USO DE ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR TRPA1 PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS A INFECCIONES BACTERIANASCAMPO DE LA INVENCIÓN5La presente invención se relaciona con el uso de ligandos antagonistasdelosreceptoresTRPA1 para la prevención y/o tratamiento de enfermedades ocasionadas por infecciones bacterianas o por exposición a endotoxinas bacterianas.ANTECEDENTES10Las infecciones bacterianas se acompañan de dolor somático o visceral que se atribuye a la sensibilización de los nociceptores como consecuencia de la activación de respuestas inflamatorias. La capacidad patógena de las bacterias gramnegativas, generalmente se asocia con ciertos componentes de su membrana externa, en particular, el lipopolisacárido (LPS), también conocido como endotoxina (Raetz C.yWhitfield C.,15Annu.Rev.Biochem., 2002,71,635–700). Cuando las bacterias son lisadas por las células del sistema inmunitario o por la acción de los antibióticos, el LPS se libera a nivel local y sistémico.El LPS puede inducir varias reacciones potencialmente letales, incluyendo una fuerte estimulación de la respuesta inmune (AkiraS. yTakedaK., Nat.Rev.Immunol.,2004,4, 20499-511;PoltorakA. y col., Science,1998,282, 2085-2088), la constricción de las vías respiratorias (Michel O. y col., Am.J.Respir.Crit.Care Med.,1996,154, 1641-1646) y una vasodilatación arterial que puede llevar a una severa caída en la presión arterial (LandryD. W.yOliverJ. A., N.Engl.J.Med,2001, 345, 588-595). Además, el LPS puede inducir síntomas de irritación y dolor que acompañan a muchas infecciones 25bacterianas tópicas y sistémicas. Cabe destacar que el dolor agudo y crónico es un síntoma muy frecuente en la meningitis, la pulpitis, el dolor de las heridas infectadas, cistitis bacteriana, la prostatitis crónica y el dolor abdominal crónico en el síndrome de intestino irritable post-infeccioso(Michel O. y col., Am.J.Respir.Crit.Care Med., 1996, 154, 1641-1646).30
Además, el LPS puede ser adquirido por la exposición al aire contaminado, polvo orgánico y el polvo en los hogares, lo que influye en la exacerbación de los síntomas del asma (Michel O. y col., Am.J.Respir.Crit.Care Med.,1996,154, 1641-1646). Incluso el humo de los cigarrillos contiene lipopolisacáridos, de los cuales aproximadamente el 1% persiste con capacidad bioactiva a la combustión, y se ha demostrado que fumar un 5paquete de cigarrillos diarios proporciona una dosis de LPS respirable que es comparable a los niveles de LPS que producen efectos adversos para la salud en trabajadores de la industria del algodón (Hasday y col.,Chest, 1999, 115,829-835).La exposición al LPS provoca una respuesta inflamatoria acompañada de hipersensibilidad de las vías respiratorias, por lo que el LPS del humo del cigarrillo podría contribuir a la 10etiología y/o exacerbación de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (Kharitonov y col.,Contrib. Microbiol., 2007,14, 83-100). Además, podría contribuir a la patogénesis de la bronquitis crónica que se desarrolla en fumadores activos y pasivos (Hasday y col., Chest, 1999, 115,829-835).Por otra parte, hay que señalar que los diferentes tipos de LPS y lípidos A son 15demasiado tóxicos para su uso como adyuvante en vacunas humanas y se han hecho numerosos intentos para detoxificar el LPS sin afectar a su capacidad inmunogénica. En este sentido, un derivado de LPS, MPL (lípido 3-O-descil-4’-monofosforilado), modificado a partir del LPS de la pared celular de la bacteria gram negativa Salmonella minnesota, se usa como adyuvante en vacunas humanas comercializadas, debido a que 20presenta una menor capacidad proinflamatoria (Mata –Haro et al.,Science,2007, 15, 316, 1628-32). Las dianas principales del LPS son las células presentadoras de antígeno (APC) del sistema inmune donde se activa el receptor tipo Toll 4 (TLR4). La activación del TLR4 supone la estimulación de una vía de señalización en APCs que es crítica para la 25liberación de citoquinas pro-inflamatorias (TNF-alfa, IL-1, IL-6). Estas citoquinas contribuyen a potenciar la respuesta inmune. Estudios recientes han documentado la expresión de TLR4 en neuronas (Wadachiy col.,J.Dent.Res.2006, 85, 49-53;Acostay col.,J.Neurosci.Res., 2008, 86,1077-86),pero hasta la fecha es una cuestión pendiente si el LPS puede provocar directamente la excitación de las fibras nerviosas 30aferentes, y en particular, de las neuronas nociceptoras.
Las neuronas nociceptoras reconocen estímulos mecánicos, térmicos y químicos que pueden resultar dañinos para el organismo. Por ello, los nociceptores son considerados como guardianes de la integridad tisular,y la nocicepcióncomo un mecanismo de seguridad esencial para la vida. A nivel molecular, los nociceptores poseen en sus terminales un conjunto de receptores proteicos que reconoceny transducen los 5estímulos nocivos de tipo físico (mecánicos, osmóticos y térmico) y químicos.Los canales TRP (Receptores de Potencial Transitorio) constituyen un familia de receptores nociceptoressubdivididos en 8 subfamilias: TRPC, TRPM, TRPV, TRPA, TRPP, TRPML, TRPN y TRPY. Estos receptores juegan un papel fundamental en la transducción de las distintas modalidades somatosensoriales en mamíferos, incluyendo 10lasensibilidad térmica, la recepción de feromonas, la regulación del tono vascular, la nocicepción y el dolor. Cada vez es más evidente que los canales TRP son muy importantes en la fisiología sensorial y que su alteración funcional, bien mediante mutaciones o por estímulos nocivos o factores pro-inflamatorios, conduce a estados patológicos en humanos.15En particular, el receptor TRPA1 es un canaliónicopermeable de calcio no selectivo que regula el potencial de membrana modulando el flujo de cationes, no solo de calcio, sino también de otros iones como el sodio. Como otros miembros de la familia, los canalesiónicosfuncionales de TRPA1 se forman a través de la tetramerización de 4 subunidades, cada uno conteniendo seis dominios transmembrana, un ciclo de poro 20entre el dominio transmembrana 5 (S5) y 6 (S6) y N-y C-términos intracelulares. TRPA1 es expresado en neuronas sensoriales y co-localizado con marcadores de dolor tales como TRPV1, péptido relacionado con el gen cacitonina y receptor de bradiquinina (Corey D.P. y col, Nature2004, 432, 723-730) En modelos de dolor, el bloqueo de la expresión de TRPA1 a través de antisentidos de gen específico ha evitado 25e invertidolahiperalgesia inducida por inflamación y daño a nervios (Obata, K. y col., Journal of Clinical Investigation, 2005, 115, 2393-2401). Además, el bloqueo de genes de TRPA1 altera la sensibilidad y evita lahipersensibilidad dolorosaevocada por bradiquinina (Kwan, K.Y. y col., Neuron2006, 50, 277-289). Colectivamente, estos datos sugieren que TRPA1 juega un papel importante en las funciones sensoriales y los 30estados de dolor.
Como un canaliónicode compuerta de ligando, TRPA1 puede ser activado a través de una variedad de estímulos, incluyendoelfrío nocivo, cationes de calcio intracelular, sustanciasendógenas (por ejemplo bradiquinina), productos naturales pungentes (por ejemplo isotiocianato de arilo, o AITC), irritantes ambientales (por ejemplo, acroleína), moléculasanfipáticas (por ejemplo, trinitrofenol y clorpromazina) y agentes 5farmacéuticos (por ejemplo, URB597). La bradiquinina activa TRPA1 indirectamente a través de la via de fosfolipasa C después de la unión de éstaa sus receptores. El trinitrofenol y la clorpromazina abren el canaliónicoTRPA1 induciendo una curvatura o crenación en la membrana de la bicapa lipídica (Xu, H. y col., Nat. Neurosci., 2006, 9, 628-635). Más recientemente, se ha mostrado que los agonistas de TRPA1 pueden 10directamente interactuarcon la proteína de canal. AITC y cinamaldehído modifican covalentemente varios residuos de cisteína y lisina localizados en el término N citoplásmico y activan dicho canal (Hinman, A. y col., Proceedings of the National Academy of Science USA, 2006, 103, 19564-19568). Además, el catión calcio intracelular se une a los dominios del extremo EF de término N y media la abertura del 15canal (Zurborg, S: y col., Nature Neuroscience, 2007, 10, 277-279).Todos estos hallazgos han revelado papeles fisiológicos potenciales de TRPA1, y también indican que la compuerta del canal iónico TRPA1 puede involucrar diferentes mecanismos y determinantes moleculares. De esta manera, la modulación de TRPA1 puede tener muchas aplicaciones industriales y terapéuticas. En particular,diversos 20antagonistas de TRPA1 han sido descritos en el estado de la técnica como fármacos potencialmente adecuados en el tratamiento del dolor nociceptivo y neuropático.Así, los documentos WO2009/089082,WO2009/147079 y WO2007/073505describenel uso dedistintos compuestos antagonistas de TRPA1 para el tratamiento deldolor, entre los que se menciona dolor crónico, dolor nociceptivo y dolor inflamatorio, así 25como de enfermedades pulmonares tales como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y constricción de bronquios. Por su parte, el documento US2010/0137259describe el uso de isopentenil pirofosfato como agente inhibidor de la actividad del receptor TRPA1 para el tratamiento del dolor. Dicho dolor resulta de la activación del TRPA1 por estímulos como baja temperatura, un estímulo inflamatorio, un estímulo 30mecánico, etc. La solicitud WO2007/098252hace referencia al uso de antagonistas en general de TRPA1 para el tratamiento de hiperalgesia, donde dichos antagonistas
bloquean específicamente la activación de TRPA1, suprimiendo o inhibiendo la quimiosensación, termosensación o mecanosensación nociva en un sujeto.Eid, S.R. y col. (Mol. Pain, 2008, 4, 48) muestranresultados del papel que juega el TRPA1 en los mecanismos responsables de la hipersensibilidad mecánica observada en modelos de dolor inflamatorio y neuropático, mediante la administración oral de HC-030031, un 5conocido antagonista del TRPA1.El documento de Kunkler y col. (Pain, 2011, 152(1), 38-44)hace referencia al papel del TRPA1 en procesos inflamatorios neurogénicos mediados por CGRP, un péptido liberado por estimulación de neuronas trigeminales junto con la sustancia P. En particular, se demuestra en modelos de ratones que conocidos agonistas de TRPA1 e irritantes medioambientales estimulan la liberación de 10CGRP de las neuronas trigeminales y que esta liberación queda bloqueada por HC-030031. Además, agonistas de TRPA1 aumentan también el flujo sanguíneo meníngeo tras su administración intranasal. La aplicación previa en venas durales de un antagonista de CGRP (CGRP 8-37) o la administración intranasal o dural de HC-030031 bloquea el aumento en el flujo sanguíneo inducido por irritantes 15medioambientales. Con ello demuestran que la activación del receptor TRPA1 mediante irritantes medioambientales estimula la liberación del CGRP y aumenta el flujo sanguíneo en el cerebro lo que contribuye a la aparición de dolores de cabeza.André E. y col. (J. Clin. Invest., 2008, 118(7), 2574-82) identificana los aldehídos α,β-insaturados presentes en el humo de los cigarros como inductores de la inflamación 20neurogénica de las vías respiratorias mediante la estimulación de TRPA1, sugiriendo el papel de este receptor en la patogénesis de las enfermedades inducidas por el humo del tabaco.En este sentido, Caceres AI. y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, 106(22), 9099-104)describenel papel del TRPA1 en la inflamación e hiperreactividad de las vías respiratorias en episodios de asma ocasionados por alérgenos y productos irritantes, 25y la capacidad del HC-030031 para inhibir la inflamación de eosinófilos y prevenir el desarrollo de la hiperreactividad de las vías respiratoriasEn el documentode Pozsgai y col. (Cardiovasc. Res., 2010, 87(4), 760-8)se describe cómo el TRPA1 media en la vasodilatación y puede ocasionar cambios en la presión sanguínea, evidenciando la relevancia patofisiológica del receptor TRPA1 en el sistema 30cardiovascular.
