ES2408554T3 - Method for preparing porous framework for tissue engineering, cell culture and cell supply - Google Patents

Abstract

Un método para preparar un armazón poroso que comprende las etapas que consisten en: a) preparar una disolución acuosa alcalina que comprende una cantidad de al menos un polisacárido, una cantidadde un agente de reticulación covalente y una cantidad de un agente porógeno, b) transformar la disolución en un hidrogel poniendo dicha disolución a una temperatura de 4°C a 80°C durante untiempo suficiente para permitir la reticulación de dicha cantidad de polisacárido, c) sumergir dicho hidrogel en una disolución acuosa, d) lavar el armazón poroso obtenido en la etapa c).A method for preparing a porous framework comprising the steps consisting of: a) preparing an alkaline aqueous solution comprising an amount of at least one polysaccharide, an amount of a covalent crosslinking agent and an amount of a porogen, b) transforming the solution in a hydrogel by placing said solution at a temperature of 4 ° C to 80 ° C for a time sufficient to allow cross-linking of said amount of polysaccharide, c) submerging said hydrogel in an aqueous solution, d) washing the porous shell obtained in stage c).

Description

Método para preparar armazón poroso para ingeniería de tejidos, cultivo celular y suministro de células. Method for preparing porous framework for tissue engineering, cell culture and cell supply.

Campo de la invención Field of the Invention

La presente invención se refiere a un método para preparar un armazón poroso para ingeniería de tejidos. Es otro objeto de la presente invención proporcionar un armazón poroso obtenible por el método como se describió anteriormente y su uso para ingeniería de tejidos, cultivo celular y suministro de células. The present invention relates to a method for preparing a porous framework for tissue engineering. It is another object of the present invention to provide a porous framework obtainable by the method as described above and its use for tissue engineering, cell culture and cell delivery.

Antecedentes de la invención Background of the invention

La ingeniería de tejidos se define en general como la creación de equivalentes de tejidos u órganos por siembra de células sobre o en un armazón adecuado para implante. Los armazones deben ser compatibles y las células deben ser capaces de unirse y proliferar en los armazones para que formen equivalentes de tejidos u órganos. Estos armazones se pueden considerar, por lo tanto, como sustratos para crecimiento celular in vitro o in vivo. Tissue engineering is generally defined as the creation of tissue or organ equivalents by planting cells on or in a framework suitable for implantation. The frameworks must be compatible and the cells must be able to join and proliferate in the frameworks to form equivalents of tissues or organs. These frameworks can therefore be considered as substrates for cell growth in vitro or in vivo.

Los atributos de un armazón biocompatible ideal incluirían la capacidad para soportar crecimiento celular in vitro o in vivo, la capacidad para soportar el crecimiento de una amplia variedad de tipos de células o linajes, la capacidad para estar dotado de grados variables de flexibilidad o rigidez requerida, la capacidad para presentar grados variables de biodegradabilidad, la capacidad para ser introducido en el sitio deseado in vivo sin provocar un daño secundario y la capacidad para servir como vehículo o depósito para suministro de fármacos o sustancias bioactivas al sitio de acción deseado. The attributes of an ideal biocompatible framework would include the ability to support cell growth in vitro or in vivo, the ability to support the growth of a wide variety of cell types or lineages, the ability to be endowed with varying degrees of flexibility or stiffness required , the ability to present varying degrees of biodegradability, the ability to be introduced at the desired site in vivo without causing secondary damage and the ability to serve as a vehicle or depot for the supply of drugs or bioactive substances to the desired site of action.

Se ha utilizado una serie de diferentes materiales de armazón, para regeneración de tejido guiada y/o como superficies biocompatibles. Los materiales poliméricos biodegradables se prefieren en muchos casos puesto que el armazón se degrada con el tiempo y finalmente la estructura del armazón celular es reemplazada completamente por las células. Entre los muchos candidatos que pueden servir como armazones útiles reivindicados para soportar crecimiento o regeneración de tejidos, se incluyen geles, espumas, láminas y numerosas estructuras en forma de partículas porosas de diferentes formas y conformaciones. A series of different framework materials have been used, for regeneration of guided tissue and / or as biocompatible surfaces. Biodegradable polymeric materials are preferred in many cases since the framework degrades over time and finally the structure of the cellular framework is completely replaced by the cells. Among the many candidates that can serve as useful frameworks claimed to support tissue growth or regeneration, gels, foams, sheets and numerous structures in the form of porous particles of different shapes and conformations are included.

Entre los polímeros naturales colectores que se ha descrito que son útiles para ingeniería o cultivo de tejidos, se pueden enumerar diversos constituyentes de la matriz extracelular incluyendo fibronectina, diversos tipos de colágeno y laminina, así como queratina, fibrina y fibrinógeno, ácido hialurónico, sulfato de heparina, sulfato de condroitina y otros. Among the natural collector polymers that have been described that are useful for tissue engineering or culture, various constituents of the extracellular matrix can be listed including fibronectin, various types of collagen and laminin, as well as keratin, fibrin and fibrinogen, hyaluronic acid, sulfate of heparin, chondroitin sulfate and others.

Otros polímeros comunes que se usaron incluyen poli(lactida-co-glicolida) (PLG). PLG son polímeros hidrolíticamente degradables que son homologados por la FDA para uso en el cuerpo y mecánicamente fuertes (Thomson RC, Yaszemski MJ, Powers JM, Mikos AG. Fabrication of biodegradable polymer scaffolds to engineer trabecular bone. Ed. J Biomater Sci Polym 1.995; 7 (1): 23-38; Wong WH. Mooney DJ. Synthesis and properties of biodegradable polymers used as synthetic matrices for tissue engineering. En: autores Atala A, Mooney DJ; autores asociados Langer R, Vacanti JP. Synthetic biodegradable polymer scaffolds. Boston: Birkhäuser: 1.997. pág. 51-82). Sin embargo, son hidrófobos y se tratan típicamente en condiciones relativamente estrictas, que hace potencialmente un reto la incorporación de factor y la inclusión de células viables. Other common polymers that were used include poly (lactide-co-glycolide) (PLG). PLG are hydrolytically degradable polymers that are FDA approved for use in the body and mechanically strong (Thomson RC, Yaszemski MJ, Powers JM, Mikos AG. Fabrication of biodegradable polymer scaffolds to engineer trabecular bone. Ed. J Biomater Sci Polym 1999; 7 (1): 23-38; Wong WH. Mooney DJ. Synthesis and properties of biodegradable polymers used as synthetic matrices for tissue engineering. In: authors Atala A, Mooney DJ; associated authors Langer R, Vacanti JP. Synthetic biodegradable polymer scaffolds Boston: Birkhäuser: 1997. p. 51-82). However, they are hydrophobic and are typically treated under relatively strict conditions, which potentially incorporates factor incorporation and the inclusion of viable cells.

Como una alternativa, una variedad de hidrogeles, se ha usado una clase de materiales poliméricos altamente hidratados (contenido en agua mayor que 30% en peso) como materiales de armazón. Están constituidos por cadenas poliméricas hidrófilas, que son de origen sintético o natural. La integridad estructural de los hidrogeles depende de las reticulaciones formadas entre cadenas poliméricas por diversos enlaces químicos e interacciones físicas. As an alternative, a variety of hydrogels, a class of highly hydrated polymeric materials (water content greater than 30% by weight) has been used as framework materials. They consist of hydrophilic polymer chains, which are of synthetic or natural origin. The structural integrity of the hydrogels depends on the crosslinks formed between polymer chains by various chemical bonds and physical interactions.

Por ejemplo, la patente de EE.UU. 6.586.246 B1 ha desvelado un método para preparar un armazón de hidrogel poroso que se puede usar como soportes para ingeniería de tejidos o matrices de cultivo. El método del documento comprende las etapas que consisten en: a) disolver un polímero sintético biodegradable en un disolvente orgánico para preparar una disolución polimérica de alta viscosidad b) añadir un agente porógeno a esta disolución; c) moldear el polímero en un molde d) retirar el disolvente orgánico e) sumergir el polímero sin disolvente orgánico / suspensión de gel de sal en una disolución acuosa caliente o disolución ácida para causar que la sal experimente efervescencia a temperatura ambiente para formar el armazón poroso. Sin embargo, este método de preparación de un hidrogel poroso implica el uso de un disolvente orgánico con un polímero sintético que hace el método según esta invención poco compatible con fines biológicos y terapéuticos. For example, US Pat. 6,586,246 B1 has disclosed a method for preparing a porous hydrogel shell that can be used as supports for tissue engineering or culture matrices. The method of the document comprises the steps consisting of: a) dissolving a biodegradable synthetic polymer in an organic solvent to prepare a high viscosity polymer solution b) adding a porogen to this solution; c) molding the polymer in a mold d) removing the organic solvent e) dipping the polymer without organic solvent / salt gel suspension in a hot aqueous solution or acid solution to cause the salt to experience effervescence at room temperature to form the shell porous. However, this method of preparing a porous hydrogel involves the use of an organic solvent with a synthetic polymer that makes the method according to this invention poorly compatible with biological and therapeutic purposes.

La patente de EE.UU. 5840777 desvela un método para producir una espuma de polisacárido tal como quitosán, reticulándolo con glutaraldehído, añadiendo un agente de formación de espuma tal como carbonato de calcio y usándolo como un apósito de herida o como un implante que contiene células. U.S. Pat. 5840777 discloses a method for producing a polysaccharide foam such as chitosan, cross-linking it with glutaraldehyde, adding a foaming agent such as calcium carbonate and using it as a wound dressing or as an implant containing cells.

La patente europea EP 1166987 desvela métodos para producir espumas biocompatibles con una superficie microestructurada dispuesta sobre al menos una superficie de la espuma, que proporciona una plantilla que facilita la organización celular y la regeneración de tejido. El método comprende la etapa de poner en contacto una disolución de polímeros con una superficie de un molde. European Patent EP 1166987 discloses methods for producing biocompatible foams with a microstructured surface disposed on at least one surface of the foam, which provides a template that facilitates cellular organization and tissue regeneration. The method comprises the step of contacting a polymer solution with a surface of a mold.

La patente de EE.UU. 2006/0153814 desvela un método para producir una matriz porosa, que comprende proporcionar una pluralidad de partículas que contienen un catión multivalente, mezclar las partículas con polisacáridos reticulados iónicos y agua para formar una mezcla, introducir un reticulador para solidificar la mezcla, disolver las partículas de la mezcla en un ácido para formar una estructura porosa y neutralizar y reticular la estructura porosa para obtener la matriz porosa. U.S. Pat. 2006/0153814 discloses a method for producing a porous matrix, comprising providing a plurality of particles containing a multivalent cation, mixing the particles with ionic crosslinked polysaccharides and water to form a mixture, introducing a crosslinker to solidify the mixture, dissolving the particles. of the mixture in an acid to form a porous structure and neutralize and cross-link the porous structure to obtain the porous matrix.

Por lo tanto, aún hay una necesidad existente en la técnica de desarrollar un método para preparar matrices de armazón poroso que se puedan usar para fines biológicos y terapéuticos. Therefore, there is still a need in the art to develop a method for preparing porous framework matrices that can be used for biological and therapeutic purposes.

