ES2406703T3

ES2406703T3 - Ensayo diagnóstico para anticuerpos anti-proteasa de escisión del factor de von Willebrand (ADAMTS13)

Info

Publication number: ES2406703T3
Application number: ES04725025T
Authority: ES
Inventors: Friedrich Scheiflinger; Manfred Rieger; Barbara Plaimauer
Original assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Current assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Priority date: 2003-04-22
Filing date: 2004-04-01
Publication date: 2013-06-07
Anticipated expiration: 2024-04-01
Also published as: US7763430B2; US7943326B2; US20100273183A1; EP1616188B1; US20040214346A1; CA2522795A1; EP1616188A1; CN1777809B; AU2004232878A1; JP4542545B2; CN1777809A; JP2010025941A; WO2004095027A1; AU2004232878B2; JP2006524321A

Abstract

Kit para la detección, cuantificación y mapeo de una región de enlace de antígeno de la vWF-cp (proteasa de escisión del factor von Willebrand), de un anticuerpo anti-vWF-cp en una muestra, que comprende uno o más fragmentos de vWF-cp seleccionados de entre el grupo consistente en las secuencias SEQ ID Nº 1-6 inmovilizados en una fase sólida, sin que las propiedades biológicas de dichos fragmentos inmovilizados de vWF-cp se vean alteradas de forma sustancial.

Description

Ensayo diagnóstico para anticuerpos anti-proteasa de escisión del factor de von Willebrand (ADAMTS13).

La presente invención se refiere a un kit para su uso en un sistema de ensayo de detección, cuantificación y asignación de una región de enlace de antígeno de la proteasa de escisión del factor von Willebrand (vWF-cp; ADAMTS 13) de un anticuerpo anti-vWF-cp en una mezcla de la que se sospecha contiene un anticuerpo anti-vWFcp. El kit puede emplearse en un método destinado al diagnóstico de trastornos asociados a la presencia de anticuerpos anti-vWF-cp en pacientes, y para discriminar entre diferentes tipos de micro-angiopatías trombóticas.

El factor von Willebrand (vWF) es una proteína muy importante en el ámbito de la hemostasis primaria. El factor von Willebrand que se encuentra en el plasma (vWF) es una proteína multimérica que media en la adherencia de las plaquetas a los puntos donde se han producido lesiones vasculares, y los multímeros de vWF de grandes dimensiones resultan especialmente competentes desde el punto de vista hemostático. Desde hace tiempo se sospecha de la existencia de factores plasmáticos que controlan las dimensiones de los multímeros del vWF. La proteasa de escisión del factor von Willebrand (“vWF-cp”) está implicada en la limitación del crecimiento de los trombos plaquetarios mediante la escisión proteolítica de los multímeros del Factor von Willebrand en el ser humano (Furlan y col. (1996) Blood 87: 4223-4234). Recientemente se han descrito la estructura molecular de la proteasa de escisión del factor von Willebrand y del gen correspondiente (WO 02/42441; Zheng y col., (2001) J. Biol. Chem. 276: 41059-41063), identificándose como un nuevo integrante de la familia ADAMTS y designándose como ADAMTS13. La vWFcp regula las dimensiones del multímero del vWF mediante un mecanismo de escisión proteolítica.

Los multímeros del vWF grandes y extragrandes desempeñan una función crucial en la trombosis arterial, donde se han detectado multímeros de vWF con unas dimensiones extraordinariamente grandes en dos formas similares de afecciones microangiopáticas trombóticas, la púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) y el síndrome urémico hemolítico (HUS), advirtiéndose en ambos casos la formación de agregados plaquetarios que desembocaron en oclusiones diseminadas de la microcirculación. Los pacientes que sufren TTP presentan una deficiencia de vWF-cp, mientras que los pacientes que padecen HUS presentan un nivel normal de actividad de la proteasa.

Existen diversos tipos de TTP: una variedad idiopática aguda o esporádica, una variedad intermitente con recaídas eventuales y una variedad crónica recidivante. La TTP crónica recidivante está asociada a una deficiencia, congénita

o adquirida, de vWF-cp. La poco frecuente variedad hereditaria de la TTP se relaciona con mutaciones génicas específicas del locus ADAMTS-13. En general, la TTP idiopática aguda o la TTP adquirida suelen tener mayor gravedad que la TTP crónica recidivante, ya que estos pacientes han adquirido anticuerpos que actúan contra la vWF-cp y que inhiben la proteasa de escisión del factor von Willebrand (Furlan y col., (1998) Blood 91: 2839-2846; Furlan y col., (1998) N. Engl. J. Med. 339: 1578-1584). La TTP adquirida ocasionalmente también se da durante el embarazo o en el período post-parto. La TTP recidivante intermitente también está asociada a la reaparición del inhibidor de vWF-cp. En lo que respecta a otras variedades de la TTP, como la TTP asociada al tratamiento con ticlopidina, también se ha observado que estos pacientes han adquirido anticuerpos que actúan contra la vWF-cp (Moake, (2002) N. Eng. J. Med. 347:589-600). No obstante, algunos pacientes que padecen TTP adquirida y que tienen unos multímeros del vWF extraordinariamente grandes en plasma presentan unos niveles extraordinariamente reducidos de vWF-cp.

En general, los anticuerpos inhibidores que actúan contra las proteínas causan graves problemas, por ejemplo, en la cascada de coagulación, lo que puede conllevar pérdida de sangre o trombosis.

Se puede distinguir entre una TTP congénita y adquirida por la presencia de anticuerpos inhibidores de vWF-cp en plasma en hasta un 80% de los pacientes que padecen TTP adquirida y la total ausencia de vWF-cp en plasma de aquellos pacientes que sufren de TTP hereditaria. Hasta el momento, la presencia en plasma de anticuerpos inhibidores se determina mediante ensayos enzimáticos estáticos en condiciones no fisiológicas, confirmando el diagnóstico de TTP aguda mediada por anticuerpos.