A pesar de los numerosos documentos que describen la utilidad terapéutica de los antagonistas de TRPA1,hasta la fecha no se ha descrito la capacidad de éstos para tratar enfermedades ocasionadas por infecciones bacterianas, en particular aquéllas producidas como consecuencia de la liberación de LPS a nivel local y sistémico.5BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNLos autores de la presente invenciónhan identificado al receptor TRPA1 como una nueva diana molecular de los efectos de los lipopolisacáridos (LPS) de las bacterias gramnegativas en el sistema nervioso periférico. Dichos efectos incluyen el incremento de la resistencia de las vías respiratorias, la vasodilatación de arterias y el dolor agudo e 10inflamatorio. Los resultados obtenidos indican que el LPS activa potencialmente el receptor TRPA1 y que este canal iónico mediaen gran parte la respuesta inducida por el LPS en neuronas nociceptoras.Estos resultados resultan de gran relevancia en el desarrollo de alternativas para el tratamiento del dolor agudo e inflamatorio asociado a las infecciones bacterianas y para 15el tratamiento de las enfermedades pulmonares asociadas a la exposición de endotoxinas.En particular, se han estudiado los efectos del LPS sobreel canal iónico TRPA1 de ratón y humano, sobreexpresado de forma heteróloga en la líneas celulares CHO (CHO-A1) y HEK293,encontrándose que la aplicación extracelular de LPS induce un aumento 20dosis-dependiente y reversible de la concentración de Ca2+en células que expresan mTRPA1. La estimulación del TRPA1 por LPS fue confirmada mediante la técnica electrofisiológica “patch clamp”, observándose que la aplicación delLPS aumenta significativamente la amplitud de las corrientes registradas en células CHO-A1.Además se ha estudiado el efecto del LPS sobre el canal iónico TRPA1 expresado de forma 25nativa en neuronas sensoriales primarias de los ganglios nodoso y trigémino.Con el fin de demostrar el papel del TRPA1 en los efectos causados por el LPS, se han efectuado ensayos in vivoy ex vivoque han puesto de manifiesto que el TRPA1 contribuye a los cambios funcionales en la ventilación pulmonar, a la vasodilatación de arterias mesentéricas y al dolor agudoe inflamatorio inducidos por LPS de E. coli.30
Se ha demostrado además que la administración de antagonistas del receptor TRPA1inhibe de forma significativa estos efectos. Por tanto, estos resultados han puesto de manifiesto la utilidad de loscompuestos antagonistas o inhibidores de la actividad del receptor TRPA1 para el tratamiento de enfermedades asociadas a infecciones bacterianas inducidas por LPS o a la exposición a endotoxinas bacterianas.5Así, la invención se dirige al uso de un inhibidor de TRPA1 o de un inhibidor de una variante funcionalmente equivalente de dicha proteína, en la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento o prevención de enfermedades o disfunciones producidas por infecciones bacterianas o por exposición a endotoxinas bacterianasEn una realización particular, dichas infecciones bacterianas son causadas por los 10lipopolisacáridos procedentes de la membrana externa de la bacteria Escherichia coli.DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURASFigura 1 . (A, B y C) Ejemplos de los efectos del LPS (10 µg/ml) sobre la [Ca2+]ien neuronasdisociadasde ganglio nodoso, y procedentes de ratones WT (A),Tlr4KO (B) 15y Trpa1KO (C). El cinamaldehído (CA, 100 µM) y la capsaicina (Caps, 100 nM) se aplicaron para identificar células que expresan TRPA1 y TRPV1, respectivamente. (D) Porcentaje de neuronas sensoriales del nodoso ytrigeminalesque responden al LPS (azul), CA (rojo), o ambos (púrpura).Las etiquetas ‘WT + HC’ y‘WT after HC’ se refieren a las respuestas del LPS (10 µg/ml) observadas en presencia de HC-030031, y 20tras interrumpir su aplicación,respectivamente. (E) Ejemplo del efecto del LPS sobre la frecuencia dedisparo de una fibra nociceptora polimodal de ratón. Calor (42ºC), frío (15ºC), LPS (200 µg/ml), MO (100 µM) ycapsaicina (5 µM) se aplicaron durante los periodos indicados con las correspondientes barras. (F) Frecuenciamediade disparo de fibras nociceptoras registradas en presencia del LPS o MO, normalizadas con respecto 25al valor medio registrado en control (* p < 0.05 y** p < 0.01, n = 11).Figura2. (A) Registro fluorimétrico de calcio intracelular,en el que semuestra el efecto del LPS sobre células CHO-A1.En este experimento, el 46 % de las células que expresan TRPA1 (sensibles a la aplicación de MO) respondieron al LPS (trazos negros, n = 25).Las células CHO-A1 que no respondieron al LPS (trazos azules, n = 29)30mostraron respuestas más pequeñas a MO. Las células que no respondieron a MO
(trazosrojos) tampoco respondieron al LPS (n = 12).Los trazos continuosrepresentan las medias y los trazos punteadosrepresentan las medias ±el correspondiente SEM. (B), Curva dosis-respuesta de los incrementos de[Ca2+]ievocados por el LPS (>80 células porcada punto).La curva sigmoidalrepresenta el ajuste a la ecuación deHill. (C) Curso temporal de la corriente mediada por TRPA1 enrespuesta a la aplicación de LPS y MO, 5monitorizada a -75 y +75 mV. Los puntos coloreados corresponden a los trazos de corriente mostradosen el panel derecho.(D) Valor promediode la amplitud máxima de las corrientes (normalizadas con respecto al control) durante la aplicación extracelular de LPS (20 µg/ml)sobre células CHO-A1 (n = 7)y células CHO control (mock, n = 6) (T= 25°C). (E) Columna a la izquierda, amplitud máxima de las corrientes mediadas 10por TRPA1 (normalizadas respecto de la corriente control) en presencia de 20 µg/ml de LPS (n = 4).En otra serie experimental, los efectos del LPS se evaluarontras la pre-aplicación de HC030031 (HC + LPS), después del lavado del HC030031 (LPS, wash HC) y la posterior aplicación de HC030031 (LPS + HC) (n = 5, T = 33°C).Las diferencias estadísticamente significativas se indican con un asterisco (p < 0.05)o dos 15asteriscos (p < 0.01). Figura 3.(A) Corrientes mediadas por TRPA1 en células CHO-A1 en respuesta a un protocolo de pulsos de voltaje en control y en presencia de LPS de E. coli.(20 µg/ml) (B) Valor promedio de la dependencia de voltaje delas corrientes de cola mediadas por TRPA1 y monitorizadas a -75 mV en control y en presencia de 20 µg/mldeLPS (n = 206). Los datos se normalizaron con respecto al valor obtenido a+ 175 mV en control.Las curvas representan el ajuste de los datos a una función de Boltzmann (C)Elevación media de[Ca2+]ien células CHO-A1en respuesta a trinitrofenol, LPS en solución controlyLPS en presencia de trinitrofenol.(D) Registro fluorimétrico dela[Ca2+]ique muestra el efecto dela aplicación extracelular de Lípido A sobre células CHO-A1.El 2536% de las células que expresan TRPA1 (sensibles a MO) respondieron al LípidoA (trazos negros, n = 50). Las células que expresan TRPA1 y fueron insensibles al LípidoA (trazos rojos, n = 87) mostraron respuestas más pequeñas a MO. Las células no transfectadas (trazos azules)no respondieron al LípidoA (n = 20).Los trazos continuosrepresentan las medias y los trazos punteadosrepresentan las medias ±el 30correspondiente SEM. (E) Elevación promediode la [Ca2+]ievocada por extractosde LPS de E. coli, S. marcescensy N. meningitidis(20 µg/ml) en células CHO-A1(n > 25
para cada trazo). (F) Amplitud promedio de la [Ca2+]ievocada por varios LPScon lípido A de diferente conformación en células CHO-A1 (n = 26-129).Figura 4.(A) Efectos de un aerosol de LPS (15 min, 100 µg/ml enHBSS) sobre el Penhen ratones WT (n = 6) yTrpa1KO (n = 6). Las líneas continuasrepresentan el valor promedio y las bandas coloreadas representan el correspondiente rango de 5promedio ± SEM. (B y C) Promedio de los incrementos relativosdela pausa inspiratoria(EIP) y de la pausa espiratoria (EEP) inducidos por el aerosol de LPS. (D) Resumen del efecto de una perfusión de LPS (100 µg/ml) sobre el diámetro de arterias mesentéricas de ratones WT y Trpa1KO en condición controlyenpresencia de HC-030031 (10 µM). Las arterias fueron pre-contraídas con el agonista beta adrenérgico 10fenilefrina(2 µM). (E) Resumen de los efectos de la inyección intraplantardeLPS (5 µg/µl in 10 µl) enla respuesta nociceptiva de ratonesWTyTrpa1KO con dos diferentes fondos genéticos.(F) Umbral de fuerza mecánica necesaria parala retirada de la pata en respuesta a estimulación mecánica, antes y después de la inyección intraplantar de LPS (5 µg/µl). (G) Correlación entre la inflamación producida en la pata 15por varios LPS de diferentes formas (azul yrojo para cilíndrico,y negro para cónico; n = 5-9)con la potencia de activación de TRPA1(estimada de la amplitud de la respuesta de Ca2+evocada en células CHO-A1; Fig. 3E).El triángulo vacío representa la inflamación inducida por el LPS deE. colien ratones Trpa1KO (n = 4). 20DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓNLos autores de la presente invención han encontrado de forma sorprendente que los lipopolisacáridos (LPS) presentes en bacterias gram negativas activan los receptores TRPA1 y que esta activación provoca un aumento dosis-dependiente y reversible de la concentración de Ca2+en células que expresan mTRPA1. Además, este efecto puede 25evitarse mediante el empleo de antagonistas delosreceptores TRPA1.Este hallazgo abre la posibilidad de terapias mejoradas para enfermedades ocasionadas por infecciones bacterianas o por exposición aendotoxinas bacterianas mediante el uso de inhibidores o antagonistas del receptor TRPA1.Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere al uso de un inhibidor deTRPA1 30o de un inhibidor de una variante funcionalmente equivalente de dicha proteína, en la
preparación de un medicamento dirigido al tratamiento o prevención de enfermedades o disfunciones producidas por infecciones bacterianas o por exposición a endotoxinas bacterianas.Alternativamente, la invención se relaciona con un inhibidor de TRPA1 o con un inhibidor de una variante funcionalmente equivalente de TRPA1 para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades o disfunciones producidas por infecciones 5bacterianas o por exposición a endotoxinas bacterianas. Alternativamente, la invención se relaciona con un método para el tratamiento o prevención de enfermedades o disfunciones producidas por infecciones bacterianas o por exposición a endotoxinas bacterianasque comprende la administración a un sujeto que la necesita de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor del 10receptor TRPA1 o de un inhibidor de una variante funcionalmente equivalente de TRPA1.Aunque puede tratarse una variedad de sujetos, se prefiere particularmente que el sujeto sea un ser humano.El término “TRPA1”, “receptor TRPA1”, “proteína TRPA1” y “canaliónicoTRPA1” 15se utilizan de forma indistinta en la presente invención. Dichos términos se refieren a un canaliónico permeable de calcio no selectivo, perteneciente a la familia de los receptores de potencial transitorio (TRP), que regula el paso de cationes como el calcio y el sodio a través de la membrana celular. La activación de este canal iónico permite el paso de los cationes extracelulares al citoplasmaa través del mismo, lo que conlleva la 20despolarización de la membrana celular de las neuronas sensoriales y contribuye de este modo a la generación de potenciales de acción que finalmente se transmiten al cerebro para reconocer, entre otros, el dolor.Como otros miembros de la familia, los canalesiónicosTRPA1 funcionales se forman a través de la tetramerización de 4 subunidades, cada uno conteniendo seis dominios 25transmembrana, un ciclo de poro entre el dominio transmembrana 5 (S5) y 6 (S6) y N-y C-términos intracelulares. Proteínas TRPA1 adecuadas para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos definida como SEQ ID NO:1,o un polipéptido equivalente o un fragmento bioactivo funcional delas mismas.El TRPA1 incluye también 30polipéptidos que mantienen una función del TRPA1 y comprenden: (i) toda o una porción de la secuencia de aminoácidos definido como SEQ ID NO:1; (ii) la secuencia
de aminoácidos definida como SEQ ID NO:1 con 1 a 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50,75 o más sustituciones de aminoácidos; (iii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia definida como SEQ ID NO:1; o (iv) fragmentos funcionales de la misma. Estos polipéptidos también incluyen homólogos, por ejemplo ortólogos y parálogos, de la secuencia 5definida como SEQ ID NO:1.El término “TRPA1” se refiere también a un ácido nucleico que codifica un polipéptidode la invención, por ejemplo, un ácido nucleico que comprende una secuencia consistente en, o sustancialmente consistente en, una secuencia polinucleótida definida como SEQ ID NO:2 que codifica parala proteína definida en el párrafo anterior. Tanto 10si se especifica de forma explícita o no en la presente invención, un experto en la materia entendería fácilmente si TRPA1 se refiere a un ácido nucleico o a una proteína.Asimismo, la invención contemplael uso de inhibidores de variantes funcionalmente equivalentes de dichas proteínas. Por “variante funcionalmente equivalente” se entiende todos aquellos polipéptidos derivados de la secuencia de TRPA1mediante 15modificación, inserción y/o deleción de uno omás aminoácidos, siempre y cuando se mantenga sustancialmente la función de la proteína TRPA1. Variantes funcionalmente equivalentes de TRPA1incluyen aquellas que muestran al menos un 25%, al menos 40%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de 20identidad de secuencia con respecto a las secuencias de TRPA1indicadas anteriormente. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo BLAST (Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 251990; 215(3):403-10). El expertoen la materia entenderá que las secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en esta descripción pueden estar modificadas químicamente, por ejemplo, mediante modificaciones químicas que son fisiológicamente relevantes, tales como, fosforilaciones, acetilaciones, etc.Tal como se usa en el presente documento, los términos “tratar”, “tratamiento” y “de 30tratamiento” se refieren a la mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad que resulta de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de
la composición de la invención o una preparación farmacéutica que comprende la misma, a un sujeto que necesita dicho tratamiento. Por tanto, “tratamiento” tal como se usa en el presente documento cubre cualquier tratamiento de una enfermedad, un trastorno o un estado de un mamífero, particularmente un ser humano, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad o el estado se produzca en un sujeto que puede estar 5predispuesto a la enfermedad o el estado pero no se ha diagnosticado aún que la/lo tiene; (b) inhibir la enfermedad o el estado, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad o el estado, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o el estado o la mejora de uno o más síntomas de la enfermedad o el estado. La población de sujetos tratados mediante el método incluye un sujeto que padece el estado o la enfermedad 10indeseable, así como sujetos en riesgo de desarrollar el estado o la enfermedad. Por tanto, un experto en la técnica comprende que un tratamiento puede mejorar el estado del paciente, pero puede no ser una cura completa de la enfermedad. Tal como se usa en el presente documento, los términos “trastorno” y “enfermedad” se usan de manera intercambiable para referirse a un estado anómalo o patológico en un sujeto que altera 15funciones corporales y puede ser mortal.La frase “cantidad terapéuticamente eficaz” se usa en el presente documento para querer decir una cantidad suficiente para evitar y preferiblemente reducir en al menos aproximadamente el 25 por ciento, más preferiblemente en al menos el 50 por ciento, los más preferiblemente en al menos el 90 por ciento, un cambio clínicamente 20significativo en una característica de la patología. En lo que se refiere a la presente invención, la expresión también puede significaruna cantidad suficiente para mejorar o revertir uno o más síntomas asociados con una enfermedad ocasionada por una infección bacteriana o por exposición a endotoxinas bacterianas.En particular, una “cantidad terapéuticamente eficaz” del tratamiento puededar como resultado la mejora, 25reducción o eliminación de al menos uno de los siguientes síntomas: doloragudo, dolor crónico, dolor nociceptivo, dolor inflamatorio, constricción e inflamación de las vías respiratorias,e hipotensión asociada al shock séptico. Cuando se aplica el principio activo a un individuo, administrado solo, la expresión se refiere a ese principio solo. Cuando se aplica en una combinación, la expresión se refiere a cantidades combinadas 30de los principios activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya se administre en combinación, en serie o de manera simultánea
El término “sujeto” se refiere a un animal, preferiblemente un mamífero incluyendo un no primate (por ejemplo una vaca, un cerdo, un caballo, un gato, un perro, una rata o un ratón) y un primate (por ejemplo un mono o un ser humano). En una realización preferida, el sujeto es un perro. En una realización más preferida, el sujeto es un primate que, en una realización todavía más preferida, dicho primate es un ser humano.5Inhibidores del receptor TRPA1El término “inhibidor de TRPA1” o “inhibidores de una variante funcionalmente equivalente de TRPA1”, según se usa en la presente invención, se refiere a cualquier compuesto que puede provocar una disminución en la actividad del TRPA1, incluyendo 10aquellos compuestos que evitan la expresión del gen de TRPA1, lo que conduce a una reducción de los niveles de proteína o de ARNm de TRPA1,así como compuestos que inhiben TRPA1, lo que provoca una disminución en el flujo de cationes (Ca2+, Na+, etc.) a través del canal. En una realización particular, el inhibidor del receptor TRPA1es un antagonista o bloqueante de TRPA1. Un “antagonista o bloqueante de TRPA1” tal 15como se usa en el presente documento se refiere a cualquier compuestoque puede unirse a la molécula de TRPA1, o bien dentro del poro o bien en otra parte del receptor importante para la función del receptor tal como sussitios de fosforilación. La unión del compuesto bloquearía entonces el flujo de los cationes a través del receptor TRPA1. Si el bloqueante actúa como un antagonista, el compuesto bloquearía o reduciría una 20respuesta mediada por agonistas. La unión de antagonistas interrumpirá la interacción e inhibirá la función de un agonista o agonista inverso en receptores. Los antagonistas median sus efectos mediante la unión a un sitio activo o a sitios alostéricos en receptores o pueden interaccionar en sitios de unión únicos que normalmente no están implicados en la regulación biológica de la actividad del receptor. Laactividad 25antagonista puede ser reversible o irreversible dependiendo de la longevidad del complejo antagonista-receptor, que, a su vez, depende de la naturaleza de la unión de receptor y antagonista.Pueden identificarse compuestos que conducen a la inhibición delreceptor TRPA1usando ensayos convencionales tales como métodos para medir el flujo de cationes (por 30ejemplo Ca2+) a través del canal, usando métodos electrofisiológicos convencionales y ensayos de unión a receptor.
Otros métodos adecuados para la determinación de aquellos compuestos que son inhibidores de TRPA1comprenden tanto los métodos basados en la determinación de los niveles de TRPA1o de ARNm que codifica TRPA1.Así, en una forma de realización particular de la invención, los niveles de expresión de TRPA1se determinan midiendo los niveles de expresión del ARNm que codifican para 5la proteína TRPA1. Para este fin, la muestra biológica se puede tratar para disgregar de forma física o mecánica la estructura del tejido o célula, para liberar los componentes intracelulares en una solución acuosa u orgánica para preparar los ácidos nucleicos para análisis adicionales. Los ácidos nucleicos se extraen de la muestra mediante procedimientos conocidos para el experto en la materia y disponibles comercialmente. 10El ARNm se extrae después a partir de muestras congeladas o recientes mediante cualquiera de los métodos típicos en la técnica, por ejemplo Sambrook, J., et al., 2001 Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3. Preferiblemente, se aportan todos los avances conocidos para evitar la degradación del ARN durante el proceso de extracción.15La cantidad de ARNm que codifica TRPA1puede ser determinada, por ejemplo, mediante ensayos de hibridación ode amplificación que incluyen, sin limitación, ensayos de Northern y Southern Blot y reacción en cadena de polimerasa (PCR). Un método para la detección del ARNm específico para TRPA1incluye el uso de sondas que son capaces de hibridar específicamente con el ARNm o ADNc de TRPA1. La 20sonda puede ser un ADNc de cadena completa o un fragmento del mismo, como por ejemplo un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud capaz de hibridar con el ARNm o ADNc diana en condiciones estrictas. Preferiblemente, la detección del ARNm se lleva a cabo tras la amplificación del ADNc obtenido a partir del ARNm usando técnicas de amplificación conocidas, tales como la 25reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de polimerasa en tiempo real ("RT-PCR"), reacción en cadena de ligasa ("LCR"), replicación de secuencias auto-sostenida ("3SR") también conocida como amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos ("NASBA"), amplificación Q-B-Replicasa, amplificación por círculo rodante ("RCA"), amplificación mediada por transcripción ("TMA"), amplificación asistida por 30enlazadores ("LADA"), amplificación por desplazamiento múltiple ("MDA"), amplificación por desplazamiento de la cadena y del invasor ("SDA").
