ES2397631T3 - Mutante antagonista de anticuerpos ANTI-CD40 - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para uso en un procedimiento de prevención o tratamiento de rechazo detrasplantes, enfermedades autoinmunes, alergia o inhibición del factor de coagulación sanguínea VIII, quecomprende un anticuerpo monoclonal como un principio activo, en la que el anticuerpo monoclonal consiste en doscadenas pesadas, cada una representada por una secuencia de aminoácidos que se extiende desde Q en laposición 27 a K en la posición 474 en SEC ID Nº 140 y dos cadenas ligeras, cada una representada por unasecuencia de aminoácidos que se extiende desde A en la posición 23 a C en la posición 235 en SEC ID Nº 142.

Description

Mutante antagonista de anticuerpo anti-CD40

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-CD40 que reconoce CD40 que es un tipo de molécula de membrana celular asociada con la inmunidad. Además, la presente invención se refiere a un anticuerpo con una mutación en la región constante del anticuerpo humano o con una subclase que tiene su parte sustituida para reducir una actividad ADCC y/o CDC, manteniendo a la vez una actividad antagonista.

Antecedentes de la técnica 1. CD40

CD40 es un antígeno que tiene un peso molecular de 50 kDa que está presente en la superficie de membrana celular, y se expresa en linfocitos B, células dendríticas (CD), algunos tipos de células cancerosas y células epiteliales tímicas. Se sabe que CD40 desempeña un papel importante en la proliferación y diferenciación de linfocitos B y CD. CD40 se identificó como un antígeno expresado en la superficie de linfocitos B humanos (E. A. Clark y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986; e I. Stamenkovic y col., EMBO J. 8: 1403, 1989) y se ha considerado un miembro de la familia del receptor de TNF que incluye receptores de NGF de baja afinidad, receptores de TNF, CD27, OX40 y CD30. Se han clonado recientemente ligados (CD40L) para CD40 humanos y murinos y se ha descubierto que son proteínas de membrana de tipo II y se expresan en linfocitos T CD4+ activados. También se ha descubierto que CD40L introduce fuertes señales para activación en linfocitos B humanos o murinos.

En células dendríticas, se ha observado que CD40 se expresa más que en linfocitos B, y se ha puesto de manifiesto que CD40 desempeña un papel importante en células dendríticas. La unión de CD40 con CD40L activa células presentadoras de antígenos (APC), es decir, expresa moléculas coestimuladoras tales como CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) o potencia la producción de IL-2 (Caux, C., y col.: Activation of human dendritic cells through CD40 crosslinking. J. Exp. Med., 180: 1263, 1994; y Shu, U., y col.: Activated T cells induce interleukin-12 production by monocyte via CD40 - CD40 ligand interaction. Eur. J. Immunol., 25: 1125, 1995). Las células dendríticas tienen una fuerte capacidad presentadora de antígenos y una fuerte capacidad para activar linfocitos T auxiliares (Th). También se cree que las células dendríticas controlan la diferenciación de linfocitos Th vírgenes en linfocitos Th1 o Th2. Cuando se cultivan monocitos de sangre periférica, que son células dendríticas mieloides, en presencia de GM-CSF e IL-4, y se maduran por CD40L, las células dendríticas maduradas resultantes (DC1) pueden producir IL-12 in vitro, y estimular y activar linfocitos Th vírgenes alogénicos para inducir linfocitos T productores de IFNy (es decir, para promover su diferenciación a Th1). Esta acción se inhibe por anticuerpo anti-IL12 y por lo tanto puede efectuarse mediante IL-12. Por otro lado, cuando se cultivan linfocitos T plasmacitoides, que están presentes en regiones T linfoides y sangre periférica, en presencia de IL-3 y ligando de CD40, se muestra que las células dendríticas linfoides resultantes (DC2) son incapaces de producir IL-12, y estimulan y activan linfocitos Th vírgenes alogénicos para inducir linfocitos T productores de IL-4, lo que indica promoción de su diferenciación a Th2. Se cree que los linfocitos Th1 están implicados en la activación de inmunidad celular, mientras que los linfocitos Th2 están asociados con potenciación de la inmunidad humoral así como restricción de inmunidad celular. Cuando se activan linfocitos T citotóxicos (CTL) con la ayuda de linfocitos Th1, pueden eliminar patógenos (varios tipos de virus, listeria, bacterias de la tuberculosis, protozoos de toxoplasma, etc.) que crecen en el citoplasma y células tumorales.

Se ha demostrado que los anticuerpos anti-CD40 monoclonales, que reconocen CD40 expresado en la superficie de membrana, tienen diferentes actividades biológicas que los linfocitos B. Los anticuerpos anti-CD40 monoclonales se clasifican en general en anticuerpos agonistas y antagonistas frente a la interacción entre CD40 y CD40L.

2. Anticuerpos agonistas

Se sabe que los anticuerpos agonistas activan linfocitos B. Por ejemplo, se ha indicado que los anticuerpos anti-CD40 inducen adhesión celular (Barrett y col., J. Immunol. 146: 1722, 1991; y Gordon y col., J. Immunol. 140: 1425, 1998), aumentan el tamaño celular (Gordon y col., J. Immunol. 140: 1425, 1998; y Valle y col., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989), inducen la división celular de linfocitos B activados solamente por un anticuerpo anti-IgM, anticuerpo anti-CD20 o éster de forbol (Clark y Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986; Gordon y col., LEUCOCYTE TYPING III. A. J. McMicheal ed. Oxford University Press. Oxford. p.426; y Paulie y col., J. Immunol.

142: 590, 1989), inducen la división celular de linfocitos B en presencia de IL4 (Valle y col., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989; y Gordon y col., Eur. J. Immunol. 17: 1535, 1987), inducen la expresión de IgE por células cultivadas estimuladas con IL-4 y privadas de linfocitos T (Jabara y col., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990; y Gascan y col., J. Immunol. 147: 8, 1991), inducen la expresión de IgG e IgM por las células cultivadas (Gascan y col., J. Immunol.

147: 8, 1991), secretan FceRII/CD23 soluble a partir de células mediante IL-4 (Gordon y Guy, Immunol. Today 8: 39, 1987; y Cairns y col., Eur. J. Immunol. 18: 349, 1988), potencian la expresión de FceRII/CD23 soluble en las células mediante IL4 (Challa, A., Allergy, 54: 576, 1999), y promueven la producción de IL-6 (Clark y Shu, J. Immunol. 145: 1400, 1990). Además, se ha indicado que la adición de IL-4 y un anticuerpo anti-CD40 a linfocitos B de cultivo primario humanos en presencia de células adhesivas CDw32 + condujo al establecimiento de linfocitos B clonados derivados de las mismas (Bancherauet y col., Science 241: 70, 1991), y se inhibió la apoptosis de células de centro germinal a través de CD40 independientemente de si su receptor de antígenos estaba activo o inactivo (Liu y col., Nature 342: 929, 1989). Como se ha descrito anteriormente, se ha identificado CD40 como antígeno expresado en la superficie de linfocitos B humanos y, en consecuencia, se ha evaluado la mayoría de los anticuerpos aislados, como un índice, principalmente usando su potencia e inducción para proliferación y/o diferenciación de linfocitos B humanos, o su actividad de inducción para muerte celular de células cancerosas (Katira, A. y col., LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, y col. eds. p.547. Oxford University Press. Oxford; W. C. Flansow y col., LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, y col. eds. p. 555. Oxford University Press. Oxford; y J. D. Pound y col., International Immunology, 11: 11, 1999).

Se ha demostrado que el anticuerpo anti-CD40 madura DC (Z. H. Zhou y col., Hybridoma, 18: 471, 1999). Además, se ha indicado que el papel de los linfocitos T CD4 en la sensibilización de linfocitos T CD8 específicos de antígeno está en la activación de DC mediante señalización CD40-CD40L, y se ha descubierto que el anticuerpo monoclonal anti-CD40 (mAb) es capaz de reemplazar linfocitos T auxiliares CD40 en la activación de células dendríticas (DC) (Shoenberger, S. P., y col.: T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40 - CD40L interactions. Nature, 480, 1998). Además, se ha descubierto que la administración de un anticuerpo anti-CD40 en ratones es capaz de proteger el cuerpo del animal de células tumorales que expresan CD40 así como células tumorales que no expresan CD40 (French, R. R., y col.: CD40 antibody evokes a cytotoxic T-cell response that eradicates lymphoma and bypasses T-cell help. Nature Medicine, 5, 1999).

Se espera que los anticuerpos anti-CD40 agonistas sean eficaces para el tratamiento de enfermedades infecciosas, debido a bacterias, virus, etc., cáncer y otras, basándose en sus funciones descritas anteriormente. Se describen anticuerpos anti-CD40 con actividades agonistas superiores en el documento WO 02/088186. Los ejemplos representativos de estos anticuerpos agonistas son anticuerpos KM341-1-19 y 2105. El hibridoma KM341-1-19 que produce el anticuerpo KM341-1-19 y el hibridoma 2105 que produce el anticuerpo 2105 se presentaron el 27 de Septiembre de 2001 y 17 de Abril de 2002, respectivamente, para su depósito internacional según el Tratado de Budapest, al Depositario de Organismos de Patente Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (central 6, 1-1, Higashi 1, Tsukuba, Ibaraki, Japón). Sus números de acceso son FERM BP7759 (KM341-1-19) y FERM BP-8024 (2105).

3. Anticuerpos antagonistas

Tomando en consideración, por otro lado, que CD40 desempeña un papel importante en respuestas inmunológicas, como se ha mencionado anteriormente, se espera que la inhibición de unión de CD40 con sus ligandos conduzca al desarrollo de agentes terapéuticos para supresión inmune en trasplante de órganos y enfermedades autoinmunes. Sawada, Hase y otros han indicado que la sangre periférica de pacientes que padecen enfermedad de Crohn tiene un mayor porcentaje de monocitos que expresan alta cantidad de CD40. Sin embargo, aún no se conoce bien que tales anticuerpos inhiban la unión de CD40 con sus ligados. Esos anticuerpos inhibidores serían útiles en el análisis funcional de CD40 y tratamiento de enfermedades que requieran la activación de CD40. También se ha sugerido que los anticuerpos inhibidores de ligandos de CD40 son eficaces frente a enfermedades que implican unión de CD40 con los ligandos de CD40. Sin embargo, se indicó que CD40L se expresa en plaquetas activadas (V. Henn y col., Nature 391: 591, 1998), y se ha indicado que, si se usa un anticuerpo anti-CD40L como un agente terapéutico, puede producirse formación de trombos (T. Kawai y col., Nat. Med. 6: 114, 2000). Desde este punto de vista, se espera que los anticuerpos para CD40 sean más seguros que anticuerpos anti-CD40L como agente de anticuerpo terapéutico para inhibir la unión de CD40 con sus ligandos. Se requeriría que los anticuerpos anti-CD40 inhibieran la unión de CD40L con CD40 y no activen aún CD40 por si solos.

Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 de este tipo pueden usarse para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y supresión de rechazos inmunológicos en trasplante de órganos, médula ósea, etc., a la vista de sus funciones descritas anteriormente. Se describen anticuerpos anti-CD40 con actividades antagonistas superiores en el documento WO 02/088186. El ejemplo representativo de estos anticuerpos antagonistas es el anticuerpo 4D11. El hibridoma 4D11 que produce el anticuerpo 4D11 se presentó el 27 de Septiembre de 2001 para depósito internacional según el Tratado de Budapest, al Depositario de Organismos de Patente Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (central 6, 1-1, Higashi 1, Tsukuba, Ibaraki, Japón). El número de acceso es FERM BP-7758.

Documento de Patente 1 WO 02/088186

Divulgación de la invención

El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones y cualquier información que no quede dentro de las reivindicaciones se proporciona solamente para informar.

La invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento de prevención o tratamiento de rechazo de trasplantes, enfermedades autoinmunes, alergia o inhibición del factor de coagulación sanguínea VIII, que comprende un anticuerpo monoclonal como principio activo, en el que el anticuerpo monoclonal consiste en dos cadenas pesadas, representada cada una por una secuencia de aminoácidos que se extiende desde Q en la posición 27 a K en la posición 474 en SEC ID Nº: 140 y dos cadenas ligeras, cada una representada

por una secuencia de aminoácidos que se extiende desde A en la posición 23 a C en la posición 235 en SEC ID Nº:

142.

La invención proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal para producción de una composición farmacéutica para prevención o tratamiento de rechazo de trasplantes, enfermedades autoinmunes, alergia o inhibición del factor de coagulación sanguínea VIII, en la que el anticuerpo monoclonal consiste en dos cadenas pesadas, cada una representada por una secuencia de aminoácidos que se extiende desde Q en la posición 27 a K en la posición 474 en SEC ID Nº: 140 y dos cadenas ligeras, cada una representada por una secuencia de aminoácidos que se extiende desde A en la posición 23 a C en la posición 235 en SEC ID Nº: 142.

El objetivo de la presente divulgación es crear mutantes a partir de los anticuerpos anti-CD40 potencialmente terapéuticos desvelados en el documento WO 02/088186, diseñándose dichos mutantes de forma óptima como agente farmacéutico.

Como resultado de investigación exhaustiva e intensiva, los presentes inventores han creado de forma exitosa nuevos mutantes de los anticuerpos agonistas o antagonistas, pudiendo tener dichos mutantes un efecto terapéutico mayor frente a enfermedades que anticuerpos anti-CD40 conocidos.

La idea básica de la modificación de los anticuerpos anti-CD40 de acuerdo con la presente divulgación se describirá en detalle posteriormente.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A-1 muestra péptidos de sitio de unión preparados basándose en la secuencia de CD40, con los que se unen anticuerpos agonistas anti-CD40; La Figura 1A-2 muestra péptidos de sitio de unión preparados basándose en la secuencia de CD40, con los que se unen anticuerpos agonistas anti-CD40 (una continuación de la Figura 1A-1); La Figura 1B-1 muestra péptidos de sitio de unión preparados basándose en la secuencia de CD40, con los que se unen anticuerpos antagonistas anti-CD40; La Figura 1B-2 muestra péptidos de sitio de unión preparados basándose en la secuencia de CD40, con los que se unen anticuerpos antagonistas anti-CD40 (una continuación de la Figura 1B-1); La Figura 2A ilustra la unión de los anticuerpos anti-CD40 con el mutante de CD40; La Figura 2B ilustra la unión de los anticuerpos anti-CD40 con el mutante de CD40; La Figura 2C ilustra la unión de los anticuerpos anti-CD40 con el mutante de CD40; La Figura 3A muestra diagramas que indican que el anticuerpo KM341-1-19 que tiene una mutación P331S está tan activo como el anticuerpo KM341-1-19 original, con respecto a unión con células Ramos; La Figura 3B muestra diagramas que indican que el anticuerpo KM341-1-19 que tiene una mutación P331S está tan activo como el anticuerpo original KM341-1-19, con respecto a potenciación de la expresión de CD95 de células Ramos; La Figura 4A muestra un diagrama que indica que el anticuerpo KM341-1-19 que tiene una mutación P331S tiene una actividad CDC menor mediante el complemento de conejo; La Figura 4B muestra un diagrama que indica que el anticuerpo G2/4 tiene una actividad de complemento menor cuando se usa el complemento humano; La Figura 5A-1 muestra diagramas que indican que la conversión de la subclase del anticuerpo 2105 de IgG2 a diferentes subclases no tiene efecto en su unión con células Ramos; La Figura 5A-2 muestra diagramas que indican que la conversión de la subclase del anticuerpo KM341-1-19 de IgG2 a diferentes subclases no tiene efecto en su unión a células Ramos; La Figura 5B-1 muestra diagramas que indican que la conversión de la subclase del anticuerpo 2105 de IgG2 a diferentes subclases reduce una actividad para potenciar la expresión de CD95 de células Ramos; La Figura 5B-2 muestra diagramas que indican que la conversión de la subclase del anticuerpo KM341-1-19 de IgG2 a diferentes subclases reduce una actividad para potenciar la expresión de CD95 de células Ramos; La Figura 6A-1 muestra diagramas que indican que la capacidad de unión de los anticuerpos KM341-1-19 con células Ramos es independiente de la estructura variable de la región bisagra; La Figura 6A-2 muestra diagramas que indican que la capacidad de unión de los anticuerpos 2105 con células Ramos es independiente de la estructura variable de la región bisagra; La Figura 6B-1 muestra diagramas que indican que las bisagras superior y media de la región bisagra son importantes para la actividad de los anticuerpos KM341-1-19 para potenciar la expresión de CD95 de células Ramos; La Figura 6B-2 muestra diagramas que indican que las bisagras superior y media de la región bisagra son importantes para la actividad de los anticuerpos 2105 para potenciar la expresión de CD95 de células Ramos; La Figura 7A muestra diagramas que indican que la conversión de la subclase del anticuerpo F72 a IgG2 no tiene efecto en su unión con células Ramos; La Figura 7B muestra diagramas que indican que la conversión de la subclase del anticuerpo F72 a IgG2 induce una actividad para potenciar la expresión de CD95 de células Ramos; La Figura 8A muestra diagramas que indican que la conversión de la subclase del anticuerpo 4D11 de IgG1