Se han descrito diferentes ensayos de la vWF-cp para el diagnóstico de la TTP congénita y adquirida. La actividad de la vWF-cp y la presencia de inhibidores de la vWF-cp se determinan por incubación de multímeros de vWF purificados en muestras de plasma de los pacientes, tras lo cual se lleva a cabo una inmunotransferencia de un sustrato de vWF degradado con anticuerpos anti-vWF y un análisis del multímero. (Furlan y col., (2002) Sem. Thromb. Haemost. 28:167-172). El método tiene una alta sensibilidad en la banda de baja actividad de la proteasa; no obstante, la precisión es tan sólo moderada a unos niveles de actividad de la proteasa normales o por debajo de los normales. Puede llevarse a cabo un ensayo de enlace de colágeno para determinar la actividad de la vWF-cp y de los inhibidores de la vWF-cp, tal y como se describe en Gerritsen y col. [(1999) Thromb. Haemost. 82:1386-1389], en un plazo de 6 horas, aunque el método tiene menor sensibilidad a los niveles más bajos de actividad de la proteasa en comparación con la inmunotransaferencia de multímeros del vWF degradados (Furlan y col. 2002 supra). No obstante, los ensayos de la técnica anterior resultan bastante laboriosos, requieren gran cantidad de tiempo y exigen que los laboratorios estén familiarizados con la técnica. Asimismo, los ensayos conocidos en la técnica anterior tan sólo permiten detectar inhibidores de la vWF-cp que impidan su función catalítica. Los anticuerpos inhibidores que pueden impedir una función de la vWF-cp que no sea la actividad catalítica, por ejemplo enlaces celulares endoteliales, no pueden ser detectados con estos ensayos.

En este contexto, el documento WO 02/44241 A2 describe un polipéptido de vWF-cp, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de vWF-cp, una composición que comprende dicho polipéptido y la utilización de dicho polipéptido para la producción de moléculas de enlace del polipéptido de la vWF-cp, así como para elaborar una preparación para la profilaxis y la terapia de la trombosis y la enfermedad tromboembólica.

Por tanto, existe la necesidad de un sistema de ensayo que permita detectar y determinar anticuerpos anti-vWF-en el plasma de un paciente que impidan el funcionamiento de la vWF-cp a excepción de la actividad proteasa catalítica de la enzima.

La invención está limitada exclusivamente por las reivindicaciones.

Uno de los objetos de la presente invención es proporcionar un kit para la detección, cuantificación y asignación de la región de enlace de antígeno de la vWF-cp de un anticuerpo anti-vWF-cp perteneciente a una muestra. El kit comprende uno o más fragmentos de vWF-cp seleccionados de entre el grupo consistente las secuencias SEQ ID Nº 1-6, y opcionalmente también comprende vWF-cp inmovilizada en una fase sólida sin afectar sustancialmente a las propiedades biológicas de la vWF-cp o de los fragmentos de vWF-cp. Adicionalmente, el kit de la presente invención también puede contener todo tipo de agentes auxiliares conocidos en la técnica para la realización de ensayos antígeno/anticuerpo (por ejemplo ELISA, EIA, RIA, etc.), tales como sales tampón, soluciones tampón descritas, agentes de bloqueo, agentes de detección y similares. Los kits descritos pueden proporcionarse en diversos formatos, por ejemplo en forma de uno o más recipientes o en forma de placa de microtitulación.

Sorprendentemente los inventores han observado que un fragmento de vWF-cp, y opcionalmente vWF-cp inmovilizada en una fase sólida, proporcionan un sistema de ensayo sencillo, eficaz, rápido y reproducible para determinar la presencia de un anticuerpo anti-vWFcp en una muestra. Mediante el sistema de la presente invención se determinan diversos inhibidores de la vWF-cp que no se habían detectado con los sistemas de la técnica anterior. El kit de la presente invención aporta una mayor precisión a los actuales ensayos que la conseguida en los ensayos de la técnica anterior y puede utilizarse para detectar una cantidad de anticuerpos de vWF inferior al umbral de detección de los sistemas conocidos. Los ensayos realizados con el kit de la presente invención permiten distinguir anticuerpos anti-vWF-cp de diferentes especificidades, en función de la neutralización de diferentes funciones biológicas de la vWF-cp. El ensayo realizado con el kit de la presente invención también permite diagnosticar con rapidez la TTP y otros trastornos asociados a los inhibidores de la vWF-cp, así como diferenciar diversas formas de microangiopatías trombóticas (TM).

Las figuras muestran:

Fig.1: ejemplos de plásmidos que pueden utilizarse para la expresión de la vWF-cp o de uno o varios

fragmentos recombinantes de vWF-cp-, o de vWF-cp o de vWF-cp- fusionados con una secuencia

heteróloga his-tag.

Fig. 2A y 2B: determinación de anticuerpos IgG (Fig. 2A) e IgM (Fig. 2B) en muestras de plasma de un paciente,

en comparación con plasma humano normal. Las barras de error indican la desviación estándar

sumada dos veces del plasma humano normal calculada a partir de varios lotes de plasma.

Uno de los aspectos de la invención hace referencia a un kit para detectar, cuantificar y mapear la región de enlace de antígeno de la vWF-cp en un anticuerpo anti-vWF-cp de una muestra que contiene un fragmento de vWF-cp seleccionado de entre el grupo consistente en las SEQ ID Nº 1-6 inmovilizado en una fase sólida sin que ello afecte a las propiedades biológicas de la vWF-cp o del fragmento de vWF-cp. La vWF-cp o el fragmento de la vWF-cp-se utilizan en el kit como agentes diagnósticos que facilitan el o los emplazamientos de determinación antigénica capaces de unirse a los anticuerpos anti-vWF-cp presentes en una muestra.