Por otro lado, el nivel de la proteína TRPA1puede ser cuantificado mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar dicha proteína en una muestra de un sujeto. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de dicha proteína pueden cuantificarse, por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a TRPA1(o a fragmentos de la misma que contengan un determinante antigénico) y la 5posterior cuantificación de los complejos formados. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Ejemplos ilustrativos de marcadores que se pueden utilizar incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes, etc. Existe una amplia variedad de ensayos conocidos que se 10pueden utilizar en la presente invención, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA (ELISA sandwich con doble 15anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar dicha proteína TRPA1, incluyentécnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando, etc. 20La inmunotransferencia se basa en la detección de proteínas previamente separadas mediante electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes e inmovilizadas en una membrana, generalmente nitrocelulosa o PVDF (Polivinilidenofluoruro), mediante incubación con un anticuerpo específico y un sistema de revelado (por ejemplo, quimioluminiscencia). El análisis mediante inmunofluorescencia requiere el uso de un 25anticuerpo específico parala proteína diana para el análisis de la expresión. El ELISA está basado en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con enzimas de modo que los conjugados formados entre el antígeno diana y el anticuerpo marcado dan como resultado la formación de complejos enzimáticamente activos. Puesto que uno de los componentes (el antígeno o el anticuerpo marcado) están inmovilizados sobre un 30soporte, los complejos antígeno-anticuerpo están inmovilizados sobre el soporte y de esta manera, se pueden detectar mediantela adición de un sustrato que es convertido por
la enzima en un producto que es detectable mediante, por ejemplo, espectrofotometría o fluorometría.Cuando se usa un método inmunológico, se puede usar cualquier anticuerpo o reactivo que se sabe se une a TRPA1con una afinidad suficientemente elevada como para detectar la cantidad de proteínas diana. Sin embargo, se prefiere el uso de un anticuerpo, 5por ejemplo sueros policlonales, sobrenadantes de hibridomas o anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, Fv, Fab, Fab’ y F(ab’)2, scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados.Por otra parte, la determinación de los niveles de expresión de proteínas se puede llevar a cabo mediante técnicas de inmunohistoquímica bien conocidas en el estado de la 10técnica. Para llevar a cabo la determinación mediante inmunohistoquímica, la muestra puede ser una muestra fresca, congelada y embebida en material plástico, o fresca embebida en parafina y fijada usando un agente protector del tipo de laformalina. Para la determinación inmunohistoquímica, la muestra se tiñe con un anticuerpo específico para TRPA1y se determina la cantidad de células que se han teñido y la intensidad de la 15tinción. Típicamente, se asigna a la muestra un valor indicativo de la expresión total y que se calcula en función de la frecuencia de células teñidas (valor que varía entre 0 y 4) y de la intensidad en cada una de las células teñidas (valor variable entre 0 y 4). Criterios típicos para asignar valores de expresión a las muestras se han descrito en detalle, por ejemplo, en Handbook of Immunohistochemistry e In Situ Hybridization in 20Human Carcinomas, M. Hayat Ed., 2004, Academic Press. Preferiblemente, la detección inmunohistoquímica se lleva a cabo en paralelo con muestras de células que sirven como marcador positivo y como marcador negativo. También es frecuente usar un control de fondo.En aquellos casos en los que se desee analizar un elevado número de muestras, es 25posible la utilización de formatos matriciales y/o procedimientos automatizados. En una forma de realización, es posible el uso de micromatrices de tejidos (Tissue Microarrays o TMA) que pueden ser obtenidos usando distintas técnicas. Las muestras que forman parte de las micromatrices pueden ser analizadas dedistinta manera incluyendo inmunohistoquímica, hibridación in situ, PCR in situ, análisis de ARN o de ADN, 30inspección morfológica y combinaciones de cualquiera de las anteriores. Métodos para el procesamiento de micromatrices de tejido han sido descritos,por ejemplo, en
Konenen, J. et al., (Nat. Med. 1987, 4:844-7). Las micromatrices de tejido se preparan a partir de núcleos cilíndricos de 0,6 a 2 mm de diámetro a partir de muestras de tejido embebidas en parafina y vueltas a embeber en un único bloque receptor. De esta forma, el tejido procedente de múltiples muestras puede ser insertado en un único bloque de parafina. 5Por “niveles de ARNm o proteína TRPA1disminuidos” en relación con los niveles de ARNm o proteína en una muestra de referencia, se entiende, según la presente invención, una disminución en los niveles de ARNm o proteína de al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más con respecto a la muestra control del 10sujeto. Por “niveles de referencia o control”, según la presente invención, se entienden los niveles de ARNm o proteína de TRPA1que presenta el sujeto antes de administrarle los inhibidores de TRPA1o al que se le administran inhibidores controles que no inhiben TRPA1.La determinación de las capacidades de inhibición o bloqueo del compuesto sobre la 15actividad biológica del receptor TRPA1puede detectarse usando los ensayos convencionales descritos anteriormente.Las capacidades de bloqueo pueden expresarse como la afinidad del inhibidor, la potencia del inhibidor o la especificidad de dicho inhibidor. La afinidad de un fármaco se calcula usando la constante de disociación en equilibrio 20del complejo receptor-fármaco, KD. KD es la razón de las constantes de velocidad para la reacción inversa (k2) y directa (k1) entre el fármaco y el receptor y el complejo fármaco-receptor. KD es también la concentración de fármaco a la que la ocupación del receptor es la mitad de la máxima. Los fármacoscon una KD alta (baja afinidad) se disocian rápidamente de los receptores; por el contrario, los fármacos con una KD baja 25(alta afinidad) se disocian lentamente de los receptores. La afinidad de un fármaco para un receptor describe la avidez con la que elfármaco se une al receptor (es decir, la KD). La afinidad puede medirse usando técnicas de unión en equilibrio tales como las descritas por Kessler et al. (Kessler M et al., Molecular Pharmacology enero de 1996 vol. 49 n.º 1:123-131).30
En una realización preferida, el inhibidor del receptor TRPA1tiene una KD de entre 0,001 nM y 10 M, preferiblemente entre 0,01 nM y 1 M, preferiblemente entre 0,01 nM y 100 nM, preferiblemente entre 0,1 nM y 10 nM.La potencia se refiere a la concentración (CE50) o dosis (DE50) de un fármaco requerida para producir el 50% del efecto máximo del fármaco. 5(http://www.ncgc.nih.gov/guidance/section3.html). CE50 es igual a KD cuando existe una relación lineal entre la ocupación y la respuesta. Con frecuencia, la amplificación de la señal se produce entre la respuesta y la ocupación del receptor, lo que da como resultado que la CE50 para una respuesta sea mucho menor (es decir, colocada a la izquierda en el eje de abscisade la curva de dosis-respuesta logarítmica) que la KD para 10la ocupación del receptor. La potencia depende tanto de la afinidad de un fármaco para su receptor, como de la eficacia con la que la interacción fármaco-receptor se acopla a la respuesta. La dosis de fármaco requerida para producir un efecto está inversamente relacionada con la potencia. En general, es importante una baja potencia sólo si da como resultado la necesidad de administrar el fármaco en grandes dosis que son poco 15prácticas. La DE50 parauna relación dosis-respuesta cuantal es la dosis a la que el 50% de individuos muestra el efecto cuantal especificado. En una realización preferida, el inhibidor del receptor TRPA1tiene una CI50 de entre 0,001 nM y 10 M, preferiblemente entre 0,01 nM y 1 M, preferiblemente entre 0,1 nM y 100 nM, preferiblemente entre 0,1 nM y 10 nM.20La eficacia (también denominada actividad intrínseca) de un fármaco es la capacidad del fármaco para provocar una respuesta cuando se une al receptor. En algunos tejidos, los agonistas que demuestran alta eficacia pueden dar como resultado un efecto máximo, incluso cuando sólo una pequeña fracción de los receptores está ocupada. La eficacia no está asociada a la potencia de un fármaco.25La concentración inhibidora media o CI50es la concentración de un antagonista que reduce una respuesta especificada hasta el 50% del efecto máximo posible.La especificidad superior de un compuesto por una molécula definida se refiere a la capacidad del compuesto para inhibir la molécula definida de una manera sustancialmente superior con respecto a la capacidad del compuesto para inhibir otra 30molécula.
En una realización preferida, el inhibidor es un inhibidor del receptor TRPA1selectivo. La expresión “inhibidor del receptor TRPA1selectivo” se refiere a un compuesto que puede inhibir la actividad del receptor TRPA1mientras que no inhibe de manera sustancial la actividad de al menos un receptor de la misma familia (talescomo los receptores de TRPC6, TRPV5, TRPV6, TRPM8, TRPV1, TRPV2, TRPV3 oTRPV4)) 5o una molécula de una familia diferente a la misma concentración de compuesto. Por ejemplo, un inhibidor del receptor TRPA1selectivo puede tener una actividad inhibidora del receptor TRPA1, que sea2, 5, 10, 20, 50, 100, 500 ó 1000 veces más potente que su actividad inhibidora de TRPV1. En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de un inhibidor del receptor TRPA1selectivo es al menos 5 veces, 10 veces 10o 20 veces más potente que la actividad inhibidora para otra molécula tal como TRPV1del compuesto. Inhibidores del receptor TRPA1a modo de ejemplo, no limitativos que pueden usarse en el tratamiento de una enfermedadocasionada por una infección bacteriana o por exposición a endotoxinas bacterianas,según la presente invención, se describenen la 15tabla I o en los documentos de patente WO2007/073505,WO2007/098252, WO2009/147079, US2010/0137259 yWO 2009089082A1.Tabla IInhibidores del receptor TRPA120
Otros ejemplos de inhibidores del receptor de TRPA1 son:Oxima de (1E, 3E)-1-(4-fluorofenil)-2-metilpent-1-en-3-onaO-metiloxima de (1E, 3E)-1-(4-fluorofenil)-2-metilpent-1-en-3-onaOxima de (1E, 3E)-1-(2-fluorofenil)-2-metilpent-1-en-3-ona5Oxima de (1E, 3E)-1-(4-fluorofenil)-2-metilhex-1-en-3-onaOxima de (1E, 3E)-1-(4-fluorofenil)-2,4,4-trimetilpent-1-en-3-onaOxima de (1E, 3E)-1-(4-fluorofenil)-2-metilhept-1-en-3-onaOxima de (1E, 3Z)-1-(4-fluorofenil)-2,4-dimetilpent-1-en-3-onaOxima de (1E, 3E)-1-(4-fluorofenil)-2,4-dimetilpent-1-en-3-ona10Oxima de (1E, 3E)-1-(3-cloro-4-fluorofenil)-2-metilpent-1-en-3-onaOxima de (1E, 3Z)-1-(4-fluorofenil)-2-metilpent-1-en-3-onaOxima de (1E, 3E)-4-(4-fluorofenil) but-3-en-2-onaOxima de (1E, 3E)-1-(4-fluorofenil) hex-1-en-3-ona
Oxima de (1E, 3E)-1-(4-fluorofenil) pent-1-en-3-onaOxima de (1E, 3Z)-1-(4-fluorofenil) pent-1-en-3-onaOxima de (1E, 3E)-1-(3,4-difluorofenil)-2-metilpent-1-en-3-onaOxima de (1E, 3E)-2-metil-1-(3,4,5-trifluorofenil)pent-1-en-3-onaEn una forma de realización particular, el inhibidor de TRPA1 se selecciona del grupo 5que consiste en 2-(1,3-dimetil-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahidro-7H-purin-7-il)-N-(4-isopropilfenil)acetamida (HC-030031), oxima de 4-(4-clorofenil)-3-metil-3-buten-2-ona (AP18), alcanfor, mentol, gadolinio, rojo de rutenio, gentamicina, amilorida y combinaciones de los mismos.De forma aún más preferente, el inhibidor de TRPA1 es 2-(1,3-dimetil-2,6-dioxo-101,2,3,6-tetrahidro-7H-purin-7-il)-N-(4-isopropilfenil)acetamida (HC-030031).En una realización particular de la presente invención, el inhibidor de TRPA1 se selecciona del grupo formado por unanticuerpo inhibidor que puede unirse específicamente e inhibir la actividad delreceptor TRPA1, una ribozima o una enzima de ADN específica para la secuencia delreceptor TRPA1, un ARN de interferencia 15específico para la secuencia del receptor TRPA1, un péptido inhibidor específico para elreceptor TRPA1y un ácido nucleico antisentido específico para elreceptor TRPA1.Anticuerpos inhibidores del receptor TRPA1Los anticuerpos contra un epítopo ubicado en o bien el poro o bien una parte externa de la molécula de TRPA1pueden inhibir de manera eficaz la función de esta proteína y, 20por tanto, pueden usarsecomo bloqueante o inhibidor en las composiciones de la presente invención. Por tanto, “anticuerpo inhibidor”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos que pueden inhibir al menos parcialmente las actividades biológicas del receptor TRPA1.La determinación de la capacidad inhibidora sobre la capacidad biológica del receptor 25TRPA1se detecta usando ensayos convencionales para medir el catión liberado a través del receptor TRPA1usando métodos descritos anteriormente. Anticuerpos inhibidores o fragmentos específicos para elreceptor TRPA1pueden estar disponibles fácilmente, o pueden producirse fácilmente usando técnicas de biología molecular convencionales. Por ejemplo, usando inmunógenos derivados de, por 30
ejemplo, una molécula de receptor TRPA1es posible obtener anticuerpos monoclonales o antisueros anti-proteína/anti-péptido usando protocolos convencionales (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed. por Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Un mamífero, tal como un ratón, un hámster o un conejo puede inmunizarse con una forma inmunogénica del péptido (por ejemplo, el receptor TRPA15o un fragmento antigénico del mismo, que puede provocar una respuesta de anticuerpos). Las técnicas para conferir inmunogenicidad en una proteína o un péptido, incluyendo la conjugación con portadores u otras técnicas, se conocen bien en la técnica. Puede administrarse una parte inmunogénica de un polipéptido en presencia de un adyuvante. Puede monitorizarse el avance de la inmunización mediante la detección 10de títulos de anticuerpo en plasma o suero. Pueden usarse ELISA convencional u otros inmunoensayos con el inmunógeno como antígeno para evaluar los niveles de anticuerpos. En una realización preferida, los anticuerpos que forman parte de las composiciones de la invención son inmunoespecíficos para determinantes antigénicos del receptor TRPA1(o una variante al menos un 80%, 85%, 90%, 95% o 98% idéntica 15al mismo). En cierta realización, los anticuerpos sujeto inmunoespecíficos noreaccionan de manera cruzada sustancialmente con una proteína relacionada con el receptor TRPA1no de vertebrado (tal como levadura). Por “no reacciona de manera cruzada sustancialmente”, quiere decirse que el anticuerpo tiene una afinidad de unión para una proteína no homóloga que es al menos un orden de magnitud, más 20preferiblemente al menos 2 órdenes de magnitud, e incluso más preferiblemente al menos 3 órdenes de magnitud menor que la afinidad de unión del anticuerpo para elreceptor TRPA1.Por tanto, el anticuerpo que puede usarse para los fines de la presente invención como anticuerpo inhibidor del receptor TRPA1, denominado a continuación en el presente 25documento el “anticuerpo de la invención”, puede unirse a un epítopo del receptor TRPA1; normalmente, se requieren al menos 6, 8, 10 ó 12 aminoácidos contiguos para formar un epítopo, sin embargo, los epítopos que implican aminoácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo, al menos 15, 25 ó 50 aminoácidos. La expresión “anticuerpo de la invención” incluye, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos 30monoclonales, fragmentos Fab y Fv de cadena sencilla (scFv) de los mismos, anticuerpos biespecíficos, heteroconjugados, anticuerpos humanos y humanizados.