Sumario de la invención Summary of the invention

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para preparar un armazón poroso que Therefore, it is an object of the present invention to provide a method for preparing a porous framework that

comprende las etapas que consisten en: a) preparar una disolución acuosa alcalina que comprende una cantidad de al menos un polisacárido, una cantidad de un agente de reticulación y una cantidad de un agente porógeno. It comprises the stages that consist of: a) preparing an alkaline aqueous solution comprising an amount of at least one polysaccharide, an amount of a crosslinking agent and an amount of a porogen.

b) transformar la disolución en un hidrogel poniendo dicha disolución a una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 80°C durante un tiempo suficiente para permitir la reticulación de dicha cantidad de polisacárido y c) sumergir dicho hidrogel en una disolución acuosa b) transforming the solution into a hydrogel by placing said solution at a temperature of approximately 4 ° C a approximately 80 ° C for a time sufficient to allow cross-linking of said amount of polysaccharide and c) immersing said hydrogel in an aqueous solution

d) lavar el armazón poroso obtenido en la etapa c). Es otro objeto de la presente invención proporcionar un armazón poroso obtenible por el método como se describió en la reivindicación 4. d) wash the porous frame obtained in step c). It is another object of the present invention to provide a porous framework obtainable by the method as described. in claim 4.

Es otro objeto más de la presente invención proporcionar el uso de armazón poroso de la invención para ingeniería de tejidos, cultivo celular y suministro celular. It is yet another object of the present invention to provide the use of porous framework of the invention for engineering. of tissues, cell culture and cell supply.

Descripción detallada de la invención Detailed description of the invention

Definiciones: Definitions:

El término quot;polisacáridoquot;, como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula que comprende dos o más unidades monosacárido. El término quot;disolución alcalinaquot;, como se usa en la presente memoria, indica una disolución con un pH superior a 7. El término quot;disolución ácidaquot;, como se usa en la presente memoria, indica una disolución con un pH inferior a 7. El término quot;disolución acuosaquot;, como se usa en la presente memoria, se refiere a una disolución en que el disolvente The term "polysaccharide", as used herein, refers to a molecule comprising two or more monosaccharide units. The term "alkaline solution" as used herein, indicates a solution with a pH greater than 7. The term "acid solution", as used herein, indicates a solution with a pH below 7. The term "aqueous solution" as used herein refers to a solution in which the solvent

es agua. El término quot;reticulaciónquot; se refiere a la unión de una cadena polimérica a otra con enlaces covalentes. El término quot;agente porógenoquot; indica cualquier agente sólido que tiene la capacidad de formar poros dentro de una is water. The term quot; cross-linkingquot; it refers to the union of one polymer chain to another with covalent bonds. The term quot; porogenic agent; indicates any solid agent that has the ability to form pores within a

estructura sólida. Como se usa en la presente memoria, un quot;armazónquot; se define como un sistema semisólido que comprende una red tridimensional de una o más especies de cadenas de polisacárido. Dependiendo de las propiedades del polisacárido solid structure As used herein, a quot; armazónquot; It is defined as a semi-solid system comprising a network three-dimensional of one or more species of polysaccharide chains. Depending on the properties of the polysaccharide

(o polisacáridos) usado, así como de la naturaleza y densidad de la red, dichas estructuras en equilibrio pueden contener diversas cantidades de agua. El término quot;agente de reticulaciónquot; incluye cualquier agente capaz de introducir reticulación entre las cadenas de los (or polysaccharides) used, as well as the nature and density of the network, such equilibrium structures can Contain various amounts of water. The term "crosslinking agent"; includes any agent capable of introducing crosslinking between the chains of the

polisacáridos de la invención. polysaccharides of the invention.

quot;Biodegradablequot;, como se usa en la presente memoria, se refiere a materiales que se degradan in vivo a compuestos no tóxicos, que pueden ser excretados o metabolizados adicionalmente. Armazones porosos y método para preparar los mismos: Un primer objeto de la invención se refiere a un método para preparar un armazón poroso que comprende las etapas "Biodegradable", as used herein, refers to materials that degrade in vivo to non-toxic compounds, which can be excreted or further metabolized. Porous frames and method to prepare them: A first object of the invention relates to a method for preparing a porous frame comprising the steps

que consisten en: a) preparar una disolución acuosa alcalina que comprende una cantidad de al menos un polisacárido, una cantidad de un agente de reticulación covalente y una cantidad de un agente porógeno which consist of: a) preparing an alkaline aqueous solution comprising an amount of at least one polysaccharide, an amount of a covalent crosslinking agent and an amount of a porogen

b) transformar la disolución en un hidrogel poniendo dicha disolución a una temperatura de 4°C a 80°C durante un tiempo suficiente para permitir la reticulación de dicha cantidad de polisacárido y b) transforming the solution into a hydrogel by placing said solution at a temperature of 4 ° C to 80 ° C for a time sufficient to allow cross-linking of said amount of polysaccharide and

c) sumergir dicho hidrogel en una disolución acuosa c) immersing said hydrogel in an aqueous solution

d) lavar el armazón poroso obtenido en la etapa c). d) wash the porous frame obtained in step c).

En la presente invención, se puede usar cualquier tipo de polisacárido. Los polisacáridos sintéticos o naturales se pueden usar alternativamente para el fin de la invención. Por ejemplo, los polisacáridos naturales adecuados incluyen, pero no se limitan a, dextrano, agar, ácido algínico, ácido hialurónico, inulina, pululano, heparina, fucoidán, quitosán, escleroglucano, curdlan, almidón, celulosa y mezclas de los mismos. Los monosacáridos que se pueden usar para producir el polisacárido deseado incluyen, pero no se limitan a, ribosa, glucosa, manosa, galactosa, fructosa, sorbosa, sorbitol, manitol, iditol, dulcitol y mezclas de los mismos. Se pueden incluir polisacáridos modificados de manera química que soporten por ejemplo grupos ácidos (carboxilato, sulfato, fosfato), grupos amino (etilenamina, dietilamina, dietilaminoetilamina, propilamina), grupos hidrófobos (alquilo, bencilo). Muchos de estos compuestos están comercialmente disponibles en compañías tales como Sigma-Aldrich (St. Louis, Michigan, US). In the present invention, any type of polysaccharide can be used. Synthetic or natural polysaccharides may alternatively be used for the purpose of the invention. For example, suitable natural polysaccharides include, but are not limited to, dextran, agar, alginic acid, hyaluronic acid, inulin, pululane, heparin, fucoid, chitosan, scleroglucan, curdlan, starch, cellulose and mixtures thereof. Monosaccharides that can be used to produce the desired polysaccharide include, but are not limited to, ribose, glucose, mannose, galactose, fructose, sorbose, sorbitol, mannitol, iditol, dulcitol and mixtures thereof. Chemically modified polysaccharides may be included which support for example acid groups (carboxylate, sulfate, phosphate), amino groups (ethylenamine, diethylamine, diethylaminoethylamine, propylamine), hydrophobic groups (alkyl, benzyl). Many of these compounds are commercially available from companies such as Sigma-Aldrich (St. Louis, Michigan, US).

El peso molecular medio ponderal preferido para el polisacárido es de aproximadamente 10.000 Daltons a aproximadamente 2.000.000 Daltons, más preferiblemente de aproximadamente 10.000 Daltons a aproximadamente The preferred weight average molecular weight for the polysaccharide is from about 10,000 Daltons to about 2,000,000 Daltons, more preferably from about 10,000 Daltons to about

500.000 Daltons, lo más preferiblemente de aproximadamente 10.000 Daltons a aproximadamente 200.000 Daltons. 500,000 Daltons, most preferably from about 10,000 Daltons to about 200,000 Daltons.

En una realización de la invención, el polisacárido o los polisacáridos usados para preparar el armazón de la invención es un polisacárido neutro tal como dextrano, agar, pululano, inulina, escleroglucano, curdlan, almidón, celulosa o una mezcla de los mismos. En una realización preferida, se usa una mezcla de pululano y dextrano para preparar el armazón de la invención. Por ejemplo, dicha mezcla comprende 25% de dextrano y 75% de pululano. In one embodiment of the invention, the polysaccharide or polysaccharides used to prepare the framework of the invention is a neutral polysaccharide such as dextran, agar, pululane, inulin, scleroglucan, curdlan, starch, cellulose or a mixture thereof. In a preferred embodiment, a mixture of pululane and dextran is used to prepare the framework of the invention. For example, said mixture comprises 25% dextran and 75% pululane.

En otra realización de la invención, el polisacárido o los polisacáridos usados para preparar el armazón de la invención es un polisacárido cargado de manera positiva tal como quitosán, DEAE-dextrano y mezclas de los mismos. In another embodiment of the invention, the polysaccharide or polysaccharides used to prepare the framework of the invention is a positively charged polysaccharide such as chitosan, DEAE-dextran and mixtures thereof.

En otra realización de la invención, el polisacárido o los polisacáridos usados para preparar el armazón de la invención es un polisacárido cargado de manera negativa tal como ácido algínico, ácido hialurónico, heparina, fucoidán y mezclas de los mismos. In another embodiment of the invention, the polysaccharide or polysaccharides used to prepare the framework of the invention is a negatively charged polysaccharide such as alginic acid, hyaluronic acid, heparin, fucoidan and mixtures thereof.

En otra realización de la invención, el polisacárido o los polisacáridos usados para preparar el armazón de la invención es una mezcla de polisacáridos neutros y cargados de manera negativa, en los que los polisacáridos cargados de manera negativa representan 1 a 20%, preferiblemente 5 a 10% de la mezcla. In another embodiment of the invention, the polysaccharide or polysaccharides used to prepare the framework of the invention is a mixture of neutral and negatively charged polysaccharides, in which negatively charged polysaccharides represent 1 to 20%, preferably 5 to 10% of the mixture.

En una realización particular, el agente de reticulación covalente es seleccionado del grupo que consiste en: trimetafosfato trisódico (STMP), oxicloruro de fósforo (POCl3), epiclorohidrina, formaldehídos, carbodiimidas hidrosolubles, glutaraldehídos o cualquier otro compuesto que sea adecuado para la reticulación de un polisacárido. En una realización preferida, el agente de reticulación es STMP. La concentración del agente de reticulación covalente en la disolución acuosa (p/v) es de aproximadamente 1% a aproximadamente 6%, más preferiblemente de aproximadamente 2% a aproximadamente 6%, lo más preferiblemente de aproximadamente 2% a aproximadamente 3%. Se prefiere usar el agente de reticulación en tal cantidad que la relación en peso del polisacárido al agente de reticulación esté en el intervalo de 20:1 a 1:1, preferiblemente de 15:1 a 1:1 y más preferiblemente de 10:1 a 1:1. In a particular embodiment, the covalent crosslinking agent is selected from the group consisting of: trisodium trimetaphosphate (STMP), phosphorus oxychloride (POCl3), epichlorohydrin, formaldehydes, water soluble carbodiimides, glutaraldehydes or any other compound that is suitable for crosslinking of a polysaccharide In a preferred embodiment, the crosslinking agent is STMP. The concentration of the covalent crosslinking agent in the aqueous solution (w / v) is from about 1% to about 6%, more preferably from about 2% to about 6%, most preferably from about 2% to about 3%. It is preferred to use the crosslinking agent in such an amount that the weight ratio of the polysaccharide to the crosslinking agent is in the range of 20: 1 to 1: 1, preferably 15: 1 to 1: 1 and more preferably 10: 1 to 1: 1.

Muchos de estos compuestos están comercialmente disponibles en compañías tales como Sigma-Aldrich (St. Louis, Michigan, US). Many of these compounds are commercially available from companies such as Sigma-Aldrich (St. Louis, Michigan, US).

La disolución acuosa que comprende el polisacárido puede comprender además diversos aditivos dependiendo de la aplicación deseada. Preferiblemente, el aditivo es compatible con el polisacárido y no interfiere con la reticulación eficaz del polisacárido o de los polisacáridos. La cantidad del aditivo usada depende de la aplicación particular y se puede determinar fácilmente por un experto en la materia usando experimentación de rutina. The aqueous solution comprising the polysaccharide may further comprise various additives depending on the desired application. Preferably, the additive is compatible with the polysaccharide and does not interfere with the effective cross-linking of the polysaccharide or polysaccharides. The amount of the additive used depends on the particular application and can easily be determined by one skilled in the art using routine experimentation.