El término “determinación” tal y como se utiliza aquí incluye la detección, cuantificación y mapeo de la región de enlace de antígeno de la vWF-cp de un anticuerpo anti-vWF-cp presente en una muestra. “Detección” se refiere a al menos una reacción positiva que indique la formación de un complejo anticuerpo/vWF-cp – o de un complejo anticuerpo/fragmento de vWF-cp – mediante un sistema de detección, por ejemplo un ensayo cromogénico. Como control negativo se utiliza una muestra que se sabe no contiene ningún anticuerpo anti-vWF-, es decir plasma humano normal. En general, “cuantificación” se refiere a que diluciones definidas de una muestra de la que se sospecha contiene anticuerpos anti-vWF-cp se ponen en contacto con la vWF-cp inmovilizada o con un fragmento de la vWF-cp, y se compara la intensidad de la reacción obtenida mediante el sistema de detección con la intensidad de la reacción obtenida con diluciones definidas de una muestra que comprende una cantidad conocida y definida de anticuerpos anti-vWF que se utiliza como patrón. El “mapeo” del sitio de unión de antígeno vWF-cp de un anticuerpo anti-vWF-cp se lleva a cabo poniendo en contacto la muestra que se sospecha contiene anticuerpos anti-vWF-cp con una vWF-cp completa, así como con fragmentos de vWF-cp obtenidos en diferentes regiones de la molécula de vWF-cp. Así, se puede obtener el espectro completo de los anticuerpos anti-vWF-cp que posiblemente se encuentren presentes en una muestra, pudiendo identificarse aquellos anticuerpos anti-vWF-cp que tienen una actividad de enlace específica en una región/dominio de la vWF-cp.

El término “muestra” tal y como se utiliza aquí se refiere a un fluido biológico, como sangre, plasma o un tejido de un paciente. Concretamente, la muestra puede obtenerse de pacientes humanos de los que se sospeche presentan un trastorno asociado a la presencia de anticuerpos anti-vWF-cp.

El término “fase sólida” no implica ninguna limitación específica y hace referencia, por ejemplo, a un material

polimérico insoluble, que puede ser un polímero orgánico tal como una poliamida o un polímero de vinilo (por ejemplo poli(met)acrilato, poliestireno y alcohol de polivinilo o sus derivados), un polímero natural tal como celulosa, dextrano, agarosa, quitina y poliaminoácidos, o un polímero inorgánico tal como vidrio o un hidróxido metálico. La fase sólida puede presentarse en forma de microportador, partícula, membrana, tira, papel, película, perla o placa, como placas de microtitulación. La vWF-cp o fragmentos de vWF-cp pueden inmovilizarse en la fase sólida directamente mediante enlace covalente o con un vehículo, tal como una molécula de unión o un anticuerpo inmovilizado en la fase sólida.

El término “propiedades biológicas” tal y como se utiliza aquí se refiere a epítopos o determinantes antigénicos funcionalmente activos de vWF-cp o de fragmentos de vWF-cp, capaces de enlazarse al menos a un anticuerpo antivWF-cp. La inmovilización de la vWF-cp o del fragmento de vWF-cp en una fase sólida se lleva a cabo de modo que se mantengan las propiedades inmunológicas y concretamente la estructura de los epítopos funcionales y determinantes antigénicos de la vWF-cp o de los fragmentos de vWF-cp, y se presentan de forma eficaz para su reconocimiento por parte de al menos un anticuerpo anti-vWF-cp presente en la muestra.

La vWF-cp o los fragmentos de vWF-cp pueden obtenerse, total o parcialmente, mediante técnicas recombinantes, pudiendo prepararse por expresión en un sistema huésped procariótico o eucariótico. Los huéspedes procarióticos pueden ser células bacterianas, como E.coli o B.subtilis. Las células eucarióticas pueden seleccionarse de entre el grupo consistente en células de levadura (por ejemplo cepas de la levadura Pichia); células de insectos (por ejemplo Sf9, Sf 21, línea cellular High Five, S2); y células mamíferas como MRCS, CHO, COS, 3T3, HEK 293, BHK, SK-Hep, HepG2, CV-1 y Hela.

Puede utilizarse muy diversos vectores para preparar la vWF-cp o los fragmentos de vWF-cp, y éstos pueden seleccionarse de entre vectores de expresión eucariótica y procariótica. Como ejemplos de vectores utilizados para la expresión procariótica se incluyen plásmidos como pRSET, pET, pBAD, etc., incluyendo los promotores utilizados en los vectores de expresión procariótica lac, trc, trp, recA, araBAD, etc. Como ejemplos de vectores para la expresión eucariótica se incluyen: (i) para la expresión en levaduras, vectores como pAO, pPIC, pYES, pMET utilizando promotores como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc.; (ii) para la expresión en células de insectos, vectores como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., utilizando promotores como PH, p10, MT, Acs, OplE2, gp64, polh, etc., y

(iii) para la expression en células de mamíferos, vectores como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pADNc3, pBPV, etc., y vectores obtenidos a partir de sistemas víricos como vaccinia virus, virus adenoasociados, virus del herpes, retrovirus, etc., utilizando promotores como CMV, SV40, EF-1α, UbC, RSV, ADV, BPV, y ß-actina.

Los fragmentos de vWF-cp se seleccionan de entre las secuencias SEQ ID Nº 1-6.

Una de las ventajas de la utilización de dichos péptidos como reactivo de diagnóstico en la presente invención es la determinación selectiva de la especificidad del anticuerpo anti-vWF-cp. Los péptidos pueden obtenerse por técnicas estándar de síntesis peptídica.

