ES2406605T3

ES2406605T3 - Moléculas pequeñas que sustituyen o agonizan la función p53

Info

Publication number: ES2406605T3
Application number: ES05786671T
Authority: ES
Inventors: Shahrooz Rabizadeh; Kayvan Niazi; Dale E. Bredesen
Original assignee: Buck Institute for Research on Aging
Current assignee: Buck Institute for Research on Aging
Priority date: 2004-08-20
Filing date: 2005-08-12
Publication date: 2013-06-07
Anticipated expiration: 2025-08-12
Also published as: AU2005277648B2; US9789121B2; CN101432001A; KR101400505B1; PL1786430T3; DK1786430T3; AU2005277648A1; HK1104237A1; EP2633858A3; US7994184B2; US20060094738A1; WO2006023410A2; PT1786430E; EP1786430A4; CA2829654A1; EP1786430A2; EP2633858A2; CA2580719C; US20120040457A1; CA2829654C

Abstract

Una composición que comprende un compuesto que promueve muerte celular en una célula p53 intacta,comprendiendo dicho compuesto la fórmula: donde: R1 y R4 se seleccionan independientemente del grupo consistente en un grupo amino, un grupo ciano, ungrupo nitro, un grupo carboxilo, halo, hidroxilo, SO2, C1-6 alquilo, C1-6 haloalquilo, C1-8 alcoxil, C1-11 alcoxialquil, C1-6alquilamino, C1-6 aminoalquilo; R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo consistente en CH, N; R5 es CH2 u O; R6 se seleccionan independientemente del grupo consistente CN, NO2, alquilo C1-10 ramificado o noramificado saturado o no saturado, alcoxi C1-10 ramificado o no ramificado, acilo C1-10 ramificado o no ramificado,aciloxi C1-10 ramificado o no ramificado, alquitio C1-10 ramificado o no ramificado, aminosulfonilo, arilo, aroilo, ariloxi,arilsulfonilo, heteroarilo heteroariloxi; R7 se seleccionan independientemente del grupo consistente en H, CN, NO2, alquilo C1-10 ramificado o noramificado saturado o no saturado, alcoxi C1-10 ramificado o no ramificado, acilo C1-10 ramificado o no ramificado,aciloxi C1-10 ramificado o no ramificado, alquitio C1-10 ramificado o no ramificado, aminosulfonilo, arilo, aroilo, ariloxi,arilsulfonilo, heteroarilo heteroariloxi; R8 se selecciona del grupo consistente NO2, OH, COOH; R9 se selecciona del grupo consistente en H, CH3; o un éster o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos donde dicho compuesto está en un excipientefarmacéuticamente aceptable.

Description

Moléculas pequeñas que sustituyen o agonizan la función p53.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención pertenece al campo de la oncología. En particular esta invención proporciona compuestos que sustituyen y/o agonizan la función p53 y métodos para identificar tales compuestos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Dos tercios de todos los cánceres de mama manifiestan mutaciones en el supresor de tumor p53 (Lai et al. (2004) Breast Cancer Res. Treat., 83: 57-66), y un tercio de todos los carcinomas de mama humana avanzados demuestran una marcada reducción en expresión del miembro Bax pro-apoptótico de la familia Bcl-2 (Krajewski et al. (1995) Cancer Res., 55: 4471-4478). Las mutaciones de Bax y p53 se asocian con un alto porcentaje de todos los tumores humanos. El subgrupo de pacientes que manifiestan mutaciones de p53 o expresión reducida de Bax generalmente responden pobremente a terapia y muestran tumores que crecen rápidamente y una menor supervivencia media (Lai et al., supra; Reed (1996) J. Clin. Invest., 97:2403-2404). Aunque se ha perseguido extensamente, se desconoce el mecanismo por el que la expresión Bax se regula en células normales, malignas o agonizantes. El único activador endógeno conocido de la expresión Bax es el factor de trascripción p53, que es responsable de inducir muerte celular en células cancerígenas y dañadas (Miyashita y Reed (1995) Cell, 80: 293299).

WO 95/19367; US 5744310; BYKOV V J N ET AL: “Moléculas pequeñas que reactivan el mutante p53”, EUROPEAN JOURNAL OF CANCER, PERGAMON EXPRESS, OXFORD, GB, vol. 39, nº 13, 1 septiembre 2003 páginas 18281834; LIONATAS ET AL: “CURCUMINA Y RESVERATROL INDUCEN APOPTOSIS Y TRASLOCACIÓN NUCLEARY ACTIVACIÓN DE P53 IN NEUROBLASTOMA HUMANO”, ANTICANCER RESEARCH, INTERNATIONAL INSTITUTE OF ANTICANCER RESEARCH, GR, vol. 24, nº 28, 1 marzo 2004 páginas 987-998; CHOUDHURI T ET AL: “Curcumina induce apoptosis en células de cáncer de mama humano a través de la inducción de Bax dependiente de p53”, FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 512, nº 1-3, 13 febrero 2002, páginas 334-340; LIN ET AL: “Fosforilación de p53 con Serina inducida por Resveratrol causa Apoptosis en una Línea Celular de Cáncer de Próstata de p53 Mutante”, JOURNAL OF UROLOGY, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, BALTIMORE, MD, US vol. 168, nº2, 1 agosto 2002, páginas 748-755; y WATABE MASAHIKO ET AL.: “Éster de fenetil de ácido cafeico induce apoptosis por inhibición de NFkappaB y activación de Fas en células MCF-7 de cáncer de mama humano”, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 13 FEB 2004, vol. 279, nº 7, 13 febrero 2004, páginas 6017 se dirigen a métodos para promover la muerte celular en células p53 intactas que comprende el uso de miméticos/agonistas de p53.

CHIO L-C ET AL: “IDENTIFICACIÓN DE INHIBIDORES MUY POTENTES Y SELECTIVOS DE HIDROFOLATO REDUCTASA DE TOXOPLASMA GONDII”, ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 37, nº 9, 1 septiembre 1993, páginas 1914-1923, desvela el uso de 5-(4-cloro-fenil)-6-6 (4-nitro-fenoximetil)-pirimidina-2,4-diamina en el tratamiento de leucemia.