a IgG4 no tiene efecto en su unión con células Ramos; La Figura 8B muestra diagramas que indican que la conversión de la subclase del anticuerpo 4D11 de IgG1 a IgG4 inhibe la potenciación por el ligando de CD40 de la expresión de CD95 de células Ramos, en el mismo grado que de otro modo; La Figura 9 muestra un diagrama que indica que la conversión de la subclase del anticuerpo 4D11 de IgG1 a IgG4 o IgG4PE reduce la actividad CDC; La Figura 10 muestra un diagrama que indica que la conversión de la subclase del anticuerpo 4D11 de IgG1 a IgG4P reduce la actividad CDC; La Figura 11 ilustra una variación del número de linfocitos B en sangre (células positivas para B220 entre los linfocitos de sangre periférica) a lo largo del tiempo después de que se administrara 4D11G1, 4D11G4P

o 4D11G4PE a ratones transgénicos de CD40; La Figura 12A ilustra una mayor expresión de CD23 de linfocitos B esplénicos (células positivas para CD23 entre los linfocitos B esplénicos) después de que se administrara cada anticuerpo anti-CD40 a ratones transgénicos de CD40 humano; La Figura 12B ilustra una mayor expresión de CD86 de linfocitos B esplénicos (células positivas para CD86 entre los linfocitos B esplénicos) después de que se administrara cada anticuerpo anti-CD40 a ratones transgénicos de CD40 humano; La Figura 12C ilustra una mayor expresión de CD95 de linfocitos B esplénicos (células positivas para CD95 entre los linfocitos B esplénicos) después de que se administrara cada anticuerpo anti-CD40 a ratones transgénicos de CD40 humano; La Figura 13A ilustra la actividad supresora de la producción de anticuerpos específicos de antígeno (IgG1) por 4D11 y 281-1-10 en ratones transgénicos de CD40 humano; La Figura 13B ilustra la actividad supresora de la producción de anticuerpos específicos de antígeno (IgM) por 4D11 y 281-1-10 en ratones transgénicos de CD40 humano; La Figura 14A ilustra los números de linfocitos B en la sangre (células positivas para B220 entre los linfocitos de sangre periférica) durante el ensayo de supresión de la actividad productora de anticuerpos específicos de antígeno; La Figura 14B ilustra los números de linfocitos B esplénicos (células positivas para B220 entre los linfocitos esplénicos) durante el ensayo de supresión de la actividad productora de anticuerpos específicos de antígeno; La Figura 15 ilustra una variación del número de linfocitos B en la sangre (células positivas para B220 entre los linfocitos de sangre periférica) a lo largo del tiempo después de que se administrara 4D11G4P o 4D11G4PE a una dosis de 30 mg/kg en monos cinomolgus; La Figura 16 ilustra los niveles de IL-12 en sangre durante el ensayo mostrado en la Figura 15; La Figura 17 muestra el efecto supresor de 4D11G4PE en la DTH de simio (hipersensibilidad de tipo retardado en monos cinomolgus macho); La Figura 18 muestra los títulos de la IgG antitoxina del tétanos durante el ensayo con los resultados mostrados en la Figura 17; La Figura 19 muestra los títulos de la IgM antitoxina del tétanos durante el ensayo con los resultados mostrados en la Figura 17; La Figura 20A ilustra las influencias respectivas de 4D11G4PE y 5C8 (anticuerpo anti-ligando de CD40) en la agregación plaquetaria; La Figura 20B muestra las influencias respectivas de 4D11G4PE y 5C8 (anticuerpo anti-ligando de CD40) en la agregación plaquetaria; La Figura 21 ilustra una variación del contenido oligomérico de 4D11G4P, 4D1104PE, 4D11G2Ser o 4D11G4/2/4 a lo largo del tiempo después de que se incubara a pH 2,7 y 37 ºC; La Figura 22 ilustra la supresión del rechazo de injertos de piel por el anticuerpo antagonista anti-CD40; La Figura 23 ilustra el cambio de volumen del tumor a lo largo del tiempo desde la implantación celular, en un caso en el que se administró 341G2Ser a ratones que portaban tumores con células Ramos implantadas en los mismos; La Figura 24 ilustra el cambio de volumen del tumor a lo largo del tiempo desde la implantación celular, en un caso en el que se administró 341G2Ser a ratones que portaban tumores con células T24 implantadas en los mismos; La Figura 25 ilustra el cambio de volumen del tumor a lo largo del tiempo desde la implantación celular, en un caso en el que se administró 341G2Ser a ratones que portaban tumores con células Hs 766T implantadas en los mismos; y La Figura 26 ilustra el cambio de volumen del tumor a lo largo del tiempo desde la implantación celular, en un caso en el que se administró 341G2Ser a ratones que portaban tumores con células Capan-2 implantadas en los mismos;

Mejor modo para llevar a cabo la presente divulgación.

1. Modificación de anticuerpos agonistas

Los anticuerpos son esencialmente moléculas que actúan para proteger cuerpos vivos frente a cuerpos extraños, tales como microorganismos y virus, y cáncer, y por lo tanto pueden destruir y eliminar tales células uniéndose a los mismos. La actividad letal está compuesta de dos actividades diferentes, denominadas Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpo (abreviada como ADCC en lo sucesivo en el presente documento) y Citotoxicidad Dependiente de Complemento (abreviada como CDC en lo sucesivo en el presente documento).

ADCC se refiere a un tipo de citotoxicidad inducida por activación de macrófagos, linfocitos NK, células neutrófilas, etc., que reconocen células diana uniéndose a la región constante del anticuerpo mediante receptores de Fc expresados en su superficie. Por el contrario, CDC se refiere a un tipo de citotoxicidad inducida por activación de un sistema de complemento que aparece a través de unión de un anticuerpo con un antígeno. Se sabe que estas actividades varían dependiendo de una subclase del anticuerpo, lo que se ha descubierto que se debe a una diferencia estructural en la región constante de los anticuerpos (Charles A. Janeway y col., Immunology, 1997, Current Biology Ltd./Garland Publishing Inc.).

Serán más preferibles como agentes terapéuticos anticuerpos agonistas anti-CD40 si no tienen las actividades de ADCC y/o CDC que pueden inducir muerte celular de células que expresan CD40, con respecto a mecanismo de acción inmunoactiva. Si las células que expresan CD40 se dañan por actividades ADCC y/o CDC, puede producirse inmunosupresión en lugar de la inmunoactivación deseada, dando como resultado el empeoramiento de la enfermedad. Además, los pacientes que padecen enfermedades infecciosas pueden tener actividades ADCC y/o CDC mayores. Por lo tanto, cuando se aplican tales anticuerpos a enfermedades infecciosas, es necesario evaluarlos con respecto a seguridad más cuidadosamente, por ejemplo, usando más complementos de conejo activos que los presentes en suero humano sano o sangre periférica lo que no podría ser eficaz para detectar las actividades anteriores en esta situación. En consecuencia, se crearon mutantes y recombinantes que no tenían actividad de ADCC o CDC y se examinaron con respecto a su actividad.

Puesto que se sabe que las actividades ADCC y/o CDC varían dependiendo de una subclase del anticuerpo de interés, la conversión de la subclase puede reducir las actividades ADCC y/o CDC. Para las subclases de IgG humana, por ejemplo, se sabe en general que IgG4 es una subclase con actividades bajas tanto de ADCC como de CDC y se ha indicado que IgG2 es activa para CDC pero escasamente activa para ADCC, mientras que IgG1 es altamente activa tanto en ADCC como en CDC (Charles A. Janeway y col., Immunology, 1997, Current Biology Ltd./Garland Publishing Inc.). La selección de una subclase particular aprovechando las características anteriores puede crear un anticuerpo menos citotóxico a partir del anticuerpo original. Una combinación de una subclase específica de anticuerpo con dicha mutación puntual como se describe posteriormente puede crear un anticuerpo con una actividad deseada. Además, se ha indicado que se obtiene reducción de las actividades ADCC y/o CDC de un anticuerpo por incorporación de una mutación a su región constante. Por ejemplo, L235, D265, D270, K322, P331 y P329 (cada letra alfabética indica un aminoácido por la notación de una letra, y cada número indica un índice EU propuesto por Kabat y col. (Kabat y col., Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 Quinta edición); dichos símbolos se usarán en lo sucesivo en el presente documento) pueden desempeñar un papel importante en la activación del complemento por IgG humana, y la sustitución de uno de esos sitios por otro aminoácido puede reducir la actividad CDC. Esohe E. Idusogie y col. J. Immunol. 2000, 164: 4178-4184, Yuanyuan Xu y col. J. Biol. Chem. 1994, 269: 3469-3474, Brekke, O. H. y col. Eur. J. Immunol. 1994, 24: 2542, Morgan, A., y col., Immunology 1995, 86: 319, Lund, J., y col., J. Immunol., 1996, 157: 4963, Tao, M. H., y col., J. Exp. Med. 1993, 178: 661). Específicamente, la sustitución de D270, K322, P329, o P331 por A puede reducir la actividad CDC. La sustitución de P331 por S o G también puede inducir lo mismo.

Se cree que Glu233-Ser239, Gly316-Lys338, Lys274-Arg301, Tyr407-Arg416, Asn297, Glu318, Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299 y Ala327-Ile332 toman parte en la unión de IgG con FcR (Duncan, A. R, Woof, J. M., Partridge, L. J., Burton, D. R, y Winter, G. (1988) Nature 332, 563-564, Gessner, J. E., Heiken, H., Tamm, A., y Schmidt, R. E. (1998) Ann. Hematol. 76, 231-248, Gavin, A., Hulett, M, y Hogarth, P. M. (1998) in The Immunoglobulin Receptors and Their Physiological and Pathological Roles in Immunity (van de Winkel, J. G. J., y Hogarth,

P. M., eds), pp. 11-35, Kluwer Academic Publishers Group, Dordrecht, The Netherlands, Sautes, C. (1997) in Cellmediated Effects of Immunoglobulins (Fridman, W. H., y Sautes, C., eds), pp. 29-66, R. G. Landes Co., Austin, TX, Da’ron, M (1997) Annu. Rev. Immunol. 15, 203-234, Canfield, S. M, y Morrison, S. L. (1991) J. Exp. Med. 173, 14831491, Chappel, M. S., Isenman, D. E., Everett, M., Xu, Y.-Y., Dorrington, K. J., y Klein, M. H. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 9036-9040, Woof, J. M., Partridge, L. J., Jefferis, R, y Burton, D. R (1986) Mol. Immunol. 23, 319-330, Wines, B. D., Powell, M. S., Parren, P. W. H. I., Barnes, N., y Hogarth, P. M. (2000) J. Imunol. 164, 5313-5318), y por lo tanto la incorporación de una mutación en una de estas regiones puede reducir la actividad ADCC. Específicamente, la sustitución de L235 por E o G237 por A puede reducir la unión de IgG con FcR.

El anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación tiene al menos una mutación de aminoácidos para reducir las actividades ADCC y/o CDC, preferentemente 1-20, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, o 1 o 2 mutaciones. La presente divulgación ha revelado que en algunos anticuerpos anti-CD40, la región bisagra de IgG2 es importante en la expresión de sus actividades agonistas fuertes. Se espera que el reemplazo de la región variable o la región constante excepto la región bisagra por un homólogo de cualquier subclase diferente, o incorporación de una mutación puntual en la misma no solamente module las actividades ADCC y/o CDC, sino que aumenta la productividad del anticuerpo, su estabilidad durante la purificación y almacenamiento, y su cinética en sangre.

Para producir un fármaco de anticuerpo, la estabilidad del anticuerpo durante la purificación y el almacenamiento es muy importante. Puesto que los anticuerpos desarrollados hasta la fecha pertenecen principalmente a la subclase IgG1, la conversión de la región variable o la región constante excepto la región bisagra en una secuencia derivada de la subclase IgG1 también será eficaz para mejorar las propiedades físicas de los anticuerpos agonistas anti-CD40 descritos anteriormente.

Se describen en el presente documento mutantes de anticuerpos agonistas anti-CD40 y otros como sigue:

[1] Una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal que tiene una actividad agonista, que se une a CD40, en el que la cadena pesada comprende una bisagra superior y una bisagra media derivada de una IgG2 humana, y una región constante con al menos un aminoácido suprimido o sustituido, o con al menos un aminoácido añadido al mismo, siendo dicha deleción, sustitución o adición capaz de aumentar o reducir ADCC y/o CDC.

[2] La cadena pesada de acuerdo con [1], en la que la región constante deriva de una IgG humana.

[3] La cadena pesada de acuerdo con [2], en la que la IgG humana es una IgG1 humana.

[4] La cadena pesada de acuerdo con [2], en la que la IgG humana es una IgG2 humana.

[5] La cadena pesada de acuerdo con [2], en la que la IgG humana es una IgG3 humana.

[6] La cadena pesada de acuerdo con [2], en la que la IgG humana es una IgG4 humana.

[7] La cadena pesada de acuerdo con cualquiera de [3] a [5], en la que dicha sustitución de aminoácidos en la región constante es sustitución de prolina con serina en la posición 331, que se indica por el índice de EU como en Kabat y col.

[8] Un anticuerpo monoclonal que comprende la cadena pesada de acuerdo con cualquiera de [1] a [7].

[9] La cadena pesada de acuerdo con cualquiera de [1] a [7], en la que la cadena pesada comprende una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma KM341-119 (Nº de Acceso FERM BP-7759).

[10] Un anticuerpo monoclonal que consiste en la cadena pesada de acuerdo con [9] y una cadena ligera que comprende una región variable de una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma KM341-1-19 (Nº de Acceso FERM BP-7759).

[11] La cadena pesada de acuerdo con cualquiera de [1] a [7], en la que la cadena pesada comprende una región variable del polipéptido representado por SEC ID Nº: 38.

[12] Un anticuerpo monoclonal que consiste en la cadena pesada de acuerdo con [11] y una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal en el que la cadena ligera comprende una región variable del polipéptido representado por SEC ID Nº: 40.

[13] La cadena pesada de acuerdo con [1], en la que la cadena pesada consiste en una parte restante proporcionada retirando la secuencia señal del polipéptido representado por SEC ID Nº: 132.

[14] Un anticuerpo monoclonal que consiste en la cadena pesada de acuerdo con [13] y una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal, en el que la cadena ligera consiste en una parte restante proporcionada retirando la secuencia señal del polipéptido representado por SEC ID Nº: 134.

[15] La cadena pesada de acuerdo con [1], en la que la cadena pesada se produce por un huésped que comprende un vector de expresión que tiene el polinucleótido representado por SEC ID Nº: 131.

[16] El anticuerpo monoclonal de acuerdo con [8], en el que el anticuerpo monoclonal se produce por un huésped que comprende un vector de expresión que tiene el polinucleótido representado por SEC ID Nº: 131 y el polinucleótido representado por SEC ID Nº: 133.

[17] La cadena pesada de acuerdo con cualquiera de [1] a [7], en la que la cadena pesada comprende una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 2105 (Nº de Acceso FERM BP-8024).

[18] Un anticuerpo monoclonal que consiste en la cadena pesada de acuerdo con [17] y una cadena ligera que comprende una región variable de una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 2105 (Nº de Acceso FERM BP-8024).

[19] La cadena pesada de acuerdo con cualquiera de [1] a [7], en la que la cadena pesada comprende una región variable del polipéptido representado por SEC ID Nº: 42.

[20] Un anticuerpo monoclonal que consiste en la cadena pesada de acuerdo con [19] y una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal, en el que la cadena ligera comprende una región variable del polipéptido representado por SEC ID Nº: 44.

[21] La cadena pesada de acuerdo con [1], en la que la cadena pesada consiste en una parte restante proporcionada retirando la secuencia señal del polipéptido representado por SEC ID Nº: 136.

[22] Un anticuerpo monoclonal que consiste en la cadena pesada de acuerdo con [21] y una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal, en el que la cadena ligera consiste en una parte restante proporcionada retirando la secuencia señal del polipéptido representado por SEC ID Nº: 138.

[23] La cadena pesada de acuerdo con [1], en la que la cadena pesada se produce por un huésped que comprende un vector de expresión que tiene el polinucleótido representado por SEC ID Nº: 135.

[24] El anticuerpo monoclonal de acuerdo con [8], en el que el anticuerpo monoclonal se produce por un huésped que comprende un vector de expresión que tiene el polinucleótido representado por SEC ID Nº: 135 y el polinucleótido representado por SEC ID Nº: 137.

[25] Un polinucleótido representado por SEC ID Nº: 131.

[26] Un polinucleótido representado por SEC ID Nº: 133.

[27] Un vector de expresión que tiene el polinucleótido de acuerdo con [25].

[28] Un vector de expresión que tiene el polinucleótido de acuerdo con [26].

[29] Un vector de expresión que tiene los polinucleótidos de acuerdo con [25] y [26].

[30] Un huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con [27].

[31] Un huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con [28].

[32] Un huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con [29].

[33] Un procedimiento para producir una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal, que comprende las etapas de: cultivar el huésped de acuerdo con [30] en un medio de cultivo; y obtener una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal del cultivo y/o el huésped.

[34] Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal, que comprende las etapas de: cultivar el huésped de acuerdo con [32] en un medio de cultivo; y obtener un anticuerpo monoclonal del cultivo y/o del huésped.

[35] Un polinucleótido representado por SEC ID Nº: 135.

[36] Un polinucleótido representado por SEC ID Nº: 137.

[37] Un vector de expresión que tiene el polinucleótido de acuerdo con [35].

[38] Un vector de expresión que tiene el polinucleótido de acuerdo con [36].

[39] Un vector de expresión que tiene los polinucleótidos de acuerdo con [35] and [36].

[40] Un huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con [37].

[41] Un huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con [38].

[42] Un huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con [39].

[43] Un procedimiento para producir una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal, que comprende las etapas de: cultivar el huésped de acuerdo con [40] en un medio de cultivo; y obtener una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal del cultivo y/o el huésped.