La disolución acuosa que comprende el polisacárido puede incluir opcionalmente al menos un agente antimicrobiano. Los conservantes antimicrobianos adecuados son conocidos en la técnica. Ejemplos de antimicrobianos adecuados incluyen, pero no se limitan a, alquilparabenos, tales como metilparabén, etilparabén, propilparabén y butilparabén; cresol; clorocresol; hidroquinona; benzoato de sodio; benzoato de potasio; triclosán y clorhexidina. Otros ejemplos de agentes antibacterianos y de agentes anti-infecciosos que se pueden usar son, de una manera no limitante, rifampicina, minociclina, clorhexidina, agentes de iones plata y composiciones a base de plata. The aqueous solution comprising the polysaccharide may optionally include at least one antimicrobial agent. Suitable antimicrobial preservatives are known in the art. Examples of suitable antimicrobials include, but are not limited to, alkylparabenos, such as methylparaben, ethylparaben, propylparaben, and butylparaben; cresol; chlorocresol; hydroquinone; sodium benzoate; potassium benzoate; Triclosan and chlorhexidine. Other examples of antibacterial agents and anti-infectious agents that can be used are, in a non-limiting manner, rifampicin, minocycline, chlorhexidine, silver ion agents and silver-based compositions.

La disolución acuosa que comprende el polisacárido también puede incluir opcionalmente al menos un colorante para aumentar la visibilidad de la disolución. Colorantes adecuados incluyen tintes, pigmentos y agentes colorantes naturales. Ejemplos de colorantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, azul alcián, isotiocianato de fluoresceína (FITC, por sus siglas en inglés) y FITC-dextrano. The aqueous solution comprising the polysaccharide may also optionally include at least one dye to increase the visibility of the solution. Suitable colorants include dyes, pigments and natural coloring agents. Examples of suitable dyes include, but are not limited to, alcian blue, fluorescein isothiocyanate (FITC) and FITC-dextran.

La disolución acuosa que comprende el polisacárido también puede incluir opcionalmente al menos un tensioactivo. Tensioactivo, como se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto que reduce la tensión superficial de agua. El tensioactivo puede ser un tensioactivo iónico, tal como laurilsulfato de sodio, o un tensioactivo neutro, tal como éteres de polioxietileno, ésteres de polioxietileno y polioxietileno sorbitán. The aqueous solution comprising the polysaccharide may also optionally include at least one surfactant. Surfactant, as used herein, refers to a compound that reduces the surface tension of water. The surfactant can be an ionic surfactant, such as sodium lauryl sulfate, or a neutral surfactant, such as polyoxyethylene ethers, polyoxyethylene esters and polyoxyethylene sorbitan.

En una realización particular, el agente porógeno puede ser un agente que se puede transformar en un gas en condiciones ácidas, formándose poros por las moléculas de dióxido de carbono que lixivian del polímero. Ejemplos de dicho agente porógeno incluyen, pero no se limitan a, carbonato de amonio, bicarbonato de amonio, carbonato de sodio y bicarbonato de sodio, carbonato de calcio y mezclas de los mismos. Se prefiere usar el agente porógeno en tal cantidad que la relación en peso del polisacárido al agente porógeno esté en el intervalo de 6:1 a 1:1, preferiblemente de 4:1 a 1:1, más preferiblemente a 2:1 a 1:1. Muchos de estos compuestos están comercialmente disponibles en compañías tales como Sigma-Aldrich (St. Louis, Michigan, US). En una realización, la relación del polisacárido al agente porógeno puede estar en el intervalo de 6:1 a 0,5:1, preferiblemente de 4:1 a 0,5:1, más preferiblemente a 2:1 a 0,5:1. En otra realización, aunque el polisacárido es un polisacárido cargado de manera positiva, la relación del polisacárido al agente porógeno puede estar en el intervalo de 50:1 a 1:1, preferiblemente de In a particular embodiment, the porogen can be an agent that can be transformed into a gas under acidic conditions, pores being formed by the carbon dioxide molecules that leach from the polymer. Examples of said porogen include, but are not limited to, ammonium carbonate, ammonium bicarbonate, sodium carbonate and sodium bicarbonate, calcium carbonate and mixtures thereof. It is preferred to use the porogen in such an amount that the weight ratio of the polysaccharide to the porogen is in the range of 6: 1 to 1: 1, preferably 4: 1 to 1: 1, more preferably 2: 1 to 1 :one. Many of these compounds are commercially available from companies such as Sigma-Aldrich (St. Louis, Michigan, US). In one embodiment, the ratio of the polysaccharide to the porogen may be in the range of 6: 1 to 0.5: 1, preferably 4: 1 to 0.5: 1, more preferably 2: 1 to 0.5: one. In another embodiment, although the polysaccharide is a positively charged polysaccharide, the ratio of the polysaccharide to the porogen may be in the range of 50: 1 to 1: 1, preferably of

20:1 a 1:1 y más preferiblemente de 10:1 a 1:1. 20: 1 to 1: 1 and more preferably from 10: 1 to 1: 1.

En esta realización particular, la disolución acuosa de la etapa c) es una disolución ácida. El ácido puede ser seleccionado del grupo que consiste en: ácido cítrico, ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fórmico, ácido tartárico, ácido salicílico, ácido benzoico y ácido glutámico. In this particular embodiment, the aqueous solution of step c) is an acid solution. The acid can be selected from the group consisting of: citric acid, hydrochloric acid, acetic acid, formic acid, tartaric acid, salicylic acid, benzoic acid and glutamic acid.

Alternativamente, el agente porógeno puede ser una sal inorgánica que se puede disolver una vez que el armazón de polisacárido reticulado se sumerge en agua. Un ejemplo de dicho agente porógeno incluye disolución saturada de sal, que se disolvería progresivamente. En esta realización particular, la disolución acuosa de la etapa c) es una disolución acuosa, preferiblemente agua y más preferiblemente agua destilada. Alternatively, the porogen may be an inorganic salt that can be dissolved once the cross-linked polysaccharide shell is immersed in water. An example of such a porogen includes saturated salt solution, which would dissolve progressively. In this particular embodiment, the aqueous solution of step c) is an aqueous solution, preferably water and more preferably distilled water.

La concentración del agente porógeno afecta al tamaño de los poros formados en los armazones, a fin de que el tamaño de poro pueda estar bajo el control de la concentración de dicho agente porógeno. The concentration of the porogen affects the size of the pores formed in the frames, so that the pore size can be under the control of the concentration of said porogen.

El tamaño de poro medio del armazón es de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 500 μm, preferiblemente de aproximadamente 150 μm a aproximadamente 350 μm, más preferiblemente de aproximadamente 175 μm a aproximadamente 300 μm. La densidad de los poros o porosidad es de aproximadamente 4% a aproximadamente 75%, preferiblemente de aproximadamente 4% a aproximadamente 50%. The average pore size of the frame is from about 1 µm to about 500 µm, preferably from about 150 µm to about 350 µm, more preferably from about 175 µm to about 300 µm. The density of the pores or porosity is from about 4% to about 75%, preferably from about 4% to about 50%.

En otra realización, el método de la invención puede comprender una etapa adicional que consiste en liofilizar el armazón obtenido en la etapa d). La liofilización se puede realizar con cualquier aparato conocido en la técnica. Hay esencialmente tres categorías de liofilizadores: evaporadores rotatorios, liofilizadores colectores y liofilizadores de bandeja. Dichos aparatos son conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles tal como un liofilizador Lyovac (GT2, bomba de álabes rotatoria STERIS, BOC EDWARDS). Básicamente, el vacío de la cámara es de 10 Pa (0,1 mBar) a aproximadamente 650 Pa (6,5 mBar). La liofilización se realiza durante un tiempo suficiente para retirar al menos 98,5% del agua, preferiblemente al menos 99% del agua, más preferiblemente al menos 99,5%. In another embodiment, the method of the invention may comprise an additional step consisting of lyophilizing the framework obtained in step d). Lyophilization can be performed with any apparatus known in the art. There are essentially three categories of freeze dryers: rotary evaporators, collector freeze dryers and tray freeze dryers. Such devices are known in the art and are commercially available such as a Lyovac lyophilizer (GT2, STERIS rotary blade pump, BOC EDWARDS). Basically, the chamber vacuum is from 10 Pa (0.1 mBar) to approximately 650 Pa (6.5 mBar). Lyophilization is carried out for a time sufficient to remove at least 98.5% of the water, preferably at least 99% of the water, more preferably at least 99.5%.

En otra realización, el método de la invención puede comprender una etapa adicional que consiste en hidratar el armazón cuando se prepara según la invención. Dicha hidratación se puede realizar sumergiendo el armazón en una disolución acuosa (por ej., agua desionizada, agua filtrada por ósmosis inversa, una disolución salina o una disolución acuosa que contiene un ingrediente activo adecuado) durante una cantidad de tiempo suficiente para producir un armazón con el contenido en agua deseado. Por ejemplo, cuando se desea un armazón que comprende el máximo contenido en agua, el armazón se sumerge en la disolución acuosa durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir que el armazón se hinche a su máximo tamaño o volumen. Típicamente, el armazón se sumerge en la disolución acuosa durante al menos aproximadamente 1 hora, preferiblemente al menos aproximadamente 2 horas y más preferiblemente aproximadamente 4 horas a aproximadamente 24 horas. Se entiende que la cantidad de tiempo necesaria para hidratar el armazón al nivel deseado dependerá de diversos factores, tales como la composición de los polisacáridos usados, el tamaño (por ej., espesor) del armazón y la temperatura de la disolución acuosa, así como otros factores. In another embodiment, the method of the invention may comprise an additional step consisting in hydrating the frame when it is prepared according to the invention. Such hydration can be performed by immersing the frame in an aqueous solution (e.g., deionized water, water filtered by reverse osmosis, a saline solution or an aqueous solution containing a suitable active ingredient) for a sufficient amount of time to produce a frame. with the desired water content. For example, when a framework comprising the maximum water content is desired, the framework is immersed in the aqueous solution for a sufficient amount of time to allow the framework to swell to its maximum size or volume. Typically, the shell is immersed in the aqueous solution for at least about 1 hour, preferably at least about 2 hours and more preferably about 4 hours to about 24 hours. It is understood that the amount of time required to hydrate the frame to the desired level will depend on various factors, such as the composition of the polysaccharides used, the size (eg, thickness) of the frame and the temperature of the aqueous solution, as well as Other factors

En una realización particular, el armazón hidratado comprende 80% de agua, preferiblemente 90% de agua, lo más preferiblemente 95% de agua. In a particular embodiment, the hydrated shell comprises 80% water, preferably 90% water, most preferably 95% water.

En otra realización particular, la disolución acuosa de la etapa a) puede ser vertida en un molde antes de la etapa b), a fin de que el armazón poroso obtenido con el método de la invención pueda tomar una forma deseada. Se puede usar cualquier molde geométrico según la invención. También se pueden prever diferentes tamaños. Por ejemplo, típicamente, la disolución acuosa puede ser vertida en un molde tubular con un eje central a fin de que el armazón poroso pueda ser tubular con un diámetro externo e interno deseado. El molde se puede fabricar de cualquier material, pero el material preferido incluye superficies no pegajosas tales como Teflón. In another particular embodiment, the aqueous solution of step a) can be poured into a mold before step b), so that the porous shell obtained with the method of the invention can take a desired shape. Any geometric mold according to the invention can be used. Different sizes can also be provided. For example, typically, the aqueous solution can be poured into a tubular mold with a central axis so that the porous shell can be tubular with a desired external and internal diameter. The mold can be made of any material, but the preferred material includes non-stick surfaces such as Teflon.