BAKER B R ET AL: “Inhibidores irreversibles de enzima. CXXXIV. Efecto de sustitución de anillo en la inhibición irreversible selectiva de reductasa dihidrofólica de leucemia e hígado de ratón L 1210 por 2,4- diamino-5- (3,4diclorofenil)-6- [p- (m-fluorosulfonil-fenilureido) fenoximetil] pirimidina”. JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY ENERO 1969, vol. 12, nº1, Enero 1969 páginas 74-78, describe una composición que comprende EtOH/THF y 5(3,4-dicloro-fenil)-6-(4-metil-3-nitro-fenoximetil)-pirimidina-2,4-diamina.

BAKER B R ET AL: “Inhibidores irreversibles de enzima. CLXVI. Inhibidores irreversibles dirigidos al sitio activo de reductasa dihidrofólica derivados de 2,4-diamino-5 (3,4-diclorofenil) pirimidina con 6 sustituyentes y algunos factores en su transporte de pared celular”, JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY ENERO 1970, vol. 13, nº1, Enero 1970 (1970-71), páginas 82-86, desvela el uso de 5- (3,4-dicloro-fenil)-6-(fenoximetil)-pirimidina-2,4-diamina y 5- (3,4dicloro-fenil)-6-(-2-feniletil)-pirimidina-2,4-diamina en el tratamiento de leucemia.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Esta invención proporciona sistemas nuevos de cribado adecuados para la identificación de agentes que actúan como miméticos/agonistas de p53. También proporciona miméticos/agonistas de p53 efectivos.

De este modo, en ciertas realizaciones, esta invención proporciona un compuesto que promueve la muerte celular en una célula p53 intacta (por ejemplo, una célula tumoral). Ciertos compuestos preferentes son los de la Formula I en el presente documento, donde R1 y R4 se seleccionan independientemente del grupo consistente en un grupo amino, un grupo ciano, un grupo nitro, un grupo carboxilo, halo, hidroxilo, SO2, C1-6 alquilo, C1-6 haloalquilo, C18 alcoxil, C1-11 alcoxialquil, C1-6 alquilamino, C1-6 aminoalquilo, y similares; R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo consistente en C, N, y similares; R5 es C u O; R6 y R7 se seleccionan independientemente del grupo consistente en H (solamente R7), halógeno, CN, NO2, alquilo C1-10 ramificado o no ramificado saturado o no saturado, alcoxi C1-10 ramificado o no ramificado, acilo C1-10 ramificado o no ramificado, aciloxi C1-10 ramificado o no ramificado, alquitio C1-10 ramificado o no ramificado, aminosulfonilo, arilo, aroilo, ariloxi, arilsulfonilo, heteroarilo heteroariloxi, y similares; R8 se selecciona del grupo consistente en NO2, OH, COOH, y similares; R9 se selecciona del grupo consistente en H, CH3, y similares, o un éster o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En ciertas realizaciones R6 y R7 son ambos halógenos. En varias realizaciones R1 y R4 son ambos amino. En varias realizaciones R2 y R3 son ambos N. En varias realizaciones R8 es NO2. En ciertas realizaciones el compuesto tiene la fórmula de la fórmula II.

También se proporciona un método para promover la muerte celular en una células p53 intacta (por ejemplo, una célula cancerígena que incluye tumores sólidos, células metastásicas, y cánceres de tumores no sólidos). El método típicamente implica el contacto de la célula con un compuesto que induce trascripción de ras. En varias realizaciones el compuesto es un compuesto de acuerdo con la Fórmula I como la descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones el compuesto es un excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones la célula es una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer uterino, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer de próstata o una célula de cáncer de colon.

También se proporciona una línea celular para examinar agentes que promueve la muerte celular en una célula p53 intacta. La línea celular comprende típicamente células de mamíferos que contienen una construcción de ácido nucleico que comprende elementos promotores de bax que comprenden un 5’ UTR, una secuencia TATAA, y una o más secuencias de consenso que se enlazan con p53, donde los elementos promotores de p53 están operativamente enlazados con un reportero de tal manera que el enlace de una proteína p53 con una o más de dichas secuencias de consenso induzca o aumente la trascripción de dicho reportero. En ciertas realizaciones el reportero es una proteína fluorescente, luciferasa, cloranfenicol acetil transferasa (CAT), �-galactosidasa (�-gal), fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante (PRP), o una hormona del crecimiento (HC). En ciertas realizaciones el reportero comprende un gen de luciferina o cADN. En varias realizaciones la célula del mamífero es una célula p53 intacta (por ejemplo, una célula HEK293T).

Esta invención también proporciona métodos para identificar agentes que promueven la muerte células en células p53 intactas. Los métodos típicamente implican contactar una o más células de la línea celular descrita en el presente documento con uno o más agentes del test; detectar una señal del reportero en la célula donde un aumento en la señal del reportero indica que el agentes es un agente que tiene probabilidades de promover muerte celular en una célula p53 intacta. En ciertas realizaciones un único agente de test se pone en contacto con dicha célula. En varias realizaciones el aumento se mide en relación con un control que carece del agente del test o que comprende el agente del test en una concentración menor. En ciertas realizaciones el método se realiza con un sistema robótico. En varias realizaciones los agentes del test son de una biblioteca seleccionada del grupo consistente en ChemBridge DiverSet E, Bionet 1, CEREP, Maybridge 1, Maybridge 2, Peakdale 1, Peakdale 2, ChemDiv Combilab and International, Placa Mezclada Comercial 1, Placa Mezclada Comercial 2, Placa Mezclada Comercial 3, Placa Mezclada Comercial 4, ChemBrige Microformat, Commercial Diversity Set1, NCI Structural Diversity Set versión 1, NCI Structural Diversity Set versión 2, NCI Mechanistic Diversity Set, NCI Open Collection 1, NCI Open Collection 2, NINDS Custom Collection, SpecPlus Collection, BIOMOL ICCB Bioactivos Desconocidos, Colecciones Distintas ICCB, ICCB2, ICCB3, ICCB4, Extractos Marinos NCI, fracciones acuosas – Extractos de Plantas y Hongos NCI, fracciones orgánicas – Extractos de Plantas y Hongos NCI, Extractos de Planta de Filipinas 1, Extractos de Planta de Filipinas 2, y Extractos de Fundación Starr 1.

DEFINICIONES

Una “célula p53 intacta” se refiere a una célula que expresa un p53 defectuoso, y/o p53 con actividad reducida, y/o que subexpresa p53 normal, etc. Típicamente las células p53 intactas muestran actividad supresora de tumor de p53 reducida en comparación con una célula “normal”.