De acuerdo con una realización de la invención, la vWF-cp o los fragmentos de vWF-cp se fusionan en una secuencia heteróloga. La secuencia heteróloga puede ser una proteína heteróloga, un polipéptido o un péptido, concretamente un péptido funcional. La secuencia heteróloga puede ser una secuencia que tenga propiedades de enlace a una fase sólida (por ejemplo, la fase sólida puede tener un sitio reactivo que permita el enlace covalente con la secuencia heteróloga o que presente afinidad por un vehículo).

La proteína heteróloga, el polipéptido o el péptido, pueden seleccionarse de entre el grupo consistente en ßgalactosidasa, producto c-myc, glutatión-5-transferasa, etiquetas FLAG y derivados de las mismas. La secuencia heteróloga también puede comprender diversos aminoácidos iguales o diferentes. Preferiblemente, la secuencia heteróloga es un péptido que puede formar un enlace covalente con la fase sólida o una polihistidina de alta afinidad, especialmente a unos anticuerpos anti-polihistidina específicos. La secuencia heteróloga puede estar fusionada con la vWF-cp o con un fragmento de vWF-cp en sus terminales N- o C-. Normalmente, la secuencia heteróloga se fusiona con el extremo C-terminal de la vWF-cp. La vWF-cp o un fragmento de vWF-cp se fusiona con la secuencia heteróloga de forma que no se vean afectadas negativamente las propiedades biológicas de la vWF-cp

: o del fragmento de vWF-cp. Puede insertarse un péptido separador corto entre la secuencia heteróloga y la vWF-cp

: o fragmento de la vWF-cp, de forma que no impida estéricamente la presentación de los epítopos de la vWF-cp o del fragmento de la vWF-cp.

De acuerdo con una realización, la vWF-cp o un fragmento de la vWF-cp se fusiona con un péptido de afinidad funcional, concretamente un péptido que contiene diversos residuos histidina, en algunos casos de 3 a 20 residuos histidina y en otros casos de 6 a 15 residuos histidina. En el documento EP 0 282 042 se describe el uso de un péptido de afinidad en forma de poli-histidina (denominado “His-tag”) fusionado en el C-terminal con una proteína para la purificación proteica.

La inmovilización en la fase sólida puede llevarse a cabo (por ejemplo, directamente o por enlaces covalentes) vía grupos reactivos de la fase sólida y la secuencia heteróloga, o mediante un portador que tenga afinidad con la secuencia heteróloga.

En una realización preferente de la invención, la secuencia heteróloga tiene una elevada afinidad con un portador y la vWF-cp o los fragmentos de vWF-cp se inmovilizan en la fase sólida mediante enlace de su componente heterólogo al portador. Así, la secuencia heteróloga tiene unas propiedades de enlace específicas o alta afinidad por el portador. De acuerdo con una realización de la invención, el portador es un anticuerpo que presenta afinidad con el componente heterólogo de la proteína de fusión vWF-cp.

En una realización de la invención, la vWF-cp o un fragmento de la vWF-cp se fusionan para formar una cola polihistidina como secuencia heteróloga, utilizándose un anticuerpo anti-his-tag como portador, para inmovilizar la vWF-cp o el fragmento de vWF-cp en la fase sólida. También pueden utilizarse otros péptidos de afinidad heterólogos y los respectivos anticuerpos anti-péptidos de afinidad conocidos por el experto en la materia para inmovilizar la proteína de fusión vWF-cp o el fragmento de vWF-cp.

La vWF-cp y/o el fragmento o fragmentos de vWF-cp o las proteínas de fusión de los mismos, se inmovilizan por separado en la fase sólida en diferentes puntos, por ejemplo en los diferentes pocillos de una placa de microtitulación, que normalmente contiene en un punto un antígeno definido, como vWF-cp o o un fragmento especifico de vWF. Mediante este sistema de ensayo, puede obtenerse el espectro completo de anticuerpos antivWF-cp, identificándose aquellos anticuerpos anti-vWF-cp que tienen una actividad de enlace especifica en una región/dominio de la vWF-cp. Esta circunstancia es muy importante, ya que determinando la especificidad del anticuerpo anti-vWF-cp y determinando el punto de enlace del antígeno en la molécula de vWF-cp se puede identificar toda la gama de anticuerpos, pudiéndose adaptar el tratamiento a aquellos pacientes que sufren un trastorno asociado a un anticuerpo anti-vWF-cp. Por ejemplo, los anticuerpos anti-vWF-cp pueden eliminarse selectivamente del plasma de un paciente identificado como portador de anticuerpos anti-vWF-cp específicos sometiendo dicho plasma a un proceso de cromatografía de afinidad como el que aquí se describe, que utiliza como adsorbente fragmentos específicos de vWF-cp utilizados en el ensayo y con afinidades con el anticuerpo o anticuerpos. Esto permite mejorar el tratamiento de los pacientes que padecen trastornos asociados a los anticuerpos anti-vWF-cp, en comparación con los métodos de la técnica anterior.

De acuerdo con una realización de la invención, el kit descrito anteriormente comprende adicionalmente, como agente diagnóstico, un anticuerpo anti-vWF-cp inmovilizado en la fase sólida. El anticuerpo anti-vWF-cp puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal derivado por técnicas de hibridoma convencionales o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo obtenido por una técnica recombinante, por ejemplo presentación de fagos o ribosomas. Esta configuración del kit de la presente invención permite llevar a cabo un diagnóstico diferenciado de los trastornos trombóticos microangiopáticos. Concretamente, y mediante un kit que comprenda vWF-cp, fragmentos de vWF-cp y un anticuerpo anti-vWF-cp en una fase sólida, puede determinarse la presencia o ausencia de anticuerpos anti-vWF, así como la presencia o ausencia de vWF-cp en una muestra, mediante un sencillo sistema de ensayo.