[44] Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal, que comprende las etapas de: cultivar el huésped de acuerdo con [42] en un medio de cultivo; y obtener un anticuerpo monoclonal del cultivo y/o el huésped.

[45] Un procedimiento para producir una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal que tenga una actividad agonista capaz de unirse a CD40, que comprende la etapa de sustituir la bisagra superior y la bisagra media de un anticuerpo, que no es una bisagra superior o una bisagra media derivada de una IgG2 humana, con una bisagra superior y una bisagra media derivadas de una IgG2 humana, respectivamente.

[46] Un procedimiento para producir una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable, y una bisagra superior y una bisagra media derivadas de una IgG2 humana, que comprende la etapa de identificar un polipéptido que forma la región variable, que es de una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a CD40.

[47] Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal que tenga una actividad agonista capaz de unirse a CD40, que comprende la etapa de sustituir la bisagra superior y la bisagra media de un anticuerpo, que no es una bisagra superior o una bisagra media derivada de una IgG2 humana, con una bisagra superior y una bisagra media derivadas de una IgG2 humana, respectivamente.

[48] Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable, y una bisagra superior y una bisagra media derivadas de una IgG2 humana, que comprende la etapa de identificar un polipéptido que forma la región variable, que es de una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a CD40.

[49] Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal de acuerdo con [8], [10], [12], [14], [16], [18], [20], [22] o [24] como un principio activo.

[50] La composición farmacéutica de acuerdo con [49] usada para prevención o tratamiento de un tumor maligno, un patógeno o una enfermedad autoinmune.

[51] Un procedimiento de prevención o tratamiento de un tumor maligno, un patógeno o una enfermedad autoinmune, que comprende administración de la composición farmacéutica de acuerdo con [49] a un mamífero.

[52] Uso del anticuerpo monoclonal de acuerdo con [8], [10], [12], [14], [16], [18], [20], [22] o [24] para producción de una composición farmacéutica usada para prevención o tratamiento de un tumor maligno, un patógeno o una enfermedad autoinmune.

[89] Un polinucleótido proporcionado retirando la parte que codifica la secuencia señal del polinucleótido representado por SEC ID Nº: 131.

[90] Un polinucleótido proporcionado retirando la parte que codifica la secuencia señal del polinucleótido representado por SEC ID Nº: 133.

[91] Un polinucleótido proporcionado retirando la parte que codifica la secuencia señal del polinucleótido representado por SEC ID Nº: 135.

[92] Un polinucleótido proporcionado retirando la parte que codifica la secuencia señal del polinucleótido representado por SEC ID Nº: 137.

Se describe en el presente documento un anticuerpo producido por modificación de un anticuerpo agonista anti-CD40 que pertenece a la IgG2 humana, en el que el anticuerpo modificado es un mutante que tiene la región constante, exclusiva de las bisagras superior y media, sustituida con una secuencia derivada de una subclase diferente. La subclase es preferentemente IgG1. Se describe en el presente documento un anticuerpo producido por modificación de un anticuerpo agonista anti-CD40 que pertenece a la IgG2 humana, en el que el anticuerpo modificado es un mutante que tiene la región constante, exclusiva de la región bisagra, sustituida con una secuencia derivada de una subclase diferente. La subclase es preferentemente IgG1.

En el presente documento, la reducción de las actividades ADCC y CDC significa reducción de esas actividades en comparación con las actividades correspondientes de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 distinto de los mutantes descritos anteriormente, por ejemplo, en comparación con las actividades correspondientes de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma KM341-1-19 (Nº de Acceso FERM BP-7759) o 2105 (Nº de Acceso FERM BP-8024). Las actividades ADCC y CDC pueden ensayarse por cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, el procedimiento descrito en los Ejemplos del presente documento. Se presentarán posteriormente las secuencias de regiones variables en las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal que se producen por el hibridoma KM341-1-19 (Nº de Acceso FERM BP-7759) o 2105 (Nº de Acceso FERM BP-8024).

Se presentará posteriormente ADN que codifica regiones variables en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo KM341-1-19 y las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera.

En la secuencia de nucleótidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 37) del anticuerpo KM341-1-19, la secuencia señal se inicia con adenina (A) en la posición 50. El límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre “adenina” ([A]) en la posición 109 y citosina (C) en la posición 110, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre adenina (A) en la posición 493 y guanina (G) en la posición 494 (se usó el software de predicción génica (Signal P ver.2)).

En la secuencia de aminoácidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 38) del anticuerpo KM341-1-19, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre serina (S) en la posición 20 y glutamina (Q) en la posición 21, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre serina (S) en la posición 148 y alanina (A) en la posición 149.

En consecuencia, la región variable en la cadena pesada del anticuerpo KM341-1-19 tiene una secuencia de nucleótidos que se extiende desde citosina (C) en la posición 110 a adenina (A) en la posición 493, como se ve en SEC ID Nº: 37. Además, la región variable de la cadena pesada del anticuerpo KM341-1-19 tiene una secuencia de aminoácidos que se extiende desde glutamina (Q) en la posición 21 a serina (S) en la posición 148, como se ve en SEC ID Nº: 38.

En la secuencia de nucleótidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 39) del anticuerpo KM341-1-19, la secuencia señal se inicia con adenina (A) en la posición 29. El límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre “adenina” ([A]) en la posición 88 y guanina (G) en la posición 89, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre adenina (A) en la posición 400 y “citosina” ([C]) en la posición 401 (se usó el software de predicción génica (Signal P ver.2)).

En la secuencia de aminoácidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 40) del anticuerpo KM341-1-19, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre glicina (G) en la posición 20 y ácido glutámico (E) en la posición 21, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre lisina (K) en la posición 124 y “arginina” ([R]) en la posición 125.

En consecuencia, la región variable en la cadena ligera del anticuerpo KM341-1-19 tiene una secuencia de nucleótidos que se extiende desde guanina (G) en la posición 89 a adenina (A) en la posición 400, como se ve en SEC ID Nº: 39. Además, la región variable en la cadena ligera del anticuerpo KM341-1-19 tiene una secuencia de aminoácidos que se extiende desde ácido glutámico (E) en la posición 21 a lisina (K) en la posición 124, como se ve en SEC ID Nº: 40.

La secuencia de nucleótidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 37) del anticuerpo KM341-1-19:

La secuencia de aminoácidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 38) del anticuerpo KM341-1-19:

La secuencia de nucleótidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 39) del anticuerpo KM341-1-19:

La secuencia de aminoácidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 40) del anticuerpo KM341-1-19:

Se presentará posteriormente ADN que codifica regiones variables en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 2105 y las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera.

En la secuencia de nucleótidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 41) del anticuerpo 2105, la secuencia señal se inicia con adenina (A) en la posición 70. El límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre “timina” ([T]) en la posición 126 y guanina (G) en la posición 127, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre adenina (A) en la posición 495 y guanina (G) en la posición 496 (se usó el software de predicción génica (Signal P ver.2)).

En la secuencia de aminoácidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 42) del anticuerpo 2105, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre cisteína (C) en la posición 19 y ácido glutámico (E) en la posición 20, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre serina (S) en la posición 142 y alanina (A) en la posición 143.

En consecuencia, la región variable en la cadena pesada del anticuerpo 2105 tiene una secuencia de nucleótidos que se extiende desde guanina (G) en la posición 127 a adenina (A) en la posición 495, como se ve en SEC ID Nº:

41. Además, la región variable en la cadena pesada del anticuerpo 2105 tiene una secuencia de aminoácidos que se extiende desde ácido glutámico (E) en la posición 20 a serina (S) en la posición 142, como se ve en SEC ID Nº: 42.

En la secuencia de nucleótidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 43) del anticuerpo 2105, la secuencia señal se inicia con adenina (A) en la posición 28. El límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre “adenina” ([A]) en la posición 87 y guanina (G) en la posición 88, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre adenina (A) en la posición 405 y “citosina” ([C]) en la posición 406 (se usó el software de predicción génica (Signal P ver.2)).

En la secuencia de aminoácidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 44) del anticuerpo 2105, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre glicina (G) en la posición 20 y ácido glutámico (E) en la posición 21, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre lisina (K) en la posición 126 y “arginina” ([R]) en la posición 127.

En consecuencia, la región variable en la cadena ligera del anticuerpo 2105 tiene una secuencia de nucleótidos que se extiende desde guanina (G) en la posición 88 a adenina (A) en la posición 405, como se ve en SEC ID Nº: 43. Además, la región variable en la cadena ligera del anticuerpo 2105 tiene una secuencia de aminoácidos que se extiende desde ácido glutámico (E) en la posición 21 a lisina (K) en la posición 126, como se ve en SEC ID Nº: 44.

La secuencia de nucleótidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 41) del anticuerpo 2105:

La secuencia de aminoácidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 42) del anticuerpo 2105:

La secuencia de nucleótidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 43) del anticuerpo 2105:

La secuencia de aminoácidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 44) del anticuerpo 2105:

En la secuencia de nucleótidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 131) del 341G2Ser, el límite entre la secuencia señal

10 y la región variable se localiza entre “adenina” ([A]) en la posición 60 y citosina (C) en la posición 61, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre adenina (A) en la posición 444 y guanina (G) en la posición 445 (se usó el software de predicción génica (Signal P ver.2)).

En la secuencia de aminoácidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 132) del 341G2Ser, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre serina (S) en la posición 20 y glutamina (Q) en la posición 21, y el límite

15 entre la región variable y la región constante se localiza entre serina (S) en la posición 148 y alanina (A) en la posición 149.

En consecuencia, la región variable en la cadena pesada del 341G2Ser tiene una secuencia de nucleótidos que se extiende desde citosina (C) en la posición 61 a adenina (A) en la posición 444, como se ve en SEC ID Nº: 131. Además, la región variable en la cadena pesada del 341G2Ser tiene una secuencia de aminoácidos que se extiende

20 desde glutamina (Q) en la posición 21 a serina (S) en la posición 148, como se ve en SEC ID Nº: 132.

La secuencia de nucleótidos de cadena pesada completa del 341G2Ser (SEC ID Nº: 131):

La secuencia de aminoácidos de cadena pesada completa del 341G2Ser (SEC ID Nº: 132):

En la secuencia de nucleótidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 133) del 341G2Ser, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre “adenina” ([A]) en la posición 60 y guanina (G) en la posición 61, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre adenina (A) en la posición 372 y “citosina” (C) en la posición 373 (se usó el software de predicción génica (Signal P ver.2)).

En la secuencia de aminoácidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 134) del 341G2Ser, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre glicina (G) en la posición 20 y ácido glutámico (E) en la posición 21, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre lisina (K) en la posición 124 y “arginina” ([R]) en la posición 125. En consecuencia, la región variable en la cadena ligera del 341G2Ser tiene una secuencia de nucleótidos que se extiende desde guanina (G) en la posición 61 a adenina (A) en la posición 372, como se ve en SEC ID Nº: 133. Además, la región variable en la cadena ligera del 341G2Ser tiene una secuencia de aminoácidos que se extiende desde ácido glutámico (E) en la posición 21 a lisina (K) en la posición 124, como se ve en SEC ID Nº: 134.

La secuencia de nucleótidos de cadena ligera completa del 341G2Ser (SEC ID Nº: 133):

La secuencia de aminoácidos de cadena ligera completa del 341G2Ser (SEC ID Nº: 134):

En la secuencia de nucleótidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 135) del 2105G2Ser, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre “timina” ([A]) en la posición 57 y guanina (G) en la posición 58, y el límite

15 entre la región variable y la región constante se localiza entre adenina (A) en la posición 426 y guanina (G) en la posición 427 (se usó el software de predicción génica (Signal P ver.2)).

En la secuencia de aminoácidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 136) del 2105G2Ser, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre cisteína (C) en la posición 19 y ácido glutámico (E) en la posición 20, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre serina (S) en la posición 142 y alanina (A) en la

20 posición 143.

En consecuencia, la región variable en la cadena pesada del 2105G2Ser tiene una secuencia de nucleótidos que se extiende desde guanina (G) en la posición 58 a adenina (A) en la posición 426, como se ve en SEC ID Nº: 135. Además, la región variable en la cadena pesada del 2105G2Ser tiene una secuencia de aminoácidos que se extiende desde ácido glutámico (E) en la posición 20 a serina (S) en la posición 142, como se ve en SEC ID Nº: 136.

25 La secuencia de nucleótidos de cadena pesada completa del 2105G2Ser (SEC ID Nº: 135):

La secuencia de aminoácidos de cadena pesada completa del 2105G2Ser (SEC ID Nº: 136):

En la secuencia de nucleótidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 137) del 2105G2Ser, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre “adenina” ([A]) en la posición 60 y guanina (G) en la posición 61, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre adenina (A) en la posición 378 y “citosina” (C) en la posición 379 (se usó el software de predicción génica (Signal P ver.2)).

En la secuencia de aminoácidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 138) del 2105G2Ser, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre glicina (G) en la posición 20 y ácido glutámico (E) en la posición 21, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre lisina (K) en la posición 126 y “arginina” ([R]) en la posición 127. En consecuencia, la región variable en la cadena ligera del 2105G2Ser tiene una secuencia de nucleótidos que se extiende desde guanina (G) en la posición 61 a adenina (A) en la posición 378, como se ve en SEC ID Nº: 137. Además, la región variable en la cadena ligera del 2105G2Ser tiene una secuencia de aminoácidos que se extiende desde ácido glutámico (E) en la posición 21 a lisina (K) en la posición 126, como se ve en SEC ID Nº: 138.

La secuencia de nucleótidos de cadena ligera completa del 2105G2Ser (SEC ID Nº: 137):

La secuencia de aminoácidos de cadena ligera completa del 2105G2Ser (SEC ID Nº: 138):

2. Modificación de anticuerpos antagonistas

Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 serán más preferibles como agentes terapéuticos así como los anticuerpos

15 agonistas, si no tienen las actividades de ADCC y/o CDC, con respecto a mecanismo de acción. Además, es importante que los anticuerpos antagonistas anti-CD40 no tengan actividad para inducir señales por su entrecruzamiento in vivo mediante receptores de Fc, incluso si no puede detectarse la actividad ADCC. En otras palabras, es necesario confirmar que no activan la inmunidad, y tales anticuerpos pueden desearse como agente farmacéutico. Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 son prometedores como agentes terapéuticos para tratar

20 enfermedades autoinmunes o suprimir rechazo de trasplante de órganos. Si inducen una actividad agonista debido a algún efecto después de que se hayan administrado a pacientes, por muy débil que pueda ser, los síntomas pueden empeorar a diferencia del efecto terapéutico deseado. Por lo tanto, un anticuerpo sin ninguna actividad agonista es más preferible como agente farmacéutico. En la presente invención, se ha demostrado que la incorporación de una mutación puntual L235E (que significa sustitución de L en la posición 235 con E; se usarán símbolos similares en lo

25 sucesivo en el presente documento) en IgG4 es eficaz para reducción in vivo de la actividad agonista, en el ensayo animal usando monos. Aunque IgG4 es una subclase con bajas actividades de ADCC y CDC, se ha indicado que cuando se intenta expresar IgG4 como proteína recombinante en células como CHO, se secretaron sus medias moléculas debido a un enlace S-S escaso entre las cadenas pesadas (Rob C. Aalberse y col., Immunology, 105, 919, 2002). Para superar este problema, se ha indicado que la incorporación de una mutación en la región constante

30 de anticuerpos promueve de forma exitosa la formación del enlace S-S. Por lo tanto, este tipo de mutación también se evaluó con respecto a su utilidad. Específicamente, se incorporó la mutación de sustitución de S en la posición 228 con P (S. Angal y col., Molecular Immunology, vol.30, nº 1, 105-108, 1993).

Para anticuerpos antagonistas así como anticuerpos agonistas, la estabilidad del anticuerpo durante la purificación y el almacenamiento es muy importante. Puede haber algunos procedimientos para crear tales anticuerpos físicamente mejores manteniendo a la vez la actividad antagonista. Los compuestos farmacéuticos de anticuerpos ofrecidos en el mercado hasta la fecha pertenecen principalmente a la subclase IgG1, y no se ha indicado que sean problemáticos en la formulación farmacéutica. Basándose en estos hechos, puede ser ventajoso desde el punto de vista de las propiedades físicas derivar la región constante de anticuerpos de IgG1. En caso de anticuerpos anti-CD40, sin embargo, convenientemente tienen menores actividades ADCC y CDC. En consecuencia, pueden desearse anticuerpos que tengan una región constante de tipo IgG1 modificada con algunas mutaciones puntuales. Las mutaciones descritas anteriormente son útiles para crear tales anticuerpos. La región constante de tipo IgG1 puede reducir sus actividades ADCC y CDC incorporando la mutación puntual P331G en la misma. También se ha observado que la incorporación de la mutación puntual L235E en IgG4 elimina una ligera actividad agonista in vivo para hacerla farmacéuticamente más activa, pero la hace físicamente menos estable a un pH bajo. Por lo tanto, la sustitución de L235 con un aminoácido distinto de E puede hacerla físicamente más funcional. Con respecto al anticuerpo 4D11, es muy similar al anticuerpo 2B11 con respecto a la estructura de su región variable. El anticuerpo 2B11 tiene una actividad antagonista menor, pero tiene una mayor estabilidad a un pH bajo, en comparación con el anticuerpo 4D11. Si algunos aminoácidos derivados de la región constante de 2B11 se incorporan en el anticuerpo 4D11, basándose en las propiedades anteriores, 4D11 puede hacerse más estable. Específicamente, la mutación puntual L38V, P58R, G62W, I79M, K81Y, H87Y, S98A, K109R, V120M o T124A en la cadena pesada, o N75S en la cadena ligera, o una combinación de las mismas puede ser eficaz para ese fin. Específicamente, puede proporcionarse para ese fin un mutante creado sustituyendo L en la posición 38 en la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 4D11 con V (abreviado como L38V; se usarán símbolos similares en lo sucesivo en el presente documento), un mutante P58R, un mutante G62W, un mutante I79M, un mutante K81Y, un mutante H87Y, un mutante S98A, un mutante K109R, un mutante V120M o un mutante T124A, o un mutante N75S en la cadena ligera, o una combinación de los mismos.