Los términos “reportero” o “gen reportero” se refieren al gen o cADN que expresa un producto que es detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos y/o químicos. Los reporteros/etiquetas útiles en este aspecto incluyen, aunque no se limitan a, proteínas luminiscentes, proteínas fluorescentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde (PFV), proteína fluorescente roja (PFR), etc.), enzimas, (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, �-galactosidasa, y otras comúnmente usados en un ELISA), y similares.

El término “gen reportero operativamente enlazado con un promotor” se refiere a un promotor y a un gen reportero dispuestos de tal manera que el promotor regule la trascripción del gen reportero.

El término “agente del test” se refiere a un agente que se examinará en uno o más de los ensayos descritos en el presente documento. El agente puede ser virtualmente cualquier compuesto químico. Puede existir un único compuesto aislado o puede ser un miembro de una biblioteca química (por ejemplo, combinatorio). En una realización particularmente preferente, el agente del test será una molécula orgánica pequeña.

El término “molécula orgánica pequeña” se refiere a una molécula de un tamaño comparable a las moléculas orgánicas generalmente usadas en productos farmacéuticos. El término excluye macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, etc.). Las moléculas orgánicas pequeñas preferentes tienen un tamaño en el rango de hasta aproximadamente 5000 Da, más preferentemente hasta 2000 Da, y más preferentemente hasta aproximadamente 1000 Da.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 ilustra elementos de enlace de p53 en el Bax 5’UTR.

La Figura 2A muestra la estructura de Rp53-1 (G6). La Figura 2B muestra que Rp53-1 (G6) activa el reportero p53/BAx en células HEK293T a niveles relativos al p53 sobreexpresado temporalmente.

La Figura 3 muestra que las células de cáncer de mama mutantes p53 (MDA-435) pero no las de tipo salvaje (MCF-7) son sensibles al compuesto mimético Rp53-1 de p53 (G6).

La Figura 4 ilustra las mutaciones de p53 que dan como resultado la desregulación de la expresión Bax/Bcl

2.

La Figura 5 ilustra que la expresión bax está inducida por p53 y lleva a apoptosis.

La Figura 6 ilustra el cribado para miméticos/agonistas de p53.

La Figura 7 muestra que un tratamiento de pulso único de células de cáncer de mama con G6 da como resultado una eficacia completa del fármaco.

La Figura 8 muestra que G6 induce el Reportero p53 en p53 Mt y Células Nulas.

La Figura 9 ilustra los resultados del tratamiento de células HT-29 con G6.

La Figura 10 muestra que el tratamiento con G6 de ratones desnudos implantados con osteosarcoma de tejido humano da como resultado una completa regresión del tumor.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Esta invención se base en parte en la idea que examinando compuestos moleculares pequeños que actúan como imitadores de p53 en la activación de expresión bax se pueden producir productos terapéuticos para muchas neoplasias mamarias.

I. Sistema de cribado para miméticos/agonistas de p53

Para identificar imitadores de p53, desarrollamos un sistema celular mamífero vivo que informa sobre la promoción de la expresión de la proteína Bax pro-apóptica. El promotor bax consiste en un nucleótido 372 5’UTR, una secuencia TATAA, y varias secuencias de consenso que se enlazan con p53, dando como resultado el aumento de la expresión Bax (véase, por ejemplo, Figura 1). Al expresar estos sitios corriente arriba de la luciferasa que codifica el gen en células HEK293T (véase, por ejemplo, Figura 5), hemos establecido un nuevo conjunto de líneas celulares reporteras. Estas células proporcionan un sistema que permite la identificación de los activadores directos de la expresión Bax y las sustituciones de una función apoptótica de p53 (véase, por ejemplo, Figura 6).

A) Cribado ultrarrápido para miméticos/agonistas de p53

Las líneas celulares descritas en el presente documento son particularmente efectivas para examinar miméticos/agonistas de p53. Además, estas líneas celulares son también adecuadas para modalidades “ultrarrápidas”. Convencionalmente, las nuevas entidades químicas con propiedades útiles (por ejemplo, modulación de actividad transportadora o expresión, o habilidad para transportarse por transportadores de esta invención) se generan identificando un compuesto químico (llamado un “compuesto principal”) con alguna propiedad o actividad deseable, creando variantes del compuesto principal, y evaluando la propiedad o actividad de esos compuestos variantes. Sin embargo, la tendencia actual es acortar la escala de tiempo para todos los aspectos de descubrimiento de fármacos. Debido a la habilidad para testar un gran número de manera rápida y eficaz, los métodos de cribado ultrarrápido (HTS) están sustituyendo a los métodos convencionales de identificación de compuesto principal.

En una realización preferente, los métodos de cribado ultrarrápido implican proporcionar una biblioteca que contiene un gran número de compuestos (compuestos candidatos/agentes del test) que potencialmente tienen la actividad deseada. Tales “bibliotecas químicas” se examinan después en uno o más ensayos, como se describe en el presente documento, para identificar aquellos miembros de biblioteca (especies o subclases químicas particulares) que manifiestan una actividad característica deseada. Los compuestos identificados de este modo pueden servir como “compuestos principales” convencionales o pueden usarse por sí mismos como productos terapéuticos potenciales o reales.

1) Bibliotecas para examinar agentes que actúan como miméticos/agonistas de p53

La probabilidad de un ensayo que identifica un agente que actúa como un mimético/agonista de p53 aumenta cuando el número de tipos de agentes del test usados en el sistema de cribado aumenta. Recientemente, se ha centrado la atención en el uso de bibliotecas químicas combinatorias para ayudar a la generación de nuevos compuestos químicos principales. Una biblioteca química combinatoria es una colección de diversos compuestos químicos generados por síntesis química o síntesis biológica combinando un número de “bloques de construcción” tales como reagentes. Por ejemplo, una biblioteca química combinatoria lineal tal como una biblioteca de polipéptidos se forma combinando un conjunto de bloques químicos de construcción llamados aminoácidos en todas las maneras posibles para una longitud dada de compuesto (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto de polipéptido). Millones de compuestos químicos pueden sintetizarse a través de tal mezcla combinatoria de bloques químicos de construcción. Por ejemplo, un comentarista ha observado que la mezcla sistemática y combinatoria de 100 bloques químicos de construcción intercambiables da como resultado una síntesis teórica de 100 millones de compuestos tetraméricos o 10 billones de compuestos pentaméricos (Gallop et al. (1994) 37(9): 1233-1250).

