaciones 1 a 6 o del par de cebadores según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, y/o sondas informadoras capaces de hibridarse a la cola informadora del cebador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o del par de cebadores según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9,

    b) realizar una amplificación por PCR con al menos un cebador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o con un par de cebadores según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8 para obtener un producto de amplificación según las reivindicaciones 11 Ó 12 respectivamente,

    e) opcionalmente eliminar los cebadores en exceso que permanecen después de la amplificación por PCR de la etapa b) por medio de digestión enzimática

    o hibridación a una sonda de pesca, opcionalmente inmovilizada a un sustrato, que comprende una secuencia capaz de hibridarse específicamente a la secuencia de pesca,

    d) permitir la hibridación entre las sondas de captura y/o las sondas informadoras de la etapa a) con las colas de captura y/o las colas informadoras del producto de amplificación ,

    e) detectar la presencia de hibridación entre las sondas de captura y/o las sondas informadoras de la etapa a) con las colas de captura y/o las colas informadoras del producto de amplificación, donde la presencia de dicha hibridación implica la presencia de la secuencia específica en la muestra y la no hibridación implica la ausencia de dicha secuencia problema en la muestra.
15. 15.-Un procedimiento según la reivindicación 14, donde las sondas de captura están inmovilizadas a un sustrato.
16. 16.-Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 y 15, donde la sonda informadora comprende un marcador que incluye moléculas electroquímicas redox, enzimas capaces de producir una reacción detectable, fluoróforos, moléculas capaces de producir electroquimioluminiscencia, cambios de color, quimioluminiscencia o fluorescencia, liposomas, partículas/cilindros metálicos, partículas/cilindros inorgánicos, partículas/cilindros poliméricos, partículas/cilindros magnéticos, puntos cuánticos, dendrímeros, marcadores radiactivos.
17. 17.-Un procedimiento según las reivindicaciones 14 y 16, donde la sonda de captura y la

    sonda informadora pueden ser un ácido nucleico seleccionado entre ADN, PNA, oligos

    Morfolino, LNA o sus combinaciones.
18. 18.-Un procedimiento según cualquiera de las rei vindicaciones 14 a 17, donde la detección de la hibridación se lleva a cabo por medio de procedimientos electroquímicos, ópticos, gravimétricos, termométricos, magnéticos y micromecánicos.
19. 19.-Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 en el que la amplificación por PCR es una PCR multiplex y se lleva a cabo con un grupo de cebadores según la reivindicación 13.