Alternativamente, los armazones de la invención se pueden cortar y conformar para tomar un tamaño y forma deseados. Alternatively, the frames of the invention can be cut and shaped to take a desired size and shape.

Los métodos de la invención pueden incluir además la etapa de esterilizar el armazón usando cualquier procedimiento adecuado. El armazón puede ser esterilizado en cualquier punto adecuado, pero se esteriliza preferiblemente antes de que se hidrate el armazón. Una técnica de esterilización por radiación adecuada es por ejemplo una irradiación con Cesio 137, 35 Gray durante 10 minutos. Las técnicas de esterilización no por radiación adecuadas incluyen, pero no se limitan a, métodos de exposición a UV, plasma gaseoso o de óxido de etileno conocidos en la técnica. Por ejemplo, el armazón se puede esterilizar usando un sistema de esterilización que esté disponible en Abtox, Inc de Mundelein, Illinois con la marca registrada PlazLyte o según los procedimientos de esterilización de plasma gaseoso desvelados en las patentes de EE.UU. 5413760 y 5603895. The methods of the invention may further include the step of sterilizing the frame using any suitable procedure. The frame can be sterilized at any suitable point, but is preferably sterilized before the frame is hydrated. A suitable radiation sterilization technique is for example an irradiation with Cesium 137, Gray for 10 minutes. Suitable non-radiation sterilization techniques include, but are not limited to, UV exposure, gaseous plasma or ethylene oxide methods known in the art. For example, the framework can be sterilized using a sterilization system that is available in Abtox, Inc of Mundelein, Illinois under the trademark PlazLyte or according to the gas plasma sterilization procedures disclosed in US Pat. 5413760 and 5603895.

El armazón producido por los métodos de la invención se puede envasar en cualquier material de envasado adecuado. Deseablemente, el material de envasado mantiene la esterilidad del armazón hasta que se rompe el material de envasado. The frame produced by the methods of the invention can be packaged in any suitable packaging material. Desirably, the packaging material maintains the sterility of the frame until the packaging material breaks.

En otra realización, se puede incorporar una o más biomoléculas en el armazón poroso. Las biomoléculas pueden comprender, en otras realizaciones, drogas, hormonas, antibióticos, sustancias antimicrobianas, tintes, sustancias radiactivas, sustancias fluorescentes, sustancias antibacterianas, productos químicos o agentes, incluyendo cualquier combinación de los mismos. Las sustancias se pueden usar para mejorar los efectos del tratamiento, aumentar la visualización, indicar la orientación apropiada, resistir a la infección, activar la curación, aumentar la suavidad o cualquier otro efecto deseado. En dicha realización, el armazón de la invención, que comprende una o más biomoléculas como se describió en la presente memoria anteriormente, se puede usar como un sistema de liberación controlada de un agente activo. In another embodiment, one or more biomolecules can be incorporated into the porous shell. Biomolecules may comprise, in other embodiments, drugs, hormones, antibiotics, antimicrobial substances, dyes, radioactive substances, fluorescent substances, antibacterial substances, chemicals or agents, including any combination thereof. The substances can be used to improve the effects of treatment, increase visualization, indicate proper orientation, resist infection, activate healing, increase softness or any other desired effect. In said embodiment, the framework of the invention, comprising one or more biomolecules as described hereinbefore, can be used as a controlled release system of an active agent.

El armazón producido por los métodos de la invención está exento de factores de crecimiento y otros estimulantes del crecimiento. En una realización, la biomolécula puede comprender agentes quimiotácticos, antibióticos, analgésicos esteroideos o no esteroideos, antiinflamatorios, inmunodepresores, fármacos anti-cáncer, diversas proteínas (por ej., péptidos de cadena corta, proteínas morfogénicas óseas, glicoproteína y lipoproteína); mediadores de unión celular; ligandos biológicamente activos; secuencia de unión de integrina; ligandos; diversos agentes de crecimiento y/o diferenciación (por ej., factor de crecimiento epidérmico, IGF-I, IGF-II, TGF-[beta], factores de crecimiento y diferenciación, factor SDF-1 derivado del estroma; factores de crecimiento endotelial vascular, factores de crecimiento de fibroblastos, factores de crecimiento procedentes de plaquetas, factor de crecimiento procedente de insulina y factores de crecimiento de transformación, hormona paratiroidea, péptido relacionado con la hormona paratiroidea, bFGF; factores de la superfamilia TGF[beta]; BMP-2; BMP-4; BMP-6; BMP-12; erizo sónico; GDF5; GDF6; GDF8; PDGF); pequeñas moléculas que afectan la regulación hacia arriba de los factores de crecimiento específicos; tenascina-C; ácido hialurónico; sulfato de condroitina; fibronectina; decorina; tromboelastina; péptidos procedentes de trombina; dominios de unión a heparina; heparina; heparán sulfato; fragmentos de ADN, plásmidos de ADN, Si-ARN, agentes transinfección o cualquier combinación de los mismos. The framework produced by the methods of the invention is free of growth factors and other growth stimulants. In one embodiment, the biomolecule may comprise chemotactic agents, antibiotics, steroidal or non-steroidal analgesics, anti-inflammatories, immunosuppressants, anti-cancer drugs, various proteins (eg, short chain peptides, bone morphogenic proteins, glycoprotein and lipoprotein); cell binding mediators; biologically active ligands; integrin binding sequence; ligands; various growth and / or differentiation agents (eg, epidermal growth factor, IGF-I, IGF-II, TGF- [beta], growth and differentiation factors, stromal-derived SDF-1 factor; endothelial growth factors vascular, fibroblast growth factors, platelet-derived growth factors, insulin-derived growth factor and transformation growth factors, parathyroid hormone, parathyroid hormone-related peptide, bFGF; TGF superfamily factors [beta]; BMP -2; BMP-4; BMP-6; BMP-12; sonic hedgehog; GDF5; GDF6; GDF8; PDGF); small molecules that affect the upward regulation of specific growth factors; tenascin-C; hyaluronic acid; chondroitin sulfate; fibronectin; decorina; thromboelastin; peptides from thrombin; heparin binding domains; heparin; heparan sulfate; DNA fragments, DNA plasmids, Si-RNA, transfection agents or any combination thereof.

En una realización los factores de crecimiento incluyen factor de crecimiento de unión a heparina (HBGF), factor de crecimiento de transformación alfa o beta (TGF.beta.), factor de crecimiento fibroblástico alfa (FGF), factor de crecimiento epidérmico (TGF), factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y SDF-1, algunos de los cuales también son factores angiogénicos. En otra realización los factores incluyen hormonas tales como insulina, glucagón y estrógeno. En algunas realizaciones, puede ser deseable incorporar factores tales como factor de crecimiento nervioso (NGF, por sus siglas en inglés) o factor morfogénico muscular (MMF, por sus siglas en inglés). En una realización, se incorporan TNF alfa/beta o Metaloproteinasas de matriz (las MMP, por sus siglas en inglés). In one embodiment the growth factors include heparin-binding growth factor (HBGF), alpha or beta transformation growth factor (TGF.beta.), Alpha fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (TGF) , vascular endothelial growth factor (VEGF) and SDF-1, some of which are also angiogenic factors. In another embodiment the factors include hormones such as insulin, glucagon and estrogen. In some embodiments, it may be desirable to incorporate factors such as nerve growth factor (NGF) or muscle morphogenic factor (MMF). In one embodiment, TNF alpha / beta or matrix metalloproteinases (MMPs) are incorporated.

Adicionalmente, los armazones de la invención pueden incluir opcionalmente agentes antiinflamatorios, tales como indometacina, acetato - ácido salicílico, ibuprofeno, sulindaco, piroxicam y naproxeno; agentes trombogénicos, tales como trombina, fibrinógeno, homocisteína y estramustina y compuestos radiopacos, tales como sulfato de bario, partículas de oro y nanopartículas de óxido de hierro (las USPIO). Additionally, the frameworks of the invention may optionally include anti-inflammatory agents, such as indomethacin, acetate-salicylic acid, ibuprofen, sulindac, piroxicam and naproxen; thrombogenic agents, such as thrombin, fibrinogen, homocysteine and estramustine and radiopaque compounds, such as barium sulfate, gold particles and iron oxide nanoparticles (the USPIO).

Adicionalmente, los armazones de la invención pueden comprender opcionalmente agentes antitrombóticos tales como antivitamina K o aspirina, agentes antiplaquetarios tales como aspirina, tienopiridina, dipiridamol o clopidogrel (que inhibe de manera selectiva y de manera irreversible agregación de plaquetas inducida por adenosina difosfato (ADP)) o agente anticoagulante tal como heparina o fucoidán. La combinación de heparina (anticoagulante) y tirofibán (agente antiplaquetario) se ha demostrado eficaz en la reducción tanto de trombo como tromboembólico y se pueden incorporar. La genisteína, una isoflavona potencial que posee propiedades antiplaquetas y antiproliferativas dependientes de la dosis e inhibe la agregación plaquetaria inducida por colágeno responsable de trombosis primaria, también se puede incorporar. Additionally, the frameworks of the invention may optionally comprise antithrombotic agents such as antivitamin K or aspirin, antiplatelet agents such as aspirin, thienopyridine, dipyridamole or clopidogrel (which selectively and irreversibly inhibits platelet aggregation induced by adenosine diphosphate (ADP) ) or anticoagulant agent such as heparin or fucoidan. The combination of heparin (anticoagulant) and tirofiban (antiplatelet agent) has proven effective in reducing both thrombus and thromboembolic and can be incorporated. Genistein, a potential isoflavone that possesses dose-dependent antiplatelet and antiproliferative properties and inhibits collagen-induced platelet aggregation responsible for primary thrombosis, can also be incorporated.

Métodos para usar los armazones de la invención: Methods for using the frames of the invention:

Los armazones de la invención son adecuados especialmente para ingeniería de tejidos, reparación o regeneración. Una diferencia en porosidad puede facilitar la migración de diferentes tipos de células a las regiones apropiadas del armazón. En otra realización, una diferencia en porosidad puede facilitar el desarrollo de conexiones célula a célula apropiadas entre los tipos de células que comprende el armazón, requeridos para la estructuración apropiada del tejido de desarrollo/reparación/regeneración. Por ejemplo, la extensión de los procesos celulares se puede adaptar más apropiadamente vía la porosidad variada del material de armazón. Por lo tanto, el armazón puede comprender células de cualquier tejido. The frames of the invention are especially suitable for tissue engineering, repair or regeneration. A difference in porosity can facilitate the migration of different types of cells to the appropriate regions of the framework. In another embodiment, a difference in porosity can facilitate the development of appropriate cell-to-cell connections between the types of cells comprising the framework, required for proper structuring of the development / repair / regeneration tissue. For example, the extent of cellular processes can be more appropriately adapted via the varied porosity of the framework material. Therefore, the framework can comprise cells of any tissue.

En una realización particular, las células se siembran sobre dicho armazón. En otra realización, los armazones de la invención se sumergen en una disolución de cultivo que comprende las células deseadas durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir la penetración de las células por el armazón. In a particular embodiment, the cells are seeded on said framework. In another embodiment, the frameworks of the invention are immersed in a culture solution comprising the desired cells for a sufficient amount of time to allow penetration of the cells through the framework.

En otra realización, el armazón de la invención es capaz de soportar la viabilidad y el crecimiento de células sembradas en cultivo durante periodos de tiempo prolongados sin inducir diferenciación. In another embodiment, the framework of the invention is capable of supporting the viability and growth of cells seeded in culture for prolonged periods of time without inducing differentiation.