La preparación y el cribado de bibliotecas químicas combinatorias son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Tales bibliotecas químicas combinatorias incluyen, aunque no se limitan a, bibliotecas de péptidos (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos 5.010.175, Furka (1991) Int. J. Pept. Prot. Res., 37: 487493, Houghton et al. (1991) Nature, 354: 84-88). La síntesis de péptidos no es de ninguna manera la única técnica que se concibe y pretende usar con la presente invención. También pueden usarse otras químicas para generar bibliotecas de diversidad química. Tales químicas incluyen, aunque no se limitan a: peptoides (Publicación PCT Nº WO 91/19735, 26 dic. 1991), péptidos codificados (Publicación PCT Nº WO 93/20242, 14 oct. 1993), bio-oligómeros arbitrarios (Publicación PCT Nº WO 92/00091, 9 enero 1992), benzodiacepinas (Patente de Estados Unidos Nº 5.288.514), diversos isómeros tales como hidrantoinas, benzodiacepinas y dipéptidos (Hobbs et al., (1993) Proc. Nat. Acad. Sci USA 90: 6909-6913), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al., (1992), J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568), peptidomiméticos no peptídicos con un andamiaje Beta-D-Glucosa (Hirschmann et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc.

114: 9217-9218), síntesis orgánicas análogas de pequeñas bibliotecas de compuestos (Chen et al. (1994) J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661), oligocarbamatos (Cho et al., (1993) Science 261:1303), y/o fosfonatos de peptidilo (Campbell et al., (1994) J. Org. Chem. 59:658). Véase, de manera general, Gordon et al., (1994) J. Med. Chem. 37: 1385, bibliotecas de ácido nucleico (véase, por ejemplo, Stratagene, Corp.), bibliotecas de ácido nucleico peptídico (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (véase, por ejemplo, Vaughn et al. (1996) Nature Biotechnology, 14(3): 309-314), y PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (véase, por ejemplo, LIang et al. (1996) Science, 274: 1520-1522, y Patente de Estados Unidos 5.593.853), y bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (véase, por ejemplo, benzodiacepinas, Baum (1993) C&EN, enero 18, Página 33, isoprenoides, Patente de Estados Unidos 5.569.588, tiazolidinonas y metatiazanonas Patente de Estados Unidos 5.549.974, pirrolidinas Patentes de Estados Unidos 5.525.735 y 5.519.134, compuestos morfolinos Patente de Estados Unidos 5.506.337, benzodiacepinas 5.288.514, y similares).

Además, un número de bibliotecas están comercialmente disponibles. Tales bibliotecas incluyen, aunque no se limitan a, ChemBridge DiverSet E (16.320 compuestos), Bionet 1 (4.800 compuestos), CEREP (4.800 compuestos), Maybridge 1 (8.800 compuestos), Maybridge 2 (704 compuestos), Peakdale 1 (2.816 compuestos), Peakdale 2 (352 compuestos), CehmDiv Combilab and International (28.864 compuestos), Placa Mezclada Comercial 1 (352 compuestos), Placa Mezclada Comercial 2 (320 compuestos), Placa Mezclada Comercial 3 (251 compuestos), Placa Mezclada Comercial 4 (331 compuestos), ChemBrige Microformat (50.000 compuestos), Commercial Diversity Set1 (5.056 compuestos), varias colecciones NCI (por ejemplo, Structural Diversity Set versión 1 (1.900 compuestos), Structural Diversity Set versión 2 (1.900 compuestos), Mechanistic Diversity Set (879 compuestos), y similares, NINDS Custom Collection (1.040 compuestos), ICBB Bioactivos 1 (489 compuestos), varias Colecciones Distintas ICCB (por ejemplo, ICCB1 (190 compuestos), ICCB2 (352 compuestos), ICCB3 ( 352 compuestos), ICCB4 (352 compuestos), y similares), varios extractos de productos naturales (por ejemplo, Extractos Marinos NCI (352 compuestos), Fracciones acuosas– Extractos de Plantas y Hongos NCI (2.112 pozos), Fracciones orgánicas – Extractos de Plantas y Hongos NCI (1.408 pozos), Extractos de Planta de Filipinas 1 (200 pozos), Extractos de Planta de Filipinas 2 (648 pozos), Extractos de Fundación Starr 1 (1.024 pozos) y similares.

2) Dispositivos para cribado ultrarrápido

Un número de sistemas de cribado ultrarrápido están comercialmente disponibles (véase, por ejemplo, Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor; OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA, etc.). Estos sistemas típicamente automatizan los procedimientos completos incluyendo el pipeteo de muestras y reagentes, la administración de líquido, las incubaciones programadas, y la lecturas finales de la microplaca en el detector o detectores apropiados para el ensayo. Estos sistemas configurables proporcionan un inicio ultrarrápido así como un alto grado de flexibilidad y customización. Los fabricantes de tales sistemas proporcionan protocolos detallados de los varios sistemas ultrarrápidos. De este modo, por ejemplo, Zymark Corp. proporciona boletines técnicos que describen sistemas de cribado para detectar la modulación de trascripción genética, enlace de ligandos, y similares.

II. Miméticos/agonistas de p53

En ciertas realizaciones, esta invención proporciona un número de miméticos/agonistas de p53. Estos compuestos típicamente promueven la muerte celular en una célula p53 intacta (por ejemplo, una célula cancerígena). En ciertas realizaciones, los compuestos comprenden la fórmula:

donde R1 y R4 se seleccionan independientemente del grupo consistente en un grupo amino, un grupo ciano, un grupo nitro, un grupo carboxilo, halo, hidroxilo, SO2, C1-6 alquilo, C1-6 haloalquilo, C1-8 alcoxil, C1-11 alcoxialquil, C1-6 alquilamino, C1-6 aminoalquilo; R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo consistente en C, N; R5 es C u O; R6 y R7 se seleccionan independientemente del grupo consistente en H, halógeno, CN, NO2, alquilo C1-10 ramificado o no ramificado saturado o no saturado, alcoxi C1-10 ramificado o no ramificado, acilo C1-10 ramificado o no ramificado, aciloxi C1-10 ramificado o no ramificado, alquitio C1-10 ramificado o no ramificado, aminosulfonilo, arilo, aroilo, ariloxi, arilsulfonilo, heteroarilo heteroariloxi, y similares; R8 se selecciona del grupo consistente en NO2, OH, COOH; R9 se selecciona del grupo consistente en H, CH3. También se incluyen ésteres o sales farmacéuticamente aceptables de tales compuestos. En ciertas realizaciones R6 y R7 son ambos halógenos. En ciertas realizaciones R1 y R4 son ambos amino. En ciertas realizaciones, R2 y R3 son ambos N. En ciertas realizaciones, R8 es NO2. En ciertas realizaciones, el compuesto tiene la fórmula:

Tales compuestos pueden formularse fácilmente, por ejemplo, usando el compuesto de la fórmula II como un punto de inicio.