El anticuerpo descrito en el presente documento tiene al menos una mutación de aminoácidos para reducir las actividades ADCC y/o CDC, preferentemente 1-15, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, o 1 o 2 mutaciones.

Se describen en el presente documento mutantes de anticuerpos antagonistas anti-CD40 y otros como sigue:

[53] Una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal que tiene una actividad antagonista capaz de unirse a CD40, en el que la cadena pesada comprende una región constante con al menos un aminoácido suprimido o sustituido, o con al menos un aminoácido añadido al mismo, siendo capaz dicha deleción, sustitución o adición de aumentar o reducir ADCC y/o CDC.

[54] La cadena pesada de acuerdo con [53], en la que la región constante deriva de una IgG humana.

[55] La cadena pesada de acuerdo con [54], en la que la IgG humana es una IgG1 humana.

[56] La cadena pesada de acuerdo con [54], en la que la IgG humana es una IgG2 humana.

[57] La cadena pesada de acuerdo con [54], en la que la IgG humana es una IgG3 humana.

[58] La cadena pesada de acuerdo con [54], en la que la IgG humana es una IgG4 humana.

[59] La cadena pesada de acuerdo con cualquiera de [55], [57] o [58] en la que dicha sustitución de aminoácidos en la región constante es sustitución de leucina con ácido glutámico en la posición 235, que se indica por el índice EU como en Kabat y col.

[60] Una cadena pesada de acuerdo con cualquiera de [53] a [58], en la que la cadena pesada comprende una región constante con al menos un aminoácido suprimido o sustituido, o con al menos un aminoácido añadido a la misma, siendo capaz dicha deleción, sustitución o adición de promover la formación del enlace S-S entre las cadenas pesadas.

[61] La cadena pesada de anticuerpo de acuerdo con [60], en la que dicha sustitución de aminoácidos en la región constante es sustitución de serina con prolina en la posición 228 que se indica por el índice EU como en Kabat y col.

[62] Un anticuerpo monoclonal que comprende la cadena pesada de acuerdo con cualquiera de [53] a [61].

[63] La cadena pesada de acuerdo con cualquiera de [53] a [61], en la que la cadena pesada comprende una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 4D11 (Nº de Acceso FERM BP-7758).

[64] Un anticuerpo monoclonal que comprende la cadena pesada de acuerdo con [63] y una cadena ligera que comprende una región variable de una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 4D11 (Nº de Acceso FERM BP-7758).

[65] La cadena pesada de acuerdo con cualquiera de [53] a [61], en la que la cadena pesada comprende una región variable del polipéptido representado por SEC ID Nº: 46.

[66] Un anticuerpo monoclonal que consiste en la cadena pesada de acuerdo con [65] y una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal en el que la cadena ligera comprende una región variable del polipéptido representado por SEC ID Nº: 48.

[67] La cadena pesada de acuerdo con [53], en la que la cadena pesada consiste en una parte restante proporcionada retirando la secuencia señal del polipéptido representado por SEC ID Nº: 140.

[68] Un anticuerpo monoclonal que consiste en la cadena pesada de acuerdo con [67] y una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal, en el que la cadena ligera consiste en una parte restante proporcionada retirando la secuencia señal del polipéptido representado por SEC ID Nº: 142.

[69] La cadena pesada de acuerdo con [53], en la que la cadena pesada se produce por un huésped que comprende un vector de expresión que tiene el polinucleótido representado por SEC ID Nº: 139.

[70] El anticuerpo monoclonal de acuerdo con [62], en el que el anticuerpo monoclonal se produce por un huésped que comprende un vector de expresión que tiene el polinucleótido representado por SEC ID Nº: 139 y el polinucleótido representado por SEC ID Nº: 141.

[71] Un polinucleótido representado por SEC ID Nº: 139.

[72] Un polinucleótido representado por SEC ID Nº: 141.

[73] Un vector de expresión que tiene el polinucleótido de acuerdo con [71].

[74] Un vector de expresión que tiene el polinucleótido de acuerdo con [72].

[75] Un vector de expresión que tiene los polinucleótidos de acuerdo con [71] y [72].

[76] Un huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con [73].

[77] Un huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con [74].

[78] Un huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con [75].

[79] Un procedimiento para producir una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal, que comprende las etapas de: cultivar el huésped de acuerdo con [76] en un medio de cultivo; y obtener una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal del cultivo y/o el huésped.

[80] Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal, que comprende las etapas de: cultivar el huésped de acuerdo con [78] en un medio de cultivo; y obtener un anticuerpo monoclonal del cultivo y/o del huésped.

[81] Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal de acuerdo con [62], [64], [66], [68] o [70] como un principio activo.

[82] La composición farmacéutica de acuerdo con [81] usada para prevención o tratamiento de rechazo de trasplante, una enfermedad autoinmune, alergia o inhibición del factor de coagulación sanguíneo VIII.

[83] Un procedimiento para prevención o tratamiento de rechazo de trasplante, una enfermedad autoinmune, alergia o inhibición del factor de coagulación sanguínea VIII, que comprende administrar la composición farmacéutica de acuerdo con [81] a un mamífero.

[84] Uso del anticuerpo monoclonal de acuerdo con [62], [64], [66], [68] o [70] para producción de una composición farmacéutica usada para prevención o tratamiento de un rechazo de trasplante, una enfermedad autoinmune, alergia o inhibición de factor de coagulación sanguínea VIII.

[85] Un procedimiento para producir una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal que tenga una actividad antagonista capaz de unirse a CD40, en el que la actividad agonista se reduce, que comprende una etapa de realizar deleción o sustitución de al menos un aminoácido, o adición de al menos un aminoácido en una región constante de una cadena pesada de un anticuerpo humano.

[86] El procedimiento de acuerdo con [85], en el que la región constante es de una IgG humana.

[87] El procedimiento de acuerdo con [86], en el que la IgG humana es una IgG4.

[88] El procedimiento de acuerdo con cualquiera de [85] a [87], en el que dicha sustitución de aminoácidos en la región constante es sustitución de leucina con ácido glutámico en la posición 235 que se indica por el índice EU como en Kabat y col.

[93] Un polinucleótido proporcionado retirando la parte que codifica la secuencia señal del polinucleótido representado por SEC ID Nº: 139.

[94] Un polinucleótido proporcionado retirando la parte que codifica la secuencia señal del polinucleótido representado por SEC ID Nº: 141.

Adicionalmente, la presente divulgación proporciona los materiales posteriores.

Un mutante de un anticuerpo antagonista anti-CD40, que comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en sustitución de L con V en la posición 38, sustitución de P con R en la posición 58, sustitución de G con W en la posición 62, sustitución de I con M en la posición 79, sustitución de K con Y en la posición 81, sustitución de H con Y en la posición 87, sustitución de S con A en la posición 98, sustitución de K con R en la posición 109, sustitución de V con M en la posición 120 y sustitución de T con A en la posición 124, llevándose a cabo todas estas sustituciones en una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 4D11 (Nº de Acceso FERM BP-7758) y un mutante de un anticuerpo antagonista anti-CD40 que comprende sustitución de N con S en la posición 75 en una región variable de una cadena ligera del anticuerpo 4D11.

En el presente documento, la reducción de las actividades ADCC y CDC significa reducción de esas actividades en comparación con las actividades correspondientes de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 distinto de los mutantes descritos anteriormente, por ejemplo, en comparación con las actividades correspondientes de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 4D11 (Nº de Acceso FERM BP-7758). Las actividades ADCC y CDC pueden ensayarse por cualquier procedimiento conocido, por ejemplo el procedimiento descrito en los Ejemplos del presente documento. Se presentarán posteriormente las secuencias de regiones variables en las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal que se produce por el hibridoma 4D11 (Nº de Acceso FERM BP-7758).

Se presentará posteriormente ADN que codifica regiones variables en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 4D11 y las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera, respectivamente.

En la secuencia de nucleótidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 45) del anticuerpo 4D11, el límite entre la secuencia señal y la región variable está localizada entre “citosina” ([C]) en la posición 93 y citosina (C) en la posición 94, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre adenina (A) en la posición 456 y guanina (G) en la posición 457 (se usó el software de predicción génica (Signal P ver.2)).

En la secuencia de aminoácidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 46) del anticuerpo 4D11, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre serina (S) en la posición 26 y glutamina (Q) en la posición 27, y el límite 5 entre la región variable y la región constante se localiza entre serina (S) en la posición 147 y alanina (A) en la posición 148.

En consecuencia, la región variable en la cadena pesada del anticuerpo 4D11 tiene una secuencia de nucleótidos que se extiende desde citosina (C) en la posición 94 a adenina (A) en la posición 456, como se ve en SEC ID Nº: 45. Además, la región variable en la cadena pesada del anticuerpo 4D11 tiene una secuencia de aminoácidos que se

10 extiende desde glutamina (Q) en la posición 27 a serina (S) en la posición 147, como se ve en SEC ID Nº: 46.

En la secuencia de nucleótidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 47) del anticuerpo 4D11, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre “timina” ([T]) en la posición 14 y guanina (G) en la posición 125, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre adenina (A) en la posición 442 y “citosina” ([C]) en la posición 443 (se usó el software de predicción génica (Signal P ver.2)).

15 En la secuencia de aminoácidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 48) del anticuerpo 4D11, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre citosina (C) en la posición 22 y alanina (A) en la posición 23 y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre lisina (K) en la posición 128 y “arginina” ([R]) en la posición 129.

En consecuencia, la región variable en la cadena ligera del anticuerpo 4D11 tiene una secuencia de nucleótidos que

20 se extiende desde guanina (G) en la posición 125 a adenina (A) en la posición 442, como se ve en SEC ID Nº: 47. Además, la región variable en la cadena ligera del anticuerpo 4D11 tiene una secuencia de aminoácidos que se extiende desde alanina (A) en la posición 23 a lisina (K) en la posición 128, como se ve en SEC ID Nº: 48.

La secuencia de nucleótidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 45) del anticuerpo 4D11:

La secuencia de aminoácidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 48) del anticuerpo 4D11:

En la secuencia de nucleótidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 139) del anticuerpo 4D11 G4PE, el límite entre la

5 secuencia señal y la región variable se localiza entre “citosina” ([C]) en la posición 78 y citosina (C) en la posición 79, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre adenina (A) en la posición 441 y guanina (G) en la posición 442 (se usó el software de predicción génica (Signal P ver.2)).

En la secuencia de aminoácidos de cadena pesada (SEC ID Nº: 140) del anticuerpo 4D11, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre serina (S) en la posición 26 y glutamina (Q) en la posición 27, y

10 el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre serina (S) en la posición 147 y alanina (A) en la posición 148.

En consecuencia, la región variable en la cadena pesada del anticuerpo 4D11 tiene una secuencia de nucleótidos que se extiende desde citosina (C) en la posición 79 a adenina (A) en la posición 441, como se ve en SEC ID Nº:

139. Además, la región variable en la cadena pesada del anticuerpo 4D11 tiene una secuencia de aminoácidos que 15 se extiende desde glutamina (Q) en la posición 27 a serina (S) en la posición 147, como se ve en SEC ID Nº: 140.

La secuencia de nucleótidos de cadena pesada completa (SEC ID Nº: 139) del 4D11 G4PE:

La secuencia de aminoácidos de cadena pesada completa (SEC ID Nº: 140) del 4D11 G4PE:

En la secuencia de nucleótidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 141) del o 4D11 G4PE, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre “timina” ([T]) en la posición 66 y guanina (G) en la posición 67, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre adenina (A) en la posición 384 y “citosina” ([C]) en la posición 385 (se usó el software de predicción génica (Signal P ver.2)).

En la secuencia de aminoácidos de cadena ligera (SEC ID Nº: 142) del 4D11G4PE, el límite entre la secuencia señal y la región variable se localiza entre citosina (C) en la posición 22 y alanina (A) en la posición 23, y el límite entre la región variable y la región constante se localiza entre lisina (K) en la posición 128 y “arginina” ([R]) en la posición

129.

5 En consecuencia, la región variable en la cadena ligera del anticuerpo 4D11G4PE tiene una secuencia de nucleótidos que se extiende desde guanina (G) en la posición 67 a adenina (A) en la posición 384, como se ve en SEC ID Nº: 141. Además, la región variable en la cadena pesada del anticuerpo 4D11 tiene una secuencia de aminoácidos que se extiende desde alanina (A) en la posición 23 a lisina (K) en la posición 128, como se ve en SEC ID Nº: 142.

10 La secuencia de nucleótidos de cadena ligera completa (SEC ID Nº: 141) del 4D11 G4PE:

La secuencia de aminoácidos de cadena ligera completa (SEC ID Nº: 142) del 4D11G4PE:

3. Definición

15 Los términos usados en el presente documento se definirán a continuación.

“CD40” descrito en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en E. A. Clark y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986, o L Stamenkovic y col., EMBO J. 8: 1403, 1989, y particularmente, un polipéptido antigénico expresado en la superficie de linfocitos B, DC, macrófagos, células endoteliales, células epiteliales o células tumorales derivadas de los mismos.

20 “Un anticuerpo anti-CD40” se refiere a cualquier anticuerpo monoclonal para un CD40 expresado en célula, un CD40 de longitud completa o un CD40 de longitud parcial.

Además, “un anticuerpo”, descrito en el presente documento deriva de genes denominados colectivamente genes de anticuerpo que codifican una región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada, así como una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera que juntas constituyen una 25 inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas humanas se agrupan en 5 clases diferentes que consisten en IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Además, IgG se compone de 4 subclases diferentes, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, mientras que IgA se compone de 2 subclases diferentes, IgA1 e IgA2. IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 se localizan en 14q32, 33 de los cromosomas humanos. La estructura fundamental de inmunoglobulina se compone de dos cadenas L homólogas (cadenas ligeras) y dos cadenas H homólogas (cadenas pesadas). La clase y subclase de una inmunoglobulina se 30 determina por sus cadenas H. El anticuerpo puede comprender cualquier clase, cualquier subclase o cualquier isotipo de inmunoglobulina. “Un fragmento funcional” del anticuerpo descrito en el presente documento se refiere a

una parte (fragmento parcial) del anticuerpo definido anteriormente que está activo de forma única o múltiple en un antígeno para el anticuerpo, incluyendo, por ejemplo, F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv, FV estabilizado por disulfuro, FV de cadena sencilla (scFV) y un multímero de los mismos (D. J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, 1998, T. J. International Ltd.).

Hasta ahora, se ha sabido que IgG1 incluye J00228, Z17370 y Y14737, IgG2 incluye J00230, AJ250170, AF449616, AF449617, AF449618, Z49802 y Z49801, IgG3 incluye M12958, K01313, X16110, X99549, AJ390236, AJ390237, AJ390238, AJ390241, AJ390242, AJ390246, AJ390247, AJ390252, AJ390244, AJ390254, AJ390260, AJ390262, AJ390272, AJ390276 y AJ390279, e IgG4 incluye K01316, AJ001563 y A1001564 (los símbolos enumerados anteriormente indican números de acceso de los genes). En la presente divulgación, cada uno de CH1, bisagra, CH2 y CH3 indica una parte de la región constante de cadena pesada de cualquier anticuerpo, y se basan en el índice EU como en Kabat y col (Kabat y col., Sequences of proteins of immunological interest, 1991 Quinta edición). Por definición, CH1 se extiende desde 118 a 213 por el índice EU, las bisagras se extienden desde 216 a 230 por el índice EU, CH2 se extiende desde 231 a 340 por el índice EU y CH3 se extiende desde 341 a 446 por el índice EU.

El “anticuerpo humano” de la presente divulgación significa un anticuerpo que es un producto de expresión de un gen de anticuerpo derivado de ser humano.

“Agonista” se refiere a una acción de potenciación de la unión de un ligando con CD40 expresado en la superficie de células tales como linfocitos B, células tumorales o células dendríticas, o una acción de proporcionar las células que expresan CD40 con al menos un efecto que realiza el ligando de CD40 en las células que expresan CD40. “Un anticuerpo agonista” se refiere a un anticuerpo que tiene dicha acción agonista. Un ejemplo de los efectos proporcionados a las células que expresan CD40 es promover la expresión de CD95.

“Antagonista” se refiere a una acción de inhibición de la unión del ligando con CD40 expresado en la superficie de células tales como linfocitos B, células tumorales o células dendríticas, o una acción de neutralización de al menos un efecto que realiza el ligando de CD40 en las células que expresan CD40. “Un anticuerpo antagonista” se refiere a un anticuerpo que tiene dicha acción antagonista. Un ejemplo de los efectos proporcionados a las células que expresan CD40 es suprimir la proliferación de linfocitos B o la producción de anticuerpos.

La presente solicitud presenta claramente anticuerpos, o regiones variables de cadena pesada o cadena ligera de los mismos, por secuencias de aminoácidos. También se describen en el presente documento las secuencias de aminoácidos con al menos un aminoácido suprimido o sustituido, o añadido a las mismas, preferentemente 1-10, 19, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3 o 1 o 2 aminoácidos.