Tales anticuerpos pueden producirse en una variedad de modos, incluyendo cultivos de hibridoma, expresión recombinante en cultivos de células de mamífero o bacterias y expresión recombinante en animales transgénicos. También pueden producirse anticuerpos seleccionando una secuencia de una biblioteca de secuencias expresadas en sistemas de presentación tales como fagos filamentosos, bacterias, levaduras o 5ribosomas. Existe una orientación abundante en la bibliografía para seleccionar una metodología de producción particular, por ejemplo, Chadd y Chamow, Curr. Opin. Biotechnol., 12:188-194 (2001). La elección de la metodología de fabricación depende de varios factores que incluyen la estructura de anticuerpo deseada, la importancia de restos de hidratos de carbono en los anticuerpos, la facilidadde cultivo y purificación, y 10los costes. Pueden generarse muchas estructuras de anticuerpos diferentes usando tecnología de expresión convencional, incluyendo anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y Fv, así como anticuerpos quiméricos que comprenden componentes de especies diferentes. Fragmentos de anticuerpo de tamaño pequeño, tales como fragmentos Fab y Fv, que no tienen 15funciones efectoras y que tienen actividad farmacocinética limitada pueden generarse enun sistema de expresión bacteriano. Fragmentos Fv de cadena sencilla muestran baja inmunogenicidad y se eliminan rápidamente de la sangre.Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos policlonales. Tales anticuerpos policlonales pueden producirse en un mamífero, tal como un mamífero no humano, por 20ejemplo, tras una o más inyecciones de un agente inmunizante y, preferiblemente, un adyuvante. Normalmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectará en el mamífero mediante una serie de inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir receptores TRPA1o fragmentos de los mismos o una proteína de fusión de los mismos o una célula que expresa receptores TRPA1. Tales 25proteínas, fragmentos o preparaciones se introducenen el mamífero no humano en presencia de un adyuvante apropiado. Otra forma de administración de un inmunógeno es como una proteína transmembrana en la superficie de una célula (métodos descritos en, por ejemplo, Spiller et al. J. Immunol. Methods, 224: 51-60 (1999)). Estas células pueden ser o bien células que expresan de manera natural el antígeno o bien en las que 30esta expresión puede obtenerse tras transfectar la célula con un constructo de ADN que contiene entre otras secuencias de ADN las que codifican para el antígeno, las
necesarias para su expresión suficiente en la célula. Este enfoque es posible no sólo cuando la membrana celular es el sitio natural en el que se expresa el antígeno sino que incluso una vez sintetizado el antígeno en la célula se dirige a esta ubicación mediante un péptido señal que se añade a la secuencia que codifica para el antígeno. Si el suero contiene anticuerpos policlonales frente a epítopos no deseados, los anticuerpos 5policlonales pueden purificarse mediante cromatografíade inmunoafinidad.Alternativamente, dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales. Pueden producirse anticuerpos monoclonales mediante hibridomas, en los que se inmuniza un ratón, un hámster u otro animal huésped apropiado con un agente inmunizante para provocar linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unirán 10específicamente al agente inmunizante, por ejemplo Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975). El agente inmunizante incluirá normalmente elreceptor TRPA1o un fragmento del mismo o una proteína de fusión del mismo y opcionalmente un portador o una preparación en bruto de proteínas que se ha enriquecido conelreceptor TRPA1o una célula que expresa cualquiera de dichas proteínas. Tales proteínas, fragmentos o 15preparacionesse introducen en el mamífero no humano en presencia de un adyuvante apropiado. Otra forma de administración de un inmunógeno es como una proteína transmembrana en la superficie de una célula (métodos descritos en, por ejemplo, Spiller et al. J. Immunol. Methods, 224: 51-60 (1999)). Estas células pueden ser cualquiera que exprese de manera natural el antígeno en su membrana celular o en la 20que esta expresión pueda obtenerse tras transfectar la célula con un constructo de ADN que contiene entre otras secuencias de ADN las que codifican para el antígeno, las necesarias para su expresión suficiente en la célula. Este enfoque es posible no sólo cuando la membrana celular es el sitio natural en el que se expresa el antígeno sino que incluso una vez sintetizado elantígeno en la célula se dirige a esta ubicación mediante 25un péptido señal que se añade a la secuencia que codifica para el antígeno. Alternativamente, pueden inmunizarse linfocitos in vitro. Generalmente, se usan células del bazo o células de ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamífero no humanos, o se usan linfocitos de sangre periférica (“PBL”) si se desean células de origen humano. Los linfocitos se fusionan con una línea de células inmortalizada usando un agente de 30fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para producir una célula de hibridoma. En general, las líneas de células inmortalizadas son células de mieloma de origen de rata,
ratón, bovino o humano. Las células de hibridoma se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de células no fusionadas, inmortalizadas. Se aíslan clones usando el método de dilución limitativa y el medio de cultivo (sobrenadante) en el que las células de hibridoma se cultivan puede someterse a ensayo para detectar la presencia de 5anticuerpos monoclonales dirigidos contra receptores TRPA1mediante técnicas convencionales, tales como mediante citometría de flujo o mediante inmunoprecipitación o mediante otro ensayo de unión in vitro, tal como RIA o ELISA. También pueden cultivarse clones in vivocomo tumores ascíticos en un animal.Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos 10mediante un clon de células de hibridoma se determina medianteinmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o mediante técnicas inmunofluorescentes tales como microscopía de fluorescencia o citometría de flujo. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de 15cultivo, fluido ascítico o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.Los anticuerpos monoclonales también pueden prepararse mediante métodos de ADN 20recombinante, tales como los descritos en el documento US 4.816.567. Puede aislarse ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales de la invención a partir de células de hibridoma específicas del receptor TRPA1y puede secuenciarse usando procedimientos convencionales, por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que pueden unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de 25anticuerpos murinos. Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede insertarse en un vector de expresión, que se transfecta entonces en células huésped tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otro modo proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las 30células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia que codifica para los dominios constantes de cadena pesada y
ligera murinos por las secuencias humanas homólogas, o uniendo covalentemente a la secuencia que codifica para las inmunoglobulinas toda o parte de la secuencia que codifica para un polipéptido distinto de inmunoglobulina. El polipéptido distinto de inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación de 5antígenos de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico. Otro método de generación de anticuerpos específicos, o fragmentos de anticuerpos, reactivos frente a una molécula diana es examinar bibliotecas de expresión que codifican para genes de inmunoglobulinas, o partes de los mismos, expresados en 10bacterias, levaduras, fagos filamentosos, ribosomas o subunidades ribosomales y otros sistemas de presentación. Estos métodos normalmente usan bibliotecas grandes de secuencias de anticuerpo o secuencias de fragmentos de anticuerpo obtenidas a partir de diversas fuentes tales como donantes sanos o pacientes o animales sanos o no. Estas secuencias se clonan y expresan en un sistema apropiado y se seleccionan por su 15afinidad de unión para el antígeno. Se han descrito diversos enfoques para seleccionar anticuerpos o fragmentos con propiedades deseadas por ejemplo neutralizantes, agonistas, etc. (Fernández, Curr. Op. Biotech., 15: 364-373 (2004);Schmidt, Eur. J. Biochem., 268: 1730-1738 (2001)). En una realización, también pueden producirse anticuerpos y fragmentos de anticuerpo característicos de hibridomas de la invención 20por medios recombinantes extrayendo ARN mensajero, construyendo una biblioteca de ADNc y seleccionando clones que codifican para segmentos de la molécula de anticuerpo.Los anticuerpos también pueden modificarse mediante ingeniería genética para alterar sus usos clínicos. Numerosos enfoques hacen uso de la biología molecular y de técnicas 25genéticas tal como el buen conocimiento de la genética y la estructura de las inmunoglobulinas para construir diferentes modificaciones de la molécula de inmunoglobulina con el objetivo de mejorar sus propiedades para usos clínicos u otros usos. Algunos de ellos tienden a reducir la inmunogenicidad de la molécula en la especie en la que debe usarse y la molécula resultante tiene una secuencia más 30homóloga con esta especie. Diversos métodos se han usado para obtener Acm de origen humano evitando los procedimientos no admisibles éticamente en seres humanos sanos.
En otros enfoques se reducen el peso y el tamaño moleculares por ejemplo con el fin de mejorar la distribución de la molécula al interior de tumores sólidos. Otras posibilidades son la conjugación en una molécula de dominios de unión para más de una molécula diana (anticuerpo biespecífico o también triespecífico, etc.) o la conjugación de un anticuerpo o un fragmento con otra molécula con la función deseada por ejemplo un 5agente tóxico, unahormona, un factor de crecimiento, un agente inmunomodulador (inmunosupresor o inmunoestimulante), un inhibidor del crecimiento celular, etc. En general todas las moléculas resultantes conservan casi un dominio variable de un anticuerpo, lo que proporciona la alta especificidad y afinidad características de la unión antígeno-anticuerpo. Algunos ejemplos de estas construcciones son:10-Anticuerpos quiméricos: Éstos se refieren a anticuerpos construidos con regiones variables de un anticuerpo de algunas especies (normalmente un mamífero en el que se generó el Acm) y regiones constantes de otra especie (aquella en la que va a usarse el anticuerpo quimérico);-Anticuerpos humanizados: Por “anticuerpo humanizado” quiere decirse un 15anticuerpo derivado de un anticuerpo no humano, normalmente un anticuerpo murino, que conserva las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo original, pero que es menos inmunogénico en seres humanos. Esto puede conseguirse mediante diversos métodos, incluyendo (a) injertar todos los dominios variables no humanos en regiones constantes humanas para generar 20anticuerpos quiméricos; (b) injertar sólo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) no humanas en regiones constantes y de entramado humanas con o sin retención de residuos de entramado críticos; y (c) trasplantar todos los dominios variables no humanos, pero “rodearlos” con una sección de tipo humano mediante la sustitución de residuos de superficie. En la técnica se 25han descrito métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en él de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácido no humanos se denominan a menudo residuos “de importación”, que se toman normalmente de un dominio variable “de importación”. La humanización puede realizarse 30esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988);
Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo secuencias de regiones hipervariables por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)). Además es importante quelos anticuerpos se humanicen conservando su alta afinidad para el antígeno y otras propiedades 5biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales usando los modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas.-Anticuerpos primatizados: Una etapa siguiente en este enfoque de preparación 10de un anticuerpo más similar al deseres humanos son los denominados anticuerpos primatizados, es decir un anticuerpo recombinante que se ha modificado mediante ingeniería genética para contener los dominios pesado y ligero variables de un anticuerpo de mono (u otro primate), en particular, un anticuerpo de mono cynomolgus, y que contiene secuencias de dominios 15constantes humanos, preferiblemente el dominio constante de inmunoglobulina gamma 1 o gamma 4 humana (o variante PE). La preparación de tales anticuerpos se describe en Newman et al., Biotechnology, 10: 1458-1460 (1992); documentos US 5.658.570 y US 6.113.898. Se ha notificado que estos anticuerpos muestran un alto grado de homología con anticuerpos humanos, es 20decir, el 85-98%, presentan funciones efectoras humanas, tienen una inmunogenicidad reducida y pueden mostrar una alta afinidad con antígenos humanos. Otro medio altamente eficaz para generar anticuerpos recombinantes se da a conocer por Newman, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992).-Anticuerpos humanos: Por “anticuerpo humano” quiere decirse un anticuerpo 25que contiene la cadena ligera y pesada humana en su totalidad así como regiones constantes, producido mediante cualquiera de los métodos convencionales conocidos. Como alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerposhumanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que pueden, tras la inmunización, producir un repertorio 30completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se hadescrito que la deleción
homocigótica del gen PH) de la región de unión a la cadena pesada del anticuerpo en ratones mutantes de línea germinal y quiméricos da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferenciade la serie de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en tales ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de 5anticuerpos humanos tras la inmunización. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Mad. Acad. Sci. USA, 90:255 1 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993). Alternativamente, puede usarse la tecnología de presentación en fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de genes de 10dominios variables (V) de inmunoglobulina de donantes. Según esta técnica, los genes de dominios V de anticuerpos se clonan en marco en un gen de la proteína de envuelta o bien principal o bien minoritaria de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Dado que la partícula filamentosa 15contiene una copia de ADN monocatenario del genoma de fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica para el anticuerpo que muestra esas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La presentación en fago puede realizarse en una variedad de formatos; para su 20revisión véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-57 1 (1993). También pueden generarse anticuerpos humanos mediante células B activadas in vitroo ratones SCID con su sistema inmunitario reconstituido con células humanas. Una vez obtenido un anticuerpo humano, sus secuencias de ADN codificante pueden aislarse, 25clonarse e introducirse en un sistema de expresión apropiado, es decir, una línea celular preferiblemente de un mamífero que se expresa posteriormente y se libera al medio de cultivo a partir del cual puede aislarse el anticuerpo.-Fragmentos de anticuerpo: Un fragmento de anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo tal como, por ejemplo, Fab, F(ab’)2, Fab’ y scFv. Se han desarrollado 30diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron por medio de digestión
proteolítica de anticuerpos intactos pero más recientemente estos fragmentos pueden producirse directamente mediante células huésped recombinantes. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento de Fv de cadena sencilla (scFv) que adicionalmente puede ser monoespecífico o biespecífico. La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a 5antígeno idénticos, denominados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento “Fc” residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab’)2 que tiene dos sitios de unión a antígeno y que todavía puede reticular el antígeno. “Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un 10sitio de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena ligera y uno de cadena pesada en asociación estrecha, no covalente. Es en esta configuración en la que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. 15Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad inferior a la de todo el sitio de unión. El fragmento Fab también 20contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CHI) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo terminal del dominio CHI de cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la designación en el presente documento para Fab’ en el 25que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan al menos un grupo tiol libre. Se produjeron originariamente fragmentos de anticuerpo F(ab’)Z como pares de fragmentos Fab’ que tienen cisteínas bisagra entre ellos. Se conocen también otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo “Fv de cadena sencilla” o “scFv” comprenden los 30dominios VH y VL de un anticuerpo, en el que estosdominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende además un ligador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el
scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, N.Y., págs. 269-315 (1994). El término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de 5cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Usando un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza que los dominios se apareen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de unión a antígeno. Se describen diacuerpos más 10completamente en, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).-Anticuerpos biespecíficos: Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes. Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción 15tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en la que las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la distribución al azar de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen 20una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las que sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa, y los rendimientos de producto son bajos. Se dan a conocer procedimientos similares en eldocumento WO 93/08829, y en Traunecker et al., 25EMBO J, 10:3655-3659 (1991). Ribozimas específicas del receptor TRPA1También pueden usarse moléculas de ribozima diseñadas para escindir catalíticamente transcritos de un ARNm diana para impedir la traducción de ARNm del receptor 30TRPA1. En consecuencia, en otra realización, las composiciones de la invención comprenden ribozimas específicamente dirigidas al ARNm del receptor TRPA1. Las
ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas que pueden catalizar la escisión específica del ARN (para una revisión, véase Rossi, Current Biology 4:469-471, 1994). El mecanismo de acción de las ribozimas implica una hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima con el ARN diana complementario, seguida por un acontecimiento de escisión endonucleolítica. La composición de moléculas de 5ribozima incluye preferiblemente una o más secuencias complementarias a un ARNm diana, y la secuencia catalítica bien conocida responsable de la escisión del ARNm o una secuencia funcionalmente equivalente (véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 5.093.246, incorporada al presente documento como referencia en su totalidad).10Aunque pueden usarse ribozimas que escinden el ARNm en secuencias de reconocimiento específicas de sitio para destruir ARNm dianas, se prefiere el uso de ribozimas de cabeza de martillo. Las ribozimas de cabeza de martillo escinden ARNm en ubicaciones dictadas por regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarias con el ARNm diana. Preferiblemente, el ARNm diana tiene la 15siguiente secuencia de dos bases: 5’-UG-3’. La construcción y producción de ribozimas de cabeza de martillo se conoce bien en la técnica y se describe más completamente en Haseloff y Gerlach, Nature 334: 585-591, 1988; y véase la solicitud PCT número WO89/05852, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia. Las secuencias de ribozimas de cabeza de martillo pueden incrustarse en un ARN estable tal 20como un ARN de transferencia (ARNt) para aumentar la eficacia de escisión in vivo(Perriman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6175-79, 1995; de Feyter, y Gaudron, Methods in Molecular Biology, vol. 74, capítulo 43, “Expressing Ribozymes in Plants”, editado por Turner, P. C, Humana Press Inc., Totowa, N.J.). En particular, se conoce bien en la técnica la expresión de ribozimas de fusión con ARNt mediada por ARN 25polimerasa III (véanse, Kawasaki et al., Nature 393: 284-9, 1998; Kuwabara et al., Nature Biotechnol. 16: 961-5, 1998; y Kuwabara et al., Mol. Cell. 2:617-27, 1998; Koseki et al., J Virol 73: 1868-77, 1999; Kuwabara et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 1886-91, 1999; Tanabe et al., Nature 406: 473-4, 2000). Normalmente, hay varios posibles sitios de escisión de ribozimas de cabeza de martillo dentro de una secuencia 30de ADNc diana dada. Preferiblemente, la ribozima se diseña mediante ingeniería genética de modo que el sitio de reconocimiento de la escisión se ubica cerca del
extremo 5’ del ARNm diana para aumentar la eficacia y minimizar la acumulación intracelular de transcritos de ARNm no funcionales. Además, el uso de cualquier sitio de reconocimiento de la escisión ubicado en la secuencia diana que codifica para diferentes partes de los dominios de aminoácidos C-terminales de, por ejemplo, formas largas y cortas de la diana permitiría la selección como diana selectiva de una u otra 5forma de la diana y, por tanto, tendría un efecto selectivo sobre una forma del producto génico diana.Las ribozimas que seleccionan como diana genes contienen necesariamente una región de hibridación complementaria a dos regiones, cada una de al menos 5 y preferiblemente cada una de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 10nucleótidos contiguos de longitud de un ARNm diana, tal como un ARNm de una secuencia representada en los genes del receptor TRPA1. Además, las ribozimas tienen actividad endorribonucleasa altamente específica, que escinde de manera autocatalítica el ARNm sentido diana. La presente invención se extiende a ribozimas que se hibridan con un ARNm sentido codificado por un gen diana tal como un gen candidato a diana 15farmacológica terapéutica, hibridándose de ese modo con el ARNm sentido y escindiéndolo, de manera que ya no puede traducirse más para sintetizar un producto polipeptídico funcional.Las ribozimas usadas en las composiciones de la presente invención incluyen también endorribonucleasas de ARN (a continuación en el presente documento “ribozimas de 20tipo Cech”) tales como las que se producen de manera natural en Tetrahymena thermophila(conocidas como IVS, o ARN IVS L-19) y que se han descrito de manera extensa por Thomas Cech y colaboradores (Zaug et al., Science 224:574-578, 1984; Zaug et al., Science 231: 470-475, 1986; Zaug et al., Nature 324: 429-433, 1986; solicitud de patente internacional publicada número WO88/04300 por University 25Patents Inc.; Been, et al., Cell 47: 207-216, 1986). Las ribozimas de tipo Cech tienen un sitio activo de ocho pares de bases que se hibrida con una secuencia de ARN diana tras lo que tiene lugar la escisión delARN diana. La invención abarca aquellas ribozimas de tipo Cech que seleccionan como diana secuencias de sitio activo de ocho pares de bases que están presentes en una secuencia de ácido nucleico o un gen diana.30Las ribozimas pueden estar compuestas por oligonucleótidos modificados (por ejemplo, para obtener estabilidad, direccionamiento, etc. mejorados) y deben suministrarse a
células que expresan el gen diana in vivo. Un método preferido de suministro implica usar un constructo de ADN que “codifica” para la ribozima bajo el control de un promotor pol III o pol II constitutivo fuerte, de modo que las células transfectadas producirán suficientes cantidades de la ribozima para destruir mensajes diana endógenos e inhibir la traducción. Debido a que las ribozimas, a diferencia de las 5moléculas antisentido, son catalíticas, se requiere una concentración intracelular inferior para lograr eficacia.En ciertas realizaciones, puede diseñarse una ribozima identificando en primer lugar una parte de la secuencia suficiente para provocar una desactivación eficaz mediante ARNi. Entonces puede incorporarse la misma parte de la secuencia en una ribozima. En 10este aspecto de la invención, las partes que seleccionan como diana genes de la ribozima o ARNi son sustancialmente la misma secuencia de al menos 5 y preferiblemente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 o más nucleótidos contiguos de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de cualquiera de las secuencias de ceramidasa ácida o colina cinasa humanas. En una cadena de ARN diana larga, números 15significativos de sitios diana no son accesibles a la ribozima debido a que están escondidos dentro de las estructuras secundaria o terciaria (Birikh et al., Eur J Biochem 245: 1-16, 1997). Para superar el problema de la accesibilidad al ARN diana, se usan normalmente predicciones generadas por ordenador de la estructura secundaria para identificar dianas que lo más probablemente deben ser monocatenarias o tener una 20configuración “abierta” (véase Jaeger et al., Methods Enzymol 183: 281-306, 1989). Otros enfoques utilizan un enfoque sistemático para predecir la estructura secundaria que implica evaluar un gran número de moléculas de oligonucleótidos de hibridación candidatas (véase Milner et al., Nat Biotechnol 15: 537-41, 1997; y Patzel y Sczakiel, Nat Biotechnol 16: 64-8, 1998). Adicionalmente, la patente estadounidense número 256.251.588, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia, describe métodos para evaluar secuencias de sondas oligonucleotídicas de modo que se predice el potencial de hibridación con una secuencia de ácido nucleico diana. El método de la invención proporciona el uso de tales métodos para seleccionar segmentos preferidos de una secuencia de ARNm diana que se predice que es monocatenaria y, 30además, para la utilización oportunista de una secuencia de ARNm diana igual o sustancialmente idéntica, que comprende de manera preferible aproximadamente 10-20
nucleótidos consecutivos del ARNm diana, en el diseño tanto de las ribozimas como de los oligonucleótidos de ARNi de la invención.ARN de interferencia (ARNi) específico del receptor TRPA1En otra realización, los inhibidores del receptor TRPA1que forman parte de las 5composiciones de la invención son ARNi que pueden desactivar la expresión delreceptor TRPA1o cualquier gen componente necesario para una función del receptor TRPA1. La ARNi es un proceso de represión génica postranscripcional específica de secuencia que puede producirse en células eucariotas. En general, esteproceso implica la degradación deun ARNm de una secuencia particular inducida por ARN bicatenario 10(ARNds) que es homólogo a esa secuencia. Por ejemplo, la expresión de un ARNds largo que corresponde a la secuencia de un ARNm monocatenario particular (ARNss) hará que ese mensaje sea lábil, “interfiriendo” de ese modo con la expresión del gen correspondiente. En consecuencia, puede reprimirse cualquier gen seleccionado introduciendo un ARNds que corresponde a todo o una parte sustancial del ARNm para 15ese gen. Parece que cuando se expresa un ARNds largo, se procesa inicialmente mediante una ribonucleasa III para dar oligonucleótidos de ARNds más cortos de tan sólo 21 a 22 pares de bases de longitud. En consecuencia, la ARNi puede efectuarse mediante la introducción o expresión de ARNds homólogos relativamente cortos. De hecho, el uso de ARNds homólogos relativamente cortos puede tener ciertas ventajas tal 20como se trata a continuación.Los oligonucleótidos bicatenarios usados para efectuar la ARNi tienen preferiblemente menos de 30 pares de bases de longitud y, más preferiblemente, comprenden aproximadamente 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18 ó 17 pares de bases de ácido ribonucleico. Opcionalmente, los oligonucleótidos de ARNds de la invención pueden 25incluir extremos 3’ en proyección. Proyecciones en 3’ de 2 nucleótidos a modo de ejemplo pueden estar compuestas por residuos de ribonucleótido de cualquier tipo o incluso pueden estar compuestas por residuos de 2-desoxitimidina, lo que reduce el coste de la síntesis de ARN y puede potenciar la resistencia a nucleasa de ARNsi en el medio de cultivo de células y dentro de las células transfectadas (véase Elbashir et al., 30Nature 411: 494-8, 2001). También pueden utilizarse ARNds más largos de 50, 75, 100 o incluso 500 paresde bases o más en ciertas realizaciones de la invención.
Concentraciones a modo de ejemplo de ARNds para efectuar la ARNi son de aproximadamente 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 1,5 nM, 25 nM o 100 nM, aunque pueden utilizarse otras concentraciones dependiendo de la naturaleza de las células tratadas, la diana génica y otros factores fácilmente apreciables por el experto. Pueden sintetizarse ARNds a modo de ejemplo químicamente o producirse in vitroo in vivo5usando vectores de expresión apropiados. Los ARN sintéticos a modo de ejemplo incluyen ARN de 21 nucleótidos sintetizado químicamente usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, timidina fosforamidita y fosforamiditas de ARN Expedite (Proligo, Alemania). Se desprotegen preferiblemente oligonucleótidos sintéticos y se purifican en gel usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Elbashir 10et al., Genes Dev. 15: 188-200, 2001). Pueden transcribirse ARN más largos a partir de promotores, tales como promotores de ARN polimerasa de T7,conocidos en la técnica. Una única diana de ARN, colocada en ambas orientaciones posibles en el sentido de 3’ respecto a un promotor in vitro, transcribirá ambas hebras de la diana para crear un oligonucleótido de ARNds de la secuencia diana deseada. Cualquiera de las especies de 15ARN anteriores se diseñará para que incluya una parte de la secuencia de ácido nucleico representada en un ácido nucleico diana, tal como, por ejemplo, un ácido nucleico que se hibrida, en condiciones rigurosas y/o fisiológicas, con el polinucleótido que codifica para elreceptor TRPA1humano.La secuencia específica utilizada en el diseño de los oligonucleótidos puede ser 20cualquier secuencia contigua de nucleótidos contenida dentro del mensaje génico expresado de la diana. Pueden usarse programas y algoritmos, conocidos en la técnica, para seleccionar secuencias diana apropiadas. Además, pueden seleccionarse secuencias óptimas utilizando programas diseñados para predecir la estructura secundaria de una secuencia de ácido nucleico monocatenario especificada y permitir la selección de 25aquellas secuencias que es probable que se produzcan en regiones monocatenarias expuestas de un ARNm plegado. Pueden encontrarse métodos y composiciones para diseñar oligonucleótidos apropiados, por ejemplo, en la patente estadounidense número 6.251.588, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia. Generalmente, se piensa que el ARN mensajero (ARNm) es una molécula lineal que 30contiene la información para dirigir la síntesis de proteínas dentro de la secuencia de ribonucleótidos, sin embargo, estudios han revelado que existen varias estructuras
secundarias y terciarias en la mayoría de los ARNm. Los elementos de estructura secundaria en el ARN se forman en gran medida mediante interacciones de tipo Watson-Crick entre diferentes regiones de la misma molécula de ARN. Los elementos estructurales secundarios importantes incluyen regiones bicatenarias intramoleculares, bucles en horquilla, protuberancias en ARN dúplex y bucles internos. Se forman 5elementos estructurales terciarios cuando los elementos estructurales secundarios se ponen en contacto entre sí o con regiones monocatenarias para producir una estructura tridimensional más compleja. Varios investigadores han medido las energías de unión de un gran número de estructuras de ARN dúplex y han derivado un conjunto de reglas que pueden usarse para predecir la estructura secundaria del ARN (véase, por ejemplo, 10Jaeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7706, 1989; y Turner et al., Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 17:167, 1988). Las reglas son útiles en la identificación de elementos estructurales del ARN y, en particular, para identificar regiones de ARN monocatenario que pueden representar segmentos preferidos del ARNm para seleccionarcomo diana para lograr tecnologías antisentido, de ribozimas o de ARNi de 15silenciamiento. En consecuencia, pueden identificarse segmentos preferidos de la diana de ARNm para el diseño de oligonucleótidos de ARNds que median la ARNi así como para el diseñode composiciones de ribozimas y ribozimas de cabeza de martillo apropiadas de la invención.Se han usado varios tipos diferentes de moléculas de manera eficaz en la tecnología de 20ARNi. El ARN de interferencia pequeño (ARNsi), conocido algunas veces como ARN de interferencia corto o ARN de silenciamiento, son una clase de moléculas de ARN bicatenario de 20-25 nucleótidos de longitud que desempeñan una variedad de papeles en biología. De la manera más notable, el ARNsi está implicado en la ruta de interferencia de ARN (ARNi) en la que el ARNsi interfiere con la expresión de un gen 25específico. Además de su papel en la ruta de ARNi, los ARNsi también actúan en rutas relacionadas con ARNi, por ejemplo, como un mecanismo antiviral o en la conformación de la estructura de la cromatina de un genoma. Se ha mostrado que ARNsi sintéticos pueden inducir la ARNi en células de mamífero. Este descubrimiento condujo a un aumento en el uso de ARNsi/ARNi para la investigación biomédica y el 30desarrollo de fármacos.
Los microARN (miARN) son una clase relacionada de pequeños ARN reguladores génicos, normalmente de 21-23 nt de longitud. Difieren normalmente del ARNsi porque se procesan a partir de precursores de ARN monocatenarios y muestran sólo una complementariedad parcial con las dianas de ARNm. Estudios iniciales han indicado que los miARN regulan la expresión génica de manera postranscripcional al nivel de la 5inhibición de la traducción en los cuerpos P en el citoplasma. Sin embargo, los miARN también pueden guiar la escisióndel ARNm de manera similar a los ARNsi. Éste es a menudo el caso en plantas en las que los sitios diana normalmente son altamente complementarios al miARN. Aunque pueden encontrarse sitios diana en ARNm de plantas en la UTR en 5’, los marcos de lectura abiertos y la UTR en 3’, en animales, es 10la UTR en 3’ la que es la diana principal. Los miARN se transcriben en primer lugar como parte de un microARN primario (pri-miARN). Se procesa entonces mediante la Drosha con la ayuda de Pasha/DGCR8 (=complejo de microprocesador) para dar pre-miARN. Se exporta entonces el pre-miARN de aproximadamente 75 nt al citoplasma mediante la exportina-5, en el que se corta entonces para dar moléculas 15similares a ARNsi de 21-23 nt mediante Dicer. En algunos casos, pueden encontrarse miARN múltiples en el pri-miARN.El ARN horquillado corto (ARNsh) es aún otro tipo de ARN que puede usarse para efectuar la ARNi. Es una secuencia de ARN que realiza un giro de horquilla estrecho que puede usarse para silenciar la expresión génica. El ARNsh se transcribe mediante la 20ARN polimerasa III.En la actualidad, están usándose de manera extensa ARN de interferencia corto (ARNsi) y ARN horquillado corto (ARNsh) para silenciar diversos genes para silenciar funciones llevadas a cabo por los genes. Cada vez es más fácil aprovechar la ARNi para silenciar genes específicos, debido al desarrollo de bibliotecas de constructos de silenciamiento 25de genes de ARNsh y ARNsi de aplicación comercial usando una variedad de fuentes. Por ejemplo, se ha desarrollado RNAi Codex, que consiste en una base de datos de información relacionada con ARNsh y un sitio web asociado, como portal para recursos de ARNsh públicamente disponibles y está accesible en http://codex.cshl.org. RNAi Codex contiene actualmente datos de labiblioteca de ARNsh Hannon-Elledge y permite 30el uso de nombres de genes fáciles para el biólogo para acceder a información sobre constructos de ARNsh que pueden silenciar el gen de interés. Está diseñado para
contener publicaciones y anotaciones aportadaspor el usuario para cada constructo, a medida que tales datos pasan a estar disponibles. Olson et al. (Nucleic Acids Res. 34 (Database issue): D153-D157, 2006, incorporado como referencia) han proporcionado descripciones detalladas sobre características de RNAi Codex, y han explicado el uso de la herramienta. Toda esta información puede usarse para ayudar al diseño de los 5diversos ARNsi o ARNsh que seleccionan como diana el receptor TRPA1u otras proteínas de interés.Ácidos nucleicos antisentido específicos del receptor TRPA1En una realización adicional, la invención se refiere al uso de los ácidos nucleicos 10“antisentido” aislados para inhibir la expresión, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o traducción de ácidos nucleicos delosreceptoresTRPA1. Los ácidos nucleicos antisentido pueden unirse a la posible diana farmacológica mediante complementariedad de pares de bases convencional o, por ejemplo, en el caso de la unión a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco mayor dela 15doble hélice. En general, estos métodos se refieren a la gama de técnicas empleadas generalmente en la técnica, e incluyen cualquier método que se base en la unión específica a secuencias oligonucleotídicas.Un constructo antisentido de la presente invención puede suministrarse, por ejemplo, como un plásmido de expresión que, cuando se transcribe en la célula, produce ARN 20que es complementario a al menos una parte única del ARNm celular que codifica para un polipéptido delreceptor TRPA1. Alternativamente, el constructo antisentido es una sonda oligonucleotídica, que se genera ex vivoy que, cuando se introduce en la célula provoca la inhibición de la expresión mediante hibridación con las secuencias de ARNm y/o genómicas de un ácido nucleico diana. Tales sondas oligonucleotídicas son 25preferiblemente oligonucleótidos modificados, que son resistentes a nucleasas endógenas, por ejemplo, exonucleasas y/o endonucleasas, y por tanto son estables in vivo. Moléculas de ácido nucleico a modo de ejemplo para su uso como oligonucleótidos antisentido son análogos de fosforamidato, fosfotioato y metilfosfonato de ADN (véanse también las patentes estadounidenses números 305.176.996; 5.264.564; y 5.256.775). Adicionalmente, se han revisado enfoques generales para construir oligómeros útiles en la terapia antisentido, por ejemplo, por