La presente invención también se refiere a un método para detectar, cuantificar y mapear la región de enlace de antígeno de la vWF-cp de un anticuerpo anti-vWF-cp perteneciente a una muestra, comprendiendo las fases de aportar vWF-cp y/o uno o más fragmentos de vWF-cp seleccionados de entre el grupo consistente en las secuencias SEQ ID Nº 1-6 e inmovilizarlos en una fase sólida, sin que ello afecte sustancialmente a las propiedades biológicas de la vWF-cp o del fragmento de vWF-cp, poner en contacto una muestra biológica de un paciente del que se sospecha padece un trastorno asociado a la presencia del anticuerpo anti-vWF-cp con la vWF-cp inmovilizada y/o con uno o más fragmentos de la vWF-cp, y detectar el complejo de anticuerpos anti-vWF-cp/vWF-cp y/o anticuerpos anti-vWF-cp/fragmentos de la vWF-cp.

El complejo formado anticuerpo anti-vWF-cp/vWF-cp o anticuerpo anti-vWF-cp/fragmentos de vWF-cp puede detectarse por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo detección mediante un anticuerpo etiquetado. El método de detección puede seleccionarse de entre el grupo consistente en ensayos enzimáticos, cromogénicos, lumínicos, fluorogénicos y radioinmunes. Las condiciones de reacción para llevar la detección de la formación del complejo anticuerpo/antígeno dependen del método de detección seleccionado. El experto en la materia conocerá la técnica de selección de los parámetros óptimos, como el sistema tampón, la temperatura y el pH del sistema de detección que va a utilizarse.

La invención también se refiere a un método para el diagnóstico diferencial de trastornos trombóticos microangiopáticos mediante el kit anteriormente descrito, comprendiendo dicho kit, como agentes de diagnóstico, vWF-cp y/o uno o más fragmentos de vWF seleccionados de entre el grupo consistente en las secuencias SEQ ID Nº 1-6, y que opcionalmente también contiene vWF-cp, o vWF-cp y/o fragmentos de vWF seleccionados de entre el grupo consistente en las secuencias SEQ ID Nº 1-6 y anticuerpos anti-vWF-cp inmovilizados en una fase sólida. Preferiblemente, cada uno de los agentes de diagnóstico se encuentra situado en distintos puntos de la fase sólida, por ejemplo en diferentes pocillos de una placa de microtitulación. Esto permite diferenciar entre las muestras que comprenden vWF-cp o anticuerpos anti-vWF-cp o ambos mediante un sistema de ensayo y establecer una

diferenciación entre trastornos trombóticos microangiopáticos, por ejemplo, entre las diferentes variedades de TTP o HUS.

El kit y el método de la presente invención puede utilizarse para diagnosticar un trastorno asociado a la presencia de anticuerpos anti-vWF-cp.

El kit y el método de la presente invención también se pueden utilizar para diagnosticar diferentes tipos de trastornos incluidos entre las microangiopatías trombóticas. Entre los trastornos clasificados como Microangiopatía Trombótica (TM) se encuentran la púrpura trombótica trombocítica (TTP), la trombocitopenia neonatal, la púrpura de Henoch-Schönlein, preclampsia o el síndrome hemolítico-urémico (HUS), el síndrome HELLP, ARDS, síndrome isquémico periférico de los dedos, isquemia mesentérica no oclusiva, pancreatitis aguda, hepatitis aguda, púrpura reumática, trombocitopenia asociada a la administración de medicamentos, TM post-operatoria, TM asociada al cáncer, coagulación intravascular diseminada (DIC), lupus eritematoso sistémico, cirrosis hepática, uremia o trastornos inflamatorios agudos.

Los ejemplos aquí facilitados muestran claramente que la presencia de un anticuerpo anti-vWF-cp en un paciente con TTP adquirida que no presente efectos neutralizantes en un ensayo estándar de actividad de la vWF-cp, pero que es muy probable que afecte negativamente a la actividad de la vWF-cp mediante unos mecanismos diferentes del mero bloqueo de la actividad de escisión del sustrato, puede determinarse mediante la utilización de un kit y un método conforme a la presente invención. Esto permite un diagnóstico rápido y sencillo de la TTP y decidir la conveniencia de realizar intervenciones clínicas urgentes y necesarias para salvar vidas, es decir tratamientos con plasma. El kit y el método de la presente invención pueden utilizarse para el diagnóstico diferencial de diversas formas de TTP.

Mediante el kit y el método de la presente invención pueden detectarse todas las clases de IgG, así como los anticuerpos IgM, mientras que los métodos de la técnica anterior tan sólo permitían la detección de anticuerpos antivWF-cp de la clase IgG.

La presente invención se explica más claramente mediante los ejemplos siguientes, sin que la limiten en modo alguno.

Ejemplo 1: Construcción de una cola His(6x) de vWF-cp y un fragmento de vWF-cp

Para expresar la proteína vWF-cp se utiliza el clon de ADNc de vWF-cp descrito en la WO 02/42442.

Para construir una fusión his-tag de la vWF-cp se llevan a cabo dos procesos PCRs consecutivos para añadir los codones correspondientes a 3 x glicina, 6 x histidinas, el codón de parada y un sitio de restricción Xhol.