III. Formulaciones farmacéuticas

En ciertas realizaciones, los miméticos/agonistas de p53 de esta invención se proporcionan y/o administran como formulaciones farmacéuticas. Típicamente, uno o más miméticos/agonistas de p53 de esta invención se administran, por ejemplo, a un individuo diagnosticado por tener uno o más síntomas de cáncer. Los miméticos/agonistas de p53 pueden administrarse en la forma “intacta” o, si se desea, en forma de sales, ésteres, amidas, profármacos, derivaos y similares, siempre y cuando la sal, éster, amida, profármaco o derivado sea farmacéuticamente adecuado, es decir, efectivo en el método presente. Las sales, ésteres, amidas, profármacos y otros derivados de los agentes activos pueden prepararse usando procedimientos estándares conocidos por aquellos expertos en la técnica de química orgánica sintética y descritos, por ejemplo, por March (1992) Advanced Organic Chemistry; Reactions, Mechanisms and Structure, 4º Ed. N.Y. Wiley-Interscience.

Por ejemplo, se preparan sales ácidas de adición a partir de la base libre usando metodología convencional que típicamente implica la reacción con un ácido adecuado. Generalmente, la forma base del fármaco se disuelve en un disolvente orgánico polar tal como metanol o etanol y el ácido se añade al mismo. La sal resultante precipita o se saca de la solución mediante adición de un disolvente menos polar. Los ácidos adecuados para preparar sales ácidas de adición incluyen ácidos orgánicos, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico, y similares, así como ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido hidroclórico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y similares. Una sal ácida de adición puede reconvertirse en base libre mediante tratamiento con una base adecuada. Las sales ácidas de adición particularmente preferentes de los agentes activos en el presente documento son sales de haluro, tales como las que se pueden preparar usando ácidos hidroclóricos e hidrobrómicos. Por el contrario, la preparación de sales básicas de los miméticos/agonistas de p53 se preparan de una manera similar usando una base farmacéuticamente aceptable tal como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio, trimetilamina, o similares. Las sales básicas particularmente preferentes incluyen sales de metal alcali, por ejemplo, la sal de sodio, y sales de cobre.

La preparación de ésteres típicamente implica la funcionalización de grupos de hidroxilo y/o carboxilo que pueden estar presentes dentro de la estructura molecular del fármaco. Los ésteres son típicamente derivados sustituidos de acilo de grupos libres de alcohol, es decir, fracciones que se derivan de ácidos carboxílicos de la fórmula RCOOH donde R es alquilo, y preferentemente un alquilo inferior. Los ésteres pueden reconvertirse a ácidos libres, si se desea, usando procedimientos convencionales de hidrogenólisis o hidrólisis.

Las amidas y profármacos también pueden prepararse usando técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica o descritas en la bibliografía pertinente. Por ejemplo, las amidas pueden prepararse a partir de ésteres, usando reactantes adecuados de amina, o pueden prepararse a partir de un anhídrido o un cloruro ácido mediante reacción con amonio o una amina de alquilo inferior. Los profármacos se preparan típicamente mediante enlace covalente de una fracción que da como resultado un compuesto que es terapéuticamente inactivo hasta que lo modifica un sistema metabólico de un individuo.

Los miméticos/agonistas identificados en el presente documento son útiles para administración parenteral, tópica, oral, nasal (o de lo contrario inhalada), rectal, o local, tal como mediante aerosol o transdérmicamente, para tratamiento profiláctico y/o terapéutico de ateroesclerosis y/ síntomas de la misma. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en una variedad de formas de dosis de unidad dependiendo del método de administración. Las formas adecuadas de dosis de unidad incluyen, aunque no se limitan a, polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, pastillas, supositorios, parches, sprays nasales, formulaciones inyectables, implantables, de liberación prolongada, complejos lípidos, etc.

Los miméticos/agonistas de esta invención típicamente se combinan con un transportador farmacéuticamente aceptable (excipiente) para formar una composición farmacológica. Los transportadores farmacéuticamente aceptables pueden contener uno o más compuestos fisiológicamente aceptables que actúan, por ejemplo, para estabilizar la composición o para aumentar o disminuir la absorción del agente o agentes activos. Los compuestos fisiológicamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa, o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular, potenciadores de protección y absorción tales como lípidos, composiciones que reducen la depuración o hidrólisis de los agentes activos, o excipientes u otros estabilizadores y/o tampones.

Otros compuestos fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes o conservantes que son particularmente útiles para prevenir el crecimiento o la acción de microorganismos. Varios conservantes son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, fenol y ácido ascórbico. Un experto en la técnica apreciará que la elección del portador o portadores farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable depende, por ejemplo, de la ruta de administración del agente o agentes activos y de las características fisioquímicas particulares del agente o agentes activos.

Los excipientes son preferentemente estériles y generalmente están libres de materia indeseable. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas.

En aplicaciones terapéuticas, las composiciones de esta invención se administran a un paciente que sufre de uno o más síntomas de ateroesclerosis o en riesgo de ateroesclerosis en una cantidad suficiente para curar o al menos prevenir parcialmente o detener la enfermedad y/o sus complicaciones. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una “dosis terapéuticamente efectiva”. Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la enfermedad y del estado general de la salud del paciente. Pueden administrarse administraciones únicas o múltiples de las composiciones dependiendo de la dosis y la frecuencia como lo requiera y tolere el paciente. En cualquier caso, la composición debería proporciona una cantidad suficiente de los agentes activos de las formulaciones de esta invención para tratar de manera efectiva (mejorar uno o más síntomas) el paciente.