En otra realización, el armazón de la invención proporciona un entorno para crecimiento celular no estimulado (sin activación por estimulantes del crecimiento). In another embodiment, the framework of the invention provides an environment for unstimulated cell growth (without activation by growth stimulants).

En otra realización, el armazón de la invención se puede usar para estudiar procesos fisiológicos y patológicos tales como crecimiento de tejidos, reestructuración ósea, curación de heridas, tumorigénesis (incluyendo migración e invasión), diferenciación y angiogénesis. El armazón permite la creación de entornos definidos y controlados donde se pueden modular y estudiar procesos específicos de una manera controlada sin factores endógenos. In another embodiment, the framework of the invention can be used to study physiological and pathological processes such as tissue growth, bone restructuring, wound healing, tumorigenesis (including migration and invasion), differentiation and angiogenesis. The framework allows the creation of defined and controlled environments where specific processes can be modulated and studied in a controlled manner without endogenous factors.

En particular, el armazón de la invención se puede usar para cultivo 3D para dosis de diagnóstico o toxicológicas. En esta realización, el armazón de la invención permitiría la evaluación de la toxicidad de un producto directamente sobre células presentes en un entorno 3D. En dicha realización, el armazón de la invención se usa para cultivar células útiles para la evaluación de la toxicidad y/o farmacología de un producto, tales como hepatocitos, células madre embriónicas, células epiteliales, queratinocitos o células madre pluripotentes inducidas (células iPS, por sus siglas en inglés). In particular, the framework of the invention can be used for 3D culture for diagnostic or toxicological doses. In this embodiment, the framework of the invention would allow the evaluation of the toxicity of a product directly on cells present in a 3D environment. In said embodiment, the framework of the invention is used to grow cells useful for the evaluation of the toxicity and / or pharmacology of a product, such as hepatocytes, embryonic stem cells, epithelial cells, keratinocytes or induced pluripotent stem cells (iPS cells, for its acronym in English).

En otra realización, el armazón de la invención es capaz de soportar crecimiento y diferenciación de tipos de células in vitro e in vivo. In another embodiment, the framework of the invention is capable of supporting growth and differentiation of cell types in vitro and in vivo.

En otra realización, las células son células madre o progenitoras. En otra realización las células pueden incluir, pero no se limitan a, condrocitos; fibrocondrocitos; osteocitos; osteoblastos; osteoclastos; sinoviocitos; células de médula ósea; células mesenquimales: células epiteliales, hepatocitos, células musculares; células estromales; células madre; células madre embriónicas; células precursoras procedentes de tejido adiposo; células progenitoras de sangre periférica; células madre aisladas de tejido adulto; células madre pluripotentes inducidas (células iPS); células transformadas de manera genética; una combinación de condrocitos y otras células; una combinación de osteocitos y otras células; una combinación de sinoviocitos y otras células; una combinación de células de médula ósea y otras células; una combinación de células mesenquimatosas y otras células; una combinación de células estromales y otras células; una combinación de células madre y otras células; una combinación de células madre embriónicas y otras células; una combinación de células progenitoras aisladas de tejido adulto y otras células; una combinación de células progenitoras de sangre periférica y otras células; una combinación de células madre aisladas de tejido adulto y otras células y una combinación de células transformadas de manera genética y otras células. In another embodiment, the cells are stem or progenitor cells. In another embodiment the cells may include, but are not limited to, chondrocytes; fibrochondrocytes; osteocytes; osteoblasts; osteoclasts; synoviocytes; bone marrow cells; mesenchymal cells: epithelial cells, hepatocytes, muscle cells; stromal cells; mother cells; embryonic stem cells; precursor cells from adipose tissue; peripheral blood progenitor cells; stem cells isolated from adult tissue; induced pluripotent stem cells (iPS cells); genetically transformed cells; a combination of chondrocytes and other cells; a combination of osteocytes and other cells; a combination of synoviocytes and other cells; a combination of bone marrow cells and other cells; a combination of mesenchymal cells and other cells; a combination of stromal cells and other cells; a combination of stem cells and other cells; a combination of embryonic stem cells and other cells; a combination of progenitor cells isolated from adult tissue and other cells; a combination of peripheral blood progenitor cells and other cells; a combination of stem cells isolated from adult tissue and other cells and a combination of genetically transformed cells and other cells.

En otra realización, cualquiera de estas células para uso en los armazones y los métodos de la invención, puede ser lograda por ingeniería genética para expresar una molécula deseada, tal como por ejemplo proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés), gen indicador (luciferasa, fosfatasa alcalina), factor de crecimiento de unión a heparina (HBGF), factor de crecimiento de transformación alfa o beta (TGF.beta.), factor de crecimiento fibroblástico alfa (FGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento epidérmico (TGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) y SDF-1, algunos de los cuales son también factores angiogénicos. En otra realización, los factores expresados incluyen hormonas tales como insulina, glucagón y estrógeno. En otra realización, se expresan factores tales como factor de crecimiento nervioso (NGF, por sus siglas en inglés) o factor morfogénico muscular (MMF, por sus siglas en inglés) o en otra realización, TNF alfa/beta. In another embodiment, any of these cells for use in the frameworks and methods of the invention can be achieved by genetic engineering to express a desired molecule, such as, for example, green fluorescent protein (GFP), gene indicator (luciferase, alkaline phosphatase), heparin-binding growth factor (HBGF), alpha or beta transformation growth factor (TGF.beta.), alpha fibroblast growth factor (FGF), factor of epidermal growth (TGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and SDF-1, some of which are also angiogenic factors. In another embodiment, the expressed factors include hormones such as insulin, glucagon and estrogen. In another embodiment, factors such as nerve growth factor (NGF) or muscle morphogenic factor (MMF) or in another embodiment, TNF alpha / beta are expressed.

En una realización particular, los armazones de la invención son adecuados para preparar sustitutos vasculares para reemplazar arterias comprometidas como se describe por ejemplo, en Chaouat et al. (Chaouat M, Le Visage C, Autissier A, Chaubet F, Letourneur D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. Nov 2.006; 27 (32): 5.546-53. Epub 20 de Jul. de 2.006). Dichos sustitutos se pueden preparar según los métodos de la invención usando un molde como se describió anteriormente. Dichos sustitutos pueden comprender después una población de células para reconstruir in vitro o in vivo un vaso. En otra realización, las células pueden incluir, pero no se limitan a, Células Madre Mesenquimales (MSC, por sus siglas en inglés), Células Progenitoras Epiteliales (las EPC, por sus siglas en inglés), células endoteliales, células fibroblásticas y células de músculo liso. In a particular embodiment, the frames of the invention are suitable for preparing vascular substitutes to replace compromised arteries as described for example, in Chaouat et al. (Chaouat M, Le Visage C, Autissier A, Chaubet F, Letourneur D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. Nov 2.006; 27 (32): 5.546-53. Epub Jul 20 .006). Such substitutes can be prepared according to the methods of the invention using a mold as described above. Said substitutes may then comprise a population of cells to reconstruct a vessel in vitro or in vivo. In another embodiment, the cells may include, but are not limited to, Mesenchymal Stem Cells (MSC), Epithelial Progenitor Cells (EPCs), endothelial cells, fibroblast cells, and smooth muscle.

En otra realización particular, los armazones de la invención son adecuados para preparar cartílago o implantes óseos. De tal manera, los armazones de la invención pueden ser cargados con condrocitos, osteocitos; osteoblastos; osteoclastos; células vasculares o mezclas de los mismos y se pueden cultivar en presencia de agentes de diferenciación. In another particular embodiment, the frames of the invention are suitable for preparing cartilage or bone implants. Thus, the frames of the invention can be loaded with chondrocytes, osteocytes; osteoblasts; osteoclasts; vascular cells or mixtures thereof and can be cultured in the presence of differentiation agents.

El sitio de implantación depende de la enfermedad/tejido dañado que requiere tratamiento. Por ejemplo, para tratar defectos estructurales en cartílago articular, menisco y hueso, el armazón de material compuesto sembrado de células se pondrá en el sitio del defecto para fomentar la reparación del tejido dañado. The implantation site depends on the disease / damaged tissue that requires treatment. For example, to treat structural defects in articular cartilage, meniscus and bone, the composite frame seeded from cells will be placed at the site of the defect to promote repair of damaged tissue.

En el caso de lesiones del sistema nervioso central (SNC), el armazón de material compuesto se puede sembrar con una combinación de células madre neuronales adultas, células madre embriónicas, células gliales y células de Sertoli. En la realización preferida, el armazón de material compuesto se puede sembrar con células de Sertoli procedentes de estirpes celulares transformadas, fuentes xenogénicas o alogénicas junto con células madre neuronales. Las células de Sertoli se pueden cultivar con el armazón de material compuesto durante un periodo antes de la adición de células madre y posterior implantación en el sitio de la lesión. Esta propuesta puede evitar uno de los mayores obstáculos del tratamiento celular para aplicaciones del SNC, es decir la supervivencia de las células madre después de trasplante. Un armazón de material compuesto que atrape un gran número de células de Sertoli puede proporcionar un entorno que es más susceptible de supervivencia de células madre. In the case of lesions of the central nervous system (CNS), the composite framework can be seeded with a combination of adult neuronal stem cells, embryonic stem cells, glial cells and Sertoli cells. In the preferred embodiment, the composite framework can be seeded with Sertoli cells from transformed cell lines, xenogeneic or allogeneic sources together with neuronal stem cells. Sertoli cells can be cultured with the composite shell for a period before the addition of stem cells and subsequent implantation at the site of injury. This proposal can avoid one of the biggest obstacles of cellular treatment for CNS applications, that is, the survival of stem cells after transplantation. A composite shell that traps a large number of Sertoli cells can provide an environment that is more susceptible to stem cell survival.

De acuerdo con esto, el armazón de polisacáridos poroso, que se prepara según la presente invención, se puede usar con eficacia como materia prima para la fabricación de tejidos u órganos artificiales tales como vasos sanguíneos artificiales, vesícula artificial, esófago artificial, nervios artificiales, corazones artificiales, válvulas cardíacas prostáticas, pieles artificiales, implantes ortopédicos, músculos artificiales, ligamentos artificiales, órganos respiratorios artificiales, etc. Además, el armazón de polisacáridos poroso de la presente invención se puede preparar en la forma de un tejido híbrido por mezcla o incorporación sobre o en otros tipos de biomateriales y con células funcionales procedentes de tejidos u órganos. Puede presentar diversas aplicaciones biomédicas, por ejemplo, para mantener funciones celulares, regeneración de tejidos, etc. Accordingly, the porous polysaccharide framework, which is prepared according to the present invention, can be used effectively as a raw material for the manufacture of artificial tissues or organs such as artificial blood vessels, artificial vesicle, artificial esophagus, artificial nerves, artificial hearts, prostate heart valves, artificial skins, orthopedic implants, artificial muscles, artificial ligaments, artificial respiratory organs, etc. In addition, the porous polysaccharide framework of the present invention can be prepared in the form of a hybrid tissue by mixing or incorporation onto or in other types of biomaterials and with functional cells from tissues or organs. It can present various biomedical applications, for example, to maintain cellular functions, tissue regeneration, etc.