PCR1: se utiliza como plantilla pADNc3.1.(+)/ vWF-cp (ADAMTSI3) completo en estado natural descrito en el documento WO 02/42441. Con los cebadores 7189 (5' GTG ATG GTG ATG GTG TCC ACC TCC GGT TCC TTC CTT TCC CTT CCA3') y 6526 (5' CTG CCT CGC CCG GAA CCC CA 3') se amplifica un fragmento de 1,3kb que incluye el fragmento C-terminal SgrAl/Xhol procedente del pADNc3.1.(+)/vWF-cp. Utilizando este fragmento y los cebadores 7190 (5' CCC TCT AGA CTC GAG TCA ATG GTG ATG GTG ATG GTG TCC ACC 3') y 6526, se lleva a cabo el segundo proceso PCR. El producto resultante se purifica, se digiere con SgrAl y Xhol y se utiliza para sustituir el correspondiente fragmento SgrAl/Xhol en el constructo pADNc3.1.(+)/ vWF-cp en estado natural.

Utilizando como plantilla el clon de ADNc completo de la vWF-cp del documento WO 02/42442, se generan constructos de fragmentos de vWF-cp que contienen distintos fragmentos del gen de la proteína madura mediante un proceso PCR utilizando las siguientes combinaciones de cebadores (Véase también la Tabla 4, cebadores, y las respectivas secuencias del dominio de vWF-cp).

Sistema de expresión de E.coli: Sistema de expresión pBAD/TOPO Thiofusion (Invitrogen)

Fusión: Tiorredoxina (N-terminal), 6xHis-cola (C-terminal)

Fragmento de ADN (pb): Fragmento de proteína (aa) Región de ADAMTS13

88 - 222: 30(P) - 74 (R) Propéptido

223 - 1317: 75(A) - 439(E) Cat./Desintegr./tspl#1

1156 - 1317: 386 (R) - 439 (E) Tsp1 #1

1318 - 2055: 440(K) - 685(A) Cys-rico/separador

2056 - 3393: 686(W) - 1131 (V) tspl#2-8

3394 - 4281: 1132(G) - 1427(T) Cub1+2

Los fragmentos obtenidos mediante PCR se cortan con las enzimas de restricción adecuadas y se clonan en el vector como pRSET (Fig. 1), se escinden con las mismas enzimas, obteniéndose en los plásmidos deseados.

Para la construcción de fusiones his-tag de fragmentos de vWF-cp, los fragmentos de vWF-cp se modifican de acuerdo con la construcción de la secuencia his-tag de vWF-cp como se ha descrito anteriormente. Los constructos se clonan con la etiqueta HIS-6 sustituyendo el fragmento Ndel-Xhol por los oligonucleótidos sintéticos o.pRET-FPdH IS(1) - 6929 y o.pRSET-FPdHIS(2) - 6930 (Fig. 1).

La vWF-cp, los fragmentos vWF-cp o las respectivas fusiones his-tag se expresan de forma recombinante en E. coli JM 109, se purifican y utilizan para la inmovilización en fase sólida como se describe seguidamente.

Clon de célula HEK 293 con expression estable de vWF-cp/C-His

Se cotransfectaron células HEK 293 (ATCC) con pADNc3.1.(+)/ vWF-cp /C-His y un plásmido de selección que albergaba el cassette de higromicina utilizando un precipitación con fosfato cálcico. Los clones iniciales y los subsiguientes subclones se seleccionan en un medio de cultivo suplementado con 100 µg/ml de higromicina y 800 µg/ml de G418 (neomicina-fosfotransferasa codificada en pADNc). La vWF-cp/his-tag recombinante expresada se purifica y se utiliza para su inmovilización en una fase sólida, tal y como se describe más adelante.

Ejemplo 2: Acoplamiento de vWF-cp y/o fragmentos de vWF-cp en un portador

La vWFcp recombinante y los fragmentos de vWF-cp se acoplan directamente en una fase sólida o utilizando como portadores anticuerpos monoclonales anti-vWF-cp. La vWF-cp-His-tag o el fragmento de vWF-cp-His-tag se inmovilizan mediante un anticuerpo anti-His-tag en la superficie de una placa ELISA. Tras su incubación con el plasma de un paciente, los anticuerpos anti-vWF-cp ligados a vWF-cp o al fragmento de vWF-cp son detectados por un segundo conjugado de fosfatasa con un anticuerpo que reconoce la región constante del anticuerpo humano. La fosfatasa, cuando reacciona con un sustrato adecuado, produce una reacción cromogénica y un color amarillo. Se mide la intensidad del color y se determina la cantidad de anticuerpo presente en la muestra comparándola con una curva patrón de una cantidad conocida del anticuerpo anti-vWF.

Configuración de la prueba ELISA:

Se disolvió un anticuerpo comercial, sin BSA, anti-His-tag (“anticuerpo portador”; Qiagen, Alemania) a una concentración final de 2 µg/ml en PB,S pH 7,4. Se incubaron 100 µl por pocillo durante cuatro horas a temperatura ambiente en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Al cabo de tres fases de lavado con PBST, pH 7,4, (solución tampón de PBS que contiene un 0,1% (v/v) de Tween 20), se añadieron 250 µl de una solución de bloqueo que contenía PBS, pH 7,4, y un 2% (p/v) de seroalbúmina bovina, incubándose a 4ºC durante una noche para bloquear todos los sitios de enlace libres. La solución se sustituyó por 100 µl de una preparación etiquetada vWF-cp-His-tag recombinante. La concentración de la vWF-cp era de 1,5 µg/ml, lo que corresponde a una actividad de proteasa de 10 U/ml. Las muestras de vWF-cp se disolvieron hasta la concentración final en una solución PBS con un 2% de BSA. Debido al anticuerpo revestido anti-His, la vWFcp/His-tag recombinante se captó e inmovilizó con el anticuerpo portador. Al cabo de dos horas a temperatura ambiente, se llevaron a cabo diez etapas de lavado. La solución tampón de lavado contenía PBS, pH 7,4, y un 0,1% (v/v) de Tween 20. Las muestras de plasma de los pacientes se disolvieron a una proporción 1:20, 1:50, 1:100, 1:200, 1: 300, 1:400, 1:600, 1:800 y 1:1.200 en una solución PBS, pH 7,4, que contenía BSA al 2%, y se incubaron 100 µl de cada solución a temperatura ambiente durante 3 horas en los pocillos que contenían la vWF-cp recombinante. Los anticuerpos inhibidores se enlazaron en la superficie de la vWFcp inmovilizada y aquellos no enlazados se eliminaron mediante diez etapas de lavado con PBST a pH 7,4. La detección de anticuerpos humanos se llevó a cabo con un anticuerpo murino específico anti-IgG Fc humano o un conjugado de fosfatasa alcalina con un anticuerpo murino anti- IgM humano. El anticuerpo se disuelve en una proporción 1:60.000 en una solución de PBS con un 2% BSA hasta que se alcanza la solución de trabajo definitiva, incubándose durante 2 horas a temperatura ambiente (100 µI/pocillo), seguido de diez etapas de lavado con una solución PBST a pH 7,4. La adición de un sustrato de fosfatasa alcalina (pNPP) dió como resultado un color amarillo, reflejando la intensidad del color la cantidad de anticuerpo enlazado (anticuerpo/vWF-cp). La intensidad del color se midió en un lector ELISA, calculándose la cantidad de anticuerpo presente en el plasma en referencia a una curva patrón de NP por dilución en serie. Como control negativo, se trataron diluciones de plasma humano normal (NHP). Los resultados se muestran en las Figuras 2A y 2B. Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-vWF-cp humanos presentes en un paciente pueden detectarse claramente, al menos a una dilución de plasma de 1:600.

El plasma humano normal se utiliza como control, calculándose la desviación estándar (SD) para diversos lotes de plasma. La titulación de anticuerpos situados por encima del plasma humano normal + 2SD se evalúan como positiva.

Análisis de muestras de pacientes con TTP

Se sometieron a una prueba ELISA que contenía vWF-cp inmovilizada diversas muestras procedentes de pacientes con TTP y de plasma normal. Los resultados se muestran en la Tabla 1. El Paciente 1 tiene un título IgG de 1:600 y de IgM de 1:400. El título IgG del paciente 2 es muy superior (1:1.200), mientras que el título IgM es de tan sólo

1:100. El paciente 1 padece una TTP aguda, mientras que el paciente 2 atraviesa una fase de recaída posterior a la TTP. El Paciente 1 no presenta ningún título inhibitorio, mientras que el paciente 2 presenta un título inhibitorio de aproximadamente 60U/ml. El plasma humano normal no mostró ninguna reacción.

Tabla 1 Prueba ELISA para detectar el anticuerpo anti-vWF-cp. Títulos IgG e IgM de dos pacientes

1:20: 1:50 1:100 1:200 1:300 1:400 1:600 1:800 1:1.200

IgG#1: ++++ ++++ +++ +++ ++ ++ + - -

IgM#1: +++ +++ +++ ++ ++ + - - -

NP: - - - - - - - - -

IgG#2: ++++ ++++ ++++ +++ +++ - ++ ++ +

IgM#2: ++ ++ + - - - - - -

NP: - - - - - - - - -

Una serie de muestras procedentes de pacientes con TTP y muestras de plasma normal se sometieron a una prueba ELISA que contenía fragmentos de vWF-cp inmovilizada obtenidos a partir de diferentes regiones de vWF

5 cp. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Los IgG e IgM del paciente Nº 1 (sin título inhibitorio) muestran el enlace de los anticuerpos en los dominios trombospondina 2-8 y dominios Cub. Los IgG e IgM del paciente Nº 2 muestran enlaces en el dominio catalítico, lo que es coherente con el título inhibitorio. El plasma humano normal no reacciona con ningún dominio. El plasma del paciente se testó por duplicado y con dos diluciones de plasma diferentes (1:50 y 1:100).

10 Tabla 2 Análisis de los enlaces en diferentes fragmentos de ADAMTS-13 de los anticuerpos del paciente

Dom. catalit. 1:50: Dom. catalit. 1:100 Catalítico desintegrina tsp1 1:50 Catalítico, desintegrina tsp1 1:100 Sep. rico en Cys 1:50 Sep. rico en Cys 1:100 Tsp 2-8, 1:50 Tsp 2-8, 1:100 CUB 1+2 1:50 CUB 1+2 1:100

IgG#1: - - - - - - ++ + + -

IgM#1: - - - - - - ++ + + -

NP: - - - - - - - - - -

IgG#2: ++++ +++ ++ ++ - - - - -

IgM#2: ++ ++ + - - - - - -

NP: - - - - - - - - -

Una serie de muestras procedentes de pacientes con TTP y muestras de plasma normal se sometieron a una prueba ELISA que contenía fragmentos de anticuerpo anti-vWF-cp inmovilizados. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Los niveles de ADAMTS -13 de los pacientes Nº 1 y Nº 2 pueden detectarse con claridad; el plasma humano normal

15 muestra los mismos niveles. El Paciente Nº 3 se caracteriza por padecer un defecto genético en un alelo que causa una reducción de la actividad del 50%. En nuestro sistema de ensayo también puede apreciarse una reducción del 50% en la cantidad de proteína. El paciente Nº 4 se caracteriza por la ausencia completa de la proteína ADAMTS-13 debido a una mutación homocigótica sin sentido. Por consiguiente, no pudo detectarse proteína.