La concentración de miméticos/agonistas de p53 pueden variar mucho, y principalmente se seleccionarán en base a los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y con las necesidades del paciente. Sin embargo, las concentraciones se seleccionarán típicamente para proporcionar dosis que oscilan desde aproximadamente 0,1 a 1 mg/kg/día a aproximadamente 50 mg/kg/día y algunas veces más alta. Las dosis típicas oscilan desde aproximadamente 3 mg/kg/día a aproximadamente 3,5 mg/kg/día, preferentemente desde 3,5 mg/kg/día a aproximadamente 7,2 mg/kg/día, más preferentemente desde aproximadamente 7,2 mg/kg/día a aproximadamente 11,0 mg/kg/día, y más preferentemente desde aproximadamente 11,0 mg/kg/día a aproximadamente 15,0 mg/kg/día. En ciertas realizaciones preferentes, las dosis oscilan desde aproximadamente 10 mg/kg/día a aproximadamente 50 mg/kg/día. Se apreciará que tales dosis pueden variar para optimizar un régimen terapéutico en un sujeto particular o grupo de sujetos.

En ciertas realizaciones, los miméticos/agonistas de p53 de esta invención se administrarán oralmente (por ejemplo, mediante un comprimido) o como un inyectable de acuerdo con los métodos estándares bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. En otras realizaciones preferentes, los miméticos/agonistas de p53, también pueden entregarse a través de la piel usando sistemas de entrega de fármaco transdérmicos convencionales, es decir, “parches” transdérmicos donde el agente o agentes activos están típicamente contenidos dentro de una estructura laminada que sirve como un dispositivo de entrega del fármaco para pegarse a la piel. En tal estructura, la composición del fármaco está típicamente contenida en una capa, o “depósito” que es la base de una capa de apoyo superior. Se apreciará que el término “depósito” en este contexto se refiere a la cantidad de “ingrediente(s) activo(s)” que en última instancia está disponible para su entrega a la superficie de la piel. De este modo, por ejemplo, el “depósito” puede incluir el ingrediente o ingredientes activos en un adhesivo sobre una capa de apoyo del parche, o en cualquiera de una variedad de formulaciones matrices diferentes conocidas por aquellos en la técnica. El parche puede contener un único depósito, o puede contener múltiples depósitos.

En una realización, el depósito comprende una matriz polimérica de un material adhesivo de contacto farmacéuticamente aceptable que sirve para pegar el sistema a la piel durante la entrega del fármaco. Los ejemplos de materiales adhesivos adecuados de contacto con la piel incluyen, aunque no se limita a, polietileno, polisiloxanos, poliisobutilenos, poliacrilatos, poliuretanos, y similares. Alternativamente, el depósito que contiene el fármaco y el adhesivo en contacto con la piel están presentes como capas separadas y distintas, con el adhesivo que es la base de la reserva que, en esta caso, puede ser una matriz polimérica como se ha descrito anteriormente, o puede ser un depósito líquido o de hidrogel, o puede tomar alguna otra forma. La capa de apoyo en estos laminados, que sirve como la superficie superior del dispositivo, funciona preferentemente como un elemento estructura principal del “parche” y proporciona mucha de su flexibilidad al dispositivo. El material seleccionado para la capa de apoyo es preferentemente sustancialmente impermeable para el agente o agentes activos y cualquieras otros materiales que estén presentes.

En ciertos casos, particularmente donde la biodisponibilidad es baja con administración sistémica, los miméticos/agonistas de p53 se administran directamente al sitio del tumor o a un sitio del tumor post-operativo. Tal entrega puede ser directa a través de una cánula o mediante inyección o colocación de una formulación de liberación controlada, por ejemplo, durante un procedimiento quirúrgico.

Otras formulaciones preferentes para la entrega tópica del fármaco incluyen, aunque no se limitan a, pomadas y cremas. Las pomadas son preparaciones semisólidas que básicamente se basan en petrolato u otros derivados de petróleo. Las cremas que contienen el agente activo seleccionado son típicamente emulsiones viscosas líquidas o semisólidas, a menudo aceite en agua o agua en aceite. Las bases de crema son típicamente lavables con agua, y contienen una fase de aceite, un emulsionante y una fase acuosa. La fase de aceite, algunas veces llamada la fase “interna”, está formada generalmente por petrolato y un alcohol graso tal como alcohol de cetilo o estearilo; la fase acuosa normalmente, aunque no necesariamente, excede la fase de aceite en volumen, y generalmente contiene un humectante. El emulsionante en una formulación de crema es generalmente un surfactante no iónico, aniónico, catiónico o anfotérico. La base específica de pomada o crema que se usará, como aquellos expertos en la técnica apreciarán, es aquella que proporcione una óptima entrega del fármaco. Como con otros transportadores o vehículo, una base de pomada debería ser inerte, estable, no irritante y no sensibilizadora.

IV. Mitigación/tratamiento de cánceres

En ciertos casos los miméticos/agonistas de p53 de esta invención se administran para mitigar uno o más síntomas de un cáncer (por ejemplo, inducir muerte celular en células cancerígenas). Los miméticos/agonistas de p53 pueden administrarse para reducir crecimiento/proliferación tumoral, para inhibir metástasis, para prevenir una recaída (por ejemplo, después de cirugía, radioterapia, etc.), o como un componente de una terapia con múltiples modalidades.

Típicamente los miméticos/agonistas de p53 se administrarán en una cantidad suficiente para producir un efecto biológico (por ejemplo, para inhibir crecimiento y/o proliferación de células cancerígenas). La mayor eficiencia se espera encontrar en cánceres caracterizados por células p53 intactas.

V. Kits

Aún en otra realización, esta invención proporciona kits para examinar miméticos/agonistas de p53. Tales kits comprenden típicamente un contenedor que contiene una línea celular como la descrita en el presente documento.

En otras realizaciones, esta invención proporciona kits que promueven muerte celular en una célula p53 intacta. Estos kits comprenden típicamente un contenedor que contiene uno o más de los miméticos/agonistas de p53 de esta invención.

Los kits pueden incluir opcionalmente uno o más reagentes para su uso en los métodos de esta invención. Tales “reagentes” pueden incluir, aunque no se limitan a, células y/o líneas celulares, reagentes de transfección (por ejemplo, CaPO4, lipofectina), etiquetas detectables, medios para detectar etiquetas, tampones, anticuerpos antitransportadores, construcciones de ácido nucleico que codifican genes constitutivos, bioreactores, jeringuillas, y otros dispositivos.