Van der Krol et al., BioTechniques 6: 958-976, 1988; y Stein et al., Cancer Res 48: 2659-2668, 1988.Con respecto al ADN antisentido, se prefieren oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de iniciación de la traducción, por ejemplo, entre las regiones -10 y +10 del gen diana. Los enfoques antisentido implican el diseño de oligonucleótidos (o bien ADN o 5bien ARN) que son complementarios al ARNm que codifica para el polipéptido diana. Los oligonucleótidos antisentido se unirán a los transcritos de ARNm y evitarán su traducción. No se requiere una complementariedad absoluta, aunque se prefiere. En el caso de ácidos nucleicos antisentido bicatenarios, puede someterse a prueba por tanto una única hebra del ARN dúplex, o puede someterse a ensayo la formación de tríplex. 10La capacidad para hibridarse dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico antisentido. Generalmente, cuando más largo sea el ácido nucleico de hibridación, más apareamientos erróneos de bases con un ARN podrá contener y formar todavía un dúplex estable (o tríplex, como puede ser el caso). Un experto en la técnica puede establecer un grado tolerable de apareamientos erróneos 15mediante el uso de procedimientos convencionales para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.Oligonucleótidos que son complementarios al extremo 5’ del ARNm, por ejemplo, la secuencia no traducida en 5’ hasta e incluyendo el codón de iniciación AUG, deben funcionar de la manera más eficaz en la inhibición de la traducción. Sin embargo, se ha 20mostrado recientemente que secuencias complementarias a las secuencias no traducidas en 3’ de los ARNm son eficaces también en la inhibición de la traducción de los ARNm(Wagner, Nature 372: 333, 1994). Por tanto, oligonucleótidos complementarios a las regiones no codificantes, no traducidas o bien en 5’ o bien en 3’ de un gen podrían usarse en un enfoque antisentido para inhibir la traducción de ese ARNm. 25Oligonucleótidos complementarios a la región no traducida en 5’ del ARNm deben incluir el complemento del codón de iniciación AUG. Oligonucleótidos antisentido complementarios a las regiones codificantes del ARNm son inhibidores de la traducción menos eficaces, pero podrían usarse también según la invención. Ya se diseñen para hibridarse con la región 5’, 3’ o codificante del ARNm, los ácidos nucleicos antisentido 30deben tener al menos seis nucleótidos de longitud, y preferiblemente tienen menos de
aproximadamente 100 y más preferiblemente menos de aproximadamente 50, 25, 17 ó 10 nucleótidos de longitud.Se prefiere que se realicen en primer lugar estudios in vitropara cuantificar la capacidad del oligonucleótido antisentido para inhibir la expresión génica. Se prefiere que estos estudios utilicen controles que distingan entre inhibición génica antisentido y efectos 5biológicos no específicos de oligonucleótidos. Se prefiere también que estos estudios comparen los niveles de proteína o ARN diana con los de una proteína o ARNcontrol interno. Los resultados obtenidos usando el oligonucleótido antisentido pueden compararse con los obtenidos usando un oligonucleótido control. Se prefiere que el oligonucleótido control sea de aproximadamente la misma longitud que el 10oligonucleótido de prueba y que la secuencia oligonucleotídica del oligonucleótido difiera de la secuencia antisentido no más de lo necesario para impedir la hibridación específica con la secuencia diana.Los oligonucleótidos antisentido pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, monocatenarios o bicatenarios. El 15oligonucleótido puede modificarse en el resto de base, el resto de azúcar o la estructura principal de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, la hibridación, etc. El oligonucleótido puede incluir otros grupos unidos tales como péptidos (por ejemplo, para seleccionar como diana receptores de células huésped), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véanse, por ejemplo, 20Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556, 1989; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652, 1987; publicación PCT número WO88/09810) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, el documento WO89/10134), agentes de escisión desencadenada por hibridación (véase, por ejemplo, Krol et al., BioTechniques 6: 958-976, 1988) o agentes de intercalación (véase, por ejemplo, Zon, Pharm. Res. 5: 25539-549, 1988). Para este fin, el oligonucleótido puede conjugarse con otramolécula, por ejemplo, un péptido, un agente de reticulación desencadenada por hibridación, un agente de transporte, un agente de escisión desencadenada por hibridación, etc.El oligonucleótido antisentido puede comprender al menos un resto de base modificada que se selecciona del grupo que incluye pero no se limita a 5-fluorouracilo, 305-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxitietil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina,
5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosolqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5’-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 52-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina.10El oligonucleótido antisentido puede comprender también al menos un resto de azúcar modificada seleccionada del grupo que incluye pero no se limita a arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa. El oligonucleótido antisentido puede contener también una estructura principal similar a péptido neutro. Tales moléculas se denominan oligómeros de ácido nucleico peptídico (PNA) y se describen, por ejemplo, 15en Perry-O’Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 14670, 1996, y en Eglom et al., Nature 365: 566, 1993. Una ventaja de los oligómeros de PNA es su capacidad para unirse a ADN complementario esencialmente de manera independiente de la fuerza iónica del medio debido a la estructura principal neutra del ADN. Aún en otra realización, el oligonucleótido antisentido comprende al menos una estructura principal 20de fosfato modificada seleccionada del grupo que consiste en un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosforodiamidato, un metilfosfonato, un alquil fosfotriéster y un formacetal o análogos de los mismos.Aún en otra realización, el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido alfa-anomérico. Un oligonucleótido alfa-anomérico forma híbridos bicatenarios 25específicos con ARN complementario en los que, al contrario que la orientación antiparalela habitual,las hebras se disponen en paralelo entre sí (Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641, 1987). El oligonucleótido es un 2’-0-metilrribonucleótido (Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148, 1987), o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al., FEBS Lett. 215: 327-330, 1987).30
Aunque pueden usarse nucleótidos antisentido complementarios a la región codificante de una secuencia de ARNm diana, también pueden usarse aquéllos complementarios a la región no traducida transcrita.En ciertos casos, puede ser difícil lograr concentraciones intracelulares del oligonucleótido antisentido suficientes para suprimir la traducción en ARNm 5endógenos. Por tanto, un enfoque preferido utiliza un constructo de ADN recombinante en el que el oligonucleótido antisentido se coloca bajo el control de un promotor pol III o pol II fuerte. El uso de un constructo de este tipo para transfectar células diana dará como resultado la transcripción de cantidades suficientes de ARN monocatenario que formará pares de bases complementarias con los transcritos de posibles dianas 10farmacológicas endógenas y de ese modo impedirán la traducción. Por ejemplo, puede introducirse un vector de manera que se tome por una célula y dirija la transcripción de un ARN antisentido. Un vector de este tipo puede permanecer de manera episomal o integrarse cromosómicamente, siempre que pueda transcribirse para producir el ARN antisentido deseado. Tales vectores pueden construirse mediante métodos de tecnología 15de ARN recombinante convencionales en la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, virales u otros conocidos en la técnica, usados para la replicación y expresión en células de mamífero. La expresión de la secuencia que codifica para el ARN antisentido puede ser mediante cualquier promotor conocido en la técnica que actúa en células de mamífero, preferiblemente humanas. Tales promotores pueden ser inducibles o 20constitutivos. Tales promotores incluyen pero no se limitan a: la región promotora temprana de SV40 (Bernoist y Chambon, Nature 290: 304-310, 1981), el promotor contenido en la repetición terminal larga en 3’ del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., Cell 22: 787-797, 1980), el promotor de timidina cinasa del herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445, 1981), las secuencias 25reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al, Nature 296: 39-42, 1982), etc. Puede usarse cualquier tipo de plásmido, cósmido, YAC o vector viral para preparar el constructo de ADN recombinante, que puede introducirse directamente en elsitio del tejido.Alternativamente, puede reducirse la expresión del gen diana seleccionando como diana 30secuencias de desoxirribonucleótidos complementarias a la región reguladora del gen (es decir, el promotor y/o los potenciadores) para formar estructuras de triple hélice que
impidan la transcripción del gen en células diana en el organismo (véase de manera general, Helene, Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84, 1991; Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 660: 27-36, 1992; y Maher, Bioassays 14(12): 807-15, 1992).Las moléculas de ácido nucleico que van a usarse en la formación de la triple hélice para la inhibición de la transcripción son preferiblemente monocatenarias y están 5compuestas de desoxirribonucleótidos. La composición de bases de estos oligonucleótidos debe promover la formación de la triple hélice por medio de las reglas de apareamiento de bases de Hoogsteen, que generalmente requieren que estén presentes tramos considerables de o bien purinas o bien pirimidinas en una hebra de un dúplex. Las secuencias de nucleótidos pueden ser a base de pirimidina, lo que dará 10como resultado tripletes de TAT y CGC a través de las tres hebras asociadas de la triple hélice resultante. Las moléculas ricas en pirimidina proporcionan complementariedad de bases a una región rica en purina de una única hebra del dúplex en una orientación paralela con respecto a esa hebra. Además, pueden elegirse moléculas de ácido nucleico que sean ricas en purina, por ejemplo, que contienen un tramo de residuos de G. Estas 15moléculas formarán una triple hélice con un dúplex de ADN que es rico en pares de GC, en los que la mayoría de los residuos de purina se ubican en una única hebra del dúplex seleccionado como diana, dando como resultado tripletes de CGC a través de las tres hebras del tríplex.Alternativamente, las posibles secuencias diana que pueden seleccionarse como diana 20para la formación de la triple hélice pueden aumentarse creando una denominada molécula de ácido nucleico “en zigzag”. Las moléculas en zigzag se sintetizan de manera 5’-3’, 3’-5’ alternante, de manera que las bases se aparean primero con una hebra de un dúplex y luego con la otra, eliminando la necesidad de que esté presente un tramo considerable de o bien purinas o bien pirimidinas en una hebra de un dúplex.25En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido son antisentidos de morfolino. Los morfolinos son moléculas sintéticas que son el producto de un rediseño de una estructura de ácido nucleico natural. Habitualmente de 25 bases de longitud, se unen a secuencias complementarias de ARN mediante apareamiento de bases de ácido nucleico convencional. Estructuralmente, la diferencia entre los morfolinos y el ADN es que 30mientras los morfolinos tienen bases de ácido nucleico convencionales, esas bases están unidas a anillos de morfolina en lugar de anillos de desoxirribosa, y se unen a través de
grupos fosforodiamidato en lugar de fosfatos. La sustitución de fosfatos aniónicos por los grupos fosforodiamidato no cargados elimina la ionización en el intervalo de pH fisiológico habitual, de modo que los morfolinos en organismos o células son moléculas no cargadas. Los morfolinos son oligos no quiméricos; toda la estructura principal de un morfolino está compuesta por estas subunidades modificadas. Los morfolinos se usan lo 5más comúnmente como oligos monocatenarios, aunque pueden usarse heterodúplex de una hebra de morfolino y una hebra de ADN complementaria en combinación con reactivos de suministro citosólicos catiónicos.A diferencia de muchos tipos estructurales antisentido (por ejemplo, fosforotioatos), los morfolinos no degradan sus moléculas de ARN diana. En su lugar, los morfolinos 10actúan mediante “bloqueo estérico”, uniéndose a una secuencia diana dentro de un ARN y simplemente poniéndose en el camino de moléculas que de lo contrario podrían interaccionar con el ARN. Los oligos de morfolino se usan a menudo para investigar el papel de un transcrito de ARNm específico en un embrión, tal como huevos o embriones de pez cebra, rana con garras africana (Xenopus), pollo y erizo de mar, que 15producen embriones tratados con morfolino. Con sistemas de suministro citosólico apropiados, los morfolinos son eficaces en cultivo celular.Unidos a la región no traducida en 5’ de un ARN mensajero (ARNm), los morfolinos pueden interferir con la progresión del complejo de iniciación ribosómico desde la caperuza en 5’ hasta el codón de iniciación. Esto impide la traducción de la región 20codificante del transcrito seleccionado como diana (denominado “desactivación” (“knocking down”) de la expresión génica). Los morfolinos proporcionan un medio conveniente de “desactivación” de la expresión de la proteína y de aprendizaje de cómo esa desactivación cambia las células o el organismo. Algunos morfolinos desactivan la expresión tan eficazmenteque tras la degradación de proteínas preexistentes las 25proteínas seleccionadas como diana se hacen indetectables mediante inmunotransferencia de tipo Western.Los morfolinos también pueden interferir con las etapas de procesamiento del pre-ARNm, habitualmente impidiendo que los complejos de snRNP que dirigen el corte y empalme se unan a sus dianas en los límites de los intrones en una hebra de pre-ARN. 30Impedir que U1 (en el sitio donador) o U2/U5 (en el resto polipirimidina y el sitio aceptor) se unan puede provocar un corte y empalme modificado, conduciendo
comúnmente a exclusiones de exones del ARNm maduro. La selección como diana de algunas dianas de corte y empalme da como resultado inclusiones de intrones, mientras que la activación de sitios de corte y empalme crípticos puede conducir a exclusiones o inclusiones parciales. Las dianas de snRNP U11/U12 también pueden bloquearse. La modificación del corte y empalme puede someterse a ensayo de manera conveniente 5mediante reacción en cadena de la polimerasacon transcriptasa inversa (RT-PCR) y se observa como un desplazamiento de las bandas tras la electroforesis en gel de los productos de RT-PCR.Se han usado también morfolinos para bloquear la actividad del ARNmi, la actividad de ribozimas, silenciadores de corte y empalme intrónicos y potenciadores de corte y 10empalme. Se han inhibido las funciones de las snRNP U2 y U12 mediante morfolinos. Los morfolinos dirigidos a secuencias de ARNm “resbaladizas” (“slippery”) dentro de regiones que codifican para proteínas pueden inducir desplazamientos del marco traduccional. Las actividades de los morfolinos frente a esta variedad de dianas sugieren que los morfolinos pueden usarse como herramienta de propósito general para bloquear 15interacciones de proteínas o ácidos nucleicos con el ARNm.En una realizaciónparticular, el inhibidor del receptor TRPA1 se selecciona de los compuestos de la tabla I, incluyendo combinaciones de los mismos. En una realización preferida, el inhibidordelreceptor TRPA1se selecciona del grupo que consiste en2-(1,3-dimetil-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahidro-7H-purin-7-il)-N-(4-isopropilfenil)acetamida20(comúnmente conocido como HC-030031), oxima de 4-(4-clorofenil)-3-metil-3-buten-2-ona (comúnmente conocido como AP18), alcanfor, mentol, gadolinio, rojo de rutenio, gentamicina y amilorida.Las cantidades eficaces del inhibidor del receptor TRPA1dependerán del modo de administración, la frecuencia de administración, la naturaleza del tratamiento, la edad y 25el estado del individuo que va a tratarse, ydel tipo de composición farmacéutica usada para suministrar el compuesto en un sistema vivo. Niveles eficaces de inhibidor del receptor TRPA1pueden oscilar desde 50 nM hasta 5 µM (administrado a animales experimentales como 20-30 mg/kg dos veces al día durante diez días), dependiendo del compuesto, el sistema, los criterios de valoración experimentales y clínicos y los 30umbrales de toxicidad. Aunque las dosis individuales varían, un experto en la técnica puede determinar intervalos óptimos de cantidades eficaces. Para inhibidores del
receptor TRPA1que están implicados en ensayos clínicos para otras indicaciones, pueden considerarse las dosificaciones seguras y eficaces identificadas en tales ensayos cuando se seleccionan dosificaciones para tratamientos según la presente invención.El inhibidor del receptor TRPA1usado según los métodos de la presente invención puede administrarse solo o como una composición farmacéutica, que incluye el/los 5compuesto(s) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los bloqueantes del receptor TRPA1se proporcionan normalmente como una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede incluir también excipientes adecuados, o estabilizadores, y puede estar en forma líquida o sólida tal como comprimidos, cápsulas, polvos, disoluciones, suspensiones o emulsiones. Normalmente, la composición 10contendrá de desde aproximadamente el 0,01 hasta el 99 por ciento, preferiblemente desde aproximadamente el 5 hasta el 95 por ciento de compuesto(s) activo(s), junto con el vehículo.El inhibidor del receptor TRPA1, cuando se combina con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéutica o fisiológicamente aceptables, ya sea en forma sólida o 15líquida tal como comprimidos, cápsulas, polvos, disoluciones, suspensiones o emulsiones, puede administrarse por vía oral, por vía parenteral, por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, mediante instilación intranasal, mediante implantación, mediante instilación intravesical o intracavitaria, por vía intraocular, por vía intraarterial, por vía intralesional, por vía transdérmica o 20mediante aplicación a membranas mucosas, tales como las de la nariz, la garganta y los tubos bronquiales (es decir, inhalación).Para la mayoría de los fines terapéuticos, elinhibidor del receptor TRPA1puede administrarse por vía oral como un sólido o como una disolución o suspensión en forma líquida, por medio de inyección como una disolución o suspensión en forma líquida, o 25por medio de inhalación de una disolución o suspensión nebulizada. Las formas farmacéuticas unitarias sólidas pueden ser del tipo convencional. La forma sólida puede ser una cápsula, tal como un tipo de gelatina ordinario que contiene los compuestos de la presente invención y un vehículo, por ejemplo, lubricantes y cargas inertes tales como lactosa, sacarosa o almidón de maíz. En otra realización, estos compuestos se preparan 30en comprimidos con bases de comprimidos convencionales tales como lactosa, sacarosa o almidón de maíz en combinación con aglutinantes como goma arábiga, almidón de