Alternativamente, los armazones de la invención se pueden usar para suministro celular. En realidad, los armazones de la invención se pueden usar como una materia prima para preparar sistemas de suministro celular que se pueden administrar a un individuo para fines terapéuticos o de diagnóstico. En una realización particular, los armazones de la invención se pueden usar para preparar un parche, una biopelícula o un apósito que se pueden cargar con células. Por ejemplo, los armazones de la invención se pueden usar para preparar un apósito que se puede aplicar sobre la piel, para reconstrucción o curación de la piel. Alternativamente, dicho apósito se puede usar para aplicarse al corazón de un individuo para tratar isquemia (infarto agudo de miocardio). En esas realizaciones, las células que están atrapadas en el armazón pueden migrar así al tejido u órgano objetivo. Alternatively, the frames of the invention can be used for cellular delivery. In reality, the frameworks of the invention can be used as a raw material to prepare cellular delivery systems that can be administered to an individual for therapeutic or diagnostic purposes. In a particular embodiment, the frames of the invention can be used to prepare a patch, a biofilm or a dressing that can be loaded with cells. For example, the frameworks of the invention can be used to prepare a dressing that can be applied to the skin, for reconstruction or healing of the skin. Alternatively, said dressing can be used to apply to the heart of an individual to treat ischemia (acute myocardial infarction). In those embodiments, the cells that are trapped in the framework can thus migrate to the target tissue or organ.

En otra realización, los armazones de la invención se pueden usar para cultivar células. Las células se pueden estimular después para experimentar crecimiento de diferenciación u otros procesos fisiológicos por la adición de factores de crecimiento apropiados. El medio de cultivo que contiene una o más citocinas, factores de crecimiento, hormonas o una combinación de los mismos, se puede usar para mantener las células en un estado no diferenciado In another embodiment, the frameworks of the invention can be used to grow cells. The cells can then be stimulated to undergo differentiation growth or other physiological processes by the addition of appropriate growth factors. Culture medium containing one or more cytokines, growth factors, hormones or a combination thereof, can be used to keep cells in an undifferentiated state.

o para diferenciar las células en una ruta particular. or to differentiate cells in a particular route.

Más en particular, el armazón de la invención se puede usar para producir moléculas de interés. En realidad, los armazones de la invención se pueden usar para proporcionar un entorno biológico para el anclaje de células en un biorreactor, a fin de que las células puedan producir las moléculas deseadas. Los armazones de la invención proporcionan protección mecánica y biomecánica de las células cultivadas. More particularly, the framework of the invention can be used to produce molecules of interest. In reality, the frameworks of the invention can be used to provide a biological environment for anchoring cells in a bioreactor, so that cells can produce the desired molecules. The frames of the invention provide mechanical and biomechanical protection of cultured cells.

Los armazones pueden servir así como depósito de células para producir las moléculas deseadas tales como proteínas, moléculas orgánicas y nucleótidos. Por ejemplo, las proteínas de interés incluyen, pero no se limitan a, factores de crecimiento, hormonas, moléculas señal, inhibidores de crecimiento celular y anticuerpos. Los armazones de la invención son interesantes en particular para producir anticuerpos monoclonales. Los armazones de la invención pueden ser también adecuados para producir moléculas orgánicas tales como sabores, moléculas terapéuticas, ... The frameworks can thus serve as a deposit of cells to produce the desired molecules such as proteins, organic molecules and nucleotides. For example, proteins of interest include, but are not limited to, growth factors, hormones, signal molecules, cell growth inhibitors and antibodies. The frameworks of the invention are particularly interesting for producing monoclonal antibodies. The frameworks of the invention may also be suitable for producing organic molecules such as flavors, therapeutic molecules, ...

Con este fin, los armazones de la invención pueden ser cargados con cualquier tipo de células, incluyendo células procariotas y eucariotas. Por ejemplo, los armazones de la invención se pueden cargar con bacterias, células de levaduras, células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, etc. Ejemplos específicos incluyen E. coli, Kluyveromyces o levaduras Saccharomyces, estirpes celulares de mamíferos (por ej., células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.) así como cultivos de células de mamíferos primarias o establecidas (por ej., producidas a partir de linfoblastos, fibroblastos, células embriónicas, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos, etc.). Más en particular, la invención considera el uso de estirpes celulares establecidas tales como hibridomas. Alternativamente, las células se pueden lograr por ingeniería genética para expresar una molécula deseada como se describió anteriormente. To this end, the frames of the invention can be loaded with any type of cells, including prokaryotic and eukaryotic cells. For example, the frames of the invention can be loaded with bacteria, yeast cells, mammalian cells, insect cells, plant cells, etc. Specific examples include E. coli, Kluyveromyces or Saccharomyces yeasts, mammalian cell lines (e.g., Vero cells, CHO cells, 3T3 cells, COS cells, etc.) as well as cultures of primary or established mammalian cells (e.g. , produced from lymphoblasts, fibroblasts, embryonic cells, epithelial cells, nerve cells, adipocytes, etc.). More particularly, the invention considers the use of established cell lines such as hybridomas. Alternatively, cells can be achieved by genetic engineering to express a desired molecule as described above.

El armazón de la invención puede ser cargado con células, cultivado durante un cierto periodo de tiempo después las células se pueden recuperar/extraer/separar del armazón para uso adicional, tal como aplicaciones terapéuticas The framework of the invention can be loaded with cells, cultured for a certain period of time after the cells can be recovered / removed / separated from the framework for additional use, such as therapeutic applications.

o de diagnóstico o análisis celular. La separación de las células del armazón puede implicar el uso de enzimas que podían degradar el armazón, tales como pululanasa y/o el uso de enzimas que pueden desprender las células tales como colagenasa, elastasa, tripsina o disoluciones que desprenden células tales como AEDT. or diagnostic or cellular analysis. The separation of the cells from the framework may involve the use of enzymes that could degrade the framework, such as pululanase and / or the use of enzymes that can release cells such as collagenase, elastase, trypsin or solutions that give off cells such as EDTA.

La invención se ilustrará además a la vista de las siguientes figuras y ejemplos. The invention will be further illustrated in view of the following figures and examples.

Figuras: Figures:

Figura 1: Un armazón poroso obtenido como en el Ejemplo 1 (Escala: 6 mm). Figure 1: A porous frame obtained as in Example 1 (Scale: 6 mm).

Figura 2: Un armazón poroso obtenido como en el Ejemplo 1: análisis de Microscopía de Barrido Electrónico del armazón (imagen derecha, escala: 200 micrómetros). Figure 2: A porous frame obtained as in Example 1: Electronic Scanning Microscopy analysis of the frame (right image, scale: 200 micrometers).

Figura 3: Absorbancia de formazán (570 nm) el día 1 como una función del número inicial de células sembradas sobre armazones porosos. Figure 3: Formazan absorbance (570 nm) on day 1 as a function of the initial number of cells seeded on porous frames.

5 Ejemplos: 5 Examples:

Ejemplo 1: Preparación de armazones a base de polisacáridos: Example 1: Preparation of polysaccharide based frameworks:

Se prepararon armazones a base de polisacáridos usando una mezcla de pululano/dextrano 75:25 (pululano, M 200.000, Hayashibara Inc., Okayama, Japón; dextrano M 500.000, Pharmacia). Una disolución de polisacáridos se preparó disolviendo 9 g de pululano y 3 g de dextrano en 40 ml de agua destilada. Se añadió después carbonato de 10 sodio (8 g) a la disolución de polisacárido y se mantuvo la agitación hasta que se obtuvo una mezcla homogénea. Se realizó reticulación química de polisacárido usando el agente de reticulación trimetafosfato trisódico STMP (Sigma, St Louis) en condiciones alcalinas. En pocas palabras, se añadió un mililitro de hidróxido de sodio 10 M a 10 g de la disolución de polisacárido, seguido por la adición de un mililitro de agua que contiene 300 mg de STMP. La mezcla se vertió después en placas de petri (Nunclon®, #150288) y se incubó a 50°C durante 15 min. Los hidrogeles Polysaccharide-based frameworks were prepared using a 75:25 pululane / dextran mixture (pululane, M 200,000, Hayashibara Inc., Okayama, Japan; dextran M 500,000, Pharmacia). A solution of polysaccharides was prepared by dissolving 9 g of pululane and 3 g of dextran in 40 ml of distilled water. Sodium carbonate (8 g) was then added to the polysaccharide solution and stirring was maintained until a homogeneous mixture was obtained. Chemical cross-linking of polysaccharide was performed using the trisodium trimetaphosphate cross-linking agent STMP (Sigma, St Louis) under alkaline conditions. Simply put, one milliliter of 10 M sodium hydroxide was added to 10 g of the polysaccharide solution, followed by the addition of a milliliter of water containing 300 mg of STMP. The mixture was then poured into petri dishes (Nunclon®, # 150288) and incubated at 50 ° C for 15 min. Hydrogels

15 resultantes se sumergieron inmediatamente en un vaso de precipitados grande que contenía una disolución de ácido acético al 20%, durante al menos 30 minutos. Los armazones resultantes se lavaron de manera extensa con disolución salina de tampón de fosfato pH 7,4 después con agua destilada durante al menos 2 días. Después de una etapa de liofilización, se almacenaron armazones porosos a temperatura ambiente hasta uso. El análisis por Microscopía de Barrido Electrónico confirmó la porosidad de los armazones (Figura 1 y 2). The resulting were immersed immediately in a large beaker containing a 20% acetic acid solution, for at least 30 minutes. The resulting frames were washed extensively with phosphate buffer saline pH 7.4 then with distilled water for at least 2 days. After a lyophilization stage, porous frames were stored at room temperature until use. Scanning electron microscopy analysis confirmed the porosity of the frames (Figure 1 and 2).

20 Ejemplo 2: Tipos de polisacáridos: Se prepararon armazones porosos como se describe en el ejemplo 1, usando diferentes tipos y relaciones de polisacáridos, al tiempo que se mantiene la cantidad total de polisacárido a un valor constante. Los polisacáridos fueron pululano, dextrano 500, fucoidán LMW (Peso Molecular Bajo, por sus siglas en inglés) y fucoidán HMW (Peso Molecular Alto, por sus siglas en inglés). Example 2: Types of polysaccharides: Porous frames were prepared as described in example 1, using different types and ratios of polysaccharides, while maintaining the total amount of polysaccharide at a constant value. The polysaccharides were pululane, dextran 500, fucoidán LMW (Low Molecular Weight, for its acronym in English) and fucoidán HMW (High Molecular Weight, for its acronym in English).

Pululano Pululane

Dextrano 500 Fucoidán LMW Fucoidán HMW Solubilización Viscosidad Dextran 500 Fucoidán LMW Fucoidán HMW Solubilization Viscosity

100% 100%

+++ +++ +++  +++

100% 100%

+/ + + / +

50%fifty%

50% ++ ++  fifty% ++  ++

75%75%

25% ++ ++  25% ++  ++

75% 75%

25% +/ +++ 25% + / +++

75% 75%

25% + + 25% + +

25 Se evaluaron visualmente la solubilización (+++ indica una solubilización completa de los polisacáridos) y la viscosidad de la disolución de polisacárido resultante (+++ indica una viscosidad muy alta de la disolución). En todos los casos se obtuvieron armazones porosos al final del protocolo. The solubilization (+++ indicates a complete solubilization of the polysaccharides) and the viscosity of the resulting polysaccharide solution (+++ indicates a very high viscosity of the solution) were visually evaluated. In all cases, porous frames were obtained at the end of the protocol.

Ejemplo 3: Cantidad de porógeno: Se prepararon armazones porosos como se describe en el ejemplo 1, al tiempo que se variaba la cantidad del agente porógeno. En pocas palabras, se añadieron 2, 4 u 8 g de carbonato de sodio a Example 3: Amount of porogen: Porous frames were prepared as described in example 1, while varying the amount of the porogen. Simply put, 2, 4 or 8 g of sodium carbonate were added to

30 la disolución de pululano/dextrano. 30 the pululane / dextran solution.