La presente solicitud presenta claramente genes que codifican anticuerpos, o regiones variables de cadena pesada

o cadena ligera de los mismos, por secuencias de nucleótidos. También se describen en el presente documento las secuencias de nucleótidos con al menos un nucleótido suprimido o sustituido, o añadido a las mismas, preferentemente 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3 o 1 o 2 aminoácidos.

El anticuerpo anti-CD40 de acuerdo con la presente invención puede proporcionarse incorporando un gen de anticuerpo en un vector de expresión, transfectando el vector a una célula huésped adecuada, recogiendo el anticuerpo de las células cultivadas o el sobrenadante, y purificándolo.

El vector puede ser un fago o un plásmido que puede replicarse en la célula huésped por sí mismo o puede integrarse en el cromosoma de la célula huésped. El ADN plasmídico puede derivar de Escherichia coli, Bacillus subtilis o una levadura, mientras que el ADN del fago puede ser de fago A.

La célula huésped para transformación no está particularmente limitada si puede expresar el gen diana. Los ejemplos de la célula huésped pueden incluir bacterias (Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.), levaduras, células animales (célula COS, célula CHO, etc.) y células de insectos.

Se conocen modos para transferir el gen a las células huésped, incluyendo cualquier modo, tal como mediación por ión de calcio, electroporación, fusión de esferoplastos, mediación por acetato de litio, transfección de fosfato cálcico

o lipofección. Para transferir el gen a un animal, como se describe posteriormente, los modos incluyen microinyección; electroporación o lipofección para células ES; y trasplante nuclear.

En la presente divulgación, “cultivo” se refiere a (a) sobrenadante de cultivo, (b) células cultivadas, biomasa cultivada

o materia alterada de la misma, o (c) secreción de transformante. Para cultivar el transformante, se usa un medio adecuado para el huésped y puede emplearse cultivo estático, cultivo en frasco rotatorio o algo distinto.

Después del cultivo, si se produce la proteína de anticuerpo deseada dentro de la biomasa o las células, el anticuerpo se recoge rompiendo la biomasa o las células. Si el anticuerpo deseado se produce fuera de la biomasa o las células, se usa la solución de cultivo tal cual o después de separarse de la biomasa o las células por centrifugación u otros medios. A continuación, se emplea un procedimiento bioquímico que usa cualquier cromatografía, que sea apropiada para separación/purificación de proteínas, solo u opcionalmente en combinación con otro para separar/aislar el anticuerpo deseado del cultivo.

Además, puede usarse la tecnología para crear un animal transgénico para producir un animal transgénico que sea un animal huésped que tenga el gen integrado en un gen endógeno, tal como un bovino transgénico, una cabra transgénica, una oveja transgénica o un cerdo transgénico (Wright, G., y col., (1991) Bio/Technology 9, 830-834) y puede obtenerse una gran cantidad de un anticuerpo monoclonal derivado del gen de anticuerpo de la leche secretada del animal transgénico. El cultivo de un hibridoma in vitro puede realizarse usando un medio nutriente conocido o cualquier medio nutriente preparado por derivación del medio básico conocido como se usa para cultivar, mantener y almacenar el hibridoma y para producir un anticuerpo monoclonal en el sobrenadante, dependiendo de las propiedades del hibridoma cultivado, el fin del estudio y el procedimiento de cultivo.

4. Propiedades de los anticuerpos

(1)

Anticuerpos agonistas

El mutante del anticuerpo agonista descrito en el presente documento puede activar el sistema inmune sin dañar células inmunocompetentes, puesto que tiene una actividad ADCC y/o CDC igual a o menor que el anticuerpo original, manteniendo a la vez una actividad agonista. Se espera por lo tanto que el mutante muestre una acción inmunoactivadora que sea igual o mayor que el anticuerpo original y una citotoxicidad para células que expresan CD40 que sea igual o menor que el anticuerpo original.

(2)

Anticuerpos antagonistas

El mutante del anticuerpo antagonista anti-CD40 de acuerdo con la presente invención tiene actividad ADCC y/o CDC reducida en comparación con el anticuerpo no modificado, manteniendo a la vez una actividad supresora frente a señales inmunoactivadoras inducidas por CD40L. También se espera que reduzca la actividad de la inducción de señales in vivo que se considera que se produce mediante receptores de Fc.

5. Composiciones farmacéuticas

También está dentro del alcance de la presente divulgación una composición farmacéutica que contiene una formulación del anticuerpo purificado descrito en el presente documento. La composición farmacéutica puede contener preferentemente un diluyente o vehículo fisiológicamente aceptable además del anticuerpo, y puede ser una mezcla de los mismos con un anticuerpo diferente o un fármaco diferente tal como un agente antibiótico. El vehículo adecuado puede incluir, pero sin limitación, solución salina fisiológica, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, solución de glucosa salina fisiológica tamponada con fosfato y solución salina fisiológica tamponada. Como alternativa, un anticuerpo puede liofilizarse para almacenamiento y, cuando se usa, reconstituirse en un tampón acuoso como se ha descrito anteriormente. La composición farmacéutica puede administrarse mediante la vía oral, o la vía parenteral, tal como inyección o dosificación intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraperitoneal.

Una dosis única eficaz, que es una combinación del anticuerpo del presente anticuerpo con un diluyente adecuado y un vehículo fisiológicamente aceptable, es de 0,0001 mg a 100 mg por kg de peso corporal, y puede tomarse a un intervalo temporal de 2 días a 8 semanas.

Cuando la composición farmacéutica de la presente invención es un anticuerpo agonista, se usa como: inmunoestimulante (agente antiviral o antiinfeccioso) para patógenos incluyendo, por ejemplo, virus de hepatitis A, B, C, D o E, VIH, virus de la gripe, virus de herpes simple, citomegalovirus, virus EB, virus del papiloma, clamidia, micoplasma, toxoplasma, malaria, tripanosoma y bacilo tuberculoso; agente antitumoral para tumores malignos que tienen células cancerosas con CD40 expresado, incluyendo, por ejemplo, cáncer pancreático, cáncer de vejiga, linfoma (por ejemplo, linfoma de Hodgkin), leucemia, melanoma maligno, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer prostático y cáncer de cabeza y cuello; y agente terapéutico para enfermedades autoinmunes tales como reumatismo. La composición farmacéutica puede usarse para una combinación de las enfermedades anteriores. También puede usarse en combinación como adyuvante para un péptido específico de cáncer. Cuando la composición farmacéutica es un anticuerpo antagonista, por otro lado, es útil como: inmunosupresor en trasplante de órganos (agente preventivo o terapéutico para rechazo de trasplantes de islotes pancreáticos, riñón o algún otro, o GVHD), agente terapéutico para enfermedades autoinmunes (por ejemplo, reumatismo, psoriasis, colitis ulcerosa crónica, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia, esclerodermia, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, hepatitis autoinmune, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de Behcet, arterioesclerosis, nefritis y síndrome de dificultad respiratoria), agente terapéutico para alergia (por ejemplo, asma), y agente terapéutico para inhibición del factor de coagulación sanguínea VIII. La composición farmacéutica puede usarse para una combinación de las enfermedades anteriores.

6. Epítopos

Se determinaron los epítopos de unión de CD40 para los anticuerpos KM341-1-19 y 2105 que tienen una actividad agonista superior, y para el anticuerpo 4D11 que tiene una actividad antagonista superior, respectivamente (Ejemplo 2). Se describen en el presente documento anticuerpos que tienen una actividad agonista o antagonista que tienen una secuencia de región variable diferente de las de los anticuerpos anteriores pero reconocen el mismo epítopo que uno de los anticuerpos anteriores. Estos anticuerpos pueden obtenerse en un procedimiento tal como se describe posteriormente.

Cuando se pretende adquirir un anticuerpo agonista anti-CD40 que reconozca el mismo epítopo que el anticuerpo KM341-1-19, por ejemplo, se inmunizan ratones o similares con CD40 para proporcionar anticuerpos monoclonales, de los que algunos anticuerpos monoclonales que compiten con el anticuerpo KM341-1-19 para unirse a CD40 se exploran de acuerdo con el procedimiento convencional. A partir de los anticuerpos explorados, se selecciona un anticuerpo que tiene el mismo patrón de unión con el péptido que el anticuerpo KM341-1-19 de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2.

La presente invención se describirá en más detalle posteriormente con referencia a ejemplos.

Ejemplo 1: Expresión y purificación de proteínas de anticuerpo y antígeno

Se transfectó un plásmido vector que contenía una región variable de un anticuerpo en células CHO (ATCC) y se seleccionaron células que expresaban anticuerpo por G418 para preparar una línea celular de expresión estable.

Se expresó un antígeno mutante introduciendo de forma transitoria un vector en células HEK (ATCC).

Se purificó un anticuerpo anti-CD40 a partir del sobrenadante de cultivo anterior por el siguiente procedimiento. El sobrenadante de cultivo que contenía un anticuerpo anti-CD40 se purificó por afinidad en una columna de proteína A Hiper D (fabricada por NGK Insulators, Ltd.) o en caso de purificación de IgG1 de ratón, una columna de Proteína G (Amersham Pharmacia Biotech) de acuerdo con las instrucciones adjuntas usando PBS(-) como un tampón de adsorción y un tampón de citrato sódico 0,1 M (pH 3) como un tampón de elución. La fracción eluida se ajustó a aproximadamente pH 7,2 mediante adición de una solución de Na2HPO4 o Tris-HCl (pH 8,0) 1 M. La solución de anticuerpo preparada se sustituyó con PBS(-) usando una membrana de diálisis (10.000 cortes, fabricada por Spectrum Laboratories, Inc.) o una columna SP (Amersham Pharmacia Biotech), y se filtró y esterilizó usando un filtro de membrana MILLEX-GV con un diámetro de poro de 0,22 !m (fabricado por Millipore Corp.). La concentración del anticuerpo purificado se calculó por medición de la absorbancia a 280 nm, tomando 1 mg/ml como 1,450 D

Ejemplo 2: Determinación de epítopos

Se desplazó un péptido de 13 unidades que abarcaba el aminoácido 175 (SEC ID Nº: 1) en una región extracelular de CD40 en dos aminoácidos cada uno para sintetizar 82 péptidos en total (SEC ID Nº: 49 a 130) como puntos desde el extremo C terminal en una membrana de celulosa y acetilar el extremo N terminal del mismo (Jerini AG, Alemania). A continuación la reacción se llevó a cabo basándose en un análisis de Western convencional (véase Reineke, U. y col. (2001), “Epitope mapping with synthetic peptides prepared by SPOT synthesis”. Antibody Engineering (Springer Lab Manual) Eds.: Kontermann/Dubel, 433-459, por ejemplo). En el análisis, la intensidad de coloración de cada punto se cuantificó usando Lumilmager™ (Boehringer-Mannheim Corp.) (Figuras 1A-1, A-2, B-1 y B-2).

Los resultados confirmaron que un anticuerpo 4D11 reconoce claramente los péptidos del 20º al 24º y el 41º, un anticuerpo 2105 reconoce claramente los péptidos 12º a 23º y 64º, un anticuerpo KM341-1-19 reconoce claramente los péptidos 41º y 42º, KM643-4-11 reconoce claramente el 43er péptido, F72 reconoce claramente el 75º péptido, 110 reconoce claramente el 64º péptido, F4-465 reconoce claramente los péptidos 34º, 35º, 54º, 55º, 65º, 66º y 75º, KM281-1-10 reconoce claramente los péptidos 21º, 24º, 64º y 75º, 2B11 (anticuerpo nuevo) reconoce claramente los péptidos 21º, 24º y 64º, y F76 (anticuerpo nuevo) reconoce claramente los péptidos 21º, 35º, 51º y 52º.

Para confirmar el sitio de unión del anticuerpo anti-CD40, se preparó una proteína de fusión CD40-FC que tenía una mutación introducida en la misma, y se examinó la capacidad de unión con la misma por ELISA. Puesto que el anticuerpo anti-CD40 no reacciona de forma cruzada con linfocitos B de ratón, se prepararon cinco proteínas de fusión CD40-FC convirtiendo parcialmente la secuencia de aminoácidos en la de CD40 de ratón. Se examinó la unión del anticuerpo con los antígenos. El procedimiento para preparar las proteínas de fusión mutantes CD40-FC se muestra posteriormente. El sitio de mutación se preparó introduciendo una secuencia CD40 de ratón en una parte a la que se une fuertemente el anticuerpo de la secuencia peptídica. CD40mut1 convirtió EFTE en un sitio correspondiente al 15º péptido en ALEK, CD40mut2 convirtió LDT en un sitio correspondiente al 21º péptido en SAQ, CD40mut3 convirtió TH en un sitio correspondiente al 24º péptido en IR, CD40mut4 convirtió EEGW en un sitio correspondiente al 42º péptido en KEGQ, y CD40mut5 convirtió VSSA en una sitio correspondiente al 64º péptido en QSSL. Los mutantes se prepararon de acuerdo con una técnica de ingeniería genética (Figuras 2A, B y C). Los resultados de análisis confirmaron que el anticuerpo 2105 tiene capacidad de unión extremadamente reducida con CD40mut1. Los resultados también confirmaron que el anticuerpo 4D11 y 2B11 tienen capacidad de unión reducida con CD40mut2.

Ejemplo 3: Actividad de unión de anticuerpo agonista anti-CD40 con células Ramos

Se suspendió una línea de células Ramos en un tampón de tinción PBS (SB) que contenía NaN3 0,1 % y FCS 2 % a una concentración de 2 x 106/ml. La suspensión celular (100 !l/pocillo) se repartió en una placa de fondo redondo de 96 pocillos (fabricada por Becton, Dickinson and Company). Se añadió cada sobrenadante de cultivo de hibridoma (50 !l), y se incubó a la temperatura del hielo durante 30 minutos. Se ajustó un anticuerpo IgG1 humano para albúmina de suero humano como un control negativo a una concentración de 2 !g/ml en un medio de cultivo de hibridoma, se añadió en una cantidad de 50 !l y después se incubó a una temperatura de hielo durante 15 minutos. Después de lavar la placa con SB, se añadieron 50 !l de un anticuerpo antihumano marcado de forma fluorescente con R-PE diluido 250 veces (fabricado por Southern Biotechnology Associates, Inc.), y se incubó a una temperatura de hielo durante 15 minutos. Después de lavar la placa con SB dos veces, se resuspendió en 300 a 500 !l de un tampón FACS, y se midió la intensidad de fluorescencia de cada célula usando FACS (FACSort, FACScan, fabricado por Becton, Dickinson and Company).

Ejemplo 4: Evaluación de la actividad agonista del anticuerpo agonista anti-CD40 para células Ramos

Se sembraron 5,0 x 105 células/ml de una suspensión de células Ramos en una placa de 96 pocillos a 100 !l/pocillo. Se diluyó un sobrenadante de cultivo de hibridoma o anticuerpo purificado a 20 !g/ml en un medio, y la dilución se añadió a la placa de 96 pocillos a una concentración de 100 !l/pocillo. Después de cultivar durante una noche, las células se recogieron, y se usó anticuerpo anti-CD95 marcado con R-PE (Pharmingen NJ) para las células. El análisis se llevó a cabo usando FACScan o FACSsort (Becton, Dickinson and Company).

Ejemplo 5: Inhibición de la expresión de CD95 por anticuerpo antagonista anti-CD40 en células Ramos

Se sembraron 1,0 x 106 células/ml de una suspensión de células Ramos en una placa de 96 pocillos a 50 !l/pocillo. Se ajustó un sobrenadante de cultivo de hibridoma o anticuerpo purificado a 2 !g/ml en un medio, y el medio se añadió a la placa de 96 pocillos a 100 !g/pocillo. Se añadieron 4 !g/ml de un ligando de CD40 soluble (Alexis Corporation) y 4 !g/ml de un anticuerpo anti-FLAG (M2, Sigma) a un medio, y el medio se añadió a una placa de 96 pocillos a 50 !l/pocillo. Después de cultivar durante una noche, las células se recogieron, y se usó un anticuerpo anti-CD95 marcado con R-PE (Pharmingen NJ) para las células. El análisis se llevó a cabo usando FACS.

Ejemplo 6: Medición de la actividad CDC en anticuerpo anti-CD40

En el ensayo de CDC, se cultivaron 2.000 células diana marcadas con Cr51 y un complemento derivado de suero humano (fabricado por Sigma Co.) o complemento derivado de suero de conejo (Cedarlane Laboratories Limited, Ontario, Canadá) a una concentración final de 5 % en una placa de 96 pocillos de fondo redondo en un volumen total de 200 !l junto con el anticuerpo a diversas concentraciones a 37 ºC en presencia de CO2 5 % durante dos horas.

Después de cultivar, la placa se centrifugó para hacer que las células precipitaran, y después se transfirieron 50 !l del sobrenadante a una placa de 96 pocillos que incluía un centelleador en polvo (Lumaplate™-96: fabricado por Packard Instrument Co., Inc.) y se secó a 55 ºC durante 1,5 horas. Después de confirmar que la placa estaba seca, se cubrió con una cobertura especial (TopSeal™-A: microplacas de 96 pocillos: fabricado por Packard Instrument Co., Inc.), y se midió la dosis de rayos y con un contador de centelleo (TopCount: fabricado por Packard Instrument Co., Inc.).

Ejemplo 7: Medición de la actividad ADCC del anticuerpo anti-CD40

Como la citotoxicidad mediada por anticuerpos, se midió la citotoxicidad para células diana en presencia de células que tienen actividad citolítica tales como linfocitos NK o neutrófilos y un anticuerpo (Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpo, en lo sucesivo en el presente documento ADCC), y la citotoxicidad para células diana en presencia de un complemento y un anticuerpo (Citotoxicidad Dependiente de Complemento, en lo sucesivo en el presente documento CDC). Se usó hIgG como control.

El procedimiento de medición se describe simplemente como sigue. Se incorporó cromo radioactivo (Cr51) al citoplasma de las células diana, y se midió la cantidad de Cr51 liberado en la solución de cultivo por muerte celular como una dosis de rayos y.

Específicamente, se suspendieron 105 células diana de una línea celular de linfoma de Burkitt Raji (ATCC CCL-86) en 15 !l de suero de ternero fetal (FCS). Se añadieron 50 !l (37 MBq/ml) de cromato sódico marcado con Cr51 (fabricado por PerkinElmer, Inc.: en lo sucesivo en el presente documento denominado Cr51) a la suspensión, y las células se cultivaron a 37 ºC durante 1 hora. A continuación, se añadieron 10 ml de un medio, y el medio se descartó por centrifugación. Esta operación se repitió tres veces para retirar Cr51 no incorporado en las células.

En el ensayo de ADCC, se cultivaron 2.000 células diana marcadas con Cr51 y 200.000 leucocitos mononucleares de sangre periférica humana sanos obtenidos por el procedimiento descrito en el Ejemplo 6 en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (fabricada por Falcon) en un volumen total de 200 !l junto con el anticuerpo a diversas concentraciones a 37 ºC en presencia de CO2 5 % durante cuatro horas.

Después de cultivar, la placa se centrifugó para provocar que las células precipitaran, y después se transfirieron 50 !l del sobrenadante a una placa de 96 pocillos que incluía un centelleador en polvo (Lumaplate™-96: fabricado por Packard Instrument Co., Inc.) y se secó a 55 ºC durante 1,5 horas. Después de confirmar que la placa se secó, la placa se cubrió con una cobertura especial (TopSeal™-A: microplacas de 96 pocillos: fabricada por Packard Instrument Co., Inc.), y se midió la dosis de rayos y con un contador de centelleo (TopCount: fabricado por Packard Instrument Co., Inc.).

Ejemplo 8 (Ejemplo de referencia):

Preparación y evaluación de la actividad del mutante P331S del anticuerpo agonista anti-CD40

Se describe la clonación génica de los anticuerpos agonistas anti-CD40 KM341-1-19 y 2105 en el documento WO 02/099186. Se ha indicado que la actividad CDC se reduce convirtiendo Pro en la posición 331 en la región constante de IgG2 en Ser. Para reducir la actividad CDC del anticuerpo KM341-1-19 y el anticuerpo 2105, se introdujo una mutación P331S en la región constante IgG2 de los mismos.

La región constante de IgG1 humana de un vector de expresión de anticuerpo N5KG1-Val Lark (IDEC Pharmaceuticals: abreviado en lo sucesivo en el presente documento a N5KG1) se sustituyó con IgG2 para preparar N5KG2, y la Pro en la posición 331 de IgG2 se convirtió a Ser para preparar una mutación. Se llevó a cabo clonación de ADNc de la región constante de IgG2 recogiendo hibridoma KM341-1-19 por centrifugación, añadiendo TRIZOL (Gibco BRL), y extrayendo ARN total de acuerdo con las instrucciones. La región variable de ADNc del anticuerpo se clonó usando un kit de amplificación de ADNc SMART RACE de Clontech Laboratories, Inc. de acuerdo con las instrucciones adjuntas. Se preparó ADNc de 1ª cadena usando 5 !g de ARN total como molde. Se llevó a cabo PCR con tnIgG3Nhe: atatGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC (SEC ID Nº: 2) G y tnIgG2Bam: atatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC (SEC ID Nº: 3) como secuencias cebadoras usando un kit ZtaqPCR (Takara) en 30 ciclos que consisten cada uno en reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 55 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 1 minuto para amplificar el gen. Después de la reacción, el producto amplificado se purificó por un kit de purificación de PCR QIAGEN, se digirió con NheI y BamHI y se incorporó en N5KG1 para confirmar la secuencia. Este vector se definió como N5KG2.

N5KG2Ser (con Pro en la posición 331 convertida en Ser) se preparó como sigue. Se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG2 como molde y los cebadores IgG3Nhe: atatGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCG (SEC ID Nº: 4) y G2Ser2: GTTTTCTCGATGGAGGCTGGGAGGCC (SEC ID Nº: 5). A la vez, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG2 como molde y los cebadores IgG2Bam: atatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC (SEC ID Nº: 6) y G2Ser1: GGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAAC (SEC ID Nº: 7). Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron usando un kit de purificación de PCR, y se mezclaron las mismas cantidades de los dos fragmentos de ADN purificados. A continuación, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos cinco veces. Se añadieron los cebadores IgG3Nhe e IgG2Bam a la mezcla, y se llevó a cabo la misma reacción 15 veces. El fragmento de ADN amplificado se escindió con NheI y BamHI, y se sustituyó con la región constante de IgG1 del vector N5KG1 (N5KG2Ser). El fragmento que contenía la secuencia de la región variable de anticuerpo digerida con BgIII y NheI se incorporó en el vector N5KG2Ser.

El anticuerpo expresado y purificado por el procedimiento anterior se evaluó con respecto a capacidad de unión con células Ramos (Figura 3A) y actividad agonista (Figura 3B). No se observó fluctuación de la actividad debido a la introducción de la variación P331S.

Ejemplo 9 (Ejemplo de referencia):

Se realizó la medición de actividad CDC del mutante 331ser de anticuerpo agonista anti-CD40 por el procedimiento anterior. Se usó complemento derivado de suero de conejo, y se usaron células Ramos como células diana. Los resultados confirmaron que, en un anticuerpo KM341-1-19 a una concentración de anticuerpo de 1 !g/ml, IgG2ser mostró actividad CDC significativamente reducida en comparación con IgG2 (Figura 4A). Por otro lado, cuando se usó un complemento humano, no se observó cambio (Figura 4B).

Ejemplo 10 (Ejemplo de referencia):

Preparación y medición de actividad de anticuerpo agonista anti-CD40 que tiene región constante convertida

Entre los anticuerpos anti-CD descritos en el documento WO 02/088186, dos anticuerpos que muestran la actividad agonista más fuerte (anticuerpo KM341-1-19 y anticuerpo 2105) pertenecen a la subclase IgG2. Para examinar si la subclase IgG2 es importante o no para la activación de CD40, se prepararon proteínas recombinantes que tenían una región constante de anticuerpo convertida en IgG1, IgG3 e IgG4, respectivamente, y se midieron con respecto a capacidad de unión con un antígeno y actividad potenciadora de la expresión de CD95 en células Ramos de acuerdo con los Ejemplos 4 y 6. IgG1 se expresó usando N5KG1 e IgG2 e IgG3 se expresaron respectivamente usando los vectores de expresión N5KG2 y N5KG3 obtenidos sustituyendo la región constante de N5KG1 con IgG2 e IgG3, respectivamente. Se llevó a cabo clonación de ADNc de la región constante de IgG3 de acuerdo con el procedimiento de clonación de IgG2 parcialmente modificado, usando un cebador específico de IgG3. IgG4 se expresó usando N5KG4PE (IDEC Pharmaceuticals).

La proteína de anticuerpo se expresó de acuerdo con el Ejemplo 1. La actividad de unión con células Ramos que expresaban CD40 humano del anticuerpo KM341-1-19 y el anticuerpo 2105 no se vio afectada convirtiendo IgG2 en IgG1, IgG3 o IgG4 (Figuras 5A-1 y 5A-2). Sin embargo, se descubrió que estos anticuerpos tenían actividad potenciadora de la expresión de CD95 en células Ramos reducida en un 10 % o más (Figuras 5B-1 y 5B-2). Esto muestra que no solamente la estructura de la región variable que define la región de unión del anticuerpo sino también la estructura de la región constante del anticuerpo son importantes para la actividad agonista fuerte del anticuerpo 2105 y el anticuerpo KM341-1-19. Por lo tanto, para examinar qué región de la región constante de IgG2 es importante para la actividad agonista, se preparó un mutante de intercambio de dominio en el que la estructura de IgG2 se mezcla con la estructura de IgG4 para medir su actividad. Como se describe posteriormente, se prepara un mutante de intercambio de dominio por sustitución de una región bisagra. En este caso, la “región bisagra” incluye la bisagra superior (desde código EU de Kabat 216), bisagra media (desde código EU de Kabat 226) y bisagra inferior (código EU de Kabat 231), como se describe en Ole H Brekke y col., Immunology Today 1995, 16, 85-90. Se prepararon cuatro mutantes de intercambio de dominio IgG2/4 (CH1 y región bisagra: IgG2, otras regiones: IgG4), IgG4/2/4 (región bisagra: IgG2, otras regiones: IgG4), IgG2/4/4 (CH1: IgG2, otras regiones: IgG4) e IgG4/2/2 (CH1: IgG4, otras regiones: IgG2) respectivamente para el anticuerpo KM341-1-19 y el anticuerpo 2105.

Se preparó un vector N5KG2/4 para expresar anticuerpo IgG2/4 usando un kit de PCR Ztaq (Takara). Se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG2 como molde y los cebadores IgG3Bam: atatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC (SEC ID Nº: 8) y 24Chi4: AG-GGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTT (SEC ID Nº: 9). A la vez, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG4 (IDEC Pharmaceuticals) como molde y los cebadores 24Chi3: AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCT (SEC ID Nº: 10) y linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEC ID Nº: 11). Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron usando un kit de purificación de PCR, y se mezclaron las mismas cantidades de los dos fragmentos de ADN purificados. A continuación, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos cinco veces. Se añadieron los cebadores IgG3Bam y linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEC ID Nº: 12) a la mezcla, y la misma reacción se llevó a cabo 15 veces. El fragmento de ADN amplificado se escindió con NheI y BamHI, y se sustituyó con la región constante de IgG1 del vector N5KG1.

Se preparó un vector N5KG4/2/4 para expresar IgG4/2/4 como sigue. Se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG4 como molde y los cebadores linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEC ID Nº: 13), G2Hin3: TTTGCGCTCAACTGTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGG (SEC ID Nº: 14), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEC ID Nº: 15) y G2Hin4: ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCG (SEC ID Nº: 16). Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron con un kit de purificación de PCR, y se mezclaron las mismas cantidades de los dos fragmentos de ADN purificados. A continuación, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos cinco veces usando la mezcla como molde. Se añadieron los cebadores linkH y linkH2 a la mezcla, y se llevó a cabo la misma reacción 15 veces. El fragmento de ADN amplificado se escindió con NheI y BamHI, y se sustituyó con la región constante de IgG1 del vector N5KG1.

Se preparó un vector N5KG2/4/4 para expresar IgG2/4/4 como sigue. Se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG2 como molde y los cebadores linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEC ID Nº: 17) y G4CH1-2: GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG (SEC ID Nº: 18). A la vez, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG4 como molde y los cebadores G4CH1-1: CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC (SEC ID Nº: 19) y linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEC ID Nº: 20). Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron usando un kit de purificación de PCR, y se mezclaron las mismas cantidades de los dos fragmentos de ADN purificados. A continuación, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos cinco veces. Se añadieron los cebadores linkH y linkH2 a la mezcla, y se llevó a cabo la misma reacción 15 veces. El fragmento de ADN amplificado se escindió con NheI y BamHI, y se sustituyó con la región constante de IgG1 del vector N5KG1.

Se preparó un vector N5KG4/2/2 para expresar IgG4/2/2 como sigue. Se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos usando N5KG4 como molde y los cebadores linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEC ID Nº: 21) y G4CH1-2: GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG (SEC ID Nº: 22). A la vez se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG2 como molde y los cebadores G4CH1-1: CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC (SEC ID Nº: 23) y linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEC ID Nº: 24). Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron usando un kit de purificación de PCR, y se mezclaron las mismas cantidades de los dos fragmentos de ADN purificados. A continuación, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos cinco veces. Se añadieron los cebadores linkH y linkH2 a la mezcla, y se llevó a cabo la misma reacción 15 veces. El fragmento de ADN amplificado se escindió con NheI y BamHI, y se sustituyó con la región constante de IgG1 del vector N5KG1.

Se examinó la actividad de unión de los cuatro mutantes de intercambio de dominio respectivos del anticuerpo KM341-1-19 y del anticuerpo 2105. Como resultado, no se observó diferencia entre ellos y el IgG2 original con respecto a capacidad de unión (Figuras 6A-1 y 6A-2). Sin embargo, solamente IgG2/4/4 tanto del anticuerpo KM3411-19 como del anticuerpo 2105 mostró actividad agonista significativamente reducida (Figuras 6B-1 y 6B-2). Los resultados confirmaron que la región bisagra de IgG2 es importante para actividad agonista.

Además, se examinó qué secuencia es importante en la región bisagra. La región bisagra se divide en tres sitios, específicamente, bisagra superior, bisagra media y bisagra inferior (Ole H Brekke y col. Immunology Today 1995, 16, 85-90). Las secuencias específicas de IgG2 en estas regiones se sustituyeron respectivamente con secuencias específicas de IgG4. Los anticuerpos obtenidos introduciendo una mutación en la bisagra superior (desde código EU de Kabat 216), bisagra media (desde código EU de Kabat 226) y bisagra inferior (desde código EU de Kabat 231) se definieron respectivamente como IgG2UH4, IgG2MH4 e IgG2LH4. Sus vectores de expresión respectivos se definieron como N5KG2UH4, N5KG2MH4 y N5KG2LH4. “Bisagra” se define como los índices EU 216 a 230 de acuerdo con Kabat y col., Sequences of proteins of immunological interest, 1991 Quinta edición.

Se preparó N5KG2UH4 como sigue. Se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG2 como molde y los cebadores linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEC ID Nº: 25) y UH4-2: CACAACATTTggaCTCAACTcTCTTGTCCACC (SEC ID Nº: 26). A la vez, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG2 como molde y los cebadores UH4-1: GGTGGACAAGAgAGTTGAGtccAAATGTTGTG (SEC ID Nº: 27) y linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEC ID Nº: 28). Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron usando un kit de purificación de PCR, y se mezclaron las mismas cantidades de los dos fragmentos de ADN purificados. A continuación, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos cinco veces. Se añadieron los cebadores linkH y linkH2 a la mezcla, y se llevó a cabo la misma reacción 15 veces. El fragmento de ADN amplificado se escindió con NheI y BamHI, y se sustituyó con la región constante de IgG1 del vector N5KG1.

Se preparó N5KG2MH4 como sigue. Se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG2 como molde y los cebadores linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEC ID Nº: 29) y UM4-2: GGCACGGTGGGCAtgggggaccataTTTGCGCTC (SEC ID Nº: 30). A la vez, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG2 como molde y los cebadores UM4-1: GAGCGCAAAtatggtcccccaTGCCCACCGTGCC (SEC ID Nº: 31) y linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEC ID Nº: 32). Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron usando un kit de purificación de PCR, y se mezclaron las mismas cantidades de los dos fragmentos de ADN purificados. A continuación, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos cinco veces. Se añadieron los cebadores linkH y linkH2 a la mezcla, y se llevó a cabo la misma reacción 15 veces. El fragmento de ADN amplificado se escindió con NheI y BamHI, y se sustituyó con la región constante de IgG1 del vector N5KG1.

Se preparó N5KG2LH4 como sigue. Se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 4 segundos, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG2 como molde y los cebadores linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEC ID Nº: 33) y UL4-2: GAAGACTGACGGTCCccccaggaactcTGGTGCTGGGCA (SEC ID Nº: 34). A la vez, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 15 veces usando N5KG2 como molde y los cebadores UL4-1: TGCCCAGCACCAgagttcctggggGGACCGTCAGTCTTC (SEC ID Nº: 35) y linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEC ID Nº: 36). Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron usando un kit de purificación de PCR, y se mezclaron las mismas cantidades de los dos fragmentos de ADN purificados. A continuación, se llevó a cabo reacción a 98 ºC durante 1 segundo, a 60 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos cinco veces. Se añadieron los cebadores linkH y linkH2 a la mezcla, y se llevó a cabo la misma reacción 15 veces. El fragmento de ADN amplificado se escindió con NheI y BamHI, y se sustituyó con la región constante de IgG1 del vector N5KG1.

Se examinó que los tres mutantes de intercambio de dominio respectivos del anticuerpo KM341-1-19 y el anticuerpo 2105 tenían la misma actividad de unión para un antígeno (Figuras 6A-1 y 6A-2). Sin embargo, IgG2UH4 e IgG2MH4 mostraron actividad agonista significativamente reducida para células Ramos (Figuras 6B-1 y 6B-2). Se descubrió a partir de lo anterior que las estructuras de bisagra superior y bisagra media en la región bisagra son importantes para actividad agonista dependiente de subclase IgG2 de los anticuerpos anti-CD40 KM341-1-19 y 2105.

Puesto que se descubrió que la subclase IgG2 era importante para la actividad agonista, se convirtieron los anticuerpos de subclase distinta a IgG2 a los de subclase IgG2 para examinar si la actividad agonista se potenciaba

o no. En el examen de varios clones, la actividad agonista de F76 pudo potenciarse convirtiendo la subclase IgG1 a subclase IgG2 (Figuras 7A y B).

Ejemplo 11: Preparación de mutantes de anticuerpo antagonista anti-CD40

Se digirió un fragmento de ADN que contenía una cadena pesada y una cadena ligera de un gen de anticuerpo 4DC11 descrito en el documento WO 02/088186, cuya subclase original es IgG1, con Bg1II y NheI, se purificó, y después se integró en los vectores N5KG4PE, N5KG4P y NSKG4 (IDEC Pharmaceuticals). N5KG4PE contiene las mutaciones puntuales S228P y L235E en la región constante de IgG4 y N5KG4P contiene una mutación puntual S228P en la región constante de IgG4. La proteína de anticuerpo se expresó y se purificó de acuerdo con el procedimiento anterior. El anticuerpo se purificó de acuerdo con el procedimiento anterior usando la unión con células Ramos como un índice. No se observó cambio de la actividad de unión de IgG1, IgG4, IgG4P e IgG4PE con células Ramos (Figura 8A). Se comparó la actividad antagonista de IgG1 con la de diversos mutantes de IgG4 de acuerdo con el procedimiento anterior para descubrir que la actividad antagonista de IgG1 no difiere de la de los mutantes de IgG4 (Figura 8B).

Ejemplo 12: Evaluación de la actividad ADCC y actividad CDC de mutantes de anticuerpo antagonista anti-CD40

Se evaluó la actividad ADCC y actividad CDC de anticuerpos mutantes anti-CD40 de acuerdo con el procedimiento anterior.

Cuando se usaron MNC humanas como células efectoras y células Daudi que expresaban CD40 como células diana, se observó que dos IgG4 e IgG4PE mutantes tenían respectivamente actividad ADCC significativamente reducida en comparación con IgG1 como la subclase original del anticuerpo 4D11 (Figura 9).

La actividad CDC de IgG1 se comparó con la de IgG4P usando células Daudi como células diana. Se descubrió que IgG4P tenía actividad CDC significativamente reducida en comparación con IgG1 (Figura 10).

Ejemplo 13: Efecto de anticuerpo antagonista anti-CD40 en linfocitos B

Se administraron 100 !g de cada uno de IgG1, IgG4P e IgG4PE del anticuerpo 4D11 a la vena de la cola de ratones que tenían un fondo genético por el que eran homocigotos para CD40 alterado endógeno de ratón y que albergaban un transgén de un gen CD40 humano (Yasui. y col. Int. Immunol. 2002 Vol 14: 319). 24 horas después de la administración, se recogió sangre del plexo venoso orbital. Después de la hemólisis con 0,16 moles/l de cloruro de amonio, se añadió un anticuerpo anti-B220 marcado con FITC al hemolisado, y se analizó usando FACS. Los resultados se muestran en la Figura 11. En la Figura, el eje longitudinal indica la relación de linfocitos B en los linfocitos totales. IgG1 redujo más la relación de linfocitos B, IgG4P redujo la relación en menor grado e IgG4PE redujo la relación en mucho menor grado. 24 horas después de la administración, se retiró el bazo y se trituró con un portaobjetos de vidrio para preparar una suspensión celular. Después de la hemólisis de la suspensión celular, se usaron un anticuerpo anti-B220 marcado con PE y un anticuerpo anti-CD23, CD86 o CD95 marcado con FITC para el hemolisado, y se analizó usando FACS. Los resultados se muestran en las Figuras 12A, B y C. En las figuras, el eje longitudinal indica la relación de linfocitos B que expresan cada marcador de superficie en los linfocitos totales. Se descubrió que 4D11G1 conseguía el mismo nivel de aumento de la expresión de cada marcador que en un anticuerpo agonista de ratón anti-CD40 humano 5C3 disponible en el mercado (Pharmingen). IgG4PE consiguió un menor aumento de la expresión de cada marcador de superficie de activación en comparación con IgG1 e IgG4P.

Ejemplo 14: Efecto de la inhibición de la producción de anticuerpo específico de antígeno y cambio del número de linfocitos B provocado por anticuerpo antagonista anti-CD40

Se administraron 100 !g (basado en NP-CGG) de un complejo de conjugados de y-globulina de pollo-4-hidroxi-3nitrofenilacetilo (NP-CGG: distribuido por el Profesor Hitoshi KIKUTANI, Instituto de Investigación de Enfermedades Microbianas, Universidad de Osaka) y alumbre (gel de hidróxido de aluminio) por vía intraperitoneal a ratones que tenían un fondo genético por el que eran homocigotos para CD40 alterado endógeno de ratón y que albergaban un transgén de un gen CD40 humano (Yasui y col. Int. Immunol. 2002 Vol 14: 319) para sensibilizar a los ratones. Inmediatamente antes de la sensibilización a antígenos, se administraron 50 o 100 !g de cada anticuerpo a la vena de la cola. Se administraron 100 !g de un anticuerpo IgG4PE humano anti-albúmina humana como un control negativo. 7 y 14 días después de la sensibilización, se recogió sangre del plexo venoso orbital. Las cantidades de anticuerpos IgG1 e IgM específicos de NP en el suero se midieron por el procedimiento de ELISA. El procedimiento de ELISA se llevó a cabo como sigue. Se añadieron 50 !l/pocillos de albúmina de suero bovino unida a NP (NP-BSA: 2,5 !g/ml) a cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos para ELISA (Maxisorp, fabricado por Nunc A/S) y se incubó a 4 ºC para provocar que NP-BSA se adsorba en la misma. A continuación, se descartó el sobrenadante, y se añadió un reactivo de bloqueo (SuperBlock, fabricado por Pierce Biotechnology, Inc.) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente para llevar a cabo el bloqueo. A continuación, cada pocillo se lavó con un tampón de fosfato (PBS-T) que contenía Tween 20 0,1 % tres veces. A continuación, se añadió cada suero diluido con PBS-T que contenía Block Ace 10 % (50 !l/pocillo) a cada pocillo, y se incubó y se hizo reaccionar a 37 ºC durante 2 horas. La microplaca se lavó con PBS-T tres veces. Después, se añadió una dilución de 1.000 veces de un anticuerpo de cabra anti-IgG1 de ratón o anticuerpo IgM marcado con fosfatasa alcalina (Cosmo Bio, 1070-04 o 1020-04) con PBS-T que contenía Block Ace 10 % (50 !g/pocillo) a cada pocillo, y se incubaron a 37 ºC durante dos horas. A continuación, la microplaca se lavó con PBS-T y después se añadió una solución de sustrato colorante (50 !l/pocillo, Sigma 104, sustrato de fosfatasa) a cada pocillo. Se midió la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm usando un lector de microplacas. Los resultados se muestran en las Figuras 13A y B. En las figuras, el eje longitudinal indica valores obtenidos convirtiendo una dilución de 10.000 veces (en el caso de IgG1) o dilución de 100 veces (en el caso del anticuerpo IgM) de suero recogido de ratones C57BL/6, a los que se inyectó NP-CGG dos veces, y agrupados en una unidad. El anticuerpo 4D11 y el anticuerpo IgG4P o IgG4PE de 281 inhibieron la producción de anticuerpos IgG1 e IgM específicos de NP de forma igualmente fuerte.

El cambio en el número de linfocitos B en la sangre periférica y bazo de los ratones usados para examinar el efecto de la inhibición de la producción de anticuerpos se midió de acuerdo con el mismo procedimiento que en el Ejemplo

1. Los resultados se muestran en las Figuras 14A y B. El anticuerpo 4D11 y el anticuerpo IgG4P de 281 redujeron la relación de linfocitos B en sangre periférica significativamente en comparación con el anticuerpo IgG4PE. La administración de 100 !g del anticuerpo IgG4PE no cambió la relación de linfocitos B en el bazo retirado 14 días después de la sensibilización a antígenos. Sin embargo, la administración de IgG4P cambió o tendió a cambiar la relación.

Ejemplo 15: Efecto del anticuerpo antagonista anti-CD40 en monos cynomolgus

Se administraron 30 mg/kg de IgG4P o IgG4PE de un anticuerpo 4D11 a la vena cefálica del antebrazo de monos cynomolgus, y se recogió sangre de la vena femoral después de un cierto periodo de tiempo. En el análisis se subconjunto de linfocitos de sangre periférica, se usaron un anticuerpo anti-CD3 marcado con FITC, un anticuerpo anti-CD20 marcado con PE y anticuerpo anti-CD45 marcado con APC para cada suspensión celular, y la relación de células positivas se midió usando FACS para calcular la relación de células positivas para CD45. Los resultados se muestran en la Figura 15. En la figura, el eje longitudinal indica la relación de células positivas para CD20 en cada momento y células positivas para CD20 antes de la administración del anticuerpo. De 1 a 7 días después de la administración del anticuerpo, las células positivas para CD20 se redujeron en aproximadamente el 40 % en individuos a los que se administró el anticuerpo IgG4P. Sin embargo, 4 días después de la administración, las células positivas para CD20 se redujeron en aproximadamente solamente el 20 % en individuos a los que se administró el anticuerpo IgG4PE.

La concentración de IL12 en suero se midió por el procedimiento de ELISA. Se permitió que la sangre recogida de la vena femoral se mantuviera a temperatura ambiente durante 20 a 60 minutos, y después se centrifugó a 3.000 rpm a temperatura ambiente durante 15 minutos. La concentración de IL12 en el suero resultante se midió usando un kit de ELISA de IL12 de mono (BioSource International Inc.). Los resultados se muestran en la Figura 16. No se observó aumento de la producción de IL-12 por el anticuerpo IgG4PE en ningún punto de recogida de sangre. Sin embargo, se observó producción de IL-12 máxima por el anticuerpo IgG4P el 4º día.

Ejemplo 16: Efecto de anticuerpo antagonista anti-CD40 en modelo de hipersensibilidad retardada de mono cynomolgus

Se sensibilizaron nueve monos cynomolgus macho por vía intradérmica y vía intramuscular con toxoide del Tétanos (TTx) (10 Lf/ml; Denka Seiken Co., Ltd.) para inducir hipersensibilidad retardada a TTx. A la vez, 10 minutos antes del comienzo de la sensibilización, se administraron por vía intravenosa 0,1 y 10 mg/kg de un anticuerpo 4D11G4PE a cada uno de tres animales tres veces (una vez a la semana) para examinar el efecto de 4D11G4PE en la hipersensibilidad retardada. Bajo anestesia por administración intramuscular de ketamina, se llevó a cabo sensibilización por administración intradérmica de TTx a la espalda (50 !l/sitio x 12 sitios) y administración intramuscular de TTx al fémur (0,6 ml/cuerpo) y se llevó a cabo presentación por administración intradérmica de TTx al tórax (10 !l/sitio, de 0 a 10 Lf/ml para cada tres sitios) 21 días después de la sensibilización. 24 y 48 horas después de la inducción, se observó reacción cutánea en los sitios de administración y se evaluó de acuerdo con la puntuación de irritación cutánea de Draize. Los resultados de la determinación de la concentración de TTx en cada tres sitios fue respectivamente un valor medio. Los resultados se muestran en la Figura 17. La administración del anticuerpo 4D11G4PE aparentemente inhibió la reacción de hipersensibilidad retardada observada 24 y 48 horas después de la administración.

Se examinó el efecto de TTx en los títulos de anticuerpo IgG e IgM específico de TTx. Se permitió que la sangre recogida de la vena femoral a lo largo del tiempo se mantuviera a temperatura ambiente durante 20 a 60 minutos, y después se centrifugó a 3.000 rpm a temperatura ambiente durante 15 minutos. El título de anticuerpo en el suero resultante se midió usando el procedimiento de ELISA. El procedimiento de ELISA se llevó a cabo como sigue. Se añadieron 100 !l/pocillo de TTx (0,5 Lf/ml) a cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos para ELISA (Maxisorp, fabricado por Nunc A/S) y se incubó a 4 ºC para provocar que TTx se adsorbiera en la misma. A continuación, se descartó el sobrenadante, y se añadió un reactivo de bloqueo (tampón fosfato que contenía BSA 0,5 %) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente para llevar a cabo bloqueo. A continuación, cada pocillo se lavó con un tampón fosfato (PBS-T) que contenía Tween 20 0,05 % tres veces. A continuación, se añadió cada suero diluido con PBS-T que contenía BSA 0,5 % (de 100 a 819, dilución 200 veces, aumento de la dilución: 2; 100 !l/pocillo) a cada pocillo, y se incubó y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante dos horas. La microplaca se lavó con PBS-T tres veces. A continuación, se añadió una dilución 3.000 veces de un anticuerpo de cabra anti-IgG de mono o anticuerpo IgM marcado con peroxidasa (Nordic Immunology) con PBS-T que contenía BSA 0,5 % (100 !g/pocillo) a cada pocillo, y se incubó a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, la microplaca se lavó con PBS-T y después se añadió una solución de sustrato colorante (100 !l/pocillo, clorhidrato de o-fenilendiamina + peróxido de hidrógeno acuoso) a cada pocillo. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 492 nm usando un lector de microplacas. El título de anticuerpo anti-TTx se definió como una ampliación de la dilución máxima para hacer la absorbancia 0,1 y más. El título de anticuerpo fue 0 cuando la absorbancia no alcanzó 0,1, incluso a dilución 100 veces. Los resultados se muestran en las Figuras 18 y 19. La administración de 1 mg/kg de 4D11G4PE suprimió los títulos de anticuerpo IgG e IgM específico de TTx a aproximadamente 1/10. Cuando se administraron 10 mg/kg de 4D11G4PE, los títulos de anticuerpo estuvieron por debajo de la sensibilidad de detección en cualquier punto de recogida de sangre.

Ejemplo 17: Efecto de anticuerpo antagonista anti-CD40 en la formación de trombos plaquetarios

La sangre recogida de un ser humano sano se dividió en cuatro alícuotas (cada una de 6 ml). Se añadieron respectivamente IgG4PE humano de control, IgG2a de ratón de control, IgG4PE humano anti-CD40 humano (4D11) e IgG2a de ratón anti-CD154 humano (5C8) a las fracciones de modo que cada fracción tuviera una concentración en sangre de 100 !g/ml. Se ensambló una cámara de perfusión plana (GlycoTech Corp.) y una placa de Petri revestida con colágeno de acuerdo con las instrucciones adjuntas. Se hizo fluir la sangre tratada con diversos anticuerpos a la cámara a una velocidad que puede aplicar una tensión de cizallamiento de 1.500/s a la sangre durante siete minutos. A continuación, se hizo fluir un tampón fosfato de paraformaldehído 4 % a la cámara a una velocidad que puede aplicar una tensión de cizallamiento de 1.500/s al tampón durante 10 minutos. El agregado plaquetario formado en la placa de Petri se fijó, se tiñó con un anticuerpo CD41 marcado con PE específico de plaquetas, y se observó con un microscopio de fluorescencia. Los resultados se muestran en las Figuras 20A y B. La sangre tratada con IgG4PE humano anti-CD40 humano (4D11) formó un agregado plaquetario en la placa de Petri revestida con colágeno, como lo hizo la sangre tratada con los anticuerpos de control. Sin embargo, la sangre tratada con IgG2a de ratón anti-CD154 humano no formó un agregado plaquetario.

Ejemplo 18: Evaluación de la estabilidad del anticuerpo antagonista anti-CD40

Se compararon anticuerpos modificados en región constante del anticuerpo 4D11 y se examinaron con respecto a estabilidad. En el procedimiento de evaluación, los sobrenadantes de cultivo obtenidos expresando de forma transitoria respectivamente G4P, G4PE, G2Ser y G4/2/4 en células HEK293 se cargaron en una columna de Proteína A (Amersham Pharmacia Biotech), se eluyeron con un tampón de citrato 0,1 M (pH 2,7), y después se incubaron a 37 ºC durante 1 minuto y 10 minutos. A continuación, se neutralizaron con un tampón fosfato 50 nM (pH 7,0). El contenido de oligómero en las soluciones de anticuerpo resultante se midió usando una columna de filtración en gel (Tosoh Corp.). Como resultado, se descubrió que el contenido de oligómero aumenta en proporción con el tiempo de incubación, y G4/2/4 produce un oligómero más fácilmente, G4PE el segundo más fácil, G2Ser el tercero más fácil y G4P el cuarto más fácil (Figura 21).

Ejemplo 19: Efecto de la inhibición del rechazo de injerto de piel por el anticuerpo antagonista anti-CD40

Se injertó un injerto recogido de la cola de ratones DBA/2 en el tórax dorsal lateral de ratones de fondo C57BL/6 que tenían un fondo genético por el que eran homocigotos para CD40 alterado endógeno de ratón y que albergaban un transgén de un gen de CD40 humano, y el injerto se fijó con un parche durante siete días. Se administraron 100 !g de una sustancia de ensayo 4D11G4PE o un vehículo a la vena de la cola 0, 2, 4, 7, 9, 11 y 14 días después del injerto cutáneo, respectivamente. Para inhibir el rechazo de injerto por linfocitos NK, se administraron por vía intraperitoneal 100 !g de un anticuerpo anti-GML aislado a todos los ratones 3 días antes de la operación y 1, 4 y 9 días después de la operación. Los resultados se muestran en la Figura 22. Se observó que el retardo en el rechazo de injerto era significativo en el grupo al que se administró 4D11G4PE en comparación con el grupo al que se administró vehículo.

Ejemplo 20: Análisis de la expresión de CD40 en líneas celulares tumorales humanas

La expresión de CD40 en una línea celular de linfoma de Burkitt Ramos, línea celular de cáncer de vejiga T24 (ATCC, HTB-4), línea celular de cáncer pancreático Hs 766T (ATCC, HTB-134) y Capan-2 (ATCC, HTB-80) se confirmó por análisis de FACS usando 341G2Ser.

Se digirieron T24, Hs 766T y Capan-2 con tripsina y se recogieron, y las Ramos se recogieron tal cual. Las líneas celulares se lavaron con PBS, y después se resuspendieron en un tampón de tinción que contenía 1 !g/ml de 341G2Ser. El tampón de tinción se preparó añadiendo EDTA 0,05 mM, azida sódica 0,05 % y suero bovino inmovilizado 5 % a PBS. Después de la incubación a 4 ºC durante 15 minutos, las células se lavaron con el tampón de tinción dos veces, y se resuspendieron en una dilución 1:250 de IgG (y) de cabra antihumano unido a PE (Southern Biotechnology Associates, Inc) con el tampón de tinción. Después de incubación a 4 ºC durante 15 minutos, las células se lavaron con el tampón de tinción dos veces, y se analizaron con FACSCalibur (fabricado por BD Biosciences). Se usó la misma cantidad de un anticuerpo anti-2,4-dinitrofenol (DNP) humano como un control negativo. El análisis se llevó a cabo usando Cellquest (fabricado por BD Biosciences) como software de análisis de datos para calcular la intensidad de fluorescencia media.

Como resultado, Ramos, T24, Hs766T y Capan-2 tuvieron una intensidad de fluorescencia media obviamente mayor que la del control negativo cuando se tiñeron con 341G2Ser, y por lo tanto se confirmó la expresión de CD40.

Ejemplo 21 (Ejemplo de referencia):

Efecto del anticuerpo agonista anti-CD40 en líneas celulares tumorales humanas

Se suspendieron respectivamente 2,5 x 103 células Ramos, 2,5 x 102 células T24, 5 x 103 células Hs766T y 5 x 103

células Capan-2 en un medio para preparar el volumen total de 100 !l en una placa de 96 pocillos de fondo plano (fabricada por Falcon). Se cultivaron Ramos y Hs766T, Capan-2 y T24 durante 66 horas, 90 horas y 114 horas, respectivamente, junto con 341G2Ser a una concentración de 1 ng/ml a 1.000 ng/ml a 37 ºC en presencia de CO2 5 %. Se añadieron 10 !l (3,7 MBq/ml) de timidina marcada con 3H (fabricada por Amersham Biosciences) y se cultivó 5 a 37 ºC en presencia de CO2 5 % durante seis horas. Se recogieron células Ramos en Filtermat Impreso A (fabricado por PerkinElmer, Inc.) usando un microrrecolector celular 96 (fabricado por Skatron Instruments, Inc.), y se cubrieron con una bolsa de muestra (fabricada por PerkinElmer, Inc.). Se añadieron 12 ml de Betaplate Scint (fabricado por PerkinElmer, Inc.), y se midió la dosis de rayos � con un contador de centelleo líquido (Pharmacia 1205 Betaplate: fabricado por Pharmacia Corp.). Las células Hs 766T, células T24 y células Capan-2 se recogieron 10 respectivamente en Unifilter (fabricado por PerkinElmer, Inc.) usando un recolector (fabricado por PerkinElmer, Inc.). Se unió un sello especial al reverso de cada filtro, y se añadieron 20 !l/pocillo de MicroScint 20 (fabricado por PerkinElmer, Inc.) al mismo. La dosis de rayos � se midió con un contador de centelleo (TopCount: fabricado por Packard Instrument Co., Inc.). Los datos se expresaron como tasas de supervivencia celular ( %) obtenidas dividiendo una media de mediciones por triplicado obtenidas en tres ensayos independientes por un valor de control

15 sin tratamiento.

Como resultado, las tasas de supervivencia celular se redujeron en todas las líneas celulares dependiendo de la concentración de 341G2Ser (Tabla 1). Cuando se añadieron 100 ng/ml de 341G2Ser, la tasa de supervivencia de células Ramos fue del 58 %, la tasa de supervivencia de células T24 fue del 22 %, la tasa de supervivencia de células Hs 766T fue del 15 % y la tasa de supervivencia de células Capan-2 fue del 77 %. Se descubrió que

20 341G2Ser tenía actividad de inhibición del crecimiento de células Ramos, células T24, células Hs 766T y células Capan-2.

Tabla 1

Tasa de supervivencia celular

Línea celular

Concentración de 341G2Ser (ng/ml)

1

10 100 1000

Ramos

98,49 % 81,68 % 57,77 % 55,26 %

T24

97,94 % 50,72 % 21,97 % 25,35 %

Hs 766T

34,67 % 21,50 % 14,67 % 15,18 %

Capan-2

100,94 % 85,34 % 76,76 % 72,89 %

Ejemplo 22 (Ejemplo de referencia):

Efecto del anticuerpo agonista anti-CD40 en modelo portador de cáncer de ratón

25 (1) Células Ramos

Se irradiaron ratones desnudos Balb/c hembra de seis semanas de edad (obtenidos de CLEA Japan, Inc.) con radiación 3Gy, y se injertaron por vía subcutánea 2 x 107 células/ratón de células Ramos en la espalda de los mismos. 16 días después del injerto, se midió el tamaño de los tumores que se produjeron allí. Los ratones portadores de cáncer que tenían un tamaño tumoral de 50 a 170 mm3 se clasificaron en grupos que consistían cada

30 uno en cinco ratones. Se administraron por vía intravenosa 100 !g/ratón de 341G2Ser (una solución en 200 !l de PBS que contenía suero de ratón desnudo 1 %) a los ratones que portaban cáncer una vez en el 16º día, y se midió el tamaño tumoral hasta el 47º día. Se usó un anticuerpo humano anti albúmina de suero humano (HAS) como un control negativo.

(2) Células T24

35 Se retiró una masa de células T24 que había experimentado pase subcutáneo en la espalda de ratones desnudos tres veces, y se injertaron por vía subcutánea en la espalda de ratones desnudos Balb/c hembra de seis semanas de edad (obtenidos de CLEA Japan, Inc.). La masa celular tumoral para injertar es de forma apropiada aproximadamente de 3 mm cuadrados. 10 días después del injerto, se midió el tamaño de los tumores injertados. Los ratones portadores de tumores que tenían un tamaño tumoral de 80 a 200 mm3 se clasificaron en grupos que

40 consistían cada uno en cinco ratones. Se administraron por vía intravenosa 100 !g/ratón de 341G2Ser (una solución en 200 !l de PBS que contenía suero de ratón desnudo 1 %) a los ratones portadores de cáncer una vez el 10º día, y el tamaño tumoral se midió hasta el 29º día. Se usó la misma cantidad de un anticuerpo anti-DNP humano como control negativo.

(3) Células Hs 766T Se injertaron por vía subcutánea 7 x 105 células/ratón de células Hs 766T en la espalda de ratones desnudos Balb/c hembra de ocho semanas de edad (obtenidos de CLEA Japan, Inc.). 16 días después del injerto, se midió el tamaño de los tumores injertados. Los ratones portadores de cáncer que tenían un tamaño tumoral de 50 a 140 mm3 se clasificaron en grupos que consistían cada uno en cinco ratones. Se administraron por vía intravenosa 100 !g/ratón

5 de 341G2Ser (una solución en 200 !l de PBS que contenía suero de ratón desnudo 1 %) a los ratones portadores de cáncer una vez el 16º día, y el tamaño tumoral se midió hasta el 32º día. Se usó la misma cantidad de un anticuerpo anti-DNP humano como un control negativo.

(4) Células Capan-2

Se injertaron por vía subcutánea 2 x 106 células/ratón de células Capan-2 en la espalda de ratones desnudos Balb/c

10 hembra de seis semanas de edad (obtenidos de CLEA Japan, Inc.). 13 días después del injerto, se midió el tamaño de los tumores injertados. Los ratones portadores de cáncer que tenían un tamaño tumoral de 30 a 130 mm3 se clasificaron en grupos que consistían cada uno en cinco ratones. Se administraron por vía intravenosa 10 o 100 !g/ratón de 341G2Ser (una solución en 200 !l de PBS que contenía suero de ratón desnudo 1 %) a los ratones portadores de cáncer dos veces por semana desde el 13er día, y el tamaño tumoral se midió hasta el 34º día. Se

15 usó un anticuerpo policlonal humano (hIgG) (fabricado por Sigma Co.) como un control negativo.

La relación de inhibición del crecimiento tumoral (TGIR) se calculó a partir de la siguiente fórmula. 100-[{(volumen tumoral medio del grupo al que se administró 341G2Ser el último día de medición – volumen tumoral medio del grupo al que se administró 341G2Ser el día de inicio de la administración de anticuerpo)/(volumen tumoral medio del grupo al que se administró control negativo el último día de medición - volumen tumoral medio del grupo al que se

20 administró control negativo el día del inicio de la administración de anticuerpo)} x 100].

Como resultado, TGIR excedió el 100 % en los ratones portadores de cáncer T24, Hs766T y Capan-2, y se observó una reducción del volumen tumoral en los ratones. Por otro lado, TGIR fue del 73,4 % en los ratones portadores de cáncer Ramos, y se suprimió considerablemente un aumento del volumen tumoral en los ratones (Tabla 2). Las Figuras 23 a 26 muestran respectivamente el cambio de volumen tumoral de ratones portadores de cáncer en los

25 que se injertaron respectivamente células Ramos, células T24, células Hs 766T y células Capan-2.

Tabla 2

Relación de inhibición del crecimiento tumoral

Línea celular

Cantidad de 341G2Ser administrada

10 !g/cabeza

100 !g/cabeza

Ramos

- 73,40 %

T24

- 109,05 %

Hs 766T

- 108,55 %

Capan-2

103,49 % 119,20 %

La relación de inhibición en cada línea celular es un valor del último día de medición.

Aplicabilidad industrial

Como se muestra en los Ejemplos, el anticuerpo anti-CD40 de la presente divulgación que tiene una región

30 constante en la que se introduce una mutación y un anticuerpo anti-CD40 en el que una parte de la estructura de la subclase se sustituye con la de otra subclase tienen actividad ADCC y actividad CDC reducidas, mientras que mantienen su actividad. En consecuencia, el anticuerpo de la presente invención tiene la citotoxicidad reducida para células que expresan CD40 cuando se administra a un sujeto como un anticuerpo terapéutico, y por lo tanto puede usarse con seguridad.

35 Texto libre del listado de secuencias

SEC ID Nº: 2 a 36: ADN sintéticos SEC ID Nº: 49 a 130: péptidos sintéticos

40 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> KIRIN BEER KABUSIKI KAISHA

<120> Un mutante de anticuerpo anti-CD40 <130> PH-2356-PCT

<140> 5 <141>

<150> JP 2003-431408

<151> 10 <160> 142

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1 15 <211> 175

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1 20 <210> 2

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético 10

<400> 2 atatgctagc accaagggcc catcggtctt ccccctggc 39

<210> 3

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 3 atatggatcc tcatttaccc ggagacaggg agaggctc 38

<210> 4

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 4 atatgctagc accaagggcc catcggtctt ccccctggcg 40

<210> 5

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 5 gttttctcga tggaggctgg gaggcc 26

<210> 6

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 6 atatggatcc tcatttaccc ggagacaggg agaggctc 38

<210> 7

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 7 ggcctcccag cctccatcga gaaaac 26

<210> 8

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 8 atatggatcc tcatttaccc ggagacaggg agaggc 36

<210> 9

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 9 aggggtccgg gagatcatga gagtgtcctt 30

<210> 10

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 10 aaggacactc tcatgatctc ccggacccct 30

<210> 11

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 11 tgatcatacg tagatatcac ggc 23

<210> 12

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 12 tgatcatacg tagatatcac ggc 23

<210> 13

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 13 gggtacgtcc tcacattcag tgatcag 27

<210> 14

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 14 tttgcgctca actgtcttgt ccaccttggt gttgctggg 39

<210> 15

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 15 tgatcatacg tagatatcac ggc 23

<210> 16

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 16 acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccg 36

<210> 17

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 17 gggtacgtcc tcacattcag tgatcag 27

<210> 18

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 18 ggtgttgctg ggcttgtgat ctacgttgca g 31

<210> 19

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 19 ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac c 31

<210> 20

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 20 tgatcatacg tagatatcac ggc 23

<210> 21

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 21 gggtacgtcc tcacattcag tgatcag 27

<210> 22

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 22 ggtgttgctg ggcttgtgat ctacgttgca g 31

<210> 23

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 23 ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac c 31

<210> 24

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 24 tgatcatacg tagatatcac ggc 23

<210> 25

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 25 gggtacgtcc tcacattcag tgatcag 27

<210> 26

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 26 cacaacattt ggactcaact ctcttgtcca cc 32

<210> 27

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 27 ggtggacaag agagttgagt ccaaatgttg tg 32

<210> 28

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 28 tgatcatacg tagatatcac ggc 23

<210> 29

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 29 gggtacgtcc tcacattcag tgatcag 27

<210> 30

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 30 ggcacggtgg gcatggggga ccatatttgc gctc 34

<210> 31

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 31 gagcgcaaat atggtccccc atgcccaccg tgcc 34

<210> 32

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 32 tgatcatacg tagatatcac ggc 23

<210> 33

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 33 gggtacgtcc tcacattcag tgatcag 27

<210> 34

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 34 gaagactgac ggtcccccca ggaactctgg tgctgggca 39

<210> 35

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 35 tgcccagcac cagagttcct ggggggaccg tcagtcttc 39

<210> 36

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 36 tgatcatacg tagatatcac ggc 23

<210> 37

<211> 1480

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 474

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 406

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 126

<212>

PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 508

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 146

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

<210> 43

<211> 414

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 129

<212>

PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 44

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400>

45 10

<210> 46

<213> Homo sapiens

<400> 46

<210> 47

<211> 448

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 47

5 <210> 48

<211> 130

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 48 <210> 49

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético 10

<400> 49

15 <210> 50

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 50

<210> 51

<211> 13 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético 10

<400> 51

15 <210> 52

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 52

<210> 53

<211> 13

<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

35 <400> 53

<210> 54 40 <211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 45 <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 54

<210> 55

<211> 13

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 55 10

<210> 56

<211> 13 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético 20

<400> 56

25 <210> 57

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 57

<210> 58

<211> 13

<212> PRT 40 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

45 <400> 58

<210> 59

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 59

<210> 60

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 60

<210> 61 25 <211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 61

35 <210> 62

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 62

<210> 63

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 63

<210> 64

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 64 15

<210> 65

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 65

<210> 66

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 66

<210> 67

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 67

<210> 68

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 68

<210> 69

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 69

<210> 70

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 70

<210> 71

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 71

<210> 72

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 72

<210> 73 15 <211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 73

<210> 74

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

35 <400> 74

<210> 75

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 75

<210> 76

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 76

<210> 77

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 77

<210> 78

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 78

<210> 79

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 79

<210> 80

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 80

<210> 81

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 81

<210> 82

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

25 <400> 82

<210> 83

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 83

<210> 84

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 84

<210> 84

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 85

<210> 86

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 86

25 <210> 87

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 87

<210> 88

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

45 <400> 88

<210> 88

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 89

<210> 90

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 90

<210> 91

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 91

<210> 92

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 92

<210> 93

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 93

<210> 94

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 94

<210> 95

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

25 <400> 95

<210> 96

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 96

<210> 97

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 97

<210> 98

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 98

15 <210> 99

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 99

<210> 100

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

35 <400> 100

<210> 101

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 101

<210> 102

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 102

<210> 103 15 <211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 103

<210> 104

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 104 35

<210> 105

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 105

<210> 106

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 106

<210> 107

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 107

<210> 108

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 108

<210> 109

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 109

<210> 110

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 110

<210> 111

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 111

<210> 112

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 112

<210> 113

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

35 <400> 113

<210> 114

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 114

<210> 115

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 115

<210> 116

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 116

<210> 117 25 <211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 117

<210> 118

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 118 45

<210> 119

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 119

<210> 120

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

15 <400> 120

<210> 121

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 121

<210> 122

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 122

<210> 123

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 123

<210> 124

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 124

<210> 125

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 125

<210> 126

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

35 <400> 126

<210> 127

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 127

<210> 128

<211> 13

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

10 <400> 128

<210> 129 15 <211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 129

<210> 130

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 30

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 130 35

<210> 131

<211> 1425

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 131

<210> 132

<211> 474

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 132

<210> 133

<213> Homo sapiens

<400> 133

<210> 134

<211> 231

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 134

<210> 135

<211> 1407

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 135 <210> 136

<211> 468

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 136

<210> 137

<211> 702

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 137

5 <210> 138

<211> 233

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 138

<210> 139

<211> 1425

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 139 <210> 140

<211> 474

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 140

<210> 141

<213> Homo sapiens

<400> 141

<210> 142

<211> 235

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 142

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición farmacéutica para uso en un procedimiento de prevención o tratamiento de rechazo de trasplantes, enfermedades autoinmunes, alergia o inhibición del factor de coagulación sanguínea VIII, que comprende un anticuerpo monoclonal como un principio activo, en la que el anticuerpo monoclonal consiste en dos

   5 cadenas pesadas, cada una representada por una secuencia de aminoácidos que se extiende desde Q en la posición 27 a K en la posición 474 en SEC ID Nº 140 y dos cadenas ligeras, cada una representada por una secuencia de aminoácidos que se extiende desde A en la posición 23 a C en la posición 235 en SEC ID Nº 142.
2. 2. Uso de un anticuerpo monoclonal para producción de una composición farmacéutica para prevención o tratamiento de rechazo de trasplantes, enfermedades autoinmunes, alergia o inhibición del factor de coagulación

   10 sanguínea VIII, en el que el anticuerpo monoclonal consiste en dos cadenas pesadas, cada una representada por una secuencia de aminoácidos que se extiende desde Q en la posición 27 a K en la posición 474 en SEC ID Nº 140 y dos cadenas ligeras, cada una representada por una secuencia de aminoácidos que se extiende desde A en la posición 23 a C en la posición 235 en SEC ID Nº 142.