maíz o gelatina, agentes disgregantes, tales como almidón de maíz, almidón de patata o ácido algínico, y un lubricante, como ácido esteárico o estearato de magnesio.Para dosificaciones inyectables, pueden prepararse disoluciones o suspensiones de estos materiales en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico. Tales vehículos incluyen líquidos estériles, tales como agua y aceites, con o sin la 5adición de un tensioactivo y otro vehículo farmacéutica y fisiológicamente aceptable, incluyendo adyuvantes, excipientes o estabilizadores. Aceites ilustrativos son los de origen sintético, vegetal, animal o del petróleo, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja o aceite mineral. En general, agua, solución salina, dextrosa acuosa y disolución de azúcar relacionada, y glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son 10vehículos líquidos preferidos, particularmente para disoluciones inyectables.Para su uso como aerosoles, el compuesto en disolucióno suspensión puede envasarse en un recipiente de aerosol presurizado junto con propelentes adecuados, por ejemplo, propelentes hidrocarbonados como propano, butano o isobutano con adyuvantes convencionales. Los materiales de la presente invención también pueden administrarse 15en forma no presurizada tal como en un nebulizador o atomizador.Para vías transdérmicas, el compuesto está presente en un vehículo que forma una composición en forma de una crema, loción, disolución y/o emulsión. La composición puede incluirse en un parche transdérmico del tipo de matriz o depósito tal como son convencionales en la técnica para este fin.20Se contempla el uso de combinaciones de inhibidores del receptor TRPA1descritos en la tabla I.Se contempla también que la administración del inhibidor del receptor TRPA1pueda llevarse a cabo en combinación con otros tratamientos terapéuticos adecuados que son útiles para tratar una enfermedad ocasionada por una infección bacteriana o por 25exposición a endotoxinas bacterianas.Por tanto, en otra realización, el inhibidor del receptor TRPA1puede combinarse con otros fármacos para el tratamiento de una enfermedad ocasionada por una infección bacteriana o por exposición a endotoxinas bacterianas. Ejemplos de estos fármacos son agentesantibióticos, agentes antivirales, agentes antifúngicos, agentes antiparasíticos, corticoesteroides, fármacos 30
antiinflamatorios no esteroides, fármacos que modifican la neovascularización, antihistamínicos, neuropéptidos, neuromoduladores y bloqueantes del canal de Na+.En el contexto de la presente invención, por infección bacteriana se entiende aquella condición bajo la cual un organismo es invadido por un material extraño, en particular una bacteria. El resultado de una infección bacteriana puede incluir elcrecimiento de la 5bacteria, la producción de toxinas y el daño al organismo infectado.La infección bacteriana puede ser causada por bacterias gram positivas o gram negativas. Ejemplos de bacterias gram positivas y gram negativas se citan en el documento WO2009/020643.En una realización particular, la infección bacteriana es causada por bacterias gram 10negativas, preferentemente por Escherichia coli.Ejemplos de infecciones bacterianas incluyen infecciones del tracto urinario, infecciones del tracto respiratorio, infecciones del tejido dérmico, infecciones del plasma sanguíneo, infecciones estomacales e intestinales o infecciones del sistema nervioso central.15De forma aún más preferente, la infección bacteriana es causada por los lipopolisacáridos (LPS) procedentes de la membrana externa de la bacteriaEscherichia coli.El LPS puede inducir varias reacciones potencialmente letales, incluyendo una fuerte estimulación de la respuesta inmune, la constricción de las vías respiratorias y una 20vasodilatación arterial que puede llevar a una severa caída en la presión arterial. Además, el LPS puede inducir síntomas de irritación y dolor que acompañan a muchas infecciones bacterianas tópicas y sistémicas. El dolor agudo y crónico es un síntoma muy frecuente en la meningitis, la pulpitis, el dolor de las heridas infectadas, cistitis bacteriana, la prostatitis crónica y el dolor abdominal crónico en el síndrome de 25intestino irritable post-infeccioso.En particular, el LPS puede inducir sepsis o shock séptico, una severa enfermedad causada por una infección del flujo sanguíneo como consecuencia de las toxinas producidas por las bacterias. Esta infección bacteriana puede originarse en cualquier parte del cuerpo, no obstante es más común en riñones, hígado o vesícula biliar, 30intestino, piel y pulmones. Dicha infección ocurre asimismo en pacientes
hospitalizados, y los lugares comunes de infección incluyen las vías intravenosas, las heridas quirúrgicas, los drenajes quirúrgicos, úlceras y escaras. La sepsis conlleva una severa caída de la presión arterial (hipotensión) provocando un shock.Por tanto, enfermedades causadas por infecciones bacterianas pueden ser dolor, en particular doloragudo, dolor crónico, dolor nociceptivoydolor inflamatorio,e 5hipotensión asociada al shockséptico.El LPS es una endotoxina bacteriana que también puede ser adquirida por la exposición al aire contaminado, al polvo orgánico y al polvo en los hogares,lo que influye en la exacerbación de los síntomas del asma. Asimismo, está presente en el humode los cigarrillos. La exposición al LPS provoca una respuesta inflamatoria acompañada de 10hipersensibilidad en las vías respiratorias lo que contribuye a la etiología y/o exacerbación de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Además, se postula que puede contribuir a la patogénesis de la bronquitis crónica que se desarrolla en fumadores activos y pasivos.Por tanto, en una realización particular de la presente invención, los inhibidores de 15TRPA1 se utilizan en la preparación de un medicamento dirigidoal tratamiento de enfermedades causadas por exposición a endotoxinas bacterianas. Dichas enfermedades incluyen, por ejemplo, el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la bronquitis crónica en fumadores activos y pasivos.Por otra parte, algunos tipos de LPS o derivados de los mismos son utilizados como 20adyuvantes en vacunas por su capacidad inmunogénica. No obstante, resultantóxicos y en muchos casos provocan una respuesta inflamatoria severa, postulándose además que estimulan los nervios aferentes sensoriales, dando lugar a una sensibilización de la respuesta inmune.Por tanto, en otra realización particular de la presente invención, las enfermedades 25causadas por exposición a endotoxinas bacterianas son enfermedades de tipo inflamatorio causadas por el uso de endotoxinas como adyuvantes en vacunas.La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.30
EjemplosEjemplo 1. Estimulación del TRPA1nativode nociceptores medianteLPS.Mediante el uso de fluorimetría de calcio intracelular [Ca2+]ibasada en el fluoróforo fura-2, se encontró que extractos del LPS de E.coli(10 µg/ml) producen un incremento de la [Ca2+]ien el 17.8% (32/180) de las neuronas de cultivos primarios obtenidos a 5partir de ganglios nodosos de ratones con fenotipo silvestre (WT) (Fig. 1A and 1D). Cabe destacar, que las neuronas del nodoso procedentes de ratones nulos para la expresión del receptor TLR4 (Tlr4KO) respondieron con una incidencia (32/136, p = 0.26; Fig. 1B and 1D) y amplitud similares (p = 0.6), lo que sugiere que los efectos observados durante la aplicación del LPS en neuronas sensoriales del nodoso, no están 10mediados por TLR4. Además, la mayor parte de neuronas WT y Tlr4KO que respondieron al LPS, también lo hicieron a cinamaldehído (100 µM) y a capsaicina (100 nM) (Fig. 1A-B and D), lo que indica que son neuronas nociceptoras polimodales (Story G. M. y col., Cell, 2003, 112, 819-829; Jordt S. E. y col., Nature, 2004, 427, 260-265) y sugiere que las respuestas neuronales al LPS son mediadas por el canal iónico 15TRPA1, el quimionociceptor de un gran abanico de compuestos con propiedades irritantes (Peterlin Z. y col., Neuron, 2007,53, 635-638; Bautista D. M. y col., Cell, 2006, 124, 1269-1282). Incluso, se encontró que las neuronas del nodoso de ratones Trpa1KO respondieron al LPS con una incidencia significativamente menor (p = 8*10-4; Fig. 1C and 1D) además de una menor amplitud (p = 0.01) que las neuronas WT.Los 20experimentos realizados con neuronas sensoriales trigeminales (TG) arrojaron unos resultados similares, con un gran solapamiento de la población de neuronas sensibles al LPS y a cinamaldehído en el WT (82.3%, 28/34) y una drástica reducción en la incidencia (p = 2*10-4; Fig. 1D) y amplitud (p = 0.02) de las respuestas al LPS en ratones TRPA1 KO frente al WT. Además, la pre-aplicación de HC-030031, un 25conocido inhibidor de TRPA1 (McNamara C. R. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2007, 104, 13525-13530), abolió enormemente las respuestas al LPS en neuronas trigeminales (p < 10-4; Fig. 1D), mientras que el lavado del inhibidor permitió la aparición de las respuestas inducidas por el LPS, principalmente en neuronas sensibles a cinamaldehído (94%) (Fig. 1D). Es destacable que las respuestas al LPS en neuronas 30viscerales de ratones nulos para la expresión de TRPV1 Trpv1KO mice, fueron robustas (p = 0.42, datos no mostrados) y casi tan frecuentes (25/187,P = 0.2527)
como en los ratones WT (Fig. 1D), lo que indica que TRPV1 no es la diana primaria del LPS en los nociceptores. Para analizar la accion del LPS sobre neuronas sensoriales en un contexto mas fisiologico, se realizaron registros electrofisiologicos extracelulares en una preparacion ex-vivo de nervio lingual de la rama V3 del trigemino. La aplicacion del LPS sobre el campo receptor de fibras nociceptoras que previamente habian respondido a estimulo mecanico y calor intenso, produjo un incremento significativo de la frecuencia de disparo en el 50 % de ellas, precisamente aquellas que fueron activadas por el aceite de mostaza, un conocido agonista de TRPA1 (Fig. 1E, F). Colectivamente, estos resultados, demuestran que el canal ionic° TRPA1, pero no el receptor canonic° del LPS, TLR4, es critico para la mediacion de los efectos agudos excitadores que el LPS produce en neuronas nociceptoras. Ejemplo 2. Estimulacion del TRPA1 recombinante de raton y humano mediante LPS Se examino si el LPS estimula el canal ionic° TRPA1 . A tal efecto, se midieron los cambios de la [Ca2+ ]' en celulas CHO (Chinesse ovarium cells) que expresan de forma heterologa el TRPA1 de raton (celulas CHO-A1) (Story G. M. y col., Cell, 2003, 112, 819-829). El LPS indujo un incremento reversible y dependiente de la dosis aplicada en celulas CHO-Al, con una concentraci6n efectiva (EC50) de 3.3 ± 0.5 [tg/m1 (Fig. 2A, B). La estimulacion inducida por el LPS no se observo en ausencia de Ca2+ extracelular (1 mM EGTA, datos no mostrados), lo que demuestra que este efecto del LPS esta mediado por el paso de Ca2+ a traves de canales ionicos TRPA1 y no por la liberacion de depositos intracelulares. Cabe destacar, que en celulas transfectadas con canales ionicos TRP humanos, el LPS tambien estimulo TRPA1, pero resulto inefectivo en la estimulacion de otros canales i6nicos TRP que se expresan en neuronas sensoriales nociceptoras , como son el receptor vaniloide TRPV1 , el receptor de mentol TRPM8 y el receptor activado por 69-tetrahidrocannabiol TRPV2 (datos no mostrados). La estimulacion de TRPA1 por el LPS se confirm6 en experimentos de patch-clamp mediante la configuracion de celula entera, en los cuales, la aplicacion extracelular de LPS (20 pg/m1) increment6 la amplitud de las corrientes registradas en celulas CHO-Al (Fig. 2C, D), pero fue inefectiva en celulas CHO sin transfectar (Fig. 2D). Ademas, el inhibidor especifico de TRPA1, HC-030031, evito totalmente y/o revirtio el incremento producido por el LPS de la corriente mediada por canales i6nicos TRPA1 (Fig. 2E). En
conjunto, estos resultados demuestran que el LPS activa directamente TRPA1.Ejemplo 3. Evidencias sobre el mecanismo de interacción del LPS y TRPA1.Se exploró el mecanismo(s) por el que el LPS estimula TRPA1. Este canal iónico puede ser activado por la modificación covalente de los aminoácidos del dominio intracelular N-terminal por compuestos electrofílicos y por iones calcio permeantes(Viana F. y 5Ferrer-Montiel A., Expert. Opin. Ther. Pat, 2009, 19, 1787-1799). Sin embargo, es poco probable que ninguno de estos mecanismos medie los efectos del LPS. El LPS no es un reactivo electrofílico y estimula a TRPA1 en ausencia de Ca2+(ΔI = -67 ± 18 pA at -75 mV, p = 0.014; 144 ± 18 pA at +50 mV, p = 0.0004; n = 6; paired T test; Fig. 3A). Por otro lado, el LPS indujo un cambio significativo hacia la izquierda de la dependencia de 10voltaje de la activación de TRPA1 (Fig. 3B), retrasando el cierre del canal y acelerando la apertura (datos no mostrados), demostrando que, al igual que ocurre con otros agonistas no electrofílicos(Karashima Y. y col., J.Neurosci.,2007, 27, 9874-9884; Fajardo O., Meseguer V. y col., Channels,2008, 2, 429-438; Talavera K. y col., Nat.Neurosci.,2009, 12, 1293-1299), el LPS estabiliza el estado abierto de TRPA1. 15Es bien conocido que las acciones biológicas del LPS y la activación de TRPA1 se modula por moléculas anfipáticas que producen un estrés mecánico enla membrana plasmática (Hill K. y Schaefer M., J. Biol. Chem., 2007, 282, 7145-7153); Seydel U., y col., J. Endotoxin. Res., 2001, 7, 243-247). De acuerdo con estas observaciones, se encontró una fuerte influencia del trinitrifenol (TNP), un compuesto anfipático con 20carga negativa que induce crenación de la membrana plasmática, sobre las respuestas mediadas por TRPA1 en respuesta al LPS. El pretratamiento con trinitrofenol, potenció las respuestas de [Ca2+]ievocadas por bajas concentraciones de LPS en células CHO-A1(Fig. 3C). La sospecha de que la inserción del LPS en la membrana plasmática es responsable de su acción estimuladora sobre TRPA1, nos llevó a ensayar los efectos del 25lípido A, que es el componente lipídico de anclaje a la membrana que forma elelemento biológicamente activo de la molécula del LPS RaetzC. R.,y col., Annu.Rev.Biochem., 2007, 76, 295-329). La aplicación de 10-50 µg/ml de lípido A indujo respuestas dependientes de la dosis aplicada en células CHO-A1, pero no en las células control (Fig. 3D). 30La conformación tridimensionaldel lípido A, resulta crucial para la actividad biológica del LPS (Ej: producción de citoquinas), y está determinada en gran medida por el
númerode ácidos grasos yde grupos fosfatoque determinan la carga neta negativa de la molécula. En este sentido, las moléculas de LPS que contienen un lípido A cónico son más activas biológicamente que aquellas que lo tienen cilíndrico(RaetzC. R., y col., Annu.Rev. Biochem.,2007, 76, 295-329); Brandenburg K., y col., Subcell. Biochem.,2010, 53, 53-67). Se aplicaron varios LPS de lípido A cónico(hexaacylasimétrico) 5procedentes de E. coli, S. thyphimurium and K. pneumoniae,sobrecélulas CHO-A1,e indujeron las respuestas más potentes(Fig. 3E and F)en comparacióncon aquellos procedentes de S. marcescensy P. aeruginosa, que tienen un lípido A cilíndrico(pentaacyl), y el LPS de N. meningitidis, cilíndrico (hexaacylsimétrico), queno mostró un efecto significativo sobre TRPA1. Colectivamente, estos datos sugieren quelamayor10capacidad de unLPSdeterminado,de inducir alteraciones mecánicas de la membrana plasmática, se corresponde con unamayor capacidad para activar TRPA1.Ejemplo 4. Contribución de TRPA1 a las respuestas evocadas por el LPS in vivo.Con el objetivo de determinar lacontribución de TRPA1 a los conocidos efectos del LPS in vivo,se usaronherramientas genéticas y farmacológicas como son losratones 15nulos para la expresión de TRPA1, y el inhibidor de TRPA1,HC030031.La exposición al LPS, que estápresente en el polvo orgánicoo que es liberado durante infecciones bacterianas de las vías respiratorias, produce inflamación(Michel O. y col., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1996, 154, 1641-1646). Mediante el uso de pletismografía de cuerpo entero, semidió la función ventilatoriade ratonesWT yTrpa1KOexpuestos a 20un aerosol que contenía LPS de E.coli. De este modo se confirmó que el LPS inhalado induce un incremento del Penh(WuY. Zy col.,Respir.Res.,2010,11, 49), un indicador funcional de laconstricción de las vías respiratorias(Fig. 4A).Curiosamente, los ratones Trpa1KO también respondieron a la administración de LPS,pero en términos comparativos,las respuestas ventilatorias fueron más tardías, de menor 25amplitud y revirtieronmás rápidamente. Adicionalmente, se encontraron evidencias de un componente neurogénico de las respuestas ventilatorias al LPS, que está mediado por TRPA1.En este sentido, en ratones WT, el LPS indujo un aumento significativo de la pausa inspiratoria (EIP) y/o de la pausa espiratoria(EEP),las cuáles son parámetros indicadores de irritación debida a la activación de las fibras aferentes sensoriales que 30inervan las vías respiratorias superiores e inferiores, respectivamente(VijayaraghavanR.y col., Arch.Toxicol.,1994, 68, 490-499) . Por el contrario, en ratones Trpa1KO, los
incrementos de la EIP y de la EEP fueron significativamente menores respecto del WT (Fig. 4B y 4C). En conjunto, estos datos indican que la estimulacion directa de TRPA1 en terminales nerviosas nociceptoras, contribuye a la constriccion de las vias respiratorias y a la irritacion producida en respuesta a LPS. La infeccion sistemica bacteriana puede conllevar vasodilatacion periferica y consecuentemente una disminucion de la presion arterial, lo que supone una condicion fisiologica comprometedora de la vida, conocida como choque septic() (Landry D. W. y Oliver J. A., N. Engl. I Med., 2001, 345, 588-595). Teniendo en cuenta que la estimulacion quimica de TRPA1 en fibras sensoriales que inervan arterias induce una potente vasodilatacion (Pozsgai G. y col., Cardiovasc. Res., 2010, 87, 760-768, se ensay6 si este canal i6nico esta implicado en las respuestas vasculares al LPS. Mediante el uso de un mi6grafo para pequelios vasos ex vivo, se encontr6 que el LPS (100 pg/m1) indujo una potente dilatacion en arteria mesentericas de ratones WT que previamente habian sido contraidas con un agonista beta adrenergico, en concreto con fenilefrina (2 pM) (Fig. 4D). Es destacable que este efcto se redujo de manera significativa en presencia del inhibidor especifico de TRPA1, HC-030031 (10 pM), y por la ablacion genetica de TRPA1 (Fig. 4D). Ademas, en los ratones Trpal KO, la dilatacion remanente inducida por el LPS fue insensible a HC-030031 (Fig. 4D). Por tanto, TRPA1 participa en la respuesta vasodilatadora inducida por el LPS, aunque otras dianas moleculares que aim no han sido identificadas tambien contribuirian a estas respuestas vasculares. Los sintomas tipicos de las infecciones locales por bacterias Gram-negativas, tales como el dolor, la inflamacion y la hipersensibilidad mecanica (Ferreira, S. y col., Br.IPharmacol, 1993, 110, 1227-1231; Kanaan S. A. y col., Pain, 1996, 66, 373-379) fueron reproducidos experimentalmente mediante inyecciones intraplantares del LPS de E. coli en ratones WT (Fig. 4E-G). De manera consistente con el papel principal que TRPA1 tiene en la deteccion del LPS, los ratones Trpal KO mostraron respuestas atenuadas con respecto al WT, y adicionalmente, la inflamacion causada por diferentes tipos de LPS, en funcion de la forma del lipido A, mostro una alta correlacion con la capacidad de estos para estimular mTRPA1 in vitro (r = 0.94; Fig. 4G).