Agente porógeno Porogenic agent

Solubilización Viscosidad Porosidad Solubilization Viscosity Porosity

2 g 2 g

++ ++ + ++  ++ +

4 g 4 g

++ ++ ++ ++  ++ ++

8g 8g

++ ++ ++ ++  ++ ++

Se valoraron visualmente la solubilización (++ indica una solubilización completa de los polisacáridos), la viscosidad de la disolución de polisacáridos resultante (+++ indica que una viscosidad muy alta de la disolución) y la porosidad. Para los armazones preparados con la cantidad más baja de porógeno (2 g), el proceso de efervescencia fue moderado, cuando se compara con la efervescencia obtenida con 4 g y 8 g de agente porógeno. En todos los casos, se obtuvieron armazones porosos al final del protocolo. The solubilization (++ indicates complete solubilization of the polysaccharides), the viscosity of the resulting polysaccharide solution (+++ indicates a very high viscosity of the solution) and the porosity were visually assessed. For the frames prepared with the lowest amount of porogen (2 g), the effervescence process was moderate, when compared with the effervescence obtained with 4 g and 8 g of porogen. In all cases, porous frames were obtained at the end of the protocol.

Ejemplo 4: Concentración de reticulador: Se prepararon armazones porosos como se describe en el ejemplo 1, al tiempo que se variaba la cantidad del agente de reticulación de 200 mg a 500 mg. Example 4: Crosslinker concentration: Porous frames were prepared as described in example 1, while varying the amount of the crosslinking agent from 200 mg to 500 mg.

Agente de reticulación Crosslinking agent

Solubilización Viscosidad Porosidad Solubilization  Viscosity Porosity

200 mg 300 mg 200 mg 300 mg

400 mg 400 mg

500 mg 500 mg

5 Se valoraron visualmente la solubilización (+++ indica una solubilización completa de los polisacáridos), la viscosidad de la disolución de polisacáridos resultante (+++ indica que una viscosidad muy alta de la disolución) y la porosidad. En todos los casos, se obtuvieron armazones porosos al final del protocolo. 5 The solubilization (+++ indicates complete solubilization of the polysaccharides), the viscosity of the resulting polysaccharide solution (+++ indicates a very high viscosity of the solution) and the porosity were visually assessed. In all cases, porous frames were obtained at the end of the protocol.

Ejemplo 5: Carga de células en los armazones porosos: Se cultivaron Células Madre Mesenquimatosas de médula ósea humana (hMSC, por sus siglas en inglés) sobre armazones preparados como en el Ejemplo 1. Se usó un 10 sacabocados circular para cortar armazones porosos de forma redonda de 6 mm de diámetro y 1 mm de espesor. El medio de cultivo consistió en DMEM bajo en glucosa (Gibco, Life Technology, Nueva York) con suero fetal bovino al 10% y penicilina/estreptomicina al 1% (Sigma). Después de tripsinización de las células, se llevó a cabo la rehidratación del armazón seco con 20 μl de suspensión de células (106 células/armazón). Las muestras se mantuvieron después en 1 ml de medio de cultivo durante hasta 1 semana. Se incubaron armazones porosos no Example 5: Loading of cells into porous frames: Human bone marrow Mesenchymal Stem Cells (hMSC) were cultured on frames prepared as in Example 1. A circular punch was used to cut porous frames 6 mm round and 1 mm thick. The culture medium consisted of low glucose DMEM (Gibco, Life Technology, New York) with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin / streptomycin (Sigma). After trypsinization of the cells, rehydration of the dry framework was carried out with 20 μl of cell suspension (106 cells / framework). The samples were then kept in 1 ml of culture medium for up to 1 week. Porous frames not incubated

15 sembrados en medio de cultivo como controles. 15 seeded in culture medium as controls.

Se realizó un ensayo metabólico (MTT, bromuro de 3-(4,5-dimetildiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, Sigma) para valorar la viabilidad de las células. En pocas palabras, se mezcló una disolución patrón de 5 mg/ml de MTT (Sigma) 1:10 con DMEM. Los armazones se incubaron durante 3 h a 37C con 1 ml de la disolución de reactivo. Después de lavado de los armazones con PBS, se solubilizaron los cristales de formazán en 0,3 ml de Isopropranol/HCI 0,04 M. A metabolic assay (MTT, 3- (4,5-dimethyldiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) was performed to assess the viability of the cells. Simply put, a 5 mg / ml standard solution of MTT (Sigma) 1:10 was mixed with DMEM. The frames were incubated for 3 h at 37 ° C with 1 ml of the reagent solution. After washing the frames with PBS, the formazan crystals were solubilized in 0.3 ml of Isopropranol / 0.04 M HCI.

20 Se registró la absorbancia a 590 nm con un lector de microplacas (Multiskan, Thermo Electron Corporation, Waltam, MA). La absorbancia el día 1 fue directamente proporcional al número inicial de células sembradas en los armazones (figura 3). The absorbance at 590 nm was recorded with a microplate reader (Multiskan, Thermo Electron Corporation, Waltam, MA). The absorbance on day 1 was directly proportional to the initial number of cells seeded in the frames (figure 3).

Se llevaron a cabo con éxito experimentos similares con otros tipos de células tales como células de músculo liso vascular primarias y células endoteliales de origen animal y humano. Similar experiments were successfully carried out with other cell types such as primary vascular smooth muscle cells and endothelial cells of animal and human origin.

25 Ejemplo 6: Análisis confocal de comportamiento celular dentro de los armazones porosos: Se prepararon armazones fluorescentes como en el ejemplo 1, por adición de una pequeña cantidad (5 mg) de FITC-dextrano a la disolución de polisacáridos. Se sembraron armazones fluorescentes como en el Ejemplo 5, con hMSC marcadas con un marcador fluorescente (PKH26, SIGMA P9691) según las instrucciones del fabricante). La formación de imagen confocal confirmó la estructura porosa del armazón. Example 6: Confocal analysis of cellular behavior within porous frameworks: Fluorescent frameworks were prepared as in Example 1, by adding a small amount (5 mg) of FITC-dextran to the polysaccharide solution. Fluorescent frames were seeded as in Example 5, with hMSC labeled with a fluorescent marker (PKH26, SIGMA P9691) according to the manufacturer's instructions). The confocal imaging confirmed the porous structure of the framework.

30 Ejemplo 7: Viabilidad de las células por ensayo de vivo y muerto: Se usó formación de imagen confocal para evaluar la viabilidad celular con un ensayo vivo/muerto (Calbiochem, San Diego, CA), basado en el uso de dos sondas fluorescentes que miden la permeabilidad de la membrana celular: un tinte fluorescente verde permeable a las células para colorear células vivas (calceína AM) y un tinte fluorescente rojo no permeable a las células (yoduro de propidio) para colorear las células muertas. El día 7, la mayoría de las células eran células vivas, con sólo algunas 30 Example 7: Viability of cells by live and dead assay: Confocal imaging was used to assess cell viability with a live / dead assay (Calbiochem, San Diego, CA), based on the use of two fluorescent probes that They measure the permeability of the cell membrane: a green fluorescent dye permeable to cells for coloring living cells (calcein AM) and a red fluorescent dye not permeable to cells (propidium iodide) to color the dead cells. On day 7, most of the cells were living cells, with only a few

35 células muertas encontradas dentro de los armazones. 35 dead cells found inside the frames.

Ejemplo 8: Influencia del agente porógeno sobre la porosidad del armazón. Example 8: Influence of the porogen on the porosity of the framework.

Se prepararon armazones porosos como se describe en el ejemplo 1, al tiempo que se variaba la cantidad y la naturaleza del agente porógeno. Para análisis confocal de armazones porosos fluorescentes, se añadieron 5 mg de FITC-dextrano a la disolución de polisacáridos. Se adquirieron secciones ópticas usando un microscopio confocal Porous frames were prepared as described in example 1, while varying the amount and nature of the porogen. For confocal analysis of fluorescent porous frameworks, 5 mg of FITC-dextran was added to the polysaccharide solution. Optical sections were acquired using a confocal microscope

40 Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania), provisto de una lente objetivo 10x Plan-NeoFluar (abertura numérica de 0,3) (Carl Zeiss). Se excitó FITC-dextrano a 488 nm con un laser de argón y se seleccionó su emisión fluorescente por un filtro de paso de banda de 505-530 nm. Se evaluó el tamaño de poro con el programa informático ImageJ®. Se calculó el volumen vacío con un módulo de medición estadístico/volumen del programa informático Amira® y los resultados se expresaron como porcentaje del volumen del armazón. 40 Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany), equipped with a 10x Plan-NeoFluar objective lens (numerical aperture of 0.3) (Carl Zeiss). FITC-dextran was excited at 488 nm with an argon laser and its fluorescent emission was selected by a 505-530 nm bandpass filter. Pore size was evaluated with the ImageJ® software. The empty volume was calculated with a statistical measurement / volume module of the Amira® software and the results were expressed as a percentage of the frame volume.

Polisacáridos Polysaccharides

Agente porógeno Porogenic agent

Diámetro medio (μm) Mean diameter (μm)

Volumen vacío (%) Empty volume (%)

Pululano (9 g) + dextrano Pululane (9 g) + dextran

Carbonato de Sodio (8 g) Sodium Carbonate (8 g)

37%37%

500 (3 g) 500 (3 g)

Pululano (9 g) + dextrano Pululane (9 g) + dextran

Carbonato de Sodio (8 g) + Sodium Carbonate (8 g) +

71%71%

500 (3 g) 500 (3 g)

Cloruro de Sodio (2 g) Sodium Chloride (2 g)

Pululano (9 g) + dextrano Pululane (9 g) + dextran

Carbonato de Sodio (8 g) + Sodium Carbonate (8 g) +

59%59%

500 (3 g) 500 (3 g)

Cloruro de Sodio (8 g) Sodium Chloride (8 g)

Ejemplo 9: polisacárido cargado de manera positiva. Example 9: positively charged polysaccharide.

Se prepararon armazones porosos cargados de manera positiva usando DEAE-Dextrano como el único polisacárido. En pocas palabras, se preparó disolución de DEAE-dextrano disolviendo 1 g de DEAE-dextrano (Fluka referencia 5 30461) en 1,5 ml de agua destilada. Después se añadió carbonato de sodio (100 mg) a la disolución de polisacárido y se mantuvo la agitación hasta que se obtuvo una mezcla homogénea. Se llevó a cabo reticulación química de polisacárido usando el agente de reticulación trimetafosfato trisódico STMP (Sigma, St Louis) en condiciones alcalinas. En pocas palabras, se añadieron 150 μl de hidróxido de sodio 10 M a la disolución de polisacárido, seguido por la adición de 150 μl de agua que contenían 45 mg de STMP. Después se vertió la mezcla en placas de Positively charged porous frames were prepared using DEAE-Dextran as the only polysaccharide. Simply put, DEAE-dextran solution was prepared by dissolving 1 g of DEAE-dextran (Fluka reference 5 30461) in 1.5 ml of distilled water. Then sodium carbonate (100 mg) was added to the polysaccharide solution and stirring was maintained until a homogeneous mixture was obtained. Chemical cross-linking of polysaccharide was carried out using the trisodium trimetaphosphate cross-linking agent STMP (Sigma, St Louis) under alkaline conditions. Simply put, 150 µl of 10 M sodium hydroxide was added to the polysaccharide solution, followed by the addition of 150 µl of water containing 45 mg of STMP. The mixture was then poured into plates of

10 petri (Nunclon®, 150288) y se incubó a 50°C durante 15 min. Se sumergieron inmediatamente los hidrogeles resultantes en un vaso de precipitados grande que contenía disolución de ácido acético al 20%, durante al menos 30 minutos. Los armazones resultantes se lavaron de manera extensa con disolución salina de tampón de fosfato pH 7,4 después con agua destilada durante al menos 2 días. Después de una etapa de liofilización, se obtuvieron armazones porosos y se almacenaron a temperatura ambiente hasta uso. 10 petri (Nunclon®, 150288) and incubated at 50 ° C for 15 min. The resulting hydrogels were immediately immersed in a large beaker containing 20% acetic acid solution, for at least 30 minutes. The resulting frames were washed extensively with phosphate buffer saline pH 7.4 then with distilled water for at least 2 days. After a lyophilization stage, porous frames were obtained and stored at room temperature until use.