Además, los kits pueden incluir materiales con instrucciones que contienen direcciones (es decir, protocolos) para la práctica de los métodos de esta invención. Ciertos materiales con instrucciones preferentes proporcionan protocolos que utilizan los contenidos del kit para examinar miméticos/agonistas de p53 o para promover muerte celular en células p53 intactas. Mientras los materiales con instrucciones comprenden típicamente materiales escritos o impresos no se limitan a tales. Esta invención contempla cualquier medio capaz de almacenar tales instrucciones y comunicarlas a un usuario final. Tales medios incluyen, aunque no se limitan a, medios electrónicos de almacenamiento (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM), y similares. Tales medios pueden incluir direcciones a sitios web que proporcionen tales materiales con instrucciones.

EJEMPLO 1

IDENTIFICACIÓN DE MIMÉTICOS DE P53

Para identificar miméticos de p53, desarrollamos un sistema celular de un mamífero vivo que informa sobre la promoción de la expresión de la proteína Bax pro-apóptica. El promotor bax cosiste en un 5’UTR de 372 nucleótidos, una secuencia TATAA, y varias secuencias de consenso que se enlazan con p53, dando como resultado un aumento de la expresión Bax (véase, por ejemplo, Figura 1). Al expresar estos sitios corriente arriba de la luciferasa que codifica el gen en células HEK293T, hemos establecido un conjunto nuevo de líneas celulares reporteras. Estas células proporcionan un sistema que permite la identificación de activadores directos de expresión Bax y sustituciones de una función apóptica de p53.

Descubrimiento de una Molécula Pequeña que Sustituye la Función p53

En estudios iniciales, la co-transfección de un plásmido de expresión p53 con un reportero que transportaba sitios de enlace de consenso oligomerizadas produjo células fuertemente luminiscentes, mientras que la cotransfección con un plásmido irrelevante no dio luminiscencia. Nuestro sistema muestra una señal lo suficientemente alta y un fondo suficientemente bajo para permitir que las pequeñas moléculas se aíslen de las bibliotecas de compuestos. Al emplear el sistema robótico con manejo líquido Multi-Probe II y el luminómetro ultrasensible Top-Count, en el Instituto Buck se han podido examinar cientos de compuestos a alta velocidad.

Hemos obtenido y examinado una biblioteca de moléculas pequeñas con 2.000 compuestos disponible en el Instituto Nacional de Cáncer en nuestro sistema reportero p53 en células HEK293T. Sorprendentemente, identificamos ocho compuestos que actuaron sobre el sistema reportero p53 y produjo aumentos en la expresión y actividad de luciferasa. Un compuesto (apodado Rp53-1 o G6) produjo niveles significativos de actividad de luciferasa, y en elevadas concentraciones (10 μM) indujo expresión de niveles de luciferasa superiores al tipo salvaje p53 transfectado (véase, por ejemplo, Figura 2B).

Agente Quimioterapéutico Rp53-1 se Dirige Específicamente a Neoplasia

Para evaluar la habilidad del compuesto Rp53-1 de molécula pequeña para imitar las funciones de transcripción-promoción de p53 que lleva a la expresión Bax y la inducción de muerte celular, las céulas humanas de cáncer de mama MDA-MB-535 mutadas con p53 y MCF-7 de tipo salvaje de p53 se trataron con Rp53-1. De manera interesante, solamente las primeras fueron sensibles a RP53-1 (Figura 3). Similarmente, otras líneas celulares de tumor mutantes p53 también fueron sensibles a Rp53-1 (colon: ColoHSR, SW480, HT29; próstata: PC-3, DU145; osteosarcoma: SAOS-2), mientras que las céulas de tipo salvaje de p53 fueron resistentes (colon: Lovo; próstata: LNCaP). La especificidad mostrada por RP53-1 en la inducción de muerte solamente en células mutantes p53 lo hace un candidato ideal para la utilización como una intervención terapéutica para tumores inactivos por p53 (o que funcionan mal por p53) (es decir, los tumores más clínicamente relevantes). La falta de toxicidad en células que generan actividad p53 normal (todas las otras células humanas) reduciría los posibles efectos secundarios.

Ya que p53 aumenta la expresión Bax mientras también reduce el Bcl-2 anti-apoptótico relacionado (teniendo así al menos dos efectos que llevan a la muerte celular), la identificación de moléculas pequeñas capaces de sustituir la actividad perdida de p53 al aumentar BAx, induciendo así la muerte celular de una manera independiente de p53 (es decir, induciendo muerte celular en ausencia de función p53 sustituyendo la actividad funcional de p53 por una molécula pequeña) puede permitir el descubrimiento de herramientas nuevas para controlar tanto Bax como Bcl-2 dentro de los tejidos. La importancia de estas moléculas fundamentales en neoplasia humana está apoyada por la alta frecuencia de mutaciones de p53, Bax y Bcl-2 en cánceres humanos.

Conclusión

El descubrimiento del primer imitador de p53, el compuesto activo Rp53-1, valida y muestra el potencial de la metodología resumida anteriormente. Los sistemas de cribado descritos en el presente documento aumentan nuestro potencial para hacer descubrimientos como Rp53-1, optimizar Rp53-1 para ensayos clínicos de humanos, y hacer posible una nueva técnica para erradicar cáncer de mama.

Ejemplo 2

Productos terapéuticos para Cáncer Usando Imitadores de p53 como Activadores de Expresión Bax

Las mutaciones p53 se asocian con un elevado porcentaje de todos los tumores humanos. Usando un nuevo cribado ultrarrápido de molécula pequeña desarrollado aquí, los científicos en la Unidad de Traslación de Descubrimiento (DTU) del Instituto Buck han descubierto el primer imitador funcional de p53 llamado G6. G6 y los productos terapéuticos relacionados pueden desarrollarse como agentes terapéuticos para cánceres que incluyen cáncer de mama, próstata, pulmón, colón y páncreas así como osteosarcoma.