Tabla 3 Detección de los niveles de ADAMTS-13 en plasma con anticuerpos anti-vWF-cp para la captura

1:20: 1:50 1:100 1:200 1:300 1:400 1:600 1:800 1:1.200

ADAMTS-13 #1: ++++ ++++ ++++ +++ +++ +++ ++ + -

ADAMTS-13 #2: ++++ ++++ ++++ +++ +++ +++ ++ + -

ADAMTS-13 #3: +++ +++ +++ ++ ++ + - - -

ADAMTS-13 #4: - - - - - - - - -

NP: ++++ ++++ ++++ +++ +++ +++ ++ + -

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Kit para la detección, cuantificación y mapeo de una región de enlace de antígeno de la vWF-cp (proteasa de escisión del factor von Willebrand), de un anticuerpo anti-vWF-cp en una muestra, que comprende uno o más fragmentos de vWF-cp seleccionados de entre el grupo consistente en las secuencias SEQ ID Nº 1-6 inmovilizados en una fase sólida, sin que las propiedades biológicas de dichos fragmentos inmovilizados de vWF-cp se vean alteradas de forma sustancial.
2.

Kit según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además vWF-cp inmovilizada en la fase sólida sin que las propiedades biológicas de dicha vWF-cp inmovilizada se vean sustancialmente alteradas.
3.

Kit según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque dicha vWF-cp o dicho fragmento de vWF-cp está fusionado con una secuencia heteróloga.
4.

Kit según la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia heteróloga se selecciona de entre el grupo consistente en una proteína, un polipéptido y un péptido.
5.

Kit según la reivindicación 4, caracterizado porque el péptido comprende de 3 a 20 residuos de histidina consecutivos.
6.

Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la vWF-cp o el fragmento de vWF-cp se encuentran inmovilizados directamente en la fase sólida.
7.

Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la vWF-cp o el fragmento de vWF-cp se encuentran inmovilizados en la fase sólida vía un portador.
8.

Kit según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho portador es un anticuerpo.
9.

Kit según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho anticuerpo se dirige a la secuencia heteróloga fusionada hacia la vWF-cp o el fragmento de vWF-cp.
10.

Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la fase sólida se selecciona de entre el grupo consistente en placas, membranas, papel, película, tiras y perlas.
11.

Kit según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, caracterizado porque la vWF-cp y los fragmentos de vWF-cp se encuentran dispuestos por separado en diferentes puntos de la fase sólida.
12.

Kit para la diferenciación de diversas formas de microangiopatías trombóticas que comprende uno o más fragmentos de vWF-cp seleccionados de entre el grupo consistente en las secuencias SEQ ID Nº 1-6, inmovilizados en una fase sólida, sin que las propiedades biológicas de dicho fragmento inmovilizado de vWFcp se vean sustancialmente alteradas.
13.

Kit según la reivindicación 12, caracterizado porque incluye además vWF-cp inmovilizada en la fase sólida sin que las propiedades biológicas de dicha vWF-cp inmovilizada se vean sustancialmente alteradas.
14.

Kit según las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado porque además incluye un anticuerpo anti-vWF-cp inmovilizado en dicha fase sólida.
15.

Kit según la reivindicación 14, caracterizado porque la vWF-cp, los fragmentos de vWF-cp y el anticuerpo antivWF-cp se encuentran dispuestos por separado en diferentes puntos de la fase sólida.
16.

Método para la detección, cuantificación y mapeo de región de enlace de antígeno de vWF-, de un anticuerpo anti-vWF-cp, presente en una muestra, que comprende las fases de:

(a)

proporcionar una fase sólida que comprende uno o más fragmentos inmovilizados de vWF-cp seleccionados de entre el grupo consistente en las secuencias SEQ ID Nº 1-6 sin que las propiedades biológicas de dichos fragmentos de vWF-cp se vean sustancialmente alteradas;

(b)

poner en contacto una muestra biológica de un paciente que se sospecha padece un trastorno asociado a la presencia de un anticuerpo anti-vWF-cp con dichos fragmentos inmovilizados de vWF-cp; y

(c)

detectar un complejo de anticuerpo anti-vWF-cp y vWF-cp y/o de anticuerpo anti-vWF-cp y fragmentos de vWF-cp
17.

Método según la reivindicación 16, caracterizado porque la fase sólida se selecciona de entre el grupo consistente en placas, membranas, papel, película, tiras y perlas.
18.

Método según las reivindicaciones 16 o 17, caracterizado porque dicho complejo se detecta mediante un ensayo seleccionado de entre el grupo consistente en ensayos enzimáticos, ensayos cromogénicos, ensayos lumínicos, ensayos fluorogénicos y ensayos radioinmunes.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque el trastorno es una enfermedad 5 tromboembólica asociada a la presencia de un anticuerpo anti-vWF-cp.
20. Método para el diagnóstico y/o la discriminación de diferentes formas de microangiopatías trombóticas, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una fase sólida que comprende uno o más fragmentos inmovilizados de vWF-cp seleccionados

de entre el grupo consistente en las secuencias SEQ ID Nº 1-6 sin que las propiedades biológicas de dichos 10 fragmentos de vWF-cp se vean sustancialmente alteradas;

(b)

poner en contacto una muestra biológica de un paciente que se sospecha padece un trastorno asociado a la presencia de un anticuerpo anti-vWF-cp con dichos fragmentos inmovilizados de vWF-cp; y

(c)

detectar un complejo de anticuerpo anti-vWF-cp y vWF-cp y/o de anticuerpo anti-vWF-cp y fragmentos de vWF-cp

15 21. Método de la reivindicación 20, caracterizado porque la fase sólida de la etapa (a) comprende adicionalmente un anticuerpo anti-vWF-cp inmovilizado.
22. Método según la reivindicación 21, caracterizado porque la presencia o ausencia de la formación de un complejo anticuerpo anti-vWF-cp/vWF-cp-indica la forma de la microangiopatía trombótica.