15 Ejemplo 10: polisacárido cargado de manera negativa 15 Example 10: negatively charged polysaccharide

Se prepararon armazones porosos cargados de manera negativa por adición de fucoidán (Sigma referencia F5631) a una mezcla pululano/dextrano. En pocas palabras, se preparó una disolución de polisacárido disolviendo 9 g de pululano y 3 g de dextrano en 40 ml de agua destilada, añadiendo después 1,2 g de fucoidán a la disolución de polisacárido. Después se añadió carbonato de sodio (8 g) a la disolución de polisacárido y se llevó a cabo el proceso Negatively charged porous frames were prepared by adding fucoid (Sigma reference F5631) to a pululane / dextran mixture. Simply put, a polysaccharide solution was prepared by dissolving 9 g of pululane and 3 g of dextran in 40 ml of distilled water, then adding 1.2 g of fucoidán to the polysaccharide solution. Then sodium carbonate (8 g) was added to the polysaccharide solution and the process was carried out.

20 de reticulación como se describe en el Ejemplo 1 para obtener un armazón 3D que contenía un polisacárido cargado de manera negativa. Crosslinking 20 as described in Example 1 to obtain a 3D framework containing a negatively charged polysaccharide.

Ejemplo 11: diferenciación de células madre mesenquimatosas humanas en células de tipo condrocitos en armazones 3D Example 11: Differentiation of human mesenchymal stem cells into chondrocyte-like cells in 3D frameworks

Se cultivaron Células Madre Mesenquimatosas de médula ósea humanas (hMSC) sobre armazones preparados Human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSC) were cultured on prepared frames

25 como en el Ejemplo 1 en medio condrogénico sin suero. El medio condrogénico consistió en DMEM enriquecido con 10 ng/ml de TGF-33 (Oncogene, Cambridge, MA), dexametasona 100 nM (Sigma, St Louis, MO), ácido ascórbico 2fosfato 170 μM (Sigma, St Louis, MO) y 5 ml de ITS-plus (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). Después de 3 semanas de cultivo, se fijaron los armazones sembrados en formaldehído al 10%, después se crioseccionaron. Se colorearon secciones congeladas con azul de toluidina al 0,05% (p/v) o con disolución de safranina O al 0,1%. Se 25 as in Example 1 in chondrogenic medium without serum. The chondrogenic medium consisted of DMEM enriched with 10 ng / ml of TGF-33 (Oncogene, Cambridge, MA), 100 nM dexamethasone (Sigma, St Louis, MO), 170 μM 2 phosphate ascorbic acid (Sigma, St Louis, MO) and 5 ml of ITS-plus (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). After 3 weeks of culture, the frames seeded in 10% formaldehyde were fixed, then cryosected. Frozen sections were colored with 0.05% (w / v) toluidine blue or with 0.1% safranine O solution. Be

30 observó una coloración positiva para síntesis de matriz extracelular, que indica diferenciación MSC en células de cartílago. 30 observed a positive coloration for extracellular matrix synthesis, which indicates MSC differentiation in cartilage cells.

Ejemplo 12: cultivo 3D de hepatocitos Example 12: 3D hepatocyte culture

Se cultivaron células HepG2, células de carcinoma hepatocelular humano, en DMEM con poca glucosa (Gibco, Life Technology, Nueva York, USA) con suero fetal bovino al 10% y 1% penicilina/estreptomicina (Sigma) sobre los HepG2 cells, human hepatocellular carcinoma cells, were cultured in low glucose DMEM (Gibco, Life Technology, New York, USA) with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin / streptomycin (Sigma) on the

35 armazones preparados como en el Ejemplo 1. Se usó un sacabocados circular para cortar armazones porosos de forma redonda de 6 mm de diámetro y 1 mm de espesor. 35 frames prepared as in Example 1. A circular punch was used to cut round, porous frames 6 mm in diameter and 1 mm thick.

Después de tripsinización de las células, se llevó a cabo rehidratación del armazón seco con 20 μl de suspensión de células (85.000 células/armazón). Después se mantuvieron las muestras en 1 ml de medio de cultivo durante hasta 1 semana. Se usaron como controles armazones porosos no sembrados en medio de cultivo. Se observó formación de esferoides de hepatocitos usando Calceína AM (Calbiochem, San Diego CA, USA) que es un tinte polianiónico hidrolizado por células vivas produciendo así una fluorescencia verde uniforme intensa (longitud de onda 485-535 nm), según las instrucciones del fabricante. Los armazones sembrados contenían hepatocitos vivos adecuados para ensayos fármaco-toxicológicos. After trypsinization of the cells, rehydration of the dry framework was carried out with 20 μl of cell suspension (85,000 cells / framework). The samples were then kept in 1 ml of culture medium for up to 1 week. Porous frames not planted in culture medium were used as controls. Hepatocyte spheroid formation was observed using Calcein AM (Calbiochem, San Diego CA, USA) which is a polyanionic dye hydrolyzed by living cells thus producing an intense uniform green fluorescence (wavelength 485-535 nm), according to the manufacturer's instructions . The seeded frames contained live hepatocytes suitable for drug-toxicological tests.

Claims (18)

REIVINDICACIONES 1. Un método para preparar un armazón poroso que comprende las etapas que consisten en: 1. A method for preparing a porous framework comprising the steps consisting of: a) preparar una disolución acuosa alcalina que comprende una cantidad de al menos un polisacárido, una cantidad de un agente de reticulación covalente y una cantidad de un agente porógeno, b) transformar la disolución en un hidrogel poniendo dicha disolución a una temperatura de 4°C a 80°C durante un a) preparing an alkaline aqueous solution comprising an amount of at least one polysaccharide, an amount of a covalent crosslinking agent and an amount of a porogen, b) transforming the solution into a hydrogel by placing said solution at a temperature of 4 ° C at 80 ° C for a tiempo suficiente para permitir la reticulación de dicha cantidad de polisacárido, c) sumergir dicho hidrogel en una disolución acuosa, d) lavar el armazón poroso obtenido en la etapa c). sufficient time to allow cross-linking of said amount of polysaccharide, c) immersing said hydrogel in an aqueous solution, d) wash the porous frame obtained in step c).

2.2.

El método según la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido es seleccionado del grupo que consiste en: dextrano, agar, ácido algínico, ácido hialurónico, pululano, inulina, heparina, fucoidán, quitosán y mezclas de los mismos.  The method according to claim 1, wherein said polysaccharide is selected from the group consisting of: dextran, agar, alginic acid, hyaluronic acid, pululane, inulin, heparin, fucoidan, chitosan and mixtures thereof.

3.3.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho agente de reticulación covalente es seleccionado del grupo que consiste en: trimetafosfato trisódico (STMP), oxicloruro de fósforo (POCl3), epiclorohidrina, formaldehídos, carbodiimidas hidrosolubles y glutaraldehídos.  The method according to any one of claims 1 to 2, wherein said covalent crosslinking agent is selected from the group consisting of: trisodium trimetaphosphate (STMP), phosphorus oxychloride (POCl3), epichlorohydrin, formaldehydes, water soluble carbodiimides and glutaraldehydes.

4.Four.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho agente de reticulación covalente es trimetafosfato trisódico (STMP).  The method according to any one of claims 1 to 3, wherein said covalent crosslinking agent is trisodium trimetaphosphate (STMP).

5.5.

El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente porógeno es seleccionado del grupo que consiste en: carbonato de amonio, bicarbonato de amonio, carbonato de calcio, carbonato de sodio y bicarbonato de sodio y mezclas de los mismos y el líquido de la etapa b) es una disolución ácida.  The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the porogen is selected from the group consisting of: ammonium carbonate, ammonium bicarbonate, calcium carbonate, sodium carbonate and sodium bicarbonate and mixtures thereof and The liquid in step b) is an acid solution.

6.6.

El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la relación en peso del polisacárido al agente porógeno está en el intervalo de 6:1 a 1:1.  The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the weight ratio of the polysaccharide to the porogen is in the range of 6: 1 to 1: 1.

7. 7.

El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la relación en peso del polisacárido al agente de reticulación está en el intervalo de 15:1 a 1:1. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the weight ratio of the polysaccharide to the crosslinking agent is in the range of 15: 1 to 1: 1.

8.8.

Un armazón poroso obtenible por el método según la reivindicación 4.  A porous frame obtainable by the method according to claim 4.

9.9.

El armazón poroso según la reivindicación 8, en el que el tamaño de los poros está comprendido entre 1 μm y 500 μm.  The porous frame according to claim 8, wherein the pore size is between 1 μm and 500 μm.

10.10.

El armazón poroso según la reivindicación 8 ó 9, en el que la porosidad está en el intervalo de 4% a 50%.  The porous frame according to claim 8 or 9, wherein the porosity is in the range of 4% to 50%.

11.eleven.

El armazón poroso según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, cargado con una cantidad de células, seleccionadas preferiblemente del grupo que consiste en: células de levaduras, células de mamífero, células de insecto y células de plantas.  The porous framework according to any one of claims 8 to 10, loaded with a number of cells, preferably selected from the group consisting of: yeast cells, mammalian cells, insect cells and plant cells.

12.12.

El armazón poroso según la reivindicación 11, en el que las células son células de mamífero seleccionadas del grupo que consiste en: condrocitos; fibrocondrocitos; osteocitos; osteoblastos; osteoclastos; sinoviocitos; células de médula ósea; células epiteliales, hepatocitos, células mesenquimales; células estromales; células musculares; células madre; células madre embriónicas; células precursoras procedentes de tejido adiposo; células progenitoras de sangre periférica; células madre aisladas de tejido adulto y células transformadas de manera genética.  The porous framework according to claim 11, wherein the cells are mammalian cells selected from the group consisting of: chondrocytes; fibrochondrocytes; osteocytes; osteoblasts; osteoclasts; synoviocytes; bone marrow cells; epithelial cells, hepatocytes, mesenchymal cells; stromal cells; muscle cells; mother cells; embryonic stem cells; precursor cells from adipose tissue; peripheral blood progenitor cells; Stem cells isolated from adult tissue and genetically transformed cells.

13.13.

El armazón poroso según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para ingeniería de tejidos, cultivo celular y suministro celular.  The porous framework according to any one of claims 8 to 12, for tissue engineering, cell culture and cell delivery.

14.14.

Un sustituto vascular fabricado con un armazón como se define según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a  A vascular substitute manufactured with a framework as defined according to any one of claims 8 to

11. eleven.

15.fifteen.

Cartílago o implantes óseos fabricados con un armazón como se define según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.  Cartilage or bone implants made of a framework as defined according to any one of claims 8 to 11.

16.16.

Uso de un armazón como se define según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para la evaluación de la toxicidad y/o farmacología de un producto.  Use of a framework as defined according to any one of claims 8 to 11, for the evaluation of the toxicity and / or pharmacology of a product.

17.17.

Un sistema de liberación controlada de un agente activo fabricado con un armazón como se define según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.  A controlled release system of an active agent manufactured with a framework as defined according to any one of claims 8 to 11.

Figura 1 Figure 1