Antecedentes

P53 es considerado como el “guardián del genoma”. Uno de los papeles de p53 es destinar genéticamente células anormales a muerte celular programada suprimiendo de este modo el crecimiento tumoral. Si p53 está ausente o mutado con una forma no funcional su papel clave como supresor tumoral se elimina, como se observa en muchos cánceres. La activación de p53 es a menudo necesaria para sensibilizar células tumorales para quimioterapia y radiación; la ausencia de la función de p53 se asocia a menudo con insensibilidad a estas terapias. Más de la mitad de todos los tumores humanos carecen de función apropiada de p53. De manera no sorprendente, se han estado buscando durante mucho tiempo métodos para restablecer la función de p53 como una estrategia anticáncer, aunque esto ha demostrado ser un problema abrumador.

Una función clave para p53 es regular la expresión de proteínas importantes para las decisiones de vida y muerte que las células toman cuando responden a situaciones adversas, neoplásticas, tales como mutaciones dañinas introducidas en ADN o aumentos injustificados en el índice de proliferación. La activación de p53 (mediante modificaciones tales como fosforilación (Figura 4, círculo)) da como resultado alteraciones en la expresión de tales proteínas como las parejas antagónicas Bax y Bcl2.

En condiciones neoplásticas, p53 aumenta la expresión de la proteína Bax pro-muerte, mientras que reduce la proteína Bcl2 anti-muerte (oncogénica). Además, el único activador endógeno conocido de expresión Bax es p53. Un tercio de todos los carcinomas humanos de mama avanzados demuestra una marcada reducción en expresión de Bax. El subgrupo de pacientes que manifiestan una expresión Bax reducida generalmente responde pobremente a terapia y muestra tumores que crecen rápidamente y una menor supervivencia media. Por estas y otras razones, hemos designado un cribado para compuestos de molécula pequeña que imitan el papel de p53 como un retardante de oncogénesis.

La tecnología

Se espera que el examen de compuestos de molécula pequeña que actúan como imitadores de p53 produzca productos terapéuticos para muchos cánceres. El descubrimiento del primer imitador funcional de p53, el compuesto activo G6 (véase, por ejemplo, Figuras 2A y 2B) valida y muestra el potencial y la metodología. Utilizando de un sistema nuevo de cribado ultrarrápido de célula viva hemos determinado que G6 (Figura 2A) remedia las actividades transcripcionales de p53 perdidas en neoplasia. Este compuesto “principal” presenta la oportunidad para la optimización de ensayo clínico humano en cánceres que son deficientes de p53 o que expresan p53 defectuoso. Claramente otras familias de compuestos pueden identificarse a través del mismo proceso de cribado.

Inherente al diseño inicial del fármaco hubo una estrategia para desarrollar una terapia que se dirige a p53 mutante que contiene células y que dejaría células sanas que expresan p53 normal no afectado (Figura 3). Al afirmar la validez de G6 como un compuesto principal, cada línea celular tumoral defectuosa de p53 tratada con G6 mostró susceptibilidad, mientras que las células de tipo salvaje del correspondiente tejido normal no se vieron afectadas, confirmando así la selectividad del fármaco (véase, por ejemplo, Tabla 1, y Figuras 8 y 9).

Tabla 1. Tipo salvaje (TS) p53 y células nulas son sensibles a G6

Estados de p53

Línea Celular: TS Mutante o Nula Sensibilidad a G6

Próstata

PC3: Nula ++

DU145: Mt ++

LNcap: TS -

Colon

ColoHSR: Mt ++++

SW480: Mt ++

Lovo: TS -

HT29: Mt ++

Mama

MDA-435: Mt +++

MCF-7: TS -

Osteosarcoma

Saos-2: Nula ++++

Pulmón

A549: TS -

H23: Mt +++

Riñón embriónico

293: TS -

Ya que G6 activa una secuencia celular inherente, un único pulso de G6 en el rango nanomolar es suficiente para activar la muerte celular (Figura 7). De este modo, G6 aparece como un tratamiento potente.

Los ensayos iniciales de G6 en ratones desnudos con xenoinjerto de osteosarcoma humano han mostrado promesas (Figura 10). Los ratones que tienen tumores anormales de p53 han respondido bien a G6. La regresión tumoral ha sido completa y ninguno de los ratones ha mostrado efectos secundarios adversos en respuesta al tratamiento con G6. Actualmente más estudios con ratones están en proceso.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un compuesto que promueve muerte celular en una célula p53 intacta, comprendiendo dicho compuesto la fórmula:

donde:

R1 y R4 se seleccionan independientemente del grupo consistente en un grupo amino, un grupo ciano, un grupo nitro, un grupo carboxilo, halo, hidroxilo, SO2, C1-6 alquilo, C1-6 haloalquilo, C1-8 alcoxil, C1-11 alcoxialquil, C1-6 alquilamino, C1-6 aminoalquilo;

R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo consistente en CH, N; R5 es CH2 u O; R6 se seleccionan independientemente del grupo consistente CN, NO2, alquilo C1-10 ramificado o no

ramificado saturado o no saturado, alcoxi C1-10 ramificado o no ramificado, acilo C1-10 ramificado o no ramificado, aciloxi C1-10 ramificado o no ramificado, alquitio C1-10 ramificado o no ramificado, aminosulfonilo, arilo, aroilo, ariloxi, arilsulfonilo, heteroarilo heteroariloxi;

R7 se seleccionan independientemente del grupo consistente en H, CN, NO2, alquilo C1-10 ramificado o no ramificado saturado o no saturado, alcoxi C1-10 ramificado o no ramificado, acilo C1-10 ramificado o no ramificado, aciloxi C1-10 ramificado o no ramificado, alquitio C1-10 ramificado o no ramificado, aminosulfonilo, arilo, aroilo, ariloxi, arilsulfonilo, heteroarilo heteroariloxi;

R8 se selecciona del grupo consistente NO2, OH, COOH; R9 se selecciona del grupo consistente en H, CH3;

o un éster o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos donde dicho compuesto está en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
2.

La composición de la reivindicación 1, donde R6 y R7 son ambos halógenos.
3.

La composición de la reivindicación 1, donde R1 y R4 son ambos amino.
4.

La composición de la reivindicación 1, donde R2 y R3 son ambos N.
5.

La composición de la reivindicación 1, donde R8 es NO2.
6.

La composición de la reivindicación 1, donde dicho compuesto tiene la fórmula:
7.

La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha composición se formula como una formulación de dosis de unidad.
8.

La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para su uso en un método para tratar cáncer.
9.

La composición de la reivindicación 8 para su uso en un método para tratar cáncer, donde dicho cáncer se selecciona del grupo consistente en cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, y cáncer de colon.