En resumen, los resultados obtenidos indican que el LPS activa el receptor TRPA1 y este canal iónico media en gran parte los efectos nocivos producidos por las endotoxinas bacterianas in vivo. 5
Figura1051015200,51,01,52,0051015200,51,01,52,00102030405060050100150200051015200,51,01,52,0CapsCAFura ratioTiempo (min)LPSsilvestreBCapsCAFura ratioTiempo (min)LPSTlr4 KOAsilvestreTlr4 KOTrpa1 KOTrpv1 KOsilvestreTrpa1 KOsilvestre + HCsilvestre tras HC01020304050TrigéminoNodoso LPS+ CA- LPS+ CA+ LPS- CA+Neuronas con respuesta (%)42 °C15 °C42 °CCapsFrecuencia (impulsos / 5s)Tiempo (min)MOLPSLPSMO0123*Frecuencia relativa**FEDCCapsCAFura ratioTiempo (min)LPSTrpa1 KO
Figura 20510150,00,30,60,902468-4-2024-100-5050-6-3360,1110100020406080100EBADCFura ratioTiempo (min)LPS 3 μg/mlMO 100 μMTiempo (min) MO 20 μM Corriente (nA)LPS 20 μg/mlI (nA)V (mV) Fura ratio normalizadoLPS (μg/ml)-75 mV+75 mV01246*Corriente relativa TRPA1-CHO Mock CHO**LPSHC + LPSLPS, lavado HCLPS + HC01246****Corriente relativa @ -75 mV
Figura 3-10001002000,00,51,01,52,00246810120,00,20,40,60,81,00510150,20,40,60,8024680,40,60,81,01,21,41,61,8ControlLPS 20 μg/mlCorriente de cola normalizadaVoltaje (mV)1 nA200 msControlLPS 20 μg/mlMO 200 μMFura ratioTiempo (min)Lipido A 50 μg/mlE. coliS. typhimuriumK. pneumoniaeS. marcescensP. aeruginosaN. meningitidis0,00,10,20,30,4FDCB∀Fura ratioconicocilindricoAE. coliS. marcescensN. meningitidisEMO 100 μMFura ratioTiempo (min)LPS 20 μg/ml0+175 mV-175 mV-75 mV TNP LPS TNP + LPS Tiempo (min)LPS 1 !g/mlTNP 50 !MMO 100 !M Fura ratio
Figura 40,00,10,20,30,4020406080-5010203040500246Trpa1 KOsilvestreTrpa1 KO0,00,51,01,5**Cambio relativo de EIPRespuesta de TRPA1Inflamacion (μm) Trpa1 KO silvestreTrpa1 KOUmbral mecanico (g) **Tiempo (h)*0601201802403000510152025Pausa respiratoria aumentadaTiempo (min)LPS silvestresilvestreTrpa1 KO012468*Cambio relativo de EEPsilvestreTrpa1 KO0204060CGFDB LPS LPS + HCVasodilatacion (%)****Asilvestre MixtoTrpa1 KO Mixtosilvestre C57BL/6Trpa1 KO C57BL/6020406080EConducta nociceptiva (s)****
LISTA DE SECUENCIAS <110> UNIVERSIDAD MIGUEL HERNANDEZ DE ELCHE CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTTFICAS <120> USO DE ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR TRPA1 PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS A INFECCIONES BACTERIANAS <130> P7110ES00 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Arg Ser Leu Arg Lys Met Trp Arg Pro Gly Glu Lys Lys Glu 1 5 10 15 Pro Gin Gly Val Val Tyr Glu Asp Val Pro Asp Asp Thr Glu Asp Phe 20 25 30 Lys Glu Ser Leu Lys Val Val Phe Glu Gly Ser Ala Tyr Gly Leu Gin 35 40 45 Asn Phe Asn Lys Gin Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asp Asp Met Asp Thr 50 55 60 Phe Phe Leu His Tyr Ala Ala Ala Glu Gly Gin Ile Glu Leu Met Glu 65 70 75 80 Lys Ile Thr Arg Asp Ser Ser Leu Glu Val Leu His Glu Met Asp Asp 85 90 95 Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Cys Ala Val Glu Lys Asn Gin Ile Glu 100 105 110 Ser Val Lys Phe Leu Leu Ser Arg Gly Ala Asn Pro Asn Leu Arg Asn 115 120 125 Phe Asn Met Met Ala Pro Leu His Ile Ala Val Gin Gly Met Asn Asn 130 135 140 Glu Val Met Lys Val Leu Leu Glu His Arg Thr Ile Asp Val Asn Leu 145 150 155 160
Glu Gly Glu Asn Gly Asn Thr Ala Val Ile Ile Ala Cys Thr Thr Asn 165 170 175 Asn Ser Glu Ala Leu Gln Ile Leu Leu Lys Lys Gly Ala Lys Pro Cys 180 185 190 Lys Ser Asn Lys Trp Gly Cys Phe Pro Ile His Gln Ala Ala Phe Ser 195 200 205 Gly Ser Lys Glu Cys Met Glu Ile Ile Leu Arg Phe Gly Glu Glu His 210 215 220 Gly Tyr Ser Arg Gln Leu His Ile Asn Phe Met Asn Asn Gly Lys Ala 225 230 235 240 Thr Pro Leu His Leu Ala Val Gln Asn Gly Asp Leu Glu Met Ile Lys 245 250 255 Met Cys Leu Asp Asn Gly Ala Gln Ile Asp Pro Val Glu Lys Gly Arg 260 265 270 Cys Thr Ala Ile His Phe Ala Ala Thr Gln Gly Ala Thr Glu Ile Val 275 280 285 Lys Leu Met Ile Ser Ser Tyr Ser Gly Ser Val Asp Ile Val Asn Thr 290 295 300 Thr Asp Gly Cys His Glu Thr Met Leu His Arg Ala Ser Leu Phe Asp 305 310 315 320 His His Glu Leu Ala Asp Tyr Leu Ile Ser Val Gly Ala Asp Ile Asn 325 330 335 Lys Ile Asp Ser Glu Gly Arg Ser Pro Leu Ile Leu Ala Thr Ala Ser 340 345 350 Ala Ser Trp Asn Ile Val Asn Leu Leu Leu Ser Lys Gly Ala Gln Val 355 360 365 Asp Ile Lys Asp Asn Phe Gly Arg Asn Phe Leu His Leu Thr Val Gln 370 375 380 Gln Pro Tyr Gly Leu Lys Asn Leu Arg Pro Glu Phe Met Gln Met Gln 385 390 395 400
Gin Ile Lys Glu Leu Val Met Asp Glu Asp Asn Asp Gly Cys Thr Pro 405 410 415 Leu His Tyr Ala Cys Arg Gin Gly Gly Pro Gly Ser Val Asn Asn Leu 420 425 430 Leu Gly Phe Asn Val Ser Ile His Ser Lys Ser Lys Asp Lys Lys Ser 435 440 445 Pro Leu His Phe Ala Ala Ser Tyr Gly Arg Ile Asn Thr Cys Gin Arg 450 455 460 Leu Leu Gin Asp Ile Ser Asp Thr Arg Leu Leu Asn Glu Gly Asp Leu 465 470 475 480 His Gly Met Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Asn Gly His Asp Lys 485 490 495 Val Val Gin Leu Leu Leu Lys Lys Gly Ala Leu Phe Leu Ser Asp His 500 505 510 Asn Gly Trp Thr Ala Leu His His Ala Ser Met Gly Gly Tyr Thr Gin 515 520 525 Thr Met Lys Val Ile Leu Asp Thr Asn Leu Lys Cys Thr Asp Arg Leu 530 535 540 Asp Glu Asp Gly Asn Thr Ala Leu His Phe Ala Ala Arg Glu Gly His 545 550 555 560 Ala Lys Ala Val Ala Leu Leu Leu Ser His Asn Ala Asp Ile Val Leu 565 570 575 Asn Lys Gin Gin Ala Ser Phe Leu His Leu Ala Leu His Asn Lys Arg 580 585 590 Lys Glu Val Val Leu Thr Ile Ile Arg Ser Lys Arg Trp Asp Glu Cys 595 600 605 Leu Lys Ile Phe Ser His Asn Ser Pro Gly Asn Lys Cys Pro Ile Thr 610 615 620 Glu Met Ile Glu Tyr Leu Pro Glu Cys Met Lys Val Leu Leu Asp Phe 625 630 635 640
Cys Met Leu His Ser Thr Glu Asp Lys Ser Cys Arg Asp Tyr Tyr Ile 645 650 655 Glu Tyr Asn Phe Lys Tyr Leu Gin Cys Pro Leu Glu Phe Thr Lys Lys 660 665 670 Thr Pro Thr Gin Asp Val Ile Tyr Glu Pro Leu Thr Ala Leu Asn Ala 675 680 685 Met Val Gin Asn Asn Arg Ile Glu Leu Leu Asn His Pro Val Cys Lys 690 695 700 Glu Tyr Leu Leu Met Lys Trp Leu Ala Tyr Gly Phe Arg Ala His Met 705 710 715 720 Met Asn Leu Gly Ser Tyr Cys Leu Gly Leu Ile Pro Met Thr Ile Leu 725 730 735 Val Val Asn Ile Lys Pro Gly Met Ala Phe Asn Ser Thr Gly Ile Ile 740 745 750 Asn Glu Thr Ser Asp His Ser Glu Ile Leu Asp Thr Thr Asn Ser Tyr 755 760 765 Leu Ile Lys Thr Cys Met Ile Leu Val Phe Leu Ser Ser Ile Phe Gly 770 775 780 Tyr Cys Lys Glu Ala Gly Gin Ile Phe Gin Gin Lys Arg Asn Tyr Phe 785 790 795 800 Met Asp Ile Ser Asn Val Leu Glu Trp Ile Ile Tyr Thr Thr Gly Ile 805 810 815 Ile Phe Val Leu Pro Leu Phe Val Glu Ile Pro Ala His Leu Gin Trp 820 825 830 Gin Cys Gly Ala Ile Ala Val Tyr Phe Tyr Trp Met Asn Phe Leu Leu 835 840 845 Tyr Leu Gin Arg Phe Glu Asn Cys Gly Ile Phe Ile Val Met Leu Glu 850 855 860 Val Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Ser Thr Val Val Phe Ile Phe Leu 865 870 875 880
Leu Leu Ala Phe Gly Leu Ser Phe Tyr Ile Leu Leu Asn Leu Gln Asp 885 890 895 Pro Phe Ser Ser Pro Leu Leu Ser Ile Ile Gln Thr Phe Ser Met Met 900 905 910 Leu Gly Asp Ile Asn Tyr Arg Glu Ser Phe Leu Glu Pro Tyr Leu Arg 915 920 925 Asn Glu Leu Ala His Pro Val Leu Ser Phe Ala Gln Leu Val Ser Phe 930 935 940 Thr Ile Phe Val Pro Ile Val Leu Met Asn Leu Leu Ile Gly Leu Ala 945 950 955 960 Val Gly Asp Ile Ala Glu Val Gln Lys His Ala Ser Leu Lys Arg Ile 965 970 975 Ala Met Gln Val Glu Leu His Thr Ser Leu Glu Lys Lys Leu Pro Leu 980 985 990 Trp Phe Leu Arg Lys Val Asp Gln Lys Ser Thr Ile Val Tyr Pro Asn 995 1000 1005 Lys Pro Arg Ser Gly Gly Met Leu Phe His Ile Phe Cys Phe Leu Phe 1010 1015 1020 Cys Thr Gly Glu Ile Arg Gln Glu Ile Pro Asn Ala Asp Lys Ser Leu 1025 1030 1035 1040 Glu Met Glu Ile Leu Lys Gln Lys Tyr Arg Leu Lys Asp Leu Thr Phe 1045 1050 1055 Leu Leu Glu Lys Gln His Glu Leu Ile Lys Leu Ile Ile Gln Lys Met 1060 1065 1070 Glu Ile Ile Ser Glu Thr Glu Asp Asp Asp Ser His Cys Ser Phe Gln 1075 1080 1085 Asp Arg Phe Lys Lys Glu Gln Met Glu Gln Arg Asn Ser Arg Trp Asn 1090 1095 1100 Thr Val Leu Arg Ala Val Lys Ala Lys Thr His His Leu Glu Pro 1105 1110 1115
<210> 2 <211> 5190 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ccagaagttc tccagggctt ccgcagagcg actttttcgc tgcctgtgag ctgcagcgcg 60 ggagagctcg ggctcgcgcg gaccccagcg cctggcaggc tgacagcgct ctctcgcccc 120 aggtgcccgc gcgcgtggtg agcagctgca ccaggtggcg tccggggtgg ggtcaatgaa 180 gcgcagcctg aggaagatgt ggcgccctgg agaaaagaag gagccccagg gcgttgtcta 240 tgaggatgtg ccggacgaca cggaggattt caaggaatcg cttaaggtgg tttttgaagg 300 aagtgcatat ggattacaaa actttaataa gcaaaagaaa ttaaaaagat gtgacgatat 360 ggacaccttc ttcttgcatt atgctgcagc agaaggccaa attgagctaa tggagaagat 420 caccagagat tcctctttgg aagtgctgca tgaaatggat gattatggaa atacccctct 480 gcattgtgct gtagaaaaaa accaaattga aagcgttaag tttcttctca gcagaggagc 540 aaacccaaat ctccgaaact tcaacatgat ggctcctctc cacatagctg tgcagggcat 600 gaataatgag gtgatgaagg tcttgcttga gcatagaact attgatgtta atttggaagg 660 agaaaatgga aacacagctg tgatcattgc gtgcaccaca aataatagcg aagcattgca 720 gattttgctt aaaaaaggag ctaagccatg taaatcaaat aaatggggat gtttccctat 780 tcaccaagct gcattttcag gttccaaaga atgcatggaa ataatactaa ggtttggtga 840 agagcatggg tacagtagac agttgcacat taactttatg aataatggga aagccacccc 900 tctccacctg gctgtgcaaa atggtgactt ggaaatgatc aaaatgtgcc tggacaatgg 960 tgcacaaata gacccagtgg agaagggaag gtgcacagcc attcattttg ctgccaccca 1020 gggagccact gagattgtta aactgatgat atcgtcctat tctggtagcg tggatattgt 1080 taacacaacc gatggatgtc atgagaccat gcttcacaga gcttcattgt ttgatcacca 1140 tgagctagca gactatttaa tttcagtggg agcagatatt aataagatcg attctgaagg 1200 acgctctcca cttatattag caactgcttc tgcatcttgg aatattgtaa atttgctact 1260 ctctaaaggt gcccaagtag acataaaaga taattttgga cgtaattttc tgcatttaac 1320 tgtacagcaa ccttatggat taaaaaatct gcgacctgaa tttatgcaga tgcaacagat 1380 caaagagctg gtaatggatg aagacaacga tgggtgtact cctctacatt atgcatgtag 1440 acaggggggc cctggttctg taaataacct acttggcttt aatgtgtcca ttcattccaa 1500 aagcaaagat aagaaatcac ctctgcattt tgcagccagt tatgggcgta tcaatacctg